特許 5929907 ピロロキノリンキノンと糖を含むリポソーム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5929907

(24)【登録日】2016年5月13日

(45)【発行日】2016年6月8日

(54)【発明の名称】ピロロキノリンキノンと糖を含むリポソーム

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4745 20060101AFI20160526BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20160526BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20160526BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20160526BHJP

   A61P 3/02 20060101ALI20160526BHJP

   A61P 27/12 20060101ALI20160526BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20160526BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20160526BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160526BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160526BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20160526BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20160526BHJP

   A23L 33/15 20160101ALN20160526BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/4745

   A61K47/26

   A61K47/24

   A61K9/127

   A61P3/02

   A61P27/12

   A61P1/16

   A61P37/00

   A61P43/00 111

   A61P35/00

   A23L1/30 Z

   C12N1/00 F

   !A23L1/302

【請求項の数】10

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2013-515202(P2013-515202)

(86)(22)【出願日】2012年5月17日

(86)【国際出願番号】JP2012062704

(87)【国際公開番号】WO2012157721

(87)【国際公開日】20121122

【審査請求日】2015年3月9日

(31)【優先権主張番号】特願2011-110639(P2011-110639)

(32)【優先日】2011年5月17日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000004466

【氏名又は名称】三菱瓦斯化学株式会社

(72)【発明者】

【氏名】池本 一人

【審査官】 上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５３０７８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２２１２０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０２２９１１４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０１８６０７７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／００４４３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５０８９１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５０１９１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第５６７２７５１（ＪＰ，Ｂ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ９／００−７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

脂質成分として水素添加大豆リン脂質を含むリポソーム組成物であって、該リポソーム組成物におけるリポソームが、下記式（１）：

【化1】

で表されるピロロキノリンキノンまたはその塩、および糖を含有し、かつ、１〜１０μｍ
の粒子径のリポソームが４５％以上であり、糖がグルコース、ショ糖及びソルビトールからなる群から選択される糖である、リポソーム組成物。

【請求項2】

リポソームの体積平均粒子経が、０．５〜２０μｍである、請求項１に記載のリポソー
ム組成物。

【請求項3】

請求項１又は２に記載のリポソーム組成物を含んでなる、食品。

【請求項4】

請求項１又は２のいずれか一項に記載のリポソーム組成物を含んでなる、医薬品。

【請求項5】

請求項１又は２のいずれか一項に記載のリポソーム組成物を含んでなる、培地。

【請求項6】

下記式（１）：

【化2】

で表されるピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、水素添加大豆リン脂質とを含んでなる４０〜１９０℃の溶液を調製することを含んでなり、糖がグルコース、ショ糖及びソルビトールからなる群から選択される糖である、リポソーム組成物の製造方法。

【請求項7】

溶液のｐＨが、８以下である、請求項６に記載の製造方法。

【請求項8】

溶液におけるピロロキノリンキノンまたはその塩の濃度が、０．０００１〜２重量％で
あり、糖が０．５〜５０重量％である、請求項６に記載の製造方法。

【請求項9】

溶液におけるピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、水素添加大豆リン脂質との重量比が、１：１〜２００：０．１〜３０である、請求項６に記載の製造方法。

【請求項10】

溶液をホモジナイズする工程をさらに含んでなる、請求項６に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の参照】

【0001】

本特許出願は、２０１１年５月１７日に提出された日本出願である特願２０１１−１１０６３９の利益を享受する。これらの先の出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

【技術分野】

【0002】

本発明はピロロキノリンキノンを含むリポソーム技術に関する。具体的には、ピロロキノリンキノンの機能が発揮される濃度範囲の拡大を可能とするリポソーム組成物およびその製造方法に関する。

【背景技術】

【0003】

ピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱと記すことがある）は新しいビタミンの可能性があることが提案され、栄養機能を強化した食品、健康補助食品、化粧品などに有用な物質として注目を集めている。さらには、ＰＱＱは細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱについては、近年までに、細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギ−作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラ−ゼＩ阻害作用−制癌作用など多くの生理活性が明らかにされている。

【0004】

このＰＱＱは、有機化学的合成法または発酵法などの方法により得たＰＱＱをクロマトグラフィーに供し、流出液中のＰＱＱ区分を濃縮して、晶析により結晶化し、乾燥して得ることができる。

【0005】

リポソームとは通常はリン脂質からなる脂質の膜でできたカプセル構造のことをいい、中に水相が閉じこめられている。リン脂質の分子は松葉のような形をしていて、頭の部分が親水性、葉のように見える部分が疎水性という２つの性質を併せ持っているので、水に放たれると親水性の部分が水と引きつけあい、リポソームを形成する。リポソームは、水溶性の成分をその親水性の部分に、油溶性の成分をその疎水性の部分に閉じこめることができる。リポソームは薬剤を投与する方法として主に医学の分野で注目されており、吸収性の向上や分散性の向上、安定性の向上等の利点が一般的に知られ、経口、皮膚に塗布する用途で広く使用されている。

