特許 5929229 アルカリホスファターゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5929229

(24)【登録日】2016年5月13日

(45)【発行日】2016年6月1日

(54)【発明の名称】アルカリホスファターゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160519BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20160519BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160519BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N9/16 B

   C12N1/21

【請求項の数】9

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2012-11753(P2012-11753)

(22)【出願日】2012年1月24日

(65)【公開番号】特開2013-150555(P2013-150555A)

(43)【公開日】2013年8月8日

【審査請求日】2015年1月13日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003160

【氏名又は名称】東洋紡株式会社

(72)【発明者】

【氏名】相場 洋志

(72)【発明者】

【氏名】岸本 高英

(72)【発明者】

【氏名】柳谷 周作

【審査官】 濱田 光浩

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−３６０２５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５２０８１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Sucharita, K., et.al.，Shewanella chilikensis sp. nov., a moderately alkaliphilic gammaproteobacterium isolated from a lagoon.，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，２００９年，2009 59(12)，3111-3115

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｎ ９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドからなるアルカリホスファターゼ。
（Ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基を欠失、置換、挿入または付加させてなる配列からなり、アルカリホスファターゼ活性を有し、その比活性が５０００Ｕ／ｍｇ以上であるポリペプチド。
（Ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アルカリホスファターゼ活性を有し、その比活性が５０００Ｕ／ｍｇ以上であるポリペプチド。

【請求項2】

下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）および（Ｆ）からなる群のうちいずれかで示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載される塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１に記載される塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなり、且つ、アルカリホスファターゼ活性を有し、その比活性が５０００Ｕ／ｍｇ以上であるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号１に記載される塩基配列において、１または数個の塩基を置換、欠失、挿入または付加されている塩基配列であり、アルカリホスファターゼ活性を有し、その比活性が５０００Ｕ／ｍｇ以上であるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加したアミノ酸配列からなり、且つ、アルカリホスファターゼ活性を有し、その比活性が５０００Ｕ／ｍｇ以上であるポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【請求項3】

請求項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。

【請求項4】

請求項３に記載のベクターで宿主細胞が形質転換されている形質転換体。

【請求項5】

宿主細胞が大腸菌である、請求項４に記載の形質転換体。

【請求項6】

請求項１に記載のアルカリホスファターゼを産生する能力を有する微生物を培養し、得られる培養物からアルカリホスファターゼ活性を有するタンパク質を採取することを含む、アルカリホスファターゼの製造方法。

【請求項7】

請求項１に記載のアルカリホスファターゼを産生する能力を有する微生物がシェワネラ（ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属に由来する、請求項６に記載のアルカリホスファターゼの製造方法。

【請求項8】

請求項１に記載のアルカリホスファターゼを産生する能力を有する微生物が、請求項４または５に記載の形質転換体である、請求項６に記載のアルカリホスファターゼの製造方法。

【請求項9】

請求項１に記載のアルカリホスファターゼを標識してなるコンジュゲート。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細菌由来のアルカリホスファターゼに関する。

【背景技術】

【0002】

アルカリホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１、以下ＡＰとも称する）は、リン酸モノエステルを加水分解し、アルコールと無機リン酸を生じる反応を触媒する酵素であり、原核生物・真核生物を問わず広く分布することが知られる。ＡＰは、遺伝子工学用酵素として利用されるほか、酵素免疫測定（ＥＩＡ）法における標識酵素として広く利用されている。現在、このＥＩＡに用いられるＡＰはほとんどがウシ小腸由来ＡＰ（ＣＩＡＰ）である。ＣＩＡＰが重宝される理由のひとつは、その比活性の高さである。市販のＣＩＡＰの比活性はメーカーやグレードにより様々であるが、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とした場合に高比活性タイプで６０００Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎを超えるものも存在する。また、１，２−ジオキセタンもくしはアクリダンを基本骨格に含んでなるＣＩＡＰ用の各種高感度発光基質も多数販売され、免疫測定における測定感度の高さを実現している。

【0003】

公知のＣＩＡＰの抱える問題のひとつは、安定性の乏しさである。一方で大腸菌に代表される細菌由来ＡＰは、ＣＩＡＰに比して安定性が高い反面、比活性という観点においてＣＩＡＰに大きく劣る。比較的比活性の高いものとして、たとえば非特許文献１並びに非特許文献２にはシェワネラ属由来ＡＰが報告されているが、比活性としてはいずれも２０００Ｕ／ｍｇに満たない。非特許文献１に記載されるＡＰは産業上有用であるとして特許登録されている（特許文献１）が、これは概酵素が大腸菌由来ＡＰよりも熱安定性が劣るために遺伝子工学的用途に有用であるとする出願であり、免疫測定用標識酵素としての有用性についてはその可能性にすら触れられていない。また、特許文献２には、バチルス属由来ＡＰが記載されるが、本酵素は比活性３０００Ｕ／ｍｇ程度であり、これも十分ではないほか、１，２−ジオキセタン系もしくはアクリダン系発光基質に対する反応性は低く、実用的とはいえなかった。また、非特許文献１には、比活性１０，０００Ｕ／ｍｇを超える細菌由来ＡＰが記載されているが、３０℃１５分処理で約２割の失活が起こり、５０℃１５分処理ではほぼ完全に活性が失われるなどＣＩＡＰと比較しても安定性が著しく低く、実用には耐えない。

