特許 5922124 二酸化炭素固定回路を導入した微生物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5922124

(24)【登録日】2016年4月22日

(45)【発行日】2016年5月24日

(54)【発明の名称】二酸化炭素固定回路を導入した微生物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20160510BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160510BHJP

   C12P 19/32 20060101ALI20160510BHJP

   C12P 7/28 20060101ALI20160510BHJP

   C12P 7/04 20060101ALI20160510BHJP

   C12P 13/14 20060101ALI20160510BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20160510BHJP

   C12N 9/14 20060101ALI20160510BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20160510BHJP

   C12R 1/185 20060101ALN20160510BHJP

   C12R 1/15 20060101ALN20160510BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   C12N15/00 A

   C12P19/32 B

   C12P7/28

   C12P7/04

   C12P13/14

   C12N9/12

   C12N9/14 101

   C12N9/02

   C12P19/32 B

   C12R1:185

   C12P19/32 B

   C12R1:15

   C12P7/28

   C12R1:185

   C12P7/28

   C12R1:15

   C12P7/04

   C12R1:185

   C12P7/04

   C12R1:15

   C12P13/14

   C12R1:185

   C12P13/14

   C12R1:15

【請求項の数】15

【全頁数】85

(21)【出願番号】特願2013-526900(P2013-526900)

(86)(22)【出願日】2012年7月27日

(86)【国際出願番号】JP2012069247

(87)【国際公開番号】WO2013018734

(87)【国際公開日】20130207

【審査請求日】2014年1月28日

(31)【優先権主張番号】特願2011-167808(P2011-167808)

(32)【優先日】2011年7月29日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000005887

【氏名又は名称】三井化学株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100079049

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100084995

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 和詳

(74)【代理人】

【識別番号】100099025

【弁理士】

【氏名又は名称】福田 浩志

(72)【発明者】

【氏名】藤井 亮太

(72)【発明者】

【氏名】白井 智量

(72)【発明者】

【氏名】安楽城 正

(72)【発明者】

【氏名】天野 仰

(72)【発明者】

【氏名】松本 佳子

(72)【発明者】

【氏名】舘野 俊博

(72)【発明者】

【氏名】竹林 のぞみ

(72)【発明者】

【氏名】森重 敬

(72)【発明者】

【氏名】高橋 均

(72)【発明者】

【氏名】和田 光史

(72)【発明者】

【氏名】清水 浩

(72)【発明者】

【氏名】古澤 力

(72)【発明者】

【氏名】平沢 敬

(72)【発明者】

【氏名】秀崎 友則

(72)【発明者】

【氏名】遠藤 絢子

(72)【発明者】

【氏名】ユーゲン−ローマン、 ドミニク ルーカス

(72)【発明者】

【氏名】マダヴァン、 アンジャリ

(72)【発明者】

【氏名】チョン、 スー サン

【審査官】 白井 美香保

(56)【参考文献】

【文献】 独国特許出願公開第１０２００７０４７２０６（ＤＥ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／００８３７７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−１４８２２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，２０１１年 ３月，vol.77 no.6，pp.1925-1936

【文献】 日本生物工学会大会講演要旨集 平成２２年度，２０１０年，p.225 1S-Dp10

【文献】 日本生物工学会大会講演要旨集 平成２２年度，２０１０年，p.137 2P-2107

【文献】 バイオサイエンスとインダストリー，２００８年，vol.66 no.8，pp.426-432

【文献】 PLoS ONE，２０１０年，vol.5 no.10 e13001，pp.1-12

【文献】 Microbial Cell Factories，２００７年，vol.6 no.19，pp.1-11

【文献】 Microbial Cell Factories，２００９年，vol.8 no.43，pp.1-15

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれをも有していない微生物に、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、または付与してもその機能を発揮せずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ、及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも２種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産回路を有するアセチルＣｏＡ生産微生物であって、
微生物が、腸内細菌科に属する微生物又はコリネ型細菌に属する微生物であるアセチルＣｏＡ生産微生物；
（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３−ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ_２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ_２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｄ）ＣＯ_２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｅ）マレートチオキナーゼと、マリルＣｏＡリアーゼとからなる群より選択された少なくとも１種。

【請求項2】

ホスホエノールピルビン酸またはピルビン酸が、オキサロ酢酸を経由し、さらにマレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼにより得られた２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸がさらに２−ホスホグリセリン酸を経由して再びホスホエノールピルビン酸に変換されるアセチルＣｏＡ生産回路を有する請求項１に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。

【請求項3】

（ｆ）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼ、またはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、またはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼからなる群より選択された少なくとも一種と、
（ｇ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼと、
（ｈ）マレートチオキナーゼと、
（ｉ）マリルＣｏＡリアーゼと、
（ｊ）グリオキシル酸カルボリガーゼと、
（ｋ）２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ、またはヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも一種と、
（ｌ）グリセリン酸２−キナーゼ、またはホスホグリセリン酸ムターゼ及びグリセリン酸３−キナーゼからなる群より選択された少なくとも一種と、
（ｍ）エノラーゼと、
からなるアセチルＣｏＡ生産回路を有する請求項１又は請求項２に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。

【請求項4】

微生物が、エシェリヒア属細菌若しくはパントエア属細菌である腸内細菌科に属する微生物、又は、コリネバクテリウム属細菌であるコリネ型細菌に属する微生物である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。

【請求項5】

微生物が、エシェリヒア属細菌であり、エシェリヒア属細菌が有する乳酸デヒドロゲナーゼの活性が不活化または低減された請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。

【請求項6】

微生物が、エシェリヒア属細菌であり、エシェリヒア属細菌が有する、イソクエン酸リアーゼ及びリンゴ酸シンターゼからなる群より選択された少なくとも１つの酵素の活性が不活化又は低減された請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。

【請求項7】

微生物が、エシェリヒア属細菌であり、エシェリヒア属細菌に、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が付与または強化された請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。

【請求項8】

微生物が、エシェリヒア属細菌であり、エシェリヒア属細菌に、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が付与または強化された請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。

【請求項9】

微生物が、パントエア属細菌であり、パントエア属細菌が有する、フマル酸ヒドラターゼＡ及びフマル酸ヒドラターゼＣの活性が不活化または低減された請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。

【請求項10】

微生物が、パントエア属細菌であり、パントエア属細菌が有するリンゴ酸シンターゼの活性が不活化または低減された請求項１〜請求項４及び請求項９のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。

【請求項11】

マレートチオキナーゼにおいて、メチロバクテリウム・エクストロクエンス由来のｍｔｋＢの１４４番のアミノ酸に相当するアミノ酸がイソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンもしくはプロリン、及び／又は２４４番目のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、チロシン、リジンもしくはアルギニンであるマレートチオキナーゼを用いることを特徴とする請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。

【請求項12】

請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料からアセチルＣｏＡを生産することを含むアセチルＣｏＡ生産方法。

【請求項13】

請求項７、請求項８又は請求項１１に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料からアセトンを生産することを含むアセトン生産方法。

【請求項14】

請求項８又は請求項１１に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。

【請求項15】

請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料からグルタミン酸を生産することを含むグルタミン酸生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アセチルＣｏＡ生産微生物及びこれを用いた物質生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アセチルＣｏＡは微生物の代謝経路における、きわめて重要な中間体のひとつである。さまざまな代謝産物がアセチルＣｏＡを経由して生産される。このようなアセチルＣｏＡを経由して生成される物質の例として、たとえば、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、などのアミノ酸類；酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、クエン酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、メタクリル酸及びポリ−３−ヒドロキシ酪酸などの有機酸類；イソプロピルアルコール、エタノール、ブタノールなどのアルコール類；その他にもアセトン、ポリグルタミン酸、などが知られている。

【0003】

アセチルＣｏＡは、多くの微生物の場合、グルコースなどの糖を炭素源として生産される。糖は、まず、エムデン・マイヤーホフ経路、エントナー・ドウドロフ経路、ペントース・リン酸経路などの、解糖系と呼ばれる代謝経路を経て、ピルビン酸へと変換される。その後、ピルビン酸デカルボキシラーゼやピルビン酸−ギ酸リアーゼなどの作用により、アセチルＣｏＡへと変換される。この際、二酸化炭素やギ酸が副生成物として生産され、糖に由来する炭素が一部欠損することとなる。このため、二酸化炭素を再固定してアセチルＣｏＡの収量を増やすための幾つかの検討が行われている。

【0004】

微生物の体内において、二酸化炭素を固定して炭素源とする経路はいくつか知られている（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７７（６）， １９２５−１９３６（２０１１））。具体的には、カルビン・ベンソン回路、還元的ＴＣＡ回路、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路、３−ヒドロキシプロピオン酸回路、４−ヒドロキシ酪酸回路、などが挙げられる。カルビン・ベンソン回路は、植物や光合成細菌に存在する、約１２種の酵素からなるＣＯ_２固定経路であり、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲｕｂｉｓＣＯ）によりＣＯ_２を固定し、最終的にグリセルアルデヒド３−リン酸が生産される。還元的ＴＣＡ回路は、緑色硫黄細菌をはじめとする嫌気性菌や微好気性菌にみられる回路で、１１種の酵素からなり、フェレドキシンを補酵素としたＣＯ_２固定酵素（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、２−オキソグルタル酸シンターゼ）を特徴とし、通常のＴＣＡ回路の逆方向の反応によりＣＯ_２からピルビン酸を生産する。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、酢酸産生菌など嫌気性微生物にみられる経路で、９種の酵素からなり、ギ酸デヒドロゲナーゼやＣＯデヒドロゲナーゼ等によりＣＯ_２や補酵素上のギ酸を還元し、最終的にアセチルＣｏＡへと変換する。３−ヒドロキシプロピオン酸回路は、クロロフレクサス属菌などにみられる回路で、１３種の酵素からなり、アセチルＣｏＡ（プロピオニルＣｏＡ）カルボキシラーゼの作用によりＣＯ_２を固定し、マロニルＣｏＡなどを経由して、アセチルＣｏＡを生産する。４−ヒドロキシ酪酸回路は、古細菌などに存在する経路で、ピルビン酸シンターゼ、アセチルＣｏＡ（プロピオニルＣｏＡ）カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、の反応によりＣＯ_２を固定し、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡなどを経由して、アセチルＣｏＡを生産する。

【0005】

一方、二酸化炭素を固定する経路を有用化合物生産微生物に導入し、有用物質を生産しようとする試みも、アイデアとしてはいくつか報告されている。たとえば国際公開第２００９／０９４４８５号パンフレットや国際公開第２０１０／０７１６９７号パンフレットには、酢酸菌のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路に類似した経路を導入した微生物を用いて二酸化炭素からアセチルＣｏＡを生産する提案が開示されている。また、ＣＯ_２を固定して有用化合物を生産させる例として、国際公開第２００９／０４６９２９号パンフレットには、ヒドロゲナーゼとテトラヒドロ葉酸リアーゼを導入した微生物を用いて二酸化炭素から乳酸を生産する試みが開示されている。また、国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレットでは、アセチルＣｏＡ上への炭酸固定反応やマロニルＣｏＡの還元反応を経由し、ＣＯ_２を固定する回路を提案している。独国特許出願公開第１０２００７０５９２４８号明細書では、４−ヒドロキシ酪酸回路に類似した経路によるアセチルＣｏＡの生産を提案している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、公知の炭酸固定回路は、ＣＯ_２を固定してアセチルＣｏＡ由来の有用化学品を生産するという観点から、必ずしも効率がよいとはいえない。たとえば、カルビン・ベンソン回路は、自然界の炭酸固定回路としてもっとも有名であるが、炭酸固定を担うＲｕｂｉｓＣＯは、反応速度が遅い上に、酸化的分解といった副反応もみられ、効率のいい酵素とはいえない（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９４（６） ４９７−５０５， ２００２）。また、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路、国際公開第２００９／０９４４８５号パンフレット、国際公開第２０１０／０７１６９７号パンフレット、国際公開第２００９／０４６９２９号パンフレットなどに記載されている経路では、ＣＯ_２をＣＯやギ酸へと還元する経路を含むが、このような還元反応は通常の条件下だと困難な上に、このように強い還元反応を触媒する酵素は還元性の環境下でしか作用しない場合が多く、絶対嫌気性の微生物以外に導入するのは容易ではない。還元的ＴＣＡ回路においても、途中のピルビン酸シンターゼや２−オキソグルタル酸シンターゼによる還元反応には、フェレドキシンを電子受容体とした強い還元力が必要で、反応として難しい。また、４−ヒドロキシ酪酸回路、３−ヒドロキシプロピオン酸回路、国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレット、国際公開第２００９／０４６９２９号パンフレットなどに記載されている経路などでは、スクシニルＣｏＡの還元や、マロニルＣｏＡの還元といった、カルボン酸もしくはその（チオ）エステルの還元反応を利用しているが、このような反応は酵素反応として一般的に困難で、発酵経路としてはできるだけ避けた方が望ましいとされている（Ａｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４５１，（３）， ８６−８９， ２００８； Ｙｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．，７， ４４５−４５２， ２０１１）。４−ヒドロキシ酪酸回路は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの脱水や、３−ヒドロキシプロピオン酸の脱水といった、脱水反応を経由しているが、このような反応は水中だとしばしば逆反応（水和）と競合するという問題がある。また、４−ヒドロキシ酪酸回路、３−ヒドロキシプロピオン酸回路、還元的ＴＣＡ回路においては、マロニルＣｏＡ合成酵素やピルビン酸合成酵素の作用により、生産されたアセチルＣｏＡが回路内で別の物質へと変換されるため、アセチルＣｏＡの生産という観点からは、必ずしも効率的とはいえない。

【0007】

さらに、このような回路を微生物に導入して、何らかの物質生産を試みる場合、回路を構成する酵素の数や、新たに付与すべき酵素活性の数を考慮する必要がある。すなわち、回路を構築する酵素や付与する酵素の数が多ければ多いほど、制御が難しくなる上に、微生物への負担も増す。たとえば、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を大腸菌に導入しようとすると、少なくとも９種の遺伝子導入が必要で、物質生産の経路を構築した上に、さらにこれほどの遺伝子を導入して制御することは、現実的にきわめて困難な作業といえる。少ない数の酵素で構成された回路を、少ない数の酵素付与で構築したほうが、回路を構築する上でも、物質生産経路と組み合わせる上でも、有利であることは明らかである。

【0008】

したがって、ＣＯ_２を固定してアセチルＣｏＡへと変換するには、Ａ．経路を構成する各酵素の活性が十分に高く、Ｂ．アセチルＣｏＡを消費する酵素を回路中に含まず、Ｃ．新たに付与する酵素の数が少なく回路がシンプルである、ことが、理想的であるといえる。しかしながら、今までに報告されたＣＯ_２からアセチルＣｏＡを生産する回路において、Ａ〜Ｃの条件をすべて満たす回路は存在せず、いずれも実現性に乏しかった。その証拠に、既存の炭酸固定回路の提案において、実際に酵素活性を工業的に利用される微生物に付与して、ＣＯ_２をアセチルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡ由来の物質へと変換して発酵に用いた例は、これまで皆無であった。

【0009】

本発明は、二酸化炭素を利用して効率よくアセチルＣｏＡを生成するために有用な微生物、及び該微生物を用いて、アセチルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡに由来する有用な代謝産物の製造方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は以下のとおりである。
［１］ 下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれをも有していない微生物に、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、または付与してもその機能を発揮せずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ、及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも２種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産回路を有するアセチルＣｏＡ生産微生物であって、
微生物が、腸内細菌科に属する微生物又はコリネ型細菌に属する微生物であるアセチルＣｏＡ生産微生物；
（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３−ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ_２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ_２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｄ）ＣＯ_２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｅ）マレートチオキナーゼと、マリルＣｏＡリアーゼとからなる群より選択された少なくとも１種。
［２］ ホスホエノールピルビン酸またはピルビン酸が、オキサロ酢酸を経由し、さらにマレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼにより得られた２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸がさらに２−ホスホグリセリン酸を経由して再びホスホエノールピルビン酸に変換されるアセチルＣｏＡ生産回路を有する［１］に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
［３］ （ｆ）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼ、またはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、またはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼからなる群より選択された少なくとも一種と、
（ｇ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼと、
（ｈ）マレートチオキナーゼと、
（ｉ）マリルＣｏＡリアーゼと、
（ｊ）グリオキシル酸カルボリガーゼと、
（ｋ）２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ、またはヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも一種と、
（ｌ）グリセリン酸２−キナーゼ、またはホスホグリセリン酸ムターゼ及びグリセリン酸３−キナーゼからなる群より選択された少なくとも一種と、
（ｍ）エノラーゼと、
からなるアセチルＣｏＡ生産回路を有する［１］又は［２］に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
［４］ 微生物が、エシェリヒア属細菌若しくはパントエア属細菌である腸内細菌科に属する微生物、又は、コリネバクテリウム属細菌であるコリネ型細菌に属する微生物である［１］〜［３］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
［５］ 微生物が、エシェリヒア属細菌であり、エシェリヒア属細菌が有する乳酸デヒドロゲナーゼの活性が不活化または低減された［１］〜［４］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
［６］ 微生物が、エシェリヒア属細菌であり、エシェリヒア属細菌が有する、イソクエン酸リアーゼ及びリンゴ酸シンターゼからなる群より選択された少なくとも１つの酵素の活性が不活化又は低減された［１］〜［５］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
［７］ 微生物が、エシェリヒア属細菌であり、エシェリヒア属細菌に、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が付与または強化された［１］〜［６］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
［８］ 微生物が、エシェリヒア属細菌であり、エシェリヒア属細菌に、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が付与または強化された［１］〜［７］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
［９］ 微生物が、パントエア属細菌であり、パントエア属細菌が有する、フマル酸ヒドラターゼＡ及びフマル酸ヒドラターゼＣの活性が不活化または低減された［１］〜［４］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
［１０］ 微生物が、パントエア属細菌であり、パントエア属細菌が有するリンゴ酸シンターゼの活性が不活化または低減された［１］〜［４］及び［９］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
［１１］ マレートチオキナーゼにおいて、メチロバクテリウム・エクストロクエンス由来のｍｔｋＢの１４４番のアミノ酸に相当するアミノ酸がイソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンもしくはプロリン、及び／又は２４４番目のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、チロシン、リジンもしくはアルギニンであるマレートチオキナーゼを用いることを特徴とする［１］〜［１０］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
［１２］ ［１］〜［１１］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料からアセチルＣｏＡを生産することを含むアセチルＣｏＡ生産方法。
［１３］ ［７］、［８］又は［１１］に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料からアセトンを生産することを含むアセトン生産方法。
［１４］ ［８］又は［１１］に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
［１５］ ［１］〜［１１］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料からグルタミン酸を生産することを含むグルタミン酸生産方法。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、二酸化炭素を効率よくアセチルＣｏＡへと変換するために有用な微生物及び該微生物を用いて、アセチルＣｏＡ及び有用な代謝産物の製造方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】本発明に係る二酸化炭素固定経路の概要を説明する経路図である。

【図2A】各種ｍｔｋＢの配列相同性を示した図である。

【図2B】各種ｍｔｋＢの配列相同性を示した図である。

【図3A】各種ｍｔｋＡの配列相同性を示した図である。

【図3B】各種ｍｔｋＡの配列相同性を示した図である。

【図4】実施例４１にかかる各種パントエア属細菌で生産されたグルタミン酸への^１３Ｃ導入パターンを示した図である。

【図5】実施例５０にかかる各種コリネバクテリウム属細菌で生産されたグルタミン酸への^１３Ｃ導入パターンを示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明に係るアセチルＣｏＡ生産微生物は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれをも有していない微生物に、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、または付与してもその機能を発揮せずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ、及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産回路を有するアセチルＣｏＡ生産微生物である。

【0014】

（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３−ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ_２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ_２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｄ）ＣＯ_２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｅ）マレートチオキナーゼと、マリルＣｏＡリアーゼとからなる群より選択された少なくとも１種。

【0015】

本発明によれば、所定の酵素活性を付与することにより、糖代謝において発生するＣＯ_２や外部から供給したＣＯ_２を固定化する、二酸化炭素固定回路が構築され、且つＣＯ_２を効率よくアセチルＣｏＡへと変換しうるアセチルＣｏＡ生産回路を有するアセチルＣｏＡ生産微生物を提供することができる。
すなわち本発明とは、ＣＯ_２をアセチルＣｏＡへと変換するために種々検討した結果、上述のように、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれをも有していない微生物に、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、または付与してもその機能を発揮せずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ、及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することによりＣＯ_２をアセチルＣｏＡへと変換できることを見出したものである。
（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３−ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ_２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ_２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｄ）ＣＯ_２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｅ）マレートチオキナーゼと、マリルＣｏＡリアーゼとからなる群より選択された少なくとも１種。

【0016】

また、このＣＯ_２をアセチルＣｏＡへと変換するアセチルＣｏＡ生産微生物を利用することにより、また当該微生物に対して所定の酵素活性を更に付与することにより、アセチルＣｏＡと、アセチルＣｏＡに由来する有用な代謝産物、例えば、イソプロピルアルコール、エタノール、アセトン、クエン酸、イタコン酸、酢酸、酪酸、（ポリ−）３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、メタクリル酸、（ポリ）グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、オルニチン、シトルリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン等の物質生産を効率よく行うことができる。

【0017】

本発明は、ＣＯ_２を固定してアセチルＣｏＡへと変換する、もっともシンプルで実用的なアセチルＣｏＡ生産回路を提案する（図１）。
図１に記載のアセチルＣｏＡ生産回路は、本発明におけるアセチルＣｏＡ生産回路の好ましい一態様を示す（以下、「図１の回路」と称する場合がある。）。

【0018】

ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼと、ピルビン酸カルボキシラーゼ及びピルビン酸キナーゼからなる群より選択された少なくとも一種と、リンゴ酸デヒドロゲナーゼと、マレートチオキナーゼと、マリルＣｏＡリアーゼと、グリオキシル酸カルボリガーゼと、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ及び２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも一種と、グリセリン酸２−キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ及びグリセリン酸３−キナーゼからなる群より選択された少なくとも一種と、エノラーゼとの８〜１０種の酵素からなり、（ホスホエノール）ピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが炭酸固定を担う。この（ホスホエノール）ピルビン酸カルボキシラーゼは炭酸固定酵素の中で活性の高い部類に属する。たとえば、植物等の光合成で利用されるＲｕｂｉｓＣＯの比活性は、３Ｕ〜２０Ｕ／ｍｇ程度の活性が知られている（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４（８） ５０７８−８２（１９９９）， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５３（１） ９７−１０１ （１９８６））のに対し、（ホスホエノール）ピルビン酸カルボキシラーゼにおいては、大腸菌で３０Ｕ／ｍｇ、高いものでは１００〜１５０Ｕ／ｍｇのものまで報告されている（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４７， ５７８５−５７９２ （１９７２） ；Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９， １４０−１４２ （１９９５）；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １４７５（３）：１９１−２０６ （２０００））。また、マリルＣｏＡを合成するマレートチオキナーゼ（ｍｔｋ）は、今回の研究で、これまで知られていた酵素（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４８（２１） ７２９５−３０３ （１９７３））と比較して、より活性の高いマレートチオキナーゼが発見された。さらに、図１の回路を構成する酵素数は８〜１０種であり、公知のアセチルＣｏＡ生産回路と比較して最もシンプルで、なおかつ微生物に付与すべき酵素数も少なくて済む。しかも、図１の回路中にはアセチルＣｏＡを消費する酵素は含まれない。したがって図１の回路は、ＣＯ_２を固定してアセチルＣｏＡへと変換するための、理想的な回路といえる。

【0019】

さらに、図１の回路の利点として、回路が解糖系とは独立しているため、さまざまな経路の解糖系と自由に組み合わせることができることも挙げられる。たとえば、ペントース・リン酸経路はＮＡＤＰＨの生産量が高いため、物質生産にしばしば用いられる（特表２００７−５１０４１１号公報）が、本回路とは独立しており、容易に組み合わせることができる。

【0020】

図１の回路は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ（ｇｌｘＲ）又はヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ｙｃｄＷ）、がそれぞれＮＡＤＨ（もしくはＮＡＤＰＨ）を還元力として消費する。また、マレートチオキナーゼ（ｍｔｋ）、グリセリン酸３−キナーゼ（ｇｌｘＫ）、グリセリン酸２−キナーゼ（ｇａｒＫ）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）はＡＴＰを消費する。ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋ）はピルビン酸を生産する。
図１の回路の収支としては、ホスホエノールピルビン酸を出発物質とする場合、「ホスホエノールピルビン酸＋２ＣｏＡ＋ＣＯ_２＋３ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋３ＡＴＰ→２アセチルＣｏＡ＋３ＮＡＤ（Ｐ）^＋＋３ＡＤＰ」である。
また、ピルビン酸を出発物質とする場合、「ピルビン酸＋２ＣｏＡ＋ＣＯ_２＋３ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋４ＡＴＰ→２アセチルＣｏＡ＋３ＮＡＤ（Ｐ）^＋＋４ＡＤＰ」となる。
すなわち、図１の回路は、ＣＯ_２を固定してアセチルＣｏＡへと変換する際、ホスホエノールピルビン酸（もしくはピルビン酸）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＡＴＰ、の供給を必要とする。

【0021】

アセチルＣｏＡを中間体とする発酵経路の中で、発酵中に酸素を消費する経路の収支式を表１に記載した。これらの発酵においては、発酵経路上でＮＡＤＨなどの還元型補酵素が生成され、それが酸素の作用により酸化型へと戻される、という現象が起こっていると想定される。そこで、もし、生成される還元型補酵素を、酸素に代わって図１の回路により消費できれば、発酵中に生成される還元力をアセチルＣｏＡ生産回路で有効利用でき、ＣＯ_２を固定して生産物へと変換できると期待される。

