特許 5925870 フラボノイド化合物、フラボノイド化合物の製造方法およびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】5925870

(24)【登録日】2016年4月28日

(45)【発行日】2016年5月25日

(54)【発明の名称】フラボノイド化合物、フラボノイド化合物の製造方法およびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤

(51)【国際特許分類】

   C07H 17/07 20060101AFI20160516BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20160516BHJP

   A61K 31/36 20060101ALI20160516BHJP

   A61K 36/70 20060101ALI20160516BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20160516BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160516BHJP

   A61P 39/06 20060101ALN20160516BHJP

【ＦＩ】

   C07H17/07CSP

   A61K31/7048

   A61K31/36

   A61K36/70

   A61P3/06

   A61P43/00 111

   !A61P39/06

【請求項の数】6

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2014-250522(P2014-250522)

(22)【出願日】2014年12月11日

【審査請求日】2015年2月5日

(73)【特許権者】

【識別番号】593006836

【氏名又は名称】寿スピリッツ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100080001

【弁理士】

【氏名又は名称】筒井 大和

(74)【代理人】

【識別番号】100093023

【弁理士】

【氏名又は名称】小塚 善高

(74)【代理人】

【識別番号】100117008

【弁理士】

【氏名又は名称】筒井 章子

(72)【発明者】

【氏名】木村 英人

(72)【発明者】

【氏名】▲徳▼山 翔太

(72)【発明者】

【氏名】石原 朋恵

(72)【発明者】

【氏名】小川 智史

(72)【発明者】

【氏名】横田 一成

【審査官】 三上 晶子

(56)【参考文献】

【文献】 HEO,B. et al，Anticancer and antioxidant effects of extracts from different parts of indigo plant，Industrial Crops and Products，２０１４年 ３月，Vol.56，pp.9-16

【文献】 HEO,B. et al，Partial characterization of indigo (Polygonum tinctorium Ait.) plant seeds and leaves，Industrial Crops and Products，２０１３年，Vol.42，pp.429-439

【文献】 KIM,K. et al，Assessment of Indigo (Polygonum tinctorium Ait.) water extracts' bioactive compounds, and their antioxidant and antiproliferative activities，LWT Food Science and Technology，２０１２年，Vol.46, No.2，pp.500-510

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｈ １／００− ９９／００

Ａ６１Ｋ ３１／３３− ３３／４４

Ａ６１Ｋ ３６／００− ３６／９０６８

Ａ６１Ｐ １／００− ４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（化学式１）に示す化学構造体を有するフラボノイド化合物。

【化1】

【請求項2】

（化学式２）に示す化学構造体を有するフラボノイド化合物。

【化2】

【請求項3】

（化学式３）に示す化学構造体を有するフラボノイド化合物。

【化3】

【請求項4】

タデアイ（Polygonum tinctorium Lour.）の葉を、搾汁する、または、水、アルコール、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、またはクロロホルムで抽出することにより得られるフラボノイド化合物であって、（化学式１）、（化学式２）および（化学式３）のいずれかに示す化学構造体を有するフラボノイド化合物の製造方法。

【化1】

【化2】

【化3】

【請求項5】

請求項４に記載のフラボノイド化合物において、
前記搾汁により得られた搾汁液、または、前記抽出により得られた抽出液を、溶出し、精製することにより得られ、
前記溶出は、カラムを用いたアルコール溶出であり、
前記精製は、逆相カラムを用いて行われる、フラボノイド化合物の製造方法。

【請求項6】

（化学式１）、（化学式２）、（化学式３）、（化学式４）および（化学式５）のいずれかに示す化学構造体を有するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤。

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フラボノイド化合物およびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、抗酸化剤に関し、特に、タデアイを利用して得られたフラボノイド化合物およびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、抗酸化剤に関するものである。

【背景技術】

【0002】

タデアイは、東南アジア原産の一年生植物で、古くから藍染めの染料原料として用いられてきた。また、タデアイは古くから薬用植物として、解毒、解熱、消炎などの目的で利用されていた（非特許文献２参照）。また、日本の一部の地方では、タデアイはタデ酢などの食品原料としても利用されている。タデアイの成分の機能性については、抗癌作用（非特許文献２〜４参照）、抗炎症作用（非特許文献５参照）、抗酸化作用（非特許文献４、６参照）、抗アレルギー作用（非特許文献７参照）、抗菌作用（非特許文献８参照）、抗血液凝固作用（非特許文献１参照）などの様々な報告がある。

【0003】

また、タデアイの機能性を示すポリフェノール成分として、没食子酸〔gallic acid〕、ケンペロール〔kaempferol〕、カフェイン酸〔caffeic acid〕、6-メトキシケンペロール〔6-methoxykaempferol〕、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone〕、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-β-D-グルコピラノシド〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone-3-O-β-D-glucopyranoside〕などが確認されている（非特許文献２参照）。

【0004】

なお、非特許文献９は、タデアイの葉茎からポリフェノール類を抽出し、精製した本発明者の報告である。また、非特許文献１０は、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基〔3-hydroxy-3-methylglutaryl基〕が結合している炭素原子のシグナルについての報告である。また、非特許文献１１は、ルチンの性質についての報告である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Kohda, H., Niwa, A., Nakamoto, Y. and Takeda, O., Flavonoid glucosides from Polygonum tintorium. Chem. Pharm. Bull. 38, 523-524（1990）.

【非特許文献2】Iwaki,K. and Kurimoto, M., Cancer preventive effects of the indigo plant, Polygonum tinctorium. Recent Res. Devel. Cancer, 4, 429-437 （2002）.

【非特許文献3】Koya-Miyata, S., Kimoto, T., Micallef MJ., Hino, K., Taniguchi, M., Ushio, S., Iwaki, K., Ikeda, M. and Kurimoto, M., Preventioon of azoxymethane-induced intestianal tumors by a crude ethyl acetate-extract and tryptanthrin extracted from Polygonum tinctorium Lour., Anticancer Res.,21, 3295-3300 （2001）.