【0006】

これまでにＰＱＱを繊維芽細胞の培養液に添加することでＤＮＡの合成、増殖に効果があることが知られている（非特許文献１，２）。この増殖作用は細胞の活性化であり、化粧品、食品での応用が期待される分野である。この作用は一定の濃度範囲で作用するが、その濃度の低減化と広い範囲での使用が求められている。広い範囲での使用することができると、管理が容易となり、化粧品、食品、培地等の組成の設計を容易にすることができる。例えば、細胞の種類が変わるとその有用性を発揮する濃度が変わり、使用に合わせて濃度を変えなければならないが、そのような作業は労力を有し、また、化粧品などではその使い分けは困難である。また、高濃度で使用すると増殖阻害の危険性が高くなり、特に吸収を上げたリポソームではその危険性を下げる技術が求められている。

【0007】

リポソーム化は一般に使用する薬剤の吸収率を高めるために使用される。しかし、その濃度範囲の拡大については知られておらず、特にＰＱＱ特有の細胞増殖性の増強に対する効果は知られていない。

【0008】

これまで、ＰＱＱを電子メディエーターとして使用し、酵素をリポソームとして固定する燃料電池は開発されている（特許文献１）。また、Ｓ-ニトロシル化合物を哺乳類に投与するための組成物として提案されているが、具体的な例はなく、製造方法についても記載がない（特許文献２）。同様にＰＱＱをリポソームにして投与できる、または、リポソームにして加えることができると記載された文献がある（特許文献３，４，５）。しかし、具体的な例はなく、これらの文献では本発明で求められている問題の解決を行うことはできない。リン脂質はそのままでは粘度が高く、リポソームにするにはクロロホルムのような溶剤に溶かし、フラスコ内部に液膜を形成して超音波で分散する方法が一般的であるが、この方法は生産性が低く、また、溶剤が残留する危険性がある。このように、ＰＱＱを含有するリポソームの提供とそれにより機能性が向上した組成物、その製造方法が求められている。また、ＰＱＱのさらなる吸収能力の向上や機能性の向上が求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特表２００６−５０８５１９号公報

【特許文献2】特表２００１−５１８０９６号公報

【特許文献3】特開２００９―２２１２０６号公報

【特許文献4】特開２００６―３３５６５１号公報

【特許文献5】特表２００５―５３０７８６号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Life Science, Vol 52, p1902-1915 (1993)

【非特許文献2】Int. J. Molecular Med., vol 19, 765-770 (2007)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明者らは、ピロロキノリンキノンと、糖と、脂質成分とを含んでなる４０℃以上の溶液を調製することにより得られた、リポソームにピロロキノリンキノンと糖を含有し、かつ、１〜１０μｍの粒子径のリポソームが４５％以上であるリポソーム組成物が、広い濃度範囲で細胞増殖促進機能を発揮することを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。

【0012】

ピロロキノリンキノンが機能を発揮する濃度範囲の拡大を可能とするリポソーム組成物およびその効率的な製造方法の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）リポソーム組成物であって、該リポソーム組成物におけるリポソームが、下記式（１）：

【化1】

で表されるピロロキノリンキノンまたはその塩、および糖を含有し、かつ、１〜１０μｍの粒子径のリポソームが４５％以上である、リポソーム組成物。
（２）リポソームの体積平均粒子経が、０．５〜２０μｍである、（１）に記載のリポソーム組成物。
（３）糖が、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、および糖アルコールからなる群から選択される、（１）に記載のリポソーム組成物。
（４）糖が、ソルビトールまたはキシリトールである、（１）に記載のリポソーム組成物。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のリポソーム組成物を含んでなる、食品。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載のリポソーム組成物を含んでなる、医薬品。
（７）（１）〜（４）のいずれかに記載のリポソーム組成物を含んでなる、培地。
（８）下記式（１）：

【化2】

で表されるピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分とを含んでなる４０〜１９０℃の溶液を調製することを含んでなる、リポソーム組成物の製造方法。
（９）溶液のｐＨが、８以下である、（８）に記載の製造方法。
（１０）溶液におけるピロロキノリンキノンまたはその塩の濃度が、０．０００１〜２重量％であり、糖が０．５〜５０重量％である、（８）に記載の製造方法。
（１１）溶液におけるピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分との重量比が、１：１〜２００：０．１〜３０である、（８）に記載の製造方法。
（１２）溶液をホモジナイズする工程をさらに含んでなる、（８）に記載の製造方法。
（１３）（８）に記載の製造方法により製造される、リポソーム組成物。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、細胞増殖促進機能を発揮する濃度範囲が広く、安定性の高いＰＱＱを含むリポソーム組成物及びその効率的な製造方法を提供できる点で有利である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】実施例１の２％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。

