特許 5923788 ４−ケト−Ｄ−アラボン酸類及びその塩類の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5923788

(24)【登録日】2016年4月28日

(45)【発行日】2016年5月25日

(54)【発明の名称】４−ケト−Ｄ−アラボン酸類及びその塩類の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/58 20060101AFI20160516BHJP

   C12R 1/01 20060101ALN20160516BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/58

   C12P7/58

   C12R1:01

【請求項の数】8

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2011-9319(P2011-9319)

(22)【出願日】2011年1月19日

(65)【公開番号】特開2012-147728(P2012-147728A)

(43)【公開日】2012年8月9日

【審査請求日】2013年12月19日

(73)【特許権者】

【識別番号】593171592

【氏名又は名称】学校法人玉川学園

(74)【代理人】

【識別番号】100122574

【弁理士】

【氏名又は名称】吉永 貴大

(72)【発明者】

【氏名】星野 達雄

(72)【発明者】

【氏名】田副 正明

(72)【発明者】

【氏名】小林 節子

(72)【発明者】

【氏名】清水 明子

【審査官】 一宮 里枝

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−１３１７６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biosci. Biotechnol. Biochem.，２０１０年，Vol. 74, No. 12，pp. 2555-2558

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

グルコノバクター オキシダンス サブエスピー メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ） ＮＢＲＣ３２９２株、グルコノバクター オキシダンス サブエスピー メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ） ＮＢＲＣ３２９３株、フラテウリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ）属、テイタメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）属からなる群から選択された少なくとも１種の細菌又は該細菌の休止菌体をグルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類を含む溶液で培養又は反応させることを特徴とする、
４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法。

【請求項2】

前記フラテウリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ）属細菌がフラテウリア アウランティア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）である、
請求項１に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法。

【請求項3】

前記テイタメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）属細菌がテイタメラ パンクタータ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ ｐｕｎｃｔａｔａ）である、
請求項１に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法。

【請求項4】

前記細菌をｐＨ３〜９、培養温度１０〜４０℃で１〜７日間培養させる、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法。

【請求項5】

前記培養におけるグルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類の濃度が、１〜４０％（ｗ／ｖ）である、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法。

【請求項6】

前記細菌の休止菌体が、培養菌体、粉末菌体、固定化菌体からなる群から選択された少なくとも１種である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法。

【請求項7】

前記休止菌体をｐＨ３〜９、反応温度１０〜４０℃で２４〜７２時間反応させる、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法。

【請求項8】

さらに、前記４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類を精製する工程を有することを特徴とする、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アラボン酸類の製造方法に関し、詳しくは、微生物を用いたグルコ−ス、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類からの４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｄ−酒石酸及びその塩類は、光学活性を有する有機化合物であり、医薬品や農薬を製造する際の光学分割剤や不斉化合物の原料として用いられると共に、Ｄ−酒石酸誘導体の原料としても工業的に広く利用されている重要な物質である。

【0003】

一方、アラボン酸類の１つである４−ケト−Ｄ−アラボン酸は、Ｄ−酒石酸の製造原料にも利用することができる有用な物質であることが分かった。

【0004】

ところで、アラボン酸類の製造方法としては、例えば、グルコース以外のヘミアセタール水酸基を有する糖に微生物の菌体を接触させ、基質とした糖に対応するアルドン酸を生成することが示され、その中の一つとして、Ｌ−アラビノースからアラボン酸の生成が可能としているが、Ｄ−アラボン酸については示されておらず、４−ケト−Ｄ−アラボン酸についても記載されていない（特許文献１）。

【0005】

なお、４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造方法についての報告は、飴山らによって、アセトバクター メラノゲナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｎｅｌａｎｏｇｅｎｕｍ）を用いたＤ−グルコースからＤ−リキスロン酸の生産に関する検討の中で、Ｄ−リキスロン酸の生合成中間体の１つとして４−ケト−Ｄ−アラボン酸の存在を推定している報告（非特許文献１）とアダチ（Ａｄａｃｈｉ）らによって自然界から分離されたグルコンアセトバクター リキファシエンス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）が４−ケト−Ｄ−アラボン酸を生成するとの報告（非特許文献２）があるだけである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００７−２８９１７号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】アメヤマ ミノル及びコンドー ケイジ（Ｍｉｎｏｒｕ ＡＭＥＹＡＭＡ ａｎｄ ｋｅｉｊｉ ＫＯＮＤＯ）、「ブル、アグリ、ケム、ソック、ジャパン（Ｂｕｌｌ．Ａｇｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ）」、（社）日本農芸化学会、１９５８、２２、ｐ．３８０−３８６