【非特許文献4】Jang, H.G., Heo, B.G., Park, Y.S., Namiesnik ,J., Barasch, D., Katrich, E., Vearasilp, K., Trakhtenberg, S. and Gorinstein S., Chemical composition, antioxidant and anticancer effects of the seeds and leaves of indigo （Polygonum tinctorium Ait.） plant. Appl Biochem Biotechnol. 167,1986-2004（2012）.

【非特許文献5】Micallef, M.J., Iwaki, K., Ishihara, T., Ushio, S., Aga, M., Kunikata, T., Koya-Miyata, S., Kimoto, T., Ikeda, M., Hino, K. and Kurimoto, M., The natural plant product tryptanthrin ameliorates dextran sodium sulfate- induced colitis in mice. Int.Immunopharmacol. 2, 565- 578 （2002）.

【非特許文献6】Kimoto, T., Koya, S., Hino, K., Yamamoto, Y., Aga, H.,Hashimoto, T., Masaki, N., Hanaya, T., Micallef, MJ., Iwaki, K., Ishihara, T., Ushio, S., Aga, M., Kunikata, T.,Arai, S., Ikeda, M., Fukuda, S. and Kurimoto, M., Protection by Indigo plant （Polygonum tinctorium Lour.） ageinst renal oxidative damage in mice treated with ferric nitrilotriacetate., Natural Medicines., 53, 291-296 （1999）.

【非特許文献7】Kunikata, T., Takefuji, T., Aga, H., Iwaki, K., Ikeda, M. and Kurimoto, M., Indirbin inhibits inflammatory reactions in delayed-type hypersensitivity. Eur. J. Pharmacol. 410, 93-100 （2000）.

【非特許文献8】Hashimoto, T., Aga, H., Chaen, H.: Fukuda, S. and Kurimoto, M., Isolation and identification of anti- helicobacter pyrori compounds from Polygonum tinctorium Lour. Natural Medicines., 53, 27-31 (1999).

【非特許文献9】Kimura, H., Ishihara, T., Michida, M., Ogawa, S., Akihiro, T. and Yokota, K., Identification and quantitative analysis of polyphenolic compounds from indigo plant （Polygonum tinctorium Lour）., Nat. prod. Res. 7, 492-495 （2014）.

【非特許文献10】Wang, S-S., Zhang, X-J., Que, S., Tu, G-Z., Wan, D., Cheng, W., Liang, H., Ye, J., and Zang, Q-Y., 3-hydroxy-3-methylglutaryl flavonol glycosides from Oxytropis falcata. J. Nat. Prod., 75, 1359-1364（2012）.

【非特許文献11】Fale, P.L., Ferreira, C., Maruzzella, F., Helena Florencio, M., Frazao, F.N., and Serralheiro, M.L., Evaluation of cholesterol absorption and biosynthesis by decoctions of Annona cherimola leaves. J. Ethnopharmacol., 150, 718-723 （2013）.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明者は、上記のタデアイの有効成分に関する研究開発に従事しており、例えば、タデアイの葉茎からポリフェノール類を抽出、精製し、カフェイン酸〔caffeic acid〕、クロロゲン酸〔chlorogenic acid〕、ケンペロール〔keampferol〕、ケルセチン〔quercetin〕、ケルセチン-3-O-グルクロニド〔quercetin-3-O-glucronide〕などの検出に成功している（非特許文献９参照）。なお、成分分析には、超高速液体クロマトグラフ質量分析計およびガスクロマトグラフ質量分析計を用いた。

【0007】

しかしながら、タデアイ抽出物には、多くの有機化合物が含まれており、未だ化学構造が不明の物質が数多くある。このような物質は、薬用植物として利用されてきたタデアイの機能と深く関係するものであり、その解明が望まれる。

【0008】

そこで、本発明者は、上記のタデアイの有効成分に関し、鋭意研究を重ね、タデアイ中に含まれている新規物質を含むフラボノイド化合物を確認し、その機能や有効性の検証を重ねた。

【0009】

本発明の目的は、新規フラボノイド化合物（以下の（化学式１）（化学式２）（化学式３）参照）を提供することにある。また、既知物質（以下の（化学式４）（化学式５）参照）を含むフラボノイド化合物（以下の（化学式１）−（化学式５）参照）のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、抗酸化剤としての新たな用途を提供することにある。

【0010】

その他の課題と新規な特徴は、本明細書の記述および添付図面から明らかになるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本願において開示される実施の形態のうち、代表的なものの概要を簡単に説明すれば、次のとおりである。

【0012】

本願において開示される一実施の形態に示されるフラボノイド化合物は、以下の（化学式１）に示す化学構造体を有する。

【0013】

【化1】

本願において開示される一実施の形態に示されるフラボノイド化合物は、以下の（化学式２）に示す化学構造体を有する。

【0014】

【化2】

本願において開示される一実施の形態に示されるフラボノイド化合物は、以下の（化学式３）に示す化学構造体を有する。

【0015】

【化3】

本願において開示される一実施の形態に示されるフラボノイド化合物は、タデアイ（Polygonum tinctorium Lour.）の葉を、搾汁する、または、水、アルコール、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、またはクロロホルムで抽出することにより得られるフラボノイド化合物であって、上記（化学式１）、上記（化学式２）および上記（化学式３）のいずれかに示す化学構造体を有する。

【0016】

例えば、上記フラボノイド化合物は、前記搾汁により得られた搾汁液、または、前記抽出により得られた抽出液を、溶出し、精製することにより得られ、前記溶出は、カラムを用いたアルコール溶出であり、前記精製は、逆相カラムを用いて行われる。ここで、溶出とは、タデアイの有効成分を溶媒に溶かし出すことをいい、精製は、タデアイの有効成分以外の成分を含む溶出液から有効成分の濃度を向上させることをいう。

【0017】

本願において開示される一実施の形態に示されるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、または、抗酸化剤は、上記（化学式１）、上記（化学式２）、上記（化学式３）、以下の（化学式４）および以下の（化学式５）のいずれかに示す化学構造体を有する。