【図2】実施例２の１０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。

【図3】実施例３の２０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。

【図4】実施例４の４０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。

【図5】比較例１の０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。

【図6】比較例２の１０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。

【図7】比較例３の小粒子径１０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。

【図8】培養細胞を使用した増殖性試験を示した図である。

【図9】実施例５の１０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本願明細書において、「リポソーム」とは、脂質二重層からなり内部に水相をもつ閉鎖小胞を意味する。

【0017】

本願明細書において、「リポソーム組成物」とは、複数のリポソームから構成されるものを意味する。リポソーム組成物は、好ましくは、リポソーム分散液である。

【0018】

本発明において、リポソームは、リポソーム膜の内部に下記式（１）の構造のＰＱＱのフリー体若しくはその塩及び糖を含む。

【化3】

【0019】

本発明において用いられるピロロキノリンキノンは、ピロロキノリンキノン（フリー体）として使用することもできるし、ピロロキノリンキノンの塩として使用することもできる。

【0020】

本発明において用いられる「ピロロキノリンキノンの塩」としてはピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩が挙げられるが、好ましくは、アルカリ金属塩である。

【0021】

本発明において用いられるピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、セシウム、ルビジュウムなどの塩が挙げられる。好ましくは、入手しやすい点で、ナトリウム塩およびカリウム塩がより好ましい。ピロロキノリンキノンは、１〜３個のアルカリ金属で置換されるピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩であってよく、モノアルカリ金属塩、ジアルカリ金属塩、トリアルカリ金属塩のどれでも良いが、好ましくは、ジアルカリ金属塩である。ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩として、特に好ましくは、ジナトリウム塩およびジカリウム塩である。

【0022】

本発明において用いられるピロロキノリンキノンまたはその塩は、特に入手しやすい、フリー体、ジナトリム体、ジカリウム体が使用しやすい。

【0023】

本発明において用いられるピロロキノリンキノンまたはその塩は、市販されているものを入手することができるし、公知の方法により製造することができる。

【0024】

糖は水溶性であることが好ましく、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖類、糖アルコールが使用できる。具体的には、単糖として、グリセリンアルデヒド、トレオース、アラビノース、キシロース、リボース、リブロース、キシルロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、タガトース、アロース、アルトース、グロース、イドース、タロース、ソルボース、プシコース、果糖等が挙げられる。二糖としては、トレハロース、ショ糖、乳糖等が挙げられる。オリゴ糖としては、マルトトリオース、ラフィノース、シクロデキストリンが挙げられる。多糖類としては、水あめ、水素化水あめ等が挙げられる。糖アルコールとしては、トレイトール、エリトリトール、アドニトール、アラビトール、キシリトール、タリトール、ソルビトール、マンニトール、イジトール、ズルシトール、イノシトール等が挙げられる。好ましくは、単糖、二糖および糖アルコールであり、より好ましくは糖アルコールである。単糖は、好ましくは、グルコースである。二糖は、好ましくは、ショ糖である。糖アルコールは、好ましくは、ソルビトール、キシリトールである。糖アルコールは一般的な糖類や水あめに水素添加して作られ、活性なカルボニル基を有していない。そのため、酸や熱に安定でカロリーが低い。糖を添加することでＰＱＱの機能性を発揮する濃度範囲を拡大することができる。

【0025】

本発明において用いられる糖は、市販されているものを入手することができるし、公知の方法により製造することができる。

【0026】

リポソーム（リポソーム膜）は、脂質成分から構成され、例えば、リン脂質又は糖脂質が単独又は混合されて構成される。

【0027】

リン脂質としては、生体に含まれるリン脂質の主成分にホスファチジルコリンがあり、レシチンとも呼ばれる。リン脂質としては、卵黄レシチン、大豆レシチン、精製大豆レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、ジセチルリン酸、ステアリルアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトールアミン、カルジオリピン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、およびこれらの混合物等が使用できる。リン脂質は、精製されたものを用いることが好ましい。

【0028】

本発明において、リン脂質としては市販のホスファチジルコリンを用いることができる。例えば、日油製ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣ−２１（水素添加大豆リン脂質、ＰＣ含量９０％以上）、日光ケミカルズ製ＮＩＫＫＯＬ レシノール Ｓ−１０ＥＸ（水素添加大豆リン脂質、ＰＣ含量９５％以上）を用いることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチン、精製大豆レシチン、水素添加大豆リン脂質が入手しやすく好ましい。