【0004】

公知のＣＩＡＰの抱える問題のもうひとつは、糖鎖を有することによるハンドリング等の問題である。糖鎖を有するタンパク質は、その糖鎖の構造や大きさが均一ではないことが多く、ゲルろ過における精製において目的のピークがブロードになるなど精製に支障をきたすことがある。また、分子表面に糖鎖が存在することで、溶液中において酵素が基質と接触するに際して物理的障壁ともなりうる。特許文献３には酵母で発現させたＣＩＡＰを脱グリコシル化することにより糖鎖を低減する方法が記載されるが、糖鎖が完全に除去されるわけではなく、またそのような工程を加えることでコストアップにもつながる。

【0005】

細菌由来のＡＰは糖鎖を有しないことから上記問題を解消でき、また大腸菌のような経済的な宿主系で容易に発現できることからコスト低減も達成できるという優位さがある一方で、比活性や既存の基質に対する反応性をはじめとする免疫診断等における必要条件を十分に満たしうるものがこれまで知られていなかった。このためＣＩＡＰは上記の問題を有しつつも免疫診断分野において標識酵素として使われ続けている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特許第３５０７８９０号公報

【特許文献2】特許第４０３５７３８号公報

【特許文献3】特許第４３０３２８３号広報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Cloning and expression of a highly active recombinant alkaline phosphatase from psychrotrophic Cobetia marina, Biotechnol Lett (2011)，Nasu et al.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、ＣＩＡＰよりも高い安定性を有し、かつ酵素表面に糖鎖を有さず、かつ比活性がＣＩＡＰと少なくとも同等であるＡＰを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、シェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属細菌からＡＰの遺伝子を取得し、この遺伝子を形質転換した微生物を培養することでＡＰの組換え生産に成功し、かつ該組み換えＡＰがＣＩＡＰよりも高い熱安定性を有し、かつＣＩＡＰと同等以上の比活性を有し、かつ各種発光基質に対する十分な反応性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0010】

すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［項１］
下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドからなるアルカリホスファターゼ。
（Ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基を欠失、置換、挿入または付加させてなる配列からなり、アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド。
［項２］
下記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載される塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１に記載される塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列からなり、且つ、アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、且つアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号１に記載される塩基配列において、１または数個の塩基を置換、欠失、挿入または付加されている塩基配列であり、アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置
換、欠失、挿入または付加したアミノ酸配列からなり、且つ、アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［項３］
項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
［項４］
項３に記載のベクターで宿主細胞が形質転換されている形質転換体。
［項５］
宿主細胞が大腸菌である、項４に記載の形質転換体。
［項６］
項１に記載のアルカリホスファターゼを産生する能力を有する微生物を培養し、得られる培養物からアルカリホスファターゼ活性を有するタンパク質を採取することを含む、アルカリホスファターゼの製造方法。
［項７］
項１に記載のアルカリホスファターゼを産生する能力を有する微生物がシェワネラ（ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属に由来する、項６に記載のアルカリホスファターゼの製造方法。
［項８］
項１に記載のアルカリホスファターゼを産生する能力を有する微生物が、項４または５に記載の形質転換体である、項６に記載のアルカリホスファターゼの製造方法。
［項９］
項１に記載のアルカリホスファターゼを標識してなるコンジュゲート。

【発明の効果】

【0011】

本発明により、免疫測定の標識酵素として有用なアルカリホスファターゼ、並びにアルカリホスファターゼ標識抗体等を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】シェワネラ・チリケンシス由来ＡＰおよびＣＩＡＰの各温度における安定性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

１．アルカリホスファターゼ
１−１．ポリペプチド
本発明の好ましい態様においては、本発明は配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるアルカリホスファターゼであり、または配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基を欠失、置換、挿入または付加させてなる配列からなり、アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドからなるアルカリホスファターゼである。配列番号２のアミノ酸配列は、後述のとおりＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｃｈｉｌｉｋｅｎｓｉｓ（シェワネラ・チリケンシス）に由来する。

【0014】

本発明のアルカリホスファターゼが、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸の置換、付加、欠失、又は挿入を有するポリペプチドから成る場合、このようなアミノ酸の変異の数や種類は、アルカリホスファターゼ活性や上述する熱安定性等の酵素特性に影響を及ぼさない限り特に制限はない。好ましくは、変異の具体的な数は、１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、更に好ましくは１〜１０個、より更に好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。

【0015】

本発明のアルカリホスファターゼが、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換されているポリペプチドから成る場合、当該アミノ酸の置換は、アルカリホスファターゼ活性や前述する酵素特性を損なわない限り特に制限はないが、好ましくは、類似のアミノ酸によって置換されている。類似のアミノ酸としては、例えば、以下を挙げることが出来る。
芳香族アミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ
脂肪族アミノ酸：Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ
極性アミノ酸：Ｇｌｎ、Ａｓｎ
塩基性アミノ酸：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ
酸性アミノ酸：Ｇｌｕ、Ａｓｐ
水酸基を有するアミノ酸：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ

【0016】

また、本発明の好ましい態様においては、本発明は配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドからなるアルカリホスファターゼである。配列番号２に記載されるアミノ酸配列との同一性は、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、９９％以上である。

【0017】

ここで「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する、同一アミノ酸残基の割合（％）を意味する。

【0018】

アミノ酸配列の同一性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ５８７３−５８７７ （１９９３） に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム （ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０） に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））］が挙げられる。

