特許 5932751 ＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１抗原を含む組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5932751

(24)【登録日】2016年5月13日

(45)【発行日】2016年6月8日

(54)【発明の名称】ＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１抗原を含む組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160526BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160526BHJP

   C12N 9/64 20060101ALI20160526BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20160526BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20160526BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160526BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20160526BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20160526BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160526BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20160526BHJP

   A61K 39/07 20060101ALI20160526BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20160526BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20160526BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20160526BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/21

   C12N9/64 A

   A61K35/74

   A61K37/02

   A61K48/00

   A61K31/7088

   A61P37/04

   A61P35/00

   A61P13/08

   A61K39/07

   A61K39/39

   A61K39/00 H

   A61K35/76

【請求項の数】23

【全頁数】120

(21)【出願番号】特願2013-219162(P2013-219162)

(22)【出願日】2013年10月22日

(62)【分割の表示】特願2010-507485(P2010-507485)の分割

【原出願日】2008年5月12日

(65)【公開番号】特開2014-64569(P2014-64569A)

(43)【公開日】2014年4月17日

【審査請求日】2013年10月22日

(31)【優先権主張番号】11/798,177

(32)【優先日】2007年5月10日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500429103

【氏名又は名称】ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア

(73)【特許権者】

【識別番号】509250870

【氏名又は名称】アドバクシス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100089266

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 陽一

(72)【発明者】

【氏名】ペーターソン、イボンヌ

(72)【発明者】

【氏名】ロスマン、ジョン

(72)【発明者】

【氏名】シャハビ、ヴァハ

【審査官】 渡邉 潤也

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０１７８５６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０２１０５４０（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００− ９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

カリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３）融合タンパク質を発現する組換えリステリア株であって、該ＫＬＫ３融合タンパク質の配列が配列番号：５４に記載された配列を含む組換えリステリア株。

【請求項2】

前記ＫＬＫ３融合タンパク質は、さらに、非ＫＬＫ３ペプチドを含み、ここで該非ＫＬＫ３ペプチドが該断片の免疫原性を増強させる請求項１記載の組換えリステリア株。

【請求項3】

前記非ＫＬＫ３ペプチドが非溶血性リステリオリシン（ＬＬＯ）ペプチド、ＡｃｔＡペプチドまたはＰＥＳＴ配列ペプチドである請求項２記載の組換えリステリア株。

【請求項4】

前記ＫＬＫ３融合タンパク質がＫＬＫ３シグナル配列を含有しない請求項１乃至３のいずれかに記載の組換えリステリア株。

【請求項5】

前記組換えリステリア株が動物宿主を通じて継代されている請求項１乃至４のいずれかに記載の組換えリステリア株。

【請求項6】

前記組換えリステリア株が組換えリステリア・モノサイトゲネス株である請求項５記載の組換えリステリア株。

【請求項7】

非ＫＬＫ３ペプチドに操作可能に連結されたカリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３）ペプチドを含む組換えポリペプチドであって、該非ＫＬＫ３ペプチドは非溶血性リステリオリシン（ＬＬＯ）ペプチド、ＡｃｔＡペプチドおよびＰＥＳＴ様アミノ酸配列から選択され、前記組換えポリペプチドの配列が配列番号：５４に記載された配列を含む組換えポリペプチド。

【請求項8】

請求項７記載の組換えポリペプチドを製造する方法であって、
前記組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子の翻訳の工程を含むことを特徴とする方法。

【請求項9】

請求項７記載の組換えポリペプチドを製造する方法であって、
前記非ＫＬＫ３ペプチドを含むポリペプチドに対して、該ＫＬＫ３ペプチドを含むポリペプチドを化学的に共役させる工程を含むことを特徴とする方法。

【請求項10】

請求項７記載の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子。

【請求項11】

対象において抗カリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３）免疫応答を誘導するための組成物の調製における、請求項１乃至６のいずれかに記載の組換えリステリア株、請求項７記載の組換えポリペプチド、または請求項１０記載のヌクレオチド分子の使用。

【請求項12】

対象においてカリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３）タンパク質発現前立腺癌を治療し、それにより、該対象は該ＫＬＫ３タンパク質発現前立腺癌に対する免疫応答を高めるための組成物の調製における、請求項１乃至６のいずれかに記載の組換えリステリア株、請求項７記載の組換えポリペプチド、または請求項１０記載のヌクレオチド分子の使用。

【請求項13】

カリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３）タンパク質発現前立腺癌を阻害し、または抑制し、それにより、該対象は該ＫＬＫ３タンパク質に対する免疫応答を高め、それにより、ＫＬＫ３タンパク質発現前立腺癌に対してヒト対象を保護するための組成物の調製における、請求項１乃至６のいずれかに記載の組換えリステリア株、請求項７記載の組換えポリペプチド、または請求項１０記載のヌクレオチド分子の使用。

【請求項14】

前記組換えリステリア株が栄養要求性リステリア株である請求項１乃至６のいずれかに記載の組換えリステリア株。

【請求項15】

前記栄養要求性リステリア株がｄａｌ／ｄａｔ突然変異体である請求項１４記載の組換えリステリア株。

【請求項16】

前記栄養要求性リステリア株が、内因性ＡｃｔＡ遺伝子において欠失を含む請求項１４または１５に記載の組換えリステリア株。

【請求項17】

前記栄養要求性リステリア株が、該栄養要求性リステリア株の栄養要求性を補充する代謝酵素を含むエピソーム発現ベクターを含む請求項１４乃至１６のいずれかに記載の組換えリステリア株。

【請求項18】

前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である請求項１７記載の組換えリステリア株。

【請求項19】

請求項１乃至６及び請求項１４乃至１８のいずれかに記載の組換えリステリア株およびアジュバントを含むワクチン。

【請求項20】

請求項７記載の組換えポリペプチドおよびアジュバントを含むワクチン。

【請求項21】

請求項７記載の組換えポリペプチドをコードする組換えワクチンベクター。

【請求項22】

請求項１０記載のヌクレオチド分子、およびアジュバントを含むワクチン。

【請求項23】

請求項１０記載のヌクレオチド分子を含む組換えワクチンベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＫＬＫ３ペプチド、ＰＳＣＡペプチド、ＦＯＬＨ１ペプチド、それを含む組換えポリペプチド、それをコードする組換えヌクレオチド分子、それを含む組換えリステリア株、およびそれを利用する免疫原性的方法および治療方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来として認識される抗原の存在に依存する。サルモネラ（Salmonella enthraca）およびマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧのような細菌抗原はファゴソームに残っており、主要組織適合性クラスＩＩ分子を通じて抗原提示を介してＣＤ４^＋Ｔ細胞を刺激する。対照的に、リステリア・モノサイトゲネスのような細菌抗原はファゴソームを出て細胞質に入る。リステリア・モノサイトゲネスのファゴリソソーム逃避は、リステリア抗原の主要組織適合性クラスＩ抗原提示を容易とするユニークなメカニズムである。この逃避は、ポア形成性スルフヒドリル活性化サイトリシン、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）に依存する。

【0003】

ＡｃｔＡは表面結合リステリア蛋白質であって、感染した宿主細胞において足場として作用して、宿主のアクチンポリマーの重合、組立、および活性化を容易として、細胞質を通じてリステリア生物を推進する。哺乳動物細胞のサイトゾルへの進入後間もなく、リステリア・モノサイトゲネスは宿主のアクチンフィラメントの重合を誘導し、アクチン重合によって生じた力を用いて、まず、細胞内に、次いで、細胞から細胞に移動する。単一の細菌蛋白質であるＡｃｔＡは、アクチンの核形成およびアクチンベースの運動性を媒介することを担う。ＡｃｔＡ蛋白質は宿主の細胞骨格成分に対する多重結合部位を供し、それにより、細胞のアクチン重合機構を組み立てるための足場として作用する。ＡｃｔＡのＮＨ_２末端はモノマーアクチンに結合し、固有のアクチン核形成活性を刺激することによって構造的に活性な核形成促進因子として作用する。ＡｃｔＡおよびｈｌｙは、共に、転写アクチベータＰｒｆＡによって調節された１０ｋｂ遺伝子クラスターのメンバーであって、哺乳動物サイトゾルにおいてほぼ２２６倍アップレギュレートされる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許出願第２００６／０２３３８３５号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

前立腺癌はアメリカの男性において最も頻繁なタイプの癌であり、この集団において癌関連死亡の二番目に重要な原因である。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、前立腺腫瘍によって高度に発現される前立腺癌についてのマーカーである。抗原、特に、腫瘍および細胞内病原体の予防および治療に有用な抗原の免疫原性を高めるための組成物および方法を開発する要望が長年存在する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、ＫＬＫ３ペプチド、ＰＳＣＡペプチド、ＦＯＬＨ１ペプチド、それを含む組換えポリペプチド、それをコードする組換えヌクレオチド分子、それを含む組換えリステリア株、およびそれを利用する免疫原性的方法および治療方法を提供する。

【0007】

もう１つの実施態様において、本発明は、カリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３）ペプチドを発現する組換えリステリア株を提供する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：２５、２７、２９ないし３２、３４、および３６ないし３９から選択される。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドは免疫原性ＫＬＫ３ペプチドである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドは当該分野で知られたいずれかの他のＫＬＫ３ペプチドである。各可能性は、本発明の別の態様を表わす。

【0008】

もう１つの実施態様において、本発明は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）ペプチドを発現する組換えリステリア株を提供する。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡペプチドの配列は本明細書中に記載されたＰＳＣＡ配列から選択される。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡペプチドは免疫原性ＰＳＣＡペプチドである。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡペプチドは当該分野で知られたいずれかの他のＰＳＣＡペプチドである。各可能性は本発明の別々の実施態様を表わす。

【0009】

もう１つの実施態様において、本発明は、葉酸ヒドロラーゼ１（ＦＯＬＨ１）ペプチドを発現する組換えリステリア株を提供する。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４１、４３、４４および４５から選択される。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドは免疫原性ＦＯＬＨ１ペプチドである。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドは当該分野で知られたいずれかの他のＦＯＬＨ１ペプチドである。各可能性は本発明の別々の実施態様を表わす。

【0010】

もう１つの実施態様において、本発明は、非ＫＬＫ３ペプチドに操作可能に連結されたＫＬＫ３ペプチドを含む組換えポリペプチドを提供する。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３ペプチドは非溶血ＬＬＯペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３ペプチドはＡｃｔＡペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３ペプチドはＰＥＳＴ様配列ペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３ペプチドはＫＬＫ３ペプチドの免疫原性を増強させる。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３ペプチドは当該分野で知られたいずれかの他の種類のペプチドである。各可能性は本発明の別々の実施態様を表わす。一実施形態では、本発明は、配列番号５４に記載された配列を含むＬＬＯ−ＫＬＫ３融合ポリペプチド、及びそれを発現する組換えリステリア株を提供する。

【0011】

もう１つの実施態様において、本発明は、非ＰＳＣＡペプチドに操作可能に連結されたＰＳＣＡペプチドを含む組換えポリペプチドを提供する。もう１つの実施態様において、非ＰＳＣＡペプチドは非溶血ＬＬＯペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＰＳＣＡペプチドはＡｃｔＡペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＰＳＣＡペプチドはＰＥＳＴ様配列ペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＰＳＣＡペプチドはＰＳＣＡペプチドの免疫原性を増強させる。もう１つの実施態様において、非ＰＳＣＡペプチドは当該分野で知られたいずれかの他の種類のペプチドある。各可能性は本発明の別々の実施態様を表わす。

【0012】

もう１つの実施態様において、本発明は、非ＦＯＬＨ１ペプチドに操作可能に連結されたＦＯＬＨ１ペプチドを含む組換えポリペプチドを提供する。もう１つの実施態様において、非ＦＯＬＨ１ペプチドは非溶血ＬＬＯペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＦＯＬＨ１ペプチドはＡｃｔＡペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＦＯＬＨ１ペプチドはＰＥＳＴ様配列ペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＦＯＬＨ１ペプチドはＦＯＬＨ１ペプチドの免疫原性を増強させる。もう１つの実施態様において、非ＦＯＬＨ１ペプチドは当該分野で知られたいずれかの他の種類のペプチドである。各可能性は本発明の別々の実施態様を表わす。

【0013】

もう１つの実施態様において、本発明は本発明の組換えポリペプチドをコードする組換えワクチンベクターを提供する。

【0014】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を提供する。

【0015】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与し、それにより、対象において抗ＫＬＫ３免疫応答を誘導することを含む、対象において抗ＫＬＫ３免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0016】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＫＬＫ３蛋白質発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＫＬＫ３蛋白質発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＫＬＫ３蛋白質発現腫瘍を治療する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0017】

もう１つの実施態様において、本発明は、ＫＬＫ３蛋白質発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は本発明の組換えリステリア株を含む組成物をヒト対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＫＬＫ３蛋白質に対する免疫応答を高め、それにより、ヒト対象をＫＬＫ３蛋白質発現腫瘍から保護する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0018】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与し、それにより、対象において抗ＰＳＣＡ免疫応答を誘導することを含む、対象において抗ＰＳＣＡ免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0019】

もう１つの実施態様において、本発明は、対象においてＰＳＣＡ蛋白質発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与する方法を含み、それにより、対象はＰＳＣＡ蛋白質発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＰＳＣＡ蛋白質発現腫瘍を治療する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0020】

もう１つの実施態様において、本発明は、ＰＳＣＡ蛋白質発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は本発明の組換えリステリア株を含む組成物をヒト対象に投与する方法を含み、それにより、対象はＰＳＣＡ蛋白質に対する免疫応答を高め、それにより、対象はＰＳＣＡ蛋白質発現腫瘍に対してヒト対象を保護する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0021】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与し、それにより、対象において抗ＦＯＬＨ１免疫応答を誘導することを含む、対象において抗ＦＯＬＨ１免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0022】

もう１つの実施態様において、本発明は、対象においてＦＯＬＨ１蛋白質発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＦＯＬＨ１蛋白質発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＦＯＬＨ１蛋白質発現腫瘍を治療する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0023】

もう１つの実施態様において、本発明は、ＦＯＬＨ１蛋白質発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は本発明の組換えリステリア株を含む組成物をヒト対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＦＯＬＨ１蛋白質発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ＦＯＬＨ１蛋白質発現腫瘍に対してヒト対象を保護する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７はＥ７を発現し、それを分泌するのに異なる発現系を用いる。Ｌｍ−Ｅ７は、遺伝子カセットをリステリア・モノサイトゲネスゲノム（Ａ）のｏｒｆＺドメインに導入することによって生成した。ｈｌｙプロモーターは、ｈｌｙシグナル配列、およびＬＬＯの最初の５つのアミノ酸（ＡＡ）、続いての、ＨＰＶ−１６ Ｅ７の発現を駆動する。Ｂ）Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、ｐｒｆＡ⁻株ＸＦＬ−７をプラスミドｐＧＧ−５５で形質転換することによって生じさせた。ｐＧＧ−５５は、ＬＬＯ−Ｅ７の非溶血融合の発現を駆動するｈｌｙプロモーターを有する。また、ｐＧＧ−５５は、イン・ビボでのＸＦＬ−７によるプラスミドの保持について選択するためにｐｒｆＡ遺伝子を含有する。

【図2】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７はＥ７を分泌する。Ｌｍ−Ｇａｇ（レーン１）、Ｌｍ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（レーン３）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（レーン４）、ＸＦＬ−７（レーン５）および１０４０３Ｓ（レーン６）をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉ培地中で３７℃にて一晩成長させた。６００ｎｍ吸光度においてＯＤによって決定されたように、等しい数の細菌をペレット化し、１８ｍｌの各上清をＴＣＡ沈殿させた。Ｅ７発現をウェスタンブロットによって分析した。ブロットを抗Ｅ７ ｍＡｂ、続いて、ＨＲＰ共役抗マウス（Ａｍｅｒｃｈｅｍ）でプローブし、次いで、ＥＣＬ検出試薬を用いて発色させた。

【図3A】ＬＬＯ−Ｅ７融合の腫瘍免疫治療効力。マウスにおけるミリメートルで表した腫瘍のサイズを、腫瘍接種から７、１４、２１、２８および５６日後において示す。ナイーブマウス：白三角形；Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７：黒丸印；Ｌｍ−Ｅ７：黒菱形；Ｌｍ−Ｇａｇ：Ｘ印；およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ：＋符号。

【図3B】ＬＬＯ−Ｏｖａ融合の腫瘍免疫治療効果。

【図4】ＴＣ−１細胞に曝露すると、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫化マウスからの脾臓細胞は増殖する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫化し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、または対照ｒＬｍ株をブースター注射した。脾臓細胞をブースター注射から６日後に収穫し、示した比率で照射したＴＣ−１細胞を平板培養した。細胞を^３Ｈチミジンでパルスし、収穫した。Ｃｐｍは（実験ｃｐｍ）−（ＴＣ−１無し対照）と定義される。

【図5】ＬＭ中で発現させたＮＰ抗原の腫瘍免疫治療効果。マウスにおけるミリメートルで表した腫瘍サイズを、腫瘍接種から１０、１７、２４および３８日後において示す。ナイーブマウス：Ｘ印；Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰを投与したマウス：黒菱形；Ｌｍ−ＮＰ：四角；Ｌｍ−Ｇａｇ：黒丸印。

【図6】ＨＰＶ１６ Ｅ７蛋白質の異なる形態を発現するワクシニアウイルス構築体の描写。

【図7】ＶａｃＬＬＯＥ７は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射された２×１０^５ＴＣ−１細胞から樹立された腫瘍の長期退行を引き起こす。１０^７ＰＦＵのＶａｃＬＬＯＥ７、ＶａｃＳｉｇＥ７ＬＡＭＰ−１、またはＶａｃＥ７／マウス腹腔内注射で、腫瘍負荷から１１および１８日後にマウスに注射し、あるいはマウスを未処理のまま放置した（ナイーブ）。処理群当たり８匹のマウスを用い、各腫瘍についての断面（２つの測定の平均）を、腫瘍接種から後の示された日数について示す。

【図8A】４つのＬＭワクチンを作成するのに用いたプラスミドインサートの模式図。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７インサートは、用いたリステリア遺伝子の全てを含有する。それはｈｌｙプロモーター、（蛋白質ＬＬＯをコードする）最初の１．３ｋｂのｈｌｙ遺伝子、およびＨＰＶ−１６ Ｅ７遺伝子を含有する。該最初の１．３ｋｂのｈｌｙはシグナル配列（ｓｓ）およびＰＥＳＴ領域を含む。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７はｈｌｙプロモーター、シグナル配列、およびＰＥＳＴおよびＥ７配列を含むが、切形されたＬＬＯ遺伝子の残りを排除する。Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７はＰＥＳＴ領域を排除するが、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、Ｅ７、および切形されたＬＬＯの残りを含有する。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、およびＥ７のみを有する。

【図8B】組換えリステリア細菌からＥ７を発現させ、およびそれを分泌させるのに用いるｐＡｃｔＡ−Ｅ７発現系の模式図。ｈｌｙプロモーター（ｐＨＬＹ）は発現を駆動し、ｐｒｆＡ遺伝子を用いて、イン・ビボでの組換えリステリアによるプラスミドの保持を選択する。

【図8C】頂部パネル：ＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体は腫瘍退行を誘導する。黒三角形：ナイーブマウス；丸印：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７；四角：Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉ；＋符号：Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７；白三角形：Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７。

【図8D】２つの別々の実験での腫瘍負荷から２８日後における平均腫瘍サイズ。

【図8E】ＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体は、脾臓においてより高いパーセンテージのＥ７特異的リンパ球を誘導する。３つの実験からのデータの平均およびＳＥを描く。

【図9】Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（白四角）、Ｌｍ−Ｅ７（黒丸印）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（×）を投与したマウス、およびナイーブマウス（非ワクチン接種；黒三角形）における腫瘍のサイズ。

【図10A】ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、続いて、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を投与し、またはワクチンを投与しない（ナイーブ）マウスにおける、脾臓におけるＥ７−特異的ＩＦＮ−ガンマ分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞の誘導、および腫瘍に貫入する数。

【図10B】図１０Ａで記載したマウスの脾臓および腫瘍におけるＥ７特異的ＣＤ８^＋細胞の誘導および貫入。

【図11A】ＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体は腫瘍内でより高いパーセンテージのＥ７特異的リンパ球を誘導する。１つの実験からの代表的なデータ。

【図11B】３つの実験からのデータの平均およびＳＥ。

【図12】ｐＧＧ５５におけるｐＡｄｖ３４の模式的地図。ＣＡＴ（Ｇ−）、Ｅ．ｃｏｌｉについてのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；ＣＡＴ（Ｇ＋）、Ｌｍについてのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；Ｏｒｉ、複製領域；ｐｒｆＡ、Ｌｍ病原性調節因子Ａ；ＬＬＯ−ＰＳＡ、そのプロモーターを含めた、Ｃ末端切形リステリオリシンＯをコードする遺伝子、およびヒトＰＳＡをコードする遺伝子の間の融合。

【図13】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡ融合蛋白質の発現および分泌。細菌を一晩増殖させ、４℃にて１０％ＴＣＡの存在下で細胞上清を沈殿させた。蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗ＰＳＡ（Ａ）および抗ＬＬＯ（Ｂ）抗体でブロットした。ＰＳＡ陽性対照は、ＰＳＡ／ワクシニアを感染させたＢｓｃＩ細胞溶解物であった。親細菌株ＸＦＬ７、およびヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原の断片を発現する２つの無関係なＬｍ株を陰性対照として用いた。

【図14】マクロファージにおけるＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡの摂取および成長。マウスマクロファージ様細胞（Ｊ７７４Ａ．１）に、イン・ビトロにて，Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ、親Ｌｍ ＸＦＬ７または野生型Ｌｍ １０４０３ｓ株で１：１のＭＯＩにて感染させた。細胞内成長を、細胞からの１時間おきに二連試料を採取し、ＢＨＩプレート上で細菌を滴定することによって８時間モニターした。ＣＦＵ：コロニー形成単位。

【図15】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化に際しての腫瘍退行。８匹のマウスの群を、０日において、５×１０^６Ｔ−ＰＳＡ２３細胞で皮下接種し、１週間間隔で３回Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で腹腔内免疫化させるか、あるいは免疫化を受けさせなかった（ナイーブ）。電子キャリパーを用いて腫瘍を毎週モニターし、２つの垂直直径の平均として表す。腫瘍が直径１５ないし１８ｍｍのサイズに到達すると、マウスを犠牲にした。結果は、各個体マウスからの腫瘍のサイズとして表す。表は、腫瘍接種から１週間または７ないし８週間後の群当たりのマウスの合計数に対する、腫瘍がない（上方パネル）または生存した（下方パネル）のいずれかの各群におけるマウスの数を示す。この実験は３回反復し、同様な結果を示す。

【図16】脾臓および腫瘍におけるＰＳＡ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞。Ｔ−ＰＳＡ２３細胞をマトリゲルとの混合物として皮下移植した。マウスをＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ、またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で２回免疫化するか、あるいはナイーブのまま放置した。脾臓および腫瘍を２回目の免疫化から６日後に抽出し、ＦＡＣＳ分析によってＣＤ８^＋／ＰＳＡテトラマー陽性Ｔ細胞の存在についてテストした。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化の結果、脾臓（上方パネル）および腫瘍（下方パネル）双方において、ＰＳＡ特異的ＣＤ８^＋細胞が生じた。各コーナーにおける数は、各組織におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の合計数を超えたＰＳＡ陽性細胞の％を示した。

【図17】脾臓および腫瘍におけるＴｒｅｇｓの存在に対するＬｍワクチンでのワクチン接種の効果。単離された脾臓細胞、および従前の実験において３つの腫瘍を担うマウスから抽出されたＴＩＬをプールし、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３について染色して、これらの組織におけるＴｒｅｇｓの存在に対するＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡでの免疫化の効果を解明した。各欄は、各プールにおける合計ＣＤ４^＋Ｔ細胞に関するＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞集団の％を表わす。

【図18】ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって検出されたＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡワクチン接種によって刺激されたＩＦＮ−γ分泌。マウスを０．１ ＬＤ_５０のＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡで３回免疫化した。単離された脾臓細胞を調製し、１μＭのＰＳＡ特異的Ｈ２Ｄ^ｂペプチド、ＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬの存在下で一晩インキュベートした。単離された細胞によるＩＦＮ−γ分泌が、ＭａｂｔｅｃｈからのＥＬＩＳｐｏｔキットを用いて検出し、スポット形成細胞（ＳＦＣ）／１００万細胞として表した。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＷＴ１免疫化またはナイーブマウスからの脾臓細胞を陰性対照として用いた。（＊はｐ＜０．０００１でのナイーブ群に関する統計学的有意性を示す）。

【図19】細胞内染色によって検出されたＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡワクチン接種によって刺激されたＩＦＮ−γの生産。マウスを０．１ ＬＤ_５０のＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡで３回免疫化した。単離された脾臓を調製し、ＰＳＡ特異的Ｈ２Ｄ^ｂペプチドの存在下で５時間インキュベートした。活性化されたＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ生産は方法において記載されたように決定された。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＷＴ１免疫化またはナイーブマウスからの脾臓を陰性対照として用いた。

【図20】マウスにおけるＰＳＡ特異的細胞傷害性応答。動物を（Ｌｍ陰性対照としての）０．１ ＬＤ_５０のＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＰＶ１６Ｅ７Ｅ６で３回免疫化するか、あるいはナイーブなまま放置した。単離された脾臓細胞を調製し、ＰＳＡ発現刺激体細胞と共に５日間インキュベートした。エフェクター細胞（Ｅ）を、ＰＳＡ Ｈ２Ｄ^ｂペプチドでパルスした標的ＥＬ４細胞と共に：Ａ）異なるＥ：Ｔ比率／固定されたペプチド濃度（１μＭ）にて；またはＢ）１：２５の固定されたＥ：Ｔ比率であるが、異なるペプチド濃度にてインキュベートすることによって、ＣＴＬアッセイを４時間行った。

【図21】他のＰＳＡベースのワクチンとの、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡの抗−腫瘍効果の比較。８匹のマウスの群に、０日において、５×１０^６ Ｔ−ＰＳＡ２３細胞で皮下接種し、１週間間隔で２回、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ、ワクシニア−ＰＳＡまたはｐＤＮＡ（ＰＳＡ＋ＧＭ−ＣＳＦ）で免疫化するか、あるいは免疫化を受けさせなかった（ナイーブ）。電子キャリパーを用いて腫瘍を毎週モニターし、２つの垂直直径の平均として表す。腫瘍が直径２０ｍｍのサイズに到達すると、マウスを犠牲にした。結果を各個々のマウスからの腫瘍サイズとして表す（２１Ａ）。表は、腫瘍がないか、あるいは腫瘍接種後に８週間生存下のいずれかの各群におけるマウスの数を示す。２１Ｂ）各群における腫瘍サイズの平均。腫瘍が２０ｍｍのサイズに到達すると、マウスを犠牲にした。それらには、平均曲線を作成するために２０ｍｍの値を与えた。この実験は、２回反復し、同様な結果を示す。

【図22】Ｌｍ−ＰＳＡの安定性。Ｌｍ−ＰＳＡを成長させ、イン・ビトロにて７連続日の間継代した。プラスミドＤＮＡを、イン・ビトロ成長の間に毎日採取した細菌試料から精製し、ＰＣＲ（２２Ａ）またはプラスミド（２２Ｂ）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限マッピングによるＰＳＡ遺伝子の増幅によってテストした。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明は、ＫＬＫ３ペプチド、ＰＳＣＡペプチド、ＦＯＬＨ１ペプチド、それを含む組換えポリペプチド、それをコードする組換えヌクレオチド分子、それを含む組換えリステリア株、およびそれを利用する免疫原生および治療方法を提供する。

【0026】

もう１つの実施態様において、本発明はカリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３）ペプチドを発現する組換えリステリア株を提供する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：２５、２７、２９ないし３２、３４、および３６ないし３９から選択される。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：２５に記載されている。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：２７に記載されている。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：２９に記載されている。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３０に記載されている。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３１に記載されている。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３２に記載されている。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３４に記載されている。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３６に記載されている。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３７に記載されている。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３８に記載されている。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３９に記載されている。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は当該分野で公知のいずれかの他のＫＬＫ３蛋白質配列である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0027】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：２５、２７、２９ないし３２、３４、および３６ないし３９から選択される配列を含む。

【0028】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドはより大きなＫＬＫ３ペプチドの免疫原性断片であり、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：２５、２７、２９ないし３２、３４、および３６ないし３９から選択される配列である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドはより大きなＫＬＫ３ペプチドの免疫原性断片であり、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：２５に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：２７に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：２９に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３０に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３１に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３２に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３４に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３６に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３７に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３８に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：３９に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＫＬＫ３ペプチドの配列は当該分野で知られたいずれかの他のＫＬＫ３蛋白質配列である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0029】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの配列は配列番号：２５、２７、２９ないし３２、３４、および３６ないし３９から選択される配列の免疫原性断片を含む。

【0030】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドは当該分野で公知のいずれかの他のＫＬＫ３ペプチドである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドは当該分野で公知のいずれかの他のＫＬＫ３ペプチドの断片である。ＫＬＫ３ペプチドの各タイプは、本発明の別の実施態様を表わす。

【0031】

「ＫＬＫ３ペプチド」とは、もう１つの実施態様において、全長ＫＬＫ３蛋白質をいう。もう１つの実施態様において、該用語はＫＬＫ３蛋白質の断片をいう。もう１つの実施態様において、該用語は、ＫＬＫ３シグナルペプチドを欠如するＫＬＫ３蛋白質の断片をいう。もう１つの実施態様において、該用語は、ＫＬＫ３シグナルペプチドを除いた全ＫＬＫ３配列を含有するＫＬＫ３蛋白質をいう。「ＫＬＫ３シグナル配列」とは、もう１つの実施態様において、天然でＫＬＫ３蛋白質に見出されるいずれのシグナル配列もいう。もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のＫＬＫ３蛋白質はいずれのシグナル配列も含有しない。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0032】

１つの実施態様において、「変種」とは、集団の大部分とは異なるが、それらのうち１つであると考えられるべき共通の態様と依然として十分に同様であるアミノ酸または核酸配列（あるいは他の実施態様においては、生物または組織）、例えば、スプライス変種をいう。

【0033】

１つの実施態様において、「イソ形態」とは、もう１つのイソ形態と比較して僅かな差のみを持つ分子、例えば、蛋白質のバージョン、または同一蛋白質のバージョンをいう。１つの実施態様において、イソ形態は異なるが関連する遺伝子から生じさせることができ、あるいはもう１つの実施態様において、オルタナティブスプライシングによって同一遺伝子から生起させることができる。もう１つの実施態様において、イソ形態は単一ヌクレオチド多形によって引き起こされる。

【0034】

１つの実施態様において、「断片」とは、全長蛋白質またはポリペプチドよりも短い、またはより少ないアミノ酸を含む蛋白質またはポリペプチドをいう。もう１つの実施態様において、断片とは、全長核酸よりも短い、またはより少ないヌクレオチドを含む核酸をいう。もう１つの実施態様において、該断片はＮ末端断片である。もう１つの実施態様において、該断片はＣ末端断片である。１つの実施態様において、該断片は蛋白質、ペプチド、または核酸の配列内セクションである。１つの実施態様において、該断片は機能的断片である。もう１つの実施態様において、該断片は免疫原性断片である。１つの実施態様において、断片は１０ないし２０核酸またはアミノ酸を有し、他方、もう１つの実施態様において、断片は５を超える核酸またはアミノ酸を有し、他方、もう１つの実施態様において、断片は１００ないし２００核酸またはアミノ酸を有し、他方、もう１つの実施態様において、断片は１００ないし５００核酸またはアミノ酸を有し、他方、もう１つの実施態様において、断片は５０ないし２００核酸またはアミノ酸を有し、他方、もう１つの実施態様において、断片は１０ないし２５０核酸またはアミノ酸を有する。

【0035】

１つの実施態様において、「ホモログ」とは、特定の核酸またはアミノ酸配列に対するあるパーセンテージの配列同一性を共有する核酸またはアミノ酸配列をいう。もう１つの実施態様において、本明細書中で提供される組成物および方法において有用な配列は、本明細書中に記載されるいずれかの配列のホモログであってよい。１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも７０％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも７２％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも７５％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも７８％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも８０％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも８２％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも８３％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも８５％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも８７％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも８８％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも９０％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも９２％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも９３％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも９５％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも９６％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも９７％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも９８％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して少なくとも９９％同一性を有する。もう１つの実施態様において、ホモログは特定の配列に対して１００％同一性を有する。各可能性は本明細書中で提供された別の実施態様を表わす。

【0036】

１つの実施態様において、本明細書中で提供された、および／または本明細書中で記載された配列のいずれかのホモログが本発明の一部であると考えられることは理解されるべきである。

【0037】

１つの実施態様において、本明細書中で用いられる「異種」は、参照種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質等を記載する。かくして、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は、１つの実施態様において、天然ではない、またはリステリア株に対して内因性であるポリペプチドを発現し、あるいはもう１つの実施態様において、リステリア株によって通常は発現されないポリペプチド、あるいはもう１つの実施態様において、リステリア株以外の源からのポリペプチドを発現するであろう。

【0038】

１つの実施態様において、本明細書中で用いる「内因性」は、参照生物内に発生しまたは由来し、あるいは参照生物内の原因から生起した、核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質等を記載する。もう１つの実施態様において、内因性とは天然をいう。

