特許 5925414 高圧酵素分解技法を利用した植物抽出物の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5925414

(24)【登録日】2016年4月28日

(45)【発行日】2016年5月25日

(54)【発明の名称】高圧酵素分解技法を利用した植物抽出物の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 13/04 20060101AFI20160516BHJP

   A61K 8/97 20060101ALI20160516BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20160516BHJP

   A61P 17/18 20060101ALI20160516BHJP

   A61K 36/899 20060101ALI20160516BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20160516BHJP

【ＦＩ】

   C12P13/04

   A61K8/97

   A61Q19/00

   A61P17/18

   A61K36/899

   A61P17/16

【請求項の数】5

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2010-253921(P2010-253921)

(22)【出願日】2010年11月12日

(65)【公開番号】特開2011-103880(P2011-103880A)

(43)【公開日】2011年6月2日

【審査請求日】2013年11月7日

(31)【優先権主張番号】10-2009-0109850

(32)【優先日】2009年11月13日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】506213681

【氏名又は名称】株式会社アモーレパシフィック

【氏名又は名称原語表記】ＡＭＯＲＥＰＡＣＩＦＩＣ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100132230

【弁理士】

【氏名又は名称】佐々木 一也

(74)【代理人】

【識別番号】100082739

【弁理士】

【氏名又は名称】成瀬 勝夫

(74)【代理人】

【識別番号】100087343

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 智廣

(72)【発明者】

【氏名】姜 顯 瑞

(72)【発明者】

【氏名】金 慧 媛

(72)【発明者】

【氏名】姜 ▲サン▼ 求

(72)【発明者】

【氏名】趙 誠 雅

(72)【発明者】

【氏名】▲ソウ▼ 濬 ▲テツ▼

(72)【発明者】

【氏名】韓 相 勳

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００６−２９６２５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−０７８４９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５８−０１０５１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−２４７９５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−１７０８３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−０６９４９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５２０４３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２１５２３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０１３０９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−３１５９６９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

４００〜８００ＭＰａの高圧で、緑茶及び竹よりなる群から選択された１種以上の植物原材料をプロテアーゼで処理する高圧酵素分解段階を含む化粧料用植物抽出物の製造方法。

【請求項2】

上記高圧が６００ＭＰａであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

上記植物原材料及びプロテアーゼが１００，０００：１〜１００：１の重量比で混合されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。

【請求項4】

上記酵素分解が３０〜６０℃の温度で行われることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。

【請求項5】

上記高圧酵素分解された抽出物を濾過及び希釈する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の植物抽出物の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高圧酵素分解技法（High Pressure-Enzymatic Decomposition Technique；ＨＰＥＤ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を利用した植物抽出物の製造方法及び高圧酵素分解技法で製造された植物抽出物を有効成分として含有する化粧料組成物に関する。本発明による高圧酵素分解技法で製造された植物抽出物は、他の抽出法を利用して製造された抽出物に比べて多様な種類と多量の効能成分を含んでいて、効能成分が有する効果を極大化させることができる。

【背景技術】

【0002】

植物から有効成分を抽出する従来の技法として溶媒抽出法は、水、水を含む有機溶媒（エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート、クロロホルムまたはヘキサンなど）または有機溶媒を入れ、常温で一日間放置して抽出する工程を２回以上繰り返して抽出液を得、抽出液を濾過した後、その濾過液を真空濃縮器で濃縮し、１次収得物を得る。その収得物に水と有機溶媒を加え、常温で２時間以上撹拌した後、静置し、層分離させる。層分離した後、水層を除去し、有機溶媒をさらに添加する。上記工程を２回以上繰り返して充分に洗浄し、濾過した後、濾過物を真空オーブンで乾燥し、所望の抽出物を得る。しかし、このような溶媒抽出法は、抽出収率が低く、有機溶媒の残存有無などの安全性問題があるため、新しい抽出法に対する必要性が提起されている。