【非特許文献2】アダチら（Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．）、「バイオサイ、バイオテクノル、バイオケム（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ）」、（社）日本農芸化学会、２０１０、７４（１２）、ｐ．２５５５−２５５８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、グルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類からＤ−酒石酸製造の出発原料となる４−ケト−Ｄ−アラボン酸を高収量かつ高収率で製造する方法であって、工業的な製造に実施可能な実用性の高い方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ある特定の細菌又は該細菌の休止菌体を用いることによって、グルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類から４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類を効率良く、かつ、低コストで製造でき、工業的な生産に利用し得る実用性の高い方法についての最適条件を見出し、本発明を完成するに至った。

【0010】

すなわち、本発明は、グルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類から４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類を製造する方法であって、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、フラテウリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ）属、テイタメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）属からなる群から選択された少なくとも１種の細菌又は該細菌の休止菌体をグルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類を含む溶液で培養又は反応させることを特徴とする、４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法を提供するものである。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、フラテウリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ）属又はテイタメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）属により、グルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類を基質として４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類を非常に効率良く、かつ、低コストで製造することができる。そのため、本発明の製造方法は、工業的な製造に利用することが可能であり、その実用性も極めて高い。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下に、本発明の実施形態について詳細に説明する。すなわち、本実施形態において、グルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類から４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類を生産する細菌とは、該細菌の生育に適した条件下でグルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類を含む培地で培養することによって、グルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類から４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類を生産する能力（以下、４−ケト−Ｄ−アラボン酸生産能とも表示する。）を有する細菌を意味し、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、フラテウリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ）属又はテイタメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）属に属する細菌を例示することができる。

【0013】

また、４−ケト−Ｄ−アラボン酸生産能に優れている菌株としては、前記グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属細菌では、例えば、グルコノバクター オキシダンス サブエスピー メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ） ＮＢＲＣ３２９２、グルコノバクター オキシダンス サブエスピー メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ） ＮＢＲＣ３２９３等を挙げることができる。

【0014】

前記フラテウリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ）属細菌では、例えば、フラテウリア アウランティア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ） ＮＢＲＣ３２４５、フラテウリア アウランティア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ） ＮＢＲＣ３２４７、フラテウリア アウランティア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）ＮＢＲＣ１３３２８、フラテウリア アウランティア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ） ＮＢＲＣ１３３３０等を挙げることができる。

【0015】

前記テイタメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）属細菌では、例えば、テイタメラ パンクタータ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ ｐｕｎｃｔａｔａ） ＤＳＭ１３７００等を挙げることができる。

【0016】

なお、本実施形態における細菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＢＲＣ）やＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｈｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）など、各公的菌株保存機関で保管されているグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、フラテウリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ）属又はテイタメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）属に属する菌株を用いることができる。また、４−ケト−Ｄ−アラボン酸生産能を有している限り、新たに自然界から分離されるグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、フラテウリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ）属又はテイタメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）属に属する菌株も用いることもできる。

【0017】

本実施形態における該細菌の培養にあたって、グルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物含有培地とは、グルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類を含有しており、かつ、該細菌が生育可能な培地である限り、特に制限されないが、該細菌が同化可能な炭素源、消化可能な窒素源、無機金属塩類及び生育に必要なビタミン類、あるいは該細菌の生育にとって必須ではないが、細胞の増殖に伴って生成される４−ケト−Ｄ−アラボン酸等の弱酸性有機酸による培養液の極度なｐＨ低下を防ぐための炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア水等のｐＨ中和剤、あるいは増殖に伴って発生する泡を抑えるための消泡剤を含んだ培地を例示することができる。

【0018】

本実施形態における該細菌の培養にあたって、種培養液を得るための前培養培地の炭素源としては、グルコース、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、ソルボース、ラクトース、ガラクトース、スクロース、マルトース、グリセリン等を用いることができる。

【0019】

また、４−ケト−Ｄ−アラボン酸生産のための生産培地の炭素源としては、グルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類を用いる。また、その濃度は、該細菌の糖資化能力、糖耐性及び４−ケト−Ｄ−アラボン酸生産性の観点から１％（ｗ／ｖ）〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲内が好ましく、５％（ｗ／ｖ）〜３０％（ｗ／ｖ）の範囲内とすることがより好ましい。