【0039】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のＫＬＫ３ペプチドの源であるカリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３蛋白質）はＰＳＡ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質はＰ−３０抗原蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質はガンマ−セミノプロテイン蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質はカリクレイン３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質はセミノゲラーゼ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質はセミニン蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、当該分野で公知のいずれかの他のタイプのＫＬＫ３蛋白質である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0040】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質はスプライス変種１ ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質はスプライス変種２ ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質はスプライス変種３ ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は転写体変種１ ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は転写体変種２ ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は転写体変種３ ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は転写体変種４ ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は転写体変種５ ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は転写体変種６ ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質はスプライス変種ＲＰ５ ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、当該分野で公知のいずれかの他のスプライス変種ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、当該分野で公知のいずれかの他の転写体変種ＫＬＫ３蛋白質である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0041】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は成熟ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質はプロ−ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、リーダー配列は、本発明の方法および組成物の成熟ＫＬＫ３蛋白質から除去されている。成熟ＫＬＫ３蛋白質の例は、配列番号：４０のａａ３７８−１０８８によってコードされる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0042】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のＫＬＫ３ペプチドの源であるＫＬＫ３蛋白質はヒトＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は霊長類ＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は当該分野で公知のいずれかの他の種のＫＬＫ３蛋白質である。もう１つの実施態様において、前記ＫＬＫ３蛋白質の１つは「ＫＬＫ３蛋白質」と当該分野で称される。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0043】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は以下の配列を有する：
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：２５；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ１４８１０）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２５のホモログである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２５の変種である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２５のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２５の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0044】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる：
ｇｇｔｇｔｃｔｔａｇｇｃａｃａｃｔｇｇｔｃｔｔｇｇａｇｔｇｃａａａｇｇａｔｃｔａｇｇｃａｃｇｔｇａｇｇｃｔｔｔｇｔａｔｇａａｇａａｔｃｇｇｇｇａｔｃｇｔａｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｃａｔｇｔｃｔｃｃｔｃｔｇｃｃｔｔｔｇｔｃｃｃｃｔａｇａｔｇａａｇｔｃｔｃｃａｔｇａｇｃｔａｃａａｇｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｔｃｃａｇｇｇｔｇａｔｃｔａｇｔａａｔｔｇｃａｇａａｃａｇｃａａｇｔｇｃｔａｇｃｔｃｔｃｃｃｔｃｃｃｃｔｔｃｃａｃａｇｃｔｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｇａｇｇｇｇｇｔｔｇｔｃｃａｇｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃａｔｇｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｔｇｇｔｃａｇｃｃｔｃｔｇｇｇｔｇｃｃａｇｃａｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｇｇａｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔｇａａｇｇｔｔｔｔａｔａｇｇｇｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇａｇｇｃｔｃｃｃｃａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃａｔｇｇｔｔｇｇｇｇｇｇａｔｇｃａｇｇａｇａｇｇｇａｇｃｃａｇｃｃｃｔｇａｃｔｇｔｃａａｇｃｔｇａｇｇｃｔｃｔｔｔｃｃｃｃｃｃｃａａｃｃｃａｇｃａｃｃｃｃａｇｃｃｃａｇａｃａｇｇｇａｇｃｔｇｇｇｃｔｃｔｔｔｔｃｔｇｔｃｔｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃａｃｔｔｃａａｇｃｃｃａｔａｃｃｃｃｃａｇｔｃｃｃｃｔｃｃａｔａｔｔｇｃａａｃａｇｔｃｃｔｃａｃｔｃｃｃａｃａｃｃａｇｇｔｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｔｃｃｃａｃｔｔａｃｃｃｃａｇａａｃｔｔｔｃｔｔｃｃｃａｔｔｔｇｃｃｃａｇｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｃｔｃｃｃａｇｃｔｇｃｔｔｔａｃｔａａａｇｇｇｇａａｇｔｔｃｃｔｇｇｇｃａｔｃｔｃｃｇｔｇｔｔｔｃｔｃｔｔｔｇｔｇｇｇｇｃｔｃａａａａｃｃｔｃｃａａｇｇａｃｃｔｃｔｃｔｃａａｔｇｃｃａｔｔｇｇｔｔｃｃｔｔｇｇａｃｃｇｔａｔｃａｃｔｇｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｔｇａｇｃｃｃｃｔｃａａｔｃｃｔａｔｃａｃａｇｔｃｔａｃｔｇａｃｔｔｔｔｃｃｃａｔｔｃａｇｃｔｇｔｇａｇｔｇｔｃｃａａｃｃｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｃｃｔｔｇａｔｇｃｔｔｇｇｃｃｔｃｃｃａａｔｃｔｔｇｃｃｃｔａｇｇａｔａｃｃｃａｇａｔｇｃｃａａｃｃａｇａｃａｃｃｔｃｃｔｔｃｔｔｔｃｃｔａｇｃｃａｇｇｃｔａｔｃｔｇｇｃｃｔｇａｇａｃａａｃａａａｔｇｇｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｃｔｇｇｃａａｔｇｇｇａｃｔｃｔｇａｇａａｃｔｃｃｔｃａｔｔｃｃｃｔｇａｃｔｃｔｔａｇｃｃｃｃａｇａｃｔｃｔｔｃａｔｔｃａｇｔｇｇｃｃｃａｃａｔｔｔｔｃｃｔｔａｇｇａａａａａｃａｔｇａｇｃａｔｃｃｃｃａｇｃｃａｃａａｃｔｇｃｃａｇｃｔｃｔｃｔｇａｇｔｃｃｃｃａａａｔｃｔｇｃａｔｃｃｔｔｔｔｃａａａａｃｃｔａａａａａｃａａａａａｇａａａａａｃａａａｔａａａａｃａａａａｃｃａａｃｔｃａｇａｃｃａｇａａｃｔｇｔｔｔｔｃｔｃａａｃｃｔｇｇｇａｃｔｔｃｃｔａａａｃｔｔｔｃｃａａａａｃｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃａｇｃａａｃｔｇａａｃｃｔｃｇｃｃａｔａａｇｇｃａｃｔｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｃｃｔａｇｃａｃｃｃｃｔｔａｔｃｃｃｃｔｃａｇａａｔｃｃａｃａａｃｔｔｇｔａｃｃａａｇｔｔｔｃｃｃｔｔｃｔｃｃｃａｇｔｃｃａａｇａｃｃｃｃａａａｔｃａｃｃａｃａａａｇｇａｃｃｃａａｔｃｃｃｃａｇａｃｔｃａａｇａｔａｔｇｇｔｃｔｇｇｇｃｇｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇｔｃｔｃｃｔａｃｃｃｔｇａｔｃｃｃｔｇｇｇｔｔｃａａｃｔｃｔｇｃｔｃｃｃａｇａｇｃａｔｇａａｇｃｃｔｃｔｃｃａｃｃａｇｃａｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃｃｔｇｃａａａｃｃｔａｇｇｇａａｇａｔｔｇａｃａｇａａｔｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｃｃｔｇｃｃｃａｔｇｔｃｃｃａｇｇａｃｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃｔｇｃｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｔｔｔｃａａａｃｃｃａｃａｔｃｃｔａａａｔｃｃａｔｃｔｃｃｔａｔｃｃｇａｇｔｃｃｃｃｃａｇｔｔｃｃｃｃｃｔｇｔｃａａｃｃｃｔｇａｔｔｃｃｃｃｔｇａｔｃｔａｇｃａｃｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｇｇｃｇｃｔｇｃｇｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｇｔｇａｇｔａｇｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇｔｃｔｇｇｇｇａｇｃａｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｃｃｃａｇａｇｇａａｔａａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｔｃｃｃｃａｇｇａｔａａｃｃｔｃｔａａｇｇｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｇａｃｔｇｇｇｇｇａｇａｇａｇｇｇａａａｇｔｔｃｔｇｇｔｔｃａｇｇｔｃａｃａｔｇｇｇｇａｇｇｃａｇｇｇｔｔｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｇｔｃｔｃｃａｔｃｔｇｔｇｔｃｃｃｔｃｔａｔｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｇｔｃｇｃｔｔｔｃａｔｔａｔｇｔｃｔｃｔｔｇｇｔａａｃｔｇｇｃｔｔｃｇｇｔｔｇｔｇｔｃｔｃｔｃｃｇｔｇｔｇａｃｔａｔｔｔｔｇｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｔｃｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｇｔｃｔｃｃａｔａｔｃｔｃｃｃｃｃｔｃｔｃｔｃｔｇｔｃｃｔｔｃｔｃｔｇｇｔｃｃｃｔｃｔｃｔａｇｃｃａｇｔｇｔｇｔｃｔｃａｃｃｃｔｇｔａｔｃｔｃｔｃｔｇｃｃａｇｇｃｔｃｔｇｔｃｔｃｔｃｇｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃａｃｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃｔｃｃｃｔａｃｔｇａａｃａｃａｃｇｃａｃｇｇｇａｔｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇｇａｃｃｃｔｇａｇａａａａｇｇａａｇｇｇｃｔｔｔｇｇｃｔｇｇｇｃｇｃｇｇｔｇｇｃｔｃａｃａｃｃｔｇｔａａｔｃｃｃａｇｃａｃｔｔｔｇｇｇａｇｇｃｃａａｇｇｃａｇｇｔａｇａｔｃａｃｃｔｇａｇｇｔｃａｇｇａｇｔｔｃｇａｇａｃｃａｇｃｃｔｇｇｃｃａａｃｔｇｇｔｇａａａｃｃｃｃａｔｃｔｃｔａｃｔａａａａａｔａｃａａａａａａｔｔａｇｃｃａｇｇｃｇｔｇｇｔｇｇｃｇｃａｔｇｃｃｔｇｔａｇｔｃｃｃａｇｃｔａｃｔｃａｇｇａｇｃｔｇａｇｇｇａｇｇａｇａａｔｔｇｃａｔｔｇａａｃｃｔｇｇａｇｇｔｔｇａｇｇｔｔｇｃａｇｔｇａｇｃｃｇａｇａｃｃｇｔｇｃｃａｃｔｇｃａｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｔｇａｃａｇａｇｔｇａｇａｃｔｃｃｇｃｃｔｃａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａｇａａａａｇａａａａｇａａａａｇａａａａｇｇａａｇｔｇｔｔｔｔａｔｃｃｃｔｇａｔｇｔｇｔｇｔｇｇｇｔａｔｇａｇｇｇｔａｔｇａｇａｇｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃａｃｔｃｃａｔｔｃｃｔｔｃｔｃｃａｇｇａｃａｔｃｃｃｔｃｃａｃｔｃｔｔｇｇｇａｇａｃａｃａｇａｇａａｇｇｇｃｔｇｇｔｔｃｃａｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｇｇａｇｇｇｇｃａａｔｔｇａｇｇｇａｇｇａｇｇａａｇｇａｇａａｇｇｇｇｇａａｇｇａａａａｃａｇｇｇｔａｔｇｇｇｇｇａａａｇｇａｃｃｃｔｇｇｇｇａｇｃｇａａｇｔｇｇａｇｇａｔａｃａａｃｃｔｔｇｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｃａｇｇｃｔａｃｃｔａｃｃｃａｃｔｔｇｇａａａｃｃｃａｃｇｃｃａａａｇｃｃｇｃａｔｃｔａｃａｇｃｔｇａｇｃｃａｃｔｃｔｇａｇｇｃｃｔｃｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｃｇｇｔｃｃｃｃａｃｔｃａｇｃｔｃｃａａａｇｔｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｔｔｔｃｔｃｔｃｃｃａｃａｃｔｔｔａｔｃａｔｃｃｃｃｃｇｇａｔｔｃｃｔｃｔｃｔａｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇａｃｔｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃｃｔｔｔｃｔｃａｔｔｃａｔｃｔｇｔｔｔｃｔｃａｃｔｔｔｃｔｇｃｃｔｇｇｔｔｔｔｇｔｔｃｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔｇｇｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｔｔｔｃｔｃｔａｔｇｔｔｔｃｔｇｔｃｔｔｔｔｃｔｔｔｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｇｔａｔｔｔｔｃｇｇｃｔｃａｃｃｔｔｇｔｔｔｇｔｃａｃｔｇｔｔｃｔｃｃｃｃｔｃｔｇｃｃｃｔｔｔｃａｔｔｃｔｃｔｃｔｇｃｃｃｔｔｔｔａｃｃｃｔｃｔｔｃｃｔｔｔｔｃｃｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃｔｃａｇｔｔｃｔｇｔａｔｃｔｇｃｃｃｔｔｃａｃｃｃｔｃｔｃａｃａｃｔｇｃｔｇｔｔｔｃｃｃａａｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｇｔａｔｔｔｔｇｇｃｃｔｇａａｃｔｇｔｇｔｃｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｔｇｔｔｔｔｃｔｃａｃｔｇｔｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｃｔｇｔｃｃｃｔｔｃｔｃｔｃｔｔｔｃｃｔｔａｔｃａｔｃｃｔｃｇｃｔｃｃｔｃａｔｔｃｃｔｇｃｇｔｃｔｇｃｔｔｃｃｔｃｃｃｃａｇｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｇｔａｃｇｃｃｔｇｇｇｃｃａｇａｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｇｇｇａｇｃｃｃａｇａｔｇｃｃｔｇｇｇｔｃｔｇａｇｇｇａｇｇａｇｇｇｇａｃａｇｇａｃｔｃｃｔｇｇｇｔｃｔｇａｇｇｇａｇｇａｇｇｇｃｃａａｇｇａａｃｃａｇｇｔｇｇｇｇｔｃｃａｇｃｃｃａｃａａｃａｇｔｇｔｔｔｔｔｇｃｃｔｇｇｃｃｃｇｔａｇｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｔｇａｇｔｃａｔｃｃｃｔａｃｔｃｃｃａａｇａｔｃｔｔｇａｇｇｇａａａｇｇｔｇａｇｔｇｇｇａｃｃｔｔａａｔｔｃｔｇｇｇｃｔｇｇｇｇｔｃｔａｇａａｇｃｃａａｃａａｇｇｃｇｔｃｔｇｃｃｔｃｃｃｃｔｇｃｔｃｃｃｃａｇｃｔｇｔａｇｃｃａｔｇｃｃａｃｃｔｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｃａｔｃｔｃａｔｔｃｃｃｔｃｃｔｔｃｃｃｔｃｔｔｃｔｔｔｇａｃｔｃｃｃｔｃａａｇｇｃａａｔａｇｇｔｔａｔｔｃｔｔａｃａｇｃａｃａａｃｔｃａｔｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃｇｔｔｃａｇｃａｃａｃｇｇｔｔａｃｔａｇｇｃａｃｃｔｇｃｔａｔｇｃａｃｃｃａｇｃａｃｔｇｃｃｃｔａｇａｇｃｃｔｇｇｇａｃａｔａｇｃａｇｔｇａａｃａｇａｃａｇａｇａｇｃａｇｃｃｃｃｔｃｃｃｔｔｃｔｇｔａｇｃｃｃｃｃａａｇｃｃａｇｔｇａｇｇｇｇｃａｃａｇｇｃａｇｇａａｃａｇｇｇａｃｃａｃａａｃａｃａｇａａａａｇｃｔｇｇａｇｇｇｔｇｔｃａｇｇａｇｇｔｇａｔｃａｇｇｃｔｃｔｃｇｇｇｇａｇｇｇａｇａａｇｇｇｇｔｇｇｇｇａｇｔｇｔｇａｃｔｇｇｇａｇｇａｇａｃａｔｃｃｔｇｃａｇａａｇｇｔｇｇｇａｇｔｇａｇｃａａａｃａｃｃｔｇｃｇｃａｇｇｇｇａｇｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｇｃｇｇｃａｃｃｔｇｇｇｇｇａｇｃａｇａｇｇｇａａｃａｇｃａｔｃｔｇｇｃｃａｇｇｃｃｔｇｇｇａｇｇａｇｇｇｇｃｃｔａｇａｇｇｇｃｇｔｃａｇｇａｇｃａｇａｇａｇｇａｇｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｇｇａｇｔｇａａｇｇａｔｃｇｇｇｇｃａｇｇｇｔｇｃｇａｇａｇｇｇａａｃａａａｇｇａｃｃｃｃｔｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃｔｃａｃｃｔｇｇｇｃｃａｃａｇｇａｇｇａｃａｃｔｇｃｔｔｔｔｃｃｔｃｔｇａｇｇａｇｔｃａｇｇａａｃｔｇｔｇｇａｔｇｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇａａｇｃａｇｇａｃａｇｇｇｃｃｔｇｇｃｔｃａｇｇｔｇｔｃｃａｇａｇｇｃｔｇｃｇｃｔｇｇｃｃｔｃｃｔａｔｇｇｇａｔｃａｇａｃｔｇｃａｇｇｇａｇｇｇａｇｇｇｃａｇｃａｇｇｇａｔｇｔｇｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｔｇｇｇｇｃｔｇａｃｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇｃｔｃｃａｇｇｃａｔｔｇｔｃｃｃｃａｃｃｔｇｇｇｃｃｃｔｔａｃｃｃａｇｃｃｔｃｃｃｔｃａｃａｇｇｃｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｇｔｃｔｃｔｃｃｃｃｔｃｃａｃｔｃｃａｔｔｃｔｃｃａｃｃｔａｃｃｃａｃａｇｔｇｇｇｔｃａｔｔｃｔｇａｔｃａｃｃｇａａｃｔｇａｃｃａｔｇｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｇａｔｇｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｇｃｔｃｃｃｔａｇｔｇｃｃｃｔｇｇａｇａｇｇａｇｇｔｇｔｃｔａｇｔｃａｇａｇａｇｔａｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｔｇｇｃｃｔｃｔｇｔｇａｇｇａｇｃｃａｃｇｇｇｇａｃａｇｃａｔｃｃｔｇｃａｇａｔｇｇ
ｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｔｇｔｃｃｃａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｔａｃａａｇｇａｃｔｇｔｃｃｔｃｇｔｇｇａｃｃｃｔｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｃａｇｇａｇｃｔｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｃｃｃｔｔｃｃｔａｃｃｇｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇａｇｃｃｃｃｔａｃｃｃｃｔｃｔｇｔｔｇｇａａｔｃｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｔｔｃｔｔｃｔｇｇａａｇｔｃｇｇｃｔｃｔｇｇａｇａｃａｔｔｔｃｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃａａａｇｃｔｇｇｇａａｃｔｇｃｔａｔｃｔｇｔｔａｔｃｔｇｃｃｔｇｔｃｃａｇｇｔｃｔｇａａａｇａｔａｇｇａｔｔｇｃｃｃａｇｇｃａｇａａａｃｔｇｇｇａｃｔｇａｃｃｔａｔｃｔｃａｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｇｃｔｔｔｔａｃｃｃｔｔａｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｇｔｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇｔｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇａｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃ（配列番号：２６；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ１４８１０）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２６の残基４０１ないし４４６、１６８８ないし１８４７、３４７７ないし３７６３、３９０７ないし４０４３、５４１３ないし５５６８、またはその組合せによってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２６のホモログによってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２６の変種によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２６のイソ形態によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２６の断片によってコードされる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0045】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は以下の配列を有する：
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＷＶＩＬＩＴＥＬＴＭＰＡＬＰＭＶＬＨＧＳＬＶＰＷＲＧＧＶ（配列番号：２７；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ ００１０３００４７）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２７のホモログである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２７の変種である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２７のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２７の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0046】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる：
ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｔｇｇｇｔｃａｔｔｃｔｇａｔｃａｃｃｇａａｃｔｇａｃｃａｔｇｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｇａｔｇｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｇｃｔｃｃｃｔａｇｔｇｃｃｃｔｇｇａｇａｇｇａｇｇｔｇｔｃｔａｇｔｃａｇａｇａｇｔａｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｔｇｇｃｃｔｃｔｇｔｇａｇｇａｇｃｃａｃｇｇｇｇａｃａｇｃａｔｃｃｔｇｃａｇａｔｇｇｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｔｇｔｃｃｃａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｔａｃａａｇｇａｃｔｇｔｃｃｔｃｇｔｇｇａｃｃｃｔｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｃａｇｇａｇｃｔｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｃｃｃｔｔｃｃｃｃａｃｃｇｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇａｇｃｃｃｃｔａｃｃｃｃｔｃｔｇｔｔｇｇａａｔｃｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｔｔｃｔｔｃｔｇｇａａｇｔｃｇｇｃｔｃｔｇｇａｇａｃａｔｔｔｃｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃａａａｇｃｔｇｇｇａａｃｔｇｃｔａｔｃｔｇｔｔａｔｃｔｇｃｃｔｇｔｃｃａｇｇｔｃｔｇａａａｇａｔａｇｇａｔｔｇｃｃｃａｇｇｃａｇａａａｃｔｇｇｇａｃｔｇａｃｃｔａｔｃｔｃａｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｇｃｔｔｔｔａｃｃｃｔｔａｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｃｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇ（配列番号：２８；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ ００１０３００４７）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２８の残基４２ないし７５８によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２８のホモログによってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２８の変種によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２８のイソ形態によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２８の断片によってコードされる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0047】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有する：
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＫ（配列番号：２９；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ ００１０３００５０）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２９のホモログである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２９の変種である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質の配列は配列番号：２９を含む。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２９のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：２９の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0048】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドの源であるＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有する：
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：３０；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ ００１０３００４９）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３０のホモログである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３０の変種である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３０のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３０の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0049】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有する：
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＫＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：３１；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ ００１０３００４８）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３１のホモログである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３１の変種である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３１のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３１の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0050】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有する：
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：３２；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ ００１６４８）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３２のホモログである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３２の変種である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３２のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３２の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0051】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる：
ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｃｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇ（配列番号：３３；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ ００１６４８）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３３の残基４２ないし８２７によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３３のホモログによってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３３の変種によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３３のイソ形態によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３３の断片によってコードされる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0052】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有する：
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：３４；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＢＣ０５６６６５）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３４のホモログである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３４の変種である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３４のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３４の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0053】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる：
ｇｇｇｇｇａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｔｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａｇｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｃｇａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ（配列番号：３５；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＢＣ０５６６６５）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３５の残基４７ないし８３２によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３５のホモログによってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３５の変種によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３５のイソ形態によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３５の断片によってコードされる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0054】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有する：
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡ（配列番号：３６；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＪ４５９７８２）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３６のホモログである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３６の変種である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３６のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３６の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0055】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有する：
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＶＳＨＰＹＳＱＤＬＥＧＫＧＥＷＧＰ（配列番号：３７；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＪ５１２３４６）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３７のホモログである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３７の変種である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３７のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質の配列は配列番号：３７を含む。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３７の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0056】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有する：
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＥＲＧＨＧＷＧＤＡＧＥＧＡＳＰＤＣＱＡＥＡＬＳＰＰＴＱＨＰＳＰＤＲＥＬＧＳＦＬＳＬＰＡＰＬＱＡＨＴＰＳＰＳＩＬＱＱＳＳＬＰＨＱＶＰＡＰＳＨＬＰＱＮＦＬＰＩＡＱＰＡＰＣＳＱＬＬＹ（配列番号：３８；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＪ４５９７８４）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３８のホモログである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３８の変種である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質の配列は配列番号：３８を含む。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３８のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３８の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0057】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有する：
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：３９；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＪ４５９７８３）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３９のホモログである。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３９の変種である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３９のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：３９の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0058】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる：
ａａｇｔｔｔｃｃｃｔｔｃｔｃｃｃａｇｔｃｃａａｇａｃｃｃｃａａａｔｃａｃｃａｃａａａｇｇａｃｃｃａａｔｃｃｃｃａｇａｃｔｃａａｇａｔａｔｇｇｔｃｔｇｇｇｃｇｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇｔｃｔｃｃｔａｃｃｃｔｇａｔｃｃｃｔｇｇｇｔｔｃａａｃｔｃｔｇｃｔｃｃｃａｇａｇｃａｔｇａａｇｃｃｔｃｔｃｃａｃｃａｇｃａｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃｃｔｇｃａａａｃｃｔａｇｇｇａａｇａｔｔｇａｃａｇａａｔｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｃｃｔｇｃｃｃａｔｇｔｃｃｃａｇｇａｃｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃｔｇｃｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｔｔｔｃａａａｃｃｃａｃａｔｃｃｔａａａｔｃｃａｔｃｔｃｃｔａｔｃｃｇａｇｔｃｃｃｃｃａｇｔｔｃｃｔｃｃｔｇｔｃａａｃｃｃｔｇａｔｔｃｃｃｃｔｇａｔｃｔａｇｃａｃｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔａｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔａｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔａｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｔｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａａｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇａａ（配列番号：４０；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ０７７３０）。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：４０の残基６７ないし１０８８によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：４０のホモログによってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：４０の変種によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：４０のイソ形態によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は配列番号：４０の断片によってコードされる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0059】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は以下のＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＢＣ００５３０７、ＡＪ３１０９３８、ＡＪ３１０９３７、ＡＦ３３５４７８、ＡＦ３３５４７７、Ｍ２７２７４、およびＭ２６６６３の１つに記載された配列を有する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は前記ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号の１つに記載された配列によってコードされる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0060】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は以下のＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＮＭ ００１０３００５０、ＮＭ ００１０３００４９、ＮＭ ００１０３００４８、ＡＪ４５９７８２、ＡＪ５１２３４６またはＡＪ４５９７８４の１つに記載された配列によってコードされる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0061】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は以下のＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：Ｘ１３９４３，Ｘ１３９４２、Ｘ１３９４０、Ｘ１３９４１、およびＸ１３９４４の１つに記載された配列を含む配列を有する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0062】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質は当該分野で公知のいずれかの他のＫＬＫ３蛋白質である。各ＫＬＫ３蛋白質は本発明の別の実施態様を表わす。

【0063】

もう１つの実施態様において、本発明は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）ペプチドを発現する組換えリステリア株を提供する。

【0064】

１つの実施態様において、ＰＳＣＡペプチドは、ここに引用して援用する米国特許第６２６７９６０号に記載されている通りである。１つの実施態様において、ＰＳＣＡは、高グレード前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性前立腺腫瘍を含めた、全ての段階の前立腺癌を横切って広く過剰発現される。１つの実施態様において、ＰＳＣＡ遺伝子は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカード細胞表面抗原のＴｈｙ−１／Ｌｙ６ファミリーのメンバーである幹細胞抗原−２（ＳＣＡ−２）に対して３０％相同性を示し、アミノ末端シグナル配列、カルボキシ末端ＧＰＩアンカリング配列、および多重Ｎ−グリコシル化部位を持つ１２３アミノ酸蛋白質をコードする。１つの実施態様において、ＰＳＣＡ ｍＲＮＡ発現は正常な男性組織において前立腺特異的であり、アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性前立腺癌異種移植片双方において高度にアップレギュレートされる。１つの実施態様において、ＰＳＣＡ ｍＲＮＡ発現は基底細胞表皮、すなわち、前立腺の推定幹細胞区画に局所化される。１つの実施態様において、ＰＳＣＡは細胞表面で圧倒的に発現され、ＧＰＩ結合によってアンカーされる。１つの実施態様において、ＰＳＣＡ遺伝子は、８０％を超える前立腺癌における対立遺伝子利得の領域である染色体８ｑ２４．２に局所化される。

【0065】

もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡペプチドの配列は本明細書中に記載されたＰＳＣＡ配列から選択される。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡペプチドの配列は当該分野で公知のいずれかの他のＰＳＣＡ蛋白質配列である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0066】

もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡペプチドの配列は本明細書中に記載されたＰＳＣＡ配列から選択される配列を含む。

【0067】

もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡペプチドはより大きなＰＳＣＡペプチドの免疫原性断片であり、より大きなＰＳＣＡペプチドの配列は本明細書中に記載されたＰＳＣＡ配列から選択される配列である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡペプチドはより大きなＰＳＣＡペプチドの免疫原性断片であり、より大きなＰＳＣＡペプチドの配列は本明細書中に記載された通りである。もう１つの実施態様において、より大きなＰＳＣＡペプチドの配列は当該分野で公知のいずれかの他のＰＳＣＡ蛋白質配列である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0068】

もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡペプチドの配列は本明細書中に記載されたＰＳＣＡ配列の免疫原性断片を含む。

【0069】

「ＰＳＣＡペプチド」とは、もう１つの実施態様においては、全長ＰＳＣＡ蛋白質をいう。もう１つの実施態様において、該用語はＰＳＣＡ蛋白質の断片をいう。もう１つの実施態様において、該用語はＰＳＣＡシグナルペプチドを欠如するＰＳＣＡ断片をいう。もう１つの実施態様において、該用語はＰＳＣＡシグナルペプチドを除く全ＰＳＣＡ配列を含有するＰＳＣＡ蛋白質をいう。「ＰＳＣＡシグナル配列」とは、もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質に天然に見出されるいずれかのシグナル配列をいう。もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のＰＳＣＡ蛋白質はいずれのシグナル配列も含有しない。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0070】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のＰＳＣＡペプチドの源であるＰＳＣＡ蛋白質はヒトＰＳＣＡ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質はマウスＰＳＣＡ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質はげっ歯類ＰＳＣＡ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質は当該分野で公知のいずれかの他の種のＰＳＣＡ蛋白質である。もう１つの実施態様において、前記ＰＳＣＡ蛋白質の１つは「ＰＳＣＡ蛋白質」として当該分野では称される。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0071】

１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質は、１つの実施態様においてヒトＰＳＣＡ配列である、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＡＣ３９６０７、ＣＡＢ９７３４７、ＡＡＨ２３５８２、ＮＰ ００５６６３、Ｏ４３６５３、ＥＡＷ８２３１３、ＥＡＷ８２３１２、ＮＰ ００５１３７、ＮＰ ０３６５８１の１つに記載されている配列を有する。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質は、１つの実施態様においてマウスＰＣＳＡ配列である、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＮＰ ０８２４９２、ＡＡＫ８４０７３、ＥＤＬ２９４３９、ＡＡＩ１０４６３、Ｐ５７０９６、ＮＰ ０８１６７５、ＡＡＫ８３１２６の１つに記載されている配列を有する。

【0072】

１つの実施態様において、ＰＳＣＡポリペプチドは以下の配列を有する：
ＭＫＡＶＬＬＡＬＬＭ ＡＧＬＡＬＱＰＧＴＡ ＬＬＣＹＳＣＫＡＱＶ ＳＮＥＤＣＬＱＶＥＮ ＣＴＱＬＧＥＱＣＷＴ ＡＲＩＲＡＶＧＬＬＴ ＶＩＳＫＧＣＳＬＮＣ ＶＤＤＳＱＤＹＹＶＧ ＫＫＮＩＴＣＣＤＴＤ ＬＣＮＡＳＧＡＨＡＬ ＱＰＡＡＡＩＬＡＬＬ ＰＡＬＧＬＬＬＷＧＰ ＧＱＬ（配列番号：６３）。

【0073】

もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質は以下のＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＦ０４３４９８．１、ＡＪ２９７４３６．１、ＡＫ０９２４３２．１、ＡＹ３５８９１２．１、ＢＣ０２３５８２．２、ＢＣ０４８８０８．１、ＢＣ０６５１８３．１、ＢＭ７６８９６７．１．の１つに記載された配列によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質は以下のＧＥＮＢＡＮＫアクセス番号：ＡＣ１１８０２２．１２（１４４６５９．．１４６８８９）、ＣＨ４６６５４５．１、ＡＦ３１９１７３．１、ＡＫ００８８５１．１、ＢＣ１１０４６２．２の１つに記載されている配列によってコードされる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0074】

もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡポリペプチドは以下の核酸配列によってコードされる：
ａｇｇｇａｇａｇｇｃａｇｔｇａｃｃａｔｇａａｇｇｃｔｇｔｇｃｔｇｃｔｔｇｃｃｃｔｇｔｔｇａｔｇｇｃａｇｇｃｔｔｇｇｃｃｃｔｇｃａｇｃｃａｇｇｃａｃｔｇｃｃｃｔｇｃｔｇｔｇｃｔａｃｔｃｃｔｇｃａａａｇｃｃｃａｇｇｔｇａｇｃａａｃｇａｇｇａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｇｔｇｇａｇａａｃｔｇｃａｃｃｃａｇｃｔｇｇｇｇｇａｇｃａｇｔｇｃｔｇｇａｃｃｇｃｇｃｇｃａｔｃｃｇｃｇｃａｇｔｔｇｇｃｃｔｃｃｔｇａｃｃｇｔｃａｔｃａｇｃａａａｇｇｃｔｇｃａｇｃｔｔｇａａｃｔｇｃｇｔｇｇａｔｇａｃｔｃａｃａｇｇａｃｔａｃｔａｃｇｔｇｇｇｃａａｇａａｇａａｃａｔｃａｃｇｔｇｃｔｇｔｇａｃａｃｃｇａｃｔｔｇｔｇｃａａｃｇｃｃａｇｃｇｇｇｇｃｃｃａｔｇｃｃｃｔｇｃａｇｃｃｇｇｃｔｇｃｃｇｃｃａｔｃｃｔｔｇｃｇｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｃａｃｔｃｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｇａｃｃｃｇｇｃｃａｇｃｔａｔａｇｇｃｔｃｔｇｇｇｇｇｇｃｃｃｃｇｃｔｇｃａｇｃｃｃａｃａｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｔｇｃｃｃｃａｇｇｃｃｔｔｔｇｔｇｃｃａｃｔｃｃｔｃａｃａｇａａｃｃｔｇｇｃｃｃａｇｔｇｇｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｔｇｇｔｔｃｃｔｇａｇｇｃａｃａｔｃｃｔａａｃｇｃａａｇｔｔｔｇａｃｃａｔｇｔａｔｇｔｔｔｇｃａｃｃｃｃｔｔｔｔｃｃｃｃｎａａｃｃｃｔｇａｃｃｔｔｃｃｃａｔｇｇｇｃｃｔｔｔｔｃｃａｇｇａｔｔｃｃｎａｃｃｎｇｇｃａｇａｔｃａｇｔｔｔｔａｇｔｇａｎａｃａｎａｔｃｃｇｃｎｔｇｃａｇａｔｇｇｃｃｃｃｔｃｃａａｃｃｎｔｔｔｎｔｇｔｔｇｎｔｇｔｔｔｃｃａｔｇｇｃｃｃａｇｃａｔｔｔｔｃｃａｃｃｃｔｔａａｃｃｃｔｇｔｇｔｔｃａｇｇｃａｃｔｔｎｔｔｃｃｃｃｃａｇｇａａｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃｃａｔｔｔａｔｇａａｔｔｇａｇｃｃａｇｇｔｔｔｇｇｔｃｃｇｔｇｇｔｇｔｃｃｃｃｃｇｃａｃｃｃａｇｃａｇｇｇｇａｃａｇｇｃａａｔｃａｇｇａｇｇｇｃｃｃａｇｔａａａｇｇｃｔｇａｇａｔｇａａｇｔｇｇａｃｔｇａｇｔａｇａａｃｔｇｇａｇｇａｃａａｇａｇｔｔｇａｃｇｔｇａｇｔｔｃｃｔｇｇｇａｇｔｔｔｃｃａｇａｇａｔｇｇｇｇｃｃｔｇｇａｇｇｃｃｔｇｇａｇｇａａｇｇｇｇｃｃａｇｇｃｃｔｃａｃａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｎｔｃｃｃｇａａｔｇｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃａｃａｇｃｇｔａｇｇｃｃｃｔｔａａｔａａａｃａｃｃｔｇｔｔｇｇａｔａａｇｃｃａａａａａａ（配列番号：６４）。

【0075】

もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質は本明細書中に記載されたＰＳＣＡ配列のホモログである。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質は本明細書中に記載されたＰＳＣＡ配列の変種である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質は本明細書中に記載されたＰＳＣＡ配列のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質は本明細書中に記載されたＰＳＣＡ配列の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0076】

もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質は前記ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号の１つに記載された配列を含む配列を有する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0077】

もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質は当該分野で公知のいずれかの他のＰＳＣＡ蛋白質である。各ＰＳＣＡ蛋白質は本発明の別の実施態様を表わす。

【0078】

もう１つの実施態様において、本発明は葉酸ヒドロラーゼ１（ＦＯＬＨ１）ペプチドを発現する組換えリステリア株を提供する。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４１、４３、４４、および４５から選択される。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４１に記載されている。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４３に記載されている。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４４に記載されている。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４５に記載されている。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドの配列は当該分野で公知のいずれかの他のＦＯＬＨ１配列である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0079】

もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４１、４３、４４、および４５から選択される配列を含む。

【0080】

もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドはより大きなＦＯＬＨ１ペプチドの免疫原性断片であり、より大きなＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４１、４３、４４、および４５から選択される配列である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドはより大きなＦＯＬＨ１ペプチドの免疫原性断片であり、より大きなＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４１に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４３に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４４に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４５に記載されている。もう１つの実施態様において、より大きなＦＯＬＨ１ペプチドの配列は当該分野で公知のいずれかの他のＦＯＬＨ１蛋白質配列である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0081】

もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１ペプチドの配列は配列番号：４１、４３、４４、および４５から選択される配列の免疫原性断片を含む。

【0082】

「ＦＯＬＨ１ペプチド」とは、もう１つの実施態様において、全長ＦＯＬＨ１蛋白質をいう。もう１つの実施態様において、該用語はＦＯＬＨ１蛋白質の断片をいう。もう１つの実施態様において、該用語はＦＯＬＨ１シグナルペプチドを欠如するＦＯＬＨ１蛋白質の断片をいう。もう１つの実施態様において、該用語はＦＯＬＨ１シグナルペプチドを除いた全ＦＯＬＨ１配列を含有するＦＯＬＨ１蛋白質をいう。「ＦＯＬＨ１シグナル配列」とは、もう１つの実施態様において、天然でＦＯＬＨ１蛋白質に見出されるいずれかのシグナル配列をいう。もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のＦＯＬＨ１蛋白質はいずれのシグナル配列も含有しない。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0083】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のＦＯＬＨ１ペプチドの源であるＦＯＬＨ１蛋白質はヒトＦＯＬＨ１蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質はマウスＦＯＬＨ１蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質はげっ歯類ＦＯＬＨ１蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は当該分野で公知のいずれかの他の種のＦＯＬＨ１蛋白質である。もう１つの実施態様において、前記ＦＯＬＨ１蛋白質の１つは「ＦＯＬＨ１蛋白質」として当該分野では称される。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0084】

本発明の方法および組成物のＦＯＬＨ１ペプチドの源であるＦＯＬＨ１蛋白質は葉酸ヒドロラーゼ（前立腺特異的膜抗原）蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質はＰＳＭＡ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質はＮ−アセチル化アルファ連結酸性ジペプチダーゼ１蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は葉酸ヒドロラーゼ１蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質はフォリルポリ−ガンマ−グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質はグルタミン酸カルボキシラーゼＩＩ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質はグルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は膜グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質はプテロイルポリ−ガンマ−グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は当該分野で公知であるいずれかの他のタイプのＦＯＬＨ１蛋白質である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0085】

もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は以下の配列を有する：
ＭＷＮＬＬＨＥＴＤＳＡＶＡＴＡＲＲＰＲＷＬＣＡＧＡＬＶＬＡＧＧＦＦＬＬＧＦＬＦＧＷＦＩＫＳＳＮＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＹＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＡＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＰＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＫＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＰＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＮＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＨＮＬＴＫＥＬＫＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＧＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＩＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＳＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＱＤＦＤＫＳＫＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＫＡＷＧＥＶＫＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ（配列番号：４１；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＢＣ０２５６７２）。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４１のホモログである。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４１の変種である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４１のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４１の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0086】

もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる：
ｃｔｇｇａｃｃｃｃａｇｇｔｃｔｇｇａｇｃｇａａｔｔｃｃａｇｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｔｇａｔａａｇｃｇａｇｇｃａｔｔａｇｔｇａｇａｔｔｇａｇａｇａｇａｃｔｔｔａｃｃｃｃｇｃｃｇｔｇｇｔｇｇｔｔｇｇａｇｇｇｃｇｃｇｃａｇｔａｇａｇｃａｇｃａｇｃａｃａｇｇｃｇｃｇｇｇｔｃｃｃｇｇｇａｇｇｃｃｇｇｃｔｃｔｇｃｔｃｇｃｇｃｃｇａｇａｔｇｔｇｇａａｔｃｔｃｃｔｔｃａｃｇａａａｃｃｇａｃｔｃｇｇｃｔｇｔｇｇｃｃａｃｃｇｃｇｃｇｃｃｇｃｃｃｇｃｇｃｔｇｇｃｔｇｔｇｃｇｃｔｇｇｇｇｃｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇｇｃｇｇｇｔｇｇｃｔｔｃｔｔｔｃｔｃｃｔｃｇｇｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｇｇｇｔｇｇｔｔｔａｔａａａａｔｃｃｔｃｃａａｔｇａａｇｃｔａｃｔａａｃａｔｔａｃｔｃｃａａａｇｃａｔａａｔａｔｇａａａｇｃａｔｔｔｔｔｇｇａｔｇａａｔｔｇａａａｇｃｔｇａｇａａｃａｔｃａａｇａａｇｔｔｃｔｔａｔａｔａａｔｔｔｔａｃａｃａｇａｔａｃｃａｃａｔｔｔａｇｃａｇｇａａｃａｇａａｃａａａａｃｔｔｔｃａｇｃｔｔｇｃａａａｇｃａａａｔｔｃａａｔｃｃｃａｇｔｇｇａａａｇａａｔｔｔｇｇｃｃｔｇｇａｔｔｃｔｇｔｔｇａｇｃｔａｇｃａｃａｔｔａｔｇａｔｇｔｃｃｔｇｔｔｇｔｃｃｔａｃｃｃａａａｔａａｇａｃｔｃａｔｃｃｃａａｃｔａｃａｔｃｔｃａａｔａａｔｔａａｔｇａａｇａｔｇｇａａａｔｇａｇａｔｔｔｔｃａａｃａｃａｔｃａｔｔａｔｔｔｇａａｃｃａｃｃｔｃｃｔｃｃａｇｇａｔａｔｇａａａａｔｇｔｔｔｃｇｇａｔａｔｔｇｔａｃｃａｃｃｔｔｔｃａｇｔｇｃｔｔｔｃｔｃｔｃｃｔｃａａｇｇａａｔｇｃｃａｇａｇｇｇｃｇａｔｃｔａｇｔｇｔａｔｇｔｔａａｃｔａｔｇｃａｃｇａａｃｔｇａａｇａｃｔｔｃｔｔｔａａａｔｔｇｇａａｃｇｇｇａｃａｔｇａａａａｔｃａａｔｔｇｃｔｃｔｇｇｇａａａａｔｔｇｔａａｔｔｇｃｃａｇａｔａｔｇｇｇａａａｇｔｔｔｔｃａｇａｇｇａａａｔａａｇｇｔｔａａａａａｔｇｃｃｃａｇｃｔｇｇｃａｇｇｇｇｃｃａａａｇｇａｇｔｃａｔｔｃｔｃｔａｃｔｃｃｇａｃｃｃｔｇｃｔｇａｃｔａｃｔｔｔｇｃｔｃｃｔｇｇｇｇｔｇａａｇｔｃｃｔａｔｃｃａｇａｔｇｇｔｔｇｇａａｔｃｔｔｃｃｔｇｇａｇｇｔｇｇｔｇｔｃｃａｇｃｇｔｇｇａａａｔａｔｃｃｔａａａｔｃｔｇａａｔｇｇｔｇｃａｇｇａｇａｃｃｃｔｃｔｃａｃａｃｃａｇｇｔｔａｃｃｃａｇｃａａａｔｇａａｔａｔｇｃｔｔａｔａｇｇｃｇｔｇｇａａｔｔｇｃａｇａｇｇｃｔｇｔｔｇｇｔｃｔｔｃｃａａｇｔａｔｔｃｃｔｇｔｔｃａｔｃｃａａｔｔｇｇａｔａｃｔａｔｇａｔｇｃａｃａｇａａｇｃｔｃｃｔａｇａａａａａａｔｇｇｇｔｇｇｃｔｃａｇｃａｃｃａｃｃａｇａｔａｇｃａｇｃｔｇｇａｇａｇｇａａｇｔｃｔｃａａａｇｔｇｃｃｃｔａｃａａｔｇｔｔｇｇａｃｃｔｇｇｃｔｔｔａｃｔｇｇａａａｃｔｔｔｔｃｔａｃａｃａａａａａｇｔｃａａｇａｔｇｃａｃａｔｃｃａｃｔｃｔａｃｃａａｔｇａａｇｔｇａｃａａｇａａｔｔｔａｃａａｔｇｔｇａｔａｇｇｔａｃｔｃｔｃａｇａｇｇａｇｃａｇｔｇｇａａｃｃａｇａｃａｇａｔａｔｇｔｃａｔｔｃｔｇｇｇａｇｇｔｃａｃｃｇｇｇａｃｔｃａｔｇｇｇｔｇｔｔｔｇｇｔｇｇｔａｔｔｇａｃｃｃｔｃａｇａｇｔｇｇａｇｃａｇｃｔｇｔｔｇｔｔｃａｔｇａａａｔｔｇｔｇａｇｇａｇｃｔｔｔｇｇａａｃａｃｔｇａａａａａｇｇａａｇｇｇｔｇｇａｇａｃｃｔａｇａａｇａａｃａａｔｔｔｔｇｔｔｔｇｃａａｇｃｔｇｇｇａｔｇｃａｇａａｇａａｔｔｔｇｇｔｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｃｔａｃｔｇａｇｔｇｇｇｃａｇａｇｇａｇａａｔｔｃａａｇａｃｔｃｃｔｔｃａａｇａｇｃｇｔｇｇｃｇｔｇｇｃｔｔａｔａｔｔａａｔｇｃｔｇａｃｔｃａｔｃｔａｔａｇａａｇｇａａａｃｔａｃａｃｔｃｔｇａｇａｇｔｔｇａｔｔｇｔａｃａｃｃｇｃｔｇａｔｇｔａｃａｇｃｔｔｇｇｔａｃａｃａａｃｃｔａａｃａａａａｇａｇｃｔｇａａａａｇｃｃｃｔｇａｔｇａａｇｇｃｔｔｔｇａａｇｇｃａａａｔｃｔｃｔｔｔａｔｇａａａｇｔｔｇｇａｃｔａａａａａａａｇｔｃｃｔｔｃｃｃｃａｇａｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｔｇｃｃｃａｇｇａｔａａｇｃａａａｔｔｇｇｇａｔｃｔｇｇａａａｔｇａｔｔｔｔｇａｇｇｔｇｔｔｃｔｔｃｃａａｃｇａｃｔｔｇｇａａｔｔｇｃｔｔｃａｇｇｃａｇａｇｃａｃｇｇｔａｔａｃｔａａａａａｔｔｇｇｇａａａｃａａａｃａａａｔｔｃａｇｃｇｇｃｔａｔｃｃａｃｔｇｔａｔｃａｃａｇｔｇｔｃｔａｔｇａａａｃａｔａｔｇａｇｔｔｇｇｔｇｇａａａａｇｔｔｔｔａｔｇａｔｃｃａａｔｇｔｔｔａａａｔａｔｃａｃｃｔｃａｃｔｇｔｇｇｃｃｃａｇｇｔｔｃｇａｇｇａｇｇｇａｔｇｇｔｇｔｔｔｇａｇｃｔａｇｃｃａａｔｔｃｃａｔａｇｔｇｃｔｃｃｃｔｔｔｔｇａｔｔｇｔｃｇａｇａｔｔａｔｇｃｔｇｔａｇｔｔｔｔａａｇａａａｇｔａｔｇｃｔｇａｃａａａａｔｃｔａｃａｇｔａｔｔｔｃｔａｔｇａａａｃａｔｃｃａｃａｇｇａａａｔｇａａｇａｃａｔａｃａｇｔｇｔａｔｃａｔｔｔｇａｔｔｃａｃｔｔｔｔｔｔｃｔｇｃａｇｔａａａｇａａｔｔｔｔａｃａｇａａａｔｔｇｃｔｔｃｃａａｇｔｔｃａｇｔｇａｇａｇａｃｔｃｃａｇｇａｃｔｔｔｇａｃａａａａｇｃａａｇｃａｔｇｔｃａｔｃｔａｔｇｃｔｃｃａａｇｃａｇｃｃａｃａａｃａａｇｔａｔｇｃａｇｇｇｇａｇｔｃａｔｔｃｃｃａｇｇａａｔｔｔａｔｇａｔｇｃｔｃｔｇｔｔｔｇａｔａｔｔｇａａａｇｃａａａｇｔｇｇａｃｃｃｔｔｃｃａａｇｇｃｃｔｇｇｇｇａｇａａｇｔｇａａｇａｇａｃａｇａｔｔｔａｔｇｔｔｇｃａｇｃｃｔｔｃａｃａｇｔｇｃａｇｇｃａｇｃｔｇｃａｇａｇａｃｔｔｔｇａｇｔｇａａｇｔａｇｃｃｔａａｇａｇｇａｔｔｃｔｔｔａｇａｇａａｔｃｃｇｔａｔｔｇａａｔｔｔｇｔｇｔｇｇｔａｔｇｔｃａｃｔｃａｇａａａｇａａｔｃｇｔａａｔｇｇｇｔａｔａｔｔｇａｔａａａｔｔｔｔａａａａｔｔｇｇｔａｔａｔｔｔｇａａａｔａａａｇｔｔｇａａｔａｔｔａｔａｔａｔａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ（配列番号：４２；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＢＣ０２５６７２）。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４２の残基１６０ないし２３１９によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４２のホモログによってコードされる。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４２の変種によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４２のイソ形態によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４２の断片によってコードされる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0087】

もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は以下の配列を有する：
ＭＷＮＬＬＨＥＴＤＳＡＶＡＴＡＲＲＰＲＷＬＣＡＧＡＬＶＬＡＧＧＦＦＬＬＧＦＬＦＧＷＦＩＫＳＳＮＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＹＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＡＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＰＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＫＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＰＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＮＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＨＮＬＴＫＥＬＫＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＧＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＩＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＳＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＱＤＦＤＫＳＫＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＫＡＷＧＥＶＫＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ（配列番号：４３；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＮＭ ００１０１４９８６）。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４３のホモログである。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４３の変種である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４３のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４３の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0088】

もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は以下の配列を有する：
ＭＷＮＬＬＨＥＴＤＳＡＶＡＴＡＲＲＰＲＷＬＣＡＧＡＬＶＬＡＧＧＦＦＬＬＧＦＬＦＧＷＦＩＫＳＳＮＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＹＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＡＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＰＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＫＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＰＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＮＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＨＮＬＴＫＥＬＫＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＧＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＩＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＳＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＱＤＦＤＫＳＮＰＩＶＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＫＡＷＧＥＶＫＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ（配列番号：４４；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＮＭ ００４４７６）。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４４のホモログである。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４４の変種である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４４のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４４の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0089】

もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は以下の配列を有する：
ＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＡＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＰＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＫＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＰＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＮＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＨＮＬＴＫＥＬＫＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＧＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＩＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＳＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＱＤＦＤＫＳＮＰＩＶＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＫＡＷＧＥＶＫＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ（配列番号：４５；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＢＣ１０８７１９）。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４５のホモログである。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４５の変種である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４５のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は配列番号：４５の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0090】

もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は以下のＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＮＦ ００１０１４９８６、ＮＭ ００４４７６、ＢＣ１０８７１９の１つに記載された配列のよってコードされる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0091】

もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は前記ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号の１つに記載された配列を含む配列を有する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0092】

もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は当該分野で公知のいずれかの他のＦＯＬＨ１蛋白質である。各ＦＯＬＨ１蛋白質は本発明の別の実施態様を表わす。

【0093】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株およびアジュバントを含むワクチンを提供する。

【0094】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む免疫原性組成物を提供する。

【0095】

もう１つの実施態様において、組換えリステリア株はＫＬＫ３ペプチドを含む組換えポリペプチドを発現する。もう１つの実施態様において、組換えリステリア株は組換えポリペプチドを含み、該組換えペプチドはＫＬＫ３ペプチドを含む。もう１つの実施態様において、組換えリステリア株は、組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを含む。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0096】

もう１つの実施態様において、組換えリステリア株はＰＳＣＡペプチドを含む組換えポリペプチドを発現する。もう１つの実施態様において、組換えリステリア株は組換えポリペプチドを含み、組換えペプチドはＰＳＣＡペプチドを含む。もう１つの実施態様において、組換えリステリア株は組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを含む。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0097】

もう１つの実施態様において、組換えリステリア株は、ＦＯＬＨ１ペプチドを含む組換えポリペプチドを発現する。もう１つの実施態様において、組換えリステリア株は組換えポリペプチドを含み、組換えペプチドはＦＯＬＨ１ペプチドを含む。もう１つの実施態様において、組換えリステリア株は、組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを含む。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0098】

組換えリステリア株によって発現されるＫＬＫ３ペプチドは、もう１つの実施態様において、融合ペプチドの形態である。もう１つの実施態様において、融合ペプチドは、非ＫＬＫ３ペプチドをさらに含む。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３ペプチドはＫＬＫ３ペプチドの免疫原性を高める。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0099】

もう１つの実施態様において、組換えリステリア株によって発現されるＰＳＣＡペプチドは融合ペプチドの形態である。もう１つの実施態様において、融合ペプチドは非ＰＳＣＡペプチドをさらに含む。もう１つの実施態様において、非ＰＳＣＡペプチドはＰＳＣＡペプチドの免疫原性を高める。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0100】

もう１つの実施態様において、組換えリステリア株によって発現されるＦＯＬＨ１ペプチドは融合ペプチドの形態である。もう１つの実施態様において、融合ペプチドは非ＦＯＬＨ１ペプチドをさらに含む。もう１つの実施態様において、非ＦＯＬＨ１ペプチドはＦＯＬＨ１ペプチドの免疫原性を高める。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0101】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物の非ＫＬＫ３／非ＦＯＬＨ１ペプチドは、ＬＬＯペプチドである。もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物の非ＫＬＫ３／非ＦＯＬＨ１ペプチドは非溶血性ＬＬＯペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３／非ＦＯＬＨ１／非ＰＳＣＡペプチドはＡｃｔＡペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３／非ＦＯＬＨ１／非ＰＳＣＡペプチドは、ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３／非ＦＯＬＨ１／非ＰＳＣＡペプチドは当該分野で公知のいずれかの他の非ＫＬＫ３／非ＦＯＬＨ１／非ＰＳＣＡペプチドである。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0102】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む組換えリステリア株を提供する。もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを含む組換えリステリア株を提供する。もう１つの実施態様において、リステリアワクチン株は種リステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）の株である。もう１つの実施態様において、本発明は、リステリア株を含む組成物を提供する。もう１つの実施態様において、本発明は、リステリア株を含む免疫原性組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0103】

もう１つの実施態様において、リステリア株は組換えリステリア・シーリジェリー株である。もう１つの実施態様において、リステリア株は組換えリステリア・グレイー株である。もう１つの実施態様において、リステリア株は組換えリステリア・イバノビイ株である。もう１つの実施態様において、リステリア株は組換えリステリア・ムライ株である。もう１つの実施態様において、リステリア株は組換えリステリア・ウェルシメリー株である。もう１つの実施態様において、リステリア株は当該分野で公知のいずれかの他のリステリア種の組換え株である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0104】

もう１つの実施態様において、本発明の組換えリステリア株は動物宿主を通じて継体されてきた。もう１つの実施態様において、該継体はワクチンベクターとしての株の効率を最大化させる。もう１つの実施態様において、該継体はリステリア株の免疫原性を安定化させる。もう１つの実施態様において、該継体はリステリア株のビルレンスを安定化させる。もう１つの実施態様において、該継体はリステリア株の免疫原性を増加させる。もう１つの実施態様において、該継体はリステリア株のビルレンスを増加させる。もう１つの実施態様において、該継体はリステリア株の不安定なサブ株を除去する。もう１つの実施態様において、該継体はリステリア株の不安定なサブ株の広まりを低下させる。もう１つの実施態様において、リステリア株はＫＬＫ３ペプチド含有組換えペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含有する。もう１つの実施態様において、リステリア株はＰＳＣＡペプチド含有組換えペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含有する。もう１つの実施態様において、リステリア株はＦＯＬＨ１ペプチド含有組換えペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含有する。もう１つの実施態様において、リステリア株はＫＬＫ３ペプチド含有組換えペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを運ぶ。もう１つの実施態様において、リステリア株は、ＰＳＣＡペプチド含有組換えペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを運ぶ。もう１つの実施態様において、リステリア株はＦＯＬＨ１ペプチド含有組換えペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを運ぶ。動物宿主を通じて組換えリステリア株を継体する方法は当該分野でよく知られており、例えば、ここに引用して援用する米国特許出願第２００６／０２３３８３５号（特許文献１）に記載されている。もう１つの実施態様において、該継体は当該分野で公知のいずれか他の方法によって行われる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0105】

もう１つの実施態様において、本発明の方法で利用される組換えリステリア株は凍結された細胞バンクに貯蔵されている。もう１つの実施態様において、組換えリステリア株は、凍結乾燥された細胞バンクに貯蔵されている。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0106】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物の細胞バンクは、マスター細胞バンクである。もう１つの実施態様において、細胞バンクはワーキング細胞バンクである。もう１つの実施態様において、細胞バンクはＧＭＰ（Good Manufacturing Practice）細胞バンクである。もう１つの実施態様において、細胞バンクは臨床グレードの材料の生産を意図している。もう１つの実施態様において、細胞バンクはヒト使用のために規制プラクティスに適合している。もう１つの実施態様において、細胞バンクは当該分野で公知のいずれかの他のタイプの細胞バンクである。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0107】

「ＧＭＰ（Good Manufacturing Practice）」は、もう１つの実施態様において、米国連邦規則集の（２１ ＣＦＲ２１０−２１１）によって定義されている。もう１つの実施態様において、「ＧＭＰ（Good Manufacturing Practice）」は、臨床グレードの材料の生産のための、またはヒト消費のための他の標準；例えば、米国以外の国の標準によって定義される。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0108】

もう１つの実施態様において、本発明の方法で利用される組換えリステリア株はワクチン用量のバッチからのものである。

【0109】

もう１つの実施態様において、本発明の方法で利用される組換えリステリア株は、本明細書中に開示された方法によって生産される凍結されたストックからのものである。

【0110】

もう１つの実施態様において、本発明の方法で利用される組換えリステリア株は本明細書中に開示された方法によって生産される凍結乾燥ストックからのものである。

【0111】

もう１つの実施態様において、本発明のワクチン用量の細胞バンク、凍結されたストック、またはバッチは、９０％を超える解凍に際して活力を呈する。もう１つの実施態様において、解凍に続いて、２４時間、低温保存のために貯蔵し、または凍結貯蔵する。もう１つの実施態様において、貯蔵は２日間である。もう１つの実施態様において、貯蔵は３日間である。もう１つの実施態様において、貯蔵は４日間である。もう１つの実施態様において、貯蔵は１週間である。もう１つの実施態様において、貯蔵は２週間である。もう１つの実施態様において、貯蔵は３週間である。もう１つの実施態様において、貯蔵は１ヶ月間である。もう１つの実施態様において、貯蔵は２ヶ月間である。もう１つの実施態様において、貯蔵は３ヶ月間である。もう１つの実施態様において、貯蔵は５ヶ月間である。もう１つの実施態様において、貯蔵は６ヶ月間である。もう１つの実施態様において、貯蔵は９ヶ月間である。もう１つの実施態様において、貯蔵は１年間である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0112】

もう１つの実施態様において、本発明のワクチン用量の細胞バンク、凍結されたストック、またはバッチは、リステリア株の培養を栄養培地中で成長させ、グリセロールを含む溶液中で培養を凍結し、リステリア株を摂氏−２０°未満で貯蔵することを含む方法によって低温保存される。もう１つの実施態様において、該温度は約摂氏−７０°である。もう１つの実施態様において、該温度は約摂氏−７０ないし−８０°である。

【0113】

もう１つの実施態様において、本発明のワクチン用量の細胞バンク、凍結されたストック、またはバッチは、（後に記載するように）リステリア株の培養を本発明の規定された培地中で成長させ、該培養をグリセロールを含む溶液中で凍結し、リステリア株を摂氏−２０°未満で貯蔵することを含む方法によって低温保存される。もう１つの実施態様において、該温度は約摂氏−７０°である。もう１つの実施態様において、該温度は約摂氏−７０ないし−８０°である。もう１つの実施態様において、本発明の定義された微生物学的培地のいずれかをこの方法で用いてもよい。各定義された微生物学的培地は本発明の別の実施態様を表わす。

【0114】

本発明の方法および組成物のもう１つの実施態様において、培養（例えば、リステリアワクチン用量のバッチを生産するのに用いるリステリアワクチン株の培養）は細胞バンクから接種する。もう１つの実施態様において、培養は凍結されたストックから接種される。もう１つの実施態様において、培養はスターター培養から接種される。もう１つの実施態様において、培養はコロニーから接種される。もう１つの実施態様において、培養は中期ｌｏｇ成長相において接種される。もう１つの実施態様において、培養はほぼ中期ｌｏｇ成長相において接種される。もう１つの実施態様において、培養はもう１つの成長相において接種される。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0115】

もう１つの実施態様において、凍結に用いられる溶液は、グリセロールの代わりに、もう１つの束一的な添加剤、または凍結防止特性を持つ添加剤を含有する。もう１つの実施態様において、凍結のために用いる溶液は、グリセロールに加えてもう１つの束一的添加剤、または凍結防止特性を持つ添加剤を含有する。もう１つの実施態様において、添加剤はマンニトールである。もう１つの実施態様において、添加剤はＤＭＳＯである。もう１つの実施態様において、添加剤はスクロースである。もう１つの実施態様において、添加剤は、当該分野で知られている、いずれかの他の束一的添加剤または凍結防止特性を持つ添加剤である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0116】

もう１つの実施態様において、リステリア株の培養を成長させるのに利用される栄養培地はＬＢである。もう１つの実施態様において、栄養培地はＴＢである。もう１つの実施態様において、栄養培地は修飾された動物産物フリーのテリフィックブロス（Terrific Broth）である。もう１つの実施態様において、栄養培地は規定された培地である。もう１つの実施態様において、栄養培地は本発明の規定された培地である。もう１つの実施態様において、栄養培地は当該分野で公知のいずれかの他のタイプの栄養培地である。各可能性は本発明の別の実施態様を表す。

【0117】

本発明の方法および組成物のもう１つの実施態様において、成長させる工程はシェーカーフラスコ中で行う。もう１つの実施態様において、フラスコは邪魔板を備えたシェーカーフラスコである。もう１つの実施態様において、成長はバッチファメンター中で行う。もう１つの実施態様において、成長は攪拌されたタンクまたはフラスコ中で行う。もう１つの実施態様において、成長はエアフリットファメンター中で行う。もう１つの実施態様において、成長は供給バッチ中で行う。もう１つの実施態様において、成長は連続的細胞リアクター中で行う。もう１つの実施態様において、成長は固定された細胞リアクター中で行う。もう１つの実施態様において、成長は当該分野で知られた細菌を成長させるいずれかの他の手段で行う。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0118】

もう１つの実施態様において、一定のｐＨを（例えば、バッチファメンター中での）培養の成長の間に維持する。もう１つの実施態様において、ｐＨは約７．０に維持する。もう１つの実施態様において、ｐＨは約６である。もう１つの実施態様において、ｐＨは約６．５である。もう１つの実施態様において、ｐＨは約７．５である。もう１つの実施態様において、ｐＨは約８である。もう１つの実施態様において、ｐＨは６．５ないし７．５である。もう１つの実施態様において、ｐＨは６ないし８である。もう１つの実施態様において、ｐＨは６ないし７である。もう１つの実施態様において、ｐＨは７ないし８である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0119】

もう１つの実施態様において、一定の温度を培養の成長の間に維持する。もう１つの実施態様において、該温度は約３７℃に維持する。もう１つの実施態様において、該温度は３７℃である。もう１つの実施態様において、該温度は２５℃である。もう１つの実施態様において、該温度は２７℃である。もう１つの実施態様において、該温度は２８℃である。もう１つの実施態様において、該温度は３０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は３２℃である。もう１つの実施態様において、該温度は３４℃である。もう１つの実施態様において、該温度は３５℃である。もう１つの実施態様において、該温度は３６℃である。もう１つの実施態様において、該温度は３８℃である。もう１つの実施態様において、該温度は３９℃である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0120】

もう１つの実施態様において、一定の溶解酸素濃度を培養の成長の間に維持する。もう１つの実施態様において、溶解酸素濃度は飽和の２０％に維持する。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の１５％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の１６％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の１８％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の２２％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の２５％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の３０％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の３５％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の４０％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の４５％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の５０％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の５５％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の６０％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の６５％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の７０％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の７５％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の８０％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の８５％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の９０％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の９５％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の１００％である。もう１つの実施態様において、該濃度は飽和の１００％近くである。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0121】

本発明の方法および組成物のもう１つの実施態様において、リステリア培養は液体窒素中でフラッシュ凍結し、続いて、最終の凍結温度にて貯蔵する。もう１つの実施態様において、培養は、例えば培養のバイアルを最終の貯蔵温度とすることによって、より徐々に凍結させる。もう１つの実施態様において、培養は、細菌培養を凍結するための当該分野で知られたいずれかの他の方法によって凍結させる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0122】

本発明の方法および組成物のもう１つの実施態様において、培養の貯蔵温度は摂氏−２０℃および−８０℃の間である。もう１つの実施態様において、該温度は−２０℃をかなり下まわる。もう１つの実施態様において、該温度は−７０℃よりも暖かくはない。もう１つの実施態様において、該温度は−７０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は約−７０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−２０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は約−２０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−３０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−４０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−５０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−６０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−８０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−３０ないし−７０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−４０ないし−７０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−５０ないし−７０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−６０ないし−７０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−３０ないし−８０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−４０ないし−８０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−５０ないし−８０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−６０ないし−８０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−７０ないし−８０℃である。もう１つの実施態様において、該温度は−７０℃よりも冷たい。もう１つの実施態様において、該温度は−８０℃よりも冷たい。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0123】

組換えリステリア株の凍結乾燥および低温保存のための方法は当業者によく知られている。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0124】

本発明の方法および組成物のリステリア含有組成物は、もう１つの実施態様において、免疫原性組成物である。もう１つの実施態様において、該組成物は、それが本発明のリステリア株を含むことによって固有に免疫原性である。もう１つの実施態様において、該組成物はさらにアジュバントを含む。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0125】

いくつかの実施態様において用語「含む」とは、他の組換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列を含むこと、ならびに１つの実施態様においては、抗原またはリステリアポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列を含んでもよい当該分野で知られているであろう他のポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列を含むことをいう。いくつかの実施態様において、用語「より実質的になる」とは、具体的な組換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列、あるいはその断片を有する、本明細書中で提供された方法で用いるための組成物についてをいう。しかしながら、組換えポリペブチドの有用性に直接的には関与しない他のポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列を含めてもよい。いくつかの実施態様において、用語「よりなる」とは、本明細書中に記載されたいずれかの形態または実施態様における特定の組換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列、あるいは断片、あるいは本明細書中で提供された組換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列、あるいは断片の組合せを有する、本明細書中に提供された方法で用いるための組成物についてをいう。

【0126】

もう１つの実施態様において、本発明は、非ＫＬＫ３ペプチドに操作可能に連結されたＫＬＫ３ペプチドを含む組換えポリペプチドを提供する。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３ペプチドはＬＬＯペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３ペプチドはＡｃｔＡペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３ペプチドはＰＥＳＴ様配列ペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３ペプチドは、ＫＬＫ３ペプチドの免疫原性を高める。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３ペプチドは当該分野で公知のいずれかの他のタイプのペプチドである。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0127】

もう１つの実施態様において、本発明は、非ＰＳＣＡペプチドに操作可能に連結されたＰＳＣＡペプチドを含む組換えポリペプチドを提供する。もう１つの実施態様において、非ＰＳＣＡペプチドはＬＬＯペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＰＳＣＡペプチドはＡｃｔＡペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＰＳＣＡペプチドはＰＥＳＴ様配列ペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＰＳＣＡペプチドはＰＳＣＡペプチドの免疫原性を高める。もう１つの実施態様において、非ＰＳＣＡペプチドは当該分野で公知のいずれかの他のタイプのペプチドである。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0128】

もう１つの実施態様において、本発明は、非ＦＯＬＨ１ペプチドに操作可能に連結されたＦＯＬＨ１ペプチドを含む組換えポリペプチドを提供する。もう１つの実施態様において、非ＦＯＬＨ１ペプチドはＬＬＯペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＦＯＬＨ１ペプチドはＡｃｔＡペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＦＯＬＨ１ペプチドはＰＥＳＴ様配列ペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＦＯＬＨ１ペプチドはＦＯＬＨ１ペプチドの免疫原性を高める。もう１つの実施態様において、非ＦＯＬＨ１ペプチドは当該分野で公知のいずれかの他のタイプのペプチドである。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0129】

本明細書中で提供されるように、ＬＬＯ−ＫＬＫ３融合を発現する組換えリステリア株はマウスを腫瘍から保護し、抗原特異的ＣＴＬの形成を誘導する。かくして、前立腺特異的抗原（例えば、前立腺特異的抗原／ＫＬＫ３、前立腺特異的膜抗原／ＦＯＬＨ１、前立腺幹細胞抗原／ＰＳＣＡ等）を発現するリステリア株は抗原性であって、ワクチン接種方法において有効である。さらに、前立腺特異的抗原（例えば、前立腺特異的抗原／ＫＬＫ３、前立腺特異的膜抗原／ＦＯＬＨ１、前立腺幹細胞抗原／ＰＳＣＡ等）に対するＬＬＯおよびその断片の融合は抗原性であって、ワクチン接種方法において有効である。

【0130】

さらに、本明細書中で提供されるように、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、Ｃ５７Ｂ１／６マウスからの樹立された皮下ＨＰＶ−１６不滅化腫瘍の退行を誘導する（実施例１）。さらに、本明細書中で提供されるように、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰはマウスを腎臓細胞癌腫であるＲＥＮＣＡ−ＮＰから保護する（実施例３）。さらに、本明細書中で提供されるように、ＡｃｔＡおよびＰＥＳＴ様配列に対する抗原の融合は同様な結果を生じる。かくして、非溶血性ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、およびＰＥＳＴ様配列は、全て、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡおよびＦＯＬＨ１ペプチドの免疫原性を高めるにおいて有効である。

【0131】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドおよびアジュバントを含むワクチンを提供する。

【0132】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。

【0133】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードする組換えワクチンベクターを提供する。

【0134】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を提供する。

【0135】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子およびアジュバントを含むワクチンを提供する。

【0136】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を提供する。

【0137】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む組換えワクチンベクターを提供する。

【0138】

他の実施態様において、本発明の方法および組成物のアジュバントはモンタニドＩＳＡ５１である。モンタニドＩＳＡ５１は天然代謝可能油および精製された乳化剤を含有する。もう１つの実施態様において、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦである。もう１つの実施態様において、アジュバントはＫＬＨである。組換えＧＭ−ＣＳＦは、もう１つの実施態様において、酵母（S.cerevisiae）ベクターにおいて成長させたヒト蛋白質である．ＧＭ−ＣＳＦは造血系先祖細胞、ＡＰＣ、ならびに樹状細胞およびＴ細胞のクローン拡大および分化を促進する。

【0139】

もう１つの実施態様において、アジュバントはサイトカインである。もう１つの実施態様において、アジュバントは成長因子である。もう１つの実施態様において、アジュバントは細胞集団である。もう１つの実施態様において、アジュバントはＱＳ２１である。もう１つの実施態様において、アジュバントはフロイントの不完全アジュバントである。もう１つの実施態様において、アジュバントはリン酸アルミニウムである。もう１つの実施態様において、アジュバントは水酸化アルミニウムである。もう１つの実施態様において、アジュバントはＢＣＧである。もう１つの実施態様において、アジュバントはミョウバンである。もう１つの実施態様において、アジュバントはインターロイキンである。もう１つの実施態様において、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧオリゴヌクレオチドである。もう１つの実施態様において、アジュバントはクイール（ｑｕｉｌｌ）グリコシドである。もう１つの実施態様において、アジュバントはモノホスホリル脂質Ａである。もう１つの実施態様において、アジュバントはリポソームである。もう１つの実施態様において、アジュバントは細菌マイトジェンである。もう１つの実施態様において、アジュバントは細菌トキシンである。もう１つの実施態様において、アジュバントはケモカインである。もう１つの実施態様において、アジュバントは当該分野で公知のいずれかの他のタイプのアジュバントである。もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のワクチンは前記アジュバントのうち２つを含む。他の実施態様において、ワクチンは２を超える前記アジュバントを含む。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0140】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与し、それにより、対象において抗ＫＬＫ３免疫応答を誘導することを含む、対象において抗ＫＬＫ３免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0141】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＫＬＫ３発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＫＬＫ３発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＫＬＫ３発現腫瘍を治療する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現腺癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺の腺癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現乳癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現卵巣腫瘍である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0142】

１つの実施態様において、「治療する」とは、治療的処置および予防または予防的手段を共にいい、目的は本明細書中に記載された標的とされた病理学的疾患または障害を予防し、または軽減することにある。かくして、１つの実施態様において、治療は、病気、障害または疾患に直接的に影響させ、またはそれらを治癒し、抑制し、阻害し、予防し、その重症度を低下させ、その開始を遅延させ、またはそれに関連する兆候を低下させ、またはその組合せを含んでもよい。かくして、１つの実施態様において、「治療する」とは、とりわけ、進行を遅延させ、緩解を早め、緩解を誘導し、緩解を増大させ、回復を早め、別の治療法に対する抵抗性の効力を増大させ、またはその抵抗性を減少させ、またはその組合せをいう。１つの実施態様において、「予防する」または「妨げる」とは、とりわけ、兆候の開始を遅延させ、病気の再発を予防し、再発エピソードの数または頻度を減少させ、兆候的エピソードの間の潜伏期を増大させ、またはその組合せをいう。１つの実施態様において、「抑制する」、「阻害する」または「に対して保護する」とは、とりわけ、兆候の重症度を低下させ、急性エピソードの重症度を低下させ、兆候の数を低下させ、病気関連兆候の発生率を低下させ、兆候の潜伏期を低下させ、兆候を緩和し、二次的兆候を低下させ、二次的感染を低下させ、患者の生存を遅延させ、またはその組合せをいう。

【0143】

もう１つの実施態様において、本発明は、ＫＬＫ３発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物をヒト対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＫＬＫ３発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ＫＬＫ３発現腫瘍からヒト対象を保護する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0144】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与し、それにより、対象において抗ＰＳＣＡ免疫応答を誘導することを含む、対象において抗ＰＳＣＡ免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0145】

もう１つの実施態様において、本発明は、対象においてＰＳＣＡ発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＰＳＣＡ発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＰＳＣＡ発現腫瘍を治療する。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現腺癌である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺の腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0146】

もう１つの実施態様において、本発明は、ＰＳＣＡ発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物をヒト対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＰＳＣＡ発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ＰＳＣＡ発現腫瘍に対してヒト対象を保護する。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腺癌はＰＳＣＡ発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0147】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与し、それにより、対象において抗ＦＯＬＨ１免疫応答を誘導することを含む、対象において抗ＦＯＬＨ１免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0148】

もう１つの実施態様において、本発明は、対象においてＦＯＬＨ１発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＦＯＬＨ１発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＦＯＬＨ１発現腫瘍を治療する。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現腺癌である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺の腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0149】

もう１つの実施態様において、本発明は、ＦＯＬＨ１発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は本発明の組換えリステリア株を含む組成物をヒト対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＦＯＬＨ１発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ヒト対象をＦＯＬＨ１発現腫瘍から保護する。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍は、ＦＯＬＨ１発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現腺癌である。もう１つの実施態様において、各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0150】

前立腺癌ワクチンの効力を評価する方法は当該分野においてよく知られており、例えば、Dzojic H et al.（Adenovirus-mediated CD40 ligand therapy induces tumor cell apoptosis and systemic immunity in the TRAMP-C2 mouse prostate cancer model. Prostate. 2006 Jun 1;66(8):831-8）、Naruishi K et al.（Adenoviral vector-mediated RTVP-1 gene-modified tumor cell-based vaccine suppresses the development of experimental prostate cancer. Cancer Gene Ther. 2006 Jul;13(7):658-63）、Sehgal I et al.（Cancer Cell Int. 2006 Aug 23;6:21）、およびHeinrich JE et al.（Vaccination against prostate cancer using a live tissue factor deficient cell line in Lobund-Wistar rats. Cancer Immunol Immunother 2007;56(5):725-30）に記載されている。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0151】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物をテストするのに用いる前立腺癌モデルはＰＳＡ発現ＴＲＡＭＰ−Ｃ１マウス腫瘍モデル（ＴＰＳＡ２３）である。もう１つの実施態様において、前立腺癌モデルは１７８−２ ＢＭＡ細胞モデルである。もう１つの実施態様において、前立腺癌モデルはＰＡＩＩＩ腺癌細胞モデルである。もう１つの実施態様において、前立腺癌モデルはＰＣ−３Ｍモデルである。もう１つの実施態様において、前立腺癌モデルは当該分野で公知のいずれかの他の前立腺癌モデルである。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0152】

もう１つの実施態様において、ワクチンがヒト対象においてテストされ、効力を、例えば、腫瘍転移の数またはサイズを決定し、または病気兆候（咳、胸部疼痛、体重喪失等）をモニターすることによって、例えば、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を直接的に測定し、または病気進行を測定する、当該分野でよく知られた方法を用いてモニターする。ヒト対象における前立腺癌ワクチンの効力を評価する方法は当該分野でよく知られており、例えば、Uenaka A et al.（T cell immunomonitoring and tumor responses in patients immunized with a complex of cholesterol-bearing hydrophobized pullulan(CHP) and NY-ESO-1 protein. Cancer Immun. 2007 Apr 19;7:9）、およびThomas-Kaskel AK et al.（Vaccination of advanced prostate cancer patients with PSCA and PSA peptide-loaded dendritic cells induces DTH responses that correlate with superior overall survival. Int J Cancer. 2006 Nov 15;119(10):2428-34）に記載されている。各方法は本発明の別の実施態様を表わす。

【0153】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、対象において抗ＫＬＫ３免疫応答を誘導することを含む、対象において抗ＫＬＫ３免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0154】

もう１つの実施態様において、本発明は、対象においてＫＬＫ３発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＫＬＫ３発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＫＬＫ３発現腫瘍を治療する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現腺癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現乳癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現卵巣腫瘍である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0155】

もう１つの実施態様において、本発明は、ＫＬＫ３発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物をヒト対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＫＬＫ３発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ヒト対象をＫＬＫ３発現腫瘍に対して保護する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３−発現腫瘍はＫＬＫ３−発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0156】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、対象において抗ＫＬＫ３免疫応答を誘導することを含む、対象において抗ＫＬＫ３免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0157】

もう１つの実施態様において、本発明は、対象においてＫＬＫ３発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＫＬＫ３発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＫＬＫ３発現腫瘍を治療する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0158】

もう１つの実施態様において、本発明は、ＫＬＫ３発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物をヒト対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＫＬＫ３発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ヒト対象をＫＬＫ３発現腫瘍から保護する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0159】

もう１つの実施態様において、本発明は、組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与することを含む、対象において抗ＫＬＫ３免疫応答を誘導する方法を提供し、該株は本発明の組換えポリペプチドを含み、それにより、対象において抗ＫＬＫ３免疫応答を誘導する。

【0160】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＫＬＫ３発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与する工程を含み、該株は本発明の組換えポリペプチドを含み、それにより、対象はＫＬＫ３発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＫＬＫ３発現腫瘍を治療する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0161】

もう１つの実施態様において、本発明はヒト対象をＫＬＫ３発現腫瘍から保護する方法を提供し、該方法は組換えリステリア株を含む組成物をヒト対象に投与する工程を含み、該株は本発明の組換えポリペプチドを含み、それにより、対象はＫＬＫ３発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ヒト対象をＫＬＫ３発現腫瘍に対して保護する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0162】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与し、それにより、対象においてＫＬＫ３発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げることを含む、対象においてＫＬＫ３発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げる方法を提供する。

【0163】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与し、それにより、ＫＬＫ３発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服することを含む、ＫＬＫ３発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服する方法を提供する。もう１つの実施態様において、本発明は、１つの実施態様においてはリステリアで初回免疫し、ポリペプチドでブースター注射することを含む、該治療の組合せを提供する。

【0164】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、対象においてＫＬＫ３発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げることを含む、対象においてＫＬＫ３発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げる方法を提供する。

【0165】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、ＫＬＫ３発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服することを含む、ＫＬＫ３発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服する方法を提供する。

【0166】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、対象においてＫＬＫ３発現現前立腺癌腫瘍の成長を妨げることを含む、対象においてＫＬＫ３発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げる方法を提供する。

【0167】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、ＫＬＫ３発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服することを含む、ＫＬＫ３発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服する方法を提供する。

【0168】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、対象において抗ＰＳＣＡ免疫応答を誘導することを含む、対象において抗ＰＳＣＡ免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0169】

もう１つの実施態様において、本発明は、対象においてＰＳＣＡ発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＰＳＣＡ発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＰＳＣＡ発現腫瘍を治療する。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0170】

もう１つの実施態様において、本発明はＰＳＣＡ発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物をヒト対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＰＳＣＡ発現腫瘍に対する免疫原性組成物を高め、それにより、ヒト対象をＰＳＣＡ発現腫瘍に対して保護する。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0171】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、対象において抗ＰＳＣＡ免疫応答を誘導することを含み、対象において抗ＰＳＣＡ免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0172】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＰＳＣＡ発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＰＳＣＡ発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＰＳＣＡ発現腫瘍を治療する。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0173】

もう１つの実施態様において、本発明は、ＰＳＣＡ発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物をヒト対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＰＳＣＡ発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ヒト対象をＰＳＣＡ発現腫瘍に対して保護する。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0174】

もう１つの実施態様において、本発明は、組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与することを含む、対象において抗ＰＳＣＡ免疫応答を誘導する方法を提供し、該株は本発明の組換えポリペプチドを含み、それにより、対象において抗ＰＳＣＡ免疫応答を誘導する。

【0175】

もう１つの実施態様において、本発明は、対象においてＰＳＣＡ発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与する工程を含み、該株は本発明の組換えポリペプチドを含み、それにより、対象はＰＳＣＡ発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＰＳＣＡ発現腫瘍を治療する。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0176】

もう１つの実施態様において、本発明は、ＰＳＣＡ発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は組換えリステリア株を含む組成物をヒト対象に投与する工程を含み、該株は本発明の組換えポリペプチドを含み、それにより、対象はＰＳＣＡ発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ヒト対象をＰＳＣＡ発現腫瘍に対して保護する。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0177】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与し、それにより、対象においてＰＳＣＡ発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げることを含む、対象においてＰＳＣＡ発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げる方法を提供する。

【0178】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与し、それにより、ＰＳＣＡ発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服することを含む、ＰＳＣＡ発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服する方法を提供する。

【0179】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、対象においてＰＳＣＡ発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げることを含む、対象においてＰＳＣＡ発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げる方法を提供する。

【0180】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、ＰＳＣＡ発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服することを含む、ＰＳＣＡ発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服する方法を提供する。

【0181】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、対象においてＰＳＣＡ発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げることを含む、対象においてＰＳＣＡ発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げる方法を提供する。

【0182】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、ＰＳＣＡ発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服することを含む、ＰＳＣＡ発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服する方法を提供する。

【0183】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、対象において抗ＦＯＬＨ１免疫応答を誘導することを含む、対象において抗ＦＯＬＨ１免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0184】

もう１つの実施態様において、本発明は、対象においてＦＯＬＨ１発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＦＯＬＨ１発現腫瘍に対して免疫応答を高め、それにより、対象においてＦＯＬＨ１発現腫瘍を治療する。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0185】

もう１つの実施態様において、本発明は、ＦＯＬＨ１発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物をヒト対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＦＯＬＨ１発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ＦＯＬＨ１発現腫瘍に対してヒト対象を保護する。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0186】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、対象において抗ＦＯＬＨ１免疫応答を誘導することを含む、対象において抗ＦＯＬＨ１免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0187】

もう１つの実施態様において、本発明は対象において抗ＦＯＬＨ１発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＦＯＬＨ１発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＦＯＬＨ１発現腫瘍を治療する。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0188】

もう１つの実施態様において、本発明はＦＯＬＨ１発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物をヒト対象に投与する工程を含み、それにより、対象はＦＯＬＨ１発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ヒト対象をＦＯＬＨ１発現腫瘍に対して保護する。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0189】

もう１つの実施態様において、本発明は組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与することを含む、対象において抗ＦＯＬＨ１免疫応答を誘導する方法を提供し、該株は本発明の組換えポリペプチドを含み、それにより、対象において抗ＦＯＬＨ１免疫応答を誘導する。

【0190】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＦＯＬＨ１発現腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与する工程を含み、該株は本発明の組換えポリペプチドを含み、それにより、対象はＦＯＬＨ１発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、対象においてＦＯＬＨ１発現腫瘍を治療する。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0191】

もう１つの実施態様において、本発明はＦＯＬＨ１発現腫瘍に対してヒト対象を保護する方法を提供し、該方法は組換えリステリア株を含む組成物をヒト対象に投与する工程を含み、該株は本発明の組換えポリペプチドを含み、それにより、対象はＦＯＬＨ１発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ヒト対象をＦＯＬＨ１発現腫瘍に対して保護する。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0192】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与し、それにより、対象においてＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げることを含む、対象においてＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げる方法を提供する。

【0193】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含む組成物を対象に投与し、それにより、ＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服することを含む、ＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服する方法を提供する。

【0194】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、対象においてＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げることを含む、対象においてＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げる方法を提供する。

【0195】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、ＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服することを含む、ＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服する方法を提供する。

【0196】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、対象においてＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げることを含む、対象においてＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫瘍の成長を妨げる方法を提供する。

【0197】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、ＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服することを含む、ＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫瘍に対する対象の免疫耐性を克服する方法を提供する。

【0198】

「耐性」とは、もう１つの実施態様において、抗原に対する宿主の応答性の欠如をいう。もう１つの実施態様において、該用語は抗原に対する宿主の検出可能な応答性の欠如をいう。もう１つの実施態様において、該用語は宿主における抗原の免疫原性の欠如をいう。もう１つの実施態様において、耐性は、イン・ビトロＣＴＬアッセイにおける応答性の欠如によって測定される。もう１つの実施態様において、耐性は、遅延型過敏アッセイにおける応答性の欠如によって測定される。もう１つの実施態様において、耐性は当該分野で公知のいずれかの他の適当なアッセイにおける応答性の欠如によって測定される。もう１つの実施態様において、耐性は、本明細書中の実施例に示されたように決定され、または測定される。各可能性は本発明のもう１つの実施態様を表わす。

【0199】

「克服する」とは、もう１つの実施態様において、ワクチンによる耐性の可逆性をいう。もう１つの実施態様において、該用語はワクチンによる検出可能な免疫応答の付与をいう。もう１つの実施態様において、免疫耐性の克服は本明細書中の実施例に示されたように決定され、または測定される。各可能性は本発明のもう１つの実施態様を表わす。

【0200】

もう１つの実施態様において、本発明は対象において良性前立腺過形成（ＢＰＨ）を治療する方法を提供し、該方法は本発明のＫＬＫ３発現リステリア株を対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＫＬＫ３発現リステリア株を対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨの進行を妨げる工程を含む。

【0201】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨを治療する方法を提供し、該方法は本発明のＰＳＣＡ発現リステリア株を対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は、対象においてＢＰＨの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＰＳＣＡ発現リステリア株を対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨの進行を妨げる工程を含む。

【0202】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨを治療する方法を提供し、該方法は本発明のＦＯＬＨ１発現リステリア株を対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＦＯＬＨ１発現リステリア株を対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨの進行を妨げる工程を含む。