【0003】

最近に開発された植物成分抽出法として、超臨界流体抽出法（Supercritical fluid extraction；ＳＦＥ）がある。この抽出法は、超臨界流体（液化二酸化炭素、液化プロパンなど）を使用するので、有機溶媒による副作用がないという長所があるが、高価の費用、臨界温度で多様な物質の抽出可能性有無などの問題点を有している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

これより、本発明は、多様な種類と多量の効能成分を含有する植物成分抽出物を製造することができる抽出法を探すために研究を重ねた結果、高圧酵素分解技法を利用して製造した植物抽出物は、多様な種類と多量の効能成分を含んでいて、抗酸化、美白及び保湿などの効果が極大化されることを知見し、本発明を完成した。

【0005】

したがって、本発明の目的は、高圧酵素分解技法を利用して多様な種類及び多量の効能成分を含む植物抽出物の製造方法及びこの抽出物を有効成分として含有する化粧料組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を達成するために、本発明は、４００〜８００ＭＰａの高圧で原材料を酵素で処理する高圧酵素分解段階を含む植物抽出物の製造方法を提供する。

【0007】

また、本発明は、上記高圧酵素分解技法で製造された植物抽出物を有効成分として含有する化粧料組成物を提供する。

【発明の効果】

【0008】

本発明による高圧酵素分解技法で製造された植物抽出物は、他の抽出法を利用して製造された抽出物に比べて多様な種類と多量の効能成分を含んでいて、効能成分が有する効果を極大化させることができる。

【0009】

本発明によって提供される植物抽出物のうち緑茶抽出物を含有する組成物は、ＤＰＰＨラジカル除去効果及びグルタチオン合成促進効果を示し、抗酸化効果に優れていて、且つメラニン合成を阻害し、チロシナーゼ活性を抑制し、美白効果に優れているので、抗酸化及び美白用化粧料組成物として使用されることができる。また、本発明の方法で抽出した竹抽出物を含有する組成物は、トランスグルタミナーゼ−１合成を促進させて、皮膚障壁強化及び保湿効果に優れていて、且つメラニン合成を阻害し、美白効果に優れているので、皮膚保湿及び美白用化粧料組成物として使用されることができる。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明は、４００〜８００ＭＰａの高圧で原材料を酵素で処理する高圧酵素分解段階を含む植物抽出物の製造方法を提供する。

【0011】

また、本発明は、上記高圧酵素分解技法で製造された植物抽出物を有効成分として含有する化粧料組成物を提供する。

【0012】

以下、本発明をさらに具体的に説明する。
本発明は、高圧及び酵素分解を一緒に利用して植物抽出物を製造することによって、既存の抽出方法では得ることができなかった微量のアミノ酸などの効能成分を抽出することができる。また、効能成分を多量で抽出することができるので、効能成分が有する効果を極大化させることができる。

【0013】

本発明による植物抽出物の製造方法は、４００〜８００ＭＰａの高圧で原材料を酵素で処理する高圧酵素分解段階を含む。また、高圧酵素分解された抽出物を濾過及び希釈する段階さらに含むことができる。

【0014】

以下、本発明の高圧酵素分解技法を使用する植物抽出物の製造方法を段階別に説明する。
１）４００〜８００ＭＰａの高圧で原材料を酵素で処理して高圧酵素分解する段階；
４００〜８００ＭＰａ、好ましくは、６，０００ｍ深さの海中圧力である６００ＭＰａで植物原材料を酵素で混合処理して分解する。４００ＭＰａ未満の圧力では、有効成分が充分に抽出されず、８００ＭＰａ超過圧力では、高圧に比べて有効成分抽出増加量が微弱で、非効率的なので、上記範囲の圧力で酵素分解する。

【0015】

本発明の植物抽出物の製造方法は、当該技術分野において通常のすべての植物の抽出に適用可能である。本発明に使用可能な原材料の具体的な例として、緑茶、竹及び鳩麦よりなる群から選択された１種以上が挙げられる。