【0029】

糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステル、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドＧ７、ガングリオシドＧ６、ガングリオシドＧ４、ジガラクトシルセラミド、およびこれらの混合物等を用いることができる。

【0030】

リポソームの膜構成成分としてリン脂質や糖脂質の脂質と共にステロールを添加してもよい。添加量は、リン脂質或いは糖脂質に対して１／５重量が好ましい量の上限であり、１／１０重量が更に好ましい。ステロールとしては、コレステロールが最も好ましいが、その他のステロールを使用してもよい。

【0031】

リポソームは、一般的な定法により製造することが可能である。例えば、レシチンを有機溶剤、例えば、クロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、フラスコの壁面に付着した脂質のフィルムにＰＱＱ溶液を加えて製造することができる。しかし、この方法は操作が複雑で、毒性のある有機溶媒が残留する危険性があるうえに、そのための分析も必要になるために費用がかかるため、最適とは言えない。

【0032】

本発明によるリポソーム組成物は、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分とを含んでなる４０〜１９０℃の溶液を調製することにより製造することができる。

【0033】

溶液は、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分、溶媒とを混合することにより得ることができる。典型的には、溶媒に、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分とを添加することにより実施することができる。添加の順序は特に限定されない。

【0034】

用いられる溶媒は、反応が進行すれば特に限定されず、水、エタノール等を使用することができるが、製品に残留しても大きな問題とならないという点から、水（水溶液）が好ましい。

【0035】

溶液におけるピロロキノリンキノンまたはその塩の濃度は、例えば、０．０００１〜２重量％とすることができるが、好ましくは、０．０１〜１．５重量％、より好ましくは、０．１〜１重量％である。

【0036】

溶液における糖の濃度は、例えば、０．５〜５０重量％とすることができるが、好ましくは、２〜５０重量％、より好ましくは、５〜３０重量％、さらに好ましくは、１０〜２０重量％である。

【0037】

溶液において、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖との重量比は、１：０．１〜２００、好ましくは、１：１〜２００、より好ましくは、１：１〜１００、さらに好ましくは、１：１０〜１００、特に好ましくは、１：３０〜７０とすることができる。

【0038】

溶液における脂質成分の濃度は、０．００１〜１０重量％とすることができる。例えば、脂質成分としてリン脂質を使用する場合は、０．００１〜１０重量％とすることができるが、好ましくは、０．０１〜８重量％、より好ましくは、０．１〜５重量％である。

【0039】

溶液において、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、脂質成分との重量比は、１：０．１〜３０、好ましくは、１：１〜２０とすることができる。

【0040】

溶液において、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分との重量比は、１：０．１〜２００：０．１〜３０、好ましくは、１：１〜２００：０．１〜３０、より好ましくは、１：１〜１００：１〜２０、さらに好ましくは、１：１０〜１００：１〜２０、特に好ましくは、１：３０〜７０：１〜２０とすることができる。特には、溶液において、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、リン脂質との重量比は、１：０．１〜２００：０．１〜３０、好ましくは、１：１〜２００：０．１〜３０、より好ましくは、１：１〜１００：１〜２０、さらに好ましくは、１：１０〜１００：１〜２０、特に好ましくは、１：３０〜７０：１〜２０とすることができる。

【0041】

得られた溶液のｐＨは、ｐＨ８以下とすることができるが、好ましくは、ｐＨ１〜６、より好ましくは、ｐＨ２〜５、さらに好ましくは、ｐＨ３〜４とすることができる。ｐＨを調整するために、酸性物質（例えば、塩酸、酢酸等）やアルカリ性物質（例えば、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム等）を使用することができる。

【0042】

得られた溶液の温度は、室温から１９０℃、好ましくは、４０〜１９０℃、より好ましくは、６０〜１９０℃、さらに好ましくは、６０〜１５０℃、さらにより好ましくは、６０〜１２０℃、特に好ましくは、６０〜１００℃、特により好ましくは、６０〜８０℃とすることができる。この温度は、溶媒の温度を調整することにより調整することができる。

【0043】

得られた溶液は、温度調整工程に供することができる。温度の「調整」は、得られた溶液の温度を考慮して、加温（温度の維持も含む）、放置、または冷却して行うことができる。具体的には、得られた溶液を、４０〜１９０℃、好ましくは、６０〜１９０℃、より好ましくは、６０〜１５０℃、さらに好ましくは、６０〜１２０℃、さらにより好ましくは、６０〜１００℃、特に好ましくは、６０〜８０℃に調整することができる。

