特許 5929752 保存センサ基板，並びに、保存センサ基板および乾燥センサ基板の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5929752

(24)【登録日】2016年5月13日

(45)【発行日】2016年6月8日

(54)【発明の名称】保存センサ基板，並びに、保存センサ基板および乾燥センサ基板の製造方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20160526BHJP

   G01N 33/547 20060101ALI20160526BHJP

   G01N 33/553 20060101ALI20160526BHJP

   C07K 17/14 20060101ALI20160526BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 525W

   G01N33/543 595

   G01N33/547

   G01N33/553

   G01N33/543 525U

   C07K17/14

【請求項の数】11

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2012-504507(P2012-504507)

(86)(22)【出願日】2011年3月10日

(86)【国際出願番号】JP2011055586

(87)【国際公開番号】WO2011111764

(87)【国際公開日】20110915

【審査請求日】2014年3月5日

(31)【優先権主張番号】特願2010-55666(P2010-55666)

(32)【優先日】2010年3月12日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000001270

【氏名又は名称】コニカミノルタ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001070

【氏名又は名称】特許業務法人ＳＳＩＮＰＡＴ

(72)【発明者】

【氏名】山本 法明

(72)【発明者】

【氏名】塚越 正徳

【審査官】 赤坂 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０９−３０４３８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−２４５４００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−１８５４９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１３３８４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００２／０４０９９９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５４３−５５／５５３

Ｃ０７Ｋ １７／１４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生理活性物質がその表面に固定化されたセンサ基板と、
糖類および非特異タンパク質を含み、該生理活性物質を被覆する保存液と、を有し、
前記糖類が、３５０未満の分子量を有することを特徴とする保存センサ基板。

【請求項2】

上記センサ基板が、
透明支持体と；
該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；
該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と；
該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化された上記生理活性物質と
を含んでなるプラズモン励起センサである請求項１に記載の保存センサ基板。

【請求項3】

上記プラズモン励起センサが、さらに、上記ＳＡＭの、上記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層を含み、上記生理活性物質が、該親水性高分子層の、該ＳＡＭと接していないもう一方の表面に固定化されている請求項１または２に記載の保存センサ基板。

【請求項4】

上記生理活性物質が、捕捉対象物質と特異的に結合するタンパク質である請求項１〜３のいずれかに記載の保存センサ基板。

【請求項5】

上記糖類が、単糖，および二糖からなる群から選択される少なくとも１種の糖類である請求項１〜４のいずれかに記載の保存センサ基板。

【請求項6】

上記糖類が、上記保存液に１〜２０重量％含まれる請求項１〜５のいずれかに記載の保存センサ基板。

【請求項7】

上記非特異タンパク質が、ウシ血清アルブミン〔ＢＳＡ〕である請求項１〜６のいずれかに記載の保存センサ基板。

【請求項8】

上記非特異タンパク質が、上記保存液に１〜５重量％含まれる請求項１〜７のいずれかに記載の保存センサ基板。

【請求項9】

上記保存液が、さらに、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕，トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕またはＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕を含む請求項１〜８のいずれかに記載の保存センサ基板。

【請求項10】

少なくとも下記工程（ｉ）を含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の保存センサ基板の製造方法；
工程（ｉ）：上記センサ基板に固定化されている上記生理活性物質に、上記保存液を被覆する工程。

【請求項11】

少なくとも下記工程（ｉ）および（ｉｉ）を含むことを特徴とする乾燥センサ基板の製造方法；
工程（ｉ）：上記センサ基板に固定化されている上記生理活性物質に、上記保存液を被覆することによって、請求項１〜９のいずれかに記載の保存センサ基板を得る工程，および
工程（ｉｉ）：該保存センサ基板に含まれる溶媒を乾燥することによって除去し、乾燥センサ基板を得る工程。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乾燥しても、保存液に含まれる特定の成分によって生理活性物質が失活しない保存センサ基板，並びに、保存センサ基板および乾燥センサ基板の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。

【0003】

例えば、表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕測定技術，表面プラズモン励起増強蛍光分光〔ＳＰＦＳ〕測定技術，水晶発振子マイクロバランス〔ＱＣＭ〕測定技術，金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。