【0016】

本発明に使用可能な酵素としては、アミラーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、ラクターゼ、スクラーゼ及びマルターゼよりなる群から選択された１種以上である。

【0017】

また、酵素分解時に、温度は、使用する酵素の活性温度範囲に適合するように調節し、３０〜６０℃に調節することが好ましい。６０℃を超過すれば、大部分の酵素が破壊され、その機能を喪失するので、６０℃以下の温度に調節する。

【0018】

上記原材料と酵素は、１００，０００：１〜１００：１の重量比で混合することが好ましい。これは、１００，０００：１未満なら酵素量が非常に少ないため、有効成分の抽出が良好に行われず、１００：１を超過すれば、投入された酵素量に比べて抽出成分の増加量が微弱で、非効率的である。

【0019】

２）酵素分解された溶液を濾過する段階；
上記１）段階で酵素分解させた溶液を濾過して不純物を除去することによって、所望の酵素分解された植物抽出物原液を得ることができる。本発明において使用可能な濾過方法としては、当該技術分野において通常のすべての方法が使用されることができ、具体的な例として、微細濾過紙を通過させることによって、不純物が除去された植物の酵素分解抽出物原液を得ることができる。

【0020】

３）濾過された溶液を希釈する段階；
上記２）段階で濾過された植物抽出物原液を使用便宜性のために適切な溶媒に希釈する。この時、当該技術分野において通常的に使用されるすべての溶媒が使用されることができ、一般的に水、ブチレングリコールまたはこれらの混合溶媒などを使用して希釈する。

【0021】

本発明は、上記の高圧酵素分解技法で製造された植物抽出物を含有する化粧料組成物を提供する。

【0022】

本発明の高圧酵素分解技法で製造された緑茶抽出物を含有する化粧料組成物は、ＤＰＰＨラジカル除去効果及びグルタチオン合成促進効果を示し、抗酸化効果に優れていて、且つメラニン合成を阻害し、チロシナーゼ活性を抑制し、美白効果に優れているので、皮膚美白及び抗酸化用化粧料組成物として使用されることができる。

【0023】

また、本発明の高圧酵素分解技法で抽出した竹抽出物を含有する化粧料組成物は、トランスグルタミナーゼ−１合成を促進させて、皮膚障壁強化及び保湿効果に優れていて、且つメラニン合成を阻害し、美白効果に優れているので、皮膚保湿、美白及び抗酸化用化粧料組成物として使用されることができる。

【0024】

本発明の植物抽出物は、組成物の全体重量に対して０．０００００１〜１０重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％の量で含有される。その含量が０．０００００１重量％未満ならその効果が微弱で、１０重量％を超過すれば、含量増加に比べて効能の増加が大きくないため、非効率的である。

【0025】

本発明の化粧料組成物は、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、シャンプー、リンス、ボディー洗浄剤、歯磨き粉または口腔清浄液などに剤形化されることができるが、これらに限定されるものではない。

【実施例】

【0026】

以下、実施例及び試験例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。

【0027】

［実施例１］高圧酵素分解技法を使用した緑茶抽出物の製造
６００ＭＰａの圧力及び５０℃の温度で緑茶葉（１００ｇ）にプロテアーゼ（０．１ｇ）を入れて混合し、酵素分解された緑茶抽出物原液を得た。次に、この原液を濾過紙で濾過して不純物を除去し、水：ブチレングリコール（２：１、ｖ／ｖ）の溶媒に１％濃度に希釈させて、緑茶抽出物を製造した。

【0028】

［実施例２］高圧酵素分解技法を使用した竹抽出物の製造
６００ＭＰａの圧力及び５０℃の温度で竹（１００ｇ）にプロテアーゼ（０．１ｇ）を入れて混合し、酵素分解された竹抽出物原液を得た。次に、この原液を濾過紙で濾過して不純物を除去し、水：ブチレングリコール（２：１、ｖ／ｖ）の溶媒に１％濃度に希釈させて竹抽出物を製造した。