【0019】

同一性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）によるアミノ酸配列同一性検索においては、配列番号２に示す配列と最も高い同一性を示す既知配列は、シェワネラ・エスピー（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．）Ｗ３−１８−１株ゲノム中に存在するＡＰとアノテーションされているＯＲＦから推定される配列であり、その同一性は７４％である。すなわち、配列番号２との同一性が８０％以上を示す公知のＡＰは存在しない。また、非特許文献１および２に記載されるシェワネラ属由来ＡＰの配列とはそれぞれ６７％、７０％の同一性であり、かつこれらＡＰとは上述のように比活性が３倍以上異なることからも、本発明のＡＰは公知のＡＰとは明確に区別される。本発明のＡＰを明確に規定する基準のひとつが、この配列番号２との同一性の高さであり、好ましい同一性としては具体的には少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。

【0020】

１−２．由来
本発明のＡＰの給源は、上記特性を有するものであれば特に限定しないが、好ましくは細菌由来であり、より好ましくはシェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属由来であり、よりさらに好ましくはシェワネラ・チリケンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｃｈｉｌｉｋｅｎｓｉｓ）由来であり、最も好ましくはＮＢＲＣ１０５２１７株として（独）製品評価技術基盤機構より分譲される菌株由来である。
本発明のＡＰは、由来するシェワネラ属細菌を培養した培養液から得たものであってもよく、また由来する細菌とは異なる宿主生物に遺伝子を導入し発現させることにより得たものであってもよい。

【0021】

１−３．熱安定性
本発明は、好ましくはＣＩＡＰに比して高い熱安定性を有するＡＰであり、より好ましくは６０℃６０分間の熱処理後に８０％以上の活性を維持しうるＡＰであり、よりさらに好ましくは６５℃６０分間の熱処理後に８０％以上の活性を維持しうるＡＰである。

【0022】

本発明で述べる熱安定性とは、５０ｍＭ トリエタノールアミン、１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 硫酸亜鉛（ｐＨ７．０）にタンパク質量として０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度となるようＡＰを溶解し、本ＡＰ溶液を６０分間加熱した際の、加熱前のＡＰ活性に対する加熱後のＡＰ活性の残存率として定義される。また、本発明で述べる加温処理は、上記条件によりなされるものである。また、活性の測定方法は後述のとおりである。

【0023】

１−４．比活性
本発明に述べる比活性は、後述の「タンパク質の定量および比活性の算出例」に記載の方法により求められる。本発明のＡＰの比活性は、少なくとも５０００Ｕ／ｍｇ以上であり、好ましくは５５００Ｕ／ｍｇ以上であり、より好ましくは６０００Ｕ／ｍｇ以上であり、よりさらに好ましくは７０００Ｕ／ｍｇ以上であり、最も好ましくは８０００Ｕ／ｍｇ以上である。公知のシェワネラ属由来ＡＰの比活性は、非特許文献１によればＳＩＢ１株由来ＡＰは５０℃という高温において１８８０Ｕ／ｍｇであり、３７℃ではさらに低いと推定される。また、非特許文献２に記載の株は、至適条件とする７０℃ ｐＨ１０．６において１５００Ｕ／ｍｇであり、３７℃ではおよそ１２００Ｕ／ｍｇである。本発明のＡＰは比活性の観点において公知のシェワネラ属由来ＡＰを凌駕しており、これらＡＰとは明確に区別される。

【0024】

２．アルカリホスファターゼの製造方法
また、本発明の好ましい態様においては、本発明は、上記のアルカリホスファターゼを産生する能力を有する微生物を培養し、得られる培養物からアルカリホスファターゼ活性を有するタンパク質を採取することを含む、アルカリホスファターゼの製造方法である。

【0025】

本発明のＡＰは、（１）該酵素を産生する細胞を原料として抽出精製する方法、（２）化学的に合成する方法、（３）遺伝子組換え技術によりＡＰを発現するように操作された細胞から精製する方法、または（４）ＡＰをコードする核酸から無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成する方法等を適宜用いることによって取得することができる。
以下に順次、上記（１）〜（４）の方法を説明する。

【0026】

２−１．（１）該酵素を産生する細胞を原料として抽出精製する方法
本発明のＡＰを産生する能力を有する微生物は、特に限定されないが、例えば天然の細胞としては、シェワネラ（ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属に由来する微生物、例えばシェワネラ・チリケンシスＮＢＲＣ１０５２１７株が例示され、（独）製品評価技術基盤機構より購入可能であり、この菌株を常法に従って培養し、増殖せしめることにより本発明のＡＰを産生可能である。

【0027】

天然のＡＰ産生細胞からのＡＰの単離精製は、例えば以下のようにして行うことができる。ＡＰ産生細胞を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこから蛋白質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより精製することができる。このような分離技術としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0028】

２−２．（２）化学的に合成する方法
化学合成によるＡＰの製造は、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を基にして、配列の全部または一部をペプチド合成機を用いて合成することにより行うことができる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明のＡＰを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を含む場合は保護基を脱離することにより、目的とするタンパク質を製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）および（２）に記載された方法に従って行われる。
（１） Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙａｎｄ Ｍ．Ａ． Ｏｎｄｅｔｔｉ， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６６）
（２） Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｌｕｅｂｋｅ， Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５）

【0029】

このようにして得られた本発明のＡＰは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるＡＰが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にタンパク質が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