【0022】

なお、ここでの還元型補酵素とは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ_２、ＦＭＮＨ_２、還元型キノン補酵素、といった、酸化還元に関与する補酵素であり、かつそれが還元状態である補酵素を指し、好ましくはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、より好ましくはＮＡＤＨを指す。一方、酸化型補酵素とは、還元型補酵素の酸化型で、たとえばＮＡＤ^＋、ＮＡＤＰ^＋、ＦＡＤ、ＦＭＮ、酸化型キノン補酵素を指し、好ましくはＮＡＤ^＋又はＮＡＤＰ^＋、より好ましくはＮＡＤ^＋を指す。

【0023】

【表1】

【0024】

また、表１のように、発酵式の左辺に酸素が存在する発酵では、しばしば酸素が大量に必要とされるが、そのためには大量の通気や強力な攪拌が要求されることがあり、設備費や電力費の増大につながる。そこで、図１の回路を導入すれば、余剰の還元力を消費することで、過剰な通気攪拌を緩和でき、発酵生産の費用を削減できると期待される。

【0025】

本発明の回路の還元力を補うために、還元力を生産できる物質を加えたり、外部からエネルギーを与えることで、還元力を与えてもよい。たとえば、還元度の高い物質（たとえば、水素、亜硫酸塩、アルコール類、パラフィン、等）を基質として利用する、電気培養で還元エネルギーを直接供給する、生物の光化学反応で還元力を供給する、などといった手段も考えられる。なお、外部から還元力を補給できれば、表１のように還元型補酵素が発生する発酵でない場合でも、提案する炭酸固定経路を駆動させることは可能である。

【0026】

以下、本発明について説明する。

【0027】

本発明における「二酸化炭素（ＣＯ_２）固定」とは、糖代謝において発生するＣＯ_２や外部から供給したＣＯ_２を有機化合物へ変換することを指す。ＣＯ_２はＨＣＯ_３⁻であってもよい。また、本明細書では「二酸化炭素（ＣＯ_２）固定」を「炭酸固定」と呼ぶことがある。

【0028】

本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。

【0029】

本発明における「不活化」とは、既存のあらゆる測定系によって測定された酵素（特に断らない限り、本明細書において「酵素」には、単独では酵素活性を示さない「因子」も含まれる）の活性が不活化前の微生物での活性を１００としたとき、その１／１０以下である状態を指す。
本発明における酵素活性の「低減」とは、当該酵素をコードする遺伝子の遺伝子組換え技術により、それらの処理を行う前の状態よりも有意に当該酵素の活性が低下している状態を指す。

【0030】

本発明における「活性」の「強化」とは、強化前の微生物での各種酵素活性が強化後に高まることを広く意味する。
強化の方法としては、微生物が有している各種酵素の活性が高まれば、特に制限はなく、細胞外から導入された酵素遺伝子による強化、細胞内の酵素遺伝子の発現増強による強化及びこれらの組み合わせを挙げることができる。

【0031】

細胞外から導入された酵素遺伝子による強化としては、具体的には、宿主由来の酵素よりも高活性の酵素をコードする遺伝子を宿主微生物の細胞外から遺伝子組換え技術により細胞内に導入して、導入された酵素遺伝子による酵素活性を追加するあるいはこの酵素活性に宿主が本来有する酵素活性と置換すること、更には宿主由来の酵素遺伝子又は細胞外からの酵素遺伝子の数を２以上に増加させること、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
微生物内の酵素遺伝子の発現増強による強化としては、具体的には、酵素遺伝子の発現を増強する塩基配列を宿主微生物の微生物外から微生物内に導入すること、宿主微生物がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーターを他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子の発現を強化させること、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。

【0032】

本発明における「活性」の「付与」とは、対象酵素遺伝子を見出せない微生物に対して、酵素遺伝子を外部から導入し、対象となる酵素の活性を与えることを広く意味する。付与の方法としては、微生物に対象となる酵素の活性が与えられれば、特に制限はなく、酵素遺伝子を保有するプラスミドによる形質転換、酵素遺伝子のゲノムへの導入、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
「活性」の「強化」もしくは「付与」で用いられるプロモーターとしては、遺伝子を発現できるものであれば特に制限はないが、構成型プロモーターもしくは誘導型プロモーターを使用することができる。

【0033】

対象となる酵素遺伝子を、当該微生物が有しているか否かを判断する場合には、たとえば、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）やＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）に登録されている、各菌株の遺伝子情報を参照することが挙げられる。なお、本発明では、ＫＥＧＧもしくはＮＣＢＩに登録されている、各菌株の遺伝子情報のみを用いることとする。

【0034】

本発明における酵素活性の付与は、例えば酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術により宿主細菌の細胞外から細胞内に導入することにより行うことができる。このとき、導入される酵素遺伝子は、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれであってもよい。

【0035】

細胞外から細胞内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）などに記載されている。

【0036】

本発明における「遺伝子組換え技術により」等との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のＤＮＡの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。

【0037】

本発明において因子又は酵素の活性が不活化された微生物とは、細胞外から細胞内への何らかの方法によって、生来の活性が損なわれた微生物を指す。これらの微生物は、例えば該蛋白質又は酵素をコードする遺伝子を破壊すること（遺伝子破壊）により作出することができる。

【0038】

本発明における遺伝子破壊としては、ある遺伝子の機能が発揮できないようにするために、その遺伝子の塩基配列に変異を入れる、別のＤＮＡを挿入する、及び、遺伝子のある部分を欠失させることを挙げることができる。遺伝子破壊の結果、例えばその遺伝子がｍＲＮＡへ転写できなくなり、構造遺伝子が翻訳されなくなる。あるいは、転写されたｍＲＮＡが不完全なために翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生じて本来の機能の発揮が不可能になる。

【0039】

遺伝子破壊株の作製は、当該酵素又は蛋白質が発現しない破壊株が得られればいかなる方法も用いることが可能である。遺伝子破壊の方法は種々の方法（自然育種、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射、ランダム突然変異、トランスポゾン、部位特異的遺伝子破壊）が報告されているが、ある特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相同組換えによる遺伝子破壊が好ましい。相同組換えによる手法はＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６１，１２１９−１２２１（１９８５）やＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，１５１１−１５１９（１９９５）やＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９７，６６４０−６６４５（２０００）に記載されており、これらの方法及びその応用によって同業技術者であれば容易に実施可能である。

【0040】

本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子を微生物外から導入された結果、本発明の効果を発揮しうる状態になった当該微生物を意味する。
なお、本発明における「宿主」とは、本来、炭素源材料からアセチルＣｏＡを生産する能力を有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより炭素源材料からアセチルＣｏＡを生産する能力を有し得る微生物を意味する。

【0041】

本発明における「宿主」は、有用な代謝産物の生産経路を備えていてもよい。本発明における「有用な代謝産物」とは、アルコール、アミノ酸、有機酸、テルペン類をはじめとする、微生物の代謝経路における主な代謝産物の総称を意味する。本来、有用な代謝産物を生産する能力を有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより有用な代謝産物を生産する能力を有し得る微生物であればよい。

【0042】

本発明における「アセチルＣｏＡに由来する有用な代謝産物」とは、代謝経路上でアセチルＣｏＡを経由して生産される、有用な代謝産物の総称を意味する。アルコールにおいては、例えば、イソプロピルアルコール、エタノール、ブタノールなどが挙げられる。アミノ酸においては、例えば、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリンなどを示す。有機酸においては、例えば、３−ヒドロキシ酪酸、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、ポリグルタミン酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、メタクリル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、メバロン酸などが挙げられる。テルペン類においては、イソプレン、スクアレン、ステロイド、カロテノイドなどが挙げられる。これら以外にも、例えばアセトンなどが挙げられる。本来、アセチルＣｏＡに由来する有用な代謝産物を生産する能力を有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることによりアセチルＣｏＡに由来する有用な代謝産物を生産する能力を有し得る微生物であればよい。

【0043】

本発明に係る「アセチルＣｏＡの生産」とは、代謝経路上で、何らかの物質をアセチルＣｏＡへと変換することを意味する。アセチルＣｏＡは代謝中間体で、代謝経路上でさまざまな物質へと速やかに変換されるため、見かけのアセチルＣｏＡ量は必ずしも増加するとは限らないが、アセチルＣｏＡに由来する物質にＣＯ_２由来のラベルが検出される、またはアセチルＣｏＡに由来する物質の対糖収率等が上昇する等により間接的に効果を把握することができる。変換に関与する要因はさまざま（補酵素量、基質量、フィードバック阻害などによる代謝変化、等）であるため、必ずしもアセチルＣｏＡの生産量がすべてのアセチルＣｏＡ由来物質の量に比例するわけではないが、もし、アセチルＣｏＡから特定の物質への生産経路を強化するか、それがもともと強い場合（たとえば、下記イソプロピルアルコール生産微生物やグルタミン酸生産微生物の場合）は、アセチルＣｏＡ以降の変換効率が外的要因に左右されにくいため、その物質の生産効率をアセチルＣｏＡ生産効率の指標とみなせる。

【0044】

本発明にかかるアセチルＣｏＡ生産微生物は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれをも有していない微生物に、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、または付与してもその機能を発揮せずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ、及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産回路を有するアセチルＣｏＡ生産微生物である。
（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３−ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ_２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ_２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｄ）ＣＯ_２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｅ）マレートチオキナーゼと、マリルＣｏＡリアーゼとからなる群より選択された少なくとも１種。

【0045】

アセチルＣｏＡ生産効率の観点より、アセチルＣｏＡ生産微生物は、マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼの酵素活性が付与されていることが好ましく、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ及びグリオキシル酸カルボリガーゼの酵素活性が付与されていることがより好ましく、マレートチオキナーゼと、マリルＣｏＡリアーゼと、グリオキシル酸カルボリガーゼと、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ及び／又はヒドロキシピルビン酸レダクターゼの酵素活性が付与されていることがさらに好ましい。
ここで、本発明における「（生来）有していない」とは、宿主微生物が天然界において本来的に有していないことを意味する。

【0046】

本明細書における「マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３−ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路」とは、下記（１）〜（７）の回路を指す。
（１）国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレットのＦＩＧ．１に示されたアセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、３−ヒドロキシプロピオン酸、プロピオニルＣｏＡ、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路
（２）国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレットのＦＩＧ．４Ａに示されたアセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、マロン酸セミアルデヒド、β−アラニン、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路
（３）国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレットのＦＩＧ．４Ｂ、１６又は１８に示されたアセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、ヒドロキシプロピオン酸、（Ｒ）−乳酸又は（Ｓ）−乳酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路
（４）国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレットのＦＩＧ．８に示されたアセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、マロン酸セミアルデヒド又はヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路
（５）国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレットのＦＩＧ．９Ａ、９Ｂ又は９Ｃに示されたアセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、ヒドロキシプロピオン酸、２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路
（６）国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレットのＦＩＧ．９Ｄ又は９Ｆに示されたアセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、ヒドロキシプロピオン酸、メチルマロニルＣｏＡ、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路
（７）国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレットのＦＩＧ．１７に示されたアセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、マロン酸セミアルデヒド又はヒドロキシプロピオン酸、メチルマロニルＣｏＡ、ピルビン酸、オキサロ酢酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路

【0047】

上記（１）〜（７）の炭酸固定回路は共通して、マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３−ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する。これらの反応はマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはマロニルＣｏＡレダクターゼが触媒する（国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレット）。このような、スクシニルＣｏＡの還元や、マロニルＣｏＡの還元といった、カルボン酸もしくはその（チオ）エステルの還元反応は酵素反応として一般的に困難で、発酵経路としてはできるだけ避けた方が望ましいとされている（Ａｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４５１，（３）， ８６−８９， ２００８； Ｙｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．，７， ４４５−４５２， ２０１１）。

【0048】

本明細書における「アセチルＣｏＡとＣＯ_２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路」とは、下記（８）〜（１０）の回路を指す。
（８）国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレットのＦＩＧ．１に示されたアセチルＣｏＡがピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、オキサロ酢酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路
（９）国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレットのＦＩＧ．７Ｃ、７Ｄ又は７Ｅに示されたアセチルＣｏＡがピルビン酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路
（１０）国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレットのＦＩＧ．９Ｍに示されたアセチルＣｏＡがピルビン酸、２−ケトグルタル酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路

【0049】

上記（８）〜（１０）の炭酸固定回路は共通して、アセチルＣｏＡとＣＯ_２からピルビン酸への酵素反応を有する。この反応を触媒するのがピルビン酸シンターゼである（国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレット）。ピルビン酸シンターゼによるピルビン酸の合成反応はフェレドキシンを介した強い還元力が必要で、反応が遅い上に、酸素に弱いため極端な嫌気条件下でないと反応が進行しない。
本明細書における「クロトニルＣｏＡとＣＯ_２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路」とは、国際公開第２０１１／０９９００６号パンフレットのＦＩＧ．９Ｈ又は９Ｊに示されたアセチルＣｏＡがクロトニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡ、オキサロ酢酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路を指す。
上記のクロトニルＣｏＡとＣＯ_２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの変換を触媒するのがクロトニルＣｏＡカルボキラーゼ−レダクターゼ又はメチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼである。クロトニルＣｏＡカルボキラーゼ−レダクターゼは、炭酸塩に対するＫｍが高く（１４ｍＭ； ＰＮＡＳ １０４（２５）１０６３１−１０６３６、（２００７））、低濃度域での活性が見込めない。また、基質であるクロトニルＣｏＡは３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから脱水反応により生産されるが、このような酵素は通常水中環境下だと逆反応の水和反応が優勢であるため、十分な速度が見込めない。また、メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼは、報告されている比活性がそれほど高くない（０．２−０．６Ｕ／ｍｇ； Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３１０（１） ６４−７５ （１９９４））上に、上記同様、基質であるクロトニルＣｏＡの生産に十分な速度が見込めないという問題もある。

【0050】

本明細書における「ＣＯ_２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路」とは、国際公開第２００９／０４６９２９号パンフレットのＦｉｇ．５、６、１３又は１４に示された回路、すなわちＣＯ_２からギ酸、セリンへと経由する経路を有し、オキサロ酢酸がリンゴ酸、マリルＣｏＡ、グリセリン酸を経由し、再びオキサロ酢酸に変換される回路を指す。

【0051】

上記のＣＯ_２からギ酸への酵素反応は強い還元力が必要で、反応が遅い上に、酸素に弱いため極端な嫌気条件下でないと反応が進行しない。
本明細書におけて、炭酸固定回路を「付与してもその機能を発揮せずに（しない）」とは、対象酵素遺伝子を見出せない微生物に対して、活性を持つ酵素遺伝子を外部から導入し、対象となる酵素の活性は与えるが、炭酸固定回路が機能していないことを指す。「炭酸固定回路が機能してしない」ことは、ラベルされたＣＯ_２を用いた試験で、回路中の代謝産物またはそれら代謝産物に由来する物質にＣＯ_２由来のラベルが検出されない、もしくは回路中の代謝産物に由来する物質の対糖収率等の上昇が見られない等により間接的に把握することができる。

【0052】

前記アセチルＣｏＡ生産微生物において構築されるアセチルＣｏＡ生産回路は、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ又は２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼを含む経路である。このようなアセチルＣｏＡ生産回路の一例を、図１に示す。また、前記アセチルＣｏＡ生産回路は、アセチルＣｏＡを消費する酵素、たとえばアセチルＣｏＡカルボキシラーゼやピルビン酸シンターゼ、を有しない。

【0053】

図１に示すアセチルＣｏＡ生産回路では、二酸化炭素は、まず、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）などの作用で、ホスホエノールピルビン酸若しくはピルビン酸と結合し、オキサロ酢酸へと変換される。オキサロ酢酸は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）の作用によりリンゴ酸へと変換される。リンゴ酸は、マレートチオキナーゼ（ｍｔｋ）の作用でマリルＣｏＡ（リンゴ酸ＣｏＡ）へと変換される。マリルＣｏＡ（リンゴ酸ＣｏＡ）は、マリルＣｏＡリアーゼ（Ｍｃｌ）の作用でアセチルＣｏＡとグリオキシル酸に変換される。グリオキシル酸は、グリオキシル酸カルボリガーゼ（ｇｃｌ）の作用で２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸へと変換される。３−ヒドロキシ−２−オキソプロピオン酸は、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ（ｇｌｘＲ）の作用でグリセリン酸へと変換されるか、又は、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ（ｈｙｉ）の作用でヒドロキシピルビン酸へと変換されてから、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ｙｃｄＷ）の作用でグリセリン酸へと変換される。グリセリン酸は、グリセリン酸３−キナーゼ（ｇｌｘＫ）の作用で３−ホスホグリセリン酸へと変換されるか、又は、グリセリン酸２−キナーゼ（ｇａｒＫ）の作用で２−ホスホグリセリン酸へと変換される。３−ホスホグリセリン酸は、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｇｐｍ）の作用で２−ホスホグリセリン酸へと変換される。２−ホスホグリセリン酸は、エノラーゼ（ｅｎｏ）の作用でホスホエノールピルビン酸へと変換される。回路にピルビン酸カルボキシラーゼを含む場合、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋ）の作用で、ホスホエノールピルビン酸はピルビン酸へと変換される。

【0054】

前記アセチルＣｏＡ生産微生物に付与される酵素活性は、付与した結果、前記アセチルＣｏＡ生産回路が機能的に構築されるものであればよく、宿主微生物に応じて、本明細書に記載の範囲内で適宜選択することができる。
図１の回路上の酵素を一部保有しないために、図１のいずれの経路でも閉じられた回路が形成されない微生物においては、不足となる酵素を付与する必要がある。エシェリヒア属細菌のうち、たとえば大腸菌は、マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼを保有しないため、少なくとも、両酵素を付与すればよい。
また、パントエア属細菌、たとえばパントエア・アナナティスは、マレートチオキナーゼ、およびマリルＣｏＡリアーゼ、およびグリオキシル酸カルボリガーゼを保有しないため、少なくとも、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼを付与すればよい。
また、コリネ型細菌のうち、たとえばコリネバクテリウム・グルタミカムは、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ、及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼを保有しないため、少なくとも、マレートチオキナーゼと、マリルＣｏＡリアーゼと、グリオキシル酸カルボリガーゼと、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ及び／又はヒドロキシピルビン酸レダクターゼを付与すればよい。

【0055】

前記アセチルＣｏＡを消費する酵素とは、アセチルＣｏＡを基質として別の物質と変換する酵素を指す。たとえば、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号６．４．１．２に分類され、アセチルＣｏＡをマロニルＣｏＡへと変換するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼや、酵素番号１．２．７．１に分類され、アセチルＣｏＡをピルビン酸へと変換するピルビン酸シンターゼが挙げられる。

【0056】

前記アセチルＣｏＡを消費する酵素を含む回路とは、アセチルＣｏＡを消費する酵素によりアセチルＣｏＡが、回路を経由して再びアセチルＣｏＡへと戻るような、閉じられた回路を指す。なお、アセチルＣｏＡを消費する酵素により変換された物質が、アセチルＣｏＡに戻ること無く別の生産物へと変換される場合（たとえば、イソプロピルアルコール生産経路で、最終産物としてイソプロピルアルコールに変換される場合）、閉じられた回路ではないため、「アセチルＣｏＡを消費する酵素を含む回路」には含まれない。

【0057】

前記閉じられた回路とは、回路上の任意の物質から開始して、回路を経由して別の物質へと変換され、最終的に最初と同じ物質へと変換される経路を指す。

【0058】

前記マレートチオキナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号６．２．１．９に分類され、リンゴ酸とＣｏＡを結合させ、マリルＣｏＡへと変換する酵素の総称である。反応の際、１分子のＡＴＰを消費し、１分子のＡＤＰとリン酸を生成する。本酵素は４００アミノ酸程度のｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔと３００アミノ酸ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔから構成される。遺伝子上には、通常、ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ、ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔという順番で存在する。本特許では、便宜上、ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔをｍｔｋＢ、ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔをｍｔｋＡと呼ぶ。本酵素の比活性としては、たとえば精製酵素で２．５Ｕ／ｍｇという例が報告されている（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２７（２）， ３６３−３６７ （１９９５））。

【0059】

本酵素はメタンなどのＣ１炭素源の資化経路（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６（２３）， ７３９８−７４０４ （１９９４））や３−ヒドロキシプロピオン酸経路（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １５１、２５２−２５６（１９８９））に主に見られる酵素で、ゲノム上の近傍には、マリルＣｏＡリアーゼが存在するという特徴がみられ、そのような酵素であれば好適に使用できる。精製酵素で活性を評価した例は、メチロバクテリウム・エクストロクエンス由来のマレートチオキナーゼで知られているが、実際の配列と活性を対比させた例は少なく、活性と配列を同時に評価した例は、唯一、メチロバクテリウム・エクストロクエンスＡＭ１株由来酵素（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＡＡ６２６５４およびＡＡＡ６２６５５）だけである（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６（２３）， ７３９８−７４０４ （１９９４））。この文献では、遺伝子をクローニングして、それを同じメチロバクテリウム・エクストロクエンスに導入して、活性を評価している。ところが、われわれが実際にこの配列を合成して評価しても、活性は認められなかった。そこで、ＡＡＡ６２６５５の配列と、本発明で改めて取得したメチロバクテリウム・エクストロクエンス由来のマレートチオキナーゼ配列（配列番号７０）と比較すると、ＡＡＡ６２６５５はカルボン酸末端が大幅（３６アミノ酸）に欠失しており、他のマレートチオキナーゼの配列（たとえば図３）と比較しても異常に短いことから、誤った不活性型の配列が記載されていると考えられる。

【0060】

したがって、実際にマレートチオキナーゼをクローニングして、異種微生物から発現させ、活性と配列とを対応させて報告した例は、事実上、本発明が初めてである。
マレートチオキナーゼは、例えば、メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）等のメチロバクテリウム属由来（配列番号７０及び７１）、ハイホマイクロビウム・メチロボラム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｍ）、ハイホマイクロビウム デニトリフィカンス（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）等のハイホマイクロビウム属由来、リゾビウム・エスピー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ）ＮＧＲ２３４等のリゾビウム属由来、グラニュリバクター ベセスデンシス（Ｇｒａｎｕｌｉｂａｃｔｅｒ ｂｅｔｈｅｓｄｅｎｓｉｓ）等のグラニュリバクター属由来（配列番号１０７及び１０８）、ニトロソモナス ユーロピア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ）等のニトロソモナス属由来、メチロコッカス キャプスラタス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）等のメチロコッカス属由来、ガンマプロテオバクテリア界由来のものが挙げられる。

【0061】

アセチルＣｏＡを経由する有用物質の生産効率の観点から、特に好ましくはハイホマイクロビウム属由来のアミノ酸配列（配列番号７３及び７４、１１０及び１１１）、リゾビウム属由来のアミノ酸配列（配列番号７５及び７６）、ニトロソモナス属由来のアミノ酸配列（配列番号１１３及び１１４）、メチロコッカス属由来のアミノ酸配列（配列番号１１６、１１７）、及びガンマプロテオバクテリア界由来のアミノ酸配列（例えば配列番号１１８、１１９）が例示される。
ハイホマイクロビウム属由来のマレートチオキナーゼ（配列番号７３、７４及び１１０及び１１１）、リゾビウム属由来のマレートチオキナーゼ（配列番号７５及び７６）及びニトロソモナス属由来のマレートチオキナーゼ（配列番号１１３及び１１４）は、６５％〜８０％の相同性を有する。また、メチロコッカス属由来のマレートチオキナーゼ（配列番号１１６、１１７）は、ガンマプロテオバクテリア界由来のマレートチオキナーゼ（例えば配列番号１１８、１１９）と７０％〜８０％の相同性を有する。
本発明において開示されているハイホマイクロビウム属由来のマレートチオキナーゼ、リゾビウム属由来のマレートチオキナーゼ、ニトロソモナス属由来のマレートチオキナーゼ、メチロコッカス属由来のマレートチオキナーゼ、ガンマプロテオバクテリア界由来のマレートチオキナーゼに対し、それぞれのアミノ酸配列において７０％以上のホモロジーを持ち、かつマレートチオキナーゼ活性を有するマレートチオキナーゼは、本発明のアセチルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡに由来する有用な産物の生産に好適に使用できる。

【0062】

実施例に示したマレートチオキナーゼのアライメント結果を図２Ａ及び図２Ｂ（ＭｔｋＢ：ｍｔｋのｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）（以下、図２Ａ及び図２Ｂを合わせて「図２」と称する。）及び図３Ａ及び図３Ｂ（ＭｔｋＡ：ｍｔｋのｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ）（以下、図３Ａ及び図３Ｂを合わせて「図３」と称する。）に示した。図２及び図３に示すとおり、マレートチオキナーゼは同一のアミノ酸もしくは類似のアミノ酸で保存された相同性の高い共通配列を全体的に保持していることが明らかになった。

【0063】

メチロバクテリウム・エクストルクエンス（図２及び図３中ではＭｅと表記）、酵素活性の高いリゾビウム エスピー（図２及び図３中ではＲｈと表記）、ハイホマイクロビウム・メチロボラム（図２及び図３中ではＨｍｅと表記）、ハイホマイクロビウム デニトリフィカンス（図２及び図３中ではＨｄと表記）、ニトロソモナス ユーロピア（図２及び図３中ではＮｅと表記）、メチロコッカス キャプスラタス（図２及び図３中ではＭｃと表記）及びガンマプロテオバクテリア界由来のマレートチオキナーゼ（図２及び図３中ではｇａｍと表記）を以下に示す第一のグループから第四のグループの４つのグループに分類し、図２及び図３にそれぞれのグループを「．＋＃＊」の４種の記号で示した。