【0029】

［比較例１］高圧抽出技法を使用した緑茶抽出物の製造
６００ＭＰａの圧力で緑茶葉（１００ｇ）を高圧抽出させた後、濾過紙で濾過した溶液を水：ブチレングリコール（２：１、ｖ／ｖ）の溶媒に１％濃度に希釈させて緑茶抽出物を製造した。

【0030】

［比較例２］酵素分解技法を使用した緑茶抽出物の製造
５０℃の温度で緑茶葉（１００ｇ）にプロテアーゼ（０．１ｇ）を入れて混合して酵素分解させた後、濾過紙で濾過した溶液を水：ブチレングリコール（２：１、ｖ／ｖ）の溶媒に１％濃度に希釈させて緑茶抽出物を製造した。

【0031】

［比較例３］エタノール抽出法を使用した緑茶抽出物の製造
緑茶葉（１０ｇ）を５０ｖｏｌ％エタノール（１００ｍＬ）に入れて常温で一日間放置して抽出する工程を２回繰り返して抽出液を得、この抽出液を濾過して真空濃縮器で濃縮した後、濃縮物に水とエタノールを加えて常温で２時間撹拌した後、静置し、層分離させた。層分離した後、水層を除去し、エタノールをさらに添加した。このような工程を２回繰り返して充分に洗浄して濾過した後、真空オーブンで乾燥して緑茶抽出物を製造した。

【0032】

［比較例４］エタノール抽出法を使用した竹抽出物の製造
竹（１０ｇ）を５０ｖｏｌ％エタノール（１００ｍＬ）に入れて常温で一日間放置して抽出する工程を２回繰り返して抽出液を得、この抽出液を濾過して真空濃縮器で濃縮した後、濃縮物に水とエタノールを加えて常温で２時間撹拌した後、静置し、層分離させた。層分離した後、水層を除去し、エタノールをさらに添加した。このような工程を２回繰り返して充分に洗浄して濾過した後、真空オーブンで乾燥して竹抽出物を製造した。

【0033】

［試験例１］本発明の高圧酵素分解技法と既存の抽出法を利用した緑茶抽出物のアミノ酸含量比較
下記ＯＰＡ法を利用して上記実施例１及び比較例１〜３の緑茶抽出物のアミノ酸種類別含量を分析した。その結果は下記表１に示した。

【0034】

アミノ酸分析法（ＯＰＡ法）
１）ＨＰＬＣ条件
−カラム：ｚｏｒｂａｘカラム（アミノ酸分析専用）
−移動相：
Ａ＝１．３６ｇ酢酸ナトリウムトリ水和物＋１００μＬトリエチルアミン→５００ｍＬ定容→ｐＨ７．２（酢酸で調節）→ＴＨＦ１．５ｍＬ
Ｂ＝１．３６ｇ酢酸ナトリウムトリ水和物／１００ｍＬＨ₂Ｏ→ｐＨ７．２＋メタノール２００ｍＬ＋ＡＣＮ２００ｍＬ
−流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
−注入：オンライン誘導化（online derivatization＊）のための注入プログラム
−検出器：３３８ｎｍ
−勾配（gradient）：オンラインプログラム＊
２）試薬準備
−アミノ酸標準液：アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、バリンなど試薬各々１０ｍｇ／１００ｍＬ Ｈ₂Ｏ
−ＯＰＡ試薬：ＨＰ社で製造して供給する試薬、保存期限６ヶ月、アンプル形態
−ホウ酸緩衝液（borate buffer）：１００ｍＬ単位供給、アミノ酸発色のために必要