【0018】

【化4】

【0019】

【化5】

【発明の効果】

【0020】

本発明者により初めて見出されたフラボノイド化合物（上記の（化学式１）（化学式２）（化学式３）参照）は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害作用、抗酸化作用という有用な機能を有する。また、既知物質（以下の（化学式４）（化学式５）参照）を含み、これらのフラボノイド化合物（以下の（化学式１）−（化学式５）参照）は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、抗酸化剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1A】タデアイのダイヤイオンＨＰ−２０カラムでのメタノール溶出フラクションを超高速液体クロマトグラフ-質量分析計で分析した結果を示すチャートである。

【図1B】タデアイのダイヤイオンＨＰ−２０カラムでのメタノール溶出フラクションの酸加水分解物を超高速液体クロマトグラフ-質量分析計で分析した結果を示すチャートである。

【図2A】成分１のハイレゾリューションモードでの超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析結果を示す図である。

【図2B】成分１のハイレゾリューションモードでの超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

（実施の形態１）
（実施例１）
（１．実験材料）
タデアイ（Polygonum tinctorium Lour.）の種子は、タキイ種苗（株）（京都）から購入し、栽培したものを用いた（標本番号14001）。ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）用のアセトニトリルと、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素アッセイキット〔HMG-CoA reductase assay kit〕は、シグマ社（Sigma，セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）から得た。N,O-ビス（トリメチルシリル）アセトアミド〔N,O-Bis（trimethylsilyl） acetamide〕と、N-トリメチルシリルイミダゾール（TMSI）-C〔N-trimethylsilylimidazole（TMSI）-C〕は、ジーエルサイエンス（東京）のものを使用した。3-ヒドロキシ-3-メチルグルタル酸〔3-hydroxy-3-methylglutaric acid〕、ロバスタチン〔lovastatin〕、ルチン〔rutin〕およびその他の試薬は和光純薬（大阪）から購入した。

【0023】

（２．実験機器）
ＮＭＲ（核磁気共鳴；Nuclear Magnetic Resonance）スペクトルは、ＪＥＯＬ社（東京）のＪＮＭ Ａ４００ ＦＴ−４００ＦＴ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）を使用した。２次元ＮＭＲのＨＭＢＣ〔Heteronuclear Multiple Bond Correlation spectroscopy〕分析は、日立化成テクノサービス（株）に依頼し、Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ社（神奈川）のＡＶ４００Ｍ（４００ＭＨｚ）を用いて測定した。赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲ〔Attenuated Total Reflection-Fourier Transform-Infrared Spectorophotometer〕）の分析には、島津製作所（京都）の ＭＩＲａｃｌｅ１０ （ＡＴＲ）を接続したＩＲ Ａｆｆｉｎｉｔｙ−１を使用した。紫外吸収スペクトルの分析には、日本分光（東京）のＶ−５３０を使用した。融点測定には、（株）ヤナコ機器開発研究所（京都）のモデルＭＰ−Ｓ３を使用した。超高速液体クロマトグラフ-質量分析（ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳ^Ｅ）には、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ミルフォード、マサチューセッツ州、アメリカ）のＡＣＱＵＩＴＹ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＰＬＣ）システムとＳＹＮＡＰＴ Ｇ２ ＨＤＭＳ システムを使用した。高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ、逆相クロマトグラフィー）による分析には、島津製作所（京都）のＬＣ−２０１０ＡとクロマトパックＣ−Ｒ８Ａを使用した。ここで、逆相クロマトグラフィーはＨＰＬＣの一般的な方法である。ＨＰＬＣでの分離（精製）は、移動相と固定相の極性に差が必要である。移動相の極性が低く、固定相の極性が高い場合は順相クロマトグラフィーと呼ばれ、逆に移動相の極性が高く、固定相の極性が低い場合を逆相クロマトグラフィーと呼ばれる。

【0024】

ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）には、島津製作所（京都）製の２００８年版のＮＩＳＴライブラリがインストールされたガスクロマトグラフ質量分析計用ワークステーションであるＧＣＭＳｓｏｌｕｔｉｏｎを接続した質量分析計ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０を使用した。ＧＣキャピラリーカラムは、ＲＥＳＴＥＫ（ベルフォント〔Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ〕、ペンシルベニア州、アメリカ）製のＲｔｘ−５ＭＳ（内径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ，膜厚０．２５μｍ）を使用した。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性試験に使用したマイクロプレートリーダーは、サーモフィッシャーサイエンティフィック〔Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．（神奈川）〕のＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯである。親水性酸素ラジカル吸収能（Ｈ−ＯＲＡＣ）法による抗酸化活性の測定に使用した蛍光マイクロプレートリーダーは、ＴＥＣＡＮ（川崎）製のｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ ２００を用いた。

【0025】

（３．抽出と精製）
タデアイの葉を、８０％のメタノールで抽出した。具体的には、タデアイの葉を細かく刻み、８０％のメタノールを加え攪拌した後、濾過し、溶媒を減圧留去し、抽出物を得た。抽出物を３０％メタノールに溶解してカラムに供した。具体的には、抽出物に３０％のメタノールを添加し、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム（三菱化学製，東京）に通して溶出した。この後、５０％のメタノール、７０％のメタノール、１００％のメタノールを用いて、同様に溶出したところ、本実施例に係る物質は、主に１００％のメタノールを用いた溶出フラクションに回収されることが判明した。

【0026】

次いで、１００％のメタノールを用いた溶出フラクションを、クロマトレックスＯＤＳ１０２４Ｔカラム（富士シリシア化学、春日井、逆相カラム）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、個々の成分を精製した。

【0027】

ＨＰＬＣは、島津製作所（京都）のＬＣ−２０１０ＡとクロマトパックＣ−Ｒ８Ａを用いた。カラム（逆相カラム、逆相のオクタデシルシリカ（ODS）カラム）は、ワイエムシィ（ＹＭＣ（京都））のＯＤＳ−ＡＭ（１５０×６．０ｍｍｉ．ｄ．，粒径３μｍ）を用いた。カラム温度は４０℃、流速は１．０ｍｌ／分に設定した。移動相は、０．１％のギ酸とアセトニトリルとの７５：２５（ｖ／ｖ）の混合溶液を用いて溶出した。検出は、３４０ｎｍの吸収をモニターした。

