特許 5923985 癌の治療及び／又は予防用医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5923985

(24)【登録日】2016年4月28日

(45)【発行日】2016年5月25日

(54)【発明の名称】癌の治療及び／又は予防用医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20160516BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160516BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20160516BHJP

   C07K 16/32 20060101ALI20160516BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20160516BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160516BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 TZNA

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61K39/395 E

   C07K16/32

   C07K16/46

   !C12N15/00 A

【請求項の数】12

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2011-510206(P2011-510206)

(86)(22)【出願日】2011年2月4日

(86)【国際出願番号】JP2011052382

(87)【国際公開番号】WO2011096517

(87)【国際公開日】20110811

【審査請求日】2014年1月28日

(31)【優先権主張番号】特願2010-23450(P2010-23450)

(32)【優先日】2010年2月4日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003159

【氏名又は名称】東レ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(72)【発明者】

【氏名】齋藤 孝則

(72)【発明者】

【氏名】岡野 文義

(72)【発明者】

【氏名】小林 真一

【審査官】 井上 明子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第０２／０８３０７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 The Journal of Immunology，２００４年，Vol.172，p.2389-2400

【文献】 Molecular and Cellular Biology，２００７年，Vol.27, No.6，p.2324-2342

【文献】 The Journal of Biological Chemistry，２００４年，Vol.279, No.50，p.52210-52217

【文献】 Experimental Cell Research，２００９年，Vol.315，p.542-555

【文献】 The Journal of Immunology，２００５年，Vol.175，p.4274-4282

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で表されるＣＡＰＲＩＮ−１の部分ポリペプチドであって配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体を有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。

【請求項2】

前記癌が乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、肥満細胞腫、腎癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌もしくは大腸癌である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体。

【請求項6】

ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を発現する癌細胞に対し細胞障害活性を有する、請求項５に記載の抗体。

【請求項7】

配列番号４０で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４１で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号４２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号４６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。

【請求項8】

配列番号４０で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４１で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号４２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５１で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号５２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。

【請求項9】

ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項10】

請求項５〜９のいずれか１項に記載の抗体を有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。

【請求項11】

前記癌が乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、肥満細胞腫、腎癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌もしくは大腸癌である、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物あるいは請求項１０又は１１に記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含んでなる、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体又はそのフラグメントの、癌の治療及び／又は予防剤等としての新規な医薬用途に関する。

【背景技術】

【0002】

癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩によって、癌に特異的に反応する抗体類、細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原類、癌抗原をコードする遺伝子類などが同定されており、癌抗原類をターゲットにした特異的癌治療法への期待が高まっている（非特許文献１）。

【0003】

癌治療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが望ましい。１９９１年、ベルギー国Ｌｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献２）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）法が報告され（非特許文献３及び特許文献１）、この方法により、正常細胞にはほとんど発現がなく、癌に特異的に発現するいくつかの癌抗原が単離されている（非特許文献４〜９）。さらに、その一部をターゲットにして、癌抗原に特異的に反応する免疫細胞を用いた細胞療法や、癌抗原を含むワクチンなどの癌特異的免疫療法の臨床試験が実施されている。

【0004】

一方、近年、癌細胞上の抗原タンパク質を標的にした、癌を治療するための各種抗体医薬が世の中に台頭してきた。癌特異的治療薬として一定の薬効が得られ注目されているが、標的となる抗原タンパク質の大部分は正常細胞にも発現するものであり、抗体投与の結果、癌細胞だけでなく、抗原が発現する正常細胞も障害されてしまい、その結果生じる副作用が問題になっている。したがって、癌細胞表面に特異的に発現する癌抗原を同定し、それを標的とした抗体を医薬品として使用することができれば、より副作用の少ない抗体医薬による治療が可能になると期待される。

【0005】

Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＣＡＰＲＩＮ−１）は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現し、また細胞内でＲＮＡと細胞内ストレス顆粒を形成してｍＲＮＡの輸送、翻訳の制御に関与することなどが知られている細胞内タンパク質である。一方で、ＣＡＰＲＩＮ−１には色々な別名が存在しており、その一例としてＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １やＭｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ １ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｍ１１Ｓ１）などがあり、あたかも本タンパク質が細胞膜タンパク質であることが知られていたかのような名称がある。これらの別名は、元々、ＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列が、ＧＰＩ結合領域を有し、大腸癌細胞に発現する膜タンパク質であるとする報告（非特許文献１０）に由来するが、後にこの報告でのＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列は誤りであり、現在ＧｅｎＢａｎｋ等に登録されているＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列が１塩基欠損することによりフレームシフトが起きることでＣ末端から８０アミノ酸が欠損し、その結果生じるａｒｔｉｆａｃｔ（７４アミノ酸）が前報告でのＧＰＩ結合部分であり、さらに５’側にも遺伝子配列のエラーがあり、Ｎ末端から５３アミノ酸が欠損していることが報告されている（非特許文献１１）。また、現在ＧｅｎＢａｎｋ等に登録されているＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列がコードするタンパク質は細胞膜タンパク質ではないことが報告されている（非特許文献１１）。

【0006】

なお、ＣＡＰＲＩＮ−１が細胞膜タンパク質であるとする非特許文献１０の報告に基づき、特許文献２及び３には、Ｍ１１Ｓ１の名称で、ＣＡＰＲＩＮ−１が細胞膜タンパク質の１つとして抗体医薬の標的として癌治療に使用されうることが記載されている（実施例には本タンパク質に対する抗体を用いた治療に関する記載は一切ない）。しかし、非特許文献１１の報告の通り、特許文献２の出願当時から現在まで、ＣＡＰＲＩＮ−１は細胞表面には発現していないものであることが通説になっており、ＣＡＰＲＩＮ−１が細胞膜タンパク質であるという誤った情報のみに基づく特許文献２及び３の内容は、当業者の技術常識として理解されるべきものでないことは明らかである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国特許第５６９８３９６号

【特許文献2】ＵＳ２００８／００７５７２２

【特許文献3】ＷＯ２００５／１００９９８

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】秋吉毅，「癌と化学療法」、１９９７年、第２４巻、ｐ５５１−５１９（癌と化学療法社、日本）

【非特許文献2】Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５４：１６４３−１６４７（１９９１）

【非特許文献3】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２：１１８１０−１１８１３（１９９５）

【非特許文献4】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７２：９６５−９７１（１９９７）

【非特許文献5】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：１０３４−１０４１（１９９８）

【非特許文献6】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２９：６５２−６５８（１９９８）

【非特許文献7】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１４：７０３−７０８（１９９９）

【非特許文献8】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６：４７６６−４７７２（１９９６）

【非特許文献9】Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ６：３３−３９， １９９７

【非特許文献10】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０：２０７１７−２０７２３， １９９５

【非特許文献11】Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７２：２３８９−２４００， ２００４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、癌細胞の表面に特異的に発現する癌抗原タンパク質を同定し、それを標的とした抗体の、癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、鋭意研究の結果、イヌの精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと乳癌患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、取得した遺伝子及びそのヒト、ウシ、ウマ、マウス、ニワトリ相同性遺伝子を基にして、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で示されるアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１及びそれらＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体を作製した。そしてＣＡＰＲＩＮ−１が乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、大腸癌、胃癌及び腎臓癌細胞に特異的に発現していること、そしてＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の一部がそれら癌細胞の細胞表面に特異的に発現していることを見出した。そして、それらＣＡＰＲＩＮ−１の各癌細胞の細胞表面に発現する部分に対する抗体が、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞を障害することを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0011】

したがって、本発明は、以下の特徴を有する。

【0012】

本発明は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有する配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で表されるＣＡＰＲＩＮ−１の部分ポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。

【0013】

その実施形態において、上記癌は、乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、大腸癌、胃癌もしくは腎臓癌である。

【0014】

別の実施形態において、上記抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。

【0015】

別の実施形態において、上記抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、又は二重特異抗体である。

【0016】

別の実施形態において、上記抗体は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するポリペプチド又その断片と免疫学的反応性を有する抗体である。

【0017】

別の実施形態において、上記抗体は、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかの抗体であって、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体、又は該抗体を有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物である。

【0018】

（ａ）配列番号４０、４１及び４２を含む重鎖可変領域と配列番号４４、４５及び４６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。

【0019】

（ｂ）配列番号４０、４１及び４２を含む重鎖可変領域と配列番号５０、５１及び５２を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。

【0020】

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-023450号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

【発明の効果】

【0021】

本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は、癌細胞を障害する。したがって、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は癌の治療や予防に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質をコードする遺伝子の、正常組織及び腫瘍細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクをコードする遺伝子の発現パターン、参照番号２；ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。

【図2】癌細胞の細胞表面に反応するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（＃１及び＃２）による、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１５７に対する細胞障害性を示す図である。参照番号３；＃１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号４；＃２のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を添加したときの活性、参照番号５；抗体の代わりにＰＢＳを添加したときの活性を示す。