【0035】

【表1】

【0036】

上記表１から分かるように、エタノール抽出法を利用して得た緑茶抽出物（比較例３）のアミノ酸全体含量を１００％にして比較するとき、高圧抽出技法と酵素分解技法で製造された緑茶抽出物（比較例１〜２）は、各々１８４％、１４１％とアミノ酸全体含量が増加したが、本発明の高圧酵素分解技法を利用して得た緑茶抽出物（実施例１）のアミノ酸全体含量は、２７７％と有意に増加した。

【0037】

したがって、本発明の高圧酵素分解技法を利用して抽出した植物抽出物は、既存の他の抽出方法を使用することより多量の効能成分を含有することができた。

【0038】

［試験例２］ＤＰＰＨ（Diphenylpicryl Hyrazyl）ラジカル除去効果
高圧酵素分解技法を使用した植物抽出物の抗酸化効果を測定するために、本発明の高圧酵素分解技法を使用した緑茶抽出物（実施例１）、溶媒抽出法を利用して抽出した緑茶抽出物（比較例３）及び知られた抗酸化効能成分であるバイカリン（Baicalin）を利用してＤＰＰＨラジカルの除去効果を比較した。

【0039】

上記ＤＰＰＨラジカルの除去効果実験は、代表的な抗酸化能測定方法として通用されている方法として、有機ラジカルである１,１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（Diphenylpicryl Hyrazyl；ＤＰＰＨ）の還元によって発生する吸光度の変化を通じて抗酸化能を評価する方法である。ＤＰＰＨの酸化が抑制され、吸光度が対照群に比べて減少する程度を測定し、対照群の吸光度に比べて５０％以下の吸光度を示す濃度（ＩＣ₅₀）を有効抗酸化濃度として評価した。ＩＣ₅₀が低いほどラジカル除去効果が高くて、抗酸化能に優れていることを意味する。

【0040】

実験過程を具体的に説明すれば、１００μＭ（ｉｎエタノール）ＤＰＰＨ溶液１９０μＬと実施例１、比較例３及びバイカリンを各々１０μＬずつ入れて反応液を製造し、３７℃で３０分間反応させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を下記表２に示した。

【0041】

【表2】

【0042】

上記表２から分かるように、本発明の高圧酵素分解技法を使用した緑茶抽出物（実施例１）は、エタノール抽出法を使用した緑茶抽出物バイカリン（比較例３）に比べて約２倍程度抗酸化能に優れていて、代表的な抗酸化剤であるバイカリンと類似の水準の抗酸化能を示していることを確認することができた。

【0043】

［試験例３］グルタチオン合成促進効果実験
高圧酵素分解技法を使用した植物抽出物の抗酸化効果を測定するために、本発明の高圧酵素分解技法を使用した緑茶抽出物（実施例１）、溶媒抽出法を利用して抽出した緑茶抽出物（比較例３）及び知られた抗酸化効能成分である桃金娘(天人花)（Rose Myrtle）を利用してグルタチオン合成促進効果を比較した。ここで、グルタチオンは、身体にある代表的な抗酸化剤であって、活性酸素を抑制する効能を有している。したがって、グルタチオンの合成促進は、活性酸素を抑制することによって、皮膚老化を阻止し、皮膚を元気にすることができる。