【0064】

第一のグループはメチロバクテリウム・エクストルクエンスと、酵素活性の高いリゾビウム エスピー、ハイホマイクロビウム・メチロボラム、ハイホマイクロビウム・デニトリフィカンス、ニトロソモナス ユーロピア、メチロコッカス キャプスラタス及びガンマプロテオバクテリアとを比較した場合に異なる配列を持つ部位であり、図２及び図３に「．」の記号で示した。配列の位置をメチロバクテリウム・エクストルクエンスのアミノ酸の配列番号にそって記載する。

【0065】

ＭｔｋＢ（図２）では、１８番目のヒスチジン、プロリンもしくはリジン、２１番目のアルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸もしくはアラニン、２６番目のチロシンもしくはヒスチジン、２９番目のグルタミン酸、アラニンもしくはアルギニン、３４番目のアルギニンもしくはバリン、３６番目のアルギニン、セリンもしくはグルタミン酸、４２番目のアルギニン、スレオニン、バリンもしくはグリシン、４４番目のバリン、６６番目のアスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシンもしくはロイシン、６７番目のヒスチジン、リジンもしくはグルタミン酸、７４番目のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸、７５番目のセリン、フェニルアラニン、アラニンもしくはグルタミン酸、８０番目のスレオニン、リジンもしくはヒスチジン、８４番目のヒスチジンもしくはプロリン、８９番目のグルタミン、アラニン、グリシンもしくはリジン、９２番目のロイシンもしくはバリン、１００番目のグルタミン酸、アラニンもしくはグルタミン、１０２番目のメチオニン、スレオニン、セリンもしくはバリン、１０３番目のアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、ヒスチジンもしくはセリン、１０４番目のイソロイシンもしくはプロリン、１０５番目のアラニン、アスパラギン酸、リジンもしくはグルタミン、１１２番目のフェニルアラニンもしくはロイシン、１２１番目のイソロイシン、１２２番目のメチオニン、バリンもしくはスレオニン、１２７番目のセリンもしくはアラニン、１２８番目のセリン、アラニン、グルタミンもしくはグルタミン酸、１３９番目のアラニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸もしくはアルギニン、１４４番目のイソロイシン、１４６番目のアルギニンもしくはリジン、１６６番目のグリシンもしくはアラニン、１７０番目のアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンもしくはアルギニン、１７１番目のアスパラギン、プロリン、アスパラギン酸もしくはグリシン、１７３番目のイソロイシンもしくはロイシン、１７５番目のグリシン、アスパラギン、プロリンもしくはアラニン、１７６番目のアルギニン、リジン、ヒスチジンもしくはグルタミン、１８３番目のグリシン、アラニンもしくはアルギニン、１８４番目のシステインもしくはイソロイシン、１９１番目のチロシン、ロイシンもしくはリジン、１９３番目のアラニン、２０６番目のアルギニン、グルタミン酸、アスパラギンもしくはセリン、２０７番目のグリシン、リジン、アスパラギン、グルタミン酸もしくはプロリン、２０８番目のアスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、セリンもしくはリジン、２３１番目のグルタミン酸、２３３番目のアルギニン、２３５番目のリジン、アスパラギンもしくはロイシン、２３８番目のグルタミン酸もしくはイソロイシン、２４３番目のスレオニン、イソロイシンもしくはバリン、２４４番目のチロシン、アラニンもしくはグルタミン酸、２４９番目のグリシン、２５６番目のアスパラギン酸、２５８番目のアスパラギンもしくはアスパラギン酸、２７８番目のイソロイシン、ロイシンもしくはフェニルアラニン、３００番目のリジンもしくはアスパラギン、３０７番目のスレオニン、アルギニン、アラニン、グルタミン酸もしくはグルタミン、３３６番目のロイシン、バリン、システインもしくはチロシン、３４０番目のグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミンもしくはアルギニン、３５８番目のアルギニンもしくはロイシン、３７５番目のアラニンもしくはアスパラギン酸、３７９番目のアスパラギン酸、リジン、グルタミン酸もしくはアラニン、３８５番目のトリプトファン、アラニン、アルギニンもしくはバリンが挙げられる。
ＭｔｋＡ（図３）では、１６番目のフェニルアラニン、１９番目のリジン、アルギニン、グルタミン酸もしくはグルタミン、２０番目のイソロイシンもしくはヒスチジン、３０番目のアルギニンもしくはアスパラギン酸、４６番目のグルタミン、スレオニンもしくはセリン、４７番目のアラニン、セリン、リジンもしくはアルギニン、４９番目のロイシンもしくはプロリン、５１番目のメチオニン、アルギニンもしくはロイシン、６７番目のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸、６８番目のアラニンもしくはバリン、７１番目のバリンもしくはイソロイシン、７４番目のプロリン、９０番目のイソロイシン、９３番目のシステイン、アラニンもしくはイソロイシン、９４番目のバリン、１１９番目のアスパラギン酸、アラニンもしくはセリン、１２１番目のメチオニン、セリンもしくはシステイン、１２４番目のイソロイシン、スレオニンもしくはロイシン、１３７番目のアラニンもしくはシステイン、１５１番目のアルギニン、バリンもしくはアスパラギン、１５５番目のバリン、１７１番目のアラニン、アルギニンもしくはリジン、１９３番目のリジン、アルギニンもしくはバリン、１９５番目のメチオニン、バリンもしくはイソロイシン、１９７番目のグルタミン酸、グルタミン、アルギニンもしくはリジン、２２３番目のアラニンもしくはグリシン、２２４番目のロイシンもしくはアルギニン、２２６番目のアラニン、２３０番目のメチオニン、２５９番目のフェニルアラニン、アラニンもしくはグルタミン酸、２６７番目のバリンもしくはメチオニン、２７１番目のグルタミン酸もしくはリジン、２７３番目のアラニン、システインもしくはロイシン、２８０番目のスレオニンもしくはアスパラギン、２８２番目のセリンもしくはアラニン、２９４番目のアラニン、リジン、グルタミン、グリシンもしくはグルタミン酸、２９５番目のメチオニン、グルタミン、アルギニン、ロイシンもしくはヒスチジンが挙げられる。
これらのアミノ酸配列を１つ以上有するマレートチオキナーゼは、酵素活性の観点からより好適である。

【0066】

第二のグループはリゾビウム エスピー、ハイホマイクロビウム・メチロボラム、ハイホマイクロビウム デニトリフィカンス、ニトロソモナス ユーロピア、メチロコッカス キャプスラタス及びガンマプロテオバクテリア全てに特徴的な共通配列であり、図２及び図３に「＋」の記号で示した。特徴的な共通配列の位置をハイホマイクロビウム・メチロボラムのアミノ酸の配列番号にそって記載する。
ＭｔｋＢ（図２）の４３番目のバリン、１２０番目のイソロイシン、１４３番目のイソロイシン、１９２番目のアラニン、２３０番目のグルタミン酸、２３２番目のアルギニン、２４８番目のグリシン及び２５５番目のアスパラギン酸が挙げられる。
ＭｔｋＡ（図３）では１６番目のフェニルアラニン、７４番目のプロリン、９０番目のイソロイシン、９４番目のバリン、１５５番目のバリン、２２６番目のアラニン及び２３０番目のメチオニンが挙げられる。
これらの特徴的な共通配列、及び全体的に保存された共通配列以外の相同性のない部分には、変異が入っていても良い。これらのアミノ酸配列を有するマレートチオキナーゼは、酵素活性の観点からさらに好適である。

【0067】

第三のグループはリゾビウム エスピー、ハイホマイクロビウム・メチロボラム、ハイホマイクロビウム デニトリフィカンス及びニトロソモナス ユーロピアに特徴的な共通配列であり、図２及び図３に「＃」の記号で示した。特徴的な共通配列の位置をハイホマイクロビウム・メチロボラムのアミノ酸の配列番号にそって記載する。
ＭｔｋＢ（図２）の２９番目のグルタミン酸、３４番目のアルギニン、６８番目のイソロイシン、８３番目のヒスチジン、９１番目のロイシン、９５番目のロイシン、１０３番目のイソロイシン、１１１番目のフェニルアラニン、１４１番目のアスパラギン酸、１８２番目のグリシン、１８３番目のシステイン、２５２番目のバリン、２９９番目のリジン、３４５番目のバリン、３５４番目のグルタミン酸、３５７番目のアルギニン及び３７４番目のアラニンが挙げられる。
ＭｔｋＡ（図３）では２０番目のイソロイシン、６８番目のアラニン、９３番目のシステイン、１２１番目のメチオニン、１２３番目のロイシン、１３７番目のアラニン、２２４番目のロイシン、２３６番目のアラニン、２３７番目のチロシン、２３８番目のイソロイシン、２６１番目のグルタミン酸、２６７番目のバリン、２７０番目のロイシン、２７１番目のリジン、２７５番目のバリン、２７７番目のイソロイシン、２８０番目のスレオニン及び２８２番目のセリンが挙げられる。
これらの特徴的な共通配列、及び全体的に保存された共通配列以外の相同性のない部分には、変異が入っていても良い。これらのアミノ酸配列を有するマレートチオキナーゼは、酵素活性の観点からさらに好適である。

【0068】

第四のグループはメチロコッカス キャプスラタス及びガンマプロテオバクテリアに特徴的な共通配列であり、図２及び図３に「＊」の記号で示した。特徴的な共通配列の位置をメチロコッカス キャプスラタスのアミノ酸の配列番号にそって記載する。
ＭｔｋＢ（図２）の２番目のアスパラギン、１５番目のチロシン、１８番目のプロリン、２６番目のチロシン、２８番目のアスパラギン酸、３４番目のバリン、３６番目のグルタミン酸、３８番目のイソロイシン、５３番目のグリシン、６０番目のバリン、６３番目のアラニン、６５番目のセリン、６７番目のグルタミン酸、７４番目のアスパラギン酸、７６番目のメチオニン、１１４番目のイソロイシン、１１９番目のグルタミン、１２２番目のスレオニン、１２８番目のグルタミン酸、１３２番目のグルタミン酸、１３６番目のバリン、１４３番目のリジン、１４５番目のバリン、１４７番目のグルタミン酸、１５３番目のイソロイシン、１６０番目のシステイン、１６２番目のリジン、１６３番目のバリン、１６６番目のアラニン、１６７番目のイソロイシン、１７３番目のロイシン、１７４番目のメチオニン、１７６番目のグルタミン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のロイシン、１８１番目のメチオニン、１８４番目のイソロイシン、１９４番目のロイシン、１９５番目のグルタミン、２０３番目のイソロイシン、２０４番目のバリン、２０５番目のグリシン、２１１番目のロイシン、２１８番目のフェニルアラニン、２１９番目のアスパラギン、２３７番目のロイシン、２３９番目のグルタミン酸、２４０番目のグルタミン酸、２４５番目のバリン、２４６番目のグルタミン酸、２４９番目のグリシン、２５３番目のアスパラギン、２５６番目のアラニン、２７７番目のアラニン、２８１番目のヒスチジン、２９８番目のグルタミン酸、２９９番目のリジン、３０２番目のアスパラギン、３０４番目のシステイン、３０６番目のイソロイシン、３３０番目のイソロイシン、３３４番目のロイシン、３３６番目のグルタミン、３４０番目のセリン、３４１番目のロイシン、３７０番目のフェニルアラニン、３７５番目のアスパラギン、３７７番目のアスパラギン酸、３７８番目のアスパラギン酸、３８１番目のアラニン及び３８６番目のイソロイシンが挙げられる。
ＭｔｋＡ（図３）では４番目のフェニルアラニン、５番目のバリン、６番目のアスパラギン、８番目のヒスチジン、９番目のセリン、１１番目のバリン、１２番目のイソロイシン、２０番目のヒスチジン、２８番目のアラニン、３０番目のアルギニン、３３番目のスレオニン、５６番目のロイシン、６０番目のアスパラギン酸、７２番目のアスパラギン酸、７３番目のバリン、９１番目のイソロイシン、９６番目のアルギニン、９７番目のバリン、１０２番目のアラニン、１０７番目のバリン、１１１番目のイソロイシン、１１４番目のグルタミン、１１７番目のアルギニン、１１９番目のグリシン、１２１番目のアスパラギン酸、１２９番目のスレオニン、１３０番目のプロリン、１３４番目のスレオニン、１３７番目のグルタミン酸、１３８番目のシステイン、１３９番目のリジン、１４０番目のバリン、１６３番目のアスパラギン、１６８番目のグルタミン酸、１７５番目のロイシン、１９１番目のスレオニン、１９２番目のアスパラギン酸、１９４番目のバリン、１９５番目のスレオニン、１９６番目のバリン、１９９番目のアラニン、２１０番目のバリン、２２１番目のバリン、２２２番目のアラニン、２２４番目のアラニン、２２５番目のアルギニン、２２７番目のアラニン、２６０番目のグルタミン酸、２６３番目のスレオニン、２６６番目のアラニン、２６８番目のメチオニン、２６９番目のアスパラギン酸、２７０番目のアラニン、２７２番目のグルタミン酸、２７４番目のロイシン、２７７番目のチロシン、２８０番目のアルギニン、２８１番目のアスパラギン、２８３番目のアラニン、２８５番目のイソロイシン、２９０番目のロイシン、２９１番目のアルギニン、２９２番目のアラニン、２９５番目のグルタミン酸が挙げられる。
これらの特徴的な共通配列、及び全体的に保存された共通配列以外の相同性のない部分には変異が入っていても良い。
これらのアミノ酸配列を有するマレートチオキナーゼは、酵素活性の観点から最も好適である。

【0069】

前記マレートチオキナーゼの遺伝子（ｍｔｋ）としては、上述した各由来生物から得られるマレートチオキナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。
好適なものとしては、メチロバクテリウム・エクストルクエンス等のメチロバクテリウム属由来（配列番号６７及び６８）、ハイホマイクロビウム メチロボラム、ハイホマイクロビウム デニトリフィカンス等のハイホマイクロビウム属由来、リゾビウム エスピー ＮＧＲ２３４等のリゾビウム属由来、グラニュリバクター ベセスデンシス等のグラニュリバクター属由来、ニトロソモナス ユーロピア等のニトロソモナス属由来、メチロコッカス キャプスラタス等のメチロコッカス属由来、ガンマプロテオバクテリア界由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
アセチルＣｏＡの生産効率の観点から、好ましくはハイホマイクロビウム属由来（配列番号６１及び６２、配列番号８６及び８７）、リゾビウム属由来（例えば、配列番号６３）、グラニュリバクター属由来（配列番号８１及び８２）、ニトロソモナス属由来（配列番号９１及び９２）、メチロコッカス属由来（配列番号９６及び９７）、ガンマプロテオバクテリア界由来の遺伝子の塩基配列（配列番号１０２及び１０３）を有するＤＮＡが例示される。
特に好ましくはハイホマイクロビウム属由来遺伝子の塩基配列（配列番号６１及び６２、配列番号８６及び８７）、及びコドンを最適化したリゾビウム属由来の遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号６３）、ニトロソモナス属由来の遺伝子の塩基配列（配列番号９１及び９２）、メチロコッカス属由来の遺伝子の塩基配列（配列番号９６及び９７）、ガンマプロテオバクテリア界由来の遺伝子の塩基配列（配列番号１０２及び１０３）が例示される。

【0070】

前記マリルＣｏＡリアーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号４．１．３．２４に分類され、マリルＣｏＡからグリオキシル酸とアセチルＣｏＡを生成する酵素である。例えば、メチロバクテリウム・エクストルクエンス等のメチロバクテリウム属由来、ハイホマイクロビウム・メチロボラム、 ハイホマイクロビウム デニトリフィカンス等のハイホマイクロビウム属由来、クロロフレクサス・アウランチアクス等のクロロフレクサス属由来、ニトロソモナス ユーロピア等のニトロソモナス属由来、メチロコッカス キャプスラタス等のメチロコッカス属由来のものが挙げられる。
アセチルＣｏＡの生産効率の観点から、特に好ましくはメチロバクテリウム属由来のアミノ酸配列（配列番号６９）ハイホマイクロビウム属由来のアミノ酸配列（配列番号７２及び１０９）、ニトロソモナス属由来のアミノ酸配列（配列番号１１２）、メチロコッカス属由来のアミノ酸配列（配列番号１１５）が例示される。
マリルＣｏＡリアーゼの比活性としては、たとえば、メチロバクテリウム・エクストロクエンスにおいて、精製酵素として２８．１Ｕ／ｍｇという報告がある（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３９， ３９９−４０５， （１９７４））。

【0071】

前記マリルＣｏＡリアーゼの遺伝子（ｍｃｌ）としては、上述した各由来生物から得られるマリルＣｏＡリアーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。
好適なものとしては、メチロバクテリウム・エクストルクエンス等のメチロバクテリウム属由来、ハイホマイクロビウム・メチロボラム、ハイホマイクロビウム デニトリフィカンス等のハイホマイクロビウム属由来、クロロフレクサス・アウランチアクス等のクロロフレクサス属由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。アセチルＣｏＡの生産効率の観点から、特に好ましくはメチロバクテリウム属由来の遺伝子、及びハイホマイクロビウム属由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
特に好ましいメチロバクテリウム属由来の遺伝子の塩基配列の一例としては、メチロバクテリウム・エクストルクエンス由来遺伝子の塩基配列（配列番号６６）、ハイホマイクロビウム属由来の遺伝子の塩基配列の一例としては、ハイホマイクロビウム・メチロボラム由来遺伝子の塩基配列（配列番号６０）、ハイホマイクロビウム デニトリフィカンス由来遺伝子の塩基配列（配列番号８５）、ニトロソモナス属由来の遺伝子の塩基配列の一例としては、ニトロソモナス ユーロピア由来遺伝子の塩基配列（配列番号９０）、メチロコッカス属由来の遺伝子の塩基配列の一例としては、メチロコッカス キャプスラタス由来遺伝子の塩基配列（配列番号９５）が挙げられる。

【0072】

前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号６．４．１．２に分類され、アセチルＣｏＡとＣＯ_２からマロニルＣｏＡへと変換する酵素の総称を指す。
前記マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号１．２．１．１８に分類され、マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒドへと変換する酵素の総称を指す。
前記マロニルＣｏＡレダクターゼとは、マロニルＣｏＡをマロン酸セミアルデヒドもしくは３−ヒドロキシプロピオン酸へと変換する酵素の総称を指す。
前記クロトニルＣｏＡカルボキラーゼ−レダクターゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号１．３．１．８５に分類され、クロトニルＣｏＡをエチルマロニルＣｏＡへと変換する酵素の総称を指す。
前記メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号６．４．１．４に分類され、クロトニルＣｏＡをグルタコニルＣｏＡへと変換する酵素の総称を指す。
前記ピルビン酸シンターゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号１．２．７．１に分類され、アセチルＣｏＡをピルビン酸へと変換する酵素の総称を指す。

【0073】

前記アセチルＣｏＡ生産微生物は、更に、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸シンターゼ、及びフマル酸ヒドラターゼからなる群より選択された少なくとも１つの酵素の活性が不活化又は低減されていることが好ましい。これにより、より効率よくアセチルＣｏＡを生産することができる。

【0074】

活性の不活化又は低減の対象となりうる乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸シンターゼ、及びフマル酸ヒドラターゼの各酵素のうち、リンゴ酸シンターゼは、アセチルＣｏＡとグリオキシル酸をリンゴ酸へと変換する反応であり、マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼによる反応の逆反応であり、アセチルＣｏＡとグリオキシル酸がリンゴ酸へと戻る反応が阻止または低減されるため、アセチルＣｏＡの収率向上につながり、好ましい。

【0075】

また、活性の不活化又は低減の対象となりうる乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸シンターゼ、及びフマル酸ヒドラターゼの各酵素のうち、フマル酸ヒドラターゼを不活化させることが、アセチルＣｏＡの生産効率の観点から好ましい。これにより、リンゴ酸がフマル酸をはじめとする他の物質へと変換されて量が減ることを防ぐことができ、アセチルＣｏＡの収率向上につながる。

【0076】

前記乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）は、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号１．１．１．２８に分類され、ピルビン酸を乳酸へと変換、もしくはその逆の変換をする酵素の総称を指す。

【0077】

前記イソクエン酸リアーゼ（ａｃｅＡ）は、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号４．１．３．１に分類され、イソクエン酸をコハク酸とグリオキシル酸へと変換する酵素の総称を指す。

【0078】

前記リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢおよびｇｌｃＢ）は、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号２．３．３．９に分類され、アセチルＣｏＡとグリオキシル酸をリンゴ酸とＣｏＡへと変換する酵素の総称を指す。リンゴ酸シンターゼは微生物によって、複数個のアイソマーをゲノム中に有する場合もある。大腸菌の多くは、ａｃｅＢおよびｇｌｃＢの２種類の名称の遺伝子を保有するので、本特許では両方とも記載する。なお、パントエア・アナナティスおよびコリネバクテリウム・グルタミカムには、ａｃｅＢもしくはｇｌｃＢに相当する遺伝子が一種類存在するが、本特許では便宜上ａｃｅＢに統一して記載する。

【0079】

前記フマル酸ヒドラターゼ（ｆｕｍ）は、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号４．２．１．２に分類され、リンゴ酸をフマル酸へと変換する酵素の総称を指す。フマル酸ヒドラターゼは、微生物によって、複数個のアイソマーをゲノム中に有している場合もある。たとえば、大腸菌はｆｕｍＡ，ｆｕｍＢ，ｆｕｍＣの三種類のフマル酸ヒドラターゼを保有している。パントエア・アナナティスはｆｕｍＡ，ｆｕｍＣを保有している。コリネバクテリウム・グルタミカムはｆｕｍＣを保有している。

【0080】

前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号４．１．１．３１に分類され、ホスホエノールピルビン酸と二酸化炭素をオキサロ酢酸とリン酸へと変換する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌、ハイホマイクロビウム・メチロボラム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｍ）等のハイホマイクロビウム属細菌、スタルケヤ・ノベラ（Ｓｔａｒｋｅｙａ ｎｏｖｅｌｌａ）等のスタルケヤ属細菌、ロドシュードモナス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）等のロドシュードモナス属細菌、ストレプトマイセス・コエリカラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）等のストレプトマイセス属細菌由来のものが挙げられる。

【0081】

前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの遺伝子（ｐｐｃ）としては、上述した各由来生物から得られるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌、ハイホマイクロビウム・メチロボラム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｍ）等のハイホマイクロビウム属細菌、スタルケヤ・ノベラ（Ｓｔａｒｋｅｙａ ｎｏｖｅｌｌａ）等のスタルケヤ属細菌、ロドシュードモナス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）等のロドシュードモナス属細菌、ストレプトマイセス・コエリカラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）等のストレプトマイセス属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【0082】

前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号４．１．１．３２、酵素番号４．１．１．３８、酵素番号４．１．１．４９、に分類され、ホスホエノールピルビン酸と二酸化炭素をオキサロ酢酸へと変換する酵素の総称を指す。その際、酵素番号４．１．１．３２はＧＤＰをＧＴＰに変換する反応、酵素番号４．１．１．３８はリン酸をピロリン酸に変換する反応、酵素番号４．１．１．４９はＡＤＰをＡＴＰに変換する反応、をそれぞれ伴っている。例えば、アクチノバチルス・スクシノジェンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）等のアクチノバチルス属細菌、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）等のマイコバクテリウム属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）等のトリパノソーマ属細菌由来のものが挙げられる。

【0083】

前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの遺伝子（ｐｃｋ）としては、上述した各由来生物から得られるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アクチノバチルス・スクシノジェンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）等、アクチノバチルス属、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）等のマイコバクテリウム属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）等のトリパノソーマ属細菌由来のものが挙げられる。

【0084】

前記ピルビン酸カルボキシラーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号６．４．１．１に分類され、ピルビン酸と二酸化炭素をオキサロ酢酸へと変換する酵素の総称を指す。反応の際、ＡＴＰを消費し、ＡＤＰとリン酸を生成する。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）等のマイコバクテリウム属細菌由来のものが挙げられる。

【0085】

前記ピルビン酸カルボキシラーゼの遺伝子（ｐｙｃ）としては、上述した各由来生物から得られるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）等のマイコバクテリウム属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【0086】

前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号１．１．１．３７に分類され、ＮＡＤＨを補酵素として用い、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子（ｍｄｈ）としては、上述した各由来生物から得られるリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【0087】

前記グリオキシル酸カルボリガーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号４．１．１．４７に分類され、２分子のグリオキシル酸を１分子の２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸へと変換する酵素の総称を指す。反応の際、１分子の二酸化炭素の脱炭酸を伴う。例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ロドコッカス・ジョスティ等のロドコッカス属細菌由来のものが挙げられる。
前記グリオキシル酸カルボリガーゼの遺伝子（ｇｃｌ）としては、上述した各由来生物から得られるグリオキシル酸カルボリガーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、ロドコッカス・ジョスティ等のロドコッカス属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【0088】

前記２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号１．１．１．６０に分類され、ＮＡＤＨを補酵素として用い、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸をグリセリン酸へと変換する酵素の総称を指す。例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
前記２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼの遺伝子（ｇｌｘＲ）としては、上述した各由来生物から得られる２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【0089】