【0020】

さらに、該細菌の十分な細胞の増殖と、４−ケト−Ｄ−アラボン酸の収率向上のために、炭素源としてグルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類を含む生産培地に、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、ソルボース、ラクトース、ガラクトース、スクロース、マルトース、グリセリンなどの炭素源をさらに添加することができる。なお、これら糖類の添加濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）〜２．０％（ｗ／ｖ）の範囲で生産培地に添加することが４−ケト−Ｄ−アラボン酸の収率をより向上させる観点から好ましい。

【0021】

前培養培地及び生産培地の窒素源としては、例えば、ペプトン、大豆粉、コーンスチープパウダー、コーンスチープリカー、肉エキス、酵母エキス、アミノ酸類等の有機窒素源や塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等の無機窒素源を単独又は複合的に用いることができる。なお、工業的生産の観点からは、安価であるコーンスチープパウダーやコーンスチープリカー等の窒素源を利用することが好ましい。

【0022】

前培養培地及び生産培地の無機金属塩としては、例えば、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、コバルト、鉄等の硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩又は燐酸塩を用いることが好ましい。また、必要に応じて少量の動物油、植物油、鉱油等を培養液に用いることが４−ケト−Ｄ−アラボン酸の収率をより向上させる観点から好ましい。

【0023】

本実施形態における好適な生産培地としては、グルコース１０％（ｗ／ｖ）、コーンスチープパウダー１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、塩化アンモニウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン・５水和物０．００４８％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム３％（ｗ／ｖ）（培地Ａ）及びグルコース１０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン・５水和物０．００４８％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム３％（ｗ／ｖ）（培地Ｂ）から成る培地を例示すことができる。

【0024】

なお、培地への炭酸カルシウムの添加は、該細菌の増殖に伴う４−ケト−Ｄ−アラボン酸等の弱酸性有機酸の生成によって培養液のｐＨの顕著な変化を防ぐ目的である。

【0025】

一方、炭酸カルシウム添加の代わりに酸溶液及び／又はアルカリ溶液を培養液中に加えながら該細菌の増殖と４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の生産に適したｐＨを維持したｐＨ制御培養を行うことでも４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の生産性が向上する。

【0026】

なお、この時のｐＨの範囲としては、ｐＨ３〜９の範囲内が好適であり、ｐＨ３〜８の範囲内がより好適であり、ｐＨ３〜６の範囲内がさらに好適である。

【0027】

前記酸溶液は、塩酸や硫酸等の酸水溶液を用いることができ、前記アルカリ溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムやアンモニア水等のアルカリ水溶液を用いることができる。

【0028】

本実施形態における培養温度は、１０℃〜４０℃の範囲内の温度が好ましく、２５℃〜３５℃の範囲内がより好ましい。

【0029】

本実施形態における培養時の酸素条件は、通気攪拌培養等の好気的条件が好ましい。

【0030】

なお、本実施形態における好適な培養条件で該細菌の培養を行なうと、１日〜７日間、好ましくは１日〜５日間で培養は終了し、３０％〜５０％のモル収率で４−ケト−Ｄ−アラボン酸を生産することが可能である。

【0031】

本実施形態においては、該培養液中に４−ケト−Ｄ−アラボン酸の水溶性塩が生産される。なお、前記４−ケト−Ｄ−アラボン酸の水溶性塩としては、４−ケト−Ｄ−アラボン酸ナトリウム、４−ケト−Ｄ−アラボン酸カリウム、４−ケト−Ｄ−アラボン酸カルシウム、４−ケト−Ｄ−アラボン酸アンモニウム等が挙げられる。

【0032】

本実施形態における４−ケト−Ｄ−アラボン酸の定量は、Ｈｅｒｒｍａｎｎらが報告した高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと示す。）法（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６４，８６−９０，２００４）を用いることもできるが、その方法を改良した定量法で分析することがより好ましい。なお、その改良した定量法を以下に示す。

【0033】

前記改良した定量法とは、カラムにショウデックス ＲＳｐａｋ ＤＥ−６１３カラム（６．０ｍｍ内径×１５０ｍｍ長、ショウデックス社製）を用い、移動相溶媒として９ｍＭ過塩素酸溶液を１分間あたり０．５ｍｌの流速で流すこととし、波長２１０ｎｍの紫外線（ＵＶ）検出器で検出し、そのピ−クを記録計で記録することで定量計算を行う。なお、該条件下においては、４−ケト−Ｄ−アラボン酸が７．７１分の保持時間を示す。