【0044】

実験過程を具体的に説明すれば、繊維芽細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり３ｘ１０⁴個ずつ分株した後、３７℃で１２時間培養した。このように準備した細胞に高圧酵素分解技法の緑茶抽出物とエタノール抽出法を使用した緑茶抽出物を２４時間処理した。この時、陽性対照群は、桃金娘を使用した。細胞培養液に０．９％トリトンＸ−１００を加え、３７℃で３０分間反応させた。溶解物（Ｌｙｓａｔｅ）を回収し、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上層液を新しいチューブに移した。上記溶解物の１／１０体積の１Ｍ ２−ビニルピリドンを加えた後、常温で１時間反応させた。この反応は、還元型グルタチオンを除去する段階で還元型グルタチオンを除去しない場合には行わずに、次の段階に移った。溶解物と同一の体積の１０％メタリン酸を加えた後、５分間常温に放置した。１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した後、上層液を回収した。上層液の１／５体積の４Ｍトリエタノールアミンを加えて酸化型／還元型グルタチオン定量用サンプルを準備した。９６ウェルマイクロタイタープレート（microtiter plate）に２−ビニルピリドンを処理したか、または処理しないサンプル５０μＬを入れ、Ｇ酵素混合物（１．２８ｍＵ／μＬグルタチオン還元酵素）５０μＬを入れた後、１００μＬのＧ緩衝溶液混合物（２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２０ｍＭ ＤＴＮＢ、０．４Ｍ ＭＥＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）を入れ、常温で１０分間反応させた後、４０５ｎｍで吸光度を測定した。その結果を各々の試料が付加されない場合の吸光度と比較してグルタチオン合成促進率を計算し、下記表３に示した。

【0045】

【表3】

【0046】

上記表３から分かるように、グルタチオン合成を促進するものと知られた桃金娘（Rose Myrtle)抽出物が１０９％のグルタチオン合成促進率を示したのに対して、高圧酵素分解技法の緑茶抽出物（実施例１）は、同一の濃度で１４８％のグルタチオン合成促進効能を示した。また、本発明の高圧酵素分解技法で抽出した緑茶抽出物は、エタノール抽出法を使用した緑茶抽出物（比較例３）と比較してさらに強いグルタチオン合成促進効果を示すことを確認することができた。

【0047】

［試験例４］メラニン生成抑制実験
高圧酵素分解技法を使用した植物抽出物の皮膚美白効果を測定するために、本発明の高圧酵素分解技法を使用した緑茶及び竹抽出物（実施例１〜２）、溶媒抽出法を利用して抽出した緑茶及び竹抽出物（比較例３〜４）、代表的な美白機能性成分であるコウジ酸を利用してメラニン生成抑制能を比較した。

【0048】

実験過程を具体的に見れば、ヒトメラノマ細胞であるＨＭ３ＫＯ細胞（Y. Funasaka, Department of dermatology, Kobe university school of medicine, 5-1 Kusunoki-cho 7-chrome, Chuo-ku, Kobe 650, Japan）を牛胎児血清が１０％入っているＭＥＭ（Minimum Essential Medium）に入れ、３７℃、５％ＣＯ₂条件の下で培養した。このように培養した細胞を細胞数が各フラスコ当たり３ｘ１０⁵になるように７５フラスコに敷設し、ひと晩細胞が器壁に付くことを待った後、細胞がよく付いたことを確認した後、培地を各々の試験物質が１０ｐｐｍずつ入っている新しい培地に交替した。対照群は、ＤＭＳＯが入っている培地を使用した。このような式で２〜３日に一度ずつ試料が入っている新しい培地に交替しながら細胞がフラスコに一杯になるまで培養した。培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、１Ｎ水酸化ナトリウムで溶解し、５００ｎｍで吸光度を測定した後、下記数式１によってメラニン生成抑制率を計算し、その結果を下記表４に示した。

【0049】

【数1】

【0050】

【表4】

【0051】

上記表４から分かるように、本発明の高圧酵素分解技法を利用して抽出した緑茶抽出物（実施例１）は、コウジ酸に比べて約８０％程度、竹抽出物（実施例２）は、コウジ酸に比べて約６０％程度のメラニン合成阻害能を有することが確認された。一方、エタノール抽出法を利用して抽出した比較例３〜４では、メラニン合成阻害能がないことを確認した。

【0052】

［試験例５］チロシナーゼ 活性抑制効果
高圧酵素分解技法を使用した植物抽出物の皮膚美白効果を測定するために、本発明の高圧酵素分解技法を使用した緑茶抽出物（実施例１）、溶媒抽出法を利用して抽出した緑茶抽出物（比較例３）及び代表的な美白機能性成分であるビタミンＣを利用してチロシナーゼ活性抑制効果を比較した。ビタミンＣは、チロシナーゼ活性を抑制し、皮膚美白に効果的な成分である。