【0028】

（４．目的物質の構造決定）
（４．１）超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析
超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析カラムは、ウォーターズのＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８（１００×２．１ｍｍｉ．ｄ．，粒径１．７μｍ）を使用した。カラム温度は４０℃、流速は０．３ｍｌ／分、検出は、フォトダイオードアレイ検出器〔ＰＤＡ ｄｅｔｅｃｔｏｒ〕を用いて３４０ｎｍで行った。移動相は、０．１％のギ酸とアセトニトリルとの混合溶液を用い、１０分で、ギ酸：アセトニトリル比を、９０：１０（ｖ／ｖ）から５０：５０（ｖ／ｖ）まで直線的に変化させた状態で溶出した。即ち、直線的濃度勾配法を用いて溶出した。質量分析（ＭＳ^Ｅ）は、負イオンモード〔negative mode〕で測定し、以下の条件で行った。測定感度は、センシティブモード〔sensitive mode〕あるいはハイレゾリューションモード〔high resolution mode〕で測定した。
電圧：キャピラリー…２．５ｋＶ、サンプリングコーン…５０Ｖ、エクストラクションコーン…４．０Ｖ
温度：ソース…１５０℃、デソルベイション…５００℃
ガス流速：コーンガス…５０Ｌ／時、デソルベイションガス…１０００Ｌ／時
スキャンタイム：０．５秒
コリジョンエネルギー：
ファンクション１、［低エネルギー］
トラップコリジョンエネルギー…ＯＮ、６Ｖ
トランスファーコリジョンエネルギー…ＯＦＦ
ファンクション２、［高エネルギー］
ランプトラップコリジョンエネルギー…ＯＮ、６−４５Ｖ
トランスファーコリジョンエネルギー…ＯＦＦ

【0029】

（４．２）アルカリ分解
各成分（成分１、成分２、成分３）の各１．０ｍｇを、５０％メタノール（１ｍｌ）に溶解し、２０％の水酸化カリウム水溶液（１ｍｌ）を加え、１晩、室温にて反応させた。塩酸で中和後、Ｇｒａｃｅ（コロンビア、メリーランド州、アメリカ）製のオルテックＣ１８マキシクリーンカートリッジカラム〔Alltec C18 Maxiclean cartridgeカラム〕に注入後、２０％メタノール５ｍｌで溶出後（２０％メタノール溶出フラクション）、１００％のメタノール５ｍｌで溶出した。このメタノール溶出フラクションを、前述の（４．１）の欄で説明した超高速液体クロマトグラフ-質量分析計により分析した。また、２０％メタノール溶出フラクションは、減圧乾固した後、１晩、真空デシケーターで乾燥させた。このサンプルをジメチルスルホキシド０．３ｍｌに溶解し、N,O-ビス（トリメチルシリル）アセトアミド〔N,O-Bis（trimethylsilyl） acetamide〕と、N-トリメチルシリルイミダゾール（TMSI）-C〔N-trimethylsilylimidazole（TMSI）-C）〕とを各１００μｌ加えて、７０℃で、１時間反応させた後、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）にて分析した。分析条件は、以下の通りである。
カラム：Ｒｔｘ−５ＭＳ（内径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍ）
カラム温度：１５０℃から２５０℃まで（５℃／分）
キャリアガス：ヘリウム、全流量５８．１ｍｌ／分、カラム流量１．０８ｍｌ／分
インジェクター温度：２５０℃
イオン源温度：２００℃
インターフェイス温度：２５０℃
スプリット比１：５０

【0030】

（４．３）酸分解
タデアイの８０％メタノール抽出物を、ダイヤイオンＨＰ−２０カラムにかけ１００％メタノールで溶出したフラクション１．０ｍｇを、１００％のメタノール（１ｍｌ）に溶解し、２．４Ｍの塩酸水溶液（１ｍｌ）を加え、９０℃で２時間、加熱還流を行った。反応後、５ｍｌの蒸留水を加えた後、オルテックＣ１８マキシクリーンカートリッジカラムに注入し、２０％メタノール５ｍｌで洗浄後、メタノール５ｍｌで溶出した。このサンプルを前述の（４．１）の欄で説明した超高速液体クロマトグラフ-質量分析計（ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳ^Ｅ）により分析した。

【0031】

成分３の糖部を分析するために、同様に酸分解を行った。成分３（１．０ｍｇ）を、１００％のメタノール（１ｍｌ）に溶解し、２．４Ｍの塩酸水溶液（１ｍｌ）を加え、９０℃で２時間、加熱還流を行った。反応後、５ｍｌの蒸留水を加えた後、オルテックＣ１８マキシクリーンカートリッジカラムに注入し、２０％メタノール５ｍｌで溶出し、メタノール５ｍｌで溶出した。注入液と、２０％メタノールで溶出した液を、炭酸カリウムで中和後、ロータリーエバポレーターで減圧乾固し、１晩、真空デシケーターで乾燥させた。このサンプルをジメチルスルホキシド０．３ｍｌに溶解し、N,O-ビス（トリメチルシリル）アセトアミド〔N,O-Bis（trimethylsilyl） acetamide〕と、N-トリメチルシリルイミダゾール（TMSI）-C〔N-trimethylsilylimidazole（TMSI）-C）〕とを各１００μｌ加えて、７０℃で、１時間反応させた後、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）にて分析した。分析条件は、以下の通りである。
カラム：Ｒｔｘ−５ＭＳ（内径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍ）
カラム温度：１５０℃から３００℃まで（５℃／分）
キャリアガス：ヘリウム、全流量５８．１ｍｌ／分、カラム流量１．０８ｍｌ／分
インジェクター温度：２５０℃
イオン源温度：２００℃
インターフェイス温度：２５０℃
スプリット比１：５０