前記ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号５．３．１．２２に分類され、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸をヒドロキシピルビン酸へと異性化する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来のものが挙げられる。
前記ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼの遺伝子（ｈｙｉ）としては、上述した各由来生物から得られるヒドロキシピルビン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【0090】

前記ヒドロキシピルビン酸レダクターゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号１．１．１．８１に分類され、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを補酵素として用い、ヒドロキシピルビン酸をグリセリン酸へと変換する酵素の総称を指す。
例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、およびパントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来のものが挙げられる。
前記ヒドロキシピルビン酸レダクターゼの遺伝子（ｙｃｄＷ）としては、上述した各由来生物から得られるヒドロキシピルビン酸レダクターゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、およびパントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【0091】

前記グリセリン酸３−キナーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号２．７．１．３１に分類され、グリセリン酸を３−ホスホグリセリン酸へと変換する酵素の総称を指す。１分子のＡＴＰを消費し、１分子のＡＤＰとリン酸を生成する。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
本発明におけるグリセリン酸３−キナーゼの遺伝子（ｇｌｘＫ）としては、上述した各由来生物から得られるグリセリン酸３−キナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【0092】

前記グリセリン酸２−キナーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号２．７．１．１６５に分類され、グリセリン酸を２−ホスホグリセリン酸へと変換する酵素の総称を指す。１分子のＡＴＰを消費し、１分子のＡＤＰとリン酸を生成する。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
本発明におけるグリセリン酸２−キナーゼの遺伝子（ｇａｒＫ）としては、上述した各由来生物から得られるグリセリン酸２−キナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【0093】

前記ホスホグリセリン酸ムターゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号５．４．２．１に分類され、３−ホスホグリセリン酸を２−ホスホグリセリン酸へと変換する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来のものが挙げられる。
前記ホスホグリセリン酸ムターゼの遺伝子（ｇｐｍ）としては、上述した各由来生物から得られるホスホグリセリン酸ムターゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【0094】

前記エノラーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号４．２．１．１１に分類され、２−ホスホグリセリン酸をホスホエノールピルビン酸へと変換する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来のものが挙げられる。
前記エノラーゼの遺伝子（ｅｎｏ）としては、上述した各由来生物から得られるエノラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【0095】

前記ピルビン酸キナーゼは国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した、酵素番号２．７．１．４０に分類され、ホスホエノールピルビン酸とＡＤＰからピルビン酸とＡＴＰを生成する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来のものが挙げられる。
前記ピルビン酸キナーゼの遺伝子（ｐｙｋ）としては、上述した各由来生物から得られるピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【0096】

前記アセチルＣｏＡ生産微生物は、アセチルＣｏＡを有用な代謝産物へと変換する経路に加えて、アセチルＣｏＡを原料とする他の代謝産物を生産する経路を有していてもよく、又は当該他の代謝産物を生産する経路に関連する酵素活性を強化していてもよい。これにより、アセチルＣｏＡに由来する有用な代謝産物を、炭素源材料及び二酸化炭素から生成すると共にアセチルＣｏＡに由来する有用な代謝産物の生産性を向上させることができる。

【0097】

本発明で用いられる微生物は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれをも有していない微生物であれば特に制限はされない。
（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３−ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ_２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ_２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｄ）ＣＯ_２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
（ｅ）マレートチオキナーゼと、マリルＣｏＡリアーゼとからなる群より選択された少なくとも１種。

【0098】

例えば、腸内細菌科に属する微生物又はコリネ型細菌に属する微生物が挙げられる。具体的には、エシェリヒア属細菌やパントエア属細菌などの腸内細菌科に属する微生物、コリネバクテリウム属細菌やブレビバクテリウム属細菌などのコリネ型細菌に属する微生物、糸状菌、放線菌等が挙げられる。
腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター属、エルビニア属、エシェリヒア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、モルガネラ属、エルウィニア属等に属する菌が挙げられる。中でも、有用な代謝産物を効率的に生産できるという観点から、エシェリヒア属又はパントエア属に属する微生物が好ましい。
コリネバクテリウム属細菌としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムなどが挙げられる。

【0099】

エシェリヒア属細菌としては、特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）、エシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５ （ＡＴＣＣ ４７０７６）、プロトタイプの野生株Ｂ株由来のエシェリヒア・コリ Ｂ （ＡＴＣＣ １１３０３）等が挙げられる。

【0100】

エシェリヒア属細菌及びパントエア属細菌は、いずれも腸内細菌科に属し、非常に近縁である（Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４３（６） ３５５−３６１ （１９９７）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｐ１０６１−１０６７ （１９９７））。
近年、エンテロクター属に属する菌には、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）又はパントエア・ディスパーサ（Ｐａｎｔｏｅａ ｄｉｓｐｅｒｓａ）等に再分類されているものがある（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｊｕｌｙ ３９（３） ３３７−３４５ （１９８９））。
また、エルビニア属に属する菌にはパントエア・アナナス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｓ）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ４３（１）， １６２−１７３ （１９９３））。
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開９５２２２１号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスＡＴＣＣ１２２８７株が挙げられる。

【0101】

パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
・パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）（欧州特許出願公開０９５２２２１号明細書）
・パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５）（欧州特許出願公開０９５２２２１号明細書）
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開０９５２２２１号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。

【0102】

本発明のコリネ型細菌とは、Ｂｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ８， ５９９ （１９７４）に定義される、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、またはミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物等をいう。
また、これまでブレビバクテリウム属に分類されていたが、その後コリネバクテリウム属に再分類されている微生物（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ４１， ２５５（１９９１））、および類縁菌であるブレビバクテリウム属に属する微生物も挙げられる。以下にコリネ型細菌の例を列挙する。
例えば、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、コリネバクテリウム・アルカノリティカム、コリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・リリウム、コリネバクテリウム・メラセコーラ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバクテリウム・ディバリカタム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・ロゼウム、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・アルバム、ブレビバクテリウム・セリヌム、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラムが挙げられる。

【0103】

特に、以下の菌株を包含する。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０、コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）、コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８、ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７、ＡＪ１２４１８（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２０５）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７１、ＡＴＣＣ６８７２、ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２及びミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４を包含する。

【0104】

微生物が、エシェリヒア属細菌である場合には、エシェリヒア属細菌に、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が付与または強化されたアセチルＣｏＡ生産微生物が、本発明におけるアセチルＣｏＡ生産微生物の好ましい一態様として挙げられる。
また、微生物が、エシェリヒア属細菌である場合には、エシェリヒア属細菌に、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が付与または強化されたアセチルＣｏＡ生産微生物も、本発明におけるアセチルＣｏＡ生産微生物の好ましい一態様として挙げられる。

【0105】

前記チオラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．９に分類され、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）細菌、ズーグロア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ）等のズーグロア属細菌、リゾビウム種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｌｉｎｕｓ）等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）等のエンテロコッカス属細菌由来のものが挙げられる。

【0106】

前記チオラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種の細菌、ズーグロア・ラミゲラ等のズーグロア属細菌、リゾビウム種の細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス等のエンテロコッカス属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌、及びエシェリヒア属細菌などの原核生物に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

【0107】

前記アセト酢酸デカルボキシラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号４．１．１．４に分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）等のバチルス属細菌由来のものが挙げられる。

【0108】

前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌に由来するもの、及びバチルス属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム、バチルス・ポリミクサ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

【0109】

前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡを利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌に由来するもの、及びバチルス属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム、バチルス・ポリミクサ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

【0110】

前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．８０に分類され、アセトンからイソプロピルアルコールを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌由来のものが挙げられる。

【0111】

前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡを利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

【0112】

前記ＣｏＡトランスフェラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．８．３．８に分類され、アセトアセチルＣｏＡからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：大腸菌）等エシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。

【0113】

前記ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ等のファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌及びエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム及びエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

【0114】

上記４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、なかでも、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼがクロストリジウム属細菌由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア属細菌由来である場合が更に好ましい。

【0115】

なかでも上記４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジュリンキ又はエシェリヒア・コリのいずれか由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、アセト酢酸デカルボキシラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼが、それぞれクロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の酵素であり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼが、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素であることがより好ましく、上記４種類の酵素は、酵素活性の観点から、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来であり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来であることが特に好ましい。

【0116】

大腸菌由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ａｔｏＤ及びａｔｏＡ）とチオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）は、ａｔｏＤ、ａｔｏＡ、ａｔｏＢの順番で大腸菌ゲノム上でオペロンを形成しているため（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｅｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１６９ ｐｐ ４２−５２ Ｌａｕｒｅｎ Ｓａｌｌｕｓ Ｊｅｎｋｉｎｓら）、ａｔｏＤのプロモーターを改変することによって、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子とチオラーゼ遺伝子の発現を同時に制御することが可能である。

【0117】

このことから、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が宿主大腸菌のゲノム遺伝子より得られたものである場合、充分なイソプロピルアルコール生産能力を獲得する観点から、両酵素遺伝子の発現を担うプロモーターを他のプロモーターと置換する等によって両酵素遺伝子の発現を増強することが好ましい。ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の発現を増強するために用いられるプロモーターとしては、前述のエシェリヒア・コリ由来ＧＡＰＤＨプロモーター等を挙げることができる。

【0118】

アセチルＣｏＡを原料として他の代謝産物を生産するアセチルＣｏＡ生産微生物としては、例えば、イソプロピルアルコール生産系を有する大腸菌（以下、「イソプロピルアルコール生産大腸菌」という。）を宿主として、上述した各酵素活性を、付与又は強化し、或いは不活性化又は低減した微生物等を挙げることができる。

【0119】

前記イソプロピルアルコール生産大腸菌としては、イソプロピルアルコール生産能を付与する各遺伝子の導入及び変更が可能であればいずれの大腸菌であってもよい。
より好ましくは、イソプロピルアルコール生産能が予め付与された大腸菌であることができ、これにより、より効率よくイソプロピルアルコールを生産させることができる。
このようなイソプロピルアルコール生産大腸菌としては、例えば国際公開第２００９／００８３７７号パンフレットに記載されているアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成大腸菌などを挙げることができる。その他、国際公開第２００９／０９４４８５号パンフレット、国際公開第２００９／０９４４８５号パンフレット、国際公開第２００９／０４６９２９号パンフレット、国際公開第２００９／０４６９２９号パンフレットに記載の微生物も、イソプロピルアルコール生産大腸菌の例として挙げられる。

【0120】

前記イソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコール生産経路を備えた大腸菌であり、遺伝子組換え技術により導入されたイソプロピルアルコール生産能力を保有する大腸菌をいう。このようなイソプロピルアルコール生産系は、対象となる大腸菌にイソプロピルアルコールを生産させるものであればいずれのものであってもよい。
本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及び前述したチオラーゼ活性の４種類の酵素活性が、細胞外から付与されていることが好ましい。

【0121】

本発明において、イソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌の例として、ＷＯ２００９／００８３７７号に記載のｐＩＰＡ／Ｂ株又はｐＩａａａ／Ｂ株を例示できる。また、該大腸菌には、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素のうち、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性とチオラーゼ活性の強化は該大腸菌のゲノム上の各遺伝子の発現を強化することで行い、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性とアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性の強化は各遺伝子の発現をプラスミドで強化した株（本明細書では、ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株と呼ぶことがある）を含む。

【0122】

更に、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、転写抑制因子ＧｎｔＲの活性が不活化されていると共に、イソプロピルアルコール生産系と、該ＧｎｔＲの活性の不活性化に伴うイソプロピルアルコール生産能を維持又は強化する酵素活性パターンの補助酵素群とを備えたイソプロピルアルコール生産大腸菌であってもよい。これにより、イソプロピルアルコールをよりいっそう高生産することができる。

【0123】

本発明における「補助酵素群」とは、このようなイソプロピルアルコール生産能に影響する１つ又は２つ以上の酵素を指す。また、補助酵素群のそれぞれの酵素活性は、不活化、活性化又は強化されており、本発明における「補助酵素群の酵素活性パターン」とは、ＧｎｔＲの活性を不活性化したことのみによって得られる向上したイソプロピルアルコール生産量が、維持又は増加し得る各酵素の酵素活性パターンを指し、１つ又は２つ以上の酵素の組み合わせを包含する。

【0124】

補助酵素群の酵素活性パターンとしては、好ましくは、以下のパターンを挙げることができる：
（１）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性の野生型の維持、
（２）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性の不活性化と、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性の強化、
（３）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性の不活性化と、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性の強化と、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性の不活性化。
なかでも、上記（３）の補助酵素群の酵素活性パターンがイソプロピルアルコール生産能の観点からより好ましい。

【0125】

なお、前記補助酵素群及びその酵素活性パターンは、これらに限定されず、ＧｎｔＲの活性の不活性化を含み、イソプロピルアルコール生産大腸菌におけるイソプロピルアルコール生産量が増加し得る補助酵素群及びその酵素活性パターンであれば、いずれも本発明に包含される。また、補助酵素群は、必ずしも複数の酵素で構成されている必要はなく、１の酵素で構成していてもよい。

【0126】

前記ＧｎｔＲとは、エントナー・ドウドロフ経路を経由したグルコン酸代謝に関与するオペロンを負に制御する転写因子を指す。グルコン酸の取り込みと代謝を担う二つの遺伝子群（ＧｎｔＩとＧｎｔＩＩ）の働きを抑制するＧｎｔＲ転写抑制因子の総称を指す。
前記グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号５．３．１．９に分類され、Ｄ−グルコース−６−リン酸からＤ−フルクトース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。

【0127】

前記グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．４９に分類され、Ｄ−グルコース−６−リン酸からＤ−グルコノ−１，５−ラクトン−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、ディノコッカス・ラジオフィラス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ）等のディノコッカス属菌、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アキュリタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）等のアスペルギルス属菌、アセトバクター・ハンセニー（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｎｓｅｎｉｉ）等のアセトバクター属菌、サーモトガ・マリチナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）等のサーモトガ属菌、クリプトコッカス ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）等のクリプトコッカス属菌、ディクチョステリウム・ディスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）等のディクチョステリウム属菌、シュードモナス・フルオセセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等のシュードモナス属、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス属、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）等のバチルス属菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。

【0128】

前記グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、ディノコッカス・ラジオフィラス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ）等のディノコッカス属菌、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アキュリタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）等のアスペルギルス属菌、アセトバクター・ハンセニー（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｎｓｅｎｉｉ）等のアセトバクター属菌、サーモトガ・マリチナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）等のサーモトガ属菌、クリプトコッカス ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）等のクリプトコッカス属菌、ディクチョステリウム・ディスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）等のディクチョステリウム属菌、シュードモナス・フルオセセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等のシュードモナス属、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス属、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）等のバチルス属菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、ディノコッカス属菌、アスペルギルス属菌 、アセトバクター属菌、サーモトガ属菌、シュードモナス属、のバチルス属菌、エシェリヒア属細菌などの原核生物に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

【0129】

前記ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．４４に分類され、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸からＤ−リブロース−５−リン酸とＣＯ_２を生成する反応を触媒する酵素の総
称を指す。

【0130】

本発明におけるこれらの酵素の活性は、細胞外から細胞内へ導入されたもの又は、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものとすることができる。

【0131】

本発明において酵素の活性を強化した大腸菌とは、何らかの方法によって該酵素活性が強化された大腸菌を指す。これらの大腸菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を、前述したものと同様の遺伝子組換え技術を用いて細胞外から細胞内にプラスミドを用いて導入する又は、宿主大腸菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させる、又はこれらの組み合わせ等の方法を用いて作出することができる。

【0132】

前記イソプロピルアルコール生産大腸菌に適用可能な遺伝子のプロモーターとは、上記いずれかの遺伝子の発現を制御可能なものであればよいが、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターがよい。具体的にはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターを例示することができる。

【0133】

前記イソプロピルアルコール生産大腸菌におけるプロモーターとはシグマ因子を有するＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のＧＡＰＤＨプロモーターはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、塩基番号３９７〜４４０に記されている。

【0134】

前記イソプロピルアルコール生産大腸菌においては、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）が破壊されていてもよい。これにより、酸素供給が制限された培養条件下においても乳酸の生産が抑制されるため、イソプロピルアルコールを効率よく生産することができる。 酸素供給が制限された培養条件とは、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に０．０２ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）、回転数２００〜６００ｒｐｍのことをいう。
前記乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）とは、ピルビン酸とＮＡＤＨからＤ−乳酸とＮＡＤを生成する酵素を指す。

【0135】

なお、前記アセチルＣｏＡ生産微生物は、アセトンを生産する場合、イソプロピルアルコール生産系のうち、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性のみを有することができる。即ち、前記アセチルＣｏＡ生産微生物を用いてアセトンを生産する場合には、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有していないものも使用することができる。

【0136】

アセチルＣｏＡを原料とする他の代謝産物を生産する経路の他の例としては、アセチルＣｏＡからグルタミン酸を生産する経路を挙げることができる。例えば、グルタミン酸を効率よく生産する経路を有する微生物（以下、「グルタミン酸生産微生物」と称する場合がある。）を宿主として、上述した各酵素活性を、付与又は強化し、或いは不活性化又は低減した微生物を、前記他の代謝産物を生産する経路を有する微生物、又は当該他の代謝産物を産生する経路に関連する酵素活性を強化した微生物の好適な一例として挙げることができる。

【0137】

グルタミン酸生産微生物としては、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する既述の微生物が挙げられる。
グルタミン酸生産微生物の具体例としては、エシェリヒア属細菌やパントエア属細菌などの腸内細菌科属菌、コリネバクテリウム・グルタミカムなどのコリネ型細菌等が挙げられるが、本発明の微生物はこれらの例に限定されない。

【0138】

前記グルタミン酸生産菌としては、グルタミン酸生産能を付与する各遺伝子の導入及び変更が可能であればいずれの微生物であってもよい。より好ましくは、グルタミン酸生産能が予め付与されたパントエア属細菌もしくはコリネ型細菌であることができ、これにより、より効率よくグルタミン酸を生産させることができる。

【0139】

微生物にグルタミン酸生産能を微生物に付与する方法は、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大及び／又は過剰発現するように改変することを含む。Ｌ−グルタミン酸生合成酵素の例としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトース−２−リン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素のうち、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼの１つ又は複数の活性が増大することが好ましく、これらの酵素の３つ全ての活性を増強させることがより好ましい。

【0140】

このようなグルタミン酸生産菌としては、例えば特開２００５−２７８６４３号公報に記載されているグルタミン酸生産菌などを挙げることができる。

【0141】

Ｌ−グルタミン酸生産菌としては、酸性条件下で培養したときに液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力（以下、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能ということがある）を有する微生物を用いることができる。例えば、欧州公開公報１０７８９８９号記載の方法により、低ｐＨ環境下でＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株を取得することにより、飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を付与することができる。

【0142】

本来的に酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有する微生物として具体的には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５）及びＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７）（以上、欧州特許出願公開０９５２２２１号明細書参照）などが挙げられる。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ， ＮＩＴＥ）、住所 郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４５として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５として寄託されたが、近年１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）に再分類されている（後記実施例参照）。また、後述するＡＪ１３３５５から誘導された菌株ＡＪ１３３５６、及びＡＪ１３６０１も、同様にエンテロバクター・アグロメランスとして前記寄託機関に寄託されているが、本明細書ではパントエア・アナナティスと記述する。ＡＪ１３６０１は、１９９９年８月１８日に経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ， ＮＩＴＥ））に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７１５６として寄託され、２０００年７月６日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７２０７が付与されている。

【0143】

Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭５０−１１３２０９号公報）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭５７−０６５１９８号公報）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭５２−０３８０８８号公報）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭５２−０３８０８８号公報）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭５６−１８８９号公報）、ＨＯＱＮＯ耐性を付与する方法（特開昭５６−１４０８９５号公報）、α−ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭５７−２６８９号公報）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭５６−３５９８１号公報）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平４−８８９９４号公報）などが挙げられる。

【0144】

このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ３９４９ （ＦＥＲＭＢＰ−２６３２；特開昭５０−１１３２０９号公報参照）
・コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１１６２８ （ＦＥＲＭ Ｐ−５７３６；特開昭５７−０６５１９８号公報参照）
・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１３５５（ＦＥＲＭ Ｐ−５００７；特開昭５６−１８８９号公報参照）
・コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１１３６８（ＦＥＲＭ Ｐ−５０２０；特開昭５６−１８８９号公報参照）
・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１２１７（ＦＥＲＭ Ｐ−４３１８；特開昭５７−２６８９号公報参照）
・コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１１２１８（ＦＥＲＭ Ｐ−４３１９；特開昭５７−２６８９号公報参照）
・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１５６４（ＦＥＲＭ Ｐ−５４７２；特開昭５６−１４０８９５公報参照）
ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１４３９（ＦＥＲＭ Ｐ−５１３６；特開昭５６−３５９８１号公報参照）
・コリネバクテリウム・グルタミカムＨ７６８４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３００４；特開平０４−８８９９４号公報参照）
・ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１４２６（ＦＥＲＭ Ｐ−５１２３；特開平５６−０４８８９０号公報参照）
・コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１１４４０（ＦＥＲＭ Ｐ−５１３７；特開平５６−０４８８９０号公報参照）
・ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１７９６（ＦＥＲＭ Ｐ−６４０２；特開平５８−１５８１９２号公報参照）

【0145】

Ｌ−グルタミン生産能を有する微生物として好ましい例は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を強化した菌、グルタミンシンセターゼ（ｇｌｎＡ）活性を強化した菌、グルタミナーゼ遺伝子を破壊した菌である（欧州特許出願公開１２２９１２１号、１４２４３９８号明細書）。グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ（ｇｌｎＥ）の破壊、ＰＩＩ制御タンパク質（ｇｌｎＢ）の破壊によっても達成できる。また、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの３９７位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株も好適なＬ−グルタミン生産菌として例示できる（米国特許出願公開第２００３−０１４８４７４号明細書）。

【0146】

Ｌ−グルタミン生産能を付与または増強する別の方法として、６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシン耐性を付与する方法 （特開平３−２３２４９７号公報）、プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法（特開昭６１−２０２６９４号公報）、α−ケトマレイン酸耐性を付与する方法（特開昭５６−１５１４９５号公報）などが挙げられる。Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例として、以下の微生物が挙げられる。

【0147】

・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１５７３ （ＦＥＲＭ Ｐ−５４９２；特開昭５６−１６１４９５号公報）
・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１５７６ （ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３８１；特開昭５６−１６１４９５号公報）
・ブレビバクテリウム・フラバム ＡＪ１２２１２ （ＦＥＲＭ Ｐ−８１２３；特開昭６１−２０２６９４号公報）

【0148】

プロリン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、シトルリン、オルニチン、ポリグルタミン酸を生産する微生物として好ましい例は、特開２０１０−４１９２０号公報に記載されている。また、酢酸、（ポリ）３−ヒドロキシ酪酸、イタコン酸、クエン酸、酪酸、を生産する微生物としては、発酵ハンドブック（共立出版）に記載されている。
４−アミノ酪酸を製造する微生物としては、たとえば、特開２０１１−１６７０９７号公報のように、グルタミン酸生産微生物にグルタミン酸脱炭酸酵素を導入した微生物が挙げられる。
４−ヒドロキシ酪酸を製造する微生物としては、たとえば、特開２００９−１７１９６０号公報のように、グルタミン酸生産微生物に、グルタミン酸脱炭酸酵素、アミノ基転移酵素、アルデヒド脱水素酵素、を導入した微生物が挙げられる。

【0149】

３−ヒドロキシイソ酪酸を製造する微生物としては、たとえば、国際公開第２００９／１３５０７４号パンフレットや国際公開第２００８／１４５７３７号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。
２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する微生物としては、たとえば、国際公開第２００９／１３５０７４号パンフレットや国際公開第２００９／１５６２１４号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。
３−アミノイソ酪酸、メタクリル酸を製造する微生物としては、たとえば、国際公開第２００９／１３５０７４号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。

【0150】

本発明における微生物は、少なくともマレートチオキナーゼとマリルＣｏＡリアーゼの両方を付与することにより、前記図１のアセチルＣｏＡ生産経路を構築した微生物である。このため、マレートチオキナーゼとマリルＣｏＡリアーゼとを生来有する微生物は、本発明のアセチルＣｏＡ生産微生物から除外される。

【0151】

Ｍｔｋとｍｃｌを生来有する微生物としては、例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンスといったメタン資化菌が挙げられる。これらの微生物は、メタン資化菌に適したベクター系や、メタン資化菌のゲノム遺伝子の改変技術は発達しておらず、大腸菌やコリネバクテリウムなどの工業微生物と比較して、遺伝子操作が困難である。また、これらの微生物は増殖が遅い場合が多く、有用な代謝産物の生産には適していない。

【0152】

本発明に係るアセチルＣｏＡ、アセトン、イソプロピルアルコール又はグルタミン酸の生産方法は、前記アセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料から、目的生産物であるアセチルＣｏＡ、アセトン、イソプロピルアルコール又はグルタミン酸を生産することを含む。即ち、前記アセチルＣｏＡ生産方法は、前記アセチルＣｏＡ生産微生物と炭素源材料とを接触させて、培養すること（以下、培養工程）と、接触により得られた目的生産物（アセチルＣｏＡ、アセトン、イソプロピルアルコール又はグルタミン酸）を回収する工程（以下、回収工程）とを含む。
前記アセチルＣｏＡ生産方法によれば、前記アセチルＣｏＡ生産微生物と炭素源材料とを接触させて培養するので、前記アセチルＣｏＡ生産微生物により炭素源材料が資化され、二酸化炭素を固定しながら、効率よく目的生産物を生産することができる。