【0034】

本実施形態における培養液中の４−ケト−Ｄ−アラボン酸の定量は、それぞれのサンプルのピ−ク面積を既知濃度の４−ケト−Ｄ−アラボン酸標準液のピ−ク面積と比較することによって、その濃度を算出する。

【0035】

本実施形態において該細菌の「休止菌体」とは、該細菌の増殖を伴わない菌体を意味し、例えば、該細菌を培養して得られた培養菌体、該培養菌体を凍結乾燥やスプレードライによって粉末にした粉末菌体、該培養菌体を担体に固定化した固定化菌体を挙げることができ、これらの群から選択された少なくとも１種の休止菌体を基質であるグルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類に反応させることで、４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類を生成することができる。

【0036】

例えば、本実施形態における培養工程で得られる培養液を遠心分離によって培養上澄液と菌体とに分け、該菌体を生理食塩水で洗浄し、菌体濁度Ａ_{６００ｎｍ}＝４０となるように滅菌精製水に懸濁し、これを休止菌体懸濁液として反応に用いることができる。

【0037】

すなわち、あらかじめ、１２１℃で２０分間のオ−トクレ−ブ滅菌したシリコン栓付ガラス試験管（１１ｍｍ内径×１００ｍｍ長）に、０．４５ｍｌの滅菌精製水、０．１ｍｌのろ過滅菌した緩衝液（１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液；ｐＨ３．５、１Ｍリン酸カリウム緩衝液；ｐＨ５．０又は１Ｍリン酸カリウム緩衝液；ｐＨ７．０）、０．２５ｍｌの前記休止菌体懸濁液及び０．２ｍｌのろ過滅菌した基質溶液（１０％グルコース溶液、グルコン酸ナトリウム溶液（和光純薬工業社製）、２−ケト−Ｄ−グルコン酸ヘミカルシウム溶液（シグマ社製）又は２,５−ジケト−Ｄ−グルコン酸カルシウム溶液）を入れ、反応を開始する。また、該反応は、２８℃で１分間あたり２５０往復の往復振とうで２４時間行うことで４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類を生産させることができる。

【0038】

本実施形態における培養液又は反応液中からの４−ケト−Ｄ−アラボン酸又はその塩類を採取する方法は、陰イオン交換樹脂を用いるイオン交換法や電気透析法等の一般的な有機酸の精製方法を用いることができる。

【0039】

例えば、本実施形態における培養液又は反応液を遠心分離やろ過によって得られる遠心上澄液又はろ液と、細胞などの残渣に分離し、この遠心上澄液又はろ液のｐＨを水酸化ナトリウムなどのアルカリ溶液でｐＨ７．０以上に調整する。また、ｐＨ調整後の遠心上澄液又はろ液を活性型の強塩基性陰イオン交換樹脂（例えば、蟻酸型）カラムに通過させ、４−ケト−Ｄ−アラボン酸等の有機酸を吸着させる。その後、低濃度の緩衝液でカラムの洗浄を行った後、緩衝液の濃度を高めることによって有機酸を溶出させることができる。なお、溶出時において、一定量ずつ溶出液を分画することで目的の４−ケト−Ｄ−アラボン酸塩を高純度で得ることができる。

【0040】

上記で分画したそれぞれの画分をＨＰＬＣによって分析し、目的の４−ケト−Ｄ−アラボン酸塩を含む画分を集めて、これを強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、Ｈ型）カラムで処理することで、遊離型の４−ケト−Ｄ−アラボン酸を得ることができる。

【0041】

さらに、前記で得た遊離型の４−ケト−Ｄ−アラボン酸を含む画分から蟻酸を除去するために、４０℃以下の温度条件で減圧濃縮を行い、真空減圧下で数時間、乾燥することが好ましい。また、この操作によって得られたペースト状の４−ケト−Ｄ−アラボン酸を少量の純水に溶解し、低温で保持（例えば、５℃で１〜３日間）することで４−ケト−Ｄ−アラボン酸の結晶を析出させることができる。

【0042】

一方、遊離型の４−ケト−Ｄ−アラボン酸溶液を適当な濃度の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム又はアンモニアなどで中和し、低温で保持することで、各種４−ケト−Ｄ−アラボン酸塩を析出させることができる。