【0032】

（４．４）構造決定
タデアイの８０％メタノール抽出物を、ダイヤイオンＨＰ−２０カラムにかけて１００％メタノール溶出フラクションを回収し、超高速液体クロマトグラフ-質量分析計で分析した。その結果を、表１および図１Ａ、図１Ｂに示す。図１Ａおよび図１Ｂの横軸は、保持時間（分）であり、縦軸は、ＡＵ（任意単位）である。図１Ａは、上記フラクションの分析結果であり、図１Ｂは、上記フラクションを加水分解したものの分析結果である。

【0033】

図１Ａに示すように、５つのピーク（成分１−成分５）が確認され、これらの成分（化合物）が、このフラクションに回収されたことが分かった。このフラクションを、塩酸を用いて酸加水分解し、超高速液体クロマトグラフ-質量分析計にかけたところ、図１Ｂに示すように、成分１−成分４のピーク位置は成分５のピーク位置にシフトした。この結果から、成分１−成分４は、成分５をアグリコンとして有することが明らかとなった。表１に、成分１−成分５の保持時間（分）と、同定した物質名と、分子イオンおよびフラグメントイオンのｍ／ｚ（ｍ／ｚ値ともいう）とをまとめた。

【0034】

【表1】

成分５の融点は、３００℃以上（＞３００℃）であり、カーボン核磁気共鳴スペクトル（^１３Ｃ−ＮＭＲ）、プロトン核磁気共鳴スペクトル（^１Ｈ−ＮＭＲ）、紫外吸収スペクトル（ＵＶ）、赤外吸収スペクトル（ＩＲ）、質量分析（ＭＳ）の結果が、前記の非特許文献１と一致した。これにより、成分５は、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone〕と同定した。

【0035】

成分４の融点は、２９７℃であり、カーボン核磁気共鳴スペクトル（^１３Ｃ−ＮＭＲ）、プロトン核磁気共鳴スペクトル（^１Ｈ−ＮＭＲ）、紫外吸収スペクトル（ＵＶ）、赤外吸収スペクトル（ＩＲ）、質量分析（ＭＳ）の結果が、前述の非特許文献１と一致した。これにより、成分４は、3,5,4’-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-β-D-グルコピラノシド〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone-3-O-β-D- glucopyranoside〕と同定した。

【0036】

成分１は、ハイレゾリューションモード〔high resolution mode〕での超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析で、分子イオンピークｍ／ｚは、６１９．１２７３［Ｍ−Ｈ］⁻（計算値６１９．１２９７）であった。赤外吸収スペクトルの分析結果は、成分４と酷似していた。

【0037】

図２Ａおよび図２Ｂに、成分１のハイレゾリューションモード〔high resolution mode〕での超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析結果を示す。図２Ａは、低エネルギー（６Ｖ）の場合の結果であり、図２Ｂは、高エネルギー（４５Ｖ）の場合の結果である。横軸は、ｍ／ｚ、縦軸は、相対強度である。図２Ａに示すように、低エネルギー（６Ｖ）で測定することにより、分子をなるべく壊さず、分子イオンピークが明確に判別できる。この結果、分子イオンピークｍ／ｚは、６１９．１２７３［Ｍ−Ｈ］⁻（計算値６１９．１２９７）であった。図２Ｂに示すように、フラグメントイオンとして、ｍ／ｚが４７５．０８５２の[（Ｍ−Ｈ）-3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル]⁻〔［(M-H)-3-hydroxy-3-methylglutaryl］⁻〕を検出した。3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルを以下にＨＭＧとして示す。また、ｍ／ｚが３１３．０３６１の[（Ｍ−Ｈ）−ＨＭＧ−グルコース]⁻〔[（Ｍ−Ｈ）−ＨＭＧ−glucose]⁻〕を検出した。

【0038】

また、グルコースに結合しているアシル基を分析する目的で、成分１を前述の（４．２）の欄で説明したアルカリ分解して中和した後、オルテックＣ１８マキシクリーンカートリッジカラム〔Alltec C18 Maxiclean cartridgeカラム〕での２０％メタノール溶出フラクションを、トリメチルシリル化〔trimethylsilyl化〕して、ガスクロマトグラフ質量分析計で分析したところ、試薬の3-ヒドロキシ-3-メチルグルタル酸〔3-hydroxy-3-methylglutaric acid〕とリテンションタイム（７．９分）およびＭＳスペクトルが一致した。

【0039】

さらに、オルテックＣ１８マキシクリーンカートリッジカラム〔Alltec C18 Maxiclean cartridgeカラム〕での１００％メタノール溶出区を、超高速液体クロマトグラフ-質量分析で分析したところ、成分４と同じリテンションタイムを示し、分子イオンピークｍ／ｚが、４７５．０８［Ｍ−Ｈ］⁻となり、アグリコンのｍ／ｚである３１３．０３を検出した。この結果から、成分１は、成分４に3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基〔3-hydroxy-3-methylglutaryl基〕が結合した物質であることが明らかとなった。^１３Ｃ−ＮＭＲ、^１Ｈ−ＮＭＲの結果は、表２、表３に示すとおりである。

【0040】

【表2】

【0041】

【表3】

^１３Ｃ−ＮＭＲのＤＥＰＴ〔Distortionless Enhancement by Polarization Transfer〕１３５による分析で、アグリコンのメチレン基（−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−）を示す「δ１０２．８」、グルコースのＣ６’’位のメチレン基を示す「δ６３．１」、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基〔3-hydroxy-3-methylglutaryl基〕のＣ２’’’とＣ４’’’のメチレン基を示す「δ４５．１と４５．２」のシグナルが検出された。

【0042】

２次元ＮＭＲのＨＭＢＣによる分析でグルコースのＣ６’’のプロトンと3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基〔3-hydroxy-3-methylglutaryl基〕のＣ１’’’とに相関が見られるとから、グルコースの６位に3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基が結合していることが明らかとなった。

【0043】

また、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基が結合している炭素原子のシグナルは、２−３ｐｐｍ低磁場側にシフトするとの報告がある（非特許文献１０参照）。今回の分析結果でも、成分４のグルコースのＣ６’’の「δ６０．８」が、成分１では3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基が結合したことにより、「δ６３．１」にシフトした。このことから、成分１は、3,5,4’-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル)-β-D-グルコピラノシド]〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone-3-O-[6''-3-hydroxy-3-methylglutaryl）-β-D-glucopyranodside〕と同定した。