【0004】

ＳＰＲ測定技術は、チップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフトまたは一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着および脱着を検知する測定技術である。

【0005】

ＳＰＦＳ測定技術は、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰〔ＡＴＲ〕する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる測定技術である。

【0006】

ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる測定技術である。

【0007】

また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。

【0008】

これら測定技術においては、いずれの場合も、生理活性物質と検体物質との特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析するため、生理活性物質を固定化する表面が重要となる。

【0009】

生理活性物質は基板表面に、共有結合，リガンド結合，イオン結合，物理吸着，包括法などで固定されているが、基板表面上の生理活性物質は経過時間に伴って劣化し、特に生理活性物質がタンパク質である場合には失活し、特異的な結合反応が低下するという問題があった。

【0010】

このような経時的な劣化は種々の要因が複合的に絡んで生じると考えられるが、乾燥状態にある場合に特に顕著に現れる。

【0011】

よって、乾燥を防ぐため、基板表面の、親水性高分子から形成される親水性高分子層を介して固定した生理活性物質に対して、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さく、かつ水素結合を形成し得る残基を有する化合物（例えば、デキストランなど）を添加し、劣化を防ぐ試みがなされている（特許文献１）が、この方法では、保存液中の該化合物が生理活性物質の結合反応を阻害する問題があった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】特開２００８−１８５４９４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、センサ基板表面に固定化された生理活性物質の保存安定性を向上させた保存センサ基板を提供し、該基板を使用する前の、保存液の除去を容易にする乾燥センサ基板をさらに提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意検討した結果、生理活性物質の保存液として、低分子量の糖類とＢＳＡなどの非特異タンパク質とを含むものを用いた際に、生理活性物質を固定化したセンサ基板の保存安定性が向上し、さらに基板使用前の保存液の除去が容易であることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0015】

すなわち、本発明の保存センサ基板は、生理活性物質がその表面に固定化されたセンサ基板と、糖類および非特異タンパク質を含み、該生理活性物質を被覆する保存液と、を有し、前記糖類が、３５０未満の分子量を有することを特徴とする。

【0016】

上記センサ基板は、透明支持体と；該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と；該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化された上記生理活性物質とを含んでなるプラズモン励起センサであってもよく、該プラズモン励起センサは、さらに、該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層を含み、該生理活性物質が、該親水性高分子層の、該ＳＡＭと接していないもう一方の表面に固定化されていることが好ましい。

【0017】

上記生理活性物質は、捕捉対象物質と特異的に結合するタンパク質であってもよい。

【0018】

上記糖類は、単糖，および二糖からなる群から選択される少なくとも１種の糖類であることが好ましい。

【0020】

上記糖類は、上記保存液に１〜２０重量％含まれることが好ましい。

【0021】

上記非特異タンパク質は、ウシ血清アルブミン〔ＢＳＡ〕であることが好ましい。

【0022】

上記非特異タンパク質は、上記保存液に１〜５重量％含まれることが好ましい。

【0023】

上記保存液は、さらに、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕，トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕またはＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕を含むことが好ましい。

【0024】

本発明の保存センサ基板の製造方法は、少なくとも下記工程（ｉ）を含むことを特徴とする；
工程（ｉ）：上記センサ基板に固定化されている上記生理活性物質に、上記保存液を被覆する工程。

【0025】

本発明の乾燥センサ基板は、上述した本発明の保存センサ基板を乾燥して得られることを特徴とする。

【0026】

また、本発明の乾燥センサ基板の製造方法は、少なくとも下記工程（ｉ）および（ｉｉ）を含むことを特徴とする；
工程（ｉ）：上記センサ基板に固定化されている上記生理活性物質に、上記保存液を被覆することによって、本発明の保存センサ基板を得る工程，および
工程（ｉｉ）：該保存センサ基板に含まれる溶媒を乾燥することによって除去し、乾燥センサ基板を得る工程。

【発明の効果】

【0027】

本発明は、センサ基板表面に固定化された生理活性物質の保存安定性を向上させた保存センサ基板を提供することができる。

【0028】

さらに、本発明は、保存液に含有される糖類が低分子量であることから、速やかに水性溶媒（例えば、測定前に流路に流す洗浄液など）に溶解し、生理活性物質から容易に取り除かれる乾燥センサ基板を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、本発明で用いるプラズモン励起センサの一態様を模式的に表した断面図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