【0153】

前記炭素源材料としては、微生物が資化可能な炭素源を含む材料であれば特に制限はないが、植物由来原料であることが好ましい。
前記植物由来原料としては、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。

【0154】

このような植物由来原料に包含される炭素源には、一般的なものとしてデンプン、スクロース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、及びこれら成分を多く含む草木質分解産物、セルロース加水分解物など、及びこれらの組み合わせを挙げることができ、更には植物油由来のグリセリン又は脂肪酸も、本発明における炭素源に含んでもよい。

【0155】

前記植物由来原料の例示としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、及びこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。

【0156】

培養工程におけるアセチルＣｏＡ生産微生物と植物由来原料との接触は、一般に、植物由来原料を含む培地でアセチルＣｏＡ生産微生物を培養することにより行われる。
前記植物由来原料とアセチルＣｏＡ生産微生物との接触密度は、アセチルＣｏＡ生産微生物の活性によって異なるが、一般に、培地中の植物由来原料の濃度として、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して２０質量％以下とすることができ、アセチルＣｏＡ生産微生物の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を１５質量％以下とすることができる。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。

【0157】

また培地中のアセチルＣｏＡ生産微生物の含有量としては、微生物の種類及び活性によって異なるが一般に、培養開始時に投入する前培養の菌液（ＯＤ６６０ｎｍ＝４〜８）の量を培養液に対して０．１質量％から３０質量％、培養条件制御の観点から好ましくは１質量％〜１０質量％とすることができる。

【0158】

アセチルＣｏＡ生産微生物の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及び、目的生産物を生産するために微生物が要求する無機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた通常用いられる培地であれば特に制限はない。

【0159】

前記培養工程での培養条件には特別の制限はなく、例えば好気条件下でｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４２℃の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養することができる。

【0160】

前記混合物中への気体の通気量は、特に制限はないが、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に０．０２ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）、５０〜６００ｒｐｍであり、大腸菌への物理的ダメージを抑制する観点から０．１ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍで行うことが好ましく、より好ましくは０．１ｖｖｍ〜１．０ｖｖｍである。

【0161】

培養工程は、培養開始から混合物中の炭素源材料が消費されるまで、又はアセチルＣｏＡ生産微生物の活性がなくなるまで継続させることができる。培養工程の期間は、混合物中のアセチルＣｏＡ生産微生物の数及び活性並びに、炭素源材料の量により異なるが、一般に、１時間以上、好ましくは４時間以上であればよい。一方、炭素源材料又はアセチルＣｏＡ生産微生物の再投入を行うことによって、培養期間は無制限に連続することができるが、処理効率の観点から、一般に５日間以下、好ましくは７２時間以下とすることができる。その他の条件は、通常の培養に用いられる条件をそのまま適用すればよい。

【0162】

培養液中に蓄積した目的生産物を回収する方法としては、特に制限はないが、例えば培養液から菌体を遠心分離などで除去した後、目的生産物の種類に応じた条件による蒸留や膜分離等通常の分離方法で目的生産物を分離する方法が採用できる。

【0163】

なお、本発明に係るアセチルＣｏＡ生産方法は、前記培養工程の前に、使用するアセチルＣｏＡ生産微生物を適切な菌数又は／及び適度な活性状態とするための前培養工程を含んでいてもよい。前培養工程は、アセチルＣｏＡ生産微生物の種類に応じた通常用いられる培養条件による培養であればよい。

【0164】

前記アセトン生産方法において用いられるアセチルＣｏＡ生産微生物としては、アセチルＣｏＡ生産微生物の好ましい一態様として前述したチオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有するアセチルＣｏＡ生産微生物であることが、アセトンの生産効率の観点から好ましい。
前記イソプロピルアルコール生産方法において用いられるアセチルＣｏＡ生産微生物としては、アセチルＣｏＡ生産微生物の好ましい一態様として前述したチオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するアセチルＣｏＡ生産微生物であることが、イソプロピルアルコールの生産効率の観点から好ましい。

【0165】

なお、前記イソプロピルアルコール生産方法又はアセトン生産方法の場合、好ましくは、前記アセチルＣｏＡ生産微生物及び炭素源材料を含む混合物中に気体を供給しながら、該アセチルＣｏＡ生産微生物を培養する培養工程と、前記培養により生成したイソプロピルアルコール又はアセトンを混合物から分離し回収する目的生産物回収工程とを含む。

【0166】

このイソプロピルアルコール生産方法又はアセトン生産方法によれば、混合物に気体を供給しながらアセチルＣｏＡ生産微生物を培養する（通気培養）。この通気培養により、生産されたイソプロピルアルコール又はアセトンは混合物中に放出されると共に、混合物から蒸散し、この結果、生成したイソプロピルアルコール又はアセトンを混合物から容易に分離することができる。また、生成したイソプロピルアルコール又はアセトンが混合物から連続的に分離するため、混合物中のイソプロピルアルコール又はアセトンの濃度の上昇を抑制することができる。これにより、前記アセチルＣｏＡ生産微生物のイソプロピルアルコール又はアセトンに対する耐性を特に考慮する必要がない。
なお、本方法における混合物とは、宿主となる微生物の培養に一般的に用いられる基本培地を主体とすればよい。培養条件については、前述した事項がそのまま適用される。

【0167】

前記目的生産物回収工程では、培養工程で生成され、混合物から分離したイソプロピルアルコール又はアセトンを回収する。この回収方法としては、通常培養により混合物から蒸散したガス状又は飛沫状のイソプロピルアルコール又はアセトンを収集することができるものであればよい。このような方法としては、一般に用いられる密閉容器等の収集部材へ収容すること等を挙げることができるが、なかでも、イソプロピルアルコール又はアセトンのみを純度高く回収できる観点から、イソプロピルアルコール又はアセトンを捕捉するための捕捉液と、混合物から分離したイソプロピルアルコール又はアセトンとを接触することを含むものであることが好ましい。

【0168】

本イソプロピルアルコール生産方法又はアセトン生産方法では、イソプロピルアルコール又はアセトンは、捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収することができる。そのような回収方法としては、例えば国際公開２００９／００８３７７号パンフレットに記載された方法などが挙げられる。回収されたイソプロピルアルコール又はアセトンは、ＨＰＬＣ等の通常の検出手段を用いて確認することができる。回収されたイソプロピルアルコールは、必要に応じて更に精製することができる。このような精製方法としては、蒸留等をあげることができる。
回収されたイソプロピルアルコール又はアセトンが水溶液の状態である場合には、本イソプロピルアルコール生産方法又はアセトン生産方法は、回収工程に加えて、脱水工程を更に含んでいてもよい。イソプロピルアルコール又はアセトンの脱水は、常法により行なうことができる。

【0169】

捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収可能なイソプロピルアルコール又はアセトンの生産方法に適用可能な装置としては、例えば、国際公開２００９／００８３７７号パンフレットの図１に示される生産装置を挙げることができる。

【0170】

この生産装置では、使用される微生物と植物由来原料とを含む培地が収容された培養槽に、装置外部から気体を注入するための注入管が連結され、培地に対してエアレーションが可能となっている。
また、培養槽には、連結管を介して、捕捉液としてのトラップ液が収容されたトラップ槽が連結されている。このとき、トラップ槽へ移動した気体又は液体がトラップ液と接触してバブリングが生じる。
これにより、培養槽で通気培養により生成したイソプロピルアルコール又はアセトンは、エアレーションによって蒸散して培地から容易に分離される共に、トラップ槽においてトラップ液に補足される。この結果、イソプロピルアルコール又はアセトンを、より精製された形態で連続的に且つ簡便に生産することができる。

【0171】

本発明に係るグルタミン酸生産方法は、前記アセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料から、目的生産物であるグルタミン酸を生産することを含む。即ち、前記グルタミン酸生産方法は、前記アセチルＣｏＡ生産微生物と炭素源材料とを接触させて、培養すること（以下、培養工程）と、接触により得られた目的生産物（グルタミン酸）を回収する工程（以下、回収工程）とを含む。
前記グルタミン酸生産方法によれば、前記アセチルＣｏＡ生産微生物と炭素源材料とを接触させて培養するので、前記アセチルＣｏＡ生産微生物により炭素源材料が資化され、二酸化炭素を固定しながら、効率よく目的生産物を生産することができる。

【0172】

培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。

【0173】

炭素源材料としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。
無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。

【0174】

培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中又は菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積される。

【0175】

また、目的とするＬ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である場合、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成、蓄積させるように培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。尚、酸性条件下での生育の向上、及び、効率的なＬ−グルタミン酸の析出を両立するためには、ｐＨは好ましくは５．０〜４．０、より好ましくは４．５〜４．０、さらに好ましくは４．３〜４．０であることが望ましい。尚、上記ｐＨでの培養は、培養の全期間であってもよく、一部であってもよい。

【0176】

培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。培地中にＬ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析させた後に、併せて単離してもよい。

【0177】

プロリン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、シトルリン、オルニチン、酢酸、（ポリ）３−ヒドロキシ酪酸、イタコン酸、クエン酸、酪酸、ポリグルタミン酸を生産する方法としては、たとえば、発酵ハンドブック（共立出版）に記載された方法が挙げられる。
４−アミノ酪酸を製造する方法としては、たとえば、特開２０１１−１６７０９７のように、グルタミン酸生産微生物にグルタミン酸脱炭酸酵素を導入した微生物による生産方法が挙げられる。
４−ヒドロキシ酪酸を製造する微生物としては、たとえば、特開２００９−１７１９６０号公報のように、グルタミン酸生産微生物に、グルタミン酸脱炭酸酵素、アミノ基転移酵素、アルデヒド脱水素酵素を導入した微生物による生産方法が挙げられる。

【0178】

３−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法としては、たとえば、国際公開第２００９／１３５０７４号パンフレットや国際公開第２００８／１４５７３７号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。
２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法としては、たとえば、国際公開第２００９／１３５０７４号パンフレットや国際公開第２００９／１５６２１４号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。
３−アミノイソ酪酸、メタクリル酸を製造する方法としては、たとえば、国際公開第２００９／１３５０７４号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。

【実施例】

【0179】

以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。

【0180】

［実施例１］
＜エシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化株の作製＞
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＣｏＡトランスフェラーゼ αサブユニットをコードする遺伝子（以下、ａｔｏＤと略することがある）の塩基配列も報告されている。すなわちａｔｏＤはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９〜２３２２１３１に記載されている。

【0181】

上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを、テンプレートと、ＣＧＣＴＣＡＡＴＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号１）、及びＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号２）のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０２５１４）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニー１０個をそれぞれアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した際、ＧＡＰＤＨプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、ＤＮＡ配列を確認しＧＡＰＤＨプロモーターが正しく挿入されたものをｐＵＣｇａｐＰとした。得られたｐＵＣｇａｐＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した。

【0182】

さらにａｔｏＤを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートと、ＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣ（配列番号３）、及びＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＡＣＧ（配列番号４）のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することで約６９０ｂｐのａｔｏＤフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを先に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＵＣｇａｐＰと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｔｏＤが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰａｔｏＤと命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。

【0183】

上述した通り、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡにおけるａｔｏＤの塩基配列も報告されている。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作製された、ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＣＴＴＧＴＣ（配列番号５）とＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＡＴＣＡＡＣＣ（配列番号６）のプライマーを用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。

【0184】

また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＧＡＰＤＨプロモーターの配列情報に基づいて作製されたＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号７）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの配列情報に基づいて作製された配列番号４のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターｐＧＡＰａｔｏＤを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤからなる約７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。

【0185】

上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）〔Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ， Ｔ．， Ｇｅｎｅ， ２４１， １８５−１９１ （２０００）〕をＰｓｔＩとＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを抗生物質を含まないＬＢ液体培地で３０℃で２時間培養し、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

【0186】

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤを含む約７９０ｂｐ断片を増幅させ、ａｔｏＤプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株と略することがある）と命名した。
なお、エシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。

【0187】

［実施例２］
＜エシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失株の作製＞
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ（以下ｐｇｉと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ１５１９６）。ｐｇｉをコードする遺伝子（１，６５０ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＧ（配列番号８）、ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＡＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＡＧ（配列番号９）、ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＡＴＡＴＧＴＡＧＧＣＣ（配列番号１０）及びＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＴＧＴＡＣＧＣ（配列番号１１）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号８のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、配列番号９および１０のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号１１のプライマーは５’末端側にＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ有している。

【0188】

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号８と配列番号９のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｇｉ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号１０と配列番号１１のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｇｉ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｇｉ−Ｌ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで、ｐｇｉ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをＸｂａＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本ＤＮＡ断片と、ｐＵＣ４Ｋプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０６４０４）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＥｃｏＲＩで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子をさらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行ったＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。その後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の間にカナマイシン耐性遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、ｐＴＨ１８ｃｓ１−ｐｇｉとした。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。

【0189】

作製したｐＴＨ１８ｃｓ１−ｐｇｉを実施例１で作製したＢ：：ａｔｏＤＡＢに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

【0190】

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｐｇｉ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約３．３ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株と略することがある）と命名した。

【0191】

なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株およびエシェリヒア・コリＢ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。

【0192】

［実施例３］
＜エシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失株の作製＞
エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）、ＧｎｔＲをコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＰ０００８１９に記載のエシェリヒア・コリＢ株ゲノム配列の３５０９１８４〜３５１０１７９に記載されている。ＧｎｔＲをコードする塩基配列（ｇｎｔＲ）の近傍領域をクローニングするため、ＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＣＡＡＴＴＴＴＣＡＣＣＣＴＣＴＡＴＣ（配列番号１２）、ＧＴＧＧＧＣＣＧＴＣＣＴＧＡＡＧＧＴＡＣＡＡＡＡＧＡＧＡＴＡＧＡＴＴＣＴＣ（配列番号１３）、ＣＴＣＴＴＴＴＧＴＡＣＣＴＴＣＡＧＧＡＣＧＧＣＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴＧＡＡＧ（配列番号１４）、ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＴＧＧＣ（配列番号１５）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号１２および１３のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位をそれぞれ有している。

【0193】

エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２と配列番号１３のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｔＲ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号１４と配列番号１５のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｔＲ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｇｎｔＲ−ＬとｇｎｔＲ−Ｒ断片を鋳型に配列番号１２と配列番号１５のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｔＲ−ＬＲ断片と呼ぶことがある）。このｇｎｔＲ−ＬＲ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ＥｃｏＲＩで消化し、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ消化物と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｇｎｔＬＲ断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｔＲとした。

【0194】

こうして得られたプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｔＲを実施例２で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

【0195】

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｎｔＲ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ株ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ株と略することがある）と命名した。

【0196】

［実施例４］
＜エシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失、ｇｎｄ遺伝子欠失株の作製＞
ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｇｎｄ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号１６）、ＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＴＴＴＡＣＴＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＧＧ（配列番号１７）、ＴＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡＡＴＴＧ（配列番号１８）、ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＧＧ（配列番号１９）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号１６のプライマーは５’末端側にＮｄｅＩ認識部位を有し、配列番号１７および配列番号１８のプライマーは５’末端側にＳａｃＩ認識部位を有している。また、配列番号１９のプライマーは５’末端側にＢａｍＨＩ認識部位を有している。

【0197】

エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、配列番号１６と配列番号１７のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｄ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号１８と配列番号１９のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｄ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｇｎｄ−Ｌ断片をＮｄｅＩ及びＳａｃＩで、ｇｎｄ−Ｒ断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化物を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、ｓコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｇｎｄをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、ｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｄとした。

【0198】

こうして得られたプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｄを実施例３で作製したエシェリア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

【0199】

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｎｄ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失、ｇｎｄ遺伝子欠失株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ△ｇｎｄ株と命名した。

【0200】

［実施例５］
＜エシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失、ｇｎｄ遺伝子欠失、ｌｄｈＡ遺伝子欠失株の作製＞
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ｌｄｈＡと略することがある）をコードする遺伝子（９９０ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＡＴＣＧＣＴＴＡＣＧＧＴＣＡＡＴＴＧ（配列番号２０）、ＧＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧ（配列番号２１）、ＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＴＣＴＴＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＡＣ（配列番号２２）、ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＧＣＡＡＡＴＧＧＣＴＴＴＣＴＴＣ（配列番号２３）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号２０および２３のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位をそれぞれ有している。

【0201】

エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２０と配列番号２１のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｌｄｈＡ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号２２と配列番号２３のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｌｄｈＡ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｌｄｈＡ−ＬとｌｄｈＡ−Ｒ断片を鋳型に配列番号２０と配列番号２３のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｌｄｈＡ−ＬＲ断片と呼ぶことがある）。このｌｄｈＡ−ＬＲ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ＥｃｏＲＩで消化し、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ消化物を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｌｄｈＡ−ＬＲ断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＴＨ１８ｃｓ１−ｌｄｈＡとした。

【0202】

こうして得られたプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｌｄｈＡを実施例４で作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ△ｇｎｄに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

【0203】

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｌｄｈＡ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失、ｇｎｄ遺伝子欠失、ｌｄｈＡ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ△ｇｎｄ△ｌｄｈＡ株と略することがある）と命名した。

【0204】

［実施例６］
＜ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失、ｇｎｄ遺伝子欠失、ｌｄｈＡ遺伝子欠失、ａｃｅＢＡ遺伝子欠失株の作製＞
イソクエン酸リアーゼおよびリンゴ酸シンターゼ（以下、ａｃｅＢＡと略することがある）をコードする遺伝子（２９３６ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＧＣＧＣＡＴＣＧＡＴＴＣ（配列番号２４）、ＣＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＴＣＡＴＧＧＡＴＣ（配列番号２５）、ＧＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＧ（配列番号２６）、ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＴＡＴＣＡＡＴＡＡＡＴＡＡＣ（配列番号２７）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号２４および２７のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位をそれぞれ有している。

【0205】

エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２４と配列番号２５のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ａｃｅＢＡ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号２６と配列番号２７のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ａｃｅＢＡ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ａｃｅＢＡ−ＬとａｃｅＢＡ−Ｒ断片を鋳型に配列番号２４と配列番号２７のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ａｃｅＢＡ−ＬＲ断片と呼ぶことがある）。このａｃｅＢＡ−ＬＲ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ＥｃｏＲＩで消化し、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ消化物と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ａｃｅＢＡ−ＬＲ断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＴＨ１８ｃｓ１−ａｃｅＢＡとした。

【0206】

こうして得られたプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ａｃｅＢＡを実施例５で作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ△ｇｎｄ△ｌｄｈＡに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

【0207】

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ａｃｅＢＡ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ株ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失、ｇｎｄ遺伝子欠失、ｌｄｈＡ遺伝子欠失、ａｃｅＢＡ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ△ｇｎｄ△ｌｄｈＡ△ａｃｅＢＡ）株と略することがある）と命名した。

【0208】

［実施例７］
＜ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失、ｇｎｄ遺伝子欠失、ｌｄｈＡ遺伝子欠失、ａｃｅＢＡ遺伝子欠失、ｇｌｃＢ遺伝子欠失株の作製＞
リンゴ酸シンターゼＧ（以下、ｇｌｃＢと略することがある）をコードする遺伝子（７２３ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＧ（配列番号２８）、ＣＴＴＴＴＴＴＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＣＴＣＧＴＴＴＴＣＧＣ（配列番号２９）、ＧＡＧＡＴＡＡＡＣＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＣＣＧＧＣ（配列番号３０）、ＧＧＡＡＴＴＣＣＧＴＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＴＡＣＣＡＧＣＣ（配列番号３１）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号２８および３１のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位をそれぞれ有している。

【0209】

エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２８と配列番号２９のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｌｃＢ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号３０と配列番号３１のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｌｃＢ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｇｌｃＢ−ＬとｇｌｃＢ−Ｒ断片を鋳型に配列番号２８と配列番号３１のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｌｃＢ−ＬＲ断片と呼ぶことがある）。このｇｌｃＢ−ＬＲ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ＥｃｏＲＩで消化し、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ消化物と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｇｌｃＢ−ＬＲ断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｌｃＢとした。

【0210】

こうして得られたプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｃｌＢを実施例６で作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ△ｇｎｄ△ｌｄｈＡ△ａｃｅＢＡ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

【0211】

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｌｃＢ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ株ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失、ｇｎｄ遺伝子欠失、ｌｄｈＡ遺伝子欠失、ａｃｅＢＡ遺伝子欠失、ｇｌｃＢ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ△ｇｎｄ△ｌｄｈＡ△ａｃｅＢＡ△ｇｌｃＢ）株と略することがある）と命名した。

【0212】

［実施例８］
＜ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失、ｇｎｄ遺伝子欠失、ｌｄｈＡ遺伝子欠失、ａｃｅＢＡ遺伝子欠失、ｇｌｃＢ遺伝子欠失、ｆｕｍＡＣ遺伝子欠失株の作製＞
フマル酸ヒドラターゼＡおよびフマル酸ヒドラターゼＣ（以下、ｆｕｍＡＣと略することがある）をコードする遺伝子（３１９３ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＴＣＧＣＣＡＧＣＧＣＧＣＧＧＧＡＴＴＴＴＴＣ（配列番号３２）、ＣＧＡＧＣＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＧ（配列番号３３）、ＡＴＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＡＣＡＴＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧ（配列番号３４）、ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＧＣＧＣＡＣＧＡＴＧＧＴＣＡＡＧ（配列番号３５）、に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号３２のプライマーは５’末端側にＮｄｅＩ認識部位を有している。配列番号３３および３４のプライマーは５’末端側にＳａｃＩ認識部位をそれぞれ有している。配列番号３５のプライマーは５’末端側にＢａｍＨＩ認識部位を有している。

【0213】

エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３２と配列番号３３のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｆｕｍＡ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号３４と配列番号３５のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｆｕｍＣ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｆｕｍＡ−Ｌ断片をＮｄｅＩ，ＳａｃＩ処理し、ｆｕｍＣ−Ｒ断片をＳａｃＩ，ＢａｍＨＩ処理した。これらの断片を温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＮｄｅＩ，ＢａｍＨＩ消化物と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＣ断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＴＨ１８ｃｓ１−ｆｕｍＡＣとした。

【0214】

こうして得られたプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｆｕｍＡＣを実施例７で作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ△ｇｎｄ△ｌｄｈＡ△ａｃｅＢＡ△ｇｌｃＢ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

【0215】

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｆｕｍＡＣ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ株ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失、ｇｎｄ遺伝子欠失、ｌｄｈＡ遺伝子欠失、ａｃｅＢＡ遺伝子欠失、ｇｌｃＢ遺伝子欠失、ｆｕｍＡＣ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ△ｇｎｄ△ｌｄｈＡ△ａｃｅＢＡ△ｇｌｃＢ△ｆｕｍＡＣ）株と略することがある）と命名した。

【0216】

［実施例９］
＜プラスミドｐＩａｚの作製＞
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ５５３９２に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１５７３０７に記載されている。

【0217】

上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。
ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号３６）、及びＣＧＣＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号３７）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｐＰを回収した。

【0218】

イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＡＴＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧ（配列番号３８）、及びＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣ ＴＴＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＣ（配列番号３９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＳａｌＩで消化することで約１．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａｌＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しＩＰＡｄｈが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＵＣ−Ｉと命名した。

【0219】

プラスミドｐＵＣ−Ｉを制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるＩＰＡｄｈを含むフラグメントとプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しＩＰＡｄｈが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ−Ｉと命名した。

【0220】

アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＴＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴＡＧＣ（配列番号４０）、及びＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＡＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣ（配列番号４１）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｌＩ、ＸｂａＩで消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作製したプラスミドｐＧＡＰ−Ｉを制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｄｃが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＩａと命名した。

【0221】

グルコース６リン酸−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）を取得するためにエシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）をテンプレートに用いてＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＧＣＡＡＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧ（配列番号４２）、及びＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＴＡＴＡＴＣＧＣＣ（配列番号４３）を用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩで消化することで約１５００ｂｐのグルコース６リン酸１−デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作製したプラスミドｐＩａを制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られたプラスミドをｐＩａｚとした。

【0222】

［実施例１０］
＜プラスミドｐＭＷＧＫＣの作製＞
ｐＢＲｇａｐＰをテンプレートに用いてＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧ（配列番号４４）、及びＧＣＴＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣ（配列番号４５）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントをＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）でリン酸化することで、ＧＡＰＤＨプロモーターを含むＤＮＡフラグメントを得た。また、プラスミドｐＭＷ１１９（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ００５４７６）を制限酵素ＡａｔＩＩ及びＮｄｅＩで処理し、得られたＤＮＡフラグメントをＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）で末端を平滑化することで、ｐＭＷ１１９の複製起点を含むＤＮＡフラグメントを得た。ＧＡＰＤＨプロモーターを含むＤＮＡフラグメントとｐＭＷ１１９の複製起点を含むＤＮＡフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地において３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＭＷＧを回収した。

【0223】

クロラムフェニコール耐性遺伝子を取得するため、ｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０１９６１０）をテンプレートに用いて、ＴＣＧＧＣＡＣＧＴＡＡＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号４６）及びＣＧＧＧＴＣＧＡＡＴＴＴＧＣＴＴＴＣＧ（配列番号４７）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントをＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）でリン酸化することで、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを得た。それから、ｐＭＷＧをテンプレートに用いてＣＴＡＧＡＴＣＴＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＣＧＧＧＴＡＡＧＣＣ （配列番号４８）、及びＣＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣ（配列番号４９）によりＰＣＲ法で増幅し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られたプラスミドをｐＭＷＧＣとした。