【0044】

成分２のハイレゾリューションモード〔high resolution mode〕での超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析で、分子イオンピークｍ／ｚは、５１７．０９９４［Ｍ−Ｈ］⁻（計算値５１７．０９８０）であった。フラグメントイオンとして、アセチル基が脱離したｍ／ｚが４７５．０８の［（Ｍ−Ｈ）-アセチル］⁻（［(M-H)-acetyl］⁻）、アグリコンのｍ／ｚが３１３．０の［（Ｍ−Ｈ）-アセチル-グルコース］⁻〔［(M-H)-acetyl-glucose］⁻〕を検出した。

【0045】

成分２を前述の（４．２）の欄で説明したアルカリ分解して中和した後、超高速液体クロマトグラフ-質量分析計により分析したところ、このアルカリ分解物は、成分４であることが確認された。

【0046】

^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析で、アセチル基を示すシグナル（Ｃ１’’’「δ１７０．０」、Ｃ２’’’「δ２０．０」）と、^１Ｈ−ＮＭＲによる分析でのシグナル（Ｃ２’’’−Ｈ「δ１．７５ｓ」）が検出された。

【0047】

２次元ＮＭＲのＨＭＢＣによる分析でグルコースのＣ６’’のプロトンとアセチル基のＣ１’’’に相関が見られるとから、グルコースの６位にアセチル基が結合していることが明らかとなった。以上の結果から、成分２は、3,5,4’-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(アセチル)-β-D-グルコピラノシド]〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone-3-O-[6''-（acetyl）-β-D-glucopyranoside〕と同定した。

【0048】

成分３のハイレゾリューションモード〔high resolution mode〕での超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析で、分子イオンピークｍ／ｚは、５３１．０７７４［Ｍ−Ｈ］⁻（計算値５３１．０７７５）であった。

【0049】

成分３を前述の（４．２）の欄で説明したアルカリ分解して中和した後、超高速液体クロマトグラフ-質量分析計により分析したところ、分子イオンピークはｍ／ｚが４８９．０７［Ｍ−Ｈ］⁻となり、ｍ／ｚが３１３．０３の[Ｍ-グルクロン酸］⁻〔［M-glucuronic acid]⁻〕を検出した。

【0050】

また、成分３を、前述の（４．３）の欄で説明した酸分解して、トリメチルシリル化〔trimethylsilyl化〕して、ガスクロマトグラフ質量分析計で分析したところ、リテンションタイム１５．９のピークが確認された。ＮＩＳＴライブラリとの照合により、酸分解物は、グルクロン酸と推定された。さらに、試薬のグルクロン酸をトリメチルシリル化〔trimethylsilyl化〕して、同様の条件で分析したところ、リテンションタイムは１５．９であった。これにより、成分３のアグリコンにグルクロン酸が結合していることが明らかとなった。

【0051】

^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析で、アセチル基を示すシグナル（Ｃ１’’’「δ１６９．９」、Ｃ２’’’「δ２０．９」）と、^１Ｈ−ＮＭＲによる分析でのシグナル（Ｃ２’’’−Ｈ「δ２．００ｓ」）が検出された。

【0052】

２次元ＮＭＲのＨＭＢＣによる分析で、Ｃ１’’のアノメリックプロトン（δ５．５６）とＣ３（δ１３３．０）に相関が見られたことにより、グルクロン酸はＣ１’’位でアグリコンのＣ３位に結合していることが明らかとなった。また、アセチル基は、グルクロン酸のＣ２’’のプロトン（δ４．７６）とアセチル基のＣ１’’’（δ１６９．９）に相関が見られ、アセチル基のＣ２’’’のプロトン（δ２．００）とＣ２’’のカーボン（δ７４．０）に相関が見られたことにより、グルクロン酸のＣ２’’に結合していることが明らかとなった。以上の結果より、成分３は3,5,4’-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[2''-(アセチル)-β-D-グルクロニド]〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone-3-O-[2''-（acetyl）-β-D-glucronide]〕と同定した。

【0053】

（機器分析データ）
以下に、成分１−成分５の機器分析データを示す。

【0054】

（成分１）3,5,4’-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル)-β-D-グルコピラノシド]について
結晶：黄色アルモファス結晶、
融点（ｍｐ）：２０８−２１０℃、
紫外吸収スペクトル（ＵＶ）λｍａｘ（メタノール溶媒）：３３９，２７９，２４０ｓｈ，２１８ｎｍ、
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）νｍａｘ：３３００，２９２４，１７１７，１６８０，１６１０，１５５６，１４８１，１３４４，１２７１，１２２４，１１８２，１０６２，１０１４ｃｍ^−１、
^１３Ｃ−ＮＭＲと^１Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシドｄ６溶液）のデータ：表２、表３に示すとおり。
超高速液体クロマトグラフ-質量分析計での分析データ：表１に示すとおり。
成分１の構造：以下の（化学式１）で示すとおり。

【0055】

【化1】

（成分２）3,5,4’-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(アセチル)-β-D-グルコピラノシド]について
結晶：淡黄色アルモファス結晶、
融点（ｍｐ）：２１８−２２０℃、
紫外吸収スペクトル（ＵＶ）λｍａｘ（メタノール溶媒）：３４０，２７８，２４０ｓｈ ｎｍ
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）νｍａｘ：３３１２，２９０８，１７２８，１６８１，１６１０，１５５３，１４７２，１３４４，１２６９，１２２７，１１７９，１０５８，１００９ｃｍ^−１、
^１３Ｃ−ＮＭＲと^１Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシドｄ６溶液）のデータ：表２、表３に示すとおり。
超高速液体クロマトグラフ-質量分析計での分析データ：表１に示すとおり。
成分２の構造：以下の（化学式２）で示すとおり。