【0044】

溶液の温度は、予め６０〜１９０℃（より好ましくは、６０〜１５０℃、さらに好ましくは、６０〜１２０℃、さらにより好ましくは、６０〜１００℃、特に好ましくは、６０〜８０℃）の溶液を得て、その温度を６０℃以上（６０〜１９０℃、好ましくは、６０〜１５０℃、より好ましくは、６０〜１２０℃、さらにより好ましくは、６０〜１００℃、特に好ましくは、６０〜８０℃）で維持することが好ましい。

【0045】

温度調整された溶液は、さらにホモジナイズ工程に供することができる。ホモジナイズ工程とは、得られた溶液中の成分を高分散化する工程を意味する。

【0046】

ホモジナイズ工程において、溶液は、調整された温度、すなわち、４０〜１９０℃、好ましくは、６０〜１９０℃、より好ましくは、６０〜１５０℃、さらに好ましくは、６０〜１２０℃、さらにより好ましくは、６０〜１００℃、特に好ましくは、６０〜８０℃で維持することができる。

【0047】

ホモジナイズ工程においては、ホモジナイザー（乳化機）を使用することができる。乳化機のうち、攪拌乳化機としては、株式会社日本精機製作所社製 ＮＩＳＳＥＩ ＡＭー３ホモジナイザー、ＩＫＡ製 ウルトラタックスＴ２５等を用いることができる。

【0048】

ホモジナイズ工程においては、高圧乳化機も使用することができる。高圧乳化機としてはプライミクス製 薄膜旋回型高速ホモミキサー（Ｔ．Ｋフィルミックス）、マイクロフルイディックス製 超高圧ホモジナイザー（マイクロフルイダイザー）、エム・テクニック製 内部せん断力型ミキサー（クレアミックス）、吉田機械興業製 湿式メディアレス微粒化装置（ナノマイザー）等を用いることができる。

【0049】

ホモジナイズの条件は、使用する装置に基づいて、適宜決定することができるが、例えば、株式会社日本精機製作所社製 ＮＩＳＳＥＩ ＡＭー３ホモジナイザーを使用する場合は、０．５〜１８０分（好ましくは、１〜６０分）で、１０００〜１００００回転で行うことができる。

【0050】

ホモジナイズ工程は、さらに室温で行うことができる。ホモジナイズの方法や条件は、上記の通りであるが、ホモジナイズ工程の時間は、好ましくは１０分以下である。

【0051】

好ましくはＰＱＱを０．０００１〜２重量％と糖を２から５０重量％になるように溶解した水溶液に、必要に応じステロール、多価アルコール、ｐＨ調整剤を加え、６０〜１９０℃に加温し、ホモジナイザーにより分散することにより製造できる。ホモジナイザーを使用することで高い生産性で作ることが可能である。ここでＰＱＱの上限濃度は溶解度の限度であり、これより高いと析出しやすく、下限濃度より低いとＰＱＱの機能が期待できない。

【0052】

ＰＱＱはアルカリ性では安定性が低いため、ｐＨは８以下が好ましく、より好ましくは１から６である。８よりｐＨが高い場合はＰＱＱが分解する。酸性にするのは安定性の面では問題がないが溶解性が下がるために高含有にするのが困難になる。

【0053】

上記工程を経て、本発明のリポソーム組成物を得ることができる。

【0054】

本発明において、リポソームの粒子径は、一般的なリポソームの粒子径の０．５から１００μｍを使用することができる。より好ましくはリポソームの粒子径が１から１０μｍである。

【0055】

本発明において、リポソームは、全リポソームに対し、１〜１０μｍの粒子径が４５％以上含まれることが好ましく、より好ましくは、５０％以上、さらに好ましくは８０ー１００％、特に好ましくは、９０〜１００％である。ここで、「％」は、「体積％」を意味する。小さなリポソーム（例えば、０．１〜０．９μｍの粒子径のリポソーム）は吸収性を上げる効果は高いが、ピロロキノリンキノンがその機能を発揮する濃度範囲を広げる効果は低い。大きなリポソーム（例えば、２０〜２００μｍの粒子径のリポソーム）は吸収性向上の機能が低く、製造も難しく好ましくない。

【0056】

本発明において、リポソームの体積平均粒子径は、０．５〜２０μｍとすることができ、好ましくは、１〜１０μｍである。

【0057】

本発明において、粒子径は、公知の機器を用いて測定することができる。例えば、粒度分布測定器（例えば、セイシン企業社製ＳＥＩＳＨＩＮ ＬＭＳ−３５０）を用いて測定することができる。