【0043】

これら析出した結晶は、ガラスフィルターによってそれぞれ集め、これを真空乾燥することで高純度の各種４−ケト−Ｄ−アラボン酸塩を得ることができる。

【0044】

以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0045】

１．ＮＢＲＣ３２９２菌株による４−ケト−Ｄ−アラボン酸生産及びその結晶の単離
（１）種培養液の調製
ＭＡ寒天培地（マンニトール２．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ディフコ・ラボラトリー社製）０．５％（ｗ／ｖ）、ペプトン（ディフコ・ラボラトリー社製）０．２％（ｗ／ｖ）、寒天１．５％（ｗ／ｖ）；ｐＨは無調整）で保存したグルコノバクター オキシダンス サブエスピ− メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ） ＮＢＲＣ３２９２株を、１２１℃で２０分間の条件でオ−トクレ−ブ滅菌した５ｍｌのＭＡ液体培地が入った試験管（１８ｍｍ内径×２００ｍｍ長）に１白金耳植菌し、培養温度２８℃で１分間あたり２５０往復の往復振とう培養を１９時間行った。

【0046】

（２）４−ケト−Ｄ−アラボン酸の生産
前記で得た０．６ｍｌの種培養液を、１２１℃で２０分間の条件でオ−トクレ−ブ滅菌した３０ｍｌの生産培地（グルコース１０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ディフコ・ラボラトリー社製）０．１％（ｗ／ｖ）、コーンスチープパウダー１％（ｗ／ｖ）、塩化アンモニウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン・５水和物０．００４８％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム３％（ｗ／ｖ））を入れた３本の３００ｍｌ容三角フラスコにそれぞれ植菌し、２８℃で１分間あたり２００回転の回転振とう培養を行った。

【0047】

なお、培養開始直後から継時的に培養液１ｍｌを無菌的に採取し、１分間当たり１０,０００回転で１０分間の遠心分離を行い、この培養上澄液をＨＰＬＣで分析し、７．７分の保持時間を示すピークの増加を追跡した。

【0048】

また、培養５日間後に培養を終了させ、３本のフラスコの培養液を１分間当たり６,０００回転で１０分間の遠心分離を行い、８５ｍｌの培養上澄液を得た。

【0049】

（３）４−ケト−Ｄ−アラボン酸の精製
前記培養上澄液を５Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整後、５００ｍｌのアンバ−ライトＣＧ４００陰イオン交換樹脂（蟻酸型、ローム・アンド・ハース社製）のカラムに通過させた。さらに、そのカラムに６００ｍｌの２０ｍＭ蟻酸ナトリウム緩衝液を通過させ、カラムを洗浄した後、各５００ｍｌの２０ｍＭ蟻酸ナトリウム緩衝液と５００ｍＭ蟻酸ナトリウム緩衝液を用いた直線的な濃度勾配によって吸着物質を溶出させ、溶出した溶液を試験管に１０ｍｌずつ分画した。

【0050】

分画した画分は、それぞれＨＰＬＣで分析を行い、７．７分の保持時間に示すピークをもつ分画番号５７〜７１の画分の溶出液を集めた。

【0051】

また、前記回収した溶出液を２００ｍｌのアンバーライトＣＧ１２０陽イオン交換樹脂（Ｈ型、ローム・アンド・ハース社製）のカラムに通過させた後、さらに２００ｍｌの脱イオン水でカラムの洗浄を行い、カラムを通過した非吸着画分及び洗液を回収した。

【0052】

さらに、この回収した溶液を３５℃で減圧濃縮し、蟻酸を除去した後、このペースト状濃縮物を少量の水に溶解し、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整した。また、再度、少量まで減圧濃縮後、この濃縮液にエタノールを白濁するまで加え、５℃で保持することで結晶を得た。

【0053】

また、得られた結晶をグラスフィルターで集め、室温で２時間真空乾燥を行うことで、２．４２ｇの結晶を回収できた。

【0054】

（４）４−ケト−Ｄ−アラボン酸の同定
前記で得た結晶２ｍｇを１ｍｌの水に溶解し、この溶液を用いて該結晶の同定をＬＣ−ＭＳ分析によって行った。すなわち、ディスカバリーＨＳ−Ｆ５（４．６ｍｍ内径×２５０ｍｍ長）カラム（スペルコ社製）を接続し、フォトダイオードアレー検出器を装着したＬＣＭＳ−２０１０Ａ液体クロマトグラフ質量分析計（島津製作所社製）を用いて検討を行った。なおこの時、溶媒移動相は、０．１％（ｗ／ｖ）蟻酸含有の２％（ｗ／ｗ）アセトニトリル水溶液溶を用い、１９０〜３００ｎｍで検出される液体クロマトグラムと検出されたピークの紫外線吸収スペクトル及び陰イオンマススペクトル、マスクロマトグラムの解析を行った。さらに、該結晶について、重水素中で^１Ｈ−及び^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルの測定及び溶解性についての検討も行った。その結果を表１に示す。