【0224】

ｐＭＷＧＣ遺伝子をテンプレートに用いて、ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧ（配列番号５０）、及びＧＣＴＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣ（配列番号５１）によりＰＣＲ法で増幅し、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＭＷＧＫＣを回収した。

【0225】

［実施例１１］
＜メチロバクテリウム エキストロクエンスＩＡＭ１２６３２由来マレートチオキナーゼ発現プラスミドの構築＞
東京大学分子細胞生物学研究所ＩＡＭカルチャーコレクションからメチロバクテリウム エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）ＩＡＭ１２６３２を購入した。ＩＡＭ１２６３２をＮＢＲＣの培地番号３５２で培養し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いて染色体ＤＮＡを得た。

【0226】

メチロバクテリウム エキストロクエンスＩＡＭ１２６３２の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＡＡＡＡＧＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＧＡＣＧＴＴＣＡＣＧＡＧＴＡＣＣＡＡＧＣＣ（配列番号５２）及びＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＧＧＡＣＴＣ（配列番号５３）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、増幅ＤＮＡをＮｄｅＩとＸｂａＩで切断し、マレートチオキナーゼのフラグメントを得た。また、メチロバクテリウム エキストロクエンスの染色体ＤＮＡを鋳型として、ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＧＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧ（配列番号５４）及びＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣ（配列番号５５）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、増幅ＤＮＡをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、マリルＣｏＡリアーゼのフラグメントを得た。メチロバクテリウム エキストロクエンスのマレートチオキナーゼとマリルＣｏＡリアーゼのフラグメントを、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＭＷＧＫＣと連結した。得られたプラスミドをｐＭＷＧＫＣ＿ｍｔｋ（Ｍｅｘ）＿ｍｃｌと命名した。
ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｔｋ（Ｍｅｘ）＿ｍｃｌは、メチロバクテリウム エキストロクエンス由来のｍｃｌの遺伝子配列（配列番号６６）、ｍｔｋＡの遺伝子配列（配列番号６７）、及びｍｔｋＢの遺伝子配列（配列番号６８）を含む。また、メチロバクテリウム エキストロクエンス由来ｍｃｌのアミノ酸配列、ｍｔｋＡのアミノ酸配列、及びｍｔｋＢのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号７１に示すとおりである。

【0227】

［実施例１２］
＜ハイホマイクロビウム メチロボラム ＮＢＲＣ １４１８０由来マレートチオキナーゼ発現プラスミドの構築＞
ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門）からハイホマイクロビウム メチロボラム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｍ）ＮＢＲＣ１４１８０を購入した。ＮＢＲＣ１４１８０をＮＢＲＣの培地番号２３３で培養し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いて染色体ＤＮＡを得た。

【0228】

ＮＢＲＣ １４１８０のセリン−グリオキシル酸アミノ転移酵素（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｄ１３７３９）のＮ末端のＤＮＡ配列を参考にしてプライマー（配列番号５６）を作製した。
ハイホマイクロビウム デニトリフィカンス（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／３０００２１５３８？ｆｒｏｍ＝３２１８４１７＆ｔｏ＝３２２１２７２＆ｒｅｐｏｒｔ＝ｇｂｗｉｔｈｐａｒｔｓ）のアミノ酸配列を元にＮＣＢＩ（米国立生物工学情報センター）のホモロジー検索ツールを用いて相同性を比較した。（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ）
相同性の高いアミノ酸配列を参考にプライマー（配列番号５７）を作製した。

【0229】

上記で得られた配列番号５６と配列番号５７のプライマーを用いて上記の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施した。増幅断片をｐＵＣ１９をＳｍａＩで消化したＤＮＡに連結し、ハイホマイクロビウム メチロボラムＮＢＲＣ １４１８０由来のセリン−グリオキシル酸アミノ転移酵素遺伝子からホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の一部をクローニングした。クローンの配列を確認し、更にプライマー（配列番号５８及び５９）を作製した。

【0230】

ハイホマイクロビウム メチロボラムＮＢＲＣ １４１８０の染色体ＤＮＡを鋳型として、上記で得られた配列番号５８及び５９のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、増幅したＤＮＡをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断して、ハイホマイクロビウムのｍｃｌ及びｍｔｋ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを得た。それから、上述のプラスミドｐＭＷＧＫＣ＿ｍｔｋ（Ｍｅｘ）＿ｍｃｌをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断して、ｍｃｌを含む約４．３ｋｂの断片を回収し、ハイホマイクロビウムのｍｃｌ及びｍｔｋ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントと連結した。得られたプラスミドをｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｈｍｅ）＿ｍｔｋ（Ｈｍｅ）＿ｍｃｌと命名した。
ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｈｍｅ）＿ｍｔｋ（Ｈｍｅ）＿ｍｃｌは、ハイホマイクロビウム メチロボラム由来のｍｃｌの遺伝子配列（配列番号６０）、ｍｔｋＡの遺伝子（配列番号６１）、及びｍｔｋＢの遺伝子（配列番号６２）を含む。また、ハイホマイクロビウム メチロボラム由来ｍｃｌのアミノ酸配列、ｍｔｋＡのアミノ酸、及びｍｔｋＢのアミノ酸は、それぞれ配列番号７２、配列番号７３、及び配列番号７４に示すとおりである。

【0231】

［実施例１３］
＜リゾビウム ｓｐ ＮＧＲ２３４由来マレートチオキナーゼ発現プラスミドの構築＞
リゾビウム ｓｐ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ）ＮＧＲ２３４のマレートチオキナーゼ・ベータサブユニット（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＣＰ２６３８１）とスクシニルＣｏＡシンテターゼ・アルファサブユニット（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＣＰ２６３８２）のアミノ酸配列情報を基に、マレートチオキナーゼの遺伝子を全合成した（配列番号６３）。得られた遺伝子をＮｄｅＩとＸｂａＩで切断し、同様に制限酵素で切断したｐＭＷＧＫＣと連結した。得られたプラスミドをｐＭＷＧＫＣ＿ｍｔｋ（Ｒｈｉ）と命名した。また、メチロバクテリウム エキストロクエンスの染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号６４及び配列番号６５のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、増幅ＤＮＡをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断して末端を平滑化した後、ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｔｋ（Ｒｈｉ）をＸｂａＩで切断して平滑化した遺伝子と連結した。ｍｔｋとｍｃｌの遺伝子が同じ方向に導入されているものをｐＭＷＧＫＣ＿ｍｔｋ（Ｒｈｉ）＿ｍｃｌと命名した。リゾビウム ｓｐ由来ｍｔｋＡのアミノ酸、及びｍｔｋＢのアミノ酸は、それぞれ配列番号７５、及び配列番号７６に示すとおりである。

【0232】

［実施例１４］
＜マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼ導入イソプロピルアルコール生産株の作製＞
実施例８で作製した大腸菌Ｂ株（ａｔｏＤＡＢ，△ｐｇｉ＿ｇｎｔＲ＿ｇｎｄ＿ｌｄｈＡ＿ａｃｅＢＡ＿ｇｌｃＢ＿ｆｕｍＡＣ）のコンピテントセルに、実施例９で作製したプラスミドｐＩａｚと、ｍｔｋ及びｍｃｌの各発現プラスミドを形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹し生育した株をそれぞれ以下のように命名した（表２参照）。
なお、表２記載の株番号は、大腸菌Ｂ株（ａｔｏＤＡＢ，△ｐｇｉ＿ｇｎｔＲ＿ｇｎｄ＿ｌｄｈＡ＿ａｃｅＢＡ＿ｇｌｃＢ＿ｆｕｍＡＣ）に、ｐＩａｚと表２記載のプラスミドを導入した株を意味する。

【0233】

【表2】

【0234】

［実施例１５］
＜^１３Ｃラベル化ＣＯ_２のイソプロピルアルコールへの導入検証＞
５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに１００ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃かつ２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを３４μｇ／ｍｌとなるようにクロラムフェニコール添加した後、表２の炭酸固定経路導入株を一白金耳植菌し、３０℃かつ１３０ｒｐｍにて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、１０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁し菌体懸濁液をそれぞれ得た。

【0235】

１００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＭの^１３Ｃでラベルされた炭酸水素ナトリウム、５０ｇ／Ｌのグルコース、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３０ｍＬのＭ９最小培地を準備した。前記菌体懸濁液を３ｍＬ接種し、シリコン栓で密封して３０℃、１００ｒｐｍで２４時間培養した。得られた培養液は、親水性ＰＴＦＥメンブレンフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、Ｈ０５０Ａ０４７Ａ、ポアサイズ０．５μＭ、ｄｉａｍｅｔｅｒ ４７ｍｍ）をセットした減圧濾過用フィルターホルダー（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、ＫＧＳ−４７）を用いて減圧濾過し、培養上清と菌体に分離した。

【0236】

菌体が付着したメンブレンフィルターは、直ちに−２０℃に冷却した１．６ｍＬのメタノール（ＬＣ／ＭＳグレード）に浸して攪拌した後、−２０℃で１時間放置した。１時間後、−２０℃に冷却した１．６ｍＬのクロロホルム（ＨＰＬＣグレード）と４℃に冷却した０．６４ｍＬの純水を加え、ボルテックスで３０秒間攪拌した。その後、４℃で遠心して上清を回収し、菌体のメタノール抽出液を得た。これをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析し、菌体中のアセチルＣｏＡの分子量分布を測定した。結果を表３に示した。なお、アセチルＣｏＡの分子量分布は、マススペクトルピークの分子量：８０８、８０９及び８１０の割合を、それぞれＭ＋０、Ｍ＋１及びＭ＋２として換算した。

【0237】

一方、上記培養上清から蒸留によりアルコール類及びアセトンを高濃度化して取り出し、分子量分布測定の原料として用いた。培養上清中のイソプロピルアルコールおよびエタノールの分子量分布を、ＧＣ−ＭＳで分析した。結果を表４及び５に示した。なお、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）の分子量分布（表４）は、マススペクトルピークの分子量：１１７、１１８及び１１９の割合を、それぞれＭ＋０、Ｍ＋１及びＭ＋２として換算した。エタノール（ＥｔＯＨ）の分子量分布（表５）は、マススペクトルピークの分子量：１０３、１０４及び１０５の割合を、それぞれＭ＋０、Ｍ＋１及びＭ＋２として換算した。

【0238】

【表3】

【0239】

【表4】

【0240】

【表5】

【0241】

表３に示されるように、ＭＴ−１株、及びＭＴ−２株では、Ｃｏｎｔｒｏｌ株と比較して、^１３Ｃが導入されていないアセチルＣｏＡ（Ｍ＋０）の割合が低く、^１３Ｃが１原子導入されたアセチルＣｏＡ（Ｍ＋１）の割合が高かった。特に、ＭＴ−２株のＭ＋１の割合が高かった。したがって、ＭＴ−１株、及びＭＴ−２株では、アセチルＣｏＡに^１３Ｃラベル化された炭酸由来の炭素が導入され、しかもその効果はＭＴ−２株のほうがより顕著であるたことがわかった。
さらに、ＭＴ−２株は、市販イソプロピルアルコールやエタノールと比較して、^１３Ｃの導入されていないイソプロピルアルコールやエタノール（Ｍ＋０）の割合が低く、^１３Ｃが１原子導入されたイソプロピルアルコールやエタノール（Ｍ＋１）の割合が高かった（表４、表５）。したがって、ＭＴ−２株ではイソプロピルアルコールやエタノールについても、^１３Ｃラベル化された炭酸由来の炭素が導入されたことがわかった。

【0242】

［実施例１６］
＜リンゴ酸を基質としたグリオキシル酸生産活性測定＞
上述のｍｔｋ及びｍｃｌ発現株を２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で培養した。粗酵素液の抽出は以下に示す方法で行った。対数増殖期の菌体を遠心分離により回収し、２００ｍＭ ＭＯＰＳ‐Ｋ バッファー（ｐＨ７．７）で洗浄後、同バッファーに溶解し、超音波破砕した。遠心上清（１２，０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）を粗酵素抽出液とした。

【0243】

粗酵素液のタンパク質濃度は、粗酵素液及び検量線作成のための濃度既知のＢＳＡをそれぞれＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ社）と反応し発色後、ＵＶプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｉｃｅｓ， ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘ １９０）でＯＤ５９５ｎｍを測定し、検量線からタンパク濃度を求めた。

【0244】

溶液中の酵素活性は以下の手順で求めた。ＭＯＰＳ−Ｋ バッファー ｐＨ７．７，３．５ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，３ｍＭ ＡＴＰ，０．３ｍＭ ＣｏＡ，１０質量％ 粗酵素液をマイクロウェル上で混合し、室温で３０分間インキュベートした後、バックグラウンドとしてＯＤ３２４ｎｍの経時変化をＵＶプレートリーダーで測定し、それから最終濃度が５ｍＭになるよう（Ｓ）−Ｌ−リンゴ酸ナトリウム溶液ｐＨ７．５を添加して、ＯＤ３２４ｎｍの経時変化を測定した。検量線として、グリオキシル酸を上記のバッファーに添加して、５分間室温放置して、ＯＤ３２４ｎｍを測定し、グリオキシル酸の検量線を作成した。酵素活性の値は、上記の（Ｓ）−Ｌ−リンゴ酸ナトリウム添加後のＯＤ３２４ｎｍの傾きから、バックグラウンドの傾きを差し引き、グリオキシル酸の検量線からグリオキシル酸の消費速度に換算した。それから、グリオキシル酸の消費速度をタンパク濃度で割ることで、タンパクあたりの酵素活性を求めた（表６）。
表６に示されるように、ＭＴ−１〜ＭＴ−３のいずれについても、酵素活性が確認された。中でも、ＭＴ−２株及びＭＴ−３株は、ＭＴ−１株と比較しても、酵素活性が高いことがわかった。これに対してコントロールでは、酵素活性が認められなかった。

【0245】

【表6】

【0246】

［実施例１７］
＜マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼ導入株の生菌数及びプラスミド保持率＞
１００ｍＬの三角フラスコに、５０ｇ／Ｌのグルコース及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３０ｍＬのＭ９最小培地及びＬＢ培地を準備した。前記のｍｔｋ及びｍｃｌ発現株をＭ９最小培地又はＬＢ培地に接種し、シリコン栓で密封して３０℃、１００ｒｐｍで２４時間培養した。培養液を水で希釈して、抗生物質を含まないＬＢプレートに１００μＬ塗布し、全生菌数を測定した。また、希釈した培養液を、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに塗布し、ｍｔｋ（ｓｍｔ））及びｍｃｌ保有プラスミドを保持する菌数を測定した。
表７に示されるように、ＭＴ−２およびＭＴ−３は、ＭＴ−１株よりも、培養液中の全生菌数の割合が高く、良好に増殖していることがわかった。また、ｍｔｋ、ｍｃｌを保有するプラスミドは、ＭＴ−１〜３株のそれぞれで、安定に保持されていた。

【0247】

【表7】

【0248】

［実施例１８］
＜グラニュリバクター ベセスデンシスＢＡＡ−１２６０由来マレートチオキナーゼ発現プラスミドの構築＞
ＡＴＣＣからグラニュリバクター ベセスデンシスのゲノムＤＮＡ（Ｇｒａｎｕｌｉｂａｃｔｅｒ ｂｅｔｈｅｓｄｅｎｓｉｓ）ＢＡＡ−１２６０Ｄ−５を購入した。
グラニュリバクター ベセスデンシスのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧＡＣＧＴＣＣＡＴＧＡＧＴＡＣＣＡ（配列番号７７）及びＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＣＡ（配列番号７８）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、グラニュリバクターのｍｔｋフラグメントを得た。また、実施例１２で作製したｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｈｍｅ）＿ｍｔｋ（Ｈｍｅ）＿ｍｃｌを鋳型として、ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡ（配列番号７９）及びＴＧＧＴＡＣＴＣＡＴＧＧＡＣＧＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧ（配列番号８０）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、ハイホマイクロビウムのｍｃｌフラグメントを得た。得られたグラニュリバクターのｍｔｋフラグメントとハイホマイクロビウムのｍｃｌフラグメントを鋳型として、配列番号７９及び配列番号７８をプライマーとしてＰＣＲを実施し、ハイホマイクロビウムのｍｃｌ及びグラニュリバクターのｍｔｋフラグメント遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを得た。ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し得られたフラグメントと実施例１０で作製したプラスミドｐＭＷＧＫＣをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断して得られたプラスミドを連結した。得られたプラスミドをｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｈｍｅ）＿ｍｔｋ（Ｇｂ）と命名した。
ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｈｍｅ）＿ｍｔｋ（Ｇｂ）は、グラニュリバクター ベセスデンシス由来のｍｔｋＡの遺伝子（配列番号８１）、及びｍｔｋＢの遺伝子（配列番号８２）を含む。また、グラニュリバクター ベセスデンシス由来ｍｔｋＡのアミノ酸配列、及びｍｔｋＢのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０７、及び配列番号１０８に示すとおりである。

【0249】

［実施例１９］
＜ハイフォマイクロビウム デニトリフィカンスＤＳＭ１８６９由来マレートチオキナーゼ発現プラスミドの構築＞
ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｇｅｒｍａｎｙ）からハイフォマイクロビウム デニトリフィカンス（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＤＳＭ１８６９を購入した。ＤＳＭ１８６９をＤＳＭＺの培地番号８０３で培養し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いて染色体ＤＮＡを得た。
ハイフォマイクロビウム デニトリフィカンスのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＡＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＡＴＡＣＣＣＴＣＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＡＡＧＣ（配列番号８３）及びＧＣＣＣＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＴＴＧＣＣＧＡＧＡＡＣＣ（配列番号８４）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、ハイフォマイクロビウムのｍｃｌ−ｍｔｋフラグメントを得た。ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し得られたフラグメントと実施例１２で作製したプラスミドｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｈｍｅ）＿ｍｔｋ（Ｈｍｅ）＿ｍｃｌをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断して得られたプラスミドを連結した。得られたプラスミドをｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｈｄｅ）＿ｍｔｋ（Ｈｄｅ）＿ｍｃｌと命名した。
ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｈｄｅ）＿ｍｔｋ（Ｈｄｅ）＿ｍｃｌは、ハイフォマイクロビウム デニトリフィカンス由来のｍｃｌの遺伝子配列（配列番号８５）、ｍｔｋＡの遺伝子（配列番号８６）、及びｍｔｋＢの遺伝子（配列番号８７）を含む。また、ハイフォマイクロビウム デニトリフィカンス由来ｍｃｌのアミノ酸配列、ｍｔｋＡのアミノ酸配列、及びｍｔｋＢのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０９、配列番号１１０、及び配列番号１１１に示すとおりである。

【0250】

［実施例２０］
＜ニトロソモナス ユーロピアＮＢＲＣ１４２９８由来マレートチオキナーゼ発現プラスミドの構築＞
ＮＢＲＣ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， ＮＩＴＥ）からニトロソモナス ユーロピア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ）ＮＢＲＣ１４２９８を購入した。ＮＢＲＣ１４２９８をＮＢＲＣの培地番号８２９で培養し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いて染色体ＤＮＡを得た。
ニトロソモナス ユーロピアのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧＣＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＧＴＣＡＴＡＣＣＣＴＧＴＡＴＧＡＡＣＣＡＡＡＡＣＡＣＣ（配列番号８８）及びＣＡＧＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＡＧＴＣＣＧＧＣＣＡＧＡＡＣＴＴＴＴＧＣＧＡＣＧ（配列番号８９）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、ニトロソモナス ユーロピアのｍｔｋフラグメントを得た。ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し得られたフラグメントと実施例１２で作製したプラスミドｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｈｍｅ）＿ｍｔｋ（Ｈｍｅ）＿ｍｃｌをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断して得られたプラスミドを連結した。得られたプラスミドをｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｎｅ）＿ｍｔｋ（Ｎｅ）＿ｍｃｌと命名した。
ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｎｅ）＿ｍｔｋ（Ｎｅ）＿ｍｃｌは、ニトロソモナス ユーロピア由来のｍｃｌの遺伝子配列（配列番号９０）、ｍｔｋＡの遺伝子（配列番号９１）、及びｍｔｋＢの遺伝子（配列番号９２）を含む。また、ニトロソモナス ユーロピア由来ｍｃｌのアミノ酸配列、ｍｔｋＡのアミノ酸配列、及びｍｔｋＢのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１２、配列番号１１３、及び配列番号１１４に示すとおりである。

【0251】

［実施例２１］
＜メチロコッカス キャプスラタスＡＴＣＣ３３００９由来マレートチオキナーゼ発現プラスミドの構築＞
ＡＴＣＣからメチロコッカス キャプスラタスのゲノムＤＮＡ（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）ＡＴＣＣ３３００９Ｄ−５を購入した。
メチロコッカス キャプスラタスのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＡＡＡＡＴＣＧＴＣＴＡＣ（配列番号９３）及びＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣ（配列番号９４）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、メチロコッカスのｍｃｌ−ｍｔｋフラグメントを得た。ＮｄｅＩとＸｂａＩで切断し得られたフラグメントと実施例１０で作製したプラスミドｐＭＷＧＫＣもしくはｐＭＷＧＣをＮｄｅＩとＸｂａＩで切断して得られたプラスミドを連結した。得られたプラスミドをｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）もしくはｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）と命名した。
ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）もしくはｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）は、メチロコッカス キャプスラタス由来のｍｃｌの遺伝子配列（配列番号９５）、ｍｔｋＡの遺伝子配列（配列番号９６）、及びｍｔｋＢの遺伝子配列（配列番号９７）を含む。また、メチロコッカス キャプスラタス由来ｍｃｌのアミノ酸配列、ｍｔｋＡのアミノ酸配列、及びｍｔｋＢのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１５、配列番号１１６、及び配列番号１１７に示すとおりである。

【0252】

［実施例２２］
＜アンカルチャードガンマプロテオバクテリアＧｅｎＢａｎｋ：ＡＰ０１１６４１．１由来マレートチオキナーゼ発現プラスミドの構築＞
アンカルチャードガンマプロテオバクテリア由来ｍｔｋを取得するために、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＰ０１１６４１．１のアミノ酸配列をもとにガンマプロテオバクテリア由来ｍｔｋを設計し、ＤＮＡ合成により以下のＤＮＡフラグメント（配列番号９８）を作製した。
作製したＤＮＡフラグメントを鋳型として、ＧＴＴＧＡＡＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣＧＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡＴＴＣＡＣＧＡＡＴＡＴＣＡ（配列番号９９）及びＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣ（配列番号１００）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、ガンマプロテオバクテリアのｍｔｋフラグメントを得た。また、実施例２１で作製したｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）もしくはｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）を鋳型として、配列番号９３及びＴＧＡＴＡＴＴＣＧＴＧＡＡＴＧＴＴＣＡＴＧＧＡＣＧＡＴＣＴＣＣＴＣＧＴＴＣＡＡＣ（配列番号１０１）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、メチロコッカスのｍｃｌフラグメントを得た。得られたガンマプロテオバクテリアのｍｔｋフラグメントとメチロコッカスのｍｃｌフラグメントを鋳型として、配列番号９３及び配列番号１００をプライマーとしてＰＣＲを実施し、メチロコッカスのｍｃｌ及びガンマプロテオバクテリアのｍｔｋフラグメント遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを得た。ＮｄｅＩとＸｂａＩで切断し得られたフラグメントと実施例１０で作製したプラスミドｐＭＷＧＫＣをＮｄｅＩとＸｂａＩで切断して得られたプラスミドを連結した。得られたプラスミドをｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（ｇａｍｍａ）と命名した。
ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（ｇａｍｍａ）は、アンカルチャードガンマプロテオバクテリア由来のｍｔｋＡの遺伝子（配列番号１０２）、及びｍｔｋＢの遺伝子（配列番号１０３）を含む。また、アンカルチャードガンマプロテオバクテリア由来ｍｔｋＡのアミノ酸配列、及びｍｔｋＢのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１８、及び配列番号１１９に示すとおりである。

【0253】

［実施例２３］
＜マレートキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼ導入イソプロピルアルコール生産ａｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失、ｇｎｄ遺伝子欠失、ｌｄｈＡ遺伝子欠失、ｆｕｍＡＣ遺伝子欠失、ａｃｅＢＡ遺伝子欠失、ｇｌｃＢ遺伝子欠失株の作製＞
実施例８で作製した大腸菌Ｂ株（ａｔｏＤＡＢ，△ｐｇｉ＿ｇｎｔＲ＿ｇｎｄ＿ｌｄｈＡ＿ａｃｅＢＡ＿ｇｌｃＢ＿ｆｕｍＡＣ）のコンピテントセルに、実施例１８〜２２で作製したプラスミドｐＩａｚと、ｍｔｋ及びｍｃｌの各発現プラスミドを形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹し生育した株をそれぞれ以下のように命名した（表８参照）。
なお、表８記載の株番号は、大腸菌Ｂ株（ａｔｏＤＡＢ，△ｐｇｉ＿ｇｎｔＲ＿ｇｎｄ＿ｌｄｈＡ＿ａｃｅＢＡ＿ｇｌｃＢ＿ｆｕｍＡＣ）に、ｐＩａｚと表８記載のプラスミドを導入した株を意味する。