【0058】

尚、本発明における粒子径は、実施例に記載している様に、リポソームを水に分散させた状態で測定したものである。

【0059】

リポソームの粒子径は、上述のように、原料の選択、製造条件等で制御することができる。あるいは、いったん製造したリポソームをフィルター等でろ過することで制御することは容易である。また、透析、凍結融解、凍結乾燥、遠心分離等の処理を施すことでリポソームの精製やサイズのコントロールを行うことができる。

【0060】

リポソームは小さなものが吸収性に優れることが広く知られているが、本発明は大きなサイズで吸収性が優れる。更に、ＰＱＱ特有の機能が発揮される最適な濃度範囲を広げることが可能となる。

【0061】

本願発明において、ピロロキノリンキノンの「機能」とは、細胞増殖促進機能、抗酸化性を意味するが、特には、細胞増殖促進機能である。

【0062】

本発明のリポソームは、リポソームと共にＰＱＱのフリー体若しくはその塩及び糖が外在したリポソーム組成物の形態でも良い。リポソーム組成物を調製する際に、本発明の効果を損なわない範囲で他のステロール、ポリオキシエチレンステロールエーテル、多価アルコール、ｐＨ調整剤、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、油剤、保湿剤、水溶性高分子、抗酸化剤、紫外線吸収剤、キレート剤、防腐剤、抗菌剤、着色剤、香料等を配合することができる。また、コエンザイムＱ１０、アスコルビン酸誘導体、トコフェロール、アラキドン酸、ＤＨＡ、レチノール誘導体等のビタミン類やイチョウエキス、カンカエキス等の植物抽出液等を配合しても良い。

【0063】

本発明のリポソーム組成物は、水溶液、水中油型乳化組成物、油中水型乳化組成物、多重乳化組成物、多層状剤のいずれでもよい。ここで、水溶液とは、リポソームが分散した水溶液を意味する。

【0064】

リポソーム組成物には、更に、薬剤学的に許容されている他の製剤素材を常法により適宜添加混合してもよい。添加しうる製剤素材としては特に限定されず、例えば、乳化剤、緊張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、矯臭剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤などが挙げられる。

【0065】

本発明のリポソーム組成物の保存方法としては、特に限定されず、例えば、低温保存、密閉容器による嫌気的保存、遮光保存などを用いることができる。こうして調製される本発明の組成物は、冷蔵あるいは室温で保存した際に、析出物なく安定に保存できる。

【0066】

本発明のリポソームは、医療用、化粧用、食品用、園芸用、酪農用など広い範囲で使用できる。具体的な形態としては注射剤、輸液、液剤、点眼剤、内服用液剤、ローション剤、ヘヤートニック、化粧用乳液、スプレー液、エアロゾル、ドリンク液、液体肥料、保存用溶液などが挙げられる。

【0067】

動物細胞の培養は研究や医薬品製造に使用されるが、その培地に添加することで抗体医薬の生産や実験を効率的に行うことが可能になる。

【0068】

本発明の好ましい態様によれば、リポソーム組成物であって、該リポソーム組成物におけるリポソームが、ピロロキノリンキノンまたはその塩、並びに、単糖、二糖、および糖アルコールからなる群から選択される糖を含有し、かつ、１〜１０μｍの粒子径のリポソームが５０％以上である、リポソーム組成物が提供される。

【0069】

本発明のより好ましい態様によれば、リポソーム組成物であって、該リポソーム組成物におけるリポソームが、ピロロキノリンキノンまたはその塩、並びに、単糖、二糖、および糖アルコールからなる群から選択される糖を含有し、かつ、１〜１０μｍの粒子径のリポソームが９０％以上である、リポソーム組成物が提供される。

【0070】

本発明の好ましい態様によれば、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、単糖、二糖、および糖アルコールからなる群から選択される糖と、リン脂質とを含んでなるｐＨ８以下であり、かつ、６０〜１２０℃（好ましくは、６０〜８０℃）の溶液を調製し、当該溶液をホモジナイズする工程を含んでなるリポソーム組成物の製造方法が提供される。

【0071】

本発明のより好ましい態様によれば、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、単糖、二糖、および糖アルコールからなる群から選択される糖と、リン脂質とを重量比１：１〜２００：０．１〜３０で含んでなる、ｐＨ８以下であり、かつ、６０〜１２０℃（好ましくは、６０〜８０℃）の溶液を調製し、当該溶液をホモジナイズする工程を含んでなるリポソーム組成物の製造方法が提供される。