次に、本発明の保存センサ基板，乾燥センサ基板およびこれらセンサ基板の製造方法などについて具体的に説明する。

【0031】

＜保存センサ基板＞
本発明の保存センサ基板は、生理活性物質がその表面に固定化されたセンサ基板と、糖類および非特異タンパク質を含み、該生理活性物質を被覆する保存液とを有することを特徴とする。

【0032】

本発明の保存センサ基板は、保存液などに含まれる溶媒（または液体成分）を乾燥させる工程前のものであり、液体成分が共存していても、乾燥状態の場合と同様に生理活性物質の保存安定性に優れている。

【0033】

〔センサ基板〕
本発明で用いるセンサ基板は、その基板表面に生理活性物質が固定化されていればよく、バイオセンサとして様々な測定・検出に用いることができる。

【0034】

本発明で用いるセンサ基板は、透明支持体と；該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と；該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化された生理活性物質とを含んでなるプラズモン励起センサであってもよい。

【0035】

このようなプラズモン励起センサは、さらに、該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層を含み、該生理活性物質が、該親水性高分子層の、該ＳＡＭと接していないもう一方の表面に固定化されていることが好ましい。

【0036】

〔プラズモン励起センサ〕
図１に示すように、本発明で用いられるプラズモン励起センサ(5)は、その一方の表面に金属薄膜が形成された透明支持体(1)と；該支持体(1)の一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕(2)と；該ＳＡＭ(2)の一方の表面に固定化された生理活性物質(4)とを含むものである。

【0037】

また、このようなプラズモン励起センサ(5)は、さらに、ＳＡＭ(2)の一方の表面に形成された親水性高分子層(3)を含むものであり、生理活性物質(4)が、親水性高分子層(3)の、ＳＡＭ(2)と接していないもう一方の表面に固定化されていてもよい。

【0038】

（透明支持体）
本発明で用いられる「透明支持体」としては、石英製やガラス製であっても、ポリカーボネート〔ＰＣ〕，シクロオレフィンポリマー〔ＣＯＰ〕などのプラスチック製であってもよく、屈折率〔ｎｄ〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。

【0039】

なお、ガラス製の透明支持体は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率〔ｎｄ〕１.５２）および「ＬａＳＦＮ９」（屈折率〔ｎｄ〕1.８５），（株）住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ３」（屈折率〔ｎｄ〕１．８４），「Ｋ−ＬａＳＦｎ１７」（屈折率〔ｎｄ〕１．８８）および「Ｋ−ＬａＳＦｎ２２」（屈折率〔ｎｄ〕１．９０），（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ１０」（屈折率〔ｎｄ〕１．７２）などが光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。

【0040】

透明支持体は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。

【0041】

酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。

【0042】

プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。

【0043】

（金属薄膜）
上記透明支持体の一方の表面に形成された「金属薄膜」としては、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなることが望ましく、これら金属の合金であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。

【0044】

なお、透明支持体としてガラス製平面基板を用いる場合に限り、ガラスと金属薄膜とをより強固に接着することができることから、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。

【0045】

透明支持体上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜を形成することが好ましい。

【0046】

金属薄膜の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。

【0047】

電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。

【0048】

金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。

【0049】

（ＳＡＭ）
ＳＡＭ〔Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜〕は、金属薄膜の透明支持体とは反対側の面に形成され、生理活性物質、好ましくは親水性高分子を金属薄膜に固定する際の土台としての役割を有する。

【0050】

本発明において、このＳＡＭが含む単分子としては、通常、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。

【0051】

ＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属薄膜がその表面に形成されたガラス製の透明支持体を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。

【0052】

（親水性高分子層）
親水性高分子層は、ＳＡＭと生理活性物質との結合を介在するように設けることが好ましい。親水性高分子層を構成する親水性高分子は、多糖類としてカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕等のデキストランが、合成樹脂としてポリアクリル酸が好ましい。これらの高分子は、非特異吸着低減に対する効果が高い官能基として、水酸基〔−ＯＨ〕およびカルボキシル基〔−ＣＯＯＨ〕を有し、水素結合による水分子の内包により非特異タンパク質の吸着を防ぐことができるため好適である。