【0055】

【表1】

【0056】

これら検討の結果、すなわち、分子量、分子式、^１Ｈ−及び^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルの分子中の水素原子及び炭素原子の化学シフト値から、本実施形態において採取した結晶は、４−ケト−Ｄ−アラボン酸と同定された。なお、以後の実施例における４−ケト−Ｄ−アラボン酸標準物質は、該結晶を用いた。

【0057】

２．各種細菌による４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の生産
（１）供試菌株
４−ケト−Ｄ−アラボン酸生産能を有する細菌として、以下の７菌株を用いた。すなわち、グルコノバクター オキシダンス サブエスピー メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ） ＮＢＲＣ３２９２株、グルコノバクター オキシダンス サブエスピー メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ） ＮＢＲＣ３２９３株、フラテウリア アウランティア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ） ＮＢＲＣ３２４５株、フラテウリア アウランティア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ） ＮＢＲＣ３２４７株、フラテウリア アウランティア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ） ＮＢＲＣ１３３２８株、フラテウリア アウランティア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ） ＮＢＲＣ１３３３０及びテイタメラ パンクタータ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ ｐｕｎｃｔａｔａ） ＤＳＭ１３７００株を使用した。

【0058】

（２）種培養液の調製
上述のＭＡ寒天培地に保存されている前記７菌株を、１２１℃で２０分間のオートクレーブ滅菌した５ｍｌのＭＡ液体培地入り試験管（１８ｍｍ内径×２００ｍｍ長）にそれぞれ１白金耳植菌し、２８℃で１分間あたり２５０往復の往復振とう培養を１９時間行った。

【0059】

（３）４−ケト−Ｄ−アラボン酸生産
前記で得た０．４ｍｌのそれぞれの種培養液を、１２１℃で２０分間のオートクレーブ滅菌した２０ｍｌのＡ培地（グルコース１０％（ｗ／ｖ）、コーンスチープパウダー１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ディフコ・ラボラトリー社製）０．１％（ｗ／ｖ）、塩化アンモニウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン・５水和物０．００４８％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム３％（ｗ／ｖ））又は２０ｍｌのＢ培地（グルコース１０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ディフコ・ラボラトリー社製）１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン・５水和物０．００４８％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム３％（ｗ／ｖ））を入れた２００ｍｌ容三角フラスコにそれぞれ植菌し、３０℃で１分間あたり２２０回転の回転振とう培養を行った。

【0060】

また、培養５日間後、該培養液１ｍｌを１分間当たり１０,０００回転で１０分間の遠心分離を行い、培養上澄液中の４−ケト−Ｄ−アラボン酸含量を前記同様ＨＰＬＣで定量した。なおこの時、１ｇ/Ｌ濃度の４−ケト−Ｄ−アラボン酸標準液を基準にして定量を行った。また、その結果を表２に示す。

【0061】

【表2】

【0062】

表２で示したように、試験した７菌株は、Ａ培地及び／又はＢ培地で４−ケト−Ｄ−アラボン酸の生産が認められた。なお、Ｂ培地を用いた場合におけるフラウテリア アウランティア ＮＢＲＣ３２４７及びＮＢＲＣ１３３３０菌株の場合には、４−ケト−Ｄ−アラボン酸の生産が認められなかった。

【0063】

上記７菌株の中で、特に４−ケト−Ｄ−アラボン酸の生産が顕著に認められた菌株は、グルコノバクター オキシダンス サブエスピー メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ） ＮＢＲＣ３２９２株、グルコノバクター オキシダンス サブエスピー メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ） ＮＢＲＣ３２９３株及びフラテウリア アウランティア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ） ＮＢＲＣ３２４５株の３菌株であった。