【0072】

本発明によれば、以下の発明も提供される。
〔１〕下記式（１）；

【化4】

で表されるピロロキノリンキノン若しくはその塩及び糖を含み、１から１０μｍの粒子径が５０％以上含まれるリポソーム。
〔２〕糖がソルビトール又はキシリトールである〔１〕記載のリポソーム。
〔３〕〔２〕記載のリポソームを含む食品。
〔４〕〔２〕記載のリポソームを含む医薬品。
〔５〕〔２〕記載のリポソームを含む培地。
〔６〕ピロロキノリンキノンと糖を溶解させた水溶液を、ｐＨを８以下に調製した後、６０℃から１９０℃に加温する工程を含む、リポソームの製造方法。
〔７〕前記水溶液におけるピロロキノリンキノン若しくはその塩の濃度が０．０００１〜２重量％であり、糖が２から５０重量％である〔６〕記載のリポソームの製造方法。
〔８〕ホモジナイザーを使用する工程を含む、〔７〕記載の製造方法。

【実施例】

【0073】

以下に実施例及び調製例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例および調製例のみに限定されるものではない。

【0074】

試薬
ピロロキノリンキノンジナトリウムは三菱ガス化学、COATSOME NC-２１（水素添加大豆リン脂質）は日本油脂、その他はＷＡＫＯの試薬を使用した。

【0075】

リポソーム粒子径測定
ＳＥＩＳＨＩＮ ＬＭＳ−３５０（セイシン企業社製）を使用して、水に分散して粒度分布を求めた。この装置では０．１μｍが検出下限である。

【0076】

比較例１：リポソーム組成物の作製
ＰＱＱジナトリウム０．３ｇ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣー２１（水素添加大豆リン脂質）３．０ｇを用い、水を全体が１００ｇになるように混合した。この時のｐＨは３．５であった。得られた溶液を６０℃以上に加温しながら、ＮＩＳＳＥＩ ＡＭー３ホモジナイザー（株式会社日本精機製作所社製）で３０分、７０００回転、その後、室温に下げ、１０分、７０００回転で処理した。処理後、蒸発減少した水分を追加した。これを比較例１のリポソーム組成物とした。

【0077】

実施例１−４
ＰＱＱジナトリウム０．３ｇ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣー２１（水素添加大豆リン脂質）３．０gを用い、ソルビトールの添加を２，１０，２０，４０ｇで行い、水は全体が１００ｇになるように混合した。この時のｐＨは３．５であった。また、温度は６０℃であった。得られた溶液を比較例１と同様に処理して、実施例１−４のリポソーム組成物を作製した。

【0078】

比較例２：ＰＱＱを含まない糖を含むリポソーム組成物の作製
ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣー２１（水素添加大豆リン脂質）３．０g、ソルビトール１０ｇを用い、全体が１００ｇとなる様に水を混合した。比較例１と同様に処理してリポソーム組成物を作製した。

【0079】

比較例３：小さなサイズを含むリポソーム組成物の作製
大豆レシチン０．３ｇ、ＰＱＱジナトリウム０．３ｇ、ソルビトール１０ｇを用い、全体が１００ｇとなる様に水を混合した。比較例１と同様の操作を行いリポソーム組成物を作製した。

【0080】

実施例１〜４、比較例１〜３で作製したリポソームの粒子径測定結果を以下の表１に、各粒度分布結果を図１から７に示す。

【表1】

【0081】

実施例１〜４、比較例１〜２について、図１−６より１−１０μｍの粒子径に殆どのリポソームが入っていることが分かった。
ソルビトールの添加による粒子径の変化は小さく、糖添加によるリポソームの粒子径への影響はないことが分かった。ＰＱＱ添加の有無も粒子径への影響はないことが分かった。
比較例３は一般的な大豆レシチンにすることで小さな粒子を含むリポソームを作ることができ、小さな粒子の影響を見ることができる。

【0082】

増殖性試験
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＤＨＦＲ；大日本住友製薬より入手）をα−ＭＥＭ＋１０％牛胎児血清の培地で５％ＣＯ_２, ３７℃で培養した。イワキ製９６穴プレートを使用し、１個の穴に５０００個の細胞になるように１００μlの培地とともに加え、一晩培養した。培養液を抜き、所定の試験濃度の実施例１ー４、比較例１ー３で調製したリポソーム組成物を含む培地を加えた。1日培養後、培地を入れ替え同仁化学 ＷＳＴアッセイキットを使用して１時間反応させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。この時の吸光度は細胞数に比例する。

【0083】

サンプルとして、実施例１〜４、比較例１〜３で調製したリポソーム組成物及びＰＱＱジナトリウム（比較例４）を用い、これらのサンプルを培地で希釈して試験した。試験濃度は５００、２５０、１２５、６２、３１、１６、８、４、２、１、０．５、０μＭで行った。比較例２はリポソーム組成物の濃度とした。各サンプルについて試験を２回行い平均化した。結果を図８に示す。縦軸は無添加の細胞濃度を１００とした値である。