【図3】癌細胞の細胞表面に反応するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（＃１及び＃２）の、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現するマウス乳癌細胞株４Ｔ１が移植されたＢａｌｂ／ｃマウスに対する抗腫瘍効果を示す図である。参照番号６；＃１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号７；＃２のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を投与されたマウスの腫瘍の大きさを、参照番号８；抗体の代わりにＰＢＳを投与されたマウスの腫瘍の大きさを示す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明で用いられる配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のポリペプチドに対する抗体の抗腫瘍活性は、後述するように、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって、あるいは、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって評価することができる。

【0024】

なお、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号（すなわち、配列番号２，４，６・・・２８，３０）のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ、配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号（すなわち、配列番号１，３，５・・・２７，２９）に示されている。

【0025】

本発明が開示する配列表の配列番号６、８、１０、１２及び１４で示されるアミノ酸配列は、イヌ精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと乳癌患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチドとして、また配列番号２及び４で示されるアミノ酸配列は、そのヒト相同因子（ホモログ）として、配列番号１６で示されるアミノ酸配列は、そのウシ相同因子として、配列番号１８で示されるアミノ酸配列は、そのウマ相同因子として、配列番号２０〜２８で示されるアミノ酸配列は、そのマウス相同因子として、配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、そのニワトリ相同因子として単離された、ＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列である（後述の実施例１参照）。ＣＡＰＲＩＮ−１は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現することが知られている。

【0026】

ＣＡＰＲＩＮ−１は、細胞表面には発現しないことが知られていたが、本検討により、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の一部が各種癌細胞の細胞表面に発現することが明らかになった。そして、配列番号３７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の部分ポリペプチドを認識する抗体が、抗腫瘍活性を示すことが明らかになった。本発明の抗体は、上記ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の断片に結合する、かつ、抗腫瘍活性を示すすべての抗体が含まれる。

【0027】

本発明で用いられる上記ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は、抗腫瘍活性を発揮しうる限りいかなる種類の抗体であってもよく、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、例えば合成抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）など、ヒト抗体、それらの抗体フラグメント、例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）_２、Ｆｖなどを含む。これらの抗体及びそのフラグメントは、また当業者に公知の方法により調製することが可能である。本発明においては、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質又はその部分ポリペプチドと免疫学的反応性を有する（すなわち、抗原−抗体反応を介してＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と結合する）抗体、好ましくはＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と特異的に結合することが可能な抗体が望ましいし、モノクローナル抗体であることが好ましいが、均質な抗体を安定に生産できるかぎり、ポリクローナル抗体であっても良い。また、被験者がヒトである場合には、拒絶反応を回避もしくは抑制するためにヒト抗体又はヒト化抗体であることが望ましい。

【0028】

ここで、「ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と特異的に結合する」とは、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に特異的に結合し、それ以外のタンパク質と実質的に結合しないことを意味する。

【0029】

本発明で用いることができる抗体の抗腫瘍活性は、後述するように、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって、あるいは、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって評価することができる。

【0030】

さらにまた、本発明における癌の治療及び／又は予防の対象である被験者は、ヒト、ペット動物、家畜類、競技用動物などの哺乳動物であり、好ましい被験者は、ヒトである。

【0031】

以下に、本発明に関する抗原の作製、抗体の作製、ならびに医薬組成物について説明する。

【0032】

＜抗体作製用抗原の作製＞
本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリなど、その由来となる動物種に制限されない。しかし細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。例えば、ＣＡＰＲＩＮ−１がヒトＣＡＰＲＩＮ−１の場合、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やその部分ペプチド、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１を発現する細胞などを用いることができる。

【0033】

ヒトＣＡＰＲＩＮ−１及びそのホモログの塩基配列及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）にアクセスし、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：５８７３−５８７７，１９９３； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２， １９９７）を利用することによって入手することができる。

【0034】

本発明では、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１の塩基配列（配列番号１もしくは３）又はアミノ酸配列（配列番号２もしくは４）を基準とした場合、これらのＯＲＦ又は成熟部分の塩基配列又はアミノ酸配列と７０％〜１００％、好ましくは８０％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、さらに好ましくは９５％〜１００％、例えば９７％〜１００％、９８％〜１００％、９９％〜１００％又は９９．５％〜１００％の配列同一性を有する配列からなる核酸又はタンパク質がターゲットになる。ここで、「％配列同一性」は、２つの配列を、ギャップを導入してか又はギャップを導入しないで、最大の類似度となるようにアラインメント（整列）したとき、アミノ酸（又は塩基）の総数に対する同一アミノ酸（又は塩基）のパーセンテージ（％）を意味する。

【0035】

ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の断片は、抗体が認識する最小単位であるエピトープ（抗原決定基）のアミノ酸長から、該タンパク質の全長未満の長さを有する。エピトープは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７〜１２アミノ酸、例えば８〜１１アミノ酸、からなる。したがって、本発明の抗体は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列のうち、約７〜１２アミノ酸、例えば８〜１１アミノ酸からなる部分配列（断片）を認識する、すなわち該部分配列（断片）と結合（好ましくは特異的に結合）する、ことを特徴としている。

【0036】

上記した、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やその部分ペプチドを含むポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ―ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる（日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、東京化学同人（日本）、１９８１年）。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第３版， Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓなど）を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。

【0037】

上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡは、ヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなど）及びＭｇ^２＋含有ＰＣＲバッファーを用いて、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。ＰＣＲの手法、条件等については、例えばＡｕｓｕｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第３版， Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（特に第１５章）に記載されている。

【0038】

また、本明細書中の配列表の配列番号１〜３０に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。そのような細胞や組織の例は、精巣、白血病、乳癌、リンパ腫、脳腫瘍、肺癌、大腸癌などの癌又は腫瘍に由来する細胞又は組織である。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）、Ａｕｓｂｅｌら（上記）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。

【0039】

上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物細胞、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、出芽酵母、分裂酵母等の酵母細胞、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0040】

宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子、等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。

【0041】

宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば（Ｈｉｓ）_６〜（Ｈｉｓ）_１０）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。

【0042】

発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、等の周知の方法を用いることができる。

【0043】

宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0044】

＜抗体の構造＞
抗体は通常少なくとも２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭは別として、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は変動する。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた鎖内ジスルフィド結合も有する。それぞれの重鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＨ領域）を有し、それにいくつかの定常領域が続く。それぞれ軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ領域）を有し、その反対の端に１つの定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と整列しており、かつ軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。抗体の可変ドメインは特定の領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特定の可変性を示して抗体に結合特異性を付与する。可変領域の相対的に保存されている部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれている。完全な重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ３つのＣＤＲにより連結された４つのＦＲを含む。３つのＣＤＲは重鎖ではそのＮ末から順にＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３、同様に軽鎖ではＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，ＣＤＲＬ３と呼ばれている。抗体の抗原への結合特異性には、ＣＤＲＨ３が最も重要である。また、各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接した状態で一緒に保持され、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗体が抗原に結合することに直接寄与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）への関与、Ｆｃγ受容体への結合を介した食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度、補体カスケードのＣ１ｑ構成要素を介した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示す。

【0045】

＜抗体の作製＞
本発明における抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体とは、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の全長又はその断片と免疫学的反応性を有する抗体を意味する。

【0046】

ここで、「免疫学的反応性」とは、生体内で抗体とＣＡＰＲＩＮ−１抗原とが結合する特性を意味し、このような結合を介して腫瘍を障害（例えば、死滅、抑制又は退縮）する機能が発揮される。すなわち、本発明で使用される抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と結合して腫瘍、例えば白血病、リンパ腫、乳癌、脳腫瘍、肺癌、食道癌、胃癌、腎臓癌、大腸癌などを障害することができるならば、その種類を問わない。

【0047】

抗体の例は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）_２）などを含む。また、抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス、例えばＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＹ、又は任意のサブクラス、例えばＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２などである。

【0048】

抗体はさらに、グリコシル化の他に、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はペグ（ＰＥＧ）化などによって修飾されていてもよい。

【0049】

以下に、種々の抗体の作製例を示す。

【0050】

抗体が、モノクローナル抗体であるときには、例えば、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３などをマウスに投与して免疫し、同マウスより脾臓を抽出し、細胞を分離の上、該細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、癌細胞増殖抑制作用を持つ抗体を産生するクローンを選択する。癌細胞増殖抑制作用を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを単離し、当該ハイブリドーマを培養し、培養上清から一般的なアフィニティ精製法により抗体を精製することで、調製することが可能である。

【0051】

モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば以下のようにしても作製することができる。まず、公知の方法にしたがって、感作抗原を動物に免疫する。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。