【0056】

【化2】

（成分３）3,5,4’-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[2''-(アセチル)-β-D-グルクロニド]について
結晶：黄色アルモファス結晶、
紫外吸収スペクトル（ＵＶ）λｍａｘ（メタノール溶媒）：３４３，２７４，２４０ｓｈ ｎｍ、
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）νｍａｘ：３３５６，２９２０，１７３２，１６８２，１６１１，１５６２，１４７１，１３４８，１２２３，１１８０，１０２８ｃｍ^−１、
^１３Ｃ−ＮＭＲと^１Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシドｄ６溶液）のデータ：表２、表３に示すとおり。
超高速液体クロマトグラフ-質量分析計での分析データ：表１に示すとおり。
成分３の構造：以下の（化学式３）で示すとおり。

【0057】

【化3】

（成分４）3,5,4’-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-β-D-グルコピラノシドについて
結晶：白色アルモファス結晶、
融点（ｍｐ）：２９７℃、
紫外吸収スペクトル（ＵＶ）λｍａｘ（メタノール溶媒）：３４０，２７８，２３９ｓｈ ｎｍ、
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）νｍａｘ：３３９３，３２３６，２８９１，１６７８，１６１０，１５５０，１４６８，１３３５，１２７５，１１７３，１０５１，１０１０ｃｍ^−１、
^１３Ｃ−ＮＭＲと^１Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシドｄ６溶液）のデータ：表２、表３に示すとおり。
超高速液体クロマトグラフ-質量分析計での分析データ：表１に示すとおり。
成分４の構造：以下の（化学式４）で示すとおり。

【0058】

【化4】

（成分５）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンについて
結晶：淡緑色針状結晶、
融点（ｍｐ）：＞３００℃、
紫外吸収スペクトル（ＵＶ）λｍａｘ（メタノール溶媒）：３５４，２７３，２４１ｓｈ ｎｍ
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）νｍａｘ：３２９２，１６８１，１６２４，１６０７，１５５３，１４９５，１３６２，１２６９，１２３８，１１５７，１０９９，１０７４，１０１２ｃｍ^−１、
^１３Ｃ−ＮＭＲと^１Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシドｄ６溶液）のデータ：表２、表３に示すとおり。
超高速液体クロマトグラフ-質量分析計での分析データ：表１に示すとおり。
成分５の構造：以下の（化学式５）で示すとおり。

【0059】

【化5】

（実施例２）
（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性試験）
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素〔ヒドロキシメチルグルタリルCoAレダクターゼ（hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, HMG-CoA reductase, HMGR）または3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAレダクターゼ（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase）〕は、コレステロールや他のイソプレノイドを合成するメバロン酸経路の律速酵素の一つである。

【0060】

タデアイの葉の８０％メタノール抽出物のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素アッセイキット〔HMG-CoA reductase assay kit〕を用いて測定したところ、活性が確認された（表４参照）。そこで、ダイヤイオンＨＰ−２０カラムで分画した、５０％、７０％および１００％のメタノールで溶出したフラクションを用いた抽出物（分画物）について、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を測定した。表４に、タデアイ葉の８０％メタノール抽出物およびダイヤイオンＨＰ−２０カラムで分画した分画物のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対する阻害作用を示す。８０％メタノール抽出物とダイヤイオンＨＰ−２０の分画物は２０μｇを試験に用いた。表４に示すように、１００％のメタノール溶出フラクションを用いた場合に強い活性が確認された。

【0061】

【表4】

次いで、上記フラクションに含まれている主要な成分１−成分５（化学式１−化学式５）についてＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を測定した。表５に、成分１−成分５（化学式１−化学式５）のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対する阻害作用を示す。ポジティブコントロールとして、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素アッセイキットに含まれているプラバスタチン（比較例１）、プラバスタチン〔pravastatin〕よりＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性が低い阻害剤であるロバスタチン（比較例２）、過去にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性が報告されているフラボノイドであるルチン（比較例３、例えば、非特許文献１１参照）についても、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を測定した（表５参照）。

【0062】

表５に、成分１−成分５（化学式１−化学式５）、プラバスタチン、ルチンおよびロバスタチンのＨＭＧ−ＧｏＡ還元酵素に対する阻害作用を示す。なお、データは平均±標準誤差（ｎ＝３）で示した。

【0063】

【表5】

表５に示すように、成分１−成分５（化学式１−化学式５）には、いずれも阻害活性が確認された。そして、阻害剤無添加のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性を１００％とした場合、ポジティブコントロールのプラバスタチン（比較例１）を０．２５μＭ添加したとき、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、２３．１±５．６％であった。ロバスタチン（比較例２）では、２００μＭで、５７．５±３．４％であった。今回単離した成分１（化学式１）は、これらとほぼ同じ活性（６０．０±３．７％）を示した。

【0064】

そして、成分２（化学式２）、成分３（化学式３）および成分４（化学式４）の５０％阻害濃度は、それぞれ１７７．２μＭ、１８３．３μＭ、１５１．１μＭであった。また、ルチン（比較例３）については、今回の反応系においては、２００μＭの濃度では、阻害活性は確認できなかった。成分５（化学式５）については、反応系での溶解度が低いため５０μＭまでの濃度で測定した。

【0065】

以上詳細に説明したように、今回同定した成分１−成分５（化学式１−化学式５）である3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン配糖体〔3,5,4'-trihidroxy-6,7-methylenedioxyflavone配糖体〕は、タデアイの葉のポリフェノール成分の主要な物質群で有り、かつ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を有すことが明らかとなった。

【0066】

（まとめ）
以上の実施例１、２から、成分１−成分３に係る新規フラボノイド化合物である（上記化学式１−化学式３）に示す化学構造体を明らかにすることができた。

【0067】

また、この新規フラボノイド化合物（上記化学式１−化学式３）と既知物質（上記化学式４、化学式５）について、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤としての新たな用途を見出すことができた。

【0068】

なお、上記実施例１、２においては、タデアイの葉を、アルコールで抽出し、成分１−成分５を得たが、タデアイの葉を搾汁することにより、成分１−成分５を得てもよい。また、アルコールの他、水、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、またはクロロホルムなどを用いて抽出してもよい。