【0203】

もう１つの実施態様において、本発明は対象において前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）を治療する方法を提供し、該方法は本発明のＫＬＫ３発現リステリア株を対象に投与し、それにより、対象においてＰＩＮを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＰＩＮの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＫＬＫ３発現リステリア株を対象に投与し、それにより、対象においてＰＩＮの進行を妨げる工程を含む。

【0204】

もう１つの実施態様において、本発明は、対象において前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）を治療する方法を提供し、該方法は本発明のＰＳＣＡ発現リステリア株を対象に投与し、それにより、対象においてＰＩＮを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＰＩＮの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＰＳＣＡ発現リステリア株を対象に投与し、それにより、対象においてＰＩＮの進行を妨げる工程を含む。

【0205】

もう１つの実施態様において、本発明は対象において前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）を治療する方法を提供し、該方法は本発明のＦＯＬＨ１発現リステリア株を対象に投与し、それにより、対象においてＰＩＮを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＰＩＮの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＦＯＬＨ１発現リステリア株を対象に投与し、それにより、対象においてＰＩＮの進行を妨げる工程を含む。

【0206】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨを治療する方法を提供し、該方法は本発明のＫＬＫ３含有ペプチドを対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＫＬＫ３含有ペプチドを対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨの進行を妨げる工程を含む。

【0207】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨを治療する方法を提供し、該方法は本発明のＰＳＣＡ含有ペプチドを対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は、対象においてＢＰＨの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＰＳＣＡ含有ペプチドを対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨの進行を妨げる工程を含む。

【0208】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨを治療する方法を提供し、該方法は本発明のＦＯＬＨ１含有ペプチドを対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＦＯＬＨ１含有ペプチドを対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨの進行を妨げる工程を含む。

【0209】

もう１つの実施態様において、本発明は対象において前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）を治療する方法を提供し、該方法は本発明のＫＬＫ３含有ペプチドを対象に投与し、それにより、対象においてＰＩＮを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＰＩＮの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＫＬＫ３含有ペプチドを対象に投与し、それにより、対象においてＰＩＮの進行を妨げる工程を含む。

【0210】

もう１つの実施態様において、本発明は対象において前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）を治療する方法を提供し、該方法は本発明のＰＳＣＡ含有ペプチドを対象に投与し、それにより、対象においてＰＩＮを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＰＩＮの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＰＳＣＡ含有ペプチドを対象に投与し、それにより、対象においてＰＩＮの進行を妨げる工程を含む。

【0211】

もう１つの実施態様において、本発明は対象において前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）を治療する方法を提供し、該方法は本発明のＦＯＬＨ１含有ペプチドを対象に投与し、それにより対象においてＰＩＮを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＰＩＮの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＦＯＬＨ１含有ペプチドを対象に投与し、それにより、対象においてＰＩＮの進行を妨げる工程を含む。

【0212】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨを治療する方法を提供し、該方法は本発明のＫＬＫ３をコードするヌクレオチド分子を対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＫＬＫ３をコードするヌクレオチド分子を対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨの進行を妨げる工程を含む。

【0213】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨを治療する方法を提供し、該方法は本発明のＰＳＣＡをコードするヌクレオチド分子を対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＰＳＣＡをコードするヌクレオチド分子を対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨの進行を妨げる工程を含む。

【0214】

もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨを治療する方法を提供し、該方法は本発明のＦＯＬＨ１をコードするヌクレオチド分子を対象に投与し、それにより、対象において、ＢＰＨを治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象においてＢＰＨの進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＦＯＬＨ１をコードするヌクレオチド分子を対象に投与し、それにより、対象においてＢＰＨの進行を妨げる工程を含む。

【0215】

もう１つの実施態様において、本発明は対象において前立腺上皮内新形成を治療する方法を提供し、該方法は本発明のＫＬＫ３をコードするヌクレオチド分子を対象に投与し、それにより、対象において前立腺上皮内新形成を治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象において前立腺上皮内新形成の進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＫＬＫ３をコードするヌクレオチド分子を対象に投与し、それにより、対象において前立腺上皮内新形成の進行を妨げる工程を含む。

【0216】

もう１つの実施態様において、本発明は対象において前立腺上皮内新形成を治療する方法を提供し、該方法は本発明のＰＳＣＡをコードするヌクレオチド分子を対象に投与し、それにより、対象において前立腺上皮内新形成を治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象において前立腺上皮内新形成の進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＰＳＣＡをコードするヌクレオチド分子を対象に投与し、それにより、対象において前立腺上皮内新形成の進行を妨げる工程を含む。

【0217】

もう１つの実施態様において、本発明は対象において前立腺上皮内新形成を治療する方法を提供し、該方法は本発明のＦＯＬＨ１をコードするヌクレオチド分子を対象に投与し、それにより、対象において前立腺上皮内新形成を治療する工程を含む。もう１つの実施態様において、本発明は対象において前立腺上皮内新形成の進行を妨げる方法を提供し、該方法は本発明のＦＯＬＨ１をコードするヌクレオチド分子を対象に投与し、それにより、対象において前立腺上皮内新形成の進行を妨げる工程を含む。

【0218】

もう１つの実施態様において、本発明の融合蛋白質はＬＭによって発現される必要はなく、むしろ、蛋白質の発現および単離で用いられる他のベクターおよび細胞系から発現させ、単離することができる。

【0219】

本明細書中で提供されるように、ＬＬＯ−Ｅ７融合は有意な治療効力を呈する。これらの実験において、ＬＬＯの非溶血切形形態との融合蛋白質としてＥ７を発現するワクシニアベクターを構築した。プラーク精製ワクシニアによるＬＬＯ−Ｅ７融合産物の発現は、ＬＬＯ蛋白質配列に対して向けられた抗体を用いることによってウェスタンブロットによって証明された。Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７は、各々、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ６マウスのＬＬＯ（９１ないし９９）およびＥ７（４９ないし５７）エピトープを用いて決定されるように、ＬＬＯおよびＥ７に対して特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞を生産することが示された。結果はＣＴＬアッセイによって確認した（実施例４）。

【0220】

かくして、リステリアにおける宿主細胞系およびリステリア以外の宿主細胞系におけるＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列の非溶血切形形態との融合蛋白質としての、抗原、例えば、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１の発現の結果、抗原の増強された免疫原性が得られる。比較実験をワクシニアを用いて行い、他方、これらの融合蛋白質を発現させるのに用いることができる多数の他のプラスミドおよび発現系が知られている。例えば、本発明において有用な細菌ベクターは、限定されるものではないが、Salmonella sp.、Shigella sp.、ＢＣＧ、リステリア・モノサイトゲネスおよびS.gordonniを含む。加えて、ファゴリソソーム融合から逃避し、細胞の細胞質において生きるように修飾された組換え細菌ベクターによって融合蛋白質を送達することができる。本発明で有用なウイルスベクターは、限定されるものではないが、ワクシニア、アビポックス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ、修飾されたワクシニア株アンカラ（ＭＶＡ）、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスを含む。裸のＤＮＡベクターを用いることもできる。

【0221】

もう１つの実施態様において、標的腫瘍細胞によって発現されたＫＬＫ３蛋白質は、リステリアベクターによって発現された（ペプチドの長さ全体に渡って）ＫＬＫ３ペプチドに対して完全な相同性を有する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３蛋白質はリステリアベクターによって発現されたＫＬＫ３ペプチドに対して（ペプチドの長さ全体に渡って）高度に相同である。「高度に相同な」とは、もう１つの実施態様において、９０％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９２％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９３％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９４％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９５％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９６％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９７％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９８％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９９％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は１００％の相同性をいう。各可能性は本発明の別の実施態様を表す。

【0222】

もう１つの実施態様において、標的腫瘍細胞によって発現されたＰＳＣＡ蛋白質はリステリアベクターによって発現された（ペプチドの長さの全体に渡る）ＰＳＣＡペプチドに対する完全な相同性を有する。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ蛋白質はリステリアベクターによって発現されたＰＳＣＡペプチドに対して（ペプチドの長さ全体に渡って）高度に相同である。「高度に相同な」とは、もう１つの実施態様において、９０％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９２％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９３％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９４％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９５％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９６％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９７％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９８％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９９％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は１００％の相同性をいう。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0223】

もう１つの実施態様において、標的腫瘍細胞によって発現されたＦＯＬＨ１蛋白質はリステリアベクターによって発現された（ペプチド長さ全体に渡って）ＦＯＬＨ１ペプチドに対する完全な相同性を有する。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１蛋白質は、リステリアベクターによって発現されたＦＯＬＨ１ペプチドに対して（ペプチドの長さ全体に渡って）高度に相同である。「高度に相同な」とは、もう１つの実施態様において、９０％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９２％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９３％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９４％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９５％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９６％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９７％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９８％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は９９％を超える相同性をいう。もう１つの実施態様において、該用語は１００％の相同性をいう。各可能性は本発明の別の実施態様を表す。

【0224】

本発明の方法および組成物のＫＬＫ３ペプチドは、もう１つの実施態様において、長さが２００ないし２６１アミノ酸（ＡＡ）である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドは約１００ないし２６１ＡＡ長である。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１１０ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１２０ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１３０ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１４０ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５０ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１６０ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１７５ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１９０ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２００ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２１０ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２２０ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２３０ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２４０ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２５０ないし２６１ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし１６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし１７０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし１８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし１９０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし２１０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし２２０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし２４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１７０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１９０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし２００ＡＡである。

【0225】

もう１つの実施態様において、該長さは約１７５ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約２２０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約２４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約２６０ＡＡである。

【0226】

各長さは、本発明の別の実施態様を表す。

【0227】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチドはＫＬＫ３蛋白質の約１／３ないし１／２よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１／１０ないし１／５よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１／５ないし１／４よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１／４ないし１／３よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１／３ないし１／２よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１／２ないし３／４よりなる。もう１つの実施態様において、断片はＫＬＫ３蛋白質に対して約３／４よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし１０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし１５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１５ないし２０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし２５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２５ないし３０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし３５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３５ないし４０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４５ないし５０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし５５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５５ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし１５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし２０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１５ないし２５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし３０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２５ないし３５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし４０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３５ないし４５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４５ないし５５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５５ないし６５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６０ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６５ないし７５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし２０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし２５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１５ないし３０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし３５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２５ないし４０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし４５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３５ないし５０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４５ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし６５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５５ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６０ないし７５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６５ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７０ないし８５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７５ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約８０ないし９５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約８５ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし２５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし３０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１５ないし３５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし４０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし５０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４０ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約８０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし３５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし４０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１５ないし４５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし５０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４０ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし４５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし５０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし５５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし６５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし７５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし１００％よりなる。

【0228】

もう１つの実施態様において、断片はＫＬＫ３蛋白質の約５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約８％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１２％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１８％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約８５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約９５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１００％よりなる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0229】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のＫＬＫ３ペプチド、ＰＳＣＡペプチド、またはＦＯＬＨ１ペプチドは免疫原性ペプチドである。「免疫原性」とは、もう１つの実施態様において、対象に投与した場合に免疫応答を誘導する能力をいう。もう１つの実施態様において、対象はヒト対象である。もう１つの実施態様において、誘導される免疫応答はＴ細胞応答である。もう１つの実施態様において、誘導される免疫応答は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答である。もう１つの実施態様において、誘導される免疫応答は検出可能である。もう１つの実施態様において、誘導される免疫応答はイン・ビトロアッセイによって検出できる。もう１つの実施態様において、該アッセイはサイトカイン放出アッセイ（例えば、蛍光活性化細胞ソーティング；またはＦＡＣＳ）である。もう１つの実施態様において、該アッセイはクロム放出アッセイ、または他のイン・ビトロ細胞傷害性アッセイである。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0230】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のＫＬＫ３ペプチドに含有される、配列番号：２５、２７、２９ないし３２、３４および３６ないし３９に記載された配列から選択される配列の免疫原性断片は約１０ないし１５０ＡＡ長である。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは６０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは７０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは８０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは９０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは６０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは７０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは６０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは７０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４０ないし６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４０ないし５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし３０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし３０である。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし３０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５ないし２０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし２０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし２０ＡＡである。

【0231】

もう１つの実施態様において、免疫原性断片の長さは約１０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約１５ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約２０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約３０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約７０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約９０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約１００ＡＡである。

【0232】

免疫原性断片の各長さは本発明の別の実施態様を表す。

【0233】

本発明の方法および組成物のＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１ペプチド、もう１つの実施態様において、長さが２００ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１ペプチドは約１００ないし７５０ＡＡ長である。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１１０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１２０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１３０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１４０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１６０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１７５ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１９０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２００ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２１０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２２０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２３０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２４０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２５０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２８０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３００ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３５０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４００ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４５０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５００ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５５０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは６００ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは６５０ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは７００ないし７５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし１６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし１７０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし１８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし１９０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし２２０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし２４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし２６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし２８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし３００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし３５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし４００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし４５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし５００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし６００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし７００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１７０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１９０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし２２０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし２４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし２６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし２８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし３００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし３５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし４００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし４５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし５００ＡＡである。

【0234】

もう１つの実施態様において、該長さは約１７５ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約２２０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約２４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約２６０ＡＡである。

【0235】

各長さは本発明の別の実施態様を表す。

【0236】

もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１ペプチドは、各々、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１蛋白質の約１／３ないし１／２よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１／１０ないし１／５よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１／５ないし１／４よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１／４ないし１／３よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１／３ないし１／２よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１／２ないし３／４よりなる。もう１つの実施態様において、断片は、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１蛋白質に対して約３／４よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし１０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし１５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１５ないし２０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし２５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２５ないし３０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし３５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３５ないし４０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４５ないし５０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし５５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５５ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし１５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし２０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１５ないし２５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし３０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２５ないし３５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし４０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３５ないし４５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４５ないし５５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５５ないし６５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６０ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６５ないし７５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし２０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし２５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１５ないし３０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし３５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２５ないし４０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし４５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３５ないし５０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４５ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし６５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５５ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６０ないし７５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６５ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７０ないし８５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７５ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約８０ないし９５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約８５ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし２５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし３０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１５ないし３５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし４０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし５０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４０ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約８０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし３５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし４０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１５ないし４５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし５０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４０ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし４５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし５０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし５５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし６５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５ないし７５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０ないし１００％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０ないし１００％よりなる。

【0237】

もう１つの実施態様において、断片はＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１蛋白質の約５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約８％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１２％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１８％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約２５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約３５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約４５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約５５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約６５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約７５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約８０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約８５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約９０％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約９５％よりなる。もう１つの実施態様において、断片はその約１００％よりなる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0238】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のＦＯＬＨ１ペプチドに含有される配列番号：４１、４３、４４および４５に記載された配列から選択される配列の免疫原性断片は約１０ないし１５０ＡＡ長である。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは６０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは７０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは８０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは９０ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約１０ないし２００ＡＡ長である。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４０ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは６０ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは７０ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは８０ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは９０ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし２００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし３００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは６０ないし３００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは７０ないし３００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは８０ないし３００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは９０ないし３００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし３００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは９０ないし３００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２００ないし３００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし４００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは６０ないし４００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは７０ないし４００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは８０ないし４００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは９０ないし４００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし４００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２００ないし４００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３００ないし４００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１００ないし１５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは６０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは７０ないし１００ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは６０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは７０ないし８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４０ないし６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５０ないし６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは４０ないし５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは３０ないし４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし３０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし３０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは２０ないし３０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは５ないし２０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１０ないし２０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは１５ないし２０ＡＡである。

【0239】

もう１つの実施態様において、免疫原性断片の長さは約１０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約１５ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約２０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約３０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約４０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約５０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約６０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約７０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約８０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約９０ＡＡである。もう１つの実施態様において、該長さは約１００ＡＡである。

【0240】

免疫原性断片の各長さは本発明の別の実施態様を表わす。

【0241】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えリステリア株を含むワクチン、免疫原性組成物、またはベクターを投与し、それにより、ＫＬＫ３発現腫瘍のサイズを低下させることを含む、ＫＬＫ３発現腫瘍のサイズを低下させる方法を提供する。もう１つの実施態様において、腫瘍の細胞はＫＬＫ３を発現する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0242】

もう１つの実施態様において、本発明は：（ａ）ＫＬＫ３ペプチドに融合した蛋白質のＮ末端断片を含む組換えリステリア株；または（ｂ）組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドのいずれかを含む有効量のワクチンを投与することを含む、ＫＬＫ３発現腫瘍の形成を抑制する方法を提供し、それにより、対象はＫＬＫ３発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ＫＬＫ３発現腫瘍の形成を抑制する。

【0243】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含むワクチン、免疫原性組成物、または、ベクターを投与し、それにより、ＫＬＫ３発現腫瘍のサイズを低下させることを含む、ＫＬＫ３発現腫瘍のサイズを低下させる方法を提供する。もう１つの実施態様において、該腫瘍の細胞はＫＬＫ３を発現する。各可能性は、本発明の別の実施態様を表わす。

【0244】

もう１つの実施態様において、本発明は：（ａ）ＫＬＫ３ペプチドに融合した蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチド：または（ｂ）該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドのいずれかを含む有効量のワクチンを投与することを含む、ＫＬＫ３発現腫瘍の形成を抑制する方法を提供し、それにより、対象はＫＬＫ３発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ＫＬＫ３発現腫瘍の形成を抑制する。

【0245】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組換えヌクレオチド分子を含むワクチン、免疫原性組成物、またはベクターを投与し、それにより、ＫＬＫ３発現腫瘍のサイズを低下させることを含む、ＫＬＫ３発現腫瘍のサイズを低下させる方法を提供する。もう１つの実施態様において、該腫瘍の細胞はＫＬＫ３を発現する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0246】

もう１つの実施態様において、本発明は：（ａ）ＫＬＫ３ペプチドに融合した蛋白質のＮ末端断片を含む組換えヌクレオチド分子；または（ｂ）該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドのいずれかを含む有効量のワクチンを投与することを含む、ＫＬＫ３発現腫瘍の形成を抑制する方法を提供し、それにより、対象はＫＬＫ３発現腫瘍に対する免疫応答を高め、それにより、ＫＬＫ３発現腫瘍の形成を抑制する。

【0247】

本発明の方法および組成物の非ＫＬＫ３／非ＦＯＬＨ１／非ＰＳＣＡペプチドは、もう１つの実施態様において、リステリオリシン（ＬＬＯ）ペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３／非ＦＯＬＨ１／非ＰＳＣＡペプチドはＡｃｔＡペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３／非ＦＯＬＨ１／非ＰＳＣＡペプチドはＰＥＳＴ様配列ペプチドである。もう１つの実施態様において、非ＫＬＫ３／非ＦＯＬＨ１／非ＰＳＣＡペプチドは、ＫＬＫ３、ＦＯＬＨ１、またはＰＳＣＡペプチドの免疫原性を高めることができるいずれかの他のペプチドである。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0248】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物の組換え融合ペプチドはＬＬＯ−ＫＬＫ３融合ペプチドである。もう１つの実施態様において、融合ペプチドは配列番号：５４に記載された配列を有する。もう１つの実施態様において、融合ペプチドは配列番号：５４に記載された配列に相同である。もう１つの実施態様において、融合ペプチドは配列番号：５４に記載された配列の変種である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは、配列番号：５４の１つに対する７２％よりも大きい同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は７５％よりも大きい。もう１つの実施態様において、「相同性」とは、配列に対する７８％よりも大きい同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８０％よりも大きい。もう１つの実施態様において、相同性は８２％よりも大きい。もう１つの実施態様において、「相同性」とは配列に対する８３％よりも大きい同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８５％よりも大きい。もう１つの実施態様において、相同性は８７％よりも大きい。もう１つの実施態様において、「相同性」とは配列に対する８８％よりも大きい同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９０％よりも大きい。もう１つの実施態様において、相同性は９２％よりも大きい。もう１つの実施態様において、「相同性」とは配列に対する９３％よりも大きい同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９５％よりも大きい。もう１つの実施態様において、「相同性」とは配列に対する９６％よりも大きい同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９７％よりも大きい。もう１つの実施態様において、相同性は９８％よりも大きい。もう１つの実施態様において、相同性は９９％よりも大きい。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0249】

本発明のワクチンを構築するのに利用されるＬＬＯ蛋白質の配列は、もう１つの実施態様において、以下のとおりである：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｐ１３１２８；配列番号：１７；核酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ１５１２７に記載されている）。この配列に対応するプロ蛋白質の最初の２５のアミノ酸はシグナル配列であって、それが細菌によって分泌されると、ＬＬＯから切断される。かくして、この実施態様において、全長活性ＬＬＯ蛋白質は５０４残基長である。もう１つの実施態様において、ＬＬＯ蛋白質は配列番号：１７のホモログである。もう１つの実施態様において、ＬＬＯ蛋白質は配列番号：１７の変種である。もう１つの実施態様において、ＬＬＯ蛋白質は配列番号：１７のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＬＬＯ蛋白質は配列番号：１７の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0250】

もう１つの実施態様において、「ＬＬＯペプチド」および「ＬＬＯ断片」とは、ＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片をいう。もう１つの実施態様において、該用語は全長であるが、非溶血性ＬＬＯ蛋白質をいう。もう１つの実施態様において、該用語は配列番号：１７のシステイン４８４、あるいは相同なＬＬＯ蛋白質におけるその対応する残基において点突然変異を含有する非溶血性蛋白質をいう。各可能性は本発明の別の実施態様を表す。

【0251】

もう１つの実施態様において、本発明の組成物および方法で利用されるＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片は配列：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤ（配列番号：１８）を有する。もう１つの実施態様において、ＬＬＯ断片は配列番号：１８のホモログである。もう１つの実施態様において、ＬＬＯ断片は配列番号：１８の変種である。もう１つの実施態様において、ＬＬＯ断片は配列番号：１８のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＬＬＯ断片は配列番号：１８の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表す。

【0252】

もう１つの実施態様において、ＬＬＯ断片は配列：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号：１９）を有する。もう１つの実施態様において、ＬＬＯ断片は配列番号：１９のホモログである。もう１つの実施態様において、ＬＬＯ断片は配列番号：１９の変種である。もう１つの実施態様において、ＬＬＯ断片は配列番号：１９のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＬＬＯ断片は配列番号：１９の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0253】

もう１つの実施態様において、ＬＬＯ断片は当該分野で公知のいずれかの他のＬＬＯ断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0254】

「ＡｃｔＡペプチド」とは、もう１つの実施態様において、全長ＡｃｔＡ蛋白質をいう。もう１つの実施態様において、該用語はＡｃｔＡ断片をいう。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0255】

本発明の方法および組成物のＡｃｔＡ断片は、もう１つの実施態様において、Ｎ末端ＡｃｔＡ断片である。もう１つの実施態様において、断片は当該分野で公知のＡｃｔＡ断片のいずれかの他のタイプである。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0256】

１つの実施態様において、本明細書中で提供される方法および組成物の抗原は、ＡｃｔＡ蛋白質に融合しており、これは、１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質のＮ末端断片であり、これは、１つの実施態様においては、ＡｃｔＡの最初の３９０ＡＡ、もう１つの実施態様においては、ＡｃｔＡの最初の４１８ＡＡ、もう１つの実施態様においてはＡｃｔＡの最初の５０ＡＡ、もう１つの実施態様においてはＡｃｔＡの最初の１００ＡＡを含み、またはそれよりなり、これは、１つの実施態様においては、配列番号：１に供されたもののようなＰＥＳＴ様配列を含む。もう１つの実施態様において、本明細書中で提供される方法および組成物において利用されるＡｃｔＡ蛋白質のＮ末端断片はＡｃｔＡの最初の１５０ＡＡ、もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡの最初のほぼ２００ＡＡを含み、またはそれよりなり、これは、１つの実施態様において、本明細書中に記載された２つのＰＥＳＴ様配列を含む。もう１つの実施態様において、本明細書中で提供される方法および組成物で利用されるＡｃｔＡ蛋白質のＮ末端断片はＡｃｔＡの最初の２５０ＡＡ、もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡの最初の３００ＡＡを含み、またはそれよりなる。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は前記ＡＡの範囲の１つに対応する相同なＡｃｔＡ蛋白質の残基を含有する。該残基の数は、もう１つの実施態様において、先に挙げた残基の数と正確に対応する必要はなく；例えば、もし相同なＡｃｔＡ蛋白質が本明細書中で利用されるＡｃｔＡ蛋白質に対して挿入または欠失を有するならば、当該分野でよく知られているＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴのような配列整列ツールを用いて当業者にルーチン的なように、残基の数はそれに従って調整することができる。

【0257】

もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質のＮ末端部分は、本明細書中に記載された方法およびアルゴリズムを用い、または当該分野で知られた代替法を用いることによって、決定できるように、１つの実施態様においては、本明細書中に記載された通りである、または他のＰＥＳＴ様配列である、少なくとも１、２、３、または４のＰＥＳＴ様配列を含む。

【0258】

もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質のＮ末端断片は配列：
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号：１５）を有する。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１５を含む。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は当該分野で公知のいずれかの他のＡｃｔＡ断片である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：１５のホモログである。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：１５の変種である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：１５のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：１５の断片である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：１５のホモログの断片である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：１５のホモログの断片である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：１５の変種の断片である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：１５のイソ形態の断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0259】

もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質のＮ末端断片は配列：
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮ（配列番号：１４）を有する。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１４のホモログである。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１４の変種である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１４のイソ形態である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0260】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡ断片はＰＥＳＴ様配列を含む。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片に含有されるＰＥＳＴ様配列は、配列番号：２ないし５から選択される。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：２ないし５に記載されたＰＥＳＴ様配列の少なくとも２つを含む。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：２ないし５に記載されたＰＥＳＴ様配列の少なくとも３つを含む。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：２ないし５に記載された４つのＰＥＳＴ様配列を含む。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0261】

もう１つの実施態様において、Ｎ末端ＡｃｔＡ断片は、配列番号：１６の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる。：
ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号：１６）、これは、１つの実施態様においては、リステリア・モノサイトゲネスにおけるＡｃｔＡをコードする最初の１１７０ヌクレオチドである。

【0262】

もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１６を含むヌクレオチド分子によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１６のホモログであるヌクレオチド分子によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１６の変種であるヌクレオチド分子によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１６のイソ形態であるヌクレオチド分子によってコードされる。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１６の断片であるヌクレオチド分子によってコードされる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0263】

本明細書中で提供される方法および組成物で利用されるＡｃｔＡ蛋白質のＮ末端断片は、もう１つの実施態様において、配列番号：６１に記載された配列：
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧＰＮＮＮＮＮＮＧＥＱＴＧＮＶＡＩＮＥＥＡＳＧＶＤＲＰＴＬＱＶＥＲＲＨＰＧＬＳＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＡＮＫＲＫＶＡＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫＡＮＱＫＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＴＰＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＭＲＥＴＡＰＳＬＤＳＳＦＴＳＧＤＬＡＳＬＲＳＡＩＮＲＨＳＥＮＦＳＤＦＰＬＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号：６１）を有し、これは、１つの実施態様においては、リステリア・モノサイトゲネス株１０４０３ＳからのＡｃｔＡについての最初の３９０ＡＡである、である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は配列番号：６１に記載された配列を含む。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は当該分野で公知のいずれかの他のＡｃｔＡ断片である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：６１のホモログである。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：６１の変種である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：６１のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：６１の断片である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：６１のホモログの断片である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：６１の変種の断片である。もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質は配列番号：６１のイソ形態の断片である。各可能性は本明細書中で提供される方法および組成物の別の実施態様を表わす。

【0264】

もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ蛋白質の断片をコードする組換えヌクレオチドは、配列番号：６２に記載された配列：
ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔａｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｃｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｃａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａｇｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔｇａｇｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａａａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇｃａａａａｇｃａｇａｇａａａｇｇｔｃｃｇａａｔａａｃａａｔａａｔａａｃａａｃｇｇｔｇａｇｃａａａｃａｇｇａａａｔｇｔｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｔｃｇａｃｃｇａｃｃａａｃｔｃｔｇｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇｔｃｔｇｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇａａａａｇｃｃａｔａｇｃｇｔｃｇｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃａｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｃａａａｔａａｇａｇａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｔｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｃｇａｇｔｃｔａｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｔｃａａａａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃｇａｔｇｃｔｔｃｔｃｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔａｃｔｃｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃｇｃｃｇｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｔａｔｇｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｃｃｔｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇｃｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａｇｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｃｇａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｔａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号：６２）を含み、これは、１つの実施態様においては、リステリア・モノサイトゲネス １０４０３Ｓ株においてＡｃｔＡをコードする最初の１１７０ヌクレオチドである。もう１つの実施態様において、組換えヌクレオチドは配列番号：６２に記載された配列を有する。もう１つの実施態様において、組換えヌクレオチドはＡｃｔＡ蛋白質の断片をコードするいずれかの他の配列を含む。各可能性は本明細書中に提供された方法および組成物の別の実施態様を表わす。

【0265】

もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は当該分野で公知のいずれかの他のＡｃｔＡ断片である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0266】

もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片は、当該分野で公知のもう１つのＡｃｔＡ断片であり、１つの実施態様においては、ＰＥＳＴ配列を含むいずれかの断片である、。かくして、１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸１ないし１００である。１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸１ないし２００である。１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸２００ないし３００である。１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸３００ないし４００である。１つの実施態様において、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸１ないし３００である。もう１つの実施態様において、本明細書中で提供された組換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡ蛋白質の断片をコードするいずれかの他の配列を含む。もう１つの実施態様において、組換えヌクレオチドは全ＡｃｔＡ蛋白質をコードするいずれかの他の配列を含む。各可能性は本明細書中に提供された方法および組成物の別の実施態様を表わす。

【0267】

１つの実施態様において、本明細書中で提供される組成物および方法で用いるＡｃｔＡ配列は、リステリア・モノサイトゲネスからのものであり、これは、１つの実施態様においては、ＥＧＤ株、１０４０３Ｓ株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＤＱ０５４５８５）、ＮＩＣＰＢＰ ５４００２株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＥＵ３９４９５９）、Ｓ３株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＥＵ３９４９６０）、ＮＣＴＣ ５３４８株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＥＵ３９４９６１）、ＮＩＣＰＢＰ５４００６株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＥＵ３９４９６２）、Ｍ７株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＥＵ３９４９６３）、Ｓ１９株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＥＵ３９４９６４）、または当該分野で公知のリステリア・モノサイトゲネスのいずれかの他の株である。

【0268】

もう１つの実施態様において、本発明の組換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡ蛋白質の断片をコードするいずれかの他の配列を含む。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0269】

本発明の方法および組成物のもう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列はＫＬＫ３ペプチド、ＰＳＣＡペプチドまたはＦＯＬＨ１ペプチドに融合している。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は配列番号：２ないし７および２０から選択される配列を有する。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列は当該分野で公知のいずれかの他のＰＥＳＴ様配列である。各可能性は、本発明の別の実施態様を表わす。

【0270】

もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列はＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号：１）である。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列はＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号：２１）である。もう１つの実施態様において、本明細書中で挙げたＰＥＳＴ様ＡＡ配列のうちの１つを含むいずれかのＬＬＯ配列に対するＫＬＫ３ペプチド、ＰＳＣＡペプチドまたはＦＯＬＨ１ペプチドの融合は，ＫＬＫ３、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１に対する細胞媒介免疫性を増強させるのに有効である。

【0271】

また、本発明は、細胞媒介および抗腫瘍免疫性を増強させる方法、およびＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１の抗原に融合した原核生物に由来したＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含む増強された免疫原性を持つ組成物も提供する。もう１つの実施態様において、ｌＰＥＳＴ様配列は抗原内に包埋される。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列は抗原のいずれかのアミノ末端に融合される。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列はカルボキシ末端に融合される。本明細書中に示すように、ＬＭのＰＥＳＴ様配列への抗原の融合は、抗原の細胞媒介および抗腫瘍免疫性を増強させた。かくして、他の原核生物に由来する他のＰＥＳＴ様配列への抗原の融合もまた、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１の免疫原性を増強させるであろう。他の原核生物のＰＥＳＴ様配列は、例えば、ＬＭについてのRechsteinerおよびRogers（1996,Trends Biochem.Sci.21:267-271）によって記載されたような方法に従ってルーチン的に同定することができる。もう１つの実施態様において、他の原核生物からのＰＥＳＴ様ＡＡ配列はこの方法に基づいて同定される。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列はもう１つのリステリア種からのものである。例えば、ＬＭ蛋白質ＡｃｔＡは４つのそのような配列を含有する。

【0272】

もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列はリステリア ＡｃｔＡ蛋白質からのＰＥＳＴ様配列である。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列はＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号：２）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号：３）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号：４）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号：５）である。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列はｌｓｏ遺伝子によってコードされるリステリア・シーリジェリー・サイトリシンからのものである。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列はＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（配列番号：２０）であえる。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列はStreptococcus sp.のストレプトリシンＯ蛋白質からのものである。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列はStreptococcus pyogenesストレプトレシンＯからのものであり、例えば、ＡＡ３５ないし５１におけるＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：６）である。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列はStreptococcus equisimilisストレプトリシンＯからのものであり、例えば、ＡＡ３８ないし５４におけるＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：７）である。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列は配列番号：１ないし７および２０ないし２１から選択された配列を有する。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列は配列番号２ないし７および２０から選択される配列を有する。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列は原核生物に由来するもう１つのＰＥＳＴ様ＡＡ配列である。

【0273】

他の原核生物のＰＥＳＴ様配列は、もう１つの実施態様において、例えば、ＬＭについてのRechsteinerおよびRogers（1996,Trends Biochem.Sci.21:267-271）によって記載されたような方法に従って同定される。別法として、他の原核生物からのＰＥＳＴ様ＡＡ配列もまたこの方法によって同定することができる。ＰＥＳＴ様ＡＡ配列が予測される他の原核生物は限定されるものではないが、他のリステリア種を含む。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列は抗原性蛋白質内に包埋される。かくして、もう１つの実施態様において、「融合」とは、ＫＬＫ３ペプチドおよび当該ＫＬＫ３ペプチドの１つの端部において連結されたＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含む抗原性蛋白質をいう。もう１つの実施態様において、該用語とは、ＰＳＣＡペプチドおよび当該ＰＳＣＡペプチドの１つの端部において連結されたＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含む抗原性蛋白質をいう。もう１つの実施態様において、該用語とは、ＦＯＬＨ１ペプチドおよび当該ＦＯＬＨ１ペプチドの１つの端部において連結されたＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含む抗原性蛋白質をいう。もう１つの実施態様において、該用語とは、ＫＬＫ３ペプチド内に包埋されたＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含む抗原性蛋白質をいう。もう１つの実施態様において、該用語はＰＳＣＡペプチド内に包埋されたＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含む抗原性蛋白質をいう。もう１つの実施態様において、該用語とは、ＦＯＬＨ１ペプチド内に包埋されたＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含む抗原性蛋白質をいう。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0274】

もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列はＰＥＳＴ発見プログラムを用いて同定される。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列は高い局所的濃度のプロリン（Ｐ）、アスパルテート（Ｄ）、グルタメート（Ｅ）、セリン（Ｓ）、および／またはスレオニン（Ｔ）残基を持つ長さが少なくとも１２ＡＡの親水性ストレッチと定義される。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列は正に荷電していないＡＡ、すなわち、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびリシン（Ｋ）を含有する。

【0275】

もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴモチーフの同定は特定の蛋白質配列内の正に荷電したＡＡ Ｒ、Ｈ、およびＫについての最初のスキャンによって達成される。正に荷電したフランクの間の全てのＡＡをカウントし、ウインドウサイズのパラメータと同等な、またはそれよりも多い多数のＡＡを含有するモチーフのみをさらに考慮する。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列は少なくとも１つのＰ、１つのＤまたはＥ、および少なくとも１つのＳまたはＴを含有しなければならない。

【0276】

もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴモチーフの質は、臨界的ＡＡの局所的濃縮ならびにモチーフの疎水性に基づくパラメータをスコア採りすることによって改善する。Ｄ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＴの濃縮は質量パーセント（ｗ／ｗ）で表され、１等量のＤまたはＥ、１等量のＰおよび１等量のＳまたはＴについて補正する。もう１つの実施態様において、疎水性の計算は、原理的には、J.KyteおよびR.F.Doolittle（Kyte,J and Dootlittle,RF.J.Mol.Biol.157,105(1982)）の方法に従う。単純化された計算のためには、以下の線形変換を用い、元来は、アルギニンについての−４．５ないしイソロイシンについての＋４．５の範囲であったKyte-Doolittleハイドロパシー指標を正の整数に変換し、これはアルギニンについての０からイソロイシンについての９０の値を生じた。

【0277】

ハイドロパシー指標＝１０^＊Kyte-Doolittleハイドロパシー指標＋４５

【0278】

もう１つの実施態様において、潜在的なＰＥＳＴモチーフの疎水性が、各ＡＡ種についてのモルパーセントおよび疎水性指標の積にわたる総和として計算される。所望のＰＥＳＴスコアは、以下の方程式によって表されるように局所的濃縮項および疎水性項の組合せとして得られる。

【0279】

ＰＥＳＴスコア＝０．５５^＊ＤＥＰＳＴ−０．５^＊疎水性指標

【0280】

もう１つの実施態様において、「ＰＥＳＴ様配列」、「ＰＥＳＴ様配列ペプチド」、または「ＰＥＳＴ様配列含有ペプチド」とは前記アルゴリズムを用いて少なくとも＋５のスコアを有するペプチドをいう。もう１つの実施態様において、該用語は少なくとも６のスコアを有するペプチドをいう。もう１つの実施態様において、該ペプチドは少なくとも７のスコアを有する。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも８である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも９である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも１０である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも１１である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも１２である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも１３である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも１４である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも１５である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも１６である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも１７である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも１８である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも１９である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも２０である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも２１である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも２２である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも２２である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも２４である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも２４である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも２５である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも２６である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも２７である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも２８である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも２９である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも３０である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも３２である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも３５である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも３８である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも４０である。もう１つの実施態様において、スコアは少なくとも４５である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0281】

もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列は、当該分野で公知のいずれかの他の方法またはアルゴリズム、例えば、CaSPredictor（Garay-Malpartida HM,Occhiucci JM,Alves J,Belizario JE. Bioinformatics.2005 Jun;21 Suppl 1:i169-76）を用いて同定される。もう１つの実施態様において、以下の方法が用いられる。

【0282】

ＰＥＳＴ指標は、ＡＡ Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに１の値を帰属させることによって、適切な長さの各ストレッチ（例えば、３０ないし３５のＡＡストレッチ）について計算する。ＰＥＳＴ残基の各々についての係数値（ＣＶ）は１であり、他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）の各々については０である。

【0283】

ＰＥＳＴ様配列を同定するための各方法は本発明の別の実施態様を表わす。

【0284】

もう１つの実施態様において、「ＰＥＳＴ様配列ペプチド」または「ＰＥＳＴ様配列は含有ペプチド」とは、前記で定義したように、ＰＥＳＴ様配列を含有するペプチドをいう。

【0285】

「ＰＥＳＴ様配列への融合」とは、もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様配列を含む蛋白質断片への融合をいう。もう１つの実施態様において、該用語は、蛋白質断片がＰＥＳＴ様配列以外の周囲の配列を含む場合を含む。もう１つの実施態様において、蛋白質断片はＰＥＳＴ様配列よりなる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0286】

本明細書中で提供されるように、ＰＥＳＴ様配列抗原融合を発現する組換えリステリア株は抗腫瘍免疫性を誘導し（実施例５）、抗原特異的腫瘍浸潤Ｔ細胞を生じさせる（実施例６）。

【0287】

もう１つの実施態様において、「相同性」とは、配列番号：２５ないし４０から選択される配列において記載されたＫＬＫ３配列に対して７０％よりも大きな同一性をいう。もう１つの実施態様において、「相同性」とは、７２％よりも大きな配列番号：２５ないし４０の１つに対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は７５％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは７８％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８０％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は８２％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは８３％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８５％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は８７％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは８８％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９０％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９２％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは９３％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９５％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは９６％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９７％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９８％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９９％よりも大である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0288】

もう１つの実施態様において、「相同性」とは、本明細書中に記載された配列に記載されたＰＳＣＡ配列に対して７０％を超える同一性をいう。もう１つの実施態様において、「相同性」とは、７２％を超える本明細書中に記載された配列の１つに対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は７５％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは７８％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８０％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は８２％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは８３％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８５％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は８７％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは８８％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９０％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９２％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは９３％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９５％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは９６％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９７％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９８％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９９％よりも大である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0289】

もう１つの実施態様において、「相同性」とは、配列番号：４１ないし４５から選択される配列に記載されたＦＯＬＨ１配列に対して７０％を超える同一性をいう。もう１つの実施態様において、「相同性」とは、７２％を超える配列番号：４１ないし４５の１つに対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は７５％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは７８％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８０％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は８２％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは８３％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８５％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は８７％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは８８％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９０％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９２％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは９３％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９５％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは９６％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９７％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９８％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９９％よりも大である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0290】