【0030】

２−３．（３）遺伝子組換え技術によりＡＰを発現するように操作された細胞から精製する方法
２−３−１．アルカリホスファターゼをコードするＤＮＡ
本発明のＡＰは、好ましくは、該蛋白質をコードする核酸をクローニング（もしくは化学的に合成）し、該核酸を担持する発現ベクターを含む形質転換体の培養物から単離精製することにより製造することができる。

【0031】

本発明のＡＰをコードする遺伝子は、好ましい態様においては以下のＤＮＡである。すなわち、配列番号２に示すアミノ酸をコードする塩基配列を有するＤＮＡであり、より具体的な一例としては、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡである。
また、概ＤＮＡは、発現される蛋白質がアルカリホスファターゼ活性を有する限りにおいては、好ましくはＡＰの特性が本願に記載する特性と同等もしくはそれ以上である限りにおいては、配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加したアミノ酸配列をコードするＤＮＡであっても良いし、あるいは、配列番号１に示す塩基配列において、１もしくは複数の塩基が置換・欠失・付加・挿入されたＤＮＡであってもよい。
また別の態様においては、概ＤＮＡは、配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、且つアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸などが用いられる。
また別の態様においては、概ＤＮＡは、配列番号１に記載される塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列からなり、且つ、アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。

【0032】

本明細書における塩基配列の同一性は、同一性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版 （Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， １９８９） に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行うことができる。

【0033】

上記において、「ストリンジェントな条件」とは、配列番号１で示される塩基配列と同等の転写終結領域機能を有する塩基配列のみが配列番号１に対して相補的な塩基配列とハイブリッド（いわゆる特異的ハイブリッド）を形成し、同等の機能を有しない塩基配列は配列番号１に対して相補的な塩基配列とハイブリッド（いわゆる非特異的ハイブリッド）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．２Ｍ ＮａＨ ２ＰＯ ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ）・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。
該ストリンジェントな条件は、好ましくはハイストリンジェントな条件である。ハイストリンジェントな条件とは、例えば０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である。）

【0034】

本発明のＡＰをコードするＤＮＡは、シェワネラ属細菌のゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ（ｃＤＮＡ）より取得することもできるが、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法を利用して接続することにより、ＡＰの全長をコードするＤＮＡを構築することも可能である。化学合成もしくはＰＣＲ法との組み合わせで全長ＤＮＡを構築することの利点は、該遺伝子を導入する宿主に合わせて使用コドンを遺伝子全長にわたり設計できる点にある。同一のアミノ酸をコードする複数のコドンは均一に使用されるわけではなく、生物種によってその使用頻度が異なる。一般にある生物種において高発現する遺伝子に含まれるコドンは、その生物種において使用頻度の高いコドンを多く含んでおり、逆に発現量の低い遺伝子は使用頻度の低いコドンの存在がボトルネックとなって高発現を妨げている例が少なくない。異種遺伝子の発現に際し、その遺伝子配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに置換することで該異種タンパク質発現量が増大した例はこれまでに多数報告されており、このような使用コドンの改変は異種遺伝子発現量の増大に効果があると期待される。

【0035】

上記の理由から、本発明のＡＰをコードするＤＮＡは、それが導入される宿主細胞により適したコドン（即ち、該宿主において使用頻度の高いコドン）に改変することが望ましい。各宿主のコドン使用頻度は、該宿主生物のゲノム配列上に存在する全遺伝子における各コドンの使用される割合で定義され、たとえば１０００コドンあたりの使用回数で表される。またコドン使用頻度は、その全ゲノム配列の解明されていない生物にあっては代表的な複数遺伝子の配列から近似的に算出することも可能である。組換えようとする宿主生物におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（財）かずさＤＮＡ研究所のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ）に公開されている遺伝暗号使用頻度データベースを用いることができ、または各生物におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよく、あるいは使用する宿主生物のコドン使用頻度データを自ら決定してもよい。入手したデータと導入しようとする遺伝子配列を参照し、遺伝子配列に用いられているコドンの中で宿主生物において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに置換すればよい。

【0036】

２−３−２．宿主細胞
本発明のＡＰをコードするＤＮＡを導入する宿主細胞は、組換え発現系が確立しているものであれば、特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌などのバクテリア、放線菌、麹菌、酵母といった微生物宿主並びに昆虫細胞、動物細胞、高等植物等が挙げられ、より好ましくは大腸菌（例えば、Ｋ１２株、Ｂ株など）が挙げられる。大腸菌において使用頻度の高いコドンとしては、例えば、Ｋ１２株の場合であれば、ＧｌｙにはＧＧＴまたはＧＧＣ、ＧｌｕにはＧＡＡ、ＡｓｐにはＧＡＴ、ＶａｌにはＧＴＧ、ＡｌａにはＧＣＧ、ＡｒｇにはＣＧＴまたはＣＧＣ、ＳｅｒにはＡＧＣ、ＬｙｓにはＡＡＡ、ＩｌｅにはＡＴＴまたはＡＴＣ、ＴｈｒにはＡＣＣ、ＬｅｕにはＣＴＧ、ＧｌｎにはＣＡＧ、ＰｒｏにはＣＣＧなどが挙げられる。
このように宿主において使用頻度の高いコドンに置換されたＡＰをコードするＤＮＡとして、例えば、シェワネラ属細菌由来のＡＰをコードするＤＮＡを、該ＡＰと同一のアミノ酸配列をコードし、且つ大腸菌Ｋ１２株において使用頻度の高いコドンに置換したＤＮＡが挙げられる。