【0053】

親水性高分子層をＳＡＭ表面に形成する方法としては、例えば、水溶性カルボジイミドである１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３エチルカルボジイミド〔ＥＤＣ〕単独またはＥＤＣとＮ−ヒドロキシこはく酸イミド〔ＮＨＳ〕との併用によって、親水性高分子が有するカルボキシル基を活性化し、ＳＡＭが有するアミノ基と反応させる方法などが挙げられるが、本発明はこの方法に限定されず、公知の方法を適宜用いることができる。

【0054】

（生理活性物質）
生理活性物質は、捕捉対象物質と特異的に結合するタンパク質であってもよく、例えば、抗原と特異的に結合する抗体のように、基質・補酵素に対する酵素，ホルモンに対するレセプタ，抗体に対するプロテインＡ・プロテインＧ，ビオチンに対するアビジン類，カルシウムに対するカルモジュリンなどが挙げられ、これらのうち、「捕捉対象物質と特異的に結合するタンパク質」としては抗体が好ましい。

【0055】

生理活性物質を固定化する方法は、公知の方法、例えば、ＥＤＣ単独またはＥＤＣとＮＨＳとの併用によって、ＳＡＭまたは親水性高分子が有するカルボキシル基を活性化し、アミノ基を有する生理活性物質を固定化する方法などが挙げられる。好ましい生理活性物質としてタンパク質を用いる場合、該タンパク質が失活しない方法であれば、本発明はこれらに限定されない。

【0056】

〔保存液〕
本発明で用いる保存液は、糖類および非特異タンパク質を含むものであり、さらに、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕，トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕またはＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕、ならびにアジ化ナトリウムを極微量含むことが好ましい。

【0057】

（糖類）
糖類は、単糖，二糖，および３〜１０個の単糖から構成されるオリゴ糖からなる群から選択される少なくとも１種の糖類であることが好ましく、その分子量が３５０未満であることがより好ましい。

【0058】

単糖としては、例えば、グルコース（Ｍｗ：１８０），フルクトース（Ｍｗ：１８０），リボース（Ｍｗ：１５０），キシロース（Ｍｗ：１５０），マンノース（Ｍｗ：１８０），ガラクトース（Ｍｗ：１８０），タロース（Ｍｗ：１８０）などが挙げられる。

【0059】

二糖としては、例えば、スクロース，マルトース，ラクトース，セロビオース，トレハロースなどが挙げられる。これら二糖の分子量はいずれも約３４２である。

【0060】

３〜１０個の単糖から構成されるオリゴ糖としては、例えば、ラフィノース（Ｍｗ：５０４），パノース（Ｍｗ：５０４），メレジトース（Ｍｗ：５０４），ゲンチアノース（Ｍｗ：５０４），スタキオース（Ｍｗ：６６７）などが挙げられる。

【0061】

また、糖類は、３５０未満の分子量〔Ｍｗ〕であることが好ましく、分子量〔Ｍｗ〕が３５０未満であると、洗浄液などの水溶性溶媒に溶解し易く、生理活性物質から容易に取り除くことができるため好適である。

【0062】

糖類は、保存液に、好ましくは１〜２０重量％、より好ましくは５〜１２重量％含まれる。糖類の含有量が上記範囲内であると、生理活性物質の保存安定性および洗浄の観点から好適である。

【0063】

（非特異タンパク質）
非特異タンパク質とは、免疫染色等の際に非特異的吸着をブロッキングするために用いられるタンパク質を意味し、例えば、ウシ血清アルブミン〔ＢＳＡ〕，カゼインなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0064】

非特異タンパク質は、保存液に、好ましくは０．１〜５重量％、より好ましくは０．５〜３重量％含まれる。非特異タンパク質の含有量が上記範囲内であると、ブロッキングの観点から好適である。

【0065】

（緩衝液）
保存液に含まれてもよい緩衝液として、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕，トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕またはＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕を用いることができ、これらのうち、好ましくはＰＢＳである。