もう１つの実施態様において、「相同性」とは、配列番号：１７ないし１９から選択される配列に記載されたＬＬＯ配列に対して７０％を超える同一性をいう。もう１つの実施態様において、「相同性」とは７２％よりも大きな配列番号：１７ないし１９の１つに対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は７５％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは７８％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８０％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は８２％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは８３％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８５％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は８７％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは８８％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９０％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９２％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは９３％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９５％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは９６％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９７％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９８％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９９％よりも大である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0291】

もう１つの実施態様において、「相同性」とは、配列番号：１４ないし１６から選択される配列に記載されたＡｃｔＡに対して７０％を超える同一性をいう。もう１つの実施態様において、「相同性」とは７２％よりも大きな配列番号：１４ないし１６の１つに対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は７５％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは７８％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８０％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は８２％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは８３％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８５％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は８７％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは８８％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９０％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９２％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは９３％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９５％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは９６％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９７％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９８％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９９％よりも大である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0292】

もう１つの実施態様において、「相同性」とは、配列番号：１ないし７および２０ないし２１から選択される配列に記載されたＰＥＳＴ様配列に対して７０％を超える同一性をいう。もう１つの実施態様において、「相同性」とは７２％よりも大きな配列番号：１ないし７および２０ないし２１の１つに対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は７５％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは７８％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８０％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は８２％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは８３％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は８５％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は８７％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは８８％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９０％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９２％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは９３％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９５％よりも大である。もう１つの実施態様において、「相同性」とは９６％よりも大きな配列に対する同一性をいう。もう１つの実施態様において、相同性は９７％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９８％よりも大である。もう１つの実施態様において、相同性は９９％よりも大である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0293】

関連する蛋白質における対応する配列を同定する方法は当該分野でよく知られており、例えば、ＡＡ配列整列を含む。各方法は本発明の別の実施態様を表わす。

【0294】

本発明のもう１つの実施態様において、「核酸」または「ヌクレオチド」とは、少なくとも２つの塩基−糖−リン酸の組合せのストリングをいう。該用語は、１つの実施態様において、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。「ヌクレオチド」とは、１つの実施態様において、核酸ポリマーのモノマー単位をいう。ＲＮＡは、１つの実施態様において、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびリボザイムの形態であってよい。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用は記載されている（Caudy AA et al.,Genes&Devel 16:2491-96およびそこに引用された文献）。ＤＮＡはプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡまたはこれらの群の誘導体の形態であってよい。加えて、ＤＮＡおよびＲＮＡのこれらの形態は一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖であってよい。該用語は、もう１つの実施態様において、他のタイプの骨格を含有してもよいが、同一の塩基を含有する人工核酸も含む。１つの実施態様において、人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチド骨格およびヌクレオチド塩基を含有し、１つの実施態様においては、ＤＮＡおよびＲＮＡ双方の分子に結合することができる。もう１つの実施態様において、ヌクレオチドはオキセタン修飾されている。もう１つの実施態様において、ヌクレオチドは、１以上のホスホジエステル結合のホスホロチオエート結合での置換によって修飾される。もう１つの実施態様において、人工核酸は当該分野で公知の天然核酸のリン酸骨格のいずれかの他の変種を含有する。ホスホロチオレート核酸およびＰＮＡの使用は当業者に知られており、例えば、Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9:353-57；およびRaz NK et al.Biochem Biophys Res Commun.297:1075-84に記載されている。核酸の生産および使用は当業者に知られており、例えば、Molecular Cloning,(2001)，Sambrook and Russell,eds. and Methods in Enzymology：Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio and G.C.Fareedに記載されている。各核酸誘導体は本発明の別の実施態様を表わす。

【0295】

本明細書中に列挙されたいずれのアミノ酸配列についての蛋白質および／またはペプチドの相同性も、１つの実施態様においては、イムノブロット分析を含めた当該分野でよく記載された方法によって、あるいは確立された方法を介する、多数の入手可能なソフトウエアパッケージのいずれかを利用するアミノ酸配列のコンピュータアルゴリズム分析を介して決定される。これらのパッケージのいくつかはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈまたはＳｃａｎｐｓパッケージを含むことができ、例えば、分析のためのSmith and Watermanアルゴリズム、および／またはグローバル／ローカルまたはＢＬＯＣＫＳ整列の使用を使用してもよい。相同性を決定する各方法は本発明の別の実施態様を表わす。

【0296】

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の方法を実行するのに利用される試薬を含むキットを提供する。もう１つの実施態様において、本発明は、本発明の組成物、ツール、または機器を含むキットを提供する。

【0297】

もう１つの実施態様において、ＡｃｔＡまたはＬＬＯ断片は化学的共役によってＫＬＫ３、ＰＳＣＡ，またはＦＯＬＨ１ペプチドに付着される。もう１つの実施態様において、パラホルムアルデヒドは共役で用いられる。もう１つの実施態様において、マレイミドは共役のために用いられる。もう１つの実施態様において、共役は当該分野で公知のいずれかの適当な方法を用いて実施される。各可能性は本発明のもう１つの実施態様を表わす。

【0298】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物によって標的化されたＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３発現腫瘍はＫＬＫ３発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0299】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物によって標的化されたＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＰＳＣＡ発現腫瘍はＰＳＣＡ発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0300】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物によって標的化されたＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現前立腺癌腫である。もう１つの実施態様において、ＦＯＬＨ１発現腫瘍はＦＯＬＨ１発現腺癌である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0301】

もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１発現腫瘍は乳癌である。もう１つの実施態様において、癌はメラノーマである。もう１つの実施態様において、癌は神経膠腫である。もう１つの実施態様において、癌は卵巣新生物である。もう１つの実施態様において、癌は乳房癌腫である。もう１つの実施態様において、癌は上衣細胞腫である。

【0302】

もう１つの実施態様において、癌はメラノーマである。もう１つの実施態様において、癌は肉腫である。もう１つの実施態様において、癌は癌腫である。もう１つの実施態様において、癌はリンパ腫である。もう１つの実施態様において、癌は白血病である。もう１つの実施態様において、癌は中皮腫である。もう１つの実施態様において、癌は神経膠腫である。もう１つの実施態様において、癌は生殖細胞腫瘍である。もう１つの実施態様において、癌は絨毛腫である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0303】

もう１つの実施態様において、癌は膵臓癌である。もう１つの実施態様において、癌は卵巣癌である。もう１つの実施態様において、癌は胃癌である。もう１つの実施態様において、癌は膵臓の癌腫病巣である。もう１つの実施態様において、癌は肺腺癌である。もう１つの実施態様において、癌は結直腸腺癌である。もう１つの実施態様において、癌は肺扁平細胞腺癌である。もう１つの実施態様において、癌は胃腺癌である。もう１つの実施態様において、癌は卵巣表面上皮新生物（例えば、その良性、増殖性または悪性変種）である。もう１つの実施態様において、癌は口腔扁平細胞癌腫である。もう１つの実施態様において、癌は非小細胞肺癌腫である。もう１つの実施態様において、癌は子宮内膜癌腫である。もう１つの実施態様において、癌は膀胱癌である。もう１つの実施態様において、癌は頭頸部癌である。もう１つの実施態様において、癌は前立腺癌腫である。

【0304】

もう１つの実施態様において、癌は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。もう１つの実施態様において、癌は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。もう１つの実施態様において、癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。もう１つの実施態様において、癌はウィルムス腫瘍である。もう１つの実施態様において、癌は白血病である。もう１つの実施態様において、癌はリンパ腫である。もう１つの実施態様において、癌は繊維形成性小円形細胞腫瘍である。もう１つの実施態様において、癌は中皮腫（例えば、悪性中皮腫）である。もう１つの実施態様において、癌は胃癌である。もう１つの実施態様において、癌は結腸癌である。もう１つの実施態様において、癌は肺癌である。もう１つの実施態様において、癌は生殖細胞腫瘍である。もう１つの実施態様において、癌は卵巣癌である。もう１つの実施態様において、癌は子宮癌である。もう１つの実施態様において、癌は甲状腺癌である。もう１つの実施態様において、癌は肝細胞癌腫である。もう１つの実施態様において、癌は甲状腺癌である。もう１つの実施態様において、癌は肝臓癌である。もう１つの実施態様において、癌は腎臓癌である。もう１つの実施態様において、癌はカポシス（Ｋａｐｏｓｉｓ）である。もう１つの実施態様において、癌は肉腫である。もう１つの実施態様において、癌はもう１つの癌腫または肉腫である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0305】

もう１つの実施態様において、癌は当該分野で公知のいずれかの他のＫＬＫ３、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１発現癌である。癌の各タイプは本発明の別の実施態様を表わす。

【0306】

本明細書中で提供されるように、増強された細胞媒介免疫性は、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、配列番号：１を含有する抗原および切形されたＬＬＯを含む融合蛋白質について示された。実施例のいくつかで用いたΔＬＬＯは、システイン４８４を含有する活性化ドメインを含むカルボキシ末端からの８８残基が切形されたように、（シグナルペプチドの切断後には）４１６アミノ酸長であった。しかしながら、本開示から、活性化ドメイン、特に、システイン４８４を含まない他のΔＬＬＯは本発明の方法で効果的である。もう１つの実施態様において、いずれかの非溶血性ＬＬＯ蛋白質またはその断片、ＡｃｔＡ蛋白質またはその断片、またはＰＥＳＴ様アミノＡＡに対するＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１の融合は、得られるワクチンの細胞媒介および抗腫瘍免疫性を増強させる。

【0307】

本明細書中で提供されるように、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の非溶血性切形形態への抗原の融合は免疫原性を増強させた。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）株１６Ｅ７およびＬＬＯの融合産物を発現し、分泌するＬＭベクターは、Ｅ７蛋白質単独を分泌するＬＭよりもＨＰＶ不滅化腫瘍に対するより効力がある癌免疫治療剤であった。さらに、融合蛋白質ＬＬＯ−Ｅ７についての遺伝子を運ぶ組換えワクシニアウイルスは、Ｅ７蛋白質単独についての遺伝子を運ぶワクシニアの同系株よりもＨＰＶ不滅化腫瘍に対してより効力がある癌免疫治療剤である。比較において、プロモーター、シグナル配列およびＬＬＯの最初の７つのＡＡ残基に融合したＥ７抗原を含む短い融合蛋白質Ｌｍ−ＡＺ／−Ｅ７は不十分な抗腫瘍免疫治療剤であった。この短い融合蛋白質はＰＥＳＴ様配列の直前で終了し、それを含有しない。

【0308】

「融合蛋白質」とは、もう１つの実施態様において、ペプチド結合または他の化学結合によって一緒に連結された２以上の蛋白質を含む蛋白質をいう。もう１つの実施態様において、蛋白質はペプチドまたは他の化学結合によって直接的に一緒に連結されている。もう１つの実施態様において、蛋白質は２以上の蛋白質の間で１以上のアミノ酸（例えば、「スペーサー」）で一緒に連結されている。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0309】

ＫＬＫ３、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１ペプチドを含む融合蛋白質は、もう１つの実施態様において、いずれかの適当な実施態様によって調製される。もう１つの実施態様において、融合蛋白質は、適当な配列のクローニングおよび制限、あるいは以下に議論する方法による直接的化学的合成によって調製される。もう１つの実施態様において、サブ配列はクローン化され、適当なサブ配列は適当な制限酵素を用いて切断される。次いで、もう１つの実施態様においては、断片が連結されて、所望のＤＮＡ配列を生じる。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１ペプチドをコードするＤＮＡは、ＤＮＡ増幅方法、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて生成される。まず、新しい末端のいずれか側の天然ＤＮＡのセグメントは別々に増幅される。１つの増幅された配列の５´末端はペプチドリンカーをコードし、他方、他の増幅された配列の３´末端もペプチドリンカーをコードする。第一の断片の５´末端は第二の断片の３´末端に相補的であるので、（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後の）２つの断片を第三のＰＣＲ反応で重複する鋳型として用いることができる。増幅された配列はコドン、（今や、アミノ配列を形成する）開いた部位のカルボキシ側のセグメント、リンカー、および（今や、カルボキシ配列を形成する）開いた部位のアミノ側の配列を含有するであろう。次いで、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチドをコードする遺伝子をプラスミドに連結する。

【0310】

もう１つの実施態様において、当業者によく知られた多数の手段のいずれかによって、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１ペプチドは切形されたＡｃｔＡ蛋白質、切形されたＬＬＯ蛋白質またはＰＥＳＴ様蛋白質に共役される。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１ペプチドは、直接的にまたはリンカー（スペーサー）を介してのいずれかで、ＡｃｔＡ蛋白質またはＬＬＯ蛋白質に共役している。ＫＬＫ３、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１ペプチドおよびＡｃｔＡ蛋白質またはＬＬＯ蛋白質の双方がポリペプチドであるもう１つの実施態様において、キメラ分子が単一鎖融合蛋白質として組換えにより発現される。

【0311】

ＫＬＫ３、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１ペプチドおよび／またはＡｃｔＡ蛋白質，ＬＬＯ蛋白質またはＰＥＳＴ様配列が比較的短い（すなわち、約５０ＡＡ未満）であるもう１つの実施態様において、それらは標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて合成される。双方の分子が比較的短い場合、もう１つの実施態様において、キメラ分子は単一の連続的ポリペプチドとして合成される。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１ペプチドおよびＡｃｔＡ蛋白質、ＬＬＯ蛋白質またはＰＥＳＴ様配列は別々に合成され、次いで、他の分子のカルボキシル末端との１つの分子のアミノ末端の縮合によって融合され、それにより、ペプチド結合を形成する。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡまたはＦＯＬＨ１ペプチドおよびＡｃｔＡ蛋白質、ＬＬＯ蛋白質またはＰＥＳＴ様配列、各々、ペプチドスペーサー分子の１つの末端と縮合され、それにより、連続的な融合蛋白質を形成する。

【0312】

もう１つの実施態様において、本発明のペプチドおよび蛋白質は、Stewart et al. in Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Edition,1984,Pierce Chemical Company,Rockford,Ill.によって記載され；およびBodanszky and Bodanszky(The Practice of Peptide Synthesis,1984,Springer-Verlag,New York)によって記載された標準的な定評のある固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって容易に調製される。開始時に、適当に保護されたアミノ酸残基は、そのカルボキシル基を通じて、架橋されたポリスチレンまたはポリアミド樹脂のような、誘導体化された不溶性ポリマー支持体に付着される。「適切に保護された」とは、アミノ酸のアルファ−アミノ基上の、およびいずれかの側鎖官能基上の保護基の存在をいう。側鎖保護基は、一般には、合成を通じて用いられる溶媒、試薬および反応条件に対して安定しており、最終のペプチド産物に影響しない条件下で除去することができる。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からのＮ保護基の除去によって行われ、所望のペプチドの配列における次のアミノ酸のカルボキシル末端のそれへカップリングされる。このアミノ酸はやはり適切に保護されている。生じるアミノ酸のカルボキシルを活性化して、カルボジイミド、対称な酸無水物、またはヒドロキシベンゾトリアゾールもしくはペンタフルオロフェニルエステルのような「活性エステル」基への形成のような、反応性基への形成によって支持体結合アミノ酸のＮ末端と反応させることができる。

【0313】

固相ペプチド合成方法の例は、アルファ−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを利用したＢＯＣ方法、およびアミノ酸残基のアルファ−アミノを保護するために９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを利用したＦＭＯＣ方法を含み、その双方の方法は当業者によく知られている。

【0314】

固相ペプチド合成方法に対して慣用的なプロトコルを用い、Ｎおよび／またはＣブロック基の取込みを達成することもできる。Ｃ末端ブロック基の取込みのためには、例えば、固相として、樹脂からの切断の結果、所望のＣ末端ブロック基を有するペプチドが生じるように化学的に修飾されている支持樹脂を用い、所望のペプチドの合成を典型的に行う。Ｃ末端が第一級アミノブロック基を担うペプチドを提供するためには、例えば、ペプチド合成が完了すると、ヨウ化水素酸での処理が所望のＣ末端アミド化ペプチドを放出するように、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を用いて合成を行う。同様に、ＨＦ処理に際して、Ｎ−メチルアミド化Ｃ末端を担うペプチドを放出するＮ−メチルアミノエチル誘導体化ＤＶＢ樹脂を用い、Ｃ末端におけるＮ−メチルアミンブロック基の取込みを達成する。エステル化によるＣ末端のブロックは、慣用的な手法を用いて達成することもできる。これは、樹脂からの側鎖ペプチドの放出を行って、所望のアルコールとの引き続いての反応を可能として、エステル機能を形成する樹脂／ブロック基組合せの使用を含む。ＦＭＯＣ保護基は、メトキシアルコキシベンジルアルコールまたは同等なリンカーで誘導体化したＤＶＢ樹脂と組合せて、この目的で用いることができ、支持体からの切断はジクロロメタン中のＴＦＡによって行われる。次いで、所望のアルコールの添加、引き続いての、エステル化されたペプチド産物の脱保護および単離によって、例えば、ＤＣＣでの適当に活性化されたカルボキシル機能のエステル化を進行させることができる。

【0315】

合成されたペプチドが、例えば、適当な無水物およびニトリルでの処理によって依然として樹脂に付着している間に、Ｎ末端ブロック基の取込みを達成することができる。Ｎ末端におけるアセチルブロック基を取り込むためには、例えば、樹脂結合ペプチドをアセトニトリル中の２０％酢酸無水物で処理することができる。次いで、Ｎブロックペプチド産物を樹脂から切断し、脱保護し、引き続いて単離することができる。

【0316】

もう１つの実施態様において、化学的または生物学的合成技術いずれかから得られたペプチドが所望のペプチドであることを確実とするためには、ペプチド組成の分析を行う。もう１つの実施態様において、アミノ酸組成分析は、ペプチドの分子量を決定するために高分解能質量分析計を用いて行う。別法としてあるいは加えて、ペプチドのアミノ酸含有量は、水性酸中でペプチドを加水分解し、ＨＰＬＣ、またはアミノ酸アナライザーを用いて混合物の成分を分離し、同定し、定量することによって確認することができる。順次にペプチドを分解し、その順序でアミノ酸を同定する蛋白質シーケンサを用いて、ペプチドの配列を明確に決定してもよい。

【0317】

もう１つの実施態様において、その使用に先立って、ペプチドを精製して、汚染物を除去する。この点に関し、ペプチドは精製されて、適当な規制当局およびガイドラインによって設定された標準を満足すると認識されるであろう。多数の慣用的な精製手法のいずれか１つを用いて、例えば、Ｃ_４−、Ｃ_８−またはＣ_１８−シリカのようなアルキル化シリカカラムを用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含めた所望のレベルの純度を達成することができる。有機物含有量を増加させる勾配移動相、例えば、通常は少量のトリフルオロ酢酸を含有する水性緩衝液中のアセトニトリルを通常は用いて精製を達成する。イオン交換クロマトグラフィーを用いてその電荷に基づいてペプチドを分離することができる。

【0318】

配列のＣ末端ＡＡを不溶性支持体に付着させ、続いて、配列中に残りのアミノ酸を順次に加える固相合成を、もう１つの実施態様において、本発明のポリペプチドの化学的合成で用いる。固相合成のための技術は、Barany and Merrifield in Solid-Phase Peptide Synthesis;pp.3-284 in The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.Vol.2：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A., Merrifield et al.J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963),and Stewart et al.,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)によって記載されている。

【0319】

もう１つの実施態様において、本発明のペプチドは、活性に影響することなく修飾されるＡＡ残基を取り込むことができる。例えば、末端を誘導体化して、ブロック基、すなわち、「望ましくない分解」からＮおよびＣ末端を保護し、および／または安定化させるのに適した化学的置換基を含めることができ、該用語は化合物の機能に影響するようなその末端における化合物の酵素的、化学的または生化学的分解、すなわち、その末端における化合物の順次の分解のいずれのタイプも含むことを意図する。

【0320】

もう１つの実施態様において、ブロック基は、ペプチドのイン・ビボ活性に悪影響しないであろうペプチド化学の分野において慣用的に用いられる保護基を含む。例えば、適当なＮ末端ブロック基はＮ末端のアルキル化またはアシル化によって導入することができる。適当なＮ末端ブロック基の例は、Ｃ_１−Ｃ_５分岐または非分岐アルキル基、ホルミルおよびアセチル基のようなアシル基、ならびにアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基のようなその置換された形態を含む。アミノ酸のデスアミノアナログは有用なＮ末端ブロック基でもあり、ペプチドのＮ末端にカップリングできるか、あるいはＮ末端残基の代わりに用いることができる。Ｃ末端のカルボキシル基が組み込まれているか、またはいないのいずれかである適当なＣ末端ブロック基はエステル、ケトンまたはアミドを含む。エステルまたはケトン形成性アルキル基、特に、メチル、エチルおよびプロピルのような低級アルキル基、および第一級アミン（−ＮＨ_２）のようなアミド形成性アミノ基、およびメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ等のようなモノ−およびジ−アルキルアミノ基はＣ末端ブロック基の例である。アグマチンのようなデスカルボキシル化アミノ酸アナログは有用なＣ末端ブロック基でもあり、ペプチドのＣ末端残基にカップリングさせることができるか、あるいはその代りに用いることができる。さらに、末端における遊離アミノおよびカルボキシル基はペプチドから一緒に除去して、ペプチド活性に対する影響なくしてそのデスアミドおよびデスカルボキシル化形態を生じさせることができると認識されるであろう。

【0321】

もう１つの実施態様において、他の修飾は活性に悪影響することなく取り込まれる。もう１つの実施態様において、そのような修飾は、限定されるものではないが、Ｄ異性体形態のアミノ酸での、天然Ｌ異性体形態の１以上のアミノ酸の置換を含む。かくして、ペプチドは１以上のＤ―アミノ酸残基を含んでもよく、あるいは全てがＤ形態であるアミノ酸を含んでもよい。本発明によるペプチドのレトロ−インベルソ形態、例えば、全てのアミノ酸がＤ−アミノ酸で置換された反転ペプチドも考えられる。

【0322】

もう１つの実施態様において、本発明の酸付加塩ペプチドはその機能的同等体として利用される。もう１つの実施態様において、ペプチドの水溶性塩を供するために、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等のような無機酸、あるいは酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、シンナミド、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等のような有機酸で処理された本発明によるペプチドは本発明で用いるのに適している。

【0323】

もう１つの実施態様において、（通常は一次配列を改変しない）修飾はポリペプチドのイン・ビボまたはイン・ビトロ化学的誘導体化、例えば、アセチル化またはカルボキシル化を含む。また、グリコシル化の修飾、例えば、その合成および処理の間の、あるいはさらなる処理工程におけるポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって；例えば、グリコシル化に影響する酵素、例えば、哺乳動物グリコシル化または脱グリコシル化酵素にポリペプチドを暴露することによってなされたものも含まれる。また、リン酸化されたアミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンを有する配列も含まれる。

【0324】

もう１つの実施態様において、通常の分子生物学技術を用いてポリペプチドを修飾して、蛋白質分解に対するその抵抗性を改良し、あるいは溶解特性を最適化し、あるいは治療剤としてそれらをより適当とする。そのようなポリペプチドのアナログは、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含有する物を含む。本発明のペプチドは本明細書中に列挙された具体的な例示的プロセスのいずれかの産物に限定されない。

【0325】

もう１つの実施態様において、本発明のキメラ融合蛋白質は組換えＤＮＡ技術を用いて合成される。一般に、これは融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列を生じさせ、該ＤＮＡを、特定のプロモーター／調節エレメントの制御下に、本発明のプラスミドのような発現カセット中のＤＮＡを置き、該蛋白質を発現させることを含む。

【0326】

本発明の融合蛋白質をコードするＤＮＡは、もう１つの実施態様において、例えば、適当な配列のクローニングおよび制限、あるいはNarang et al.（1979,Meth.Enzymol.68:90-99）のホスホトリエステル方法；Brown et al.（1979,Meth.Enzymol 68:109-151）のホスホジエステルの方法；Beaucage et al.（1981,Tetra. Lett.,22:1859-1862）のジエチルホスホルアミダイト方法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体方法のような方法による直接的化学的合成を含めたいずれかの適当な方法によって調製される。

【0327】

化学的合成は一本鎖オリゴヌクレオチドを生じる。これは、もう１つの実施態様においては、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、あるいは鋳型として一本鎖を用いるＤＮＡポリメラーゼでの重合によって二本鎖ＤＮＡに変換される。当業者であれば、ＤＮＡの化学合成は約１００塩基の配列に限定され、他方、より長い配列はより短い配列の連結によって得ることができるのを認識するであろう。

【0328】

もう１つの実施態様において、「単離された核酸」は、本発明の融合蛋白質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列、およびそれが細胞なしとなった場合、あるいはそれが細胞と会合した場合にはヌクレオチド配列をより安定とするＤＮＡまたはＲＮＡの化学的修飾を含めたそのいずれかの修飾された形態を含む。ヌクレオチドの化学的修飾を用いて、ヌクレオチド配列が細胞によって取り込まれる効率、あるいはそれが細胞において発現される効率を高めることができる。そのような修飾は本明細書中において他の箇所で詳細に記載される。ヌクレオチド配列の修飾のいずれかおよび全ての組合せが本発明で考えられる。

【0329】

もう１つの実施態様において、本発明は非溶血性ＬＬＯ、切形されたＡｃｔＡ蛋白質、またはＰＥＳＴ様配列に操作可能に連結されたＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチドをコードする単離された核酸を提供し、ここで単離された核酸は、該核酸が、好ましくは、核酸によってコードされる蛋白質の発現を指令することができるように、プロモーター／調節配列を含む。かくして、本発明は、例えば、Sambrook et al.（1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York）、およびAusubel et al.（1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York）に記載されたもののような細胞における外因性ＤＮＡの同時発現での、外因性ＤＮＡの細胞への導入のための発現ベクターおよび方法を含む。

【0330】

もう１つの実施態様において、本発明のヌクレオチドはリステリア株においてコードされたペプチドの発現を駆動するプロモーター／調節配列に操作可能に連結されている。遺伝子の構成的発現を駆動するのに有用なプロモーター／調節配列は当該分野でよく知られており、例えば、リステリアのＰ_ｈｌｙＡ、Ｐ_ＡｃｔＡ、およびｐ６０プロモーター、Streptococcus bacプロモーター、Streptomyces griseus sgiAプロモーター、およびB.thuringiensis phaZプロモーターを含む。かくして、本発明は、それに操作可能に連結された所望の蛋白質の発現を駆動することができるいずれのプロモーター／調節配列の使用も含むと認識されるであろう。

【0331】

ベクターを用いる非溶血性ＬＬＯ、切形されたＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列に操作可能に連結されたＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチドの発現は、多量の組換えにより生産される蛋白質の単離を可能とする。特定のプロモーター／調節配列を選択し、それらのプロモーター／調節配列を、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に操作可能に連結させるのは十分に当業者の技量内のものである。そのような技術は当該分野でよく知られており、例えば、Sambrook et al.（1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York）、およびAusubel et al.（1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York）に記載されている。

【0332】

もう１つの実施態様において、本発明は、非溶血性ＬＬＯ、切形されたＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列に操作可能に連結されたＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチドをコードする単離された核酸を含むベクターを提供する。所望の核酸のベクターへの取込み、およびベクターの選択は、例えば、Sambrook et al.（1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York）、およびAusubel et al.（1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York）に記載されている。

【0333】

もう１つの実施態様において、本発明はそのようなベクターを含有する細胞、ウイルス、プロウイルス等を提供する。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を生産する方法は当該分野でよく知られている。例えば、Sambrook et al.（1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York）、およびAusubel et al.（1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York）参照。

【0334】

もう１つの実施態様において、非溶血性ＬＬＯ、切形されたＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列に操作可能に連結されたＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチドをコードする核酸をプラスミドベクターにクローン化する。もう１つの実施態様において、組換えリステリア株をプラスミドベクターで形質転換する。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0335】

一旦本発明を備えると、非溶血性ＬＬＯ、切形されたＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列に操作可能に連結されたＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチドをコードする他の核酸は、本明細書中に開示された他の融合蛋白質の生成についての実験の詳細のセクションにて本明細書中に記載された以下の手法（例えば、部位特異的突然変異誘発、フレームシフト突然変異等）、および当該分野における手法によって得ることができる。

【0336】

融合蛋白質の誘導体または変種形態の生成のための方法は当該分野でよく知られており、とりわけ、例えば、Sambrook et al.（1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York）、およびAusubel et al.（1997,Current Protocols in Molecular Biology,Green&Wiley,New York）に、および本明細書中における他の箇所に記載されたもののような当該分野でよく知られた組換えＤＮＡ方法を用いることを含む。

【0337】

もう１つの実施態様において、本発明は、非溶血性ＬＬＯ、切形されたＡｃｔＡ蛋白質、またはＰＥＳＴ様配列に操作可能に連結されたＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチドをコードする核酸を提供し、ここで標識ポリペプチドをコードする核酸はそれに共有結合により連結される。すなわち、本発明はキメラ核酸を含み、ここで標識ポリペプチドをコードする核酸配列はＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチド含有蛋白質をコードする核酸に共有結合により連結されている。そのようなｔａｇポリペプチドは当該分野でよく知られており、例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ｍｙｃ、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ（ｍｙｃ−ＰＫ）、Ｈｉｓ_６、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、インフルエンザウイルス血球凝集素標識ポリペプチド、フラグ標識ポリペプチド（ＦＬＡＧ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識ポリペプチドを含む。しかしながら、本発明は前記で列挙した標識ポリペプチドをコードする核酸に限定されるとは断じて解釈されるべきではない。むしろ、これらの標識ポリペプチドに実質的に同様に機能し得るポリペプチドは本発明に含まれると解釈されるべきである。

【0338】

また、本発明は、本発明のＡｃｔＡ、ＬＬＯ、およびＰＥＳＴ様配列、その断片、蛋白質、またはペプチドのアナログも提供する。アナログは、もう１つの実施態様において、保存的アミノ酸配列の差によって、配列に影響しない修飾によって、または双方によって、天然に存在する蛋白質またはペプチドとは異なる。

【0339】

もう１つの実施態様において、本発明は増強された免疫原性を持つＫＬＫ３ペプチドを提供する。もう１つの実施態様において、本発明は増強された免疫原性を持つＰＳＣＡペプチドを提供する。もう１つの実施態様において、本発明は増強された免疫原性を持つＦＯＬＨ１ペプチドを提供する。すなわち、本明細書中に開示されたデータが示すように、切形されたＡｃｔＡ蛋白質、非溶血性ＬＬＯ蛋白質、またはＰＥＳＴ様配列に融合されたＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチドの結果、動物に投与された場合、存在する腫瘍の除去、および腫瘍または感染された細胞に浸潤することができる抗原特異的細胞傷害性リンパ球の誘導が起こる。本開示、ならびに本明細書中に開示された方法および組成物を備えた場合、当業者であれば、本発明は多数の疾患の治療および／または予防に使用できると容易に認識するであろう。

【0340】

もう１つの実施態様において、市販のプラスミドを本発明で用いる。そのようなプラスミドは種々の源、例えば、Invitrogen（Carlsbad,Calif.），Stratagene（La Jolla,Calif.），Clontech（Palo Alto,Calif.）から入手可能であるか、あるいは当該分野でよく知られた方法を用いて構築することができる。原核生物における発現を容易とするための原核生物の複製起点およびプロモーター／調節エレメントを持つ原核生物発現ベクターである、ｐＥＴ（Gibbstown,NJ）のような市販のプラスミド。

【0341】

本発明は、さらに、（ａ）ＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチド；および（ｂ）切形されたＡｃｔＡ蛋白質、切形されたＬＬＯ蛋白質、またはＰＥＳＴ様配列をコードする単離された核酸を含むプラスミドでそのようなリステリア株を形質転換することを含む。もう１つの実施態様において、もしＬＭワクチン株がｐｒｆＡ遺伝子またはａｃｔＡ遺伝子において欠失を含むならば、プラスミドは突然変異を補充するためのｐｒｆＡまたはａｃｔＡ遺伝子を含み、それにより、リステリア・モノサイトゲネスワクチン株に対して機能を回復させる。本明細書中において他の箇所で記載したように、細菌を形質転換する方法は当該分野でよく知られているように、塩化カルシウムコンピテント細胞ベースの方法、エレクトロポレーション方法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的および物理的形質転換技術を含む（de Boer et al.,1989,Cell 56:641-649;Miller et al.,1995,FASEB J.,9:190-199;Sambrook et al.1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,New York; Ausubel et al.,1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York;Gerhardt et al.,eds.,1994,Methods for General and Molecular Bacteriology,American Society for Microbiology,Washington,D.C.;Miller,1992,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.）を含む。

【0342】

本発明のプラスミドはもう１つの実施態様において、融合蛋白質をコードする遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を含む。

【0343】

本発明で有用なプラスミドおよび他の発現ベクターは本明細書中で他の箇所に記載されており、プロモーター／調節配列、グラム陰性および／またはグラム陽性細菌のための複製の起点、および融合蛋白質をコードする単離された核酸のような特徴を含むことができる。さらに、融合蛋白質をコードする単離された核酸は、そのような単離された核酸の発現を駆動するのに適したそれ自体のプロモーターを有する。細菌系において発現を駆動するのに有用なプロモーターは当該分野でよく知られており、バクテリオファージラムダ、ｐＢＲ３２２のベータ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターを含む。例えば、原核生物プロモーターの例はバクテリオファージラムダの主要な右側および左側プロモーター（Ｐ_ＬおよびＰ_Ｒ）、E.coliのｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃｄ、およびｇａｌプロモーター、B.subtilisのアルファ−アミラーゼ（Ulmanen et al,1985.J.Bacteriol.162:176-182）およびＳ２８−特異的プロモーター（Gilman et al,1984 Gene 32:11-20）、Bacillusのバクテリオファージのプロモーター（Gryczan,1982,In:The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press,Inc.,New York）、およびStreptomycesプロモーター（Ward et al,1986,Mol.Gen.Genet.203:468-478）を含む。本発明で考えられるさらなる原核生物プロモーターは、例えば、Glick（1987,J.Ind.Microbiol.1:277-282）；Cenatiempo，（1986,Biochimie,68:505-516）；およびGottesman，（1984,Ann.Rev.Genet.18:415-442）にレビューされている。本発明で考えられるプロモーター／調節エレメントは、限定されるものではないが、リステリアのｐｒｆＡプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｙ０７６３９）、Listeriのｈｌｙプロモーター（ＧｅｎＢａｎアクセス番号Ｘ１５１２７）、およびリステリアのｐ６０プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＹ１２６３４２）、またはその断片を含む。

【0344】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のリステリア株はＫＬＫ３ペプチドを含むペプチドをコードする一体化された遺伝子を含有する。もう１つの実施態様において、リステリア株はＰＳＣＡペプチドを含むペプチドをコードする一体化された遺伝子を含有する。もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のリステリア株はＦＯＬＨ１ペプチドを含むペプチドをコードする一体化された遺伝子を含有する。

【0345】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のリステリア株は、部位特異的一体化ベクターを用いて作成される。もう１つの実施態様において、一体化された遺伝子を含有するリステリア株は相同組換えを用いて作成される。もう１つの実施態様において、一体化された遺伝子を含有するリステリア株は、リステリア染色体に遺伝子を組み込む当該分野で公知のいずれかの他の方法を用いて作成される。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0346】

もう１つの実施態様において、組込みベクターはＰＳＡ ａｔｔＰＰ´部位を含む。もう１つの実施態様において、組込みベクターはＰＳＡインテグラーゼをコードする遺伝子を含む。もう１つの実施態様において、組込みベクターはＵ１５３ ａｔｔＰＰ´部位を含む。もう１つの実施態様において、組込みベクターはＵ１５３インテグラーゼをコードする遺伝子を含む。もう１つの実施態様において、組込みベクターはＡ１１８ ａｔｔＰＰ´部位を含む。もう１つの実施態様において、組込みベクターはＡ１１８インテグラーゼをコードする遺伝子を含む。もう１つの実施態様において、組込みベクターは当該分野で公知のいずれかの他のａｔｔＰＰ´部位を含む。もう１つの実施態様において、組込みベクターは当該分野で公知のいずれかのファージインテグラーゼを含む。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0347】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のリステリア株は代謝遺伝子において突然変異または栄養要求性を含有する。もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のリステリア株、さらに、内因性ＡｃｔＡ遺伝子において突然変異を含む。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチド、ＰＳＣＡペプチドまたはＦＯＬＨ１ペプチドを運ぶプラスミドは、突然変異または栄養要求性を補う代謝遺伝子を含む。もう１つの実施態様において、ＫＬＫ３ペプチド、ＰＳＣＡペプチドまたはＦＯＬＨ１ペプチドをコードする組込みベクター、またはリステリア染色体への組込みで用いられる構築体は、該突然変異または栄養要求性を補う遺伝子を含有する。もう１つの実施態様において、該代謝遺伝子は抗生物質耐性遺伝子の代わりの選択で用いられる。もう１つの実施態様において、代謝遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子に加えて選択で用いられる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0348】

もう１つの実施態様において、代謝遺伝子はアミノ酸代謝酵素をコードする遺伝子である。もう１つの実施態様において、代謝酵素はアラニンラセマーゼ（ｄａｌ）酵素である。もう１つの実施態様において、代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（ｄａｔ）である。

【0349】

もう１つの実施態様において、代謝酵素は、細菌成長プロセスで用いられるアミノ酸（ＡＡ）を代謝する。もう１つの実施態様において、産物ＡＡは複製プロセスで用いられる。もう１つの実施態様において、産物ＡＡは細胞壁合成で用いられる。もう１つの実施態様において、代謝酵素は細胞壁合成で用いるアミノ酸の形成を触媒する。もう１つの実施態様において、代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。もう１つの実施態様において、産物ＡＡは蛋白質合成で用いられる。もう１つの実施態様において、産物ＡＡは脂肪酸の代謝で用いられる。もう１つの実施態様において、産物ＡＡは当該分野で公知のいずれかの他の成長または複製プロセスで用いられる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0350】

もう１つの実施態様において、代謝酵素は細胞壁合成で用いるＡＡの形成を触媒する。もう１つの実施態様において、代謝酵素は細胞壁合成で用いるＡＡの合成を触媒する。もう１つの実施態様において、代謝酵素は細胞壁合成で用いるＡＡの合成に関与する。もう１つの実施態様において、ＡＡは細胞壁生合成で用いられる。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0351】

もう１つの実施態様において、代謝酵素は、細胞壁成分であるＤ−グルタミン酸についての合成酵素である。

【0352】

もう１つの実施態様において、代謝酵素はアラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）遺伝子によってコードされる。Ｄ−グルタミン酸合成は、部分的には、Ｄ−ｇｌｕ＋ｐｙｒのアルファ−ケトグルタレート＋Ｄ−ａｌａへの変換、および逆反応に関与するｄａｌ遺伝子によって制御される。

【0353】

もう１つの実施態様において、本発明の方法および組成物のｄａｌ蛋白質は配列：
［００１］ＭＶＴＧＷＨＲＰＴＷＩＥＩＤＲＡＡＩＲＥＮＩＫＮＥＱＮＫＬＰＥＳＶＤＬＷＡＶＶＫＡＮＡＹＧＨＧＩＩＥＶＡＲＴＡＫＥＡＧＡＫＧＦＣＶＡＩＬＤＥＡＬＡＬＲＥＡＧＦＱＤＤＦＩＬＶＬＧＡＴＲＫＥＤＡＮＬＡＡＫＮＨＩＳＬＴＶＦＲＥＤＷＬＥＮＬＴＬＥＡＴＬＲＩＨＬＫＶＤＳＧＭＧＲＬＧＩＲＴＴＥＥＡＲＲＩＥＡＴＳＴＮＤＨＱＬＱＬＥＧＩＹＴＨＦＡＴＡＤＱＬＥＴＳＹＦＥＱＱＬＡＫＦＱＴＩＬＴＳＬＫＫＲＰＴＹＶＨＴＡＮＳＡＡＳＬＬＱＰＱＩＧＦＤＡＩＲＦＧＩＳＭＹＧＬＴＰＳＴＥＩＫＴＳＬＰＦＥＬＫＰＡＬＡＬＹＴＥＭＶＨＶＫＥＬＡＰＧＤＳＶＳＹＧＡＴＹＴＡＴＥＲＥＷＶＡＴＬＰＩＧＹＡＤＧＬＩＲＨＹＳＧＦＨＶＬＶＤＧＥＰＡＰＩＩＧＲＶＣＭＤＱＴＩＩＫＬＰＲＥＦＱＴＧＳＫＶＴＩＩＧＫＤＨＧＮＴＶＴＡＤＤＡＡＱＹＬＤＴＩＮＹＥＶＴＣＬＬＮＥＲＩＰＲＫＹＩＨ（配列番号：５６；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＦ０３８４３８）を有する。もう１つの実施態様において、ｄａｌ蛋白質は配列番号：５６に対して相同である。もう１つの実施態様において、ｄａｌ蛋白質は配列番号：５６の変種である。もう１つの実施態様において、ｄａｌ蛋白質は配列番号：５６のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ｄａｌ蛋白質は配列番号：５６の断片である。もう１つの実施態様において、ｄａｌ蛋白質は配列番号：５６のホモログの断片である。もう１つの実施態様において、ｄａｌ蛋白質は配列番号：５６の変種の断片である。もう１つの実施態様において、ｄａｌ蛋白質は配列番号：５６のイソ形態の断片である。