【0064】

３．ＮＢＲＣ３２４５菌株による４−ケト−Ｄ−アラボン酸生産及びその結晶の単離
（１）種培養液の調製
上述のＭＡ寒天培地で保存したフラテウリア アウランティア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ） ＮＢＲＣ３２４５株を１２１℃で２０分間のオ−トクレ−ブ滅菌した５ｍｌのＭＡ培地入りの試験管（１８ｍｍ内径×２００ｍｍ長）に１白金耳植菌し、２８℃で１分間あたり２５０往復の往復振とう培養を１９時間行った。

【0065】

（２）４−ケト−Ｄ−アラボン酸生産
前記で得た０．４ｍｌの種培養液を１２１℃で２０分間のオ−トクレ−ブ滅菌した２０ｍｌの生産培地（グルコース１０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ディフコ・ラボラトリー社製）１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン・５水和物０．００４８％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム３％（ｗ／ｖ））を入れた３本の２００ｍｌ容三角フラスコにそれぞれ植菌し、３０℃で１分間あたり２２０回転の回転振とう培養を行った。

【0066】

また、培養５日間後、各培養液１ｍｌを１分間当たり１０,０００回転で１０分間の遠心分離を行い、これら培養上澄液中の４−ケト−Ｄ−アラボン酸含量を前記同様ＨＰＬＣで定量を行った。なおこの時、１ｇ/Ｌ濃度の４−ケト−Ｄ−アラボン酸標準液を基準にして定量を行った。

【0067】

その結果、３本のフラスコで培養して得た各培養上澄液中には、４−ケト−Ｄ−アラボン酸が平均２２．１ｇ/Ｌ（モル収率：２４．３％）含有していた。

【0068】

（３）４−ケト−Ｄ−アラボン酸の精製
前記培養液を１分間当たり６,０００回転で１０分間の遠心分離を行い、５８ｍｌの培養上澄液を得た。この培養上澄液５８ｍｌを５Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した後、５００ｍｌのアンバーライトＣＧ４００陰イオン交換樹脂（蟻酸型、ローム・アンド・ハース社製）のカラムに通過させた。さらに、そのカラムを５００ｍｌの２０ｍＭ蟻酸ナトリウム緩衝液で洗浄後、各５００ｍｌの２０ｍＭ蟻酸ナトリウム緩衝液と５００ｍＭ蟻酸ナトリウム緩衝液を用いて直線的な濃度勾配によって吸着物質を溶出させ、試験管に１０ｍｌずつ分画した。

【0069】

分画した画分は、それぞれＨＰＬＣで分析を行い、４−ケト−Ｄ−アラボン酸標準液と同一の保持時間を示すピークをもつ分画番号５５〜６８の画分の溶出液を集めた。

【0070】

また、前記回収した画分を２００ｍｌのアンバーライトＣＧ１２０陽イオン交換樹脂（Ｈ型、ローム・アンド・ハース社製）のカラムに通過させた後、さらに２００ｍＬの脱イオン水でカラムの洗浄を行い、カラムを通過した非吸着画分及び洗液を回収した。

【0071】

さらに、回収した画分を３５℃で減圧濃縮し、蟻酸を除去した後、ペースト状物質を少量の水に溶解し、５Ｎ水酸化カリウム溶液でｐＨ７．０に調整した。また、再度、少量まで減圧濃縮し、この濃縮液にエタノールを白濁するまで加え、５℃で保持することで４−ケト−Ｄ−アラボン酸カリウム塩の結晶を得た。

【0072】

また、得られた結晶をグラスフィルタ−で集め、室温で２時間真空乾燥を行い、０．７７ｇの結晶を得た。

【0073】

該結晶１ｍｇを１ｍｌの水に溶解し、前記同様ＨＰＬＣで分析を行ったところ、該結晶は、実施例１で得た精製標品４−ケト−Ｄ−アラボン酸の保持時間と一致した。

【0074】

４．休止菌体による４-ケトアラボン酸の生産
（１）供試菌株
グルコノバクター オキシダンス サブエスピー メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ）ＮＢＲＣ３２９２株及びフラテウリア アウランティア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）ＮＢＲＣ３２４５株の２菌株を使用した。

【0075】

（２）種培養液の調製
上述のＭＡ寒天培地に保存した前記２菌株を１２１℃で２０分間のオートクレーブ滅菌した５ｍｌのＭＡ液体培地入り試験管（１８ｍｍ内径×２００ｍｍ長）にそれぞれ１白金耳植菌し、２８℃で１分間あたり２５０往復の往復振とう培養を１９時間行った。