【0084】

全細胞数が無添加と比較して１０％程度少なくなる添加量を増殖停止濃度とし（この濃度が下がると吸収性が向上している）、また細胞濃度が無添加と比較して５％程度高くなる濃度を増殖促進濃度とし、各サンプルの試験結果を表２に示す。

【表2】

【0085】

全細胞数が培地のみと比較して１０％少なくなる添加量は比較例４のＰＱＱジナトリウム５００μＭ、比較例１のソルビトール無添加のリポソーム組成物で６２μＭであった。これに対し、小さなリポソーム組成物を含む比較例３では３１μＭとなっていた。増殖停止濃度はリポソーム化により吸収性が上がり、低い濃度で効果が表れた。
増殖促進濃度は、比較例１より実施例１−４の方が広い濃度範囲で有効であった。
リポソームにＰＱＱと糖を添加すると増殖停止濃度は上がり、増殖抑制効果は糖の添加により、小さくなった。
比較例２のＰＱＱを添加しない糖添加のリポソーム組成物では５００μＭ相当では細胞増殖に影響がみられたが、その他では影響がない。また、比較例３の小さなリポソーム組成物では低い濃度で増殖阻害が現れ、増殖促進効果は見られない（試験範囲よりも低い濃度になっていると予想される）。

【0086】

さらに、予想外にもＰＱＱによる５％程度の増殖促進が見られる濃度は糖の添加が増えることで広い濃度範囲になった。低濃度から高い範囲で有効であった。
細胞の増殖を促進する濃度が広くなることで培地に添加する際の組成選択が容易になると考えられる。

【0087】

実施例５
ＰＱＱジナトリウム０．３ｇ、ソルビトール１０ｇ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣー２１（水素添加大豆リン脂質）３．０ｇに、水を全体が１００ｇになるように混合した。この時のｐＨは３．５であった。また、温度は４０℃であった。得られた溶液の温度を上げながら、最終的に６０℃以上になるように加温しながら、ＮＩＳＳＥＩ ＡＭ−３ホモジナイザーで３０分、７０００回転、その後、室温に下げ、３０分、７０００回転で処理した。処理後、合計重量１００ｇになるように蒸発減少した水分を追加した。

【0088】

実施例５で作製したリポソームの粒子径測定結果を以下の表３に、粒度分布結果を図９に示す。

【表3】

【0089】

実施例６および７
ＰＱＱジナトリウム０．３ｇ、ソルビトール５０または０．５ｇ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣー２１（水素添加大豆リン脂質）３．０gに、水を全体が１００ｇになるように混合した。この時のｐＨは３．５であった。また、温度は６０℃であった。実施例１〜４と同様に処理してリポソーム組成物を作製した。

【0090】

実施例６および７で作製したリポソームの粒子径測定結果を以下の表４に示す。

【表4】

【0091】

実施例５〜７についての増殖性試験の結果を以下の表５に示す。

【表5】

【0092】

１−１０μｍの存在量が５３％で、広い濃度範囲で増殖促進できることが確認された（実施例５）。
また、糖の濃度が０．５重量％、５０重量％でも広い濃度範囲で増殖促進できることが確認された（実施例６および７）。

【0093】

実施例８〜１２
ＰＱＱジナトリウム０．３ｇ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣー２１（水素添加大豆リン脂質）３．０ｇ、糖を表６に示す重量を用い、全体が１００ｇとなるように水を混合した。この時のｐＨは３．５であった。また、温度は６０℃であった。得られた溶液のＮＩＳＳＥＩ ＡＭー３ホモジナイザーによる処理は以下のように行い、実施例８−１２のリポソーム組成物を作製した。
実施例８：８０℃以上に加温しながら１時間、７０００回転
実施例９：４０℃以上に加温しながら３０分、７０００回転
実施例１０：６０℃以上加温しながら３０分、７０００回転、その後、室温に下げ、１時間、７０００回転
実施例１１および１２：６０℃以上加温しながら３０分、７０００回転

【0094】

実施例８〜１２で作製したリポソームの粒子径測定結果を以下の表６に示す。

【表6】

【0095】

実施例８〜１２についての増殖性試験の結果を以下の表７に示す。

【表7】

【0096】

１−１０μｍの存在量が４９．５５％で、広い濃度範囲で増殖促進できることが確認された（実施例９）。
また、糖については、糖アルコールのみならず単糖、二糖でも広い濃度範囲で増殖促進できることが確認された（実施例１１および１２）。

【産業上の利用可能性】

【0097】

本発明は、化粧品、食品、医薬・農薬等の分野で有効利用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】