【0354】

もう１つの実施態様において、ｄａｌ蛋白質は当該分野で公知のいずれかの他のリステリア ｄａｌ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ｄａｌ蛋白質は当該分野で公知のいずれかのBacillus subtilis dal蛋白質である。もう１つの実施態様において、ｄａｌ蛋白質は当該分野で公知のいずれかの他のグラム陽性ｄａｌ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ｄａｌ蛋白質は当該分野で公知のいずれかの他のｄａｌ蛋白質である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0355】

本発明の方法および組成物のｄａｔ蛋白質は、もう１つの実施態様において、配列：
ＭＫＶＬＶＮＮＨＬＶＥＲＥＤＡＴＶＤＩＥＤＲＧＹＱＦＧＤＧＶＹＥＶＶＲＬＹＮＧＫＦＦＴＹＮＥＨＩＤＲＬＹＡＳＡＡＫＩＤＬＶＩＰＹＳＫＥＥＬＲＥＬＬＥＫＬＶＡＥＮＮＩＮＴＧＮＶＹＬＱＶＴＲＧＶＱＮＰＲＮＨＶＩＰＤＤＦＰＬＥＧＶＬＴＡＡＡＲＥＶＰＲＮＥＲＱＦＶＥＧＧＴＡＩＴＥＥＤＶＲＷＬＲＣＤＩＫＳＬＮＬＬＧＮＩＬＡＫＮＫＡＨＱＱＮＡＬＥＡＩＬＨＲＧＥＱＶＴＥＣＳＡＳＮＶＳＩＩＫＤＧＶＬＷＴＨＡＡＤＮＬＩＬＮＧＩＴＲＱＶＩＩＤＶＡＫＫＮＧＩＰＶＫＥＡＤＦＴＬＴＤＬＲＥＡＤＥＶＦＩＳＳＴＴＩＥＩＴＰＩＴＨＩＤＧＶＱＶＡＤＧＫＲＧＰＩＴＡＱＬＨＱＹＦＶＥＥＩＴＲＡＣＧＥＬＥＦＡＫ（配列番号：５７；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＦ０３８４３９）によってコードされる。もう１つの実施態様において、ｄａｔ蛋白質は配列番号：５７に対して相同である。もう１つの実施態様において、ｄａｔ蛋白質は配列番号：５７の変種である。もう１つの実施態様において、ｄａｔ蛋白質は配列番号：５７のイソ形態である。もう１つの実施態様において、ｄａｔ蛋白質は配列番号：５７の断片である。もう１つの実施態様において、ｄａｔ蛋白質は配列番号：５７のホモログの断片である。もう１つの実施態様において、ｄａｔ蛋白質は配列番号：５７の変種の断片である。もう１つの実施態様において、ｄａｔ蛋白質は配列番号：５７のイソ形態の断片である。

【0356】

もう１つの実施態様において、ｄａｔ蛋白質は当該分野で公知のいずれかの他のリステリア ｄａｔ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ｄａｔ蛋白質は当該分野で公知のいずれかの他のグラム陽性 ｄａｔ蛋白質である。もう１つの実施態様において、ｄａｔ蛋白質は当該分野で公知のいずれかの他のｄａｔ蛋白質である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0357】

もう１つの実施態様において、代謝酵素はＤ−グルタミン酸合成遺伝子である。もう１つの実施態様において、代謝酵素はｄｇａによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はａｌｒ（アラニンラセマーゼ）遺伝子によってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はアラニン合成に関与する当該分野で公知のいずれかの他の酵素である。

【0358】

もう１つの実施態様において、代謝酵素はｓｅｒＣ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素は、細胞壁構成ジアミノピメリン酸の合成に関与するａｓｄ（アスパルテートベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）によってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素は、（Ｓ）−４−アミノ−５−オコソペンタノエートからの５−アミノレブリネートの形成を触媒するｇｓａＢ−グルタメート−１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素は、（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノエートからの５−アミノレブリネートの形成を触媒するＨｅｍＬによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素は、Ｌ−アスパルテートおよび２−オキソグルタレートからのオキサロ酢酸およびＬ−グルタメートの形成を触媒するアスパルテートアミノトランスフェラーゼであるａｓｐＢによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はアルギニン生合成に関与するａｒｇＦ−１によってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はアミノ酸生合成に関与するａｒｏＥによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素は３−デヒドロキネート生合成に関与するａｒｏＢによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はアミノ酸生合成に関与するａｒｏＤによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はアミノ酸生合成に関与するａｒｏＣによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はヒスチジン生合成に関与するｈｉｓＢによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はヒスチジン生合成に関与するｈｉｓＤによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はヒスチジン生合成に関与するｈｉｓＧによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はメチオニン生合成に関与するｍｅｔＸによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はプロリン生合成に関与するｐｒｏＢによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はアルギニン生合成に関与するａｒｇＲによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はアルギニン生合成に関与するａｒｇＪによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はチアミン生合成に関与するｔｈｉＩによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はトリプトファン生合成に関与するＬＭＯｆ２３６５ １６５２２によってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はトリプトファン生合成に関与するａｒｏＡによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はバリンおよびイソロイシン生合成に関与するｉｌｖＤによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はバリンおよびイソロイシン生合成に関与するｉｌｖＣによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はロイシン生合成に関与するｌｅｕＡによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はリシン生合成に関与するｄａｐＦによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はスレオニン生合成に関与するｔｈｒＢによってコードされる（全てＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ ００２９７３）。

【0359】

もう１つの実施態様において、代謝酵素はｔＲＮＡシンテターゼである。もう１つの実施態様において、代謝酵素はトリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼをコードするｔｒｐＳ遺伝子によってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素は当該分野で公知のいずれかの他のｔＲＮＡシンテターゼである。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0360】

もう１つの実施態様において、宿主株細菌はΔ（ｔｒｐＳ ａｒｏＡ）であり、双方のマーカーは組込みベクターに含有される。

【0361】

もう１つの実施態様において、代謝酵素はジアミノピメリン酸の合成に関与するｍｕｒＥによってコードされる（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＮＣ ００３４８５）。

【0362】

もう１つの実施態様において、代謝酵素はテイコ酸生合成に関与するＬＭＯｆ２３６５ ２４９４によってコードされる。

【0363】

もう１つの実施態様において、代謝酵素はＷｅｃＥ（リポ多糖生合成蛋白質ｒｆｆＡ；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＥ０１４０７５．１）によってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はａｍｉＡ、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼである。もう１つの実施態様において、代謝酵素はヒスチジノール−リン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＮＰ ４６６３４７）である。もう１つの実施態様において、代謝酵素は細胞壁テイコ酸グリコシル化蛋白質ＧｔｃＡである。

【0364】

もう１つの実施態様において、代謝酵素はペプチドグリカン成分または前駆体についての合成酵素である。もう１つの実施態様において、成分はＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチドである。もう１つの実施態様において、成分はＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンである。もう１つの実施態様において、成分はＭｕｒＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリル−ウンデカプレノールである。もう１つの実施態様において、成分はＧｌｃＮＡｃ−β−（１，４）−ＭｕｒＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリル−ウンデカプレノールである。もう１つの実施態様において、成分は当該分野で公知のいずれかの他のペプチドグリカン成分または前駆体である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0365】

もう１つの実施態様において、代謝酵素はｍｕｒＧによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はｍｕｒＤによってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はｍｕｒＡ−１によってコードされる。もう１つの実施態様において、代謝酵素はｍｕｒＡ−２によってコードされる（全てＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＮＣ ００２９７３に記載されている）。もう１つの実施態様において、代謝酵素はペプチドグリカン成分または前駆体についてのいずれかの他の合成酵素である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0366】

もう１つの実施態様において、代謝酵素はトランス−グリコシラーゼである。もう１つの実施態様において、代謝酵素はトランス−ペプチダーゼである。もう１つの実施態様において、代謝酵素はカルボキシ−ペプチダーゼである。もう１つの実施態様において、代謝酵素は当該分野で公知のいずれかの他のクラスの代謝酵素である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0367】

もう１つの実施態様において、代謝酵素は当該分野で公知のいずれかの他のリステリア・モノサイトゲネス代謝酵素である。

【0368】

もう１つの実施態様において、代謝酵素は当該分野で公知のいずれかの他のリステリア代謝酵素である。

【0369】

もう１つの実施態様において、代謝酵素は当該分野で公知のいずれかの他のグラム陽性細菌代謝酵素である。

【0370】

もう１つの実施態様において、代謝酵素は当該分野で公知のいずれかの他の代謝酵素である。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0371】

もう１つの実施態様において、組込みベクターはリステリアを感染させることができる当該分野で公知のいずれかの他の部位特異的組込みベクターである。各可能性は本発明の別の実施態様を表わす。

【0372】

もう１つの実施態様において、本発明はＬＬＯの非溶血性切形形態（「ΔＬＬＯ」）への抗原の融合を介してＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１抗原の免疫原生を増強させる方法を提供する。もう１つの実施態様において、抗原はＰＥＳＴ様配列に融合される。もう１つの実施態様において、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列はＬＬＯの配列番号：１である。本発明は、さらに、切形されたＡｃｔＡ蛋白質、切形されたＬＬＯ蛋白質、またはその断片に抗原を融合させることによって、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１抗原の免疫原性を増強させるための方法および組成物を提供する。本明細書中に開示されるデータによって示されるように、ＡｃｔＡ蛋白質へ融合された抗原は、存在する腫瘍を除去し、その結果、抗原特異的細胞傷害性リンパ球が誘導される免疫応答を誘導する。

【0373】

もう１つの実施態様において、本発明の融合蛋白質は、ＫＬＫ３ペプチドおよび非ＫＬＫ３ペプチド双方をコードするプラスミドまたはヌクレオチド分子の、細菌における、転写および翻訳を介して組換えにより生産される。もう１つの実施態様において、もう１つの実施態様において、融合蛋白質は、ＰＳＣＡペプチドおよび非ＰＳＣＡペプチド双方をコードするプラスミドまたはヌクレオチド分子の、細菌における、転写および翻訳を介して組換えにより生産される。もう１つの実施態様において、融合蛋白質は、ＦＯＬＨ１ペプチドおよび非ＦＯＬＨ１ペプチド双方をコードするプラスミドまたはヌクレオチド分子の、細菌における、転写および翻訳を介して組換えにより生産される。もう１つの実施態様において、プラスミドまたはヌクレオチドはイン・ビトロで転写されおよび／または翻訳される。もう１つの実施態様において、抗原は、リステリア・モノサイトゲネスのＰＥＳＴ様ＡＡ配列、またはもう１つの原核生物に由来するＰＥＳＴ様ＡＡ配列を含むＬＬＯの切形された形態に化学的に共役される。「抗原」とは、もう１つの実施態様において、同定されたＴ細胞エピトープを含むこれらの天然ＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１遺伝子産物または切形されたバージョンをいう。もう１つの実施態様において、次いで、これらの融合蛋白質を、対象への投与のためのワクチンに取り込んで、融合蛋白質の抗原に対する増強された免疫応答を誘導する。他の実施態様において、本発明の融合蛋白質はＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチンまたは複製ＲＮＡワクチンとして送達される。本開示に際して、当業者に明らかなように、本発明の融合蛋白質を含むワクチンは、感染症および新生物疾患の予防および治療で特に有用である。

【0374】

本発明は、さらに、有効量の本発明のワクチンを含む組成物を動物またはヒトに投与する方法を含む。該組成物は、とりわけ、医薬上許容される担体を含む。もう１つの実施態様において、組成物は、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチドに融合した、切形されたＡｃｔＡ蛋白質、切形されたＬＬＯ蛋白質、またはその断片を含むリステリアワクチン株、および医薬上許容される担体を含む。

【0375】

もう１つの実施態様において、本発明は、切形されたＬＬＯ蛋白質、切形されたＡｃｔＡ蛋白質、またはＰＥＳＴ様配列に融合された、ＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチド、および／またはそれを含むリステリアワクチン株を含む組成物、アプリケーター、および本発明の方法を実行するための化合物の使用を記載する指示資料を含むキットを提供する。モデルキットを以下に記載するが、他の有用なキットの内容は本開示に徴して当業者に明らかであろう。これらのキットの各々は本発明内にあると考えられる。

【0376】

もう１つの実施態様において、本発明は抗原に対する増強された免疫応答を誘導するキットを提供し、該キットは切形されたＡｃｔＡ蛋白質、切形されたＬＬＯ蛋白質、またはＰＥＳＴ様配列に融合したＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチド、および医薬上許容される担体を含み、該キットは、さらに、アプリケーター、およびその使用のための指示資料を含む。

【0377】

もう１つの実施態様において、本発明は抗原に対する増強された免疫応答を誘導するキットを提供する。該キットは本発明について本明細書中に開示された方法と同一の方法で用いられる。もう１つの実施態様において、キットは、切形されたＡｃｔＡ蛋白質、切形されたＬＬＯ蛋白質、またはＰＥＳＴ様配列に融合したＫＬＫ３、ＰＳＣＡ、またはＦＯＬＨ１ペプチドを含むリステリアワクチン株を投与するために用いられる。もう１つの実施態様において、キットはアプリケーター、該キットの使用のための指示資料を含む。これらの指示は、単純に、本明細書中に提供された例を具体化する。

【0378】

もう１つの実施態様において、本発明は抗原に対する増強された免疫応答を誘導するキットを提供する。該キットは本発明について本明細書中に開示された方法と同一の方法で用いられる。簡単に述べれば、キットはＡｃｔＡ蛋白質、ＬＬＯ蛋白質、またはＰＥＳＴ様配列に融合した抗原を投与するために用いることができる。加えて、キットはアプリケーター、該キットの使用のための指示資料を含む。これらの指示は、単純に、本明細書中に提供された例を具体化する。

【実施例】

【0379】

実施例１：ＬＬＯ抗原融合は抗腫瘍免疫性を誘導する。

【0380】

材料および実験方法（実施例１ないし２）

【0381】

細胞系

【0382】

Ｃ５７ＢＬ／６同系ＴＣ−１腫瘍を、ＨＰＶ−１６ Ｅ６およびＥ７で不滅化し、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換した。ＴＣ−１は低レベルのＥ６およびＥ７を発現し、高度に腫瘍形成性である。ＴＣ−１を、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０マイクロモル（ｍｃＭ）の２−ＭＥ、４００マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍｌのＧ４１８、および10%National Collection Type Culture-109培地中で３７°にて１０％ＣＯ_２にて成長させた。Ｃ３はＨＰＶ１６の完全なゲノムで不滅化され、かつｐｅＪ−ｒａｓで形質転換されたＣ５７ＢＬ／６マウスからのマウス胚細胞である。ＥＬ−４／Ｅ７は、Ｅ７でレトロウイルスにより形質導入された胸腺腫ＥＬ−４である。

【0383】

リステリア・モノサイトゲネス株および増殖

【0384】

用いたリステリア株はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（エピソーム発現系におけるｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子；図１Ａ）、Ｌｍ−Ｅ７（リステリアゲノムに組込まれた単一コピーＥ７遺伝子カセット）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（「ＤＰ−Ｌ２０２８」；エピソーム発現系におけるｈｌｙ−ＮＰ融合遺伝子）、およびＬｍ−Ｇａｇ（「ＺＹ−１８」；染色体に組み込まれた単一コピーＨＩＶ−１ Ｇａｇ遺伝子カセット）であった。

【0385】

ｐＧＧ−５５を生じさせるために、ＬＬＯ−Ｅ７プラスミド、Ｅ７を、プライマー５´−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３´（配列番号：８；ＸｈｏＩ部位に下線を施す）および５´−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３´（配列番号：９；ＳｐｅＩ部位に下線を施す）を用いてＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ２．１（Invitrogen,San Diego,CA）に連結させた。Ｅ７をＸｈｏｌ／ＳｐｅＩ消化によってｐＣＲ２．１から切り出し、ｐＤＰ−２０２８（Ikonomidis G et al.Delivery of a viral antigen to the class I processing and presentation pathway by Listeria monocytogenes. J Exp Med.1994 Dec 1;180(6):2209-18）に連結させた。ｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子および多能性転写因子ｐｒｆＡを増幅し、マルチコピーシャトルプラスミド（Wirth R et al.,J Bacteriol,165:831,1986）であるｐＡＭ４０１にサブクローンし、ｐＧＧ−５５を生じさせた。ｈｌｙプロモーターおよび遺伝子断片を、プライマー５´−ＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３´（配列番号：１０；ＮｈｅＩ部位は下線を施す）および５´−ＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣ−３´（配列番号：１１；ＸｈｏＩ部位に下線を施す）を用いて増幅した。ｐｒｆＡ遺伝子は、プライマー５´−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３´（配列番号：１２；ＸｂａＩ部位に下線を施す）および５´−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３´（配列番号：１３；ＳａｌＩに下線を施す）を用いてＰＣＲ増幅した。

【0386】

得られたプラスミドｐＧＧ−５５において、ｈｌｙプロモーターは、Ｅ７遺伝子にＸｈｏＩ部位によって連結された、引き続いて切断されるシグナル配列を含めたｈｌｙ遺伝子産物の最初の４４１ＡＡの発現を駆動し、ｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子が生じ、これを転写し、ＬＬＯ−Ｅ７として分泌させる。このＬＬＯ断片は溶血性Ｃ末端を欠如し、配列番号：１８に記載された配列を有する。これを以下において「ΔＬＬＯ」といい、これは、単に、本発明の方法および組成物で用いることができる多くのうちの例示的なΔＬＬＯである。（ペンシルバニア大学のHao Shen博士によって提供された）リステリアのｐｒｆＡ陰性株ＸＦＬ−７のｐＧＧ−５５での形質転換は、イン・ビボでのプラスミドの保持について選択された（図１Ａないし１Ｂ）。

【0387】

Ｌｍ−Ｅ７は、ｈｌｙプロモーター、およびＥ７の発現および分泌を駆動するシグナル配列を含有する発現カセットをＬＭゲノムのｏｒｆＺドメインに導入することによって生じさせた。Ｅ７は、プライマー５´−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ−３´（配列番号：２２；ＢａｍＨＩ部位に下線を施す）および５´−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧ−３´（配列番号：２３；ＸｂａＩ部位に下線を施す）を用いるＰＣＲによって増幅した。次いで、Ｅ７をｐＺＹ−２１シャトルベクターに連結した。ＬＭ株１０４０３Ｓを、ＬＭゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに対応する１．６−ｋｂ配列の中央に挿入された発現カセットを含む得られたプラスミドｐＺＹ−２１−Ｅ７で形質転換した。相同性ドメインは、相同組換えによる、Ｅ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの挿入を可能とする。クローンを、Ｅ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの組み込みについてスクリーニングした。細菌を、（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）を含む、または（Ｌｍ−Ｅ７およびＺＹ−１８）クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含まないブレインハートインフージョン培地中で成長させた。細菌を−８０°Ｃにて少量ずつ凍結させた。発現はウェスタンブロッティングによって確認した（図２）。

【0388】

ウェスタンブロッティング

【0389】

リステリア株を３７℃にてルリア−ベルトニ培地中で成長させ、６００ｎｍで測定した同一光学密度で収穫した。上清をＴＣＡ沈殿させ、０．１Ｎ ＮａＯＨを補足した１×試料緩衝液中に再懸濁させた。同一量の各細胞ペレットまたは各ＴＣＡ沈殿上清を４ないし２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（NOVEX,San Diego,CA）上に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデンに移し、抗Ｅ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Zymed Laboratories,South San Francisco,CA）でプローブし、次いで、ＨＲＰ共役抗マウス二次Ａｂ（Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont,U.K.）と共にインキュベートし、Amersham ECL検出試薬で発色させ、Hyperfilm（Amersham Pharmacia Biotech）に曝露した。

【0390】

腫瘍成長の測定

【0391】

腫瘍を、最も短いおよび最も長い直径に渡るキャリパーで１日置きに測定した。これらの２つの測定の平均を種々の時点に対してミリメートルで表した平均腫瘍直径としてプロットした。腫瘍の直径が２０ｍｍに到達すると、マウスを犠牲にした。各時点についての腫瘍測定を生存マウスについてのみ示す。

【0392】

樹立された腫瘍成長に対するリステリア組換え体の効果

【0393】

６ないし８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Charles River）に、左脇腹に２×１０^５ＴＣ−１細胞を皮下にて投与した。腫瘍接種から１週間後に、腫瘍は直径が４ないし５ｍｍの可触サイズに到達した。次いで、８匹のマウスの群を、７日および１４日に、０．１ ＬＤ_５０腹腔内Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０^７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１０^６ＣＦＵ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（１０^７ＣＦＵ）またはＬｍ−Ｇａｇ（５×１０^５ＣＦＵ）で処理した。

【0394】

^５１Ｃｒ放出アッセイ

【0395】

６ないし８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ_５０Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇで腹腔内免疫化した。免疫化から１０日後に、脾臓を収穫した。脾臓細胞をフィーダー細胞としての照射されたＴＣ−１細胞（１００：１，脾臓細胞：ＴＣ−１）を含む培養で樹立させ；イン・ビトロにて５日間刺激し、次いで、以下の標的：ＥＬ−４、ＥＬ−４／Ｅ７、またはＥＬ−４、またはＥ７ Ｈ−２ｂペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）でパルスしたＥＬ−４を用い、標準^５１Ｃｒ放出アッセイで用いた。三連で行ったＥ：Ｔ細胞比率は８０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１および２．５：１であった。３７℃での４時間のインキュベーション後に、細胞をペレット化し、５０μｌ上清を各ウェルから除去した。試料をＷａｌｌａｃ１４５０シンチレーションカウンター（Gaithersburg,MD）でアッセイした。パーセント特異的溶解は［（分当たりの実験的カウント−分当たりの自然発生カウント）／（分当たりの合計カウント−分当たりの自然発生カウント）］×１００として決定した。

【0396】

ＴＣ−１−特異的増殖

【0397】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ_５０で免疫化し、２０日後に、１回のＬＤ_５０ Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇで腹腔内注射によりブースター注射した。ブースティングから６日後に、脾臓を免疫化およびナイーブマウスから収穫した。脾臓細胞を、Ｅ７ Ａｇの源としての２．５×１０^４、１．２５×１０^４、６×１０^３、または３×１０^３照射ＴＣ−１細胞／ウェルを含む、またはＴＣ−１細胞を含まない、または１０μｇ／ｍｌ Ｃｏｎ Ａ．を含む平底９６ウェルプレート中で５×１０^５／ウェルにて培養で樹立した。細胞を４５時間後に０．５μＣｉ［^３Ｈ］チミジン／ウェルでパルスした。プレートを、Ｔｏｍｔｅｃハーベスター９６（Orange,CT）を用いて１８時間後に収穫し、増殖をＷａｌｌａｃ１４５０シンチレーションカウンターで評価した。分当たりのカウントの変化を、分当たりの実験カウント−分当たりのＡｇ無しカウントとして計算した。

【0398】

フローサイトメトリー分析

【0399】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ_５０Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７で静脈内（ｉ．ｖ．）免疫化し、３０日後にブースター注射した。ＣＤ８（５３−６．７，ＰＥ共役）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ；ＭＥＬ−１４，ＡＰＣ共役）、およびＥ７ Ｈ−２Ｄｂテトラマーについての３色フローサイトメトリーを、CellQuest（登録商標）ソフトウェア（Becton Dickinson,Mountain View,CA）を備えたFACS Calibur（登録商標）フローサイトメーターを用いて行った。ブーストから５日後に収穫した脾臓細胞を、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）または対照（ＨＩＶ−Ｇａｇ）ペプチドを負荷したＨ−２Ｄｂテトラマーで室温にて染色した。テトラマーは１／２００希釈で用い、これは、Larry R.Pease博士（Mayo Clinic,Rochester,MN）によって、およびNational Institute of Allergy and Infectious Diseases Tetramer Core Facilityおよびthe National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Programによって供給された。テトラマー^＋、ＣＤ８^＋、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ細胞を分析した。

【0400】

特異的免疫成分の枯渇

【0401】

ＣＤ８^＋細胞、ＣＤ４^＋細胞およびＩＦＮを、腫瘍負荷から６、７、８、１０、１２、および１４日後に、各々、ｍＡｂのマウス当たり０．５ｍｇ：２．４３、ＧＫ１．５、またはｘｍｇ１．２をマウスに注射することによってＴＣ−１担持マウスにおいて枯渇させた。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋細胞集団を９９％だけ低下させた（フローサイトメトリー分析）。ＣＤ２５^＋細胞を、４および６日に、０．５ｍｇ／マウス抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（ＰＣ６１，Andrew J.Catonによって供給された）の腹腔内注射によって枯渇させた。ＴＧＦは、６、７、８、１０、１２、および１４，１６、１８、および２０日に、ＴＣ−１−担持マウスへの、抗ＴＧＦ−ｍＡｂ（２Ｇ７，H.I.Levitskyによって供給された）の腹腔内注射によって枯渇させた。腫瘍負荷から７日後に、マウスを１０^７Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７で処理した。

【0402】

養子導入

【0403】

ドナーＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化し、７日後に、０．１ＬＤ_５０Ｌｍ−Ｅ７またはＬｍ−Ｇａｇでブースター注射した。ドナー脾臓細胞を収穫し、ナイロン羊毛カラムに通して、Ｔ細胞を濃縮させた。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、０．１μｇ ２．４３抗ＣＤ８ ｍＡｂと共に室温にて３０分間インキュベートすることによってイン・ビトロによって枯渇させた。次いで、標識された細胞をウサギ補体で処理した。ドナー脾臓細胞は＞６０％ＣＤ４^＋Ｔ細胞であった（フローサイトメトリー分析）。腫瘍負荷から７日後に、ＴＣ−１腫瘍担持レシピエントマウスを０．１ＬＤ_５０で免疫化した。ＣＤ４^＋濃縮ドナー脾臓細胞（１０^７）を腫瘍負荷から７日後に静脈内注射によってレシピエントマウスに導入した。

【0404】

Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａ実験

【0405】

２４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに５×１０^５Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａ細胞を接種した。３，１０、および１７日に、８匹のマウスの群を０．１ＬＤ_５０Ｌｍ−ＯＶＡ（１０^６ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（１０^８ｃｆｕ）で免疫化し、８匹のマウスを処理しないまま放置した。

【0406】

統計学

【0407】

腫瘍直系の比較のために、各群についての腫瘍サイズの平均およびＳＤを決定し、スチューデントｔ検定によって統計学的有意性を決定した。ｐ?０．０５が有意であると考えられた。

【0408】

結果

【0409】

Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、ＴＣ−１成長に対してインパクトを与えるその能力について比較した。皮下腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に樹立した。７日後に、腫瘍は可触サイズ（４ないし５ｍｍ）に達した。マウスに、７および１４日に、０．１ＬＤ_５０Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、または対照としての、Ｌｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰをワクチン接種した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は樹立されたＴＣ−１腫瘍の７５％の完全な退行を誘導し、他方、該群における他の２匹のマウスはその腫瘍の成長を制御した（図３Ａ）。対照的に、免疫化Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−Ｇａｇは腫瘍の退行を誘導しなかった。この結果を多数回反復し、常に、非常に同様な結果が伴った。加えて、異なる免疫化プロトコルの下で、同様な結果がＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で達成された。もう１つの実験において、単一の免疫化は、樹立された５ｍｍ ＴＣ−１腫瘍のマウスを治癒することができた。

【0410】

他の実験において、同様な結果が、２つの他のＥ７発現腫瘍細胞系：Ｃ３およびＥＬ−４／Ｅ７で得られた。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７でのワクチン接種の効果を確認するために、その腫瘍を排除した動物を、各々、６０日または４０日に、ＴＣ−１またはＥＬ−４／Ｅ７腫瘍細胞で再度負荷した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫化した動物は、実験の終了（ＴＣ−１の場合に１２４日、およびＥＬ−４／Ｅ７については５４日）まで腫瘍がないままであった。

【0411】

同様な実験をニワトリオボアルブミン抗原（ＯＶＡ）で行った。マウスをＬｍ−ＯＶＡまたはＬｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡいずれかで免疫化し、次いで、ＯＶＡを発現するように操作したＥＬ−４胸腺腫、または非常に低いＭＨＣクラスＩ発現を有する非常に攻撃的なマウスメラノーマ細胞系Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａいずれかで負荷した。双方の場合において、Ｌｍ−ＯＶＡはそうでなかったが、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡは樹立された腫瘍の退行を誘導した。例えば、Ｂ１６Ｆ０実験の最後（２５日）には、ナイーブ群およびＬｍ−Ｏｖａ群におけるすべてのマウスは死亡した。全てのＬｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡマウスは生きており、それらの５０％は腫瘍がなかった（図３Ｂ）。

【0412】

かくして、ΔＬＬＯとの融合蛋白質としての抗原遺伝子の発現は、抗原の免疫原性を増強させる。

【0413】

実施例２：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７処理はＴＣ−１特異的脾臓細胞増殖を誘導する。

【0414】

ｒＬｍ免疫化マウスからの脾臓細胞のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、ＴＣ−１特異的増殖応答で、Ｌｍ−Ｅ７によるＴ細胞の誘導を測定するために、抗原特異的免疫適格性の尺度を評価した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫化マウスからの脾臓細胞は、２０：１、４０：１、８０：１、および１６０：１の脾臓細胞：ＴＣ−１比率にて、Ｅ７の源としての照射されたＴＣ−１細胞に暴露された場合に増殖した（図４）。逆に、Ｌｍ−Ｅ７およびｒＬｍ対照免疫化マウスからの脾臓細胞はバックグラウンドレベルの増殖を呈したに過ぎなかった。

【0415】

実施例３：ＬＬＯへのＮＰの融合はその免疫原性を増強させる。

【0416】

材料および実験方法

【0417】

インフルエンザ核蛋白質（ＮＰ）が抗原としてのＥ７を置き換えた以外は、図１に示したようにＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰを調製した。３２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに５×１０^５ＲＥＮＣＡ−ＮＰ腫瘍細胞を接種した。ＲＥＮＣＡ−ＮＰは（ここで引用して援用する米国特許第５，８３０，７０２号に記載された）インフルエンザ核蛋白質ＮＰでレトロウイルスにより形質導入された腎臓細胞癌腫である。可触巨視的腫瘍が１０日に成長した後に、各群における８匹の動物を０．１ＬＤ_５０の各リステリアベクターで腹腔内免疫化した。動物には１週間後に第二の免疫化を受けさせた。

【0418】

結果

【0419】

抗原にＬＬＯを融合させると、増強された免疫性が付与されるという発見の一般性を確認するために、（Ｌｍ−Ｅ７ベクターと同系であるが、インフルエンザ抗原を発現する）Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰおよびＬｍ−ＮＰを構築し、ベクターを腫瘍退行を誘導する能力について、陰性対照としての（発現された抗原を除いてＬｍ−ＮＰと同系の）Ｌｍ−Ｇａｇと比較した。図５に示すように、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰを受けたマウスの６／８は腫瘍がなかった。対照的に、各々、Ｌｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＮＰ群における１／８および２／８マウスのみが腫瘍がなかった。ナイーブ群における全てのマウスは大きな腫瘍を有しており、４０日までに死亡した。かくして、ＮＰおよびＬＬＯ−ＮＰ融合を発現するＬＬＯ株は免疫原性であった。同様な結果が、異なる免疫化プロトコルの下でＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７について達成された。さらに、たった１回の免疫化は５ｍｍ直径の樹立されたＴＣ−１のマウスを治癒することが示された。

【0420】

実施例４：ＬＬＯへの抗原の融合による免疫原性の増強はリステリアベクターを必要としない。

【0421】

材料および実験方法

【0422】

Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐの構築

【0423】

ワクシニアのＷＲ株を受容体として用い、融合遺伝子をリステリアのプラスミドから切り出し、ｐ７５プロモーターの制御下でｐＳＣ１１に挿入した。このベクターを選択したのは、それがワクシニア構築体Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７ＬａｍｐおよびＶａｃ−Ｅ７で用いる導入ベクターだからであり、従って、Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７との直接的比較を可能とするであろう。このように、全ての３つのワクシニア組換え体は同一の初期／後期化合物プロモーターｐ７．５の制御下で発現されるであろう。加えて、ＳＣ１１はＴＫ選択に対する組換えウイルスプラークの選択、およびベータ−ガラクトシダーゼスクリーニングを可能とする。図６は、これらの実験で用いる種々のワクシニア構築体を表す。Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐは、リソソーム結合膜蛋白質（ＬＡＭＰ−１）シグナル配列、およびＬＡＭＰ−１の細胞質テールからの配列の間で融合されたＥ７蛋白質を発現する組み換えワクシニアウイルスである。それは、ＭＨＣクラスＩＩ経路への抗原の標的化を容易とするように設計された。

【0424】

以下の修飾を施して、ワクシニアによる遺伝子産物の発現を可能とした：（ａ）ワクシニアによる初期転写を妨げるＴ５ＸＴ配列を、ＰＣＲによってＬＬＯ―Ｅ７の５´部分から除去した。（ｂ）さらなるＸｍａＩ制限部位をＰＣＲによって導入して、ＬＬＯ−Ｅ７のＳＣ１１への最終的挿入を可能とした。（ＬＬＯ−Ｅ７についてコードする元の配列の喪失なくしての）これらの変化の導入の成功は、スクリーニングによって確認された。得られたｐＳＣｌ １−Ｅ７構築体を用いて、野生型ワクシニア株ＷＲで感染されているＴＫ−ｖｅ細胞系ＣＶ１をトランスフェクトした。この共感染／トランスフェクションから得られた細胞溶解物は、３回プラーク精製したワクシニア組換え体を含有する。プラーク精製ワクシニアによるＬＬＯ−Ｅ７融合産物の発現は、ＬＬＯ蛋白質の配列に対して向けられた抗体を用いるウェスタンブロットによって確認した。加えて、ＬＬＯおよびＥ７に特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞を生じさせるＶａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７の能力を、各々、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ６マウスのＬＬＯ（９１−９９）およびＥ７（４９−５７）エピトープを用いて決定した。結果はクロム放出アッセイにおいて確認された。

【0425】

結果

【0426】

ＬＬＯへの抗原の融合による免疫原性の増強がリステリアベクターを必要とするか否かを決定するために、ＬＬＯ（ΔＬＬＯ）の非溶血性切形形態との融合蛋白質としてのＥ７を発現するワクシニアベクターを構築した。腫瘍拒絶実験は、実施例１に記載されたプロトコルに従ってＴＣ−１で行った。処理を開始する前に、２つの実験を異なる遅延を伴って行った。１つの実験においては、腫瘍が直径約３ｍｍとなった時に処理を開始した（図７）。７６日に関しては、Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７処理マウスの５０％は腫瘍がなく、他方、Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐマウスの２５％のみが腫瘍がなかった。他の実験において、ΔＬＬＯ抗原融合は、並列比較において、ＳＢＡＳ２または非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドと混合されたＥ７ペプチドよりも免疫原性であった。

【0427】

これらの結果は、（ａ）ΔＬＬＯ抗原融合はリステリアの関係のみならず、他の関係においても免疫原性であり；および（ｂ）ΔＬＬＯ抗原融合の免疫原性は他の認められたワクチンアプローチと好都合に比較されることを示す。

【0428】

実施例５：ＡｃｔＡ抗原およびＰＥＳＴ抗原融合は抗腫瘍免疫性を付与する

【0429】

材料および実験方法

【0430】

Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉの構築（図８Ａ）

【0431】

Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それがプロモーターおよびｈｌｙ遺伝子のＰＥＳＴ配列、特にＬＬＯの最初の５０ＡＡを含有する以外はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を構築するためには、ＳＯＥ（重複延長による遺伝子スプライシング）ＰＣＲ技術を用いて、ｈｌｙプロモーターおよびＰＥＳＴ領域を全長Ｅ７遺伝子に融合した。Ｅ７遺伝子およびｈｌｙ−ＰＥＳＴ遺伝子断片を、ＬＬＯの最初の４４１ＡＡを含有するプラスミドｐＧＧ−５５から増幅し、慣用的なＰＣＲ技術によって一緒にスプライシングした。最終のプラスミドｐＶＳ１６．５を作り出すために、ｈｌｙ−ＰＥＳＴ−Ｅ７断片およびｐｒｆＡ遺伝子を、イン・ビトロでの選択のためのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドｐＡＭ４０１にサブクローンし、得られたサブクラスを用いてＸＦＬ−７を形質転換した。

【0432】

Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７は、それがＰＥＳＴ配列を欠如する以外は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である組換えリステリア株である。それは、ＰＥＳＴ含有領域（ｂｐ３３３−３８７）をｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子から除去するために設計されたプライマーを用いてエピソーム発現系を構築した以外は、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７について実質的に記載されたように作成した。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ＰＥＳＴ領域またはＬＬＯなくしてＥ７を分泌する組換え株である。この株を形質転換するのに用いるプラスミドは、ｈｌｙプロモーターの遺伝子断片、およびＥ７遺伝子に融合したシグナル配列を含有する。この構築体は、染色体に組み込まれたＥ７遺伝子の単一コピーを発現する元来のＬｍ−Ｅ７とは異なる。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、発現されたＥ７抗原の形態を除いては、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７と完全に同系である。

【0433】

Ｌｍ−ａｃｔＡ−Ｅ７の構築

【0434】

Ｌｍ−ａｃｔＡ−Ｅ７は、ａｃｔＡ蛋白質の切形されたバージョンに融合したＥ７蛋白質を発現するプラスミドを含むＬＭの組換え株である。Ｌｍ−ａｃｔＡ−Ｅ７は、ｐＤＰ−２０２８を修飾することによって構築されたプラスミドベクターｐＤＤ−１をＬＭに導入することによって生じさせた。ｐＤＤ−１は、ａｃｔＡ−Ｅ７の発現および分泌を駆動する、３１０ｂｐ ｈｌｙプロモーターおよびｈｌｙシグナル配列（ｓｓ）；４つのＰＥＳＴ配列を含む１１７０ｂｐのａｃｔＡ遺伝子（配列番号：１６）（切形されたＡｃｔＡポリペプチドは分子の最初の３９０ＡＡよりなる、配列番号：１５）；３００ｂｐ ＨＰＶ Ｅ７＊遺伝子；１０１９ ｂｐ ｐｒｆＡ＊遺伝子（病原性病原性遺伝子の制御発現）；および形質転換された細菌クローンの選択のためのＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）のコピーを発現する発現カセットを含む（図８Ｂ）。

【0435】

ｈｌｙプロモーター（ｐＨｌｙ）および遺伝子断片は、プライマー５´−ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３´（ＸｂａＩ部位に下線を施す；配列番号：４６）および５´−ＡＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＧＣ−３´（ＮｏｔＩ部位に下線を施す；最初の１８ヌクレオチドはＡｃｔＡ遺伝子重複であり；配列番号：４７）を用いてｐＧＧ−５５（実施例１）からＰＣＲ増幅させた。ａｃｔＡ遺伝子は、プライマー５´−ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴ−３´（ＮｏｔＩ部位に下線を施す；配列番号：４８）およびプライマー５´−ＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧＧＣＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣ−３´（ＸｈｏＩ部位に下線を施す；配列番号：４９）を用いてＬＭ １０４０３ｓ野生型ゲノムからＰＣＲ増幅した。Ｅ７遺伝子はプライマー５´−ＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡ−３´（ＸｈｏＩ部位に下線を施す；配列番号：５０）およびプライマー５´−ＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３´（ＸｍａＩ部位に下線を施す；配列番号：５１）を用いてｐＧＧ５５（ｐＬＬＯ−Ｅ７）からＰＣＲ増幅した。ｐｒｆＡ遺伝子は、プライマー５´−ＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３´（ＸｍａＩ部位に下線を施す；配列番号：５２およびプライマー５´−ＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３´（ＳａｌＩ部位に下線を施す；配列番号：５３）を用いてＬＭ １０４０３ｓ野生型ゲノムからＰＣＲ増幅した。ｈｌｙプロモーターをａｃｔＡ遺伝子（ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ）に融合し、ＰＣＲ生成し、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：４６）および下流ａｃｔＡプライマー（配列番号：４９）を用いて精製されたｐＨｌｙ ＤＮＡおよび精製されたａｃｔＡ ＤＮＡから増幅した。

【0436】

ｐｒｆＡ遺伝子（Ｅ７−ｐｒｆＡ）に融合したＥ７遺伝子をＰＣＲ生成させ、上流Ｅ７プライマー（配列番号：５０）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：５３）を用いて精製されたＥ７ ＤＮＡおよび精製されたｐｒｆＡ ＤＮＡから増幅した。