【0254】

【表8】

【0255】

［実施例２４］
＜リンゴ酸を基質としたグリオキシル酸生産活性測定＞
実施例１６と同様の方法により、タンパクあたりの酵素活性を求めた（表９）。
表９に示されるように、ＭＴ−４〜ＭＴ−８のいずれにおいても、酵素活性が確認され、ＭＴ−１株と比較しても、酵素活性が高かった。中でも、ＭＴ−５株、ＭＴ−６株、ＭＴ−７株及びＭＴ−８株は、実施例１６にて示したＭＴ−２及びＭＴ−３株と同等かそれ以上に活性が高いことがわかった。これに対してコントロールでは、酵素活性が認められなかった。

【0256】

【表9】

【0257】

［実施例２５］
＜ａｔｏＤゲノム強化、ａｃｅＢ遺伝子欠失株の作製＞
リンゴ酸シンターゼ（以下、ａｃｅＢと略することがある）をコードする遺伝子（１６０２ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＧＣＧＣＡＴＣＧＡＴＴＣ（配列番号２４）、ＧＴＴＡＴＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＴＣＡＴＧＧ（配列番号１０４）、ＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＴＡＡＣＴＡＴＧＧＡＧ（配列番号１０５）、ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧ（配列番号１０６）、に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号およびのプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位をそれぞれ有している。
エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２４と配列番号１０６のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ａｃｅＢ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号１０５と配列番号１０６のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ａｃｅＢ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ａｃｅＢ−ＬとａｃｅＢ−Ｒ断片を鋳型に配列番号２４と配列番号１０８のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ａｃｅＢ−ＬＲ断片と呼ぶことがある）。このａｃｅＢ−ＬＲ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ＥｃｏＲＩで消化し、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ消化物と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ａｃｅＢ−ＬＲ断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＴＨ１８ｃｓ１−ａｃｅＢとした。
こうして得られたプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ａｃｅＢを実施例１で作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ａｃｅＢ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ株ａｔｏＤゲノム強化、ａｃｅＢ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ）株と略することがある）と命名した。

【0258】

［実施例２６］
＜ａｔｏＤゲノム強化、ａｃｅＢ遺伝子欠失、ｇｌｃＢ遺伝子欠失株の作製＞
実施例７で作製したプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｃｌＢを実施例２５で作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｌｃＢ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ株ａｔｏＤゲノム強化、ａｃｅＢ遺伝子欠失、ｇｌｃＢ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ△ｇｌｃＢ株と略することがある）と命名した。

【0259】

［実施例２７］
＜ａｔｏＤゲノム強化、ｌｄｈＡ遺伝子欠失株の作製＞
実施例５で作製したプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｌｄｈＡを実施例１で作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｌｄｈＡ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をａｔｏＤゲノム強化、ｌｄｈＡ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｌｄｈＡ株と略することがある）と命名した。

【0260】

［実施例２８］
＜ｐＢＲｇａｐＰ、ｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）／Ｂ株、ｐＢＲｇａｐＰ、ｐＭＷＧＣ／Ｂ株の作製＞
大腸菌Ｂ株のコンピテントセルに、実施例２で作製したプラスミドｐＢＲｇａｐＰと、実施例２１で作製したプラスミドｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）、もしくはｐＭＷＧＣを形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹し生育した株を得た。

【0261】

［実施例２９］
＜ｐＩａ、ｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株、ｐＩａ、ｐＭＷＧＣ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株の作製＞
実施例１で作製した大腸菌Ｂ株（Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ）のコンピテントセルに、実施例９で作製したプラスミドｐＩａと、実施例２１で作製したプラスミドｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）、もしくはｐＭＷＧＣを形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹し生育した株を得た。

【0262】

［実施例３０］
＜ｐＩａ、ｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ株、ｐＩａ、ｐＭＷＧＣ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ株の作製＞
実施例２５で作製した大腸菌Ｂ株（Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ）のコンピテントセルに、実施例９で作製したプラスミドｐＩａと、実施例２１で作製したプラスミドｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）、もしくはｐＭＷＧＣを形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹し生育した株を得た。

【0263】

［実施例３１］
＜ｐＩａ、ｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ△ｇｌｃＢ株、ｐＩａ、ｐＭＷＧＣ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ△ｇｌｃＢ株の作製＞
実施例２６で作製した大腸菌Ｂ株（Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ△ｇｌｃＢ）のコンピテントセルに、実施例９で作製したプラスミドｐＩａと、実施例２１で作製したプラスミドｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）、もしくはｐＭＷＧＣを形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹し生育した株を得た。

【0264】

［実施例３２］
＜ｐＩａ、ｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｌｄｈＡ株、ｐＩａ、ｐＭＷＧＣ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｌｄｈＡ株の作製＞
実施例２７で作製した大腸菌Ｂ株（Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｌｄｈＡ）のコンピテントセルに、実施例９で作製したプラスミドｐＩａと、実施例２１で作製したプラスミドｐＭＷＧＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）、もしくはｐＭＷＧＣを形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹し生育した株を得た。

【0265】

［実施例３３］
＜イソプロピルアルコールの生産＞
本実施例では、ＷＯ２００９／００８３７７号パンフレット図１に示される生産装置を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽は３リットル容のガラス製のものを使用し、トラップ槽には、トラップ液としての水（トラップ水）を１槽あたり９Ｌの量で注入し、２台連結して使用した。
イソプロピルアルコール生産評価に用いた株の一覧を表１０として示した。

【0266】

【表10】

【0267】

前培養として２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ， Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）５０ｍＬを入れた５００ｍＬ容三角フラスコに各評価株を植菌し、一晩、培養温度３０℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養４５ｍＬを、以下に示す組成の培地９００ｇの入った３Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＳ−ＰＩ）に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．４５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度４９０ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ７．０（ＮＨ_３水溶液で調整）で行った。培養開始から８時間後までの間、５０ｗｔ／ｗｔ％のグルコース水溶液を２０ｇ／Ｌ／時間の流速で添加した。その後は５０ｗｔ／ｗｔ％のグルコース水溶液を２０ｇ／Ｌ／時間の流速で、培養槽内にグルコースがなるべく残存しないように適宜添加した。培養開始から３０時間まで数回、菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中及びトラップ水中のイソプロピルアルコール、アセトン及び主な副産物の蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ槽２台中の合算値である。結果を表１１、副産物を表１２に示した。
＜培地組成＞
コーンスティープリカー（日本食品化工製）：５０ｇ／Ｌ
Ｆｅ_２ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．１ｇ／Ｌ
Ｋ_２ＨＰＯ_４：２ｇ／Ｌ
ＫＨ_２ＰＯ_４：２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：２ｇ／Ｌ
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４：２ｇ／Ｌ
アデカノールＬＧ１２６（旭電化工業）０．１ｇ／Ｌ
（残部：水）

【0268】

【表11】

【0269】

【表12】

【0270】

評価の結果、対照株（ｖｅｃ／ａｔｏＤＡＢ）のイソプロピルアルコール生産量は３３．２ｇ／３０ｈであり、ｍｔｋ導入株（ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ａｔｏＤＡＢ）の生産量は３４．６ｇ／３０ｈであった。アセトンの生産量は対照株（ｖｅｃ／ａｔｏＤＡＢ）では６．０ｇ／３０ｈ、ｍｔｋ導入株（ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ａｔｏＤＡＢ）は８．８ｇ／３０ｈであった。このことから、ｍｔｋ＋ｍｃｌを導入した方がイソプロピルアルコール、アセトンの生産量が向上することがわかった。また、３０ｈにおけるイソプロピルアルコールの対糖収率は対照株（ｖｅｃ／ａｔｏＤＡＢ）では１５．８％、ｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ａｔｏＤＡＢ）では、１６．５％、イソプロピルアルコールとアセトンの対糖収率は対照株（ｖｅｃ／ａｔｏＤＡＢ）では１８．６％、ｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ａｔｏＤＡＢ）では、２０．７％を示した。このことから、ｍｔｋ＋ｍｃｌの経路を導入することにより、糖のイソプロピルアルコール、アセトンへの変換効率が向上していることが示された。
同様にａｔｏＤＡＢ△ｌｄｈＡにおいてもｍｔｋ＋ｍｃｌを導入した株の方がイソプロピルアルコール、アセトンの生産量、対糖収率ともにａｔｏＤＡＢと同様に向上していることが示された。ａｔｏＤＡＢ△ｌｄｈＡ、ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ、ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ△ｇｌｃＢにおいて、対糖収率がそれぞれの株の対照株（ｖｅｃ）よりｍｔｋ＋ｍｃｌを導入した株の方が向上したことから、ｍｔｋ＋ｍｃｌによりアセチルＣｏＡ、アセチルＣｏＡに由来する有用物質が効率的に増加したと考えられる。
表１２では副産物を示した。３０ｈにおける対照株（ｖｅｃ／Ｂ）とｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（ｍｔｋ＿ｍｃｌ／Ｂ）を比較するとエタノール、ピルビン酸、コハク酸の量が減少しており、副産物の総量においても予想外にｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株の方が対照株に対して、減少していることが分かった。同様にａｔｏＤＡＢ、ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ、ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ△ｇｌｃＢ、ａｔｏＤＡＢ△ｌｄｈＡにおいてもｍｔｋ＋ｍｃｌを導入した株の方がエタノール、ピルビン酸、コハク酸、副産物の総量が対照株に対して、減少していることが示された。このことから、ａｔｏＤＡＢあるなしに関わらず、ｍｔｋ＋ｍｃｌによる同様の効果がみられることがわかった。
ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ及びａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ△ｇｌｃＢではＩＰＡ及びＩＰＡとアセトンの対糖収率は、ａｔｏＤＡＢ株と比較してほぼ同等であるが、ｖｅｃ、ｍｔｋ導入株共に副産物の総量が減っており、特にｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株において予想外に乳酸、コハク酸の蓄積が顕著に減少していた。培養液中からのイソプロピルアルコール、アセトンの回収の際、副産物が少ないと精製負荷を格段に軽減できることから、ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ及びａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ△ｇｌｃＢは工業上望ましい。
同様にａｔｏＤＡＢ△ｌｄｈＡにおいてもｍｔｋ＋ｍｃｌを導入した株の方がイソプロピルアルコール、アセトンの生産量、対糖収率ともにａｔｏＤＡＢと同様に向上していることが示された。また上記の株すべてにおいて、対糖収率が対照株（ｖｅｃ）よりｍｔｋ＋ｍｃｌを導入した株において向上したことから、アセチルＣｏＡ、アセチルＣｏＡに由来する有用物質が効率的に増加したと考えられる。
ａｔｏＤＡＢ△ｌｄｈＡにおいては、副産物の総量が減っているのと同時にｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株においてピルビン酸の蓄積が顕著に減少していた。さらにｍｔｋ＋ｍｃｌ導入したａｔｏＤＡＢ△ｌｄｈＡにおいてイソプロピルアルコール、アセトンの対糖収率が高いことから、効率よくグルコースとｍｔｋ＋ｍｃｌの経路の双方からイソプロピルアルコール、アセトンへ流れていることが示された。ａｔｏＤＡＢ△ｌｄｈＡでは上記ａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ及びａｔｏＤＡＢ△ａｃｅＢ△ｇｌｃＢと同様に副産物が少ないことに加えてｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株においてイソプロピルアルコール、アセトンの対糖収率が高い。イソプロピルアルコール、アセトンの回収の際の精製負荷の軽減と収率の向上の双方から工業的にイソプロピルアルコール、アセトンを生産する上でｌｄｈＡ破壊が好ましいことを示している。
Ｂ株においてはイソプロピルアルコール、アセトンの生産経路が導入されていない。酢酸が顕著に増加したことから、アセチルＣｏＡは主として酢酸の方に流れたと考えられる。また、ｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（ｍｔｋ＿ｍｃｌ／Ｂ）において、増加したアセチルＣｏＡは酢酸とエタノールへと流れたと予測される。このことからＢ株においてもｍｔｋ＋ｍｃｌの効果により、アセチルＣｏＡが増加していることが示された。

【0271】

［実施例３４］
＜プラスミドｐＧＡＰＳの構築＞
スペクチノマイシン耐性遺伝子を取得するため、プラスミドｐＩＣ１５６（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ｅｔ． Ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １９９４， １４２（１）：７９−８３）をテンプレートに用いて、ＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＧＴＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＴＧＴＧＡＡＡＧＧ（配列番号１２０）及びＣＴＴＴＴＧＴＴＴＡＴＡＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＣＣＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＴＴＣＴＴＴＴＣＡＣ（配列番号１２１）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントをＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｏｙｏｂｏ）でリン酸化することで、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを得た。それから、プラスミドｐＧＡＰをＰｖｕＩで処理し、ＤＮＡ断片をＴｏｙｏｂｏ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈで平滑化して、前述のスペクチノマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメントと連結させ、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、スペクチノマイシン１２０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをスペクチノマイシン１２０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて一晩培養し、得られたプラスミドをｐＧＡＰＳと命名した。

【0272】

［実施例３５］
＜プラスミドｐＧＡＰＳ＿ｇｃｌの作製＞
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株から、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いて染色体ＤＮＡを得た。
グリオキシル酸カルボリガーゼ（ｇｃｌ， ＮＣＢＩ−ＧＩ：９４５３９４）を含むオペロンを参考にして、２種のプライマー ＡＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＣＣＧＴＴＧＡＣＧＣＧＧＣＡＡＴＧ（配列番号１２２）及びＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＣＣＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＡＧＣＣＡＴＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣ（配列番１２３）を作製した。
また、２種のプライマー ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴＴＧＴＣＡＴＴＧＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＴＴＴＴＡＡＡＧＡＧＡＧＣＴ（配列番号１２４）及びＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＴＴＴＴＡＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧを（配列番号１２５）作製した。
上記で得られた配列番号１２２と配列番号１２３のプライマーを用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し約３ｋｂの増幅ＤＮＡを得た。それから、上記で得られた１２４と配列番号１２５のプライマーを用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、約１．１ｋｂの増幅ＤＮＡを得た。増幅ＤＮＡをそれぞれＰｓｔＩで切断、連結した。この連結ＤＮＡをテンプレートとして、ＡＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＣＣＧＴＴＧＡＣＧＣＧＧＣＡＡＴＧ（配列番号１２６）及びＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＴＴＴＴＡＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧ（配列番号１２７）をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡを得た。この増幅ＤＮＡをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同様に制限酵素で切断したプラスミドｐＧＡＰＳと連結した。エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換して、スペクチノマイシンを含むＬＢ寒天プレートで培養し、得られた形質転換体からプラスミドを回収した。
このプラスミドを制限酵素ＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＧＡＰＳとｇｃｌの遺伝子を含む、約４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片は、末端を平滑化後、セルフライゲーションさせてから、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換して、１２０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天プレートで培養し、生育した菌を１２０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ液体培地で培養して、形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、プラスミドｐＧＡＰＳ＿ｇｃｌを得た。

【0273】

［実施例３６］
＜パントエア・アナナティス ＰＡ株の取得＞
パントエア・アナナティスＡＪ１３６０１（特許寄託菌株ＢＰ−７２０７）からプラスミドＲＳＦＣＰＧを取り出した。プラスミドＲＳＦＣＰＧは、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素である、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、を有する、テトラサイクリン耐性のプラスミドである（特開２００１―３３３７６９号公報）。ＲＳＦＣＰＧを用い、パントエア・アナナティスＡＪ４１７（特許寄託菌株ＢＰ−８６４６）をＣａＣｌ_２法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ， ２００１）で形質転換し、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬＢ培地で培養して、パントエア・アナナティスＡＪ４１７／ＲＳＦＣＰＧ（以後ＰＡ株と略することがある）を取得した。

【0274】

［実施例３７］
＜パントエア・アナナティス ａｃｅＢ遺伝子欠失株の作製＞
パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５（特許寄託菌株ＢＰ−６６１４）のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＰ０１２０３２）、パントエア・アナナティスのマレートシンターゼ（以下ＰＡａｃｅＢと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ＿０１７５３１）。ａｃｅＢをコードする遺伝子（１，５９９ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＡＣＴＣＧＧＴＴＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＡＡＴＴＡＣＴＴＴＴＣＡＧ（配列番号１２８）、ＧＡＣＧＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＴＡＧＡＧＡＧＣ（配列番号１２９）、ＴＴＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＴＴＣＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＧＣＧＣＡＡＴＧＡＡＴＧ（配列番号１３０）、ＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＴＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＧ（配列番号１３１）、に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。
また、カナマイシン耐性遺伝子をクローニングするため、ＴＴＴＴＴＣＡＴＡＡＣＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣ（配列番号１３２）、ＣＧＣＧＣＧＣＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＣ（配列番号１３３）、に示すオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成した。

【0275】

パントエア・アナナティスＡＪ４１７株のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２８と配列番号１２９のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことによりａｃｅＢ遺伝子近傍の配列を含むのＤＮＡ断片を増幅した（以下ＰＡａｃｅＢ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号１３０と配列番号１３１のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことによりａｃｅＢ遺伝子近傍の配列を含むのＤＮＡ断片を増幅した（以下ＰＡａｃｅＢ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。また、カナマイシン耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＵＣ４Ｋを、配列番号１３２と配列番号１３３のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことによりカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下ＫａｎＲ断片と呼ぶことがある）。また、プラスミドｐＵＣ１８をＥｃｏＲＩ とＸｍａＩで処理し、ｐＵＣ１８断片を作製した。これらのＰＡａｃｅＢ−Ｌ断片、ＰＡａｃｅＢ−Ｒ断片、ＫａｎＲ断片、ｐＵＣ１８断片を回収し、それぞれの断片を混合して、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて処理し、エシェリヒア・コリＤＨ５α（ＮＥＢ５α；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）コンピテントセルを形質転換し、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレートで培養した。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ＤＮＡシーケンシングによりｐＵＣ１８ベクター中で、ａｃｅＢ前方部分配列＿カナマイシン耐性遺伝子＿ａｃｅＢ後方部分配列、という配列が構築されたことを確認した。このプラスミドを鋳型として、ＧＣＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号１３４）及び ＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＴＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＧ（配列番号１３５）でＰＣＲを行い、精製して、増幅産物をＥｃｏＲＩで切断し、ＤＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ）によりセルフライゲーションさせることで、複製起点を有さないプラスミドを得た。このプラスミドを用い、パントエア・アナナティスＡＪ４１７株を形質転換して、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレートで培養した。得られたコロニーについて、ａｃｅＢ遺伝子が正しく欠失していることをゲノムＰＣＲとＤＮＡシーケンシングにより確認した。取得した株を、ＲＳＦＣＰＧを用いＣａＣｌ_２法で形質転換し、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬＢ培地で培養して、パントエア・アナナティスＡＪ４１７株ａｃｅＢ遺伝子欠失株（ＰＡ△ａｃｅＢ株と略することがある）と命名した。

【0276】

［実施例３８］
＜パントエア・アナナティス ｆｕｍＡ遺伝子欠失株の作製＞
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒ． １６８（ＡＴＣＣ ２３８５７）のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＡＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＡＡＣＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号１３６）、及びＡＧＴＣＴＡＧＡＡＧＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴ（配列番号１３７）のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩで消化することで約２．０ｋｂｐのｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＨＳＧ２９８（Ｔａｋａｒａ）を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したＤＮＡフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＨＳＧ２９８にｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが挿入されたプラスミドｐＨＳＧ−ｓａｃＢを得た。

【0277】

パントエア・アナナティス ＡＪ１３３５５が元来保有するプラスミドｐＥＡ３２０の全塩基配列は公知であり（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＣ＿０１７５３３．１）、フマル酸ヒドラターゼ クラスＩ（以下ｆｕｍＡと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている。ｆｕｍＡをコードする遺伝子（１，６４７ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＧＣＡＡＣＧＴＴＧＧＣＴＣＴＣＡＴＣＴ（配列番号１３８）、ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＡＣＧＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＣＡ（配列番号１３９）、ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＡＣＧＣＡＧＧＣＴＧＡＣ（配列番号１４０）及びＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣ（配列番号１４１）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。
パントエア・アナナティス ＡＪ４１７株のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３８と配列番号１３９のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約０．７ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｆｕｍＡ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号１４０と配列番号１４１のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｆｕｍＡ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。
これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｆｕｍＡ−Ｌ断片及びｆｕｍＡ−Ｒ断片をＢａｍＨＩでそれぞれ消化し、リガーゼを用いて結合した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’末端リン酸化処理を行った。本ＤＮＡ断片と、上記ｐＨＳＧ−ｓａｃＢをＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った後、さらにアルカリフォスファターゼ処理したＤＮＡフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｆｕｍＡをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’近傍断片の２つの断片がｐＨＳＧ−ｓａｃＢに正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをｐｓａｃＢ−ＰＡｆｕｍＡと命名した。
ｐｓａｃＢ−ＰＡｆｕｍＡは、パントエア・アナナティス内で複製可能なプラスミドである。そこで、複製起点を有さずパントエア・アナナティス内で複製不能なｆｕｍＡ遺伝子欠失用プラスミドを得るために、ｐｓａｃＢ−ＰＡｆｕｍＡを鋳型に、ＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣ（配列番号１４２）及び５’末端側にＳａｃＩ認識部位を有するＴＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡ（配列番号１４３）のプライマーペアを用いたＰＣＲにより約５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅した。このＤＮＡ断片をＳａｃＩで消化し、リガーゼを用いて結合することでプラスミドｐＰＡｆｕｍＡを得た。得られたｐＰＡｆｕｍＡは、ｆｕｍＡ−Ｌ断片、ｆｕｍＡ−Ｒ断片、ｓａｃＢ遺伝子、及びカナマイシン耐性遺伝子を含み、複製起点を有さない。エレクトロポレーション法により、ｐＰＡｆｕｍＡを用いてパントエア・アナナティス ＡＪ４１７を形質転換し、これをカナマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株をＬＢ培地で一晩液体培養し、培養液を１０％（Ｗ／Ｖ）スクロース含有ＬＢ寒天培地に塗付した。
次に、上記の培地で得られたクローンからカナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示したクローンを選択した。更にこれらのクローンの染色体ＤＮＡから配列番号１３８と配列番号１４１のプライマーペアを用いたＰＣＲにより、ｆｕｍＡ遺伝子が欠失したことで約１．５ｋｂｐ断片の増幅が得られる株を選抜し、得られた株をパントエア・アナナティス ＡＪ４１７株ｆｕｍＡ遺伝子欠失株（以下ＰＡ△ｆｕｍＡ株と略することがある）と命名した。

【0278】

［実施例３９］
＜パントエア・アナナティス ｆｕｍＡ遺伝子欠失、ｆｕｍＣ遺伝子欠失株の作製＞
フマル酸ヒドラターゼ クラスＩＩ（以下ｆｕｍＣと呼ぶことがある）をコードする遺伝子（１，３９８ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧ（配列番号１４４）、ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴＡＧＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＴＧ（配列番号１４５）、ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＡＡＧＡＴＴＧＣＴＡＡＣＧＡＣＧ（配列番号１４６）及びＴＧＡＴＧＣＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＡＣＧＣ（配列番号１４７）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。
パントエア・アナナティス ＡＪ４１７株のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１４４と配列番号１４５のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｆｕｍＣ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号１４６と配列番号１４７のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約０．７ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｆｕｍＣ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。
これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｆｕｍＣ−Ｌ断片及びｆｕｍＣ−Ｒ断片をＢａｍＨＩでそれぞれ消化し、リガーゼを用いて結合した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’末端リン酸化処理を行った。本ＤＮＡ断片と、実施例３８で作製したｐＨＳＧ−ｓａｃＢをＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った後、さらにアルカリフォスファターゼ処理したＤＮＡフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｆｕｍＣをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’近傍断片の２つの断片がｐＨＳＧ−ｓａｃＢに正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをｐｓａｃＢ−ＰＡｆｕｍＣと命名した。
プラスミドｐｓａｃＢ−ＰＡｆｕｍＡをｐｓａｃＢ−ＰＡｆｕｍＣと変更した以外は、実施例３８と同様の方法で、複製起点を有さずパントエア・アナナティスム内で複製不能なｆｕｍＣ遺伝子欠失用プラスミドｐＰＡｆｕｍＣを得た。更に、実施例３８で用いたプラスミドｐＰＡｆｕｍＡをｐＰＡｆｕｍＣとし、形質転換に用いたパントエア・アナナティス ＡＪ４１７株をＰＡ△ｆｕｍＡ株とした以外は、実施例３８と同様の方法で、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示したクローンを選択した。更にこれらのクローンの染色体ＤＮＡから配列番号１３８と配列番号１４１のプライマーペアを用いたＰＣＲにより、ｆｕｍＣ遺伝子が欠失したことで約１．５ｋｂｐ断片の増幅が得られる株を選抜た。取得した株を、ＲＳＦＣＰＧを用いＣａＣｌ_２法で形質転換し、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬＢ培地で培養してパントエア・アナナティス ｆｕｍＡ遺伝子欠失、ｆｕｍＣ遺伝子欠失株（以下ＰＡ△ｆｕｍＡＣ株と略することがある）と命名した。

【0279】

［実施例４０］
＜パントエア・アナナティス評価株の構築＞
実施例３６、３７、および３９で作製した、パントエア・アナナティスＰＡ株、ＰＡ△ａｃｅＢ株、ＰＡ△ｆｕｍＡＣ株、を用い、実施例３４のｐＧＡＰＳ、実施例３５のｐＧＡＰＳ＿ｇｃｌ、実施例１０のｐＭＷＧＫＣ、および実施例２１のｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）を、ＣａＣｌ_２法もしくはエレクトロポレーション法で形質転換した。それぞれの株は３０μｇ／ｍＬ クロラムフェニコール、１２０μｇ／ｍＬ スペクチノマイシン、１５μｇ／ｍＬ テトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、生育した株を評価株とした。それらの株を表１３にまとめた。