【0066】

（極微量成分）
保存液には、その他の成分を極微量成分として含んでいてもよい。例えば、アジ化ナトリウムを０．０１〜０．１重量％程度含んでいてもよい。

【0067】

＜乾燥センサ基板＞
本発明の乾燥センサ基板は、上述した本発明のセンサ基板を乾燥して得られることを特徴とする。ここで「乾燥」とは、凍結乾燥であっても自然乾燥であってもよい。

【0068】

乾燥センサ基板の製造から使用までの間に、乾燥センサ基板として保管・輸送することが好適である。

【0069】

一般に、タンパク質などの生理活性物質は、水溶液中で水分子が配位することで三次元構造を維持しているが、乾燥すると三次元構造を保持できず失活する。また、基板表面の親水性高分子中に担持されている場合には、乾燥することで生理活性物質同士が接近し凝集が発生する。本発明で用いる保存液に含有され乾燥後に残留する糖類・非特異タンパク質は、水分子に代って生理活性物質の三次元構造を保持することで失活を抑制するか、または生理活性物質を被覆して立体効果で凝集を抑制することができる。

【0070】

＜保存センサ基板・乾燥センサ基板の製造方法＞
保存センサ基板は、少なくとも下記工程（ｉ）を含むことを特徴とする本発明の製造方法に従って製造することができ、他方、乾燥センサ基板は、保存センサ基板の製造方法において、さらに下記工程（ｉｉ）を含むことを特徴とする。

【0071】

工程（ｉ）：上記センサ基板に固定化されている上記生理活性物質に、上記保存液を被覆することによって、本発明の保存センサ基板を得る工程。

【0072】

工程（ｉｉ）：該保存センサ基板に含まれる溶媒を乾燥することによって除去し、乾燥センサ基板を得る工程。

【0073】

すなわち、本発明の乾燥センサ基板は、本発明の保存センサ基板を製造した後に、該保存センサ基板に対して上記工程（ｉｉ）を施すことによって製造することできる。

【0074】

〔工程（ｉ）〕
工程（ｉ）とは、上記センサ基板に固定化されている上記生理活性物質に、上記保存液を被覆することによって、本発明の保存センサ基板を得る工程である。

【0075】

保存液を用いて、生理活性物質を被覆する方法として、センサ基板表面に保存液を満たしてもあるいは塗布してもよい。

【0076】

センサ基板上で生理活性物質を隙間なくばらつきなく被覆できることから、基板上に保存液を満たす方法がより好ましい。

【0077】

保存液の、センサ基板単位面積当りの使用量は、生理活性物質の固定化量や保存液に含有される糖類・非特異タンパク質の濃度に応じて適宜調整することができるが、例えば、０．５〜５μＬ／ｍｍ²が好ましい。

【0078】

また、保存液として、糖類が溶解している保存液と非特異タンパク質が溶解している保存液とを別個に用意し、それぞれの被覆処理が連続していれば、一方を用いて生理活性物質を被覆した後に他方を用いてさらに該生理活性物質を被覆することもできる。

【0079】

〔工程（ｉｉ）〕
工程（ｉｉ）とは、工程（ｉ）で得られた保存センサ基板に含まれる溶媒を乾燥することによって除去し、乾燥センサ基板を得る工程である。

【0080】

溶媒（または液体成分）は、乾燥によって除去するが、乾燥する方法としては、上述したように、凍結乾燥であっても自然乾燥であってもよく、本発明においては特に限定されない。

【0081】

＜使用方法＞
本発明の乾燥センサ基板は、通常、測定前に予め洗浄液を流し、保存液に含有されている糖類・非特異タンパク質を取り除くが、低分子量の糖類は容易に試料溶液に溶解することから、直接試料溶液を流して用いることもできる。

【実施例】

【0082】

次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

【0083】

[実施例１]
(１)センサ基板の作製
工程（ａ）：屈折率〔ｎｄ〕１．７２，厚さ１ｍｍのガラス製の透明支持体（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ １０」）をプラズマ洗浄し、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ，金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。

【0084】

工程（b1）：工程（ａ）で得られた支持体を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭを形成した。支持体を該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。