【0437】

Ｅ７−ｐｒｆＡ融合産物に融合されたｐＨｌｙ−ａｃｔＡ融合産物をＰＣＲ生成させ、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：４６）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：５３）を用いて、精製された融合ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ ＤＮＡ産物およびＥ７−ｐｒｆＡ ＤＮＡ産物から増幅させ、ｐＣＲＩＩ（Invitrogen,La Jolla,Calif.）に連結させた。適格Ｅ．ｃｏｌｉ（ＴＯＰ１０´Ｆ，Invitrogen,La Jolla,Calif.）をｐＣＲＩＩ−ＡｃｔＡＥ７で形質転換した。溶解および単離の後に、ＢａｍＨＩ（予測される断片サイズ７７０ｂｐおよび６４００ｂｐ（またはインサートがベクターに戻される場合：２５００ｂｐおよび４１００ｂｐ））およびＢｓｔＸＩ（予測される断片サイズ２８００ｂｐおよび３９００ｂｐ）を用いる制限分析によってプラスミドをスクリーニングし、また、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：４６）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：５３）を用いるＰＣＲ分析でスクリーニングした。

【0438】

ｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−ＰｒｆＡ ＤＮＡインサートを、ＸｂａＩおよびＳａｌＩでの二重消化によってｐＣＲＩＩから切り出し、やはりＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化したｐＤＰ−２０２８に連結した。発現系ｐＡｃｔＡＥ７でＴＯＰ１０´ＦコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Invitrogen,La Jolla,Calif.）を形質転換した後に、クロラムフェニコール耐性クローンを、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：４６）および下流ＰｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：５３）を用いてＰＣＲ分析によってスクリーニングした。ｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を運ぶクローンを、２０ｍｃｇ（マイクログラム）／ｍｌ（ミリリットル）クロラムフェニコール（Difco,Detroit,MI）を含むブレインハートインフージョン培地中で成長させ、ミニプレップＤＮＡ精製システムキット（Promega,Madison,Wis.）を用い、ｐＡｃｔＡＥ７を細菌細胞から単離した。ペニシリン処理リステリア株ＸＦＬ−７をｐＡｃｔＡＥ７で形質転換し、クローンをイン・ビボにてプラスミドの保持について選択した。クローンを、３７℃にて、クロラムフェニコール（２０ｍｃｇ／ｍｌ）を含むブレインハートインフージョン中で成長させた。細菌を−８０℃にて少量ずつ凍結させた。

【0439】

結果

【0440】

Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７対Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によって誘導された抗腫瘍免疫性を比較するために、２×１０^５ＴＣ−１腫瘍細胞をマウスに皮下移植し、可触サイズ（ほぼ５ミリメートル［ｍｍ］）まで成長させた。７および１４日に、マウスをＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（５×１０^８ＣＦＵ）（十字）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０^８ＣＦＵ）（四角）またはＬｍ−Ｅ７（１０^６ＣＦＵ）（丸）いずれかの１つのＬＤ_５０でマウスを腹腔内免疫化した。２６日までに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７における動物の全ては腫瘍がなく、かつそのままであり、他方、ナイーブ動物（三角）およびＬｍ−Ｅ７で免疫化した動物の全てはより大きな腫瘍を成長させた（図９）。かくして、ＡｃｔＡ−Ｅ７融合でのワクチン接種は腫瘍退行を引き起こす。

【0441】

加えて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを、Ｅ７発現腫瘍の退行を引き起こすその能力について比較した。皮下ＴＣ−１腫瘍は４０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹で樹立された。腫瘍が４ないし５ｍｍに到達した後、マウスを８匹のマウスの５群に分割した。各群を４つの組換えＬＭワクチンの１つで処理し、１つの群は未処理のまま放置した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、各々、５／８および３／８の場合に樹立された腫瘍の退行を誘導した。いずれの時点においても、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で処理したマウスの平均腫瘍サイズの間に統計学的差はなかった。しかしながら、ＰＥＳＴ配列、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを含まないＥ７を発現したワクチンは、１つを除いて全てのマウスにおいて腫瘍退行を引き起こさなかった（図８Ｃ）。これは２つの実験の代表であり、そこでは、２８日における平均腫瘍サイズの統計学的に有意な差がＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７で処理した腫瘍、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉまたはＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７の間で観察された（Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定；図８Ｄ）。加えて、テトラマー陽性脾臓細胞のパーセンテージの増大は、ＰＥＳＴ含有ワクチンで接種したマウスの脾臓における３つの実験にわたって再現性よく見られた（図８Ｅ）。かくして、ＰＥＳＴ−Ｅ７融合でのワクチン接種は腫瘍退行を引き起こす。

【0442】

実施例６：ＬＬＯ、ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ様配列へのＥ７の融合は抗原特異的免疫性を増強させ、腫瘍浸潤Ｅ７特異的ＣＤ８^＋細胞を生じさせる

【0443】

材料および実験方法

【0444】

リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｃｌの２×１０^５ＴＣ−１腫瘍細胞＋４００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.）を含む５００ｍｃｌ（マイクロリットル）のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に皮下移植した（ｎ＝３）。マウスを７、１４および２１日に腹腔内免疫化し、脾臓および腫瘍を２８日に収穫した。腫瘍ＭＡＴＲＩＧＥＬをマウスから取り出し、氷上で、２ミリリットル（ｍｌ）のＲＰ １０培地を含有するチューブ内で４℃にて一晩インキュベートした。腫瘍を鉗子でミンチし、２ｍｍのブロックに切断し、３ｍｌの酵素混合物（ＰＢＳ中の０．２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ−Ｐ、１ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ−１）と共に３７℃にて１時間インキュベートした。組織懸濁液を、ナイロンメッシュを通して濾過し、テトラマーおよびＩＦＮ−ガンマ染色のために、ＰＢＳ中の５％胎児ウシ血清＋０．０５％のＮａＮ_３で洗浄した。

【0445】

脾臓細胞および腫瘍細胞を、１０^７細胞／ｍのブレフェルジンＡの存在下で、１マイクロモル（ｍｃｍ）のＥ７ペプチドと共に５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５０ｍｃｌの抗マウスＦｃ受容体上清（２．４ Ｇ２）中で４℃にて１時間または一晩インキュベートした。細胞を表面分子ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌについて染色し、浸透させ、浸透キットＧｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ（登録商標）またはGolgi-Plug（登録商標）（Pharmingen,San Diego,Calif.）を用いて固定し、ＩＦＮ−ガンマについて染色した。５００，０００事象を２−レーザーフローサイトメーターＦＡＣＳカリブールを用いて獲得し、Cellquest Software（Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ）を用いて分析した。活性化された（ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞内のＩＦＮ−ガンマ分泌細胞のパーセンテージを計算した。

【0446】

テトラマー染色のために、Ｈ−２Ｄ^ｂテトラマーにフィコエリスリン（ＰＥ）共役Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ，配列番号：２４）に負荷し、室温で１時間染色し、抗アロフィコシアニン（ＡＰＣ）共役ＭＥＬ−１４（ＣＤ６２Ｌ）およびＦＩＴＣ−共役ＣＤ８□で４℃にて３０分間染色した。細胞を、脾臓および腫瘍におけるテトラマー^＋ＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ細胞を比較して分析した。

【0447】

結果

【0448】

抗原特異的免疫性を増強させるＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の能力を分析するために、マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０^７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０^６ＣＦＵ）またはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（２×１０^８ＣＦＵ）いずれかで免疫化し、あるいは未処理とした（ナイーブ）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７群からのマウスの腫瘍は、Ｌｍ−Ｅ７またはナイーブマウスにおけるよりも、より高いパーセンテージのＩＦＮ−ガンマ分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図１０Ａ）およびテトラマー特異的ＣＤ８^＋細胞（図１０Ｂ）を含有した。

【0449】

もう１つの実施態様において、腫瘍担持マウスにＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、またはＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを投与し、腫瘍内のＥ７特異的リンパ球のレベルを測定した。マウスを０．１ ＬＤ_５０の４つのワクチンで７および１４日に処理した。腫瘍を２１日に収穫し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８に対する抗体で、およびＥ７／Ｄｂテトラマーで染色した。腫瘍内のテトラマー陽性リンパ球のパーセンテージの増大が、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７でワクチン接種したマウスで見られた（図１１Ａ）。この結果は３つの実験にわたって再現性があった（図１１Ｂ）。

【0450】

かくして、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７、およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、腫瘍親潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞の誘導および腫瘍退行において各々有効である。

【0451】

実施例７：リステリア−ＬＬＯ−ＰＳＡ構築体の作成および確認

【0452】

材料および実験方法

【0453】

オリゴおよびｐＣＤＮＡ３．１はInvitrogen（Carlsbad,CA）から購入し、ＤＮＡ配列決定はGenewiz Inc（Plainfield,NJ）によって行った。ペプチドはEZbiolabs（Westfield,IN）によって合成された。フローサイトメトリー試薬はBecton Dickinson（ＢＤ）Biosciences（San Diego,CA）から購入した。細胞培養基および補足物はGibco/Invitrogenからのものであった。ＥＬＩＳｐｏｔ抗体 Mabtech AB（Cincinnati,OH）から購入した。他の試薬は、示しているのでなければ、Ｓｉｇｍａ（St.Louis,MO）からのものであった。ＰＳＡ／ワクシニアは、親切にも、National Cancer institute,Bethesda,MDのＳｃｈｌｏｍ博士によって提供された。
マウス、細胞系および培地

【0454】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスはJackson Laboratories（Bar Harbor,ME)から購入した。マウスはRutgers University,New Brunswick,NJのCook Campus動物施設に維持した。マウスについての実験は、Institutional Animal Care and Use Committee of Rutgers Universityによる規制に従って行った。全ての細胞系はＡＴＣＣ（Manassas,VA）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから由来するＴＲＡＭＰＣ−１（Transgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate（マウス前立腺のトランスジェニック腺癌））細胞系は従前に記載されている。細胞を、５μｇ／ｍｌのウシインスリン、１０ｎＭデヒドロイソアンドロステロン、５％胎児ウシ血清および５％Ｎｕ−Ｓｅｒｕｍ ＩＶを補足した、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムおよび４．５ｇ／Ｌグルコースを含有するように調整された４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むダルベッコ修飾イーグル培地中で成長させ、維持した。（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドからの）ＭＣ５７Ｇ繊維芽肉腫細胞を、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、ならびに１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％胎児ウシ血清を含有するように調整された２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびイーグルのＢＳＳを含むイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）中に維持した。ＥＬ４リンパ腫細胞を、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムおよび４．５ｇ／Ｌグルコース、１０％胎児ウシ血清を含有するように調整された、４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むダルベッコ修飾イーグル培地中で維持した。マウス細胞系であるＪ７７４Ａ．１を、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムおよび４．５ｇ／Ｌグルコース、１０％胎児ウシ血清を含有するように調整された、４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０培地中に維持した。完全なＲＰＭＩ（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地は、２ｍＭグルタミン，０．１ｍＭ非必須アミノ酸、ならびに１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％胎児ウシ血清を補足したＲＰＭＩ １６４０を含有した。

【0455】

ＰＳＡ／ｐＣＤＮＡ３．１ワクチンの構築

【0456】

そのシグナル配列を含めたＰＳＡの全オープンリーティングフレームを、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩ部位においてｐＣＤＮＡ３．１^（−）ベクターバックボーン（Invitrogen）にクローン化した。このプラスミドにおいて、ＰＳＡの発現はＣＭＶプロモーターの制御下にあり、２９３細胞系（ＡＴＣＣ）への一過的なトランスフェクションによって確認された。トランスフェクトされた細胞によるＰＳＡの分泌は、抗ＰＳＡ ＥＬＩＳＡキット（American Qualex,San Clemente,CA）を用いて培養された細胞の上澄中で確認された。プラスミドＧＭ−ＣＳＦ／ｐＣＤＮＡはUniversity of Pennsylvania,Philadelphia,PAのVonderheide博士からの親切な贈物であった。

【0457】

Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡワクチンの構築

【0458】

（その分泌シグナル配列を排除する）ヒトＰＳＡについてコードする遺伝子を、ｐｆｘポリメラーゼ、順方向オリゴ：ｇｔｇＣＴＣＧＡＧａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇ（配列番号：５８）および逆方向オリゴ：ｇａｔＡＣＴＡＧＴｔｔａｇｇｇｇｔｔｇｇｃｃａｃｇａｔｇｇ（配列番号：５９）を用いて増幅した。ｐＧＧ５５におけるＬＬＯへの融合としてのＰＳＡのフレームクローニングで用いた２つの制限部位ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩは大文字で示す。ＬＬＯ−ＰＳＡ融合蛋白質の翻訳を停止させるための停止コドンは逆方向オリゴにおいて下線を施す。増幅されたＰＳＡを、制限部位ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩの間にて、ＬＬＯのＮ末端における最初の４４１アミノ酸に対する融合蛋白質（ｐＡｄｖ３４，図１２）としての、ＬｍプラスミドｐＧＧ５５にクローン化した。得られたプラスミドを配列決定して、突然変異の不存在を確認した。プラスミドｐＡｄｖ３４を（ゲノムｐｒｆＡ遺伝子を欠如する）Ｌｍ株ＸＦＬ７にエレクトロポレーションし、それは、元来、ストレプトマイシン耐性株Ｌｍ１０４０３ｓに由来した。プラスミド（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）を含有するリステリアｅを、ブレインハートインフージョン（ＢＨＩ／Ｃｈｌ／Ｓ）プレート上でクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）および２５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを用いて選択した。クローンをＰＣＲによってスクリーニングして、ＰＳＡ遺伝子の存在を確認した。

【0459】

ＬＬＯ−ＰＳＡのサブクローニング

【0460】

その分泌シグナル配列を欠如する、切形されたＰＳＡオープンリーディングフレーム（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００１６４８）の最初の２４ＡＡを、プライマー：Ａｄｖ６０−ＰＳＡ（ＸｈｏＩ−ＡＴＧなし）Ｆ：ｇｔｇＣＴＣＧＡＧａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇ（配列番号：５８）およびＡｄｖ６１−ＰＳＡ（ＳｐｅＩ−Ｓｔｏｐ）Ｒ：ｇａｔＡＣＴＡＧＴｔｔａｇｇｇｇｔｔｇｇｃｃａｃｇａｔｇｇ（配列番号：５９）を用いて増幅し、ＬＬＯの最初の４４１アミノ酸とインフレームにてサブクローンした（図１２）。プラスミドバックボーンｐＧＧ５５（実施例１）もまた、リステリア病原性遺伝子ｐｒｆＡのコピー、およびグラム陽性およびグラム陰性細菌株双方においてクロラムフェニコール耐性とする２つのクロラムフェニコールアセチル−トランスフェラーゼ遺伝子のコピーを有する。ＬＬＯ−ＰＳＡのＡＡ配列は以下の通りである：

【0461】

ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＬＥＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＹＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：５４；ＰＳＡに下線を施す）。

【0462】

位置Ｎ２２１Ｙにおいて、このＰＳＡ、およびＮＭ＿００１６４８中の配列の間に１つのＡＡの差がある。ｐＧＧ５５−ＬＬＯ−ＰＳＡをリステリア・モノサイトゲネス ＸＦＬ−７にエレクトロポレーションした（実施例１）。

【0463】

細菌ワクチン株の成長および貯蔵

【0464】

組換えリステリア−ＰＳＡを、３７℃にて、シェーカーインキュベーター中で、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび２５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンの存在下で、動物産物がない培地（Modified Terrific Broth）中で成長させた。対数成長相を示す０．５の光学密度（ＯＤ_６００）に到達した後、細菌を遠心によって収集し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、２％グリセロールを含有するＰＢＳ中に再懸濁し、次いで、アリコットし、−８０℃で貯蔵した。１つのアリコットを１日のうちに解凍し、滴定して、細菌力価（コロニー形成単位／ｍｌ）を決定した。このようにして貯蔵したリステリアワクチンは１年まで安定である。次いで、これらのアリコットを解凍し、１×１０^７ＣＦＵ／用量で希釈し、以下のように、免疫原性実験で用いた。

【0465】

Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡの発現

【0466】

Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡコロニーを３７℃および２２５ｒｐｍにおいて、ＢＨＩ／Ｃｈｌ／Ｓブロス中で８時間成長させた。細菌を１０，０００ｇでの遠心によって５分間で培養基から分離し、上清を回収した。培養上清中の蛋白質を、４℃の１０％ｖ／ｖのトリ−クロロ酢酸の存在下で少なくとも１時間沈殿させ、４ないし２０％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。蛋白質をＰＶＤＦ膜に移した後に、ＬＬＯ−ＰＳＡ融合蛋白質を、ウサギポリクローナル抗ＬＬＯ（ハウスにおいて作成）または抗ＰＳＡ抗体（Sigma）いずれかでのイムノブロティングによって検出した。シグナルはWestern-Breeze発色性キット（Invitrogen）を用いて発色させた。
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡのイン・ビボ継代

【0467】

Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡをイン・ビボにて２回継代した。簡単に述べれば、１×１０^６ＣＦＵの用量のＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡを６ないし８週齢のマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。脾臓を注射から３日後に収穫し；単一細胞懸濁液を脾臓から調製し、ＢＨＩ／Ｃｈｌ／Ｓプレートで平板培養して、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ成長について選択した。第一の継代からのＬＬＯ−ＰＳＡ陽性コロニーを用い、この腫瘍をさらに１回反復した。２回のイン・ビボ継代後に回収されたＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡコロニーをＬＬＯ−ＰＳＡ分泌についてテストした。単一クローンを選択して、プラスミドＤＮＡ配列決定、腫瘍の実験および他の機能アッセイのために用いた。

【0468】

イン・ビボ病原性実験

【0469】

病原性実験を行って、マウスにおけるＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡの安全な用量を決定いた。４匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢）の２つの群に２つの異なる用量のＬｍ−ＰＳＡ：１×１０^８および５×１０^７ＣＦＵ／用量で腹腔内注射した。マウスを、接種から５日後まで疾患の兆候についてモニターした。
プラスミド配列決定

【0470】

Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡを、３７℃および２２５ｒｐｍにおいて、２００ｍｌのＢＨＩ／Ｃｈｌ／Ｓ中で一晩成長させた。細菌を、４℃の１０分間の１０，０００ｇにおける遠心によって培養ブロスから分離した。細菌ペレットをリゾチウム（２ｍｇ／ｍｌ）で３７℃にて３０分間処理して、細胞壁を破壊した。プラスミドｐＡｄｖ３４を、製造業者の指示に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋプラスミドミニプレップキット（Invitrogen）を用いて精製し、ジデオキシ鎖ターミネーター方法によって全部を配列決定した。

【0471】

結果

【0472】

切形されたＰＳＡ（カリクレイン関連ペプチダーゼ３）に融合された非溶血性ＬＬＯを発現するリステリア株を作成した。得られた組換えリステリア株はＬＬＯ−ＰＳＡについての予測されたサイズ（７５Ｋｄ）の蛋白質を分泌し、これは抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体双方によって検出され、これは、ＬＬＯ−ＰＳＡ蛋白質が発現され、分泌されたことを示す（図１３）。

【0473】

ＰＳＡを発現する組換えリステリア・モノサイトゲネスの作成。ヒトＰＳＡについてコードする遺伝子を、そのＮ末端において保存されたＰＥＳＴ配列を含有するＬＬＯの切形された非溶血性セグメントとの融合蛋白質としてクローン化した（図１２）。従前に記載されているプラスミドバックボーンｐＧＧ５５は、ゲノム病原性因子ｐｒｆＡが欠如している減弱化Ｌｍ株ＸＦＬ７によるエピソーム起源からのＬＬＯ融合蛋白質の発現および分泌を可能とする。ｐｒｆＡ遺伝子はＬｍのイン・ビボ生存に必要とされ、かくして、プラスミドに運ばれたコピーによって補充される。ＰＳＡシグナル配列を欠失させて、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡにおけるＬＬＯ分泌シグナル配列によって媒介される、ＬＬＯ−ＰＳＡ融合蛋白質の適切な分泌でのこの配列のいずれの介入も回避した。

【0474】

Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡはＬＬＯ−ＰＳＡ融合蛋白質を発現し、分泌できる。ＬｍからのＬＬＯ−ＰＳＡ融合蛋白質の発現および分泌を、細菌のイン・ビトロ成長後に細胞培養上澄においてテストした。本発明者らはＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡの４つのコロニーをテストし、全ては、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体双方で検出された融合蛋白質ＬＬＯ−ＰＳＡを分泌することができた（図１３）。この分泌は、マウスにおける２回のイン・ビボ継代後に単離された細菌において維持され（データは示さず）、これは、プラスミドはイン・ビボにて少なくとも３日間安定であって、保持されることを示唆する。安定性を確認するために、ｐＡｄｖ３４を継代されたＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡから抽出し、全部を配列決定した。本発明者らの参照プラスミドｐＧＧ５５およびヒトＰＳＡ遺伝子配列（ＮＣＢＩ：ＮＭ＿００１６４８）と比較して、２回のイン・ビボ継代後に、プラスミドバックボーンまたはＰＳＡ遺伝子において検出される突然変異はなかった。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡの安全な用量が動物実験で用いられるかを決定するために、この構築体の２つの用量を腹腔内注射（１×１０^８および５×１０^７ＣＦＵ／用量）によってマウスにおいてテストした。動物実験で用いた用量（１ｘ１０^７ＣＦＵ／マウス）を、免疫化されたマウスに対する有害効果を有することが観察された最低の用量の１／１０と定義した。

【0475】

Ｌｍ−ＰＳＡのイン・ビトロ安定性をテストするために、株を、修飾されたテリフィックブロス中で７連続日の間成長させ、継代した。この時点の後に、細菌はプラスミドを保持し、プラスミドはＰＳＡ遺伝子を含有し、プラスミドにおいて欠失または再編成はなく、プラスミドの安定性を示す（図２２）。

【0476】

Ｌｍ−ＰＳＡのイン・ビボ安定性をテストするために、株をマウスを通じて２回継代した。次いで、プラスミドをGenewiz（商標）によって配列決定し、次の配列を有することが判明した：

【0477】

ＡＡＴＴＣＣＧＧＡＴＧＡＧＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＣＧＧＧＣＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＴＡＡＡＧＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＣＴＴＧＴＧＣＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＣＧＧＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＴＡＡＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＡＴＡＧＧＴＡＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡＡＴＧＣＣＴＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＴＴＴＡＣＧＡＴＧＣＣＡＴＴＧＧＧＡＴＡＴＡＴＣＡＡＣＧＧＴＧＧＴＡＴＡＴＣＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴＡＧＣＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴＡＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＣＧＣＣＣＧＧＴＡＧＴＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＴＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＴＡＣＧＴＧＣＣＧＡＴＣＡＡＣＧＴＣＴＣＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＡＡＡＧＴＴＧＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＧＧＡＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＣＴＧＣＧＡＡＧＴＧＡＴＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＧＧＴＡＴＴＴＡＴＴＣＧＧＣＧＣＡＡＡＧＴＧＣＧＴＣＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＣＴＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＧＴＧＴＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴＡＣＴＧＡＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＣＣＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＴＡＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＣＴＡＴＧＴＴＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＡＡＧＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＡＡＴＡＴＧＴＧＡＴＡＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＡＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡＡＣＧＧＧＧＣＧＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴＡＣＴＴＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＴＧＡＧＡＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＡＡＧＣＡＴＣＡＣＧＡＡＡＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＡＡＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＴＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＣＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＣＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＴＣＣＡＣＧＣＣＴＧＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＡＧＧＣＡＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＴＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＡＡＡＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＴＴＧＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＴＴＡＧＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＴＧＣＧＣＣＧＧＴＴＡＡＧＧＣＴＡＡＡＣＴＧＡＡＡＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＴＧＧＴＧＡＣＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＡＧＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＧＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＡＣＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＡＴＴＡＡＴＣＡＧＡＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣＣＴＡＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＣＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＡＧＧＣＡＴＴＡＡＣＡＴＴＴＧＴＴＡＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＡＡＧＧＡＴＡＧＣＡＡＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＧＣＴＡＴＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＡＧＡＡＧＣＧＡＡＴＴＴＣＧＣＣＡＡＴＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＧＴＡＴＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＴＡＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＣＴＴＡＴＡＴＴＡＧＴＴＡＧＴＣＴＡＣＣＡＡＴＴＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧＴＡＴＡＴＡＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＴＡＧＴＡＴＡＣＣＡＣＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＧＴＴＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＡＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＴＴＧＴＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＴＣＧＡＧＣＣＴＡＡＣＣＴＡＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＣＴＣＧＴＡＡＡＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＴＡＡＡＡＣＧＴＧＡＴＴＣＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＧＣＡＴＴＧＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＡＴＧＡＣＴＡＡＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＡＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＡＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＣＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＡＡＡＴＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＧＣＴＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＣＧＧＣＧＣＡＡＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＣＴＡＴＡＡＣＧＴＧＡＡＴＧＴＴＡＡＴＧＡＡＣＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＡＣＴＡＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＧＣＡＡＧＣＧＣＴＴＧＧＡＧＴＧＡＡＴＧＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＴＡＴＣＴＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＧＣＣＧＴＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＡＡＣＴＡＡＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＣＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＡＡＧＣＧＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＣＴＣＡＧＧＴＧＡＴＧＴＡＧＡＡＣＴＡＡＣＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＡＡＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＡＧＣＣＧＴＡＡＴＴＴＡＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＣＧＧＡＧＡＣＴＴＡＣＧＣＧＡＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＴＡＣＴＴＴＴＡＡＴＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＣＣＡＴＴＧＣＴＴＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＴＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＡＣＴＣＡＧＡＡＴＡＴＡＴＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＴＴＡＡＣＡＴＣＧＡＴＣＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＣＧＴＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＧＡＴＣＴＣＧＡＧａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔｔａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃＴＡＡＡＣＴＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＡＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＣＴＡＴＡＴＧＴＡＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＴＴＡＧＣＧＴＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＡＣＡＡＴＴＧＴＴＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＴＡＡＡＡＡＡＣＧＡＴＴＧＧＧＧＧＡＴＧＡＧＡＣＡＴＧＡＡＣＧＣＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＣＴＡＡＣＧＧＧＡＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＡＴＴＴＴＣＣＴＡＴＡＴＧＡＴＧＧＴＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＧＡＧＴＡＴＴＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＡＣＡＡＴＡＣＴＡＣＡＡＡＧＧＧＧＣＴＴＴＣＧＴＴＡＴＡＡＴＧＴＣＴＧＧＣＴＴＴＡＴＴＧＡＴＡＣＡＧＡＡＡＣＡＴＣＧＧＴＴＧＧＣＴＡＴＴＡＴＡＡＴＴＴＡＧＡＡＧＴＣＡＴＴＡＧＣＧＡＧＣＡＧＧＣＴＡＣＣＧＣＡＴＡＣＧＴＴＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＡＣＧＡＡＣＴＡＡＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＣＧＣＡＣＴＴＴＴＴＣＴＡＴＧＴＴＴＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＣＣＴＡＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＴＣＧＡＴＴＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＴＴＴＧＣＧＧＴＣＡＡＣＴＴＴＴＡＡＴＣＣＴＧＡＣＣＴＡＴＧＴＧＴＡＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＣＴＧＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＡＧＴＧＧＣＡＴＣＧＣＡＣＡＴＡＧＣＴＣＡＧＣＴＧＴＴＡＧＣＡＧＡＡＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＴＣＧＴＧＴＡＴＡＡＡＡＡＴＴＣＡＴＧＣＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＧＴＧＡＴＴＡＴＣＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＴＧＣＣＣＣＴＡＡＡＴＴＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＣＡＴＧＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＣＡＧＴＡＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＴＡＣＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＣＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＣＴＴＡＣＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＣＣＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＡＧＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＣＣＡＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＡＴＧＡＣＴＡＴＣＧＴＣＧＣＣＧＣＡＣＴＴＡＴＧＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＡＴＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＡＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＧＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＡＣＣＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＴＧＣＧＧＴＡＴＴＣＧＧＡＡＴＣＴＴＧＣＡＣＧＣＣＣＴＣＧＣＴＣＡＡＧＣＣＴＴＣＧＴＣＡＣＴＧＧＴＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＴＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＡＴＴＡＴＣＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＣＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＣＧＡＣＧＣＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＴＡＴＧＡ
ＴＴＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＧＧＧＡＴＧＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＧＣＴＧＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧＡＣＧＡＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＣＧＣＴＣＧＣＧＧＣＴＣＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＡＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＡＴＣＧＴＣＡＣＧＧＣＧＡＴＴＴＡＴＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＧＡＧＣＡＣＡＴＧＧＡＡＣＧＧＧＴＴＧＧＣＡＴＧＧＡＴＴＧＴＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＣＴＡＴＡＣＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣＧＴＣＧＣＧＧＴＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＣＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＴＧＣＧＧＡＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＴＧＣＧＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＣＧＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＧＣＧＣＡＴＣＴＣＧＧＣＴＴＴＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＴＴＡＴＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＣＧＣＣＧＡＡＣＧＴＴＴＡＧＡＡＧＧＴＡＴＣＧＡＧＣＡＡＧＡＴＡＴＡＡＣＧＴＧＡＣＡＧＴＣＧＡＴＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＡＡＡＧＡＧＧＧＡＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＧＴＡＣＧＧＴＴＡＴＴＴＴＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴＴＡＧＣＣＴＡＣＧＣＡＡＧＴＧＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＣＧＧＴＴＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＣＣＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＡＡＣＧＴＴＴＡＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＣＡＴＴＴＡＧＴＧＧＡＡＴＴＡＧＣＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＴＴＡＴＧＡＣＧＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＴＡＣＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＡＡＡＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＧＴＴＧＣＡＧＡＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＡＴＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＧＣＡＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＧＧＴＣＧＡＴＴＡＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＣＴＴＴＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＧＧＡＴＣＡＡＴＡＧＣＴＴＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＴＡＡＴＣＣＧＡＡＧＣＧＧＴＴＴＴＣＡＡＡＡＴＴＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＴＴＡＣＴＡＴＣＣＣＴＴＴＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＡＴＴＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＣＧＣＡＡＧＣＣＣＴＴＴＧＴＡＴＡＣＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＴＡＣＡＡＧＧＴＡＣＡＴＴＴＴＣＡＣＴＡＧＧＡＣＧＴＧＴＴＣＡＡＡＣＧＣＣＣＡＣＣＴＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＴＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＣＣＡＡＧＧＧＴＣＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＧＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＣＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＣＡＡＧＣＴＡＡＡＡＴＡＧＧＣＡＡＴＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＴＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＴＡＧＴＣＣＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＧＴＡＧＴＴＴＧＣＡＡＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＴＴＴＡＴＡＡＡＧＣＧＡＣＡＧＣＧＡＧＣＣＡＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＴＡＡＴＧＴＡＡＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＴＣＡＡＧＧＴＡＴＡＣＡＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧＣＡＣＡＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＧＣＧＣＡＣＴＴＡＴＡＣＡＴＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＴＧＴＡＡＣＧＴＧＣＴＡＡＧＴＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＧＧＣＧＣＡＣＴＴＡＴＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＣＡＡＴＣＴＴＧＴＡＴＡＴＴＴＣＴＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＡＡＴＴＴＴＧＡＣＡＧＧＧＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＡＴＡＡＡＧＡＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＣＴＣＴＴＴＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＧＣＴＡＧＴＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＧＧＴＧＣＡＴＣＴＴＣＣＡＡＧＴＡＡＡＧＴＡＴＡＡＣＡＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＡＴＴＴＡＣＴＡＣＧＴＴＴＣＡＴＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＧＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＣＧＡＧＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＴＡＡＡＴＣＡＧＴＣＣＡＴＡＡＧＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＧＴＧＧＴＴＧＴＴＡＴＡＣＧＴＴＣＡＴＡＡＡＴＴＴＴＡＴＧＡＴＣＡＣＴＴＡＣＧＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＴＣＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＣＣＣＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＡＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＡＣＣＴＡＴＣＧＴＡＡＴＡＡＴＡＧＧＣＡＡＴＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧＴＴＡＣＣＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＣＴＡＡＡＡＴＣＡＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＴＣＡＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＡＴＧＧＴＧＴＴＴＴＣＡＧＧＴＡＴＣＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＡＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＡＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＡＧＣＡＡＧＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＴＣＣＡＡＡＴＧＴＴＡＧＴＡＡＡＴＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴＧＣＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣＴＧＴＡＴＡＣＡＡＡＧＧＡＴＴＴＡＡＣＴＴＡＴＣＣＣＡＡＴＡＡＣＣＴＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＡＴＴＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＡＡＡＣＡＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＣＡＡＣＴＴＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＧＡＴＡＡＡＴＴＴＣＡＴＡＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＧＴＡＡＴＧＣＴＡＴＡＡＧＴＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＡＧＴＧＴＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＧＴＣＡＴＡＴＡＴＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＴＣＣＴＣＴＧＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＡＴＧＴＣＡＣＣＴＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＴＡＴＡＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＴＡＣＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＴＣＡＣＧＴＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＴＴＧＴＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＣＴＴＴＴＡＡＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＡＴＴＡＡＴＴＣＣＧＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＴＣＴＡＡＴＣＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＡＧＴＣＴＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＧＣＡＡＣＡＡＡＧＴＡＴＡＡＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＴＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＣＡＧＴＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＡＴＣＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＴＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＡＣＧＣＣＡＴＡＡＡＴＧＴＴＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＴＡＴＣＴＴＴＡＣＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＡＡＴＣＴＡＴＣＡＣＴＡＴＣＡＣＧＧＡＣＡＣＣＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＣＴＴＧＣＣＡＴＴＡＣＧＡＣＣＡＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＧＣＴＴＴＡＴＣＡＧＴＣＡＴＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＣＴＡＡＧＴＣＴＡＡＴＣＴＴＧＴＡＡＡＡＣＣＧＴＣＡＴＣＴＴＣＣＡＴＧＴＡＧＴＣＧＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＡＣＣＡＡＡＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＴＣＡＡＣＡＣＧＣＡＴＡＴＴＡＣＧＴＣＴＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＴＡＴＴＣＧＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＡＡＡＣＴＴＴＧＴＴＴＧＡＡＧＴＡＴＡＴＣＣＣＡＡＡＧＴＣＧＴＡＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣＴＡＣＡＣＴＣＡＴＡＡＡＧＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＡＧＴＴＴＴＧＴＴＣＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＡＡＣＴＴＡＡＴＧＣＧＧＧＴＴＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＡＧＴＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＡＡＣＣＧＧＣＴＡＴＴＡＣＴＴＡＡＣＣＧＧＣＴＡＴＴＡＧＡＧＡＣＧＧＡＡＣＴＡＡＣＴＣＡＡＣＧＣＴＡＧＴＡＧＴＧＧＡＴＴＴＡＡＴＣＣＣＡＡＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＡＡＧＴＡＡＣＡＴＴＧＧＡＧＴＴＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＧＡＡＴＡＡＴＧＣＡＣＧＡＡＡＴＣＡＴＴＧＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＴＡＴＡＣＴＡＧＡＴＡＴＡＡＣＧＡＡＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＧＡＣＣＡＧＴＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴＡＡＣＴＧＣＧＡＧＣＣＴＴＡＡＴＴＧＡＴＴＡＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＡＴＴＡＡＡＧＡＡＧＴＣＧＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡＴＴＴＧＧＴＡＡＡＧＴＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＴＴＴＡＴＴＡＡＴＣＡＧＡＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＣＴＧＴＡＡＡＣＣＣＡＴＴＡＴＡＴＣＧＧＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＡＡＴＣＡＡＴＴＡＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＡＣＴＴＴＧＡＴＣＧＴＡＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＣＧＴＡＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＡＴＴＣＧＣＴＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＣＡＡＧＣＣＡＧＧＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＧＧＧＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＣＧＴＡＴＣＧＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＧＡＴＴＧＧＣＧＧＡＣＧＴＧＧＣＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＣＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＴＡＣＧＣＡＴＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＴＧＧＴＡＣＧＴＡＴＧＣＡＧＡＣＧＡＡＡＡＣＣＧＴＴＣＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＧＧＡＣＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＡＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＡＴＡＣＣＴＴＣＴＴＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＣＡＣＡＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＧＣＡＡＧＣＧＡＴＡＴＴＴＴＡＡＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＴＧＡＴＴＴＡＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＣＧＴＴＡＡＴＴＡＴＣＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＡＡＧＧＴＴＡＴＣＡＡＧＣＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧＡＡＡＣＧＣＣＡＧＴＣＴＡＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡＡＡＴＣＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＣＧＣＡＡＡＡＴＡＴＣＣＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＧＧＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＴＡＡＣＧＴＧＣＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧＧＧＡＴＴＧＣＴＣＧＴＡＴＡＣＣＡＡＧＡＡＣＧＧＡＣＡＡＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＣＧＴＴＡＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＡＴＴＧＧＴＣＴＴＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＡＡＴＡＡＧＧＧＣＴＴＴＡＣＴＣＧＴＴＣＡＡＧＴＣＴＡＡＣＧＧＴＴＴＴＡＡＧＣＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＴＴＡＡＴＣＴＣＴＴ
ＡＴＴＧＣＡＣＧＡＡＡＣＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴＴＡＧＴＡＧＧＧＣＧＣＡＡＴＡＧＣＧＴＴＡＴＧＴＴＴＡＣＣＣＴＣＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＡＣＴＴＴＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＡＴＴＣＡＡＴＣＧＡＡＡＣＧＴＧＣＧＡＡＴＡＴＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＡＴＡＡＴＣＧＡＴＴＡＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＣＡＡＡＡＴＴＧＴＴＡＧＡＡＧＴＧＣＣＴＡＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴＡＡＴＡＧＧＧＡＡＴＡＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＡＴＣＡＡＧＴＧＡＴＴＴＡＡＣＣＡＧＴＡＡＡＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＡＧＧＧＴＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＣＧＴＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＴＡＡＴＧＧＣＴＴＡＴＡＴＴＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＡＴＧＴＡＴＡＣＡＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＡＧＣＧＡＣＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＴＴＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＡＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧＡＡＣＧＧＡＣＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＴＴＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＴＴＣＡＡＣＴＴＧＣＴＡＧＴＧＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＣＧＡＴＣＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＡＧＣＴＡＴＡＴＡＡＡＧＧＣＧＣＴＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＴＴＴＡＡＴＴＴＡＧＡＡＣＧＴＡＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＣＣＣＣＡＡＡＡＣＧＧＡＣＣＣＡＣＡＡＣＴＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＣＴＡＣＧＡＴＡＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＣＣＧＣＡＣＴＡＴＧＣＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＡＴＡＴＣＴＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＧＴＡＡＧＡＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＴＡＧＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＴＡＧＣＣＣＧＡＡＡＡＣＴＴＴＴＡＧＴＴＧＧＣＴＴＧＧＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＧＴＣＧＡＧＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＡＧＣＧＡＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＡＡＧＴＴＧＣＴＡＴＣＡＴＴＴＡＴＡＧＧＴＣＡＡＴＡＧＡＧＴＡＴＡＣＣＴＡＴＴＴＧＴＣＣＴＡＡＴＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＣＡＧＴＡＴＡＡＴＴＧＡＣＴＴＧＧＴＧＡＡＴＡＧＧＴＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＣＡＴＡＡＴＡＧＧＡＧＧＡＧＴＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＡＧＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＴＧＡＣＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＧＣＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴＡＴＣＧＣＴＴＡＣＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＣＣＧＡＧＡＧＡＡＴＴＴＴＡＧＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＡＡＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＴＴＧＧＴＴＡＴＧＣＡＣＧＴＧＴＣＡＧＴＡＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＧＡＴＣＧＧＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＣＧＴＴＡＣＡＧＧＧＣＧＴＴＴＣＴＡＡＧＧＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＴＴＡＡＧＣＧＧＴＣＡＡＴＣＧＧＴＣＧＡＡＣＧＣＣＣＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＣＴＡＴＧＣＴＴＡＡＣＴＡＴＡＴＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＴＴＡＧＡＴＣＧＡＴＴＡＧＧＡＣＧＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＡＡＣＡＧＡＡＴＴＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＡＡＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＴＡＡＡＴＴＴＡＣＣＣＴＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＴＴＡＡＧＧＣＧＴＴＴＧＡＴＴＡＡＴＡＧＣＣＴＴＧＴＣＡＴＴＧＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＧＧＡＡＣＧＴＣＡＧＧＣＡＣＡＡＧＧＡＡＴＣＧＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＴＣＣＡＣＧＴＴＴＡＡＡＧＴＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＧＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＴＴＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＣＴＡＧＧＣＴＧＧＣＧＧＧＧＴＴＧＣＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＧＡＡＴＧＡＡＴＣＡＣＣＧＡＴＡＣＧＣＧＡＧＣＧＡＡＣＧＴＧＡＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＴＧＧＴＣＴＴＣＧＧＴＴＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＧＴＡＡＡＧＴＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＣＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＡＡＣＣＡＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＣＡＡＣＧＣＣＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＴＣＡＴＴＴＣＴＴＡＴＴＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＣＡＧＴＣＣＧＣＡＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＡＴＧＡＣＴＡＴＣＧＴＣＧＣＣＧＣＡＣＴＴＡＴＧＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＡＴＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＡＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＧＧＣＡＧＣＧＣＣＣＡＡＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＧＣＣＡＣＧＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＡＣＣＣＡＣＧＣＣＧＡＡＡＣＡＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＡＴＧＴＴＣＣＧＧＡＴＣＴＧＣＡＴＣＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＴＴＡＡＣＧＡＡＧＣＧＣＴＡＡＣＣＧＴＴＴＴＴＡＴＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＡＴＡＡＡＴＧＡＴＣＡＴＡＴＣＧＴＣＡＡＴＴＡＴＴＡＣＣＴＣＣＡＣＧＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＴＧＧＣＣＴＣＡＧＧＣＡＴＴＴＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣＡＣＡＣＴＧＣＴＴＣＣＧＧＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡＡＣＣＡＧＣＡＡＴＡＧＡＣＡＴＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＡＡＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＧＧＧＴＣＧＡＡＴＴＴＧＣＴＴＴＣＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＡＴＴＣＡＧＧＣＧＴＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＴＡＡＣＴＧＣＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＡＣＴＧＴＴＧＴＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＣＴＧＣＣＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＡＣＡＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＡＡＴＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＴＣＧＣＣＴＴＧＣＧＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＧＣＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＧＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＣＡＴＡＴＴＧＧＣＣＡＣＧＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＧＡＣＧＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＴＣＴＣＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＴＴＡＧＧＧＡＡＡＴＡＧＧＣＣＡＧＧＴＴＴＴＣＡＣＣＧＴＡＡＣＡＣＧＣＣＡＣＡＴＣＴＴＧＣＧＡＡＴＡＴＡＴＧＴＧＴＡＧＡＡＡＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＣＧＴＣＧＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＡＴＧＡＡＡＡＣＧＴＴＴＣＡＧＴＴＴＧＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＣＡＣＴＡＴＣＣＣＡＴＡＴＣＡＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＧ（配列番号：５５）。該配列は、ｐＧＧ５５にクローン化されたＰＳＡの正確に予測された配列にマッチする。ＬＬＯ−ＰＳＡオープンリーディングフレームに下線を施し、より低い場合の文字はＰＳＡ単独の配列を示す。