【0037】

２−３−３．ベクター
本発明はまた、本発明のＡＰをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。本発明の組換えベクターは原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターやウイルスベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当該技術分野において入手可能な公知のクローニングベクターまたは発現ベクターに、上記のＡＰをコードするＤＮＡを適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより調製することができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。

【0038】

ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（-）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）など、酵母由来プラスミドとして、例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドとして、例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４などが挙げられる。また、ウイルスとして、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等のパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）等のレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニヤウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。

【0039】

特に、本発明は、目的の宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下にＡＰをコードするＤＮＡが配置されたＡＰ発現ベクターを提供する。使用されるベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域（例えば宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピート、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有していることが好ましい。さらに、挿入されるＡＰをコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を包含する。
宿主として酵母，動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは、エンハンサー配列、ＡＰ ｍＲＮＡの５’側および３’側の非翻訳領域、ポリアデニレーション部位等をさらに含むことが好ましい。

【0040】

作成した組換えベクターを導入する宿主生物としては、組換え発現系が確立している大腸菌、枯草菌などのバクテリア、放線菌、麹菌、酵母といった微生物宿主並びに昆虫細胞、動物細胞、高等植物等を挙げることができるが、中でもタンパク質発現能力に優れている大腸菌を用いるのが好ましい。また、特に糖鎖を有しないＡＰとすることでＣＩＡＰにみられる問題を解消できるという点からも、大腸菌宿主も用いるのが好適である。組換えプラスミドを導入する方法としてはエレクトロポレーションによる導入のほか、塩化カルシウム等薬品処理によりコンピテント化した宿主であればヒートショックによる導入も可能である。宿主ベクターへの目的組換えプラスミドの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの各種薬剤耐性遺伝子に代表されるマーカーとＡＰ活性とを同時に発現する微生物を検索すればよく、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＡＰを発現する微生物を選択すればよい。

【0041】

２−３−４．培養
本発明のＡＰは、上記のようにして調製されるＡＰ発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物からＡＰを採取、回収することによって製造することができる。

【0042】

使用される培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばテトラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいてもよい。

【0043】

培養は当分野において知られている方法により行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに何ら限定されるものではない。
宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌等である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜９である培地である。宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ． Ｊ．， Ｅｘｐ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ， ｐ．４３１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７２）］等が例示される。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃で約３〜７２時間行うことができる。宿主が枯草菌の場合、必要により通気・攪拌をしながら、通常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母の場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最少培地 ［Ｂｏｓｔｉａｎ． Ｋ．Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７， ４５０５ （１９８０）］が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として、例えば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）［Ｓｃｉｅｎｃｅ， １２２， ５０１ （１９５２）］、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ８， ３９６ （１９５９）］、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ． Ａｍ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ．， １９９， ５１９ （１９６７）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， ７３， １ （１９５０）］ 等を用いることができる。これら培地には、ＡＰを安定化させるための金属塩を添加してもよく、そのような金属塩としては、好ましくはマグネシウム塩および／又は亜鉛塩が用いられる。これら金属塩は、培養する細胞に毒性を示さない範囲において設定すればよく、マグネシウム塩であれば終濃度０．００１ｍＭ〜１０ｍＭ、亜鉛塩であれば０．００１ｍＭ〜１ｍＭが好ましい添加量の範囲として例示されるが、この範囲に限定されない。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、培地として、例えばウシ胎仔血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２， ８４０４ （１９８５）］等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。

【0044】

２−３−５．精製
ＡＰの精製は、ＡＰ活性の存在する画分に応じて、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。
培養物の培地中に存在するＡＰは、培養物を遠心または濾過して培養上清（濾液）を得、該培養上清から、例えば、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。

【0045】

一方、細胞質に存在するＡＰは、培養物を遠心または濾過して細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解、浸透圧ショック、および／またはトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤処理などにより、細胞およびオルガネラ膜を破砕（溶解）した後、遠心分離や濾過などによりデブリスを除去して可溶性画分を得、該可溶性画分を、上記と同様の方法で処理することにより単離精製することができる。

【0046】

組換えＡＰを迅速且つ簡便に取得する手段として、ＡＰのコード配列のある部分（好ましくはＮまたはＣ末端）に、金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列（例えば、ヒスチジン、アルギニン、リシン等の塩基性アミノ酸からなる配列、好ましくはヒスチジンからなる配列）をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子操作により付加して宿主細胞で発現させ、該細胞の培養物のＡＰ活性画分から、該金属イオンキレートを固定化した担体とのアフィニティーによりＡＰを分離回収する方法が好ましく例示される。金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、例えば、ＡＰをコードするＤＮＡをクローニングする過程で、ＡＰのＣ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に該ＤＮＡ配列を連結したハイブリッドプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ったり、あるいは該ＤＮＡ配列を終止コドンの前に含む発現ベクターにＡＰをコードするＤＮＡをインフレームで挿入することにより、ＡＰコード配列に導入することができる。また、精製に使用される金属イオンキレート吸着体は、遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル、鉄の二価イオン、あるいは鉄、アルミニウムの三価イオン等、好ましくはコバルトまたはニッケルの二価イオン含有溶液を、リガンド、例えばイミノジ酢酸（ＩＤＡ）基、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）基、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）基等を付着したマトリックスと接触させて該リガンドに結合させることにより調製される。キレート吸着体のマトリックス部は通常の不溶性担体であれば特に限定されない。
あるいは、タグとしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＨＡ、ＦＬＡＧペプチドなどを用いてアフィニティー精製することもできる。