【0052】

このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

【0053】

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９７９）１２３， １５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９７８）８１， １−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ． Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９７６）６， ５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ． Ｄ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （１９７６）８， ４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９７８）２７６， ２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅＳｔ． Ｇｒｏｔｈ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （１９８０）３５， １−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ， Ｉ．Ｓ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． （１９７８）１４８， ３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９７９）２７７， １３１−１３３）等が好適に使用される。

【0054】

前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９８１）７３， ３−４６）等に準じて行うことができる。

【0055】

より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

【0056】

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。

【0057】

細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とするハイブリドーマを形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。

【0058】

このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。

【0059】

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６（登録番号ＴＩＢ１９６）と融合させ、所望の活性（例えば、細胞増殖抑制活性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。

【0060】

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

【0061】

すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。

【0062】

本発明で使用可能な抗体の別の例がポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、例えば、次のようにして得ることができる。

【0063】

天然のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質、あるいはＧＳＴなどとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させた組換えＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質、又はその部分ペプチドをマウス、ヒト抗体産生マウス、ウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。

【0064】

ここで、ヒト抗体産生マウスとしては、例えばＫＭマウス（キリンファーマ／Ｍｅｄａｒｅｘ）及びＸｅｎｏマウス（Ａｍｇｅｎ）が知られている（例えば、国際公開第ＷＯ０２／４３４７８号、同第ＷＯ０２／０９２８１２号など）。このようなマウスをＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質又はその断片で免疫するときには、完全ヒトポリクローナル抗体を血液から得ることができる。また、免疫後のマウスから脾臓細胞を取出し、ミエローマ細胞との融合法によりヒト型モノクローナル抗体を作製することができる。

【0065】

抗原の調製は、例えば、動物細胞を用いた方法（特表２００７−５３００６８）やバキュロウイルスを用いた方法（例えば、国際公開第ＷＯ９８／４６７７７号など）などに準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。

【0066】

さらにまた、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ， Ａ．Ｋ． Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ， Ｊａｍｅｓ， Ｗ． Ｌａｒｒｉｃｋ， ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ， １９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。

【0067】

本発明の抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。しかし、ポリクローナル抗体、遺伝子改変抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体など）などであってもよい。

【0068】

モノクローナル抗体には、ヒトモノクローナル抗体、非ヒト動物モノクローナル抗体（例えばマウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）、キメラ型モノクローナル抗体などが含まれる。モノクローナル抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を免疫した非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ヒト抗体産生マウス、ニワトリ、ウサギなど）からの脾細胞とミエローマ細胞との融合によって得られたハイブリドーマを培養することによって作製されうる。キメラ型抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより得られる。後述の実施例では、ヒト−ニワトリキメラ型モノクローナル抗体が作製され、抗腫瘍効果が確認された。これらのモノクローナル抗体は、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）領域と、配列番号４７又は配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含み、ここで、該ＶＨ領域には配列番号４０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号４２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３が含まれ、該ＶＬ領域には配列番号４４又は配列番号５０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号４５又は配列番号５１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号４６又は配列番号５２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３が含まれる。

【0069】

ポリクローナル抗体には、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を免疫して得られる抗体が含まれる。

【0070】

ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。

【0071】

具体的には、例えばマウス抗体やニワトリ抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ； ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入して産生させることにより得られる（欧州特許出願公開第ＥＰ２３９４００号、国際公開第ＷＯ９６／０２５７６号参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９３， ５３： ８５１−８５６）。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい（国際公開第ＷＯ９９／５１７４３号参照）。

【0072】

ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９３， ５３： ８５１−８５６）。

【0073】

キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。

【0074】

アミノ酸の置換は、例えば１５未満、１０未満、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下のアミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１又は２アミノ酸、の置換であり、置換抗体は、未置換抗体と機能的に同等であるべきである。置換は、保存的アミノ酸置換が望ましく、これは、電荷、側鎖、極性、芳香族性などの性質の類似するアミノ酸間の置換である。性質の類似したアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（トレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）などに分類しうる。

【0075】

抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。

【0076】

ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明の抗体と同様の生物学的あるいは生化学的活性、具体的には腫瘍を障害する機能、を有すること、ヒトへの適用時に拒絶反応を本質的に起こさないことなどを指す。このような活性としては、例えば、細胞増殖抑制活性、あるいは結合活性を例示することができる。

【0077】

あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｇｅｎｅ １５２， ２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ， ＭＪ．， ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｍ． （１９８３） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００， ４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ， ＨＪ．， （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４， ３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ， ＴＡ．， （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８２， ４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ８５， ２７６３−２７６６）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。

【0078】

上記抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質のエピトープを認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質のエピトープを通常の方法（例えば、エピトープマッピングなど）により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法などにより得ることができる。ここで、「エピトープ」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７〜１２アミノ酸、好ましくは８〜１１アミノ酸からなる。

【0079】

本発明の抗体の親和定数Ｋａ（ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）は、好ましくは、少なくとも１０^７Ｍ^−１、少なくとも１０^８Ｍ^−１、少なくとも５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも５×１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、あるいは、少なくとも１０^１３Ｍ^−１である。

【0080】

本発明の抗体は、抗腫瘍剤とコンジュゲートすることができる。抗体と抗腫瘍剤との結合は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオール基などと反応性の基（例えば、コハク酸イミジル基、ホルミル基、２−ピリジルジチオ基、マレイイミジル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基など）をもつスペーサーを介して行うことができる。

【0081】

抗腫瘍剤の例は、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン （ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、並びにそれらの薬学的に許容可能な塩又は誘導体を包含する。

【0082】

また、本発明の抗体と、抗腫瘍剤を併用投与することで、より高い治療効果を得ることができる。本手法は、ＣＡＰＲＩＮ−１が発現している癌患者に対して、外科的手術前後のどちらにおいても適応できる。特に手術後に適用することで、従来抗腫瘍剤単独で処置されていたＣＡＰＲＩＮ−１が発現している癌に対して、より高い癌再発防止や生存期間の延長が得られる。

【0083】

本発明の抗体との併用投与に用いられる抗腫瘍剤の例は、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン （ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、並びにそれらの薬学的に許容可能な（公知の）塩又は（公知の）誘導体を包含する。上記のうち、特にシクロホスファミド、パクリタキセル、ドキセタキセル、ビノレルビンが好ましく用いられる。

【0084】

あるいは、本発明の抗体には、文献等で公知の、^２１１Ａｔ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３ＳＭ、^２１２Ｂｉ、^３２Ｐ、^１７５Ｌｕ、^１７６Ｌｕなどの放射性同位体を結合することも可能である。放射性同位体は、腫瘍の治療や診断のために有効なものが望ましい。

【0085】

本発明の抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１と免疫学的反応性を有する抗体、あるいは、ＣＡＰＲＩＮ−１を特異的に認識する抗体、あるいは、ＣＡＰＲＩＮ−１と特異的に結合する抗体であって、癌に対する細胞障害活性、又は腫瘍増殖抑制作用、を示す抗体である。該抗体は、それを投与する対象動物において拒絶反応がほとんど又はまったく回避されるような構造をもつ抗体であるべきである。そのよう抗体としては、例えば対象動物がヒトである場合、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体（例えばヒト−マウスキメラ抗体）、単鎖抗体、二重特異性抗体などが挙げられる。これらの抗体は、重鎖及び軽鎖の定常領域及び可変領域が共にヒト抗体由来のものであるか、重鎖及び軽鎖の可変領域のうち相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）が非ヒト動物抗体由来であり、かつ、フレームワーク領域と重鎖及び軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来のものであり、かつ、重鎖及び軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のものである組換え型抗体である。好ましい抗体は、前２つの抗体である。

【0086】

これらの組換え型抗体は、次のようにして作製することができる。ハイブリドーマなどの抗体産生細胞からヒトＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）をコードするＤＮＡをクローニングし、これを鋳型にして該抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法等により作製し、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈＥｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））に基づいて軽鎖及び重鎖の各可変領域の配列又は各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を決定する。

【0087】

さらに、これらの各可変領域をコードするＤＮＡ又は各ＣＤＲをコードするＤＮＡを、遺伝子組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））又はＤＮＡ合成機を用いて作製する。ここで、上記ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にヒトＣＡＰＲＩＮ−１を免疫したのち、該免疫動物から切除した脾細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって作製することができる。これとは別に、必要に応じて、遺伝子組換え技術又はＤＮＡ合成機を用いてヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡを作製する。

【0088】

ヒト化抗体の場合には、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ中のＣＤＲコーディング配列を、それらに対応する、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲコーディング配列と置換したＤＮＡを作製し、それによって得られたＤＮＡをそれぞれヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、ヒト化抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。

【0089】

キメラ抗体の場合には、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、キメラ抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。