【0076】

（３）休止菌体の調製
前記で得た１．０ｍｌの種培養液を１２１℃で２０分間のオ−トクレ−ブ滅菌した５０ｍｌのＢ培地（グルコース１０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ディフコ・ラボラトリー社製）１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン・５水和物０．００４８％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム３％（ｗ／ｖ））を入れた５００ｍｌ容三角フラスコにそれぞれ植菌し、３０℃で１分間あたり２２０回転の回転振とう培養を行った。

【0077】

また、培養３日間後、それぞれ菌株の培養液５０ｍｌを１２１℃で２０分間のオ−トクレ−ブ滅菌した２５０ｍｌ容遠心管に入れ、培養液に含まれる炭酸カルシウムを取り除くために１０℃、９００回転で１分間の低速遠心分離を行い、細胞を含む遠心上澄液を得た。

【0078】

前記細胞を含む遠心上澄液を１２１℃で２０分間のオ−トクレ−ブ滅菌した２５０ｍｌ容遠心管に入れ、再度、１０℃、９，０００回転で１０分間の高速遠心分離を行った後、この遠心上澄液を捨て、遠心管に沈降した菌体ペレットに５０ｍｌの滅菌した０．８５％（ｗ／ｖ）食塩水を加えて、菌体懸濁液を調製した。

【0079】

前記細胞懸濁液を１０℃、９，０００回転で１０分間の高速遠心分離を行い、前記同様の操作によって該菌体を０．８５％（ｗ／ｖ）食塩水で２回洗浄したものを洗浄菌体とした。

【0080】

該洗浄菌体を菌体濁度Ａ_{６００ｎｍ}＝４０となるように１２１℃で２０分間のオ−トクレ−ブ滅菌した精製水に懸濁し、この菌体懸濁液を休止菌体懸濁液として以下の反応に用いた。

【0081】

（３）休止菌体による４-ケト−Ｄ−アラボン酸の生産
あらかじめ、１２１℃で２０分間のオ−トクレ−ブ滅菌したシリコン栓付ガラス試験管（１１ｍｍ内径×１００ｍｍ長）に、０．４５ｍｌの滅菌精製水、０．１ｍｌのろ過滅菌した緩衝液（１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液；ｐＨ３．５、１Ｍリン酸カリウム緩衝液；ｐＨ５．０又は１Ｍリン酸カリウム緩衝液；ｐＨ７．０）、０．２５ｍｌの前記休止菌体懸濁液及び０．２ｍｌのろ過滅菌した基質溶液（１０％グルコース溶液、グルコン酸ナトリウム溶液（和光純薬工業社製）、２−ケト−Ｄ−グルコン酸ヘミカルシウム溶液（シグマ社製）又は２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸カルシウム溶液）を加え、反応を開始した。なお、該反応は、２８℃で１分間あたり２５０往復の往復振とうで行った。

【0082】

反応２４時間後、該反応液を１分間当たり１０，０００回転で１０分間の遠心分離を行い、該反応上澄液中の４−ケト−Ｄ−アラボン酸量を前記同様ＨＰＬＣで定量した。なおこの時、１ｇ/Ｌ濃度の４−ケト−Ｄ−アラボン酸標準液を基準にして定量を行った。また、その結果を表３に示す。

【0083】

【表3】

【0084】

表３で示したように、試験したＮＢＲＣ３２９２菌株及びＮＢＲＣ３２４５菌株の休止菌体は、ｐＨ３．５、ｐＨ５．０又はｐＨ７．０の緩衝液中のグルコース、グルコン酸、２−ケト−Ｄ−グルコン酸又は２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を基質とした全てにおいて４−ケト−Ｄ−アラボン酸を生成し、その生成量は、ＮＢＲＣ３２４５菌株及びＮＢＲＣ３２９２菌株とも高い値を示した。また、両菌株とも基質がグルコース、グルコン酸、２−ケト−Ｄ−グルコン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の順で４−ケト−Ｄ−アラボン酸の生成量が増加した。

【0085】

本発明によれば、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、フラテウリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ）属又はテイタメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）属により、グルコース、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、２，５−ジケトグルコン酸又はそれらの混合物からなる群から選択された少なくとも１種の糖類を基質として４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類を非常に効率良く、かつ、低コストで製造することができる。そのため、Ｄ−酒石酸製造の原料となる本発明の４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造方法は、特に有用となる。