【0280】

【表13】

【0281】

［実施例４１］
＜パントエア株による^１３Ｃラベル化ＣＯ_２のグルタミン酸への導入検証＞
対象となるパントエア株を、３０μｇ／ｍＬ クロラムフェニコール、１２０μｇ／ｍＬ スペクチノマイシン、１５ μｇ／ｍＬ テトラサイクリンを含むＬＢ培地で、２２０ｒｐｍ、３０℃の条件で前培養した。前培養液から、遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分間）により菌体を回収した。それから、２０ｇ／Ｌ グルコース、３０μｇ／ｍＬ クロラムフェニコール、１２０μｇ／ｍＬ スペクチノマイシン、１５ μｇ／ｍＬ テトラサイクリン、を含む２ｍＬのパントエア用最小培地（１７ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ ＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１０μＭ ＣａＣｌ_２、５０ｍｇ／Ｌ Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ、５０ｍｇ／Ｌ Ｌ−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、ｐＨ６．０）を準備し、前培養菌体をＯＤが１〜５の範囲内になるよう調整して添加した。密栓した後、３０℃、２２０ｒｐｍで１日間培養した。培養液は定期的にサンプリングして、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３分間）して菌体を除去し、上清を親水性ＰＴＦＥメンブレンフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、ＭＳＧＶＮ２Ｂ５０）でろ過し、培養サンプルとした。培養サンプルとして用いた株を表１３にまとめた。
培養サンプルのグルタミン酸中の^１３Ｃ含量を測定する際は、適当量のサンプルを、凍結乾燥もしくは減圧乾燥などにより乾燥後、５００μＬのＭＴＢＳＴＦＡ＋１％ＴＢＤＭＳＣｌ（シグマ・アルドリッチ社製、３７５９３４）および５００μＬのｄｒｙＤＭＦを加え、８０℃で２時間加熱し、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、５分間）して、上清をＧＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａおよび５９７５ｃ）により分析した。誘導体化したグルタミン酸のｔ−ブチル基が一ヶ所外れた構造と予想される、分子量４３２、４３３、４３４のマススペクトルピークの面積を測定した。なお、分子量４３２は、すべての原子が最も豊富な同位体からなる構造で、分子量４３３および４３４は、１個および２個の中性子をさらに含む構造と考えられる。分子量が４３２、４３３、４３４のピークをそれぞれ［Ｍ＋０］、［Ｍ＋１］及び［Ｍ＋２］とし、［Ｍ＋１］／［Ｍ＋０］の値をｘ軸、［Ｍ＋２］／［Ｍ＋０］の値をｙ軸として、分析結果を図４に示した。

【0282】

通常のグルタミン酸発酵において、ＮａＨ^１３ＣＯ_３由来の^１３Ｃは、オキサロ酢酸を経て、グルタミン酸の１位もしくは５位の炭素のどちらか片方にしか導入されないため、記載された基準線上の値となる。なお、基準線は以下の式により求めた。

【0283】

ｘ＝（ｘ_０−ｘ_０×α＋α）／（１−α）
ｙ＝（ｙ_０−ｙ_０×α＋ｘ_０×α）／（１−α）

【0284】

αはグルタミン酸中のＣＯ_２由来炭素（１位もしくは５位）の^１３Ｃ同位体の割合｛≒^１３Ｃ／（^１３Ｃ＋^１２Ｃ）｝を示す。ｘおよびｙは、基準線上の任意の点の座標を示す。ｘ_０、ｙ_０は、グルタミン酸中の、ＣＯ_２由来の炭素（グルタミン酸の１位もしくは５位のどちらか片方の炭素）の同位体比における^１２Ｃの割合が１００％で、他の原子は天然の同位体比に等しい、と仮定した場合のｘおよびｙの値（すなわち、α＝０の際のｘおよびｙの値）で、それぞれ、０．３５８５２７、０．１６８２２０８４３１４と設定した。上記の式を解くと、基準線は以下の式で示される。

【0285】

ｙ＝ｘ_０・ｘ＋ｙ_０−ｘ_０^２

【0286】

本来のグルタミン酸生産経路において、ＮａＨ^１３ＣＯ_３由来の^１３Ｃは、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）といった炭酸固定酵素により固定され、オキサロ酢酸を経由して、グルタミン酸の１位もしくは５位の炭素のどちらか片方にのみ導入される。ここで、ｐｐｃが取り込む^１２ＣＯ_２と^１３ＣＯ_２の割合にしたがって、［Ｍ＋１］や［Ｍ＋２］の値は変化するが、導入される箇所が１ヶ所の場合、常に基準線上の値となる。一方、もし想定する炭酸固定経路が機能した場合、^１３Ｃは、オキサロ酢酸とアセチルＣｏＡの両方を経由するため、グルタミン酸の炭素の１位と５位に同時に導入される可能性が発生し、その結果［Ｍ＋２］の値が相対的に上昇して、基準線よりも上部の値となるはずである。
図４によると、ＰＡ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ株、ＰＡ△ａｃｅＢ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ株、ＰＡ△ｆｕｍＡＣ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ株では、基準線よりあきらかに上部の値を示した。すなわち、固定されたＣＯ_２が、アセチルＣｏＡを経由して、グルタミン酸に導入されたと考えられる。一方、対照株（ＰＡ／ｖｅｃ）では、基準線上にプロットされ、アセチルＣｏＡ経由の^１３Ｃ導入はみられなかった。また、ｍｔｋ＋ｍｃｌだけの導入株（ＰＡ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ）でも、アセチルＣｏＡ経由の^１３Ｃ導入は見られなかった。パントエア・アナナティスはｇｃｌを有しないため、ｍｔｋとｍｃｌの付与だけではグリオキシル酸の行き所がなく、反応が進行しなかったと考えられる。したがって、図１のように、ｍｔｋとｍｃｌの導入だけでなく、ｇｃｌ以降の経路をつなぐことで、ＣＯ_２がアセチルＣｏＡへと変換されることが示された。

【0287】

［実施例４２］
＜パントエア株によるグルタミン酸生産＞
実施例４１の培養液における、グルタミン酸量および副生成物の量を測定した。培養サンプル中のグルタミン酸の定量には、ＮＮ−８１４（昭和電工社）カラムを装着したＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社 ２６９５）とＵＶ／Ｖｉｓ検出器（Ｗａｔｅｒｓ社 ２４８９）を用いた。ろ液中のグルコース、およびその他生成物の定量には、ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ−８０Ｈ（信和化工社）カラムを装着したＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社 ２６９５）とＲＩ検出器（Ｗａｔｅｒｓ社 ２４１４）を用いた。結果を表１４および１５に示した。

【0288】

【表14】

【0289】

【表15】

【0290】

ｍｔｋ＋ｍｃｌ＋ｇｃｌを付与した株（ＰＡ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ）は、対照株（ＰＡ／ｖｅｃ）やｍｔｋ＋ｍｃｌを付与した株（ＰＡ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ）よりも高い対糖収率を示した。また、ａｃｅＢ遺伝子やｆｕｍＡＣ遺伝子を破壊すると、対糖収率はさらに向上した（ＰＡ△ａｃｅＢ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ、ＰＡ△ｆｕｍＡＣ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ）。
副産物量に関しては、ｍｔｋ＋ｍｃｌ＋ｇｃｌ導入株（ＰＡ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ）と対照株（ＰＡ／ｖｅｃ）を比較すると、予想外なことに、コハク酸と２，３―ブタンジオール（２，３−ＢＤＯ）の量が減少しており、副産物の総量においても減少することが分かった。さらに、ａｃｅＢ遺伝子を破壊した株（ＰＡ△ａｃｅＢ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ）と破壊前（ＰＡ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ）と比較すると、予想外なことに、コハク酸および酢酸が減少し、副産物総量も大きく減少することが判明した。ｆｕｍＡＣ遺伝子破壊株（ＰＡ△ｆｕｍＡＣ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ）においては、破壊前（ＰＡ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ）と比較して、コハク酸量は大幅に減少したが、酢酸量は増加し、副産物総量も減少した。培養液中からグルタミン酸を回収する際、副産物の量が少ないと、精製負荷を格段に軽減できることから、工業利用時の有用性は大きい。
なお、上記の副産物低減効果は、ＲＳＦＣＰＧを保有しないＰＡ株においても、同様の効果が見られた。

【0291】

［実施例４３］
＜プラスミドｐＣＡＳＥＴの作製＞
ｐＨＳＧ２９８（Ｔａｋａｒａ）をテンプレートにＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧ（配列番号１４８）、及びＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＧＡＧ（配列番号１４９）のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩで消化し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＨＳＧ２９８にＸｈｏＩの認識配列が挿入されたプラスミドをｐＨＳＧ２９８−ＸｈｏＩと命名した。
ｔａｃプロモーターを取得するためｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をテンプレートにＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＧＧＡＡＧ（配列番号１５０）、及びＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴ（配列番号１５１）のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＰｖｕＩＩ及びＳｍａＩで消化することで約０．２ｋｂｐのｔａｃプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＨＳＧ２９８−ＸｈｏＩを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理した約２．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＨＳＧ２９８−ＸｈｏＩのｌａｃプロモーターがｔａｃプロモーターに置換され、ｔａｃプロモーターの方向が元のｌａｃプロモーターと同じ向きになっているプラスミドｐＨＳＧＴ１を得た。
得られたｐＨＳＧＴ１のｔａｃプロモーターの下流にｐＨＳＧ２９８のマルチクローニングサイトを連結するために、ｐＨＳＧ２９８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩで消化することでｐＨＳＧ２９８のマルチクローニングサイトを含む約１．０ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＨＳＧＴ１を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理した約１．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｔａｃプロモーターの下流にｐＨＳＧ２９８のマルチクローニングサイトが連結されたプラスミドｐＨＳＧＴ２を得た。
コリネバクテリウム・カゼイ ＪＣＭ １２０７２から単離されたｐＣＡＳＥ１（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２００９） ８１：１１０７−１１１５）の複製起点、ｒｅｐＡ及びｒｅｐＢを含むＤＮＡフラグメント（配列番号１５２）をＤＮＡ合成により作製した。配列を以下に示す。
ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧＧＧＴＴＣＴＴＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＧＧＧＧＡＡＡＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＣＣＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＧＴＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＧＡＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＣＧＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＧＣＡＡＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＣＣＧＴＧＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣＧＣＧＣＴＣＴＣＴＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＴＴＧＣＧＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＡＡＣＧＣＧＧＴＧＧＴＴＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＴＡＡＡＣＧＧＧＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＣＡＣＣＧＡＡＴＡＣＧＣＣＡＡＡＣＧＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＧＣＣＴＡＴＧＣＣＧＣＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＧＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＧＧＡＴＡＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＡＴＧＧＧＡＴＡＧＴＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＧＡＴＡＡＧＣＴＧＴＡＴＡＣＧＣＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＴＣＧＡＡＧＡＡＡＣＣＧＧＣＴＴＴＡＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＴＣＧＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＴＡＧＧＴＣＧＴＡＡＴＴＧＣＧＣＡＣＴＣＴＴＴＧＡＡＡＧＣＧＣＡＣＧＴＡＣＧＴＧＧＧＣＡＴＡＴＣＧＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣＧＣＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＧＣＡＡＧＣＡＣＴＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＡＴＧＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＡＴＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＣＣＡＴＡＡＡＴＧＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＴＧＣＡＡＴＣＣＧＣＡＣＧＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＧＴＣＧＴＧＡＧＧＣＴＧＧＡＣＡＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＴＴＧＧＣＴＡＡＧＧＴＴＴＡＴＧＣＡＣＧＴＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＡＣＧＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＴＧＣＣＧＧＴＡＴＧＴＣＧＧＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＣＡＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＴＣＣＧＡＡＣＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＧＴＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＴＧＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＣＧＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＣＡＡＡＧＧＴＣＴＧＴＣＣＡＴＧＣＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＴＴＧＧＴＴＧＣＴＣＧＧＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＧＴＣＡＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＧＣＧＴＡＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＴＡＧＴＣＡＣＣＣＴＣＧＧＣＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧＴＣＣＡＴＣＧＴＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧ
作製したＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩで消化することで得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＨＳＧＴ２を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したＤＮＡフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＨＳＧＴ２のＸｈｏＩ認識部位にｐＣＡＳＥ１の複製起点、ｒｅｐＡ及びｒｅｐＢを含むＤＮＡフラグメントが挿入されたプラスミドをｐＣＡＳＥＴと命名した。回収したｐＣＡＳＥＴでは、ｐＣＡＳＥ１由来ｒｅｐＡの方向がｔａｃプロモーターと逆向きになっていた。

【0292】

［実施例４４］
＜プラスミドｐＣＡＳＥＬの構築＞
実施例４３で合成した、ｐＣＡＳＥ１の複製起点、ｒｅｐＡ及びｒｅｐＢを含むＤＮＡフラグメント（配列番号１５２）を制限酵素ＸｈｏＩで消化することで得られたＤＮＡフラグメントと、実施例４３で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８−ＸｈｏＩを制限酵素ＸｈｏＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したＤＮＡフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＨＳＧ２９８−ＸｈｏＩのＸｈｏＩ認識部位にｐＣＡＳＥ１の複製起点、ｒｅｐＡ及びｒｅｐＢを含むＤＮＡフラグメントが挿入されたプラスミドをｐＣＡＳＥＬと命名した。回収したｐＣＡＳＥＬでは、ｐＣＡＳＥ１由来ｒｅｐＡの方向がｐＨＳＧ２９８由来ｌａｃプロモーターと逆向きになっていた。

【0293】

［実施例４５］
＜メチロコッカス・キャプスラタス由来ｍｔｋ及びｍｃｌ発現プラスミドの構築＞
ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）を鋳型として、ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＧＴＣＴＡＣ（配列番号１５３）及び ＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧ（配列番号１５４）のプライマーペアでＰＣＲを実施し、メチロコッカスのｍｃｌ−ｍｔｋを含むＤＮＡ断片を得た。配列番号１５３および１５４のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を有している。このＤＮＡ断片およびプラスミドｐＣＡＳＥＴをＥｃｏＲＩで切断して、両者を連結した。ＤＮＡシーケンシングにより、ｍｃｌ−ｍｔｋフラグメントがプラスミドのプロモーターによる発現に適した方向に挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＣＡＳＥＴ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）およびｐＣＡＳＥＬ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）と命名した。

【0294】

［実施例４６］
＜グラニュリバクター・ベセスデンシス、ニトロソモナス・ユーロピア、ハイホマイクロビウム・メチロボラム由来ｍｔｋ発現プラスミドの構築＞
ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｈｍｅ）＿ｍｔｋ（Ｇｂ）、ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｈｍｅ）＿ｍｔｋ（Ｈｍｅ）＿ｍｃｌ、ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｎｅ）＿ｍｔｋ（Ｎｅ）のそれぞれを用い、ｄａｍ⁻／ｄｃｍ⁻ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を形質転換して、３０μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを含むＬＢ培地で増殖させてからプラスミドを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断して、ｍｔｋとｍｃｌを含む約３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。それから、プラスミドｐＣＡＳＥＬを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断し、ｍｔｋとｍｃｌを含むＤＮＡ断片と連結させ、コリネバクテリウムでｍｔｋおよびｍｃｌを発現させるためのベクターｐＣＡＳＥＬ＿ｍｃｌ（Ｈｍｅ）＿ｍｔｋ（Ｇｂ）、ｐＣＡＳＥＬ＿ｍｃｌ（Ｈｍｅ）＿ｍｔｋ（Ｈｍｅ）、ｐＣＡＳＥＬ＿ｍｃｌ（Ｎｅ）＿ｍｔｋ（Ｎｅ） を作製した。それぞれ、グラニュリバクター・ベセスデンシス、ニトロソモナス・ユーロピア、ハイホマイクロビウム・メチロボラムのｍｔｋを保有する。
これまでに作製したコリネバクテリウム用プラスミドを表１６にまとめた。

【0295】

【表16】

【0296】

［実施例４７］
＜コリネバクテリウムにおけるｍｔｋの活性測定＞
実施例４５および実施例４６で作製したプラスミドを用い、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０１２株をエレクトロポレーション法で形質転換し、１５μｇ／ｍｇのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で１〜４日培養した。生育した株を、１５μｇ／ｍｇのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で３０℃で１〜４日培養し、遠心分離により菌体を回収した。菌体をＭＯＰＳ−Ｋ バッファー ｐＨ７．７に懸濁し、懸０．１ｍｍグラスビーズを用い、ビーズショッカー（安井器械社、ＭＢ５０００）で破砕した。遠心上清（１３，０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）を変異体粗酵素抽出液として、以後実施例１６と同様の方法で菌体の活性測定を行った。結果を表１７に示す。

【0297】

【表17】

【0298】

ｐＣＡＳＥＬを発現ベクターとした場合、メチロコッカス・キャプスラタス由来ｍｔｋを発現させたプラスミドが最も高い値を示した。また、表９と比較した場合、高活性なｍｔｋと低活性なｍｔｋの順序の相関はおおむね同じだった。それから、ｐＣＡＳＥＬとｐＣＡＳＥＴに導入したメチロコッカス・キャプスラタス由来ｍｔｋの活性を評価したところ、ｐＣＡＳＥＴに導入した株の方が高い活性を示した。

【0299】

［実施例４８］
＜コリネバクテリウム用ｍｔｋ、ｍｃｌ、ｇｃｌ、およびｇｌｘＲ発現プラスミドの構築＞
ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門）からロドコッカス・ジョスティＮＢＲＣ１６２９５を購入した。ＮＢＲＣ１６２９５をＮＢＲＣの培地番号８０２で培養し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを得た。このゲノムＤＮＡを鋳型として、ＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＣＧＧ（配列番号１５５）ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＡＧ（配列番号１５６）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、ロドコッカスのｇｌｘＲ−ｇｃｌフラグメントを得た（配列番号１５７）。ＳａｃＩとＢａｍＨＩで切断し得られたフラグメントと、ｐＣＡＳＥＴ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）をＳａｃＩとＢａｍＨＩで切断して得られたフラグメントを連結した。このプラスミドをｐＣＡＳＥＴ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｇｌｘＲ（Ｒｊ）＿ｇｃｌ（Ｒｊ）と命名した。

【0300】

［実施例４９］
＜コリネバクテリウム・グルタミカムにおけるグルタミン酸生産および^１３Ｃ導入評価株の構築＞
コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳＭ１４１２（以後、「ＣＧ株」と呼ぶことがある。）実施例４３、４５、および４８で構築したプラスミドを用い、エレクトロポレーション法で形質転換した。それぞれの株は１５μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、生育した株を評価株とした。それらの株を表１８にまとめた。

【0301】

【表18】

【0302】

［実施例５０］
＜コリネバクテリウム株による^１３Ｃラベル化ＣＯ_２のグルタミン酸への導入検証＞
対象となる微生物株を、１５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ液体培地により、３０℃かつ２８０ｒｐｍの条件で、十分な生育がみられるまで培養した。それから、１００ｍＬの羽根つき三角フラスコに、２０ｇ／Ｌのグルコース、および１５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む１０ｍｌのコリネバクテリウム用最小培地｛３０ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、３ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、６ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、８４ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２、３．９ｍｇ／Ｌ ＦｅＣｌ_３、０．９ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．３ｍｇ／Ｌ ＣｕＣｌ_２・Ｈ_２Ｏ、５．５６ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ （ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ、０．３ｍｇ／Ｌ Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０Ｈ_２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、４０ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、５００μｇ／Ｌ Ｖｉｔａｍｉｎｅ Ｂ１・ＨＣｌ、０．１ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、１０μｇ／Ｌ Ｂｉｏｔｉｎ｝を調整し、前述のＬＢ液体培地による培養液を１ｍＬ添加して、十分な増殖がみられるまで１日〜４日培養し、前培養液とした。前培養液から、遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分間）により菌体を回収した。
１００ｍＭの炭酸水素ナトリウム（^１３Ｃラベル化）、２０ｇ／Ｌのグルコース、１．５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ６０（シグマ・アルドリッチ社製）、および１５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２ｍＬのコリネバクテリウム用最小培地（ただしＢｉｏｔｉｎ最終濃度は２μｇ／Ｌに変更）を準備し、前培養菌体をＯＤが１〜５の範囲内になるよう調整して添加した。密栓した後、３０℃、１５０ｒｐｍで１〜２日間培養した。培養液は定期的にサンプリングして、遠心分離（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社 １２，０００ｒｐｍ、３分間）して菌体を除去し、上清を親水性ＰＴＦＥメンブレンフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、ＭＳＧＶＮ２Ｂ５０）でろ過し、培養サンプルとした。培養サンプルの１３Ｃ分析は、実施例４１と同様の方法で実施した。すなわち、ＧＣ−ＭＳ分析時のＭＷ４３２、４３３、４３４のピーク面積を、それぞれ［Ｍ］、［Ｍ＋１］、［Ｍ＋２］とし、横軸は［Ｍ＋１］／［Ｍ］、縦軸は［Ｍ＋２］／［Ｍ］を示す。基準線は実施例４１に記載の方法にしたがって計算した。

【0303】

図５によると、ｍｔｋ＋ｍｃｌ＋ｇｃｌ＋ｇｌｘＲ導入株（ＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ＿ｇｌｘＲ）は基準線より上方の値を示したことから、固定されたＣＯ_２が、アセチルＣｏＡを経由して、グルタミン酸に導入されたと考えられる。一方、対照株（ＣＧ／ｖｅｃ）は、ほぼ基準線上にプロットされ、アセチルＣｏＡ経由の^１３Ｃ導入は見られなかった。また、ｍｔｋ＋ｍｃｌを導入した株（ＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ）においても、ほぼ基準線上にプロットされ、アセチルＣｏＡ経由の^１３Ｃ導入は見られなかった。コリネバクテリウム・グルタミカムはｇｃｌ、ｇｌｘＲを有しないため、パントエア・アナナティスと同様、ｍｔｋとｍｃｌだけでは反応が進行しなかったと考えられる。

【0304】

［実施例５１］
＜コリネバクテリウム株によるグルタミン酸生産試験＞
実施例５０の培養液における、グルタミン酸量および副生成物の量を測定した。培養液中のグルタミン酸、グルコース、その他有機化合物を実施例４２と同様の方法で分析した。結果を表１９および表２０に示す。

【0305】

【表19】

【0306】

【表20】

【0307】

ｍｔｋ＋ｍｃｌ＋ｇｃｌ＋ｇｌｘＲを付与した株（ＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ＿ｇｌｘＲ）は、対照株（ＣＧ／ｖｅｃ）やｍｔｋ＋ｍｃｌだけの導入株（ＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ）よりも高い対糖収率を示した。
副産物量に関しては、ｍｔｋ＋ｍｃｌ＋ｇｃｌ＋ｇｌｘＲ導入株（ＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ＿ｇｌｘＲ）株と対照株（ＣＧ／ｖｅｃ）を比較すると、予想外なことに、乳酸が主に減少しており、副産物の総量においても減少することが分かった。ｍｔｋ＋ｍｃｌだけの導入株（ＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ）は、副産物量に関して対照株とほぼ同じであった。

【0308】

［実施例５２］
＜メチロバクテリウム・エクストルクエンス由来マレートチオキナーゼ遺伝子への変異導入による活性向上＞
ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｔｋ（Ｍｅｘ）＿ｍｃｌを鋳型とし、表２１記載の配列番号のプライマーペアでＰＣＲを行い、制限酵素ＤｐｎＩで処理して鋳型を分解後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルを形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養した。培養液の一部からプラスミドを回収し、ＤＮＡ配列を確認して、目的の変異が正しく導入されたものを変異体サンプルとした。このサンプルをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬ含むＬＢ液体培地で前培養後、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬ含むＬＢ液体培地３ｍＬに植菌し、３０℃、２８０ｒｐｍで一晩培養した。そのうち２ｍＬを１０，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を除去後、２ｍＬの１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を添加して洗浄した。この洗浄操作をさらにもう一回実施後、５００μＬのｐＨ７の１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に懸濁した。懸濁液を、０．１ｍｍグラスビーズを用い、ビーズショッカー（安井器械社、ＭＢ５０００）で破砕した。遠心上清（１３，０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）を変異体粗酵素抽出液とした。
それぞれの変異体粗酵素抽出液について、［実施例１６］の手法に基づき活性を評価した。結果を表２１に示す。その結果、ｍｔｋＢのＱ２４４Ｅ変異、およびｍｔｋＢのＬ１４４Ｉ変異は変異導入前と比較して、活性値の向上が見られた。また、ｍｔｋＢのＱ２４４位に別のアミノ酸を導入したところ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｙ，Ｋ、Ｒにおいて、活性の向上がみられた。また、ｍｔｋＢのＬ１４４位に変異を導入したところ、Ｎ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｑ、Ｐの変異により、活性の向上がみられた。

【0309】

【表21】

【0310】

このように本発明によれば、ＣＯ_２をアセチルＣｏＡへと変換できる。また、本発明によれば、アセチルＣｏＡに由来する物質、例えばイソプロピルアルコール、アセトン、およびグルタミン酸も効率よく生産できる。

【0311】

２０１１年７月２９日に出願の日本国出願番号第２０１１−１６７８０８号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]