【0090】

単鎖抗体の場合には、この抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーを介して直線状に連結された抗体であり、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、リンカーをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを結合することによって単鎖抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。また、リンカーは、１２〜１９アミノ酸からなり、例えば１５アミノ酸の（Ｇ_４Ｓ）_３（Ｇ． −Ｂ． Ｋｉｍら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２００７， ２０（９）： ４２５−４３２）が挙げられる。

【0091】

二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）の場合には、この抗体は２つの異なるエピトープと特異的に結合可能な抗体であり、例えば重鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡをこの順序で結合する（ただし、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡと重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡとは上記のようなリンカーをコードするＤＮＡを介して結合される。）ことによって二重特異性抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ヒト抗体由来においてＣＤＲのみがヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたものである。

【0092】

上記のようにして作製された組換えＤＮＡを、１つ又は複数の適当なベクターに組み込み、これを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、（共）発現させることによって組換え型抗体を作製することができる（Ｐ．Ｊ． Ｄｅｌｖｅｓ．， ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．， １９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ． Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ． Ｄｅａｎ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．， ２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ； Ｊ．Ｗ． Ｇｏｄｉｎｇ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．， １９９３ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ）。

【0093】

上記の方法によって作製される本発明の抗体は、例えば以下の（ａ）又は（ｂ）の抗体が挙げられる。

【0094】

（ａ）配列番号４０、４１及び４２を含む重鎖可変領域と配列番号４４、４５及び４６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号４３の重鎖可変領域及び配列番号４７の軽鎖可変領域で構成される抗体）。

【0095】

（ｂ）配列番号４０，４１及び４２を含む重鎖可変領域と配列番号５０，５１及び５２を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号４３の重鎖可変領域及び配列番号５３の軽鎖可変領域で構成される抗体）。

【0096】

ここで、配列番号４０、４１及び４２に示すアミノ酸配列は、ニワトリ抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、また、配列番号４４、４５及び４６、配列番号５０，５１及び５２に示すアミノ酸配列はそれぞれ、ニワトリ抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３である。

【0097】

また、本発明のヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体は、例えば以下の抗体である（抗体（ａ）で例示する）。

【0098】

（ｉ）重鎖の可変領域が配列番号４０、４１及び４２のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号４４、４５及び４６のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含む抗体（例えば、重鎖可変領域に配列番号４３のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域に配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体）。

【0099】

（ｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号４０、４１及び４２のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号４４、４５及び４６のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体（例えば、重鎖の可変領域が配列番号４３のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体）。

【0100】

なお、ヒト抗体重鎖及び軽鎖の定常領域及び可変領域の配列は、例えばＮＣＢＩ（米国：ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅなど）から入手可能であり、例えばヒトＩｇＧ１重鎖定常領域については登録番号Ｊ００２２８、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域については登録番号Ｊ００２３０、ヒトＩｇＧ３重鎖定常領域については登録番号Ｘ０３６０４、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域については登録番号Ｋ０１３１６、ヒト軽鎖κ定常領域については登録番号Ｖ００５５７、Ｘ６４１３５、Ｘ６４１３３など、ヒト軽鎖λ定常領域については登録番号Ｘ６４１３２、Ｘ６４１３４などの配列を参照することができる。

【0101】

上記抗体は、好ましくは、細胞障害活性を有しており、これによって抗腫瘍効果を発揮することができる。

【0102】

また、上記抗体における重鎖及び軽鎖の可変領域やＣＤＲの特定の配列は、単に例示を目的としたものであり、特定の配列に限定されないことは明らかである。ヒトＣＡＰＲＩＮ−１に対する別のヒト抗体又は非ヒト動物抗体（例えばマウス抗体）を産生しうるハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収し、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１との免疫学的結合性及び細胞障害活性を指標として目的の抗体であるか否かを判定する。それによって目的のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを識別したのち、上記のとおり、該ハイブリドーマから目的の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを作製し配列決定し、該ＤＮＡを別の抗体の作製のために利用する。

【0103】

さらに本発明の上記抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１を特異的に認識するという特異性を有する限り、上記（ａ）と（ｂ）の各抗体の特にフレームワーク領域の配列及び／又は定常領域の配列において、１若しくは数個（好ましくは、１若しくは２個）のアミノ酸の置換、欠失又は付加があってもよい。ここで数個とは、２〜５個、好ましくは２個又は３個を意味する。

【0104】

本発明はさらに、本発明の上記抗体をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡも提供する。そのようなＤＮＡは、例えば抗体（ａ）の場合、配列番号４０、４１及び４２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、配列番号４４、４５及び４６のアミノ酸配列をコードする塩基配列含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、などを含む。

【0105】

これらの配列のＤＮＡによってコードされる相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の特異性を決定する領域であるため、抗体のそれ以外の領域（すなわち、定常領域及びフレームワーク領域）をコードする配列は他の抗体由来の配列であってもよい。ここで他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。すなわち、上記のＤＮＡでは、重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。

【0106】

さらに、本発明の抗体をコードするＤＮＡの別の例は、例えば抗体（ａ）の場合、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列番号４７のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡなどである。ここで、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列番号５７の塩基配列である。また、配列番号４７のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列番号５８の塩基配列である。これらのＤＮＡでも、重鎖及び軽鎖の各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。

【0107】

本発明のＤＮＡは、例えば上記の方法又は以下の方法で得ることができる。まず、本発明の抗体に関わるハイブリドーマから、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて全ＲＮＡを調製し、ランダムプライマー等を用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。次いで既知のマウス抗体重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の各可変領域において、それぞれ保存されている配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。定常領域をコードする配列については、既知の配列をＰＣＲ法で増幅することによって得ることができる。ＤＮＡの塩基配列は、配列決定用プラスミド又はファージに組み込むなどして、常法により決定することができる。

【0108】

本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体によるＣＡＰＲＩＮ−１発現癌細胞に対する抗腫瘍効果はＣＡＰＲＩＮ−１発現細胞のエフェクター細胞抗体依存的細胞障害性（ＡＤＣＣ）、又はＣＡＰＲＩＮ−１発現細胞の補体依存的細胞障害性（ＣＤＣ）により起こると考えられる。

【0109】

したがって、本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の活性評価は、以下実施例に具体的に示されるように、生体外でＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞に対して上記ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を測定することで評価することができる。

【0110】

本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体は、癌細胞上のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と結合し、上記活性によって、抗腫瘍作用を示すことから、癌の治療あるいは予防に有用であると考えられる。すなわち本発明は、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を有効成分とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト化抗体にすることが好ましい。

【0111】

なお、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体と癌細胞表面上のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質との結合親和性が高い程、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体による、より強い抗腫瘍活性が得られる。したがって、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と高い結合親和性を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を獲得できれば、より強い抗腫瘍効果が期待でき、癌の治療及び／又は予防を目的とした医薬組成物として適応することが可能になる。高い結合親和性として、前述したように、結合定数（親和定数）Ｋａ（ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）が、好ましくは、少なくとも１０^７Ｍ^−１、少なくとも１０^８Ｍ^−１、少なくとも５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも５×１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、あるいは、少なくとも１０^１３Ｍ^−１であることが望ましい。

【0112】

＜抗原発現細胞への結合＞
抗体がＣＡＰＲＩＮ−１に結合する能力は、実施例で述べられるようなたとえばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析などを用いた結合アッセイを利用して特定することができる。

【0113】

＜免疫組織化学染色＞
ＣＡＰＲＩＮ−１を認識する抗体は、当業者に周知の方法での免疫組織化学により、外科手術の間に患者から得た組織や、自然に又はトランスフェクション後にＣＡＰＲＩＮ−１を発現する細胞系を接種した異種移植組織を担持する動物から得た組織から、パラホルムアルデヒド又はアセトン固定した凍結切片又はパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋した組織切片を使用して、ＣＡＰＲＩＮ−１との反応性に関して試験することができる。

【0114】

免疫組織化学染色のため、ＣＡＰＲＩＮ−１に対して反応性のある抗体を、様々な方法で染色させることができる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウス抗体やヤギ抗ニワトリ抗体を反応させることにより、可視化することができる。

【0115】

＜医薬組成物＞
本発明はまた、配列番号３７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有する配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で表されるＣＡＰＲＩＮ−１の部分ポリペプチドと免疫学的反応性を有する上記の抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。

【0116】

本発明の癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物の標的は、ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子を発現する癌（細胞）であれば特に限定されない。

【0117】

本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。

【0118】

本発明において対象となる癌としては、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質をコードする遺伝子を発現している癌であり、好ましくは、乳癌、脳腫瘍、白血病、肺癌、リンパ腫、肥満細胞腫、腎癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌及び大腸癌である。

【0119】

これらの特定の癌には、例えば、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、肺腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、神経上皮組織性腫瘍である神経膠腫、脳室上衣腫、神経細胞性腫瘍、胎児型の神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、神経線維腫、髄膜腫、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、盲腸癌、上行結腸癌、下行結腸癌、横行結腸癌、Ｓ状結腸癌、直腸癌が包含されるが、これらに限定されない。