【0478】

実施例８：リステリア−ＬＬＯ−ＰＳＡ構築体は抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し、腫瘍保護を提供する−Ｉ

【0479】

材料および実験方法

【0480】

ＣＴＬアッセイ

【0481】

雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ５０のＬｍ−ＰＳＡまたは０．１ＬＤ５０のＬｍ−ＨＰＶ１６Ｅ７Ｅ６ＴＭのいずれかで腹腔内免疫化し、２週間後に１回ブースター注射する。脾臓をブーストから６日後に収穫した。単離された脾臓細胞を調製し、フィーダーとしてのマイトマイシン処理ＰＳＡワクシニア感染ＭＣ５７Ｇ細胞で５日間刺激した。最初の実験において、以下のＥ：Ｔ比率２５：１、８：１、２．８：１、０．９：１、０．３：１、０．１：１および０．０３：１を用い、１００μＭのユーロピウム（Sigma）で標識した標的としてのＰＳＡ Ｈ２Ｄｂペプチド（１μＭ，ＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬ；配列番号：６０）でパルスしたＥＬ４細胞を用いてＣＴＬアッセイを行った。混合された標的およびエフェクターの４時間のインキュベーション後に、細胞を遠心によって培養上清から分離した。上清中の溶解した細胞からの放出されたユーロピウムを以下のように決定した：１０μｌの上清を１００μｌのユーロピウム増強溶液（Delfia）に加えた。Ｖｉｃｔｏｒ ＩＩ分光計（Perkin Elmer）を用い、吸光度を５９０ｎｍで読んだ。ユーロピウムの最大放出は、１％トリトンＸ−１００を含む標識標的細胞の上清から決定し、自然放出は、エフェクター細胞の不存在下においてインキュベートされた標的細胞から決定した。第二の実験において、Ｅ：Ｔ比率を２５：１に一定に保ち、ペプチド濃度を示されたように変化させた。パーセント特異的溶解は［（実験放出−自然放出）／（最大放出―自然放出）］×１００として計算した。

【0482】

サイトカイン分泌アッセイ

【0483】

雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＬｍ−ＰＳＡまたはウィルムス腫瘍抗原の異なる断片を発現するリステリアのいずれかで免疫化し（陰性対照）、あるいは免疫化しないまま放置した。マウスを２週間後に１回ブースター注射し、ブーストから６日後に脾臓を収穫した。単離された脾臓細胞を調製し、１μＭ ＰＳＡ Ｈ２Ｄｂペプチドの存在下でイン・ビトロにて一晩刺激した。単離された脾臓細胞によるＩＦＮ−γ分泌はＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。

【0484】

細胞培養、材料および試薬

【0485】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス前立腺腫瘍に由来するＴＲＡＭＰ−Ｃ１マウス前立腺腺癌はＡＴＣＣから購入した。細胞系はＰＳＡ発現について陰性である。細胞を、０．００５ｍｇ／ｍｌウシインスリンおよび１０ｎＭデヒドロイソアンドロステロン、９０％；胎児ウシ血清、５％；Ｎｕ血清ＩＶ，５％を補足した、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、および４．５ｇ／Ｌグルコースを含有するように調整された４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むダルベッコ修飾イーグル培地中に細胞を維持した。そのシグナル配列を含めた全長ヒトＰＳＡ蛋白質をコードする遺伝子をｐＵＶ６／ｖ５プラスミド（Invitrogen）にサブクローンした。正しい配列の確認後、プラスミドを線状化し、Lipofectamine 2000（商標）（Invitrogen）を用いてＴＲＡＭＰ−Ｃ１細胞にトランスフェクトした。陽性クローンを１０μｇ／ｍｌブラスチシジンの存在下で選択した。いくつかの安定に発現するＰＳＡクローンを単離し、ヒトＰＳＡの細胞培養基への分泌をテストした。

【0486】

皮下腫瘍接種

【0487】

ＰＳＡ発現ＴＲＡＭＰ−Ｃ１細胞の２つの異なるクローンを、２００ｍｃｌ用量当り５×１０^６細胞にて再懸濁した。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり８，６ないし８週齢）を左側脇腹に皮下接種した。

【0488】

腫瘍退行実験

【0489】

腫瘍接種から７日後に、マウスを０．１ＬＤ_５０のＬｍ−ＰＳＡ（１０^７ＣＦＵ）、０．１ＬＤ_５０のＬｍ−ＨＰＶ１６Ｅ７、またはＰＢＳいずれかで免疫化した。２つのブーストを腫瘍接種から１５および２５日後に投与する。腫瘍を９０日間モニターする。腫瘍のサイズを２つの垂直直径の平均として定義する。

【0490】

前立腺腫瘍細胞の同所性注射

【0491】

６週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２％イソフルランで麻酔する。滅菌場において、より低い中線切開を行って、前立腺にアクセスする。後ろ側前立腺の左側葉に、５０μｌ Hamiltonシリンジに契合させた２７ゲージ針を用い、ＰＢＳ中の単一細胞懸濁液からの１×１０^５ＴＲＡＭＰＣ−１／ＰＳＡ腫瘍を注射した。マウスを縫合し、縫合糸を外科的処置から１０日後に除去する。７日後に、マウスをＬｍ−ＰＳＡ、ＬｍＨＰＶ１６Ｅ７またはＰＢＳで静脈内免疫化する。マウスを異なる時点で犠牲にし、前立腺を外科的に摘出し、腫瘍成長の決定のために重量を測定する。

【0492】

腫瘍保護実験

【0493】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫化し、先の実施例に記載したように、Ｌｍ−ＰＳＡ、ＬｍＨＰＶ１６Ｅ７またはＰＢＳでブースター注射する。ブーストから７日後に、マウスに５×１０^６ＴＲＡＭＰＣ−１／ＰＳＡ腫瘍細胞を皮下注射する。腫瘍の成長は、キャリパーで９０日間測定することによってモニターする。

【0494】

前立腺癌転移の阻害

【0495】

同所性腫瘍インキュベーションのために８ないし１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Jackson labs）をイソフルランで麻酔する。包皮腺に対して頭側の下腹部皮膚切開を行い、精嚢を注意深く外部に取り出して、後−側前立腺を露出させる。２９ゲージインスリンシリンジを用い，ＰＢＳに懸濁させた５×１０^５ＴＲＡＭＰＣ−１／ＰＳＡ細胞を、２０□Ｌ容量にて後−側前立腺に注射する。精嚢および前立腺を１分間保持して、注射された細胞を該腺に沈降させ、次いで、腹腔に穏やかに再度入れる。体壁および閉じた皮膚創傷を、各々、５−０ＰＤＳおよび５−０ナイロンで閉じた。

【0496】

腫瘍を５０日間発達させる。一次腫瘍を剖検の間に取り出し、ホルマリン中で固定し、次いで、パラフィンに包埋させ、区分化し、Ｈ＆Ｅで染色する。?部領域からの拡大されたリンパ節を外科的顕微鏡観察下で可視化し、次いで、切開し、固定し、包埋し、前立腺癌細胞について組織学的に分析する。

【0497】

腫瘍免疫染色

【0498】

ホルマリン固定前立腺腫瘍細胞をパラフィン包埋し、区分化し、Plus slides（商標）（VWR Corp）に適用し、次いで、Ｄａｋｏ自動染色機システムを用いて染色する。スライドを３．０％過酸化水素で１０分間予備処理し、次いで、濯ぎ、プロテイナーゼＫ溶液の１０μｇ／ｍＬ溶液で３分間処理して、抗原の検索を高める。非特異的結合部位を正常なヤギ血清の添加によって３０分間ブロックし、次いで、ウサギ抗ヒトＰＳＡ抗体（Sigma）またはウサギ抗ヒト増殖細胞核抗原（ＡＢ１５４９７，ＡｂＣａｍ抗体）の１０μｇ／ｍＬ溶液を組織に３０分間適用する。一次抗体を洗浄によって除去し、適当な西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を３０分間適用し、８分のインキュベーションにおいて、ＮｏｖａＲｅｄ（商標）基質（Vector Labs,Burlingame,CA）を用いて検出する。スライドを染色の前にヘマトキシリンで逆染色する。

【0499】

一次およびリンパ節セクションのスライドからの細胞を、ヒトＰＳＡについて陽性または陰性としてスコア採りする。各スライドの４つの領域をランダムに選択し、各領域からの２０細胞をスコア採りする。腫瘍におけるＰＳＡ染色を同一マウスからのリンパ節転移と比較する。

【0500】

リステリア株

【0501】

リステリアワクチンを調製し、従前の実施例に記載したように貯蔵する。

【0502】

結果

【0503】

ＬＬＯ−ＰＳＡの免疫原性をテストするために、６ないし８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Jackson Laboratories）をＬｍ−ＰＳＡ（０．１ＬＤ_５０，１×１０^７ＣＦＵ／用量）、またはＬｍ−ＨＰＶ１６Ｅ７Ｅ６ＴＭ（陰性対照，０．１ＬＤ_５０、１×１０^６ＣＦＵ／用量）いずれかで腹腔内免疫化し、あるいは免疫化せずに放置した。ワクチン接種したマウスからの脾臓細胞を、ＣＴＬアッセイにおいてイン・ビトロでＰＳＡペプチド提示細胞を認識し、それを溶解する能力についてテストした。免疫化されたマウスからの脾臓細胞は、高い効率にてＰＳＡペプチドでパルスした腫瘍細胞を認識し、それを溶解することができた（図２０Ａ）。さらに、応答は、標的細胞によって提示された抗原の量に関して用量依存的であった（図２０Ｂ）。

【0504】

さらなるアッセイにおいて、マウスを、Ｌｍ−ＰＳＡ、またはＷｉｌｍ´ｓ腫瘍抗原の断片を発現する株で免疫化し（陰性対照）、サイトカイン分泌を、ＰＳＡペプチドとのインキュベーション応答させて、決定した。ワクチン接種したマウスからの脾臓細胞は高レベルのＩＦＮ−γ分泌を呈した（図１８）。

【0505】

かくして、ＰＳＡ発現ＬＭ株およびＬＬＯ−ＰＳＡ融合は、標的細胞溶解およびＩＦＮ−γ分泌が可能である抗原特異的ＣＴＬの誘導において効果的である。従って、ＰＳＡ発現ＬＭ株およびＬＬＯ−ＰＳＡ融合はＰＳＡ発現前立腺癌に対する治療および予防ワクチン接種において有効である。

【0506】

先の実施例に記載されたリステリアワクチンを、同所性前立腺癌腫動物モデルにおける腫瘍保護実験で用いる。マウスをＬｍ−ＰＳＡ、ＬｍＨＰＶ１６Ｅ７、またはＰＢＳいずれかで免疫化し、次いで、ＴＲＡＭＰＣ−１ Ｌｍ−ＰＳＡでの注射は、マウスを腫瘍形成から保護する。

【0507】

さらなる実験において、マウスを、まず、ＴＲＡＭＰＣ−１／ＰＳＡ前立腺癌細胞で注射し、４日後に、Ｌｍ−ＰＳＡ、ＬｍＨＰＶ１６Ｅ７、またはＰＢＳでワクチン接種し、同一ワクチンでブースター注射する。Ｌｍ−ＰＳＡは前立腺転移の成長を妨げる。

【0508】

かくして、ＰＳＡ生産ＬＭ株およびＬＬＯ−ＰＳＡ融合は腫瘍保護を誘導する。

【0509】

実施例９：リステリア−ＬＬＯ−ＰＳＡ構築体は抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し、腫瘍保護を提供する−ＩＩ

【0510】

材料および実験方法

【0511】

イン・ビトロマクロファージ侵入実験。マウスマクロファージ様Ｊ７７４Ａ．１細胞を２４ウェルプレートのウェル当たり１×１０^６にて平板培養した。後の日に、細胞を、抗生物質の不存在下で、異なるＬｍ株で１：１のＭＯＩで感染させた。細胞外細菌は、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する培地中で細胞を３７℃および５％ＣＯ_２にて３０分間洗浄し、インキュベートすることによって排除した。細胞内細菌成長は、異なる時点において８時間まで試料を採取し、引き続いて、ｄＨ_２Ｏで細胞を溶解した後にＢＨＩプレート上での細菌の滴定によってモニターした。

【0512】

抗腫瘍有効性。ＴＲＡＭＰＣ−１はＣ５７ＢＬ／６マウスバックグラウンドでのマウス腺癌前立腺腫瘍細胞系であり、これを用いて、ワクチンとしての、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡの効率をテストするためのＰＳＡ分泌前立腺腫瘍モデルを構築した。分子のＮ末端におけるその分泌シグナル配列を含めた、完全なヒトＰＳＡオープンリーティングフレームを、プラスミドｐＵＢ６／Ｖ５（Invitrogen）中のＵｂＣプロモーターの制御下でクローン化した。得られたプラスミド（ｐＡｄｖ６３）を、正しいＰＳＡ遺伝子配列の確認のために配列決定し、リポフェクトアミン２０００（Invitrogen）を用いてＴＲＡＭＰＣ−１細胞系にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、１０μｇ／ｍｌのブラスチシジン（Invitrogen）を含有する培地中で細胞を培養することによって選択した。単一クローンを限界希釈法によって単離し、抗ヒトＰＳＡ ＥＬＩＳＡキットを用い、ＰＳＡの細胞外培養基の分泌のためにスクリーニングした。いくつかの陽性クローンが得られ、拡大培養し、液体窒素中で貯蔵した。１つのクローン（Ｔ−ＰＳＡ２３）をさらなる実験のために選択した。

【0513】

腫瘍退行実験。８匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６ないし８週齢）の群を、５×１０^６Ｔ−ＰＳＡ２３細胞で右横腹に皮下接種した。７日後に、腫瘍が４ないし５ｍｍの平均直径に到達すると、それをＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（１×１０^７ＣＦＵ／用量）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０^８ＣＦＵ／用量）で腹腔内免疫化するか、または処理しなかった。Gunn et al.によって従前に記載されたＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡと同様に構築したが、ＰＳＡの代わりに、それはＨＰＶ１６Ｅ７を発現し、無関係なＬｍ対照としてこの実験で用いた。免疫化を１週間間隔で２回反復した。腫瘍を７週間毎週モニターした。全ての実験動物からの血液試料を、尾静脈からの腫瘍接種後４０日に収集し、血清中のＰＳＡ蛋白質の存在を、ＰＳＡ ＥＬＩＳＡキットを用いてテストした。比較実験のために、腫瘍細胞を前記したように注射したマウスをＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（２００μｌＰＢＳ中１×１０^７ＣＦＵｓ／用量）、組換えＰＳＡ−ワクシニア（２００μｌＰＢＳ中の１×１０^７ＰＦＵ／用量の腹腔内投与）または５０μｌ容量中のＰＳＡ／ｐＣＤＮＡ３．１（１００μｇ）とＧＭ−ＣＳＦ／ｐＣＤＮＡ３．１（１００μｇ）との混合物を含むｐＤＮＡワクチンのいずれかで、左大腿四頭筋中への筋肉内注射によって２回免疫化した。電子キャリパーを用いて腫瘍を１週間につき１回モニターし、腫瘍サイズを、２つの垂直直系の平均として発現した。

【0514】

マウスにおける免疫原性の実験

【0515】

ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ：４ないし５匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６ないし８週齢）の群を、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ、または陰性対照としての無関係抗原を含有する同様な構築体（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＷＴ１）で３回免疫化し、あるいは免疫化しなかった（ナイーブ）。ブーストから６日後に、脾臓を収穫し、単一細胞懸濁液に処理した。赤血球細胞をＡＣＫ溶解溶液との２分間のインキュベーション、続いての、Ｃ−ＲＰＭＩ培地での２回の洗浄によって溶解させた。単離された脾臓細胞を、マウスＩＦＮ−γ抗体（ｍＡｂ ＡＮ１８）で従前に被覆されたＥＬＩＳｐｏｔプレート上で、１μＭ ＰＳＡ_{６５−７４}ペプチド（Ｈ２Ｄ^ｂ?制限ＰＳＡエピトープＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬ）の存在下で２×１０^５細胞／ウェルで平板培養した。プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。製造業者の指示（Mabtech AB）に従って、スポット形成細胞（ＳＦＣ）を検出した。スポットは切開顕微鏡を用いてカウントした。

【0516】

ＩＦＮ−γについての細胞内染色。免疫化された、対照またはナイーブマウスから単離された脾臓細胞を、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＩ）およびモネンシンＡ（StopGolgi,BD Biosciences）の存在下で、１μＭのＰＳＡ_{６５−７４}ペプチドまたは対照ペプチドいずれかを含む丸底９６ウェルプレート中で、２×１０^６細胞／ウェルにて５時間刺激した。ペプチドを含まない培地中でインキュベートした細胞を陰性対照として用いた。インキュベーションの後、細胞を抗マウスＣＤ８−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５およびＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ抗体で染色した。引き続いて、細胞を浸透させ、抗マウスＩＦＮγ−ＰＥ抗体で染色し、FACS Calibur（BD Biosciences）サイトメーターで分析した。データはCellQuest Proソフトウェアを用いて分析した。細胞をＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗとしてゲートし、ＩＦＮ−γ陽性細胞の数を合計ゲート細胞のパーセンテージとして表した。

【0517】

細胞傷害性アッセイ。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡワクチン接種に応答してのＴ細胞の細胞傷害性活性をＰＳＡ特異的ＣＴＬアッセイによって測定した。４匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群を、１週間間隔で、３つの用量のＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（１×１０^７ＣＦＵ）または無関係抗原（ＨＰＶ１６Ｅ７Ｅ６）を発現するリステリアで腹腔内注射した。ナイーブ群はいずれの免疫化も受けなかった。免疫化されたおよびナイーブマウスの脾臓を最後のブーストから６日後に収穫した。脾臓細胞を、ＰＳＡ／ワクシニア（４時間のＭＯＩ５）で感染させたＭＣ５７Ｇ細胞の存在下で、２０Ｕ／ｍｌのマウスＩＬ−２（Sigma）を含有するＣ−ＲＰＭＩ培地中で５日間インキュベートし、１：２０のエフェクター：スティミュレーター比率にてマイトマイシンＣで処理した。細胞傷害性アッセイは、エフェクター細胞をＥＬ４標的細胞と共にインキュベートすることによって４時間行い、Ｈ２Ｄ^ｂ、ＰＳＡ_{６５−７４}ペプチドで１時間パルスし、ユーロピウムで標識した。溶解された細胞から放出されたユーロピウムは、細胞培養上澄の試料をユーロピウム増強溶液（Delfia/Perkin Elmer,Waltham,MA）と混合し、５９０ｎｍで吸光度を読む（Perkin Elmer/Wallac,VictorII）ことによって測定した。２つの組のアッセイを：ａ）１μＭの固定されたペプチド濃度にて、異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率を用い；およびｂ）２５：１の固定されたＥ：Ｔ比率のＰＳＡペプチドの異なる濃度を用いて行った。ＳＣ_５０値は、用いた最大ペプチド濃度の値（１μＭ）の５０％に必要なペプチドの濃度から０μＭにおけるバックグラウンドレベルを差し引いたものとして計算した。

【0518】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の分析：マトリゲルに包埋されたＴ−ＰＳＡ２３細胞を、７および１４日にＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ、対照Ｌｍワクチンで免疫化するか、あるいは未処理のまま放置した、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下接種した。２０日に、腫瘍を外科的に切り出し、氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、外科用メスでミンチした。腫瘍を、氷上で、マトリゲル細胞回収溶液（BD Biosciences）中で２時間インキュベートした。シリンジプランジを用い、細胞ストレーナ中の組織の機械的破壊によってＴＩＬをさらに放出させた。単離された細胞をＰＳＡ_{６５−７４}Ｈ−２Ｄ^ｂテトラマー−ＰＥおよび抗マウスＣＤ８−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５およびＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ抗体で染色して、ＰＳＡエピトープに対して特異的なＣＴＬを特徴付けた。腫瘍中の調節Ｔ細胞を分析するために、ＴＩＬをＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５およびＣＤ２５−ＡＰＣでも染色した。細胞を引き続いて透過させ、抗ＦｏｘＰ３−ＰＥ抗体（Milteny Biotec）で染色した。細胞をFACS Calibur（BD Biosciences）サイトメーター中で分析した。データはCellQuest Proソフトウェアを用いて分析した。調節Ｔ細胞はＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｐ３^＋細胞として定義した。

【0519】

統計学的分析：非パラメータMann-WhitneyおよびKruskal Wallisテストを適用して、異なる処理群の間で腫瘍のサイズを比較した。腫瘍のサイズは統計学的分析のために４０日に比較した。なぜならば、これは各群におけるマウスの最高数を伴う最も遅い時点だからであった。スチューデントｔ検定を用いて、ＥＬＩＳｐｏｔ実験において平均を比較した。０．０５未満のｐ値がこれらの分析において統計学的に有意と考えられた。

【0520】

結果

【0521】

Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡはイン・ビトロにてマクロファージに感染することができる。樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞による摂取は、Ｌｍベースのワクチンにとって、抗原を免疫系に首尾よく送達し、提示するための必須の要件である。この特性を、マウスマクロファージ様細胞系Ｊ７７４Ａ．１を感染させ、Ｌｍワクチン株が適切に細胞に進入し、増幅したことの指標である、細胞内細菌成長を定量することによってイン・ビトロによってテストすることができる。このアッセイにおいて、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡはマクロファージに侵入し、同様にして野生型Ｌｍ株１０４０３ｓまで成長することができることが示された。対照的に、ｐｒｆＡが欠如し、ファゴリソソームから逃避しないＬｍ株ＸＦＬ７は、Ｊ７７４Ａ．１細胞中で増殖できず、その力価は感染から数時間後に一定のままである（図１４）。プラスミドｐＡｄｖ３４でのＬｍ株ＸＦＬ７におけるｐｒｆＡの実施の結果、該株のイン・ビトロ侵入性特性が回復し、これは野生型株のそれと同程度であった。

【0522】

Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、マウスにおいて予め樹立されたＰＳＡ発現腫瘍の退行を引き起こす。ＰＳＡ発現腫瘍を退行させるにおけるＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡの効率は、ＰＳＡトランスフェクトＴＲＡＭＰＣ−１細胞系を用いてマウスモデルでテストした。元来、マウス前立腺腺癌腫瘍に由来するＴｒａｍｐＣ−１細胞を、ヒトユビキチンＣプロモーターの制御下でヒトＰＳＡ遺伝子で安定にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞によるＰＳＡの分泌はＥＬＩＳＡによって確認した。４つのクローンを拡大培養し、抗生物質選択マーカーであるブラスチシジンの不存在下で２５世代の間継代した。細胞培養上澄を、初期の継代および継代２５において細胞間でと同程度であることが示されたＰＳＡ分泌のレベルについてテストした（データは示さず）。これらのクローンの１つはイン・ビボにて腫瘍形成性を保持し、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける皮下接種に際して固体腫瘍を形成した。このクローンの初期の継代を腫瘍実験で用い、それをＴ−ＰＳＡ２３という。８匹のマウスの３つの群を５×１０^６Ｔ−ＰＳＡ２３細胞で皮下接種し、毎日腫瘍の成長についてモニターした。７日後に、直径が４ないし５ｍｍの固体腫瘍の塊が各群で８匹のうち７匹に検出された（図１５）。この時点において、マウスをＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（１×１０^７ＣＦＵ／マウス）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０^８ＣＦＵ／マウス）で免疫化するか、あるいは未処理のまま放置した。一次免疫化に続いて、プライムと同一の用量にて１週間間隔で２回ブースター用量を投与した。対照群の各々におけるマウス（８匹のうち７匹）は遅い成長腫瘍を発生し、これは接種から７週間以内に２ｃｍの直径に到達し（図１５）、その時点でそれを犠牲にした。各群において１匹のマウスはいずれの時点においてもいずれの腫瘍の兆候も示さなかった。最初の免疫化から５日後に、腫瘍の低下がＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化群の８匹のうち７匹で観察され、完全な腫瘍退行は１週間後にこれらのマウスのうち５匹で観察された。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化群における腫瘍の１つは、第三の免疫化まで安定なままであった。しかしながら、第三のワクチン接種から１週間後に、この腫瘍も退行し、検出不可能となった。この群におけるもう１つのマウスは遅い成長腫瘍を発生させ、これは７週間以内に１８ないし２０ｍｍのサイズに到達し、犠牲にした。腫瘍接種から８週間後の実験の最後において、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化群における８匹のマウスのうち７匹は依然として腫瘍がなかった。この実験を同様な結果を伴って２回反復した。非パラメータＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ統計学的分析を、ナイーブおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７群におけるマウスが犠牲とされる前に、４０日に腫瘍のサイズについて行った。ナイーブ群におけるマウス、およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫化したマウスの腫瘍のサイズの間に統計学的に有意な差はなかった（ｐ＝０．６１３）。しかしながら、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡでの免疫化は、Ｔ−ＰＳＡ２３腫瘍成長に対して有意なインパクトを与えることが示された（ｐ＝０．００２）。対照およびＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスからの血清試料を腫瘍負荷から４０日後に収集し、抗ヒトＰＳＡ ＥＬＩＳＡキット（American Qualex）を用いてＰＳＡの存在についてテストした。ＰＳＡの有意なレベル（５−１０ｎｇ／ｍｌ）が対照マウスの血清において、および腫瘍を有するＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ群におけるマウスで検出された。腫瘍退行後に、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの血清においてＰＳＡは見出されなかった。

【0523】

Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡは脾臓および腫瘍の双方においてＰＳＡに対して免疫性を有する。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ誘導ＰＳＡ特異的ＣＴＬでのワクチン接種が腫瘍に浸潤できるか否かを解明するために、マウスにＴ−ＰＳＡ２３細胞＋マトリゲルの混合物を皮下移植し、２つの用量のＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫化するか、または何もしなかった。脾臓および腫瘍を最後の免疫化から６日後に収穫し、ＦＡＣＳ分析によって、ＣＤ８^＋／ＰＳＡ_{６５−７４}（Ｈ２Ｄ^ｂ制限）テトラマー陽性Ｔ細胞の存在についてテストした。ナイーブ（０．０５％）またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（０．０９％）ワクチン接種マウスの脾臓において、有意な抗ＰＳＡ応答は観察されなかった（図１６，上方パネル）。しかしながら、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡでの免疫化に際して、有意な数のＰＳＡ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞が脾臓で見出された。興味深いことには、本発明者らがＴＩＬの存在についてこれらのマウスから切り出された腫瘍をテストすると、少数のＰＳＡ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞がナイーブおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫化マウスの双方で同定された（各々、１．５％および０．５１％）。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡでの免疫化は、この数のかなりの増加を引き起こした。というのは、全てのＣＤ８^＋ＴＩＬの１６．１％がＰＳＡ_{６５−７４}特異的であることが示されたからである（図１６，下方パネル）。

【0524】

Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡでの免疫化は脾臓ではなく腫瘍においてＴ調節細胞での減少を引き起こす。ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋Ｔ調節（Ｔｒｅｇ）腫瘍浸潤細胞の存在は、腫瘍進行の増加機会と関連することが示されている。従って、本発明者らは、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化または対照マウスの腫瘍におけるこのＴ細胞集団の存在を調べた。興味深いことには、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡまたはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７いずれかでの免疫化は、ナイーブマウスからの腫瘍と比較して、腫瘍におけるＴｒｅｇの頻度のかなりの減少を引き起こした（図１７）。事実、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡは腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの頻度においてＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７よりもわずかにより大きなインパクトを有した。他方、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡまたは対照マウスの脾臓から単離されたＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞のパーセンテージの間に有意な差はなかった。

【0525】

Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡでの免疫化の結果、ＰＳＡに対して強い細胞免疫応答が生じる。Ｌｍベースのワクチンによって誘導された免疫応答は、液性応答よりもむしろ細胞応答を生じることが示された。本発明者らは、免疫化マウスの脾臓においてＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡによって誘導されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化および機能性を調べた。

【0526】

サイトカイン分泌。Ｈ２Ｄ^ｂ ＰＳＡペプチドでのイン・ビトロ刺激に応答しての活性化されたＴ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を、ＥＬＩＳｐｏｔおよび細胞内サイトカイン染色によってテストした。マウスをＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡまたはＬｍ−ＬＬＯ−ＷＴ−１（陰性対照としてのＬｍ−ＬＬＯ−Ｗｉｌｍ´ｓ腫瘍抗原で３回免疫化するか、あるいは免疫化しなかった（ナイーブ）。次いで、単離された脾臓細胞を調製し、ＰＳＡペプチドと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８^＋細胞を定量した。双方のアッセイにおいて、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスは、陰性対照よりもペプチドパルシングに応答して有意により多数のＩＦＮ−γ分泌細胞を示した（ｐ＜０．００１）。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定されたＩＦＮ−γ分泌細胞の数は、対照よりもほぼ１１倍高かった（図１８）。ＩＦＮ−γについて細胞内サイトカイン染色によってテストすると、ＬＭ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスからのＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ ＩＦＮ−γ分泌細胞の数の３０倍増加が、対照と比較して検出された（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡについて４．２２％ ｖｓ ナイーブについては０．１５％）（図１９）。

【0527】

細胞傷害性（ＣＴＬ）アッセイ。ＰＳＡ特異的なＴ細胞の機能的活性を決定するために、免疫化またはナイーブマウスからの脾臓細胞を、Ｈ２Ｄ^ｂ ＰＳＡペプチドでパルスした細胞に対してＣＴＬアッセイでテストした。固定されたペプチド濃度（１μＭ）を用い、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスからの脾臓細胞は６０％の最大特異的溶解を示し、これはＥ：Ｔ比率に比例して低下した（図２０Ａ）。この結果は、ただ０．１μＭのペプチド濃度に到達する最大値を持つ溶解アッセイにおけるペプチド濃度に依存した（図２０Ｂ）。平均Ｔ細胞結合力の有用な尺度であるポリクローナル集団のＳＣ_５０値はほぼ１ｐＭであった。この実験からの結果は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡでの免疫化が、標的抗原ＰＳＡを呈する細胞を溶解することができる高い結合力の特異的細胞溶解性Ｔ細胞を生じたことも確認した。

【0528】

Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡの抗腫瘍効果と他のＰＳＡベースのワクチン様式との比較。 最後に、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡワクチンをさらに評価するために、本発明者らはその抗腫瘍効率を、文献に記載されている２つの他のＰＳＡベースのワクチン、すなわち、組換えＤＮＡおよびワクシニアベースのワクチンと比較した。このために、ＰＳＡの完全なオープンリーティングフレームを対照ｈＣＭＶプロモーター下でｐＣＤＮＡ３．１クローン化した（ｐＡｄｖ４０．１）。同様なＤＮＡワクチンは、同様なベクターバックボーン、すなわち、ｐＶａｘ（Invitrogen）を用いるRoos et atによって従前に記載された。２つのベクターバックボーン（ｐＣＤＮＡ３．１およびｐＶａｘ）の間の差は、その抗生物質選択マーカーにのみある。ｐＡｄｖ４０．１を、他のＤＮＡワクチンのための有効なアジュバントとして用いられてきたＧＭ−ＣＳＦ／ｐＣＤＮＡとの混合物として筋肉内注射した。ＰＳＡ／ｐＣＤＮＡプラスミドからのＰＳＡの発現は、２９３ＦＴ細胞系へのイン・ビトロトランスフェクションによって確認された（データは示さず）。組換えＰＳＡ−ワクシニアはHudge et al.によって従前に記載されている。マウスに先に記載したようにＴ−ＰＳＡ２３腫瘍細胞を移植し、次いで、文献に引用された最適な用量および投与経路によってワクチンの各々で２回免疫化した。ＰＳＡ／ワクシニアでの免疫化はＴ−ＰＳＡ２３腫瘍の成長に対してなんらインパクトも有しなかった。というのは、全てのナイーブおよびＰＳＡ／ワクシニア免疫化マウスは腫瘍を発生し、これは７ないし８週間以内に２０ｃｍのサイズに到達したからであり、それらは犠牲としなければならなかった（図２１ｂ）。しかしながら、ＰＳＡ／ＤＮＡワクチンで免疫化した８匹のマウスのうち１匹、およびＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡでワクチン接種した８匹のマウスのうち３匹は９０日にわたって腫瘍がないままであり、その時点で、実験を終了した（図２１Ａおよび表インサート）。この実験を２回反復し、同様な結果が示された。かくして、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、樹立されたＰＳＡ発現腫瘍を退行させるにおいて３つのＰＳＡワクチン様式の最も有効なワクチンであることが証明された。比較実験において、他の２つのワクチンの入手可能性が限定されているため、２つの用量のみが投与されたことに注意されるべきである。したがって、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、３回注射した場合（ここで、図１５に見られるように８つの腫瘍のうち７つが退行した）よりも、効果が少ない（完全な腫瘍退行は８つのうち３つでのみ観察された）ことが示された。この観察は、いくつかの他の実験で確認された（データは示さず）。

【0529】

実施例１０：リステリア−ＬＬＯ−葉酸ヒドロラーゼ１（ＦＯＬＨ１）およびリステリア−ＬＬＯ−前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）構築体は抗原特異的細胞溶解性Ｔ細胞を誘導する

【0530】

材料および実験方法

【0531】

細菌ワクチン株の成長および貯蔵

【0532】

組換えリステリア−ＬＬＯ−ＦＯＬＨ１およびリステリア−ＬＬＯ−ＰＳＣＡを、前記実施例７においてリステリア−ＰＳＡについて記載したように成長させ、維持する。

【0533】

結果

【0534】

その分泌シグナル配列を除いて、ＦＯＬＨ１の完全なオープンリーティングフレームを含有する切形されたＦＯＬＨ１をコードする遺伝子を、前記実施例７においてＫＬＫ３について記載したのと同様に、リステリオリシンＯの切形された非溶血性断片をコードする遺伝子に融合させる。同様に、その分泌シグナル配列を除いて、ＰＳＣＡの完全なオープンリーティングフレームを含有する切形されたＰＳＣＡをコードする遺伝子を、リステリオリシンＯの切形された非溶血性断片をコードする遺伝子に融合させる。各遺伝子をリステリアプラスミドｐＧＧ５５にクローン化し、ＬＭ ＸＦＬ−７にエレクトロポレーションする。ＬＬＯ−ＦＯＬＨ１蛋白質およびＬＬＯ−ＰＳＣＡ蛋白質は、かくして発現され、別の組換えリステリア株からエピソームにより分泌される。

【0535】

ＬＬＯ−ＦＯＬＨ１およびＬＬＯ−ＰＳＣＡの免疫原生をテストするために、マウスを、前記実施例７においてＬＬＯ−ＫＬＫ３について記載したように、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＦＯＬＨ１、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＣＡまたはＬｍＷＴ１Ａ（無関係抗原対照）またはＰＢＳ（陰性対照）いずれかで再度免疫化した。５日間のワクシニア−ＰＳＡ感染スティミュレーター細胞での培養に続き、ＦＯＬＨ１−ワクチン接種マウスからの脾臓細胞は、ＣＴＬアッセイにおいて高い効率でＦＯＬＨ１−ペプチドでパルスした腫瘍細胞を認識し、溶解でき、ＰＳＣＡワクチン接種マウスからの脾臓細胞は、ＣＴＬアッセイにおいて高い効率でＰＳＣＡペプチドパルスド腫瘍細胞を認識し、溶解させることができる。加えて、脾臓細胞は、各々、ＦＯＬＨ１ペプチドまたはＰＳＣＡペプチドと一緒でのインキュベーションに応答して、高いレベルのＩＦＮ−γ分泌を呈する。

【0536】

かくして、ＦＯＬＨ１発現ＬＭ株、ＰＳＣＡ発現ＬＭ株、ＬＬＯ−ＰＳＣＡ融合およびＬＬＯ−ＦＯＬＨ１融合は、標的細胞溶解およびＩＦＮ−γ分泌が可能な抗原特異的ＣＴＬの誘導において有効である。従って、ＦＯＬＨ１発現ＬＭ株、ＰＳＣＡ発現ＬＭ株、ＬＬＯ−ＰＳＣＡ融合およびＬＬＯ−ＦＯＬＨ１融合は、ＰＳＡ発現前立腺癌に対する治療的および予防的ワクチン接種において有効である。

【0537】

実施例１１：リステリア−ＬＬＯ−ＦＯＬＨ１構築体は腫瘍保護を提供する。

【0538】

先の実施例に記載されたリステリアワクチンは、前記実施例８および９に記載された同所性前立腺癌腫動物モデルにおいて腫瘍保護実験で用いられる。マウスをＬｍ−ＦＯＬＨ１、Ｌｍ−ＰＳＣＡ、ＬｍＷＴ１Ａ、またはＰＢＳいずれかで免疫化し、次いで、ＰＣ３Ｍ−ＬＮ４または２２Ｒｖ１細胞を注射した。Ｌｍ−ＦＯＬＨ１およびＬｍ−ＰＳＣＡは腫瘍形成からマウスを保護する。

【0