【0069】

（応用例）
近年、高脂血症、動脈硬化、糖尿病などの生活習慣病が社会問題となっている中、健康維持を目的とした植物由来の物質や、また、それを利用した健康食品等が注目されている。日本人の死因として悪性新生物（癌）に続き多く見受けられる心疾患や脳血管疾患などの血管疾患と関わりが深い動脈硬化の原因の一つとして、高脂血症が考えられ、この予防として、コレステロールの低減を効果的に図ることが望まれる。

【0070】

このようなコレステロールを低減させる手段として、コレステロール合成に係わるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害することが有効であり、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤として、実施例１、２で説明したフラボノイド化合物（成分１−成分５）を用いることができる。

【0071】

タデアイの葉から得られたフラボノイド化合物（成分１−成分５）は、各成分を精製して個別にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤として用いてもよいし、また、上記成分１−成分５のうちのいずれかの混合物をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤として用いてもよい。例えば、食品に添加する場合には、タデアイの葉の搾汁液やアルコールなどによる抽出液をそのまま使用してもよい。精製したもの、搾汁液や抽出液を乾固したものを食品に加えてもよい。

【0072】

また、菓子、パン、茶、ジュースなどの飲料、清酒、ビール、豆腐、麺類、調味料等の食品には、１００ｇあたり、乾固したものを、例えば０．００１μｇ以上、１００ｍｇ以下の範囲で添加すればよい。表５の結果より、成分１−成分５はロバスタチンと同等もしくはそれ以上のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を有している。したがって、ロバスタチンが使用されている投与量（１日あたり１０−８０ｍｇ）から考えて１００ｇあたり、乾固したものを０．７ｍｇ以上添加した場合には、ロバスタチンと同等の効果が確保できる。

【0073】

また、１００ｍｇ以下であれば食品自体に対する食味の低下を抑制することができる。飲料（例えば、黒豆茶、ハーブティー、紅茶、黒豆茶、プーアル茶、ヤーコン茶、緑茶など）へも、同様の割合で添加することで、風味を害することなく、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害効果を確保できる。

【0074】

また、健康食品への添加も当然に考えられる。例えば、ドリンク剤や錠剤、カプセル等サプリメントなどの健康食品への添加が考えられる。かかる健康食品の添加に際しては、例えば、１日摂取量が０．１ｍｇ以上、１００ｍｇ以下となるように添加すればよい。

【0075】

実施例１、２で説明したフラボノイド化合物（成分１−成分５、混合物を含む）を、医薬品として使用してもよい。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害し、コレステロールを低減させる薬として、錠剤およびドリンク剤などの形態で医薬品として利用してもよい。この場合、例えば、１日摂取量が０．１ｍｇ以上、１００ｍｇ以下となるように添加すればよい。

【0076】

（実施の形態２）
本実施の形態においては、実施の形態１で検討した成分１−成分５の抗酸化活性について検討した。

【0077】

（実施例）
（親水性酸素ラジカル吸収能（Ｈ−ＯＲＡＣ）法による抗酸化活性の確認試験）
親水性酸素ラジカル吸収能（Ｈ−ＯＲＡＣ）法による成分１−５の抗酸化活性の確認は、「非特許文献：沖智之，竹林純，山崎光司，食品機能性評価マニュアル集第ＩＩ集，「ＯＲＡＣ法」，食品機能性評価支援センター技術普及資料等検討委員会編，（社団法人日本食品科学工学会，つくば）， ｐｐ．７９−８６ （２００８）．」の方法にしたがって行った。Ｈ−ＯＲＡＣ値は、トロロックス（ＴＥ）相当量（ｍｏｌＴＥ／ｍｏｌ）で表した。

【0078】

成分１−５のＨ−ＯＲＡＣ値はそれぞれ６．５０±０．１５、５．６７±０．０８、５．３７±０．１５、６．０３±０．０６、３．９５±０．４１ｍｏｌＴＥ／ｍｏｌであった。

【0079】

このように、新規フラボノイド化合物（上記化学式１−化学式３）と既知物質（上記化学式４、化学式５）について、抗酸化剤としての新たな用途を見出すことができた。

【0080】

（応用例）
実施の形態１においても説明した動脈硬化について、その発症には活性酸素やフーリーラジカルなどの酸化ストレスによるＬＤＬの酸化が深く関わっていると考えられている。この酸化を抑えるためには抗酸化物質の摂取が有効であり、抗酸化剤として実施例１、２で説明したフラボノイド化合物（成分１−成分５）を用いることができる。

【0081】

タデアイの葉から得られたフラボノイド化合物（成分１−成分５）は、各成分を精製して個別に抗酸化剤として用いてもよいし、また、上記成分１−成分５のうちのいずれかの混合物を抗酸化剤として用いてもよい。例えば、食品に添加する場合には、タデアイの葉の搾汁液やアルコールなどによる抽出液をそのまま使用してもよい。精製したもの、搾汁液や抽出液を乾固したものを食品に加えてもよい。

【0082】

具体的な用法、容量については、例えば、前述したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤と同様の用法（例えば、食品、健康食品や医薬品）、容量にて用いることができる。

【0083】

また、抗酸化作用を有する成分１−成分５については、化粧品などに用いることができる。例えば、化粧水、クリームなどに０．００１μｇ以上、１００ｍｇの範囲で添加してもよい。

【0084】

以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることはいうまでもない。

【要約】

【課題】タデアイの葉から得られた新規フラボノイド化合物を提供する。また、タデアイの葉から得られたフラボノイド化合物（既知物質を含む）の新たな用途を提供する。
【解決手段】新規フラボノイド化合物は、（成分１）3,5,4’-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル)-β-D-グルコピラノシド]、（成分２）3,5,4’-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(アセチル)-β-D-グルコピラノシド]、（成分３）3,5,4’-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[2''-(アセチル)-β-D-グルクロニド]である。既知物質は、（成分４）3,5,4’-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-β-D-グルコピラノシドと、（成分５）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンである。これらのフラボノイド化合物は、いずれもＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性が確認された。
【選択図】なし

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】