【0120】

また、対象となる好ましい被験者は、哺乳動物であり、例えば霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、特にヒト、イヌ及びネコが好ましい。

【0121】

本発明で用いられる抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。

【0122】

注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

【0123】

注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−６０と併用してもよい。

【0124】

油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

【0125】

投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。

【0126】

また、患者の年齢、体重、性別、症状などにより適宜投与方法を選択することができる。抗体又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重、年齢、性別、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。

【0127】

本発明の抗体又はそのフラグメントを含む上記の医薬組成物を被験者に投与することによって癌、好ましくは、乳癌、脳腫瘍、白血病、肺癌、リンパ腫、肥満細胞腫、腎癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌及び大腸癌を治療及び／又は予防することができる。

【0128】

さらに、本発明の医薬組成物を、上記で例示したような抗腫瘍剤又は抗腫瘍剤を含む医薬組成物と組み合わせて、被験者に併用投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法も本発明に包含される。本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤は、同時に、あるいは、別々に被験者に投与されうる。別々に投与する場合には、いずれの医薬組成物が先であっても又は後であってもよく、それらの投与間隔、投与量、投与経路及び投与回数は、専門医によって適宜選択されうる。同時に投与する別の医薬剤型には、例えば、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤を、薬理学上許容される担体（もしくは媒体)中で混合し製剤化して得られる医薬組成物も包含されるものとする。また、抗腫瘍剤を含有する上記医薬組成物及び剤型のいずれに対しても、本発明の抗体を含有する医薬組成物及び剤型についての処方、製剤化、投与経路、用量、癌などの説明を適用しうる。したがって、本発明は、本発明の医薬組成物と、上で例示したような抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含む、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品も提供する。また、本発明は、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤とを、薬理学上許容される担体とともに含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物も提供する。

【0129】

＜ポリペプチド及びＤＮＡ＞
本発明は更に、上記抗体（ａ）及び（ｂ）に関わる以下のポリペプチド及びＤＮＡも提供する。

【0130】

（ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【0131】

（ｉｉ）配列番号４７、配列番号５３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【0132】

（ｉｉｉ）配列番号４０、４１及び４２に示すアミノ酸配列からなる群から選択される、重鎖ＣＤＲポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【0133】

（ｉｖ）配列番号４４、４５及び４６、配列番号５０，５１及び５２に示すアミノ酸配列からなる群から選択される、軽鎖ＣＤＲポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【0134】

これらのポリペプチド及びＤＮＡは、上記のとおり、遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。

【0135】

＜本発明の要約＞
上で説明した本発明を以下に要約する。

【0136】

（１）配列番号３７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有する配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で表されるＣＡＰＲＩＮ−１の部分ポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。

【0137】

（２）前記癌が乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、肥満細胞腫、腎癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌もしくは大腸癌である、上記（１）に記載の医薬組成物。

【0138】

（３）前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、上記（１）又は（２）に記載の医薬組成物。

【0139】

（４）前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。

【0140】

（５）配列番号３７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体。

【0141】

（６）ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を発現する癌細胞に対し細胞障害活性を有する、上記（５）に記載の抗体。

【0142】

（７）配列番号４０、４１及び４２を含む重鎖可変領域と配列番号４４、４５及び４６を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。

【0143】

（８）配列番号４０，４１及び４２を含む重鎖可変領域と配列番号５０，５１及び５２を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。

【0144】

（９）ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、上記（５）〜（８）のいずれかに記載の抗体。

【0145】

（１０）上記（５）〜（９）のいずれかに記載の抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。

【0146】

（１１）前記癌が乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、肥満細胞腫、腎癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌もしくは大腸癌である、上記（１０）に記載の医薬組成物。

【0147】

（１２）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の医薬組成物あるいは上記（１０）又は（１１）に記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含んでなる、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。

【0148】

（１３）上記（５）〜（９）のいずれかに記載の抗体又はそのフラグメント、あるいは上記（１０）又は（１１）に記載の医薬組成物を、被験者に投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。

【0149】

（１４）被験者において上記（１２）に記載の組み合わせ医薬品の各医薬組成物を併用することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。

【実施例】

【0150】

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例によって制限されないものとする。

【0151】

実施例１ ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの同定
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
健常な犬の精巣組織から酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム法（Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ ＲＮＡを精製した。

【0152】

この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ， ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ， ＺＡＰ−ｃＤＮＡ ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｇ Ｋｉｔ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは７．７３×１０^５ｐｆｕ／ｍｌであった。

【0153】

（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
上記作製したイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２２１０クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’）に感染させ、４２℃、３〜４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ Ｅｘｔｒａ： ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｎｅｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２〜３時間反応させた。

【0154】

上記患犬血清としては、乳癌の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｒｅ ＭＲＦ’）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃にて一晩培養した。次いで０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ_３ ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ−カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。

【0155】

かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｄｏｇ ＩｇＧ−ｈ＋Ｉ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ： ＢＥＴＨＹＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、室温１時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌＳＯ_４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％ゼラチン ｐＨ７．５）５００μｌに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する３０９４０個のファージクローンをスクリーニングして、５個の陽性クローンを単離した。

【0156】

（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
上記方法により単離した５個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’）を吸光度ＯＤ_６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液２５０μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５〜３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心分離を行い、上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ_６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μｌをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃で一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。

【0157】

精製したプラスミドは、配列番号３１に記載のＴ３プライマーと配列番号３２に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号５，７，９，１１，１３に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列（配列番号６，８，１０，１２，１４）を用いて、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を行い既知遺伝子との相同性検索を行った結果、得られた５個の遺伝子全てがＣＡＰＲＩＮ−１をコードする遺伝子であることが判明した。５個の遺伝子間の配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において塩基配列１００％、アミノ酸配列９９％であった。この遺伝子のヒト相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９８％であった。ヒト相同因子の塩基配列を配列番号１、３に、アミノ酸配列を配列番号２、４に示す。また、取得したイヌ遺伝子のウシ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９７％であった。ウシ相同因子の塩基配列を配列番号１５に、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウシ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９３〜９７％であった。また、取得したイヌ遺伝子のウマ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９３％、アミノ酸配列９７％であった。ウマ相同因子の塩基配列を配列番号１７に、アミノ酸配列を配列番号１８に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウマ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９３％、アミノ酸配列９６％であった。また、取得したイヌ遺伝子のマウス相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８７〜８９％、アミノ酸配列９５〜９７％であった。マウス相同因子の塩基配列を配列番号１９、２１、２３、２５、２７に、アミノ酸配列を配列番号２０、２２、２４、２６、２８に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とマウス相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８９〜９１％、アミノ酸配列９５〜９６％であった。また、取得したイヌ遺伝子のニワトリ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８２％、アミノ酸配列８７％であった。ニワトリ相同因子の塩基配列を配列番号２９に、アミノ酸配列を配列番号３０に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とニワトリ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８１〜８２％、アミノ酸配列８６％であった。

【0158】

（４）各組織での遺伝子発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ及びヒトの正常組織及び各種細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０〜１００ｍｇ及び各細胞株５〜１０×１０^６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（配列番号３３及び３４に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃−３０秒のサイクルを３０回繰り返して行った。なお、上記遺伝子特異的プライマーは、配列番号５の塩基配列（イヌＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子）中の２０６番〜６３２番及び配列番号１の塩基配列（ヒトＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子）中の６９８番〜１１２４番塩基の領域を増幅するものであった。比較対照のため、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（配列番号３５及び３６に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、健常なイヌ組織では精巣に強い発現が見られ、一方イヌ乳癌及び腺癌組織で発現が見られた。さらに、取得した遺伝子のヒト相同因子の発現を併せて確認したところ、イヌＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子と同様、正常組織で発現が確認できたのは精巣のみだったが、癌細胞では乳癌、脳腫瘍、白血病、肺癌、食道癌細胞株など、多種類の癌細胞株で発現が検出され、特に多くの乳癌細胞株で発現が確認された。この結果から、ＣＡＰＲＩＮ−１は精巣以外の正常組織では発現が見られず、一方、多くの癌細胞で発現しており、特に乳癌細胞株に発現していることが確認された。

【0159】

なお、図１中、縦軸の参照番号１は、上記で同定した遺伝子の発現パターンを、参照番号２は、比較対照であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。