【0053】

上記チロシナーゼ活性阻害効果をバンニなどの方法（A. Vanni, Annali Di Chimica, 80, p35, 1990）を利用して測定した。具体的に、０．１Ｍポタシウムホスフェート緩衝液（ｐＨ６．８）１．０ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬチロシン水溶液１．０ｍＬ、１,２５０ユニット／ｍＬチロシナーゼ（ＳＩＧＭＡＴ−７７５５）０．１ｍＬを混合した後、これに試料溶液を２００ｍｇ／ｍＬ濃度に各々０．２ｍＬずつ添加し、３７℃で１０分間酵素反応を行った。反応溶液の吸光度を４８０ｎｍで測定し、下記数式２によりチロシナーゼ活性抑制率（％）を求め、その結果を下記表５に示した。

【0054】

【数2】

Ａ：試料を添加しない反応溶液の４８０ｎｍで吸光度
Ｂ：試料を添加した反応溶液の４８０ｎｍで吸光度

【0055】

【表5】

【0056】

上記表５から分かるように、エタノール抽出法を利用して抽出した緑茶抽出物（比較例３）がチロシナーゼの活性抑制効果がないが、本発明の高圧酵素分解技法で抽出した緑茶抽出物（実施例１）は、ビタミンＣと類似するか、またはさらに高いチロシナーゼ活性抑制効果を示すことを確認した。

【0057】

［試験例６］トランスグルタミナーゼ−１合成促進効果
高圧酵素分解技法を使用した植物抽出物の皮膚保湿効果を測定するために、本発明の高圧酵素分解技法を使用した竹抽出物（実施例２）、溶媒抽出法を利用して抽出した竹抽出物（比較例４）及び代表的なトランスグルタミナーゼ−１の合成促進成分である塩化カルシウムを利用してトランスグルタミナーゼ−１合成促進効果を比較した。

【0058】

上記トランスグルタミナーゼ−１の合成は、角質層の形成及び維持に必須要素なので、トランスグルタミナーゼ−１の合成促進効果は、皮膚障壁強化及び保湿効果増大として見られる。

【0059】

実験過程を具体的によく見れば、人間の皮膚細胞株を９６孔平板培養器に各孔当たり５ｘ１０⁴個を入れ、２４時間付着させた。付着させた皮膚細胞株に試験物質を処理した後、２日が経過した後、培地を除去し、−２０℃冷蔵庫に保管した。凍結解凍（Freeze-thawing）を２回繰り返して物質処理した細胞を破壊させた後、−２０℃に保管したアセトン：エタノール（１：１、ｖ／ｖ）で処理し、４℃で３０分間放置して細胞を固定させた。その後、室温に放置し、有機溶媒が蒸発されるようにし、ブロッキング（１％牛血清アルブミン）し、トランスグルタミナーゼ抗体（primary antibody）とＨＲＰアンチ−マウス抗体（secondary antibody）でインキュベートし、発色は、ＯＰＤ（o-phennyldiamine）を添加して行った。発現量は、４９０ｎｍで吸光度を測定し、補正は、６３０ｎｍでバックグラウンドを測定して行った。無処理対照群の吸光度値と比較してトランスグルタミナーゼ−１合成促進率を計算し、その結果を下記表６に示した。

【0060】

【表6】

【0061】

上記表６から分かるように、本発明の高圧酵素分解技法を利用して抽出した竹抽出物（実施例２）は、溶媒抽出法で抽出した竹抽出物（比較例４）と異なって、トランスグルタミナーゼ−１の合成促進効果があることを確認した。また、代表的なトランスグルタミナーゼ−１の合成促進成分である塩化カルシウム１．５ｍＭと比較したとき、実施例２を５０ｍｇ／ｍＬで使用する場合、約９５％の効果があることを確認することができた。