【0047】

上記精製工程において、必要に応じて膜濃縮、減圧濃縮、活性化剤および安定化剤添加等の処理を行うこともできる。これら工程に用いる溶媒としては特に限定されないが、ｐＨ６〜９程度の範囲において緩衝能を有するＫ−リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等に代表される各種緩衝液が好ましい。また、本ＡＰの安定性を担保するために、これら緩衝液中に金属塩を添加してもよく、そのような金属塩としては、好ましくはマグネシウム塩および／又は亜鉛塩が用いられる。これら金属塩は、ＡＰの安定化に奏効する範囲において設定すればよく、マグネシウム塩であれば終濃度０．００１ｍＭ〜１０ｍＭ、亜鉛塩であれば０．００１ｍＭ〜１ｍＭが好ましい添加量の範囲として例示されるが、この範囲に限定されない。

【0048】

かくして得られるＡＰが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該タンパク質が塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。

【0049】

精製酵素は液状で産業利用に供することも可能であるが、粉末化し、あるいはさらに造粒することもできる。液状酵素の粉末化は定法により凍結乾燥することでなされる。

【0050】

２−４．（４）ＡＰをコードする核酸から無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成する方法
さらに、本発明のＡＰは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。
本発明のＡＰをコードするＲＮＡは、本発明のＡＰをコードするｍＲＮＡを常法を用いて該ＲＮＡを発現する宿主細胞から精製するか、あるいは、ＡＰをコードするＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写系を用いてｃＲＮＡを調製することによって取得することができる。無細胞タンパク質転写／翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液はＰｒａｔｔ Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， “Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ”， Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ． ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ． ｅｄｓ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ １７９−２０９ （１９８４） に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製） やＲＴＳ ５００ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｒｏｃｈｅ社製） 等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製） 等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製） 等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ Ｆ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １７９： １６０−１６１ （１９５７） あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ Ａ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ９６： ３８−５０ （１９９６） 等に記載の方法を用いることができる。

【0051】

タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法 ［Ｐｒａｔｔ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） 前述］ や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム ［Ｓｐｉｒｉｎ Ａ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２： １１６２−１１６４ （１９８８）］、透析法 （Ｋｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， 第２１回日本分子生物学会， ＷＩＤ６）、あるいは重層法 （ＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭＷｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｒｅ ｋｉｔ取扱説明書： ＴＯＹＯＢＯ社製） 等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法 （特開２０００−３３３６７３） 等を用いることができる。

【0052】

２−５．コンジュゲート
また、本発明の別の態様は、上述のアルカリホスファターゼによって標識されてなるコンジュゲートであり、標識の対象となる物質はたとえば核酸プローブ、ビオチンなどの生体物質、ポリペプチド・アビジン・抗体などのタンパク質などが好適に選択される。標識の方法は、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、グルタルアルデヒド法の各手法が適用可能であり、標識対象物質、用いる官能基、使用目的などにより使い分けることができる。ＥＬＩＳＡや免疫診断試薬において使用されるＡＰ標識抗体・ＡＰ標識抗原の作製方法並びにそれらを用いた免疫測定の方法については「超高感度酵素免疫測定法」（石川榮治著、学会出版センター刊）などに詳しい。

【0053】

典型的な免疫測定方法の一例は、まず測定対象となる物質の一次抗体を含む溶液を添加・インキュベートすることにより固相に吸着させる。この固相は反応層として用いる容器であってもよく、また反応層とは別に用意した磁性ビーズ等であってもよい。一次抗体を吸着させた後、溶液を除いて洗浄バッファーで数回リンスして非吸着物質を除く。洗浄バッファーは抗体が安定に存在しうる中性付近のｐＨ領域で緩衝能を有するものを利用可能であり、また洗浄能を高めるために界面活性剤を含んでいてもよい。洗浄後の固相は、さらにウシ血清アルブミンや不活性化型ＡＰ等のタンパク質を含んだ液に浸漬され、インキュベートすることによりブロッキングを行う。ブロッキング後の固相は前出の洗浄バッファーで洗浄の後、測定対象となるサンプルに接触させ、一定時間インキュベートすることで、測定対象物を一次抗体に吸着させる。サンプル溶液を完全に除き、前出の洗浄バッファーで洗浄ののち、ＡＰ標識二次抗体を含む溶液を添加し一定時間インキュベートすることにより、固相上の一次抗体に捕捉された測定対象物にＡＰ標識二次抗体を吸着させる。溶液を完全に除き、前出の洗浄バッファーで洗浄ののち、ＡＰの基質を添加して活性を検出する。ＡＰの基質としては、活性の検出方法が比色法であればｐ−ニトロフェニルリン酸や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸が、蛍光法であれば４−メチルウンベリフェリルリン酸が、発光法であれば１，２−ジオキセタン系もしくはアクリダン系発光基質からなる各種発光基質を利用可能である。これらの中で、本発明のＡＰは特に発光基質に対する反応性に優れており、これを用いる方法がより好適に選択される。発光基質としては、たとえばＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、ＣＤＰ−ｓｔａｒ、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０、ＡＰＳ−５などが挙げられるが、これらに限定されない。あらかじめ測定対象物質の標準液を用いて作成した検量線より、測定対象物質を定量する。