【0160】

（５）免疫組織化学染色
（５）−１ マウス及びイヌ正常組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌）及びイヌ（ビーグル犬、雌）をエーテル麻酔下及びケタミン／イソフルラン麻酔下で放血させ、開腹後、各臓器（胃、肝臓、眼球、胸腺、筋肉、骨髄、子宮、小腸、食道、心臓、腎臓、唾液腺、大腸、乳腺、脳、肺、皮膚、副腎、卵巣、膵臓、脾臓、膀胱）をそれぞれＰＢＳの入った１０ｃｍディッシュに移した。ＰＢＳ中で各臓器を切り開き、４％ ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）を含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で一晩還流固定した。還流液を捨て、ＰＢＳで各臓器の組織表面をすすぎ、１０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液を５０ｍｌ容の遠心チューブに入れ、その中に各組織を入れて４℃で２時間ローターを用いて振とうした。２０％ ショ糖を含むＰＢＳ溶液に入れ替え、４℃で組織が沈むまで静置後、３０％ ショ糖を含むＰＢＳ溶液に入れ替え、４℃で組織が沈むまで静置した。組織を取り出し、必要な部分を手術用メスで切りだした。次に、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ社製）をかけて組織表面になじませた後、クライオモルドに組織を配置した。ドライアイスの上にクライオモルドをおいて急速凍結させた後、クライオスタット（ＬＥＩＣＡ社製）を用いて１０〜２０μｍに薄切し、スライドガラスごとヘアードライアーで３０分間風乾し、薄切組織がのったスライドガラス作製した。次にＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）を満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮ（ＤＡＫＯ社製）で囲んだ後、ブロッキング液として、マウス組織はＭＯＭマウスＩｇブロッキング試薬（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）を、イヌ組織は１０％ ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液をそれぞれのせ、モイストチャンバー上で室温にて１時間静置した。次に、実施例４で作製した癌細胞表面に反応する、配列番号４３の重鎖可変領域と配列番号４７の軽鎖可変領域を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体＃１）をブロッキング液で１０μｇ／ｍｌに調製した溶液をのせ、モイストチャンバー内で４℃下にて一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ブロッキング液で２５０倍に希釈したＭＯＭビオチン標識抗ＩｇＧ抗体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）をのせ、モイストチャンバー内で室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、アビジンービオチンＡＢＣ試薬（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）をのせ、モイストチャンバー内で室温にて５分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＢ １０ｍｇ＋３０％ Ｈ_２Ｏ_２ １０μｌ／０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍｌ）をのせ、モイストチャンバー内で室温で３０分間静置した。蒸留水でリンスし、ヘマトキシリン試薬（ＤＡＫＯ社製）を載せて室温で１分間静置後、蒸留水でリンスした。７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、キシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は、唾液腺、腎臓、結腸、胃の各組織において細胞内で僅かに発現が認められたが、細胞表面での発現は認められず、また、その他の臓器由来の組織では全く発現が認められなかった。なお、本結果は、配列番号４３の重鎖可変領域と配列番号５３の軽鎖可変領域を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体＃２）を用いた場合も同様であった。

【0161】

（５）−２ イヌ乳癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
病理診断で悪性乳癌と診断されたイヌの凍結された乳癌組織１０８検体を用いて、上述と同様の方法で凍結切片スライド作製及び実施例４で作製したモノクローナル抗体＃１を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は１０８検体中１００検体（９２．５％）で発現が確認され、特に異型度の高い癌細胞表面に強く発現していた。なお、本結果は、モノクローナル抗体＃２を用いた場合も同様であった。

【0162】

（５）−３ ヒト乳癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト乳癌組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の乳癌組織１８８検体を用いて、免疫組織化学染色を行った。ヒト乳癌組織アレイを６０℃で３時間処理後、キシレンを満たした染色瓶に入れて５分ごとにキシレンを入れ替える操作を３回行った。次にキシレンの代わりにエタノール及びＰＢＳ−Ｔで同様の操作を行った。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を満たした染色瓶にヒト乳癌組織アレイを入れ、１２５℃で５分間処理後、室温で４０分以上静置した。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮで囲み、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）を適量滴下した。室温で５分間静置後、ＰＢＳ−Ｔを満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。ブロッキング液として、１０％ ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液をのせ、モイストチャンバー内で室温で１時間静置した。次に実施例４で作製した癌細胞表面に反応するモノクローナル抗体＃１を５％ ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液で１０μｇ／ｍｌに調製した溶液をのせ、モイストチャンバー内で４℃で一晩静置し、ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＤＡＫＯ社製）適量滴下し、モイストチャンバー内で室温で３０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＫＯ社製）をのせ、室温で１０分程度静置した後、発色液を捨て、ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、蒸留水でリンスし、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、キシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は全乳癌組織１８８検体のうち、１３８検体（７３％）で強い発現が認められた。なお、本結果は、モノクローナル抗体＃２を用いた場合も同様であった。

【0163】

（５）−４ ヒト悪性脳腫瘍におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト悪性脳腫瘍組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の悪性脳腫瘍組織２４７検体を用いて、上述（５）−３と同様の方法で実施例４において作製したモノクローナル抗体＃１を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は全悪性脳腫瘍組織２４７検体のうち、２２７検体（９２％）で強い発現が認められた。なお、本結果は、モノクローナル抗体＃２を用いた場合も同様であった。

【0164】

（５）−５ ヒト乳癌転移リンパ節におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト乳癌転移リンパ節組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の乳癌転移リンパ節組織１５０検体を用いて、上述（５）−３と同様の方法で実施例４において作製したモノクローナル抗体＃１を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は全乳癌転移リンパ節組織１５０検体の内、１３６検体（９０％）で強い発現が認められた。すなわち、乳癌から転移した癌組織においてもＣＡＰＲＩＮ−１は強く発現することが判った。なお、本結果は、モノクローナル抗体＃２を用いた場合も同様であった。

【0165】

（５）−６ ヒト各種癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト各種癌組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の検体を用いて、上述と同様の方法で実施例４において作製したモノクローナル抗体＃１を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は食道癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、腎癌、膀胱癌及び子宮頸癌で強い発現が認められた。なお、本結果は、モノクローナル抗体＃２を用いた場合も同様であった。

【0166】

実施例２ ヒト新規癌抗原タンパクの作製
（１）組換えタンパク質の作製
実施例１で取得した配列番号１の遺伝子を基に、以下の方法にてヒト相同遺伝子の組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織・細胞ｃＤＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μｌ、ＳａｃＩ及びＸｈｏＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号３８及び３９に記載）を各０．４μＭ， ０．２ｍＭ ｄＮＴＰ， １．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃−１０秒、６８℃−２．５分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号２のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。

【0167】

精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＳａｃＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。

【0168】

（２）組換えタンパク質の精製
上記で得られた、配列番号１の遺伝子を発現するそれぞれの組換え大腸菌を３０μｇ／ｍｌ カナマイシン含有ＬＢ培地にて６００ｎｍでの吸光度が０．７付近になるまで３７℃で培養後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド終濃度が１ｍＭとなるよう添加し、３７℃で４時間培養した。その後４８００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。この菌体ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、さらに４８００ｒｐｍで１０分間遠心し菌体の洗浄を行った。

【0169】

この菌体をリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、氷上にて超音波破砕を行った。大腸菌超音波破砕液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。

【0170】

可溶性画分を、定法に従って調整したニッケルキレートカラム（担体：Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ社）、カラム容量５ｍｌ、平衡化緩衝液５０ｍＭ 塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加した。未吸着画分をカラム容量の１０倍量の５０ｍＭ 塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）と２０ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄操作を行った後、直ちに、１００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて６ベッド溶出した。クマシー染色によって目的タンパク質の溶出を確認した１００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）溶出画分を強陰イオン交換カラム（担体：Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ社）、カラム容量５ｍｌ、平衡化緩衝液としての２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加した。未吸着画分をカラム容量の１０倍量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と２００ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄操作を行った後、直ちに、４００ｍＭ 塩化ナトリウム含有２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて５ベッド溶出を行い、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する各タンパク質の精製画分を得た。

【0171】

上記方法によって得られた各精製標品のうち、２００μｌを１ｍｌの反応用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ， ５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２ｍＭ ＣａＣｌ_２ ｐＨ７．４）に分注を行った後、エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）２μｌ添加した後、室温にて一晩静置、反応を行い、Ｈｉｓタグを切断し、Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて添付プロトコールに従って精製を行った。次に、上記方法によって得られた精製標品１．２ｍｌを、限外ろ過ＮＡＮＯＳＥＰ １０Ｋ ＯＭＥＧＡ（ＰＡＬＬ社製）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬社製）置換した後、ＨＴタフリンアクロディスク０．２２μｍ（ＰＡＬＬ社製）にて無菌ろ過を行い、これを以下の実験に用いた。