【0085】

工程（ｄ）：該工程（b1）で得られた支持体表面に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を２５ｍｇ／ｍＬと、水溶性カルボジイミド〔ＥＤＣ〕を２５ｍｇ／ｍＬとを含むＭＥＳ〔2-morpholinoethanesulfonic acid〕緩衝生理食塩水（ｐＨ５．０）を０．８ｍＬ滴下し、２０分間反応させた後、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（１Ｄ５，２．５ｍｇ／ｍＬ；（株）日本医学臨床検査研究所製）を含むＡｃｅｔａｔｅ溶液（ｐＨ６．０）０．８ｍＬを３０分間反応させることで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。

【0086】

工程（ｅ）：次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）０．８ｍＬを１５分間反応させることで、未反応の活性化エステル基をブロッキングし、１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＴＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間反応させることで、非特異的吸着防止処理を行った。

【0087】

（２）乾燥センサ基板の製造
（１）で得られたセンサ基板上に、保存液としてスクロース（ＳＩＧＭＡ社）を３重量％およびＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳ ０．８ｍＬを滴下し、1時間静置した後ピペットを用いて除去し、自然乾燥させた。

【0088】

（３）４週間後抗体活性残存率の測定
（２）で得られた乾燥センサ基板を２枚製造し、その抗体の抗原結合活性を、一方は製造後直ちに、もう片方は密閉した容器に封入し４０℃で４週間保存した後に、以下のようにして４週間後抗体活性残存率を測定した。

【0089】

はじめに、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳ ０．８ｍＬで３回洗浄した。次いで、標的抗原として０．１ｎｇ／ｍＬのＡＦＰを含有する１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液８００μＬを２５分間接触させた。Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳ ０．８ｍＬで３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を標識した２次抗体（１,０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製した１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を０．８ｍＬ添加し、２０分間反応させた。

【0090】

その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳ ０．８ｍＬで３回洗浄した。それぞれの乾燥センサ基板に、ガラス製の透明支持体の、金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６３３ｎｍ，１０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量をＣＣＤイメージセンサから観察したときのシグナル値を計測し「アッセイ測定シグナル」とした。

【0091】

なお、ＡＦＰが０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルを「ブランクシグナル」とした。アッセイ測定シグナルとブランクシグナルとから、アッセイシグナルを以下の式で評価した。

【0092】

アッセイシグナル＝｜（アッセイ測定シグナル）−（ブランクシグナル）｜
得られた結果を表１に示す。

【0093】

[実施例２]
（１）センサ基板の作製
工程（b2）：実施例１（１）工程（ａ）で得られた支持体を、１１−アミノ−１−ウンデカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭを形成した。支持体を該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。

【0094】

工程（ｃ）：次いで、ＳＡＭ上にＣＭＤからなる親水性高分子層（以下「ＣＭＤ層」ともいう。）を形成するために、１ｍｇ／ｍＬのＣＭＤ−５００−０６Ｉ４（名糖産業（株）製：平均分子量５０万，置換度０．５１）を含む２５ｍＭのＭＥＳ緩衝生理食塩水，１０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）に、最終濃度がそれぞれ０．５ｍＭになるようにＥＤＣおよびＮＨＳを加え、攪拌後直ちにＳＡＭが形成された支持体表面に滴下し、室温で１．５時間反応させた。その後、１ＮのＮａＯＨ水溶液０．８ｍＬを添加し３０分間反応させ、超純水０．８ｍＬで３回洗浄することによって、ＣＭＤ表面支持体を製造した。

【0095】

工程（ｄ）：実施例１（１）の工程（ｄ）において、同工程（b1）で得られた支持体の代わりに、実施例２（１）の工程（ｃ）で得られたＣＭＤ表面支持体を用いた以外は同様にしてＣＭＤ層に１次抗体を固相化した。

【0096】

工程（ｅ）：実施例１（１）の工程（ｅ）と同様にして、非特異的吸着防止処理を行った。

【0097】

（２）乾燥センサ基板の製造
実施例１において、実施例１（１）で得られたセンサ基板の代わりに、実施例２（１）で得られたセンサ基板を用いた以外は実施例１（２）と同様にして乾燥センサ基板を製造した。

【0098】

（３）４週間後抗体活性残存率の測定
実施例１において、実施例１（２）で得られた乾燥センサ基板の代わりに、実施例２（２）で得られた乾燥センサ基板を用いた以外は実施例１（３）と同様にして、乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0099】