【0054】

典型的な免疫測定試薬の構成の一例は、反応層、一次抗体が固定化され、かつウシ血清アルブミンや不活性化型ＡＰ等のタンパク質でブロッキングされた固相、測定対象である抗原の標準液、ＡＰが標識された二次抗体、反応層中でサンプルや二次抗体を反応させた後に洗浄するための洗浄液、ＡＰの基質溶液、使用マニュアルを含む。ＡＰの基質としては、活性の検出方法が比色法であればｐ−ニトロフェニルリン酸や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸が、蛍光法であれば４−メチルウンベリフェリルリン酸が、発光法であれば１，２−ジオキセタン系もしくはアクリダン系発光基質からなる各種発光基質を利用可能である。これらの中で、本発明のＡＰは特に発光基質に対する反応性に優れており、これを用いる方法がより好適に選択される。発光基質としては、たとえばＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、ＣＤＰ−ｓｔａｒ、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０、ＡＰＳ−５などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0055】

３．活性測定例
本発明に述べるＡＰ活性は、特に断りがない限り以下の方法で測定されたものである。
まず、下記の溶液Ａ・Ｂを調製する。
Ａ：１Ｍジエタノールアミン緩衝液 （ｐＨ９．８）
Ｂ：０．６７Ｍ ｐ−ニトロフェニルリン酸 （溶液Ａに溶解する）
溶液Ａ２．９ｍｌと溶液Ｂ０．１ｍｌとをキュベット（光路長＝１．０ｃｍ）に調製し、３７℃で５分間予備加温する。ＡＰ溶液０．１ｍｌを添加してゆるやかに混和し、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で４０５ｎｍの吸光度変化を３〜５分間記録し、その直線部分から１分間あたりの吸光度変化を求める（ΔＯＤＴＥＳＴ）。盲検は酵素の代わりに酵素を溶解しているバッファーを０．１ｍｌ加え、同様に１分間あたりの吸光度変化を求める（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）。これらの値を用いて、下記の式よりＡＰ活性を求める。

ＡＰ活性（Ｕ／ｍｌ）＝{（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．１}／{１８．２×１．０×０．１}

３．１：ＡＰ溶液添加後の反応液量（ｍｌ）
１８．２：上記測定条件における、ｐ−ニトロフェノールのミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／μｍｏｌ）
１．０：光路長（ｃｍ）
０．１：酵素溶液の添加量（ｍｌ）

【0056】

４．タンパク質の定量および比活性の算出例
本発明に述べるタンパク質量は２８０ｎｍの吸光度を測定することにより測定したものである。すなわち、２８０ｎｍにおける吸光度が０．１〜１．０の範囲となるように酵素溶液を蒸留水で希釈し、蒸留水を用いてゼロ点補正を行った吸光度計を用いて２８０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）を測定する。本発明に述べるタンパク質濃度は、１Ａｂｓ≒１ｍｇ／ｍｌと近似し、吸光度の測定と測定した溶液の希釈倍率とを乗じた値で示したものである。また、本発明に述べる比活性とは、本測定方法によるタンパク質量として１ｍｇあたりのＡＰの活性（Ｕ／ｍｇ）であり、この際のＡＰ活性は、上記活性測定例に従って測定することにより得られる値である。

【0057】

以下、本発明を具体的に実施例として示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例1】

【0058】

ＡＰ遺伝子のクローニング
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｃｈｉｌｉｋｅｎｓｉｓ ＮＢＲＣ１０５２１７株を試験管中の５ｍｌＬＢ培地に植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。培養液を１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れ、冷却遠心機で１２０００ｒｐｍ５分遠心し、上清を吸引除去することにより、菌体を得た。この菌体より、ゲノムＤＮＡ抽出キット（ＴＯＹＯＢＯ製、ＮＰＫ−１）を用いて、該キットに添付のマニュアルに従ってゲノムＤＮＡを取得した。このゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩもしくはＢｇｌＩＩで消化させ、ＤＮＡ精製キット（ＴＯＹＯＢＯ製、ＮＰＫ−６）を用いて精製し、制限酵素を除いた。このＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩで消化し精製したｐＢＲ３２２と混合し、混合液と等量のライゲーション液（ＴＯＹＯＢＯ製、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ）を加えて１６℃で一晩インキュベートした。このライゲーション溶液を大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製、コンピテントハイＪＭ１０９）に添加し、ヒートショックによりプラスミドを形質転換することで、Ｔ３−３株のゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。５０μｇ／ｍｌのＢＣＩＰおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にこのライブラリーを植菌して３０℃で培養し、形質転換コロニーを形成させた。形成されたコロニーをうち青色を呈したものを爪楊枝でつき、試験管中の５ｍｌＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に植菌し、３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液より、プラスミド抽出キット（ＴＯＹＯＢＯ製、ＮＰＫ−３）を用いてＮＢＲＣ１０５２１７株由来ＡＰ遺伝子を含むプラスミド（ｐＬＰＰ１０５２１７−１）を抽出、精製した。得られたプラスミドは、約６ｋｂのインサートを有しており、この配列をシーケンス解析することにより、ＡＰ遺伝子全長およびその隣接領域の配列を決定した。決定されたＡＰ遺伝子の塩基配列を配列番号１に、またこの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。