【0172】

実施例３ ＣＡＰＲＩＮ−１に対するニワトリモノクローナル抗体の作製
実施例２で調製した配列番号２に示される、抗原タンパク質（ヒトＣＡＰＲＩＮ−１）３００μｇを等量のフロイントの完全アジュバントと混合し、これをニワトリ１羽当たりの抗原溶液とした。抗原溶液を７週齢のニワトリの腹腔内に投与後、４週間毎に７回投与を行い免疫を完了した。最後の免疫から４日後に摘出したそれぞれの脾臓を滅菌した２枚のスライドガラスに挟んで擦り潰し、ＰＢＳ（−）（日水社製）を用いて洗浄し１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去する操作を３回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞と、鳥類細網内皮症ウイルスを用いてニワトリから形質転換法により樹立した、軽鎖が欠損しているニワトリミエローマ細胞とを５：１の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％ ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地２００μｌとＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）８００μｌを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて、５分間静置して細胞融合を行った。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、Ｇｉｂｃｏ社製のＨＡＴ溶液を２％当量加えた１０％ ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地（ＨＡＴ選択培地）３００ｍｌで細胞を懸濁し、９６穴プレート（ヌンク社製）の１ウェル当たり１００μｌずつ、プレート３０枚に播種した。７日間、３７℃、５％ ＣＯ_２の条件で培養することで、脾臓細胞とニワトリミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。

【0173】

作製したハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ−１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液（シグマ社製）を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを複数個選抜した。

【0174】

選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ−１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％ ＢＳＡ溶液を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ抗体（ＳＩＧＭＡ社製））を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を複数個得た。

【0175】

次にそれらモノクローナル抗体のうち、ＣＡＰＲＩＮ−１が発現する乳癌細胞の細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、５×１０^５個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖを１．５ｍｌ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの培養上清１００μｌを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％ ＦＢＳを含むＰＢＳで３０倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ハイブリドーマ培養用培地を用いて行い、コントロールのサンプルとした。その結果、コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する乳癌細胞の細胞表面に反応するモノクローナル抗体２個（モノクローナル抗体＃１及び＃２）を選抜した。

【0176】

実施例４ 選抜した抗体の特徴付け
（１）抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の可変領域遺伝子のクローニング
実施例３で選抜した２個のモノクローナル抗体をそれぞれ産生する各ハイブリドーマ株から、ｍＲＮＡを抽出し、ニワトリＦＲ１由来配列及びニワトリＦＲ４由来の配列に特異的なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ法により、各抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域の遺伝子を取得した。配列決定のために、それら遺伝子をｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。

【0177】

（１）−１ ＲＴ−ＰＣＲ
１０^６個の各ハイブリドーマ株から、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。これら操作は各キットの添付プロトコールに従って行った。

【0178】

合成したｃＤＮＡを鋳型としＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(ＴＯＹＯＢＯ社製)を用いて、常法に従い、ＰＣＲ法にて、ニワトリ抗体重鎖遺伝子可変領域及びニワトリ抗体軽鎖遺伝子可変領域を増幅した。

【0179】

ＶＨ領域の遺伝子取得のために、ニワトリ重鎖ＦＲ１配列に特異的なプライマー及びニワトリ重鎖ＦＲ４配列に特異的なプライマーを使用した。またＶＬ領域の遺伝子取得のために、ニワトリ軽鎖ＦＲ１配列に特異的なプライマー及びニワトリ軽鎖ＦＲ４に特異的なプライマーを使用した。

【0180】

上記で得られた各ＰＣＲ産物を用いてアガロースゲルにて電気泳動を行い、ＶＨ領域及びＶＬ領域それぞれのＤＮＡバンドを切り出した。ＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてその添付プロトコールに従って行った。精製した各ＤＮＡはＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。連結したベクターをＤＨ５・コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）に定法に従い形質転換を行った。各形質転換体それぞれ１０クローンを培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で３７℃一晩培養後、各プラスミドＤＮＡをＱｉａｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。

【0181】

（１）−２ 配列決定
上記で得られた各プラスミド中のＶＨ領域及びＶＬ領域の遺伝子配列解析は、Ｍ１３フォワードプライマー（配列番号４８）及びＭ１３リバースプライマー（配列番号４９）を用いて、蛍光シーケンサー（ＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサー３１３０ＸＬ）により、ＡＢＩ社製のビッグダイターミネーターＶｅｒ３．１サイクルシーケンシングキットを用いて、その添付プロトコールに従い行った。その結果、各々の遺伝子配列が決定された（各々１０クローンで一致）。

【0182】

得られたモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号４３に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号４７及び配列番号５３に示す。

【0183】

すなわち、モノクローナル抗体＃１は配列番号４３の重鎖可変領域と配列番号４７の軽鎖可変領域から成り、そのうち、重鎖可変領域中のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２のアミノ酸配列から成り、軽鎖可変領域中のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６のアミノ酸配列から成ることが確認された。また、＃２は配列番号４３の重鎖可変領域と配列番号５３の軽鎖可変領域から成り、そのうち、重鎖可変領域中のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２のアミノ酸配列から成り、軽鎖可変領域中のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２のアミノ酸配列から成ることが確認された。

【0184】

（２）ヒト−ニワトリキメラ組換え抗体の作製
上記（１）で得られた、配列番号４３で示されるニワトリモノクローナル抗体＃１及び＃２の重鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、配列番号５４を含むヒト抗体由来のリーダー配列と配列番号５５を含むヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。また、配列番号４７で示されるにニワトリモノクローナル抗体＃１の軽鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、配列番号５４を含むニワトリ抗体由来のリーダー配列と配列番号５６を含むヒトＩｇＧ１のＬ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。同様に、配列番号５３で示されるにニワトリモノクローナル抗体＃２の軽鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、ニワトリ抗体由来のリーダー配列とヒトＩｇＧ１のＬ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターへ常法に従って挿入した。

【0185】

次に、配列番号４３で示されるニワトリモノクローナル抗体＃１及び＃２の重鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターと、配列番号４７で示されるニワトリモノクローナル抗体＃１の軽鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞（理研セルバンクより入手）に導入した。具体的には、１２穴培養プレートの１ウェル当たりに１ｍｌの１０％ ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養された２×１０^５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞をＰＢＳ（−）で洗浄したのちに、１ウェル当たり１ｍｌの１０％ ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地を新たに加えたウェルに３０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に溶解した上記各ベクター２５０ｎｇとＰｏｌｙｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）３０μｌとを混合したものを添加した。上記組換えベクターを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞を、２００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ならびに２００μｇ／ｍｌジェネチシン（ロシュ社製）を添加した１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地で培養したのち、９６ウェルプレートの１ウェル当たりに０．５個となるように上記組換えベクターを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞を播種して、ニワトリモノクローナル抗体＃１の可変領域を有するヒト−ニワトリキメラ抗体＃１（＃１）を安定的に産生する細胞株を作製した。作製した細胞株を１５０ｃｍ^２フラスコを用いて５×１０^５個／ｍｌで血清を含まないＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）３０ｍｌを用いて５日間培養し、＃１を含む培養上清を得た。

【0186】

同様の方法で、配列番号４３で示される重鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターと、配列番号５３で示されるニワトリモノクローナル抗体＃２の軽鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入して、ニワトリモノクローナル抗体＃２由来の可変領域を有するヒトーニワトリキメラ抗体＃２（＃２）を安定的に産生する細胞株を作製した。作製した細胞株を１５０ｃｍ^２フラスコで血清を含まないＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて５日間培養し、＃２を含む培養上清を得た。

【0187】

（３）抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１及び＃２を用いた各種癌細胞表面でのＣＡＰＲＩＮ−１の発現
次にＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子の発現が確認された乳癌細胞株７種（ＭＤＡ−ＭＢ−１５７，Ｔ４７Ｄ，ＭＲＫ−ｎｕ−１，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖ，ＢＴ２０，ＳＫ−ＢＲ−３，ＤＡ−ＭＢ−２３１Ｔ）及びその他の乳癌細胞株３種（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｃ，ＭＣＦ−７，ＺＲ７５−１）、グリオーマ細胞株５種（Ｔ９８Ｇ，ＳＮＢ１９，Ｕ２５１，Ｕ８７ＭＧ，Ｕ３７３）、腎臓癌細胞株４種（Ｃａｋｉ−１，Ｃａｋｉ−２，Ａ４９８，ＡＣＨＮ）、胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８，ＭＫＮ４５）、大腸癌細胞株５種（ＨＴ２９，ＬｏＶｏ，Ｃａｃｏ２，ＳＷ４８０，ＨＣＴ１１６）、肺癌細胞株３種（Ａ５４９、ＱＧ５６、ＰＣ８）、白血病細胞株４種（ＡＭＬ５，Ｎａｍａｌｗａ、ＢＤＣＭ、ＲＰＩ１７８８）、子宮頸癌細胞株１種（ＳＷ７５６）、膀胱癌細胞株１種（Ｔ２４）、食道癌細胞株１種（ＫＹＳＥ１８０）及びリンパ腫細胞株１種（Ｒａｍｏｓ）について、上記（２）で得られた＃１と＃２を含むＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清を用いて、各細胞の細胞表面上でのＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の発現を調べた。各細胞株それぞれ１０^６細胞を１．５ｍｌ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離した。上記（２）で得られた＃１と＃２をそれぞれ含む各細胞培養上清（１００μｌ）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％ ＦＢＳを含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、＃１及び＃２を含むＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清の代わりに、抗体遺伝子が導入されていないＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清を用いて行い、陰性コントロールとした。その結果、＃１及び＃２のヒトーニワトリキメラ抗体を添加された細胞は、コントロールに比べて、いずれも蛍光強度が２０％以上強かった。具体的には、＃１の抗体を用いた場合、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７が２１７％、Ｔ４７Ｄが３２６％、ＭＲＫ−ｎｕ−１が１２５％、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖが５２７％、ＢＴ２０が２００％、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｔが３２７％の蛍光強度の増強を示した。また、＃２の抗体を用いた場合もほぼ同等の蛍光強度の増強を示した。このことから、上記各種ヒト癌細胞株の細胞膜表面上にＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質が発現していることが確認された。なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。