[実施例３]
実施例１において、保存液に含まれるスクロースの濃度を３重量％から１０重量％に変更した以外は、実施例１と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0100】

[実施例４]
実施例２において、保存液に含まれるスクロースの濃度を３重量％から１０重量％に変更した以外は、実施例２と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0101】

[実施例５]
実施例１において、保存液に含まれるスクロースの濃度を３重量％から２０重量％に変更した以外は、実施例１と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0102】

[実施例６]
実施例２において、保存液に含まれるスクロースの濃度を３重量％から２０重量％に変更した以外は、実施例２と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0103】

[実施例７]
実施例１において、保存液に含まれる３重量％のスクロースの代わりに１０重量％のトレハロースを用いた以外は、実施例１と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0104】

［実施例８]
実施例２において、保存液に含まれる３重量％のスクロースの代わりに１０重量％のトレハロースを用いた以外は、実施例２と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0105】

[比較例１]
実施例１の（２）乾燥センサ基板の製造において、センサ基板を保存液で被覆しなかった以外は実施例１と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0106】

[比較例２]
実施例２の（２）乾燥センサ基板の製造において、センサ基板を保存液で被覆しなかった以外は、実施例２と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0107】

[比較例３]
実施例１において、保存液に含まれる３重量％のスクロースの代わりに１０重量％のＣＭＤ（分子量４万）を用いた以外は、実施例１と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。乾燥センサ基板の製造直後からアッセイ測定シグナルはブランクシグナルとほぼ同じでアッセイシグナルは得られなかった。そのため４週間後抗体活性残存率は得られず、その結果を表１中に（−）で表す。

【0108】

[比較例４]
実施例２において、保存液に含まれる３重量％のスクロースの代わりに１０重量％のＣＭＤ（分子量４万）を用いた以外は、実施例２と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。比較例３と同様にアッセイシグナルは得られなかった。４週間後抗体活性残存率の結果を、表１中に（−）で表す。

【0109】

[比較例５]
実施例３において、ＢＳＡを含まない保存液を用いた以外は、実施例３と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0110】

[比較例６]
実施例４において、ＢＳＡを含まない保存液を用いた以外は、実施例４と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0111】

[比較例７]
実施例１において、スクロースを含まない保存液を用いた以外は、実施例１と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0112】

[比較例８]
実施例２において、スクロースを含まない保存液を用いた以外は、実施例２と同様にして乾燥センサ基板の製造直後および４週間後のアッセイ測定シグナルを計測した。４週間後抗体活性残存率の結果を表１に示す。

【0113】

【表1】

表１に示すように、スクロースまたはトレハロースとＢＳＡとをともに含有する保存液を被覆する実施例１〜８において、乾燥センサ基板製造直後と、乾燥センサ基板製造して４０℃で４週間保存した後との抗体活性は同等、すなわち残存率が１００％であった。

【0114】

実施例１〜８において、ＢＳＡを用いる際にその含有量を１重量％に固定した態様のみを示したが、ＢＳＡの含有量を３重量％や５重量％に変更した場合も、表１に示した４週間抗体活性残存率は同様に１００％であった。

【0115】

一方で、保存液で被覆しなかった比較例１，２では、４週間後には抗体活性が１０％以下に低下していた。また、分子量４万のＣＭＤを１０重量％およびＢＳＡを１重量％含有する保存液で被覆した比較例３，４は、センサ基板製造直後に抗体活性が低下してしまっていた。さらに、実施例１，２で用いた保存液においてＢＳＡまたはスクロースを含まない保存液をそれぞれ用いた比較例５〜８では、比較例１，２と同様に、４週間後には抗体活性が１０％以下に低下していた。

【産業上の利用可能性】

【0116】

本発明のセンサ基板を乾燥することによって得られた本発明の乾燥センサ基板は、保存安定性に優れていることから、製品化することが容易となる。

【符号の説明】

【0117】

１・・・・・・その一方の表面に金属薄膜が形成された透明支持体
２・・・・・・自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕
３・・・・・・親水性高分子層
４・・・・・・生理活性物質
５・・・・・・プラズモン励起センサ

【図1】