【実施例2】

【0059】

大腸菌宿主でのＡＰの発現
実施例１で取得したプラスミド（ｐＬＰＰ１０５２１７−１）を大腸菌Ｃ６００株にエレクトロポレーションにより導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布、３０℃で一晩培養することにより、形質転換コロニーを形成させた。この形質転換コロニーを５００ｍｌ容坂口フラスコ中の６０ｍｌＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に一白金耳植菌し、３０℃１８０ｒｐｍで一晩振とう培養した。この培養液全量を１０Ｌ容ジャーファーメンター中の６Ｌ生産培地（１．２％ペプトン、２．４％酵母エキス、０．１％ＮａＣｌ、０．１ｍＭ硫酸亜鉛、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、ｐＨ７．０）に全量投入し、通気量２Ｌ／分、攪拌３８０ｒｐｍ、温度３０℃で４８時間攪拌通気培養した。これにより、２０３Ｕ／ｍｌのＡＰを産生させた。

【実施例3】

【0060】

大腸菌組換えＡＰの精製
実施例３で得られた培養液を５００ｍｌ容遠心管に分注し、高速冷却遠心装置で８０００ｒｐｍ３０分遠心し、上清をデカントで除去することにより菌体を得た。菌体を１．５Ｌの２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し、フレンチプレス破砕機により圧力８０ＭＰａで破砕した。破砕液に５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミンを対液１％添加し、生成した固形分を高速冷却遠心装置で８０００ｒｐｍ３０分遠心により沈降させ除いた。この液に０．２飽和の硫酸アンモニウムを溶解させ、生じた固形分を高速冷却遠心装置で８０００ｒｐｍ３０分遠心することにより除いた。さらに、終濃度０．６飽和となるように硫酸アンモニウムを追加して溶解させ、高速冷却遠心装置で８０００ｒｐｍ３０分遠心し、デカントにより上清を除いてＡＰを含む沈殿を得た。この沈殿を９０ｍｌの２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５、かつ１ｍＭの塩化マグネシウムを含む）を加えて溶解させた。この溶液を２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５、かつ１ｍＭの塩化マグネシウムを含む）で緩衝化したＧ−２５セファロースゲル（ＧＥヘルスケア製）を用いて脱塩した。この液を、２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５、かつ１ｍＭの塩化マグネシウムを含む）で緩衝化したＤＥＡＥセファロースゲル（ＧＥヘルスケア製）に吸着させ、同バッファーでＮａＣｌ濃度を０．５Ｍまで上昇させることによりグラジエント溶出を行った。ＡＰ活性を有する画分を集め、０．２飽和となるよう硫酸アンモニウムを溶解した。この溶液を２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５、かつ０．２飽和の硫酸アンモニウムおよび１ｍＭの塩化マグネシウムを含む）で緩衝化したＰｈｅｎｙｌセファロースゲル（ＧＥヘルスケア製）にアプライ、同バッファーを通液しつづけて非吸着画分を回収し、同バッファーで硫酸アンモニウム濃度を０まで下げることによりグラジエント溶出した。ＡＰを含む画分をあつめ、２０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．５、かつ０．３Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化マグネシウムおよび０．１ｍＭの硫酸亜鉛を含む）で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘ２００カラムでゲルろ過し、ＡＰを含む画分を集めた。このＡＰ溶液について比活性を測定したところ、８０１０Ｕ／ｍｇであった。

【実施例4】

【0061】

Ｔ３−３株由来組換えＡＰの熱安定性
実施例４で作製したＡＰを５０ｍＭトリエタノールアミン、１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 硫酸亜鉛（ｐＨ７．０）を用いて１０μｇ／ｍＬの濃度になるよう希釈した。この液を、６０℃、６５℃、７０℃の各温度で１時間インキュベートし、インキュベート前後のＡＰ活性を比較した。また、比較対象として、比活性６０００Ｕ／ｍｇのＣＩＡＰについても同様の処理を行った。各インキュベート温度と、インキュベート後の活性残存率を図３に示す。本発明のＡＰは、６５℃においても８０％以上の活性を維持していた。一方のＣＩＡＰは、６０℃の処理で２９％、６５℃では２％の残存率であり、本発明のＡＰがＣＩＡＰに比して高い熱安定性を有していることが明らかとなった。

【実施例5】

【0062】

ＡＰの発光基質に対する反応性比較
実施例４で作製したＡＰについて、それぞれ２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５、１ｍＭ 塩化マグネシウムおよび０．１ｍＭ 硫酸亜鉛を含む）を用いて０．５Ｕ／ｍｌもしくは０．１Ｕ／ｍｌとなるよう希釈した。このＡＰ希釈液を９６ウエルのＥＬＩＳＡプレートに５μＬずつ分注した。ここに、発光基質としてＡＰＳ−５、ルミホス５３０（以上Lumigen社製）、ＣＤＰ−ｓｔａｒ（Roche社製）のいずれかを５０μＬ加え、マルチラベルプレートカウンター（パーキンエルマー社製、Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯ ＭＸ）を用いて発光強度を測定した。結果を表１に示す。本発明のＡＰは、汎用の発光基質に対して十分な反応性を有していることが確認された。

【0063】

【表1】

【産業上の利用可能性】

【0064】

本発明のアルカリホスファターゼは、免疫測定用標識酵素として有用であるほか、プローブハイブリダイゼーション、ウエスタンブロッティング用標識酵素として利用可能である。さらに、本発明のアルカリホスファターゼは、ＤＮＡ断片の脱リン酸化するための遺伝子工学用酵素として利用可能である。

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]