【0188】

平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）−（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００。

【0189】

（４）抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１及び＃２の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＡＤＣＣ活性）
次に、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体＃１及び＃２の癌細胞に対する細胞障害活性を評価した。上記（２）で得た＃１及び＃２を産生する各細胞培養上清をＨｉｔｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（−）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを活性測定用の抗体として用いた。１０^６個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１５７を５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０^３個ずつ添加して標的細胞とした。これに、上記精製抗体をそれぞれ１μｇ添加し、さらにヒト末梢血から常法に従って分離したリンパ球を１０^５個添加して、３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体による癌細胞に対する細胞障害活性を算出した。陰性コントロールには抗体の代わりにＰＢＳを添加したもの、アイソタイプコントロール抗体を添加したものを用いた。その結果、＃１及び＃２の抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７に対して、それぞれ２５．３％、３１％の活性を示した（図２参照）。なお、陰性コントロールであるＰＢＳを添加したもの、アイソタイプコントロール抗体を添加したものの活性は、それぞれ１．６％、３．３％であった。同様にして、他の癌細胞、グリオーマ細胞株Ｔ９８Ｇ、Ｕ３７３、肺癌細胞株Ａ５４９、ＱＧ５６、腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−１、ＡＣＨＮ、子宮頸癌細胞株ＳＷ７５６、膀胱癌細胞株Ｔ２４、食道癌細胞株ＫＹＳＥ１８０、胃癌細胞株ＭＫＮ２８、ＭＫＮ４５、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、白血病細胞株ＡＭＬ５及びリンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓに対する抗体＃１及び＃２の細胞障害活性を調べたところ、抗体＃１の活性は、Ｔ９８Ｇは１０．５％（アイソタイプコントロールは１．３％）、Ｕ３７３は１０．９％（アイソタイプコントロールは３％）、Ａ５４９は、１４．０％（アイソタイプコントロールは２．６％）、ＱＧ５６は、１５．９％（アイソタイプコントロールは０．２％）、Ｃａｋｉ−１は、１０．９％（アイソタイプコントロールは３．０％）、ＡＣＨＮは、１２．６％（アイソタイプコントロールは１．５％）、ＳＷ７５６は、１１．８％（アイソタイプコントロールは２．５％）、Ｔ２４は、１２．３％（アイソタイプコントロールは２．１％）、ＫＹＳＥ１８０は１７．７％（アイソタイプコントロールは３．０％）の活性を示し、ＭＫＮ２８は１０．１％（アイソタイプコントロールは１．７％）、ＭＫＮ４５は９．４％（アイソタイプコントロールは２．３％）、ＳＷ４８０は１０．３％（アイソタイプコントロールは１．３％）、ＡＭＬ５は８．３％（アイソタイプコントロールは２．１％）、Ｒａｍｏｓは９．５％（アイソタイプコントロールは３．８％）の活性を示した。また、抗体＃２においても同様の結果を示した。以上の結果より、取得した抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１及び＃２は、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する各種ヒト癌細胞を障害することが示された。

【0190】

（５）抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１及び＃２の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＣＤＣ活性）
次に、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体＃１及び＃２の癌細胞に対する細胞障害活性（ＣＤＣ活性）を評価した。ウサギから採血した血液をエッペンドルフチューブに入れ、室温で６０分間、静置した後３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離することで、ＣＤＣ活性測定用の血清を調製した。ヒト乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖを１０^５個を５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした後、１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で３回洗浄した。その後上記で調製したウサギ血清を５０％含むＲＰＭＩ培地で懸濁し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０^３個ずつ添加した。これに上述（４）で得た＃１及び＃２をそれぞれ１μｇずつ添加して、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、各抗体のＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖに対するＣＤＣ活性を算出した。その結果、＃１及び＃２の抗体はともに、３０％以上のＣＤＣ活性を示した。したがって、＃１及び＃２は、ＣＤＣ活性によっても、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。

【0191】

実施例５ マウス生体内における抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１及び＃２の抗腫瘍効果
次に、取得したＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体＃１及び＃２の担癌マウス生体内における抗腫瘍効果を評価した。使用した抗体は上記と同様に、＃１及び＃２を産生する各細胞の培養上清をカラム精製したものを用いた。

【0192】

ＣＡＰＲＩＮ−１を発現するマウス由来の癌細胞株を移植した担癌マウスを用いて、＃１及び＃２の抗体の抗腫瘍効果を検討した。３０匹のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の背部皮下に、１匹あたり１０^６個の４Ｔ１細胞（ＡＴＣＣより購入）を移植し、腫瘍が直径５ｍｍ程度の大きさになるまで成長させた。そのうち、３０匹の担癌マウスに対して、＃１及び＃２の抗体を１匹あたり３００μｇ（３００μｌ）ずつ、１抗体につき１０匹に腹腔内投与した。その後、２日間計３回、同量の各抗体を各担癌マウスの腹腔に投与し、毎日腫瘍の大きさを計測し、抗腫瘍効果を観察した。一方、残り１０匹の担癌マウスに対して、抗体の代わりにＰＢＳ（−）を投与し、これをコントロール群とした。抗腫瘍効果の観察の結果、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体＃１及び＃２を投与した検討群は、腫瘍が抗体投与開始時の腫瘍体積を１００％とした場合に、１１日目にはそれぞれ７０％、８０％にまで腫瘍が退縮し、１５日目には、８％、２６％にまで腫瘍が退縮した。（図３参照）。一方、ＰＢＳ（−）を投与したコントロール群では、４日目、６日目、８日目、１１日目にはそれぞれ、約２３０％、３４０％、５５０％、８４０％にまで腫瘍が増大した（図３参照）。この結果から、取得した＃１及び＃２の抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞に対して、生体内で強い抗腫瘍効果を発揮することが示された。なお、腫瘍の大きさは、長径×短径×短径×０．５の計算式を用いて、体積を算出した。

【0193】

実施例６ 抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１及び＃２が結合するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質中のエピトープの同定
実施例４（２）で取得した、癌細胞の細胞表面に反応するＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体＃１及び＃２を用いて、それらが認識するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質中のエピトープペプチドの同定を行った。ヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質のアミノ酸配列中、１２〜１６アミノ酸から成る、９３個の候補ペプチドを合成し、それぞれ１ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＤＭＳＯで溶解した。

【0194】

各ペプチドを０．１Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中に３０μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製、製品番号：４３６００６）の１穴あたり１００μｌずつ添加して４℃で一晩静置した。液を捨て、１０ｍＭエタノールアミン／０．１Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ９．６）を１穴あたり２００μｌずつ添加し、室温で１時間静置した後、液を捨て、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）にて２回洗浄することによって、各ペプチドが固相化されたプレートを作製した。

【0195】

これに、実施例４（２）で得られたヒトーニワトリキメラモノクローナル抗体を含む細胞培養上清を１穴あたり５０μｌ添加し、室温で１時間振とうした後、液を除去し、ＰＢＳＴにて３回洗浄した。次に、ＨＲＰが標識された抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：６２−７１２０）抗体をＰＢＳＴにて３０００〜４０００倍希釈した２次抗体溶液を５０μｌずつ添加した後、液を除去し、ＰＢＳＴにて６回洗浄を行った。

【0196】

ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、＃１及び＃２の抗体は、いずれもＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質中の部分配列ペプチドである、配列番号３７のポリペプチドを認識しており、したがって、本ポリペプチドが抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１及び＃２のエピトープ領域を含んでいることが判った。

【産業上の利用可能性】

【0197】

本発明の抗体は、癌の治療及び／又は予防のため有用である。

【0198】

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

【配列表フリーテキスト】

【0199】

配列番号３１〜３６、３８、３９、４８、４９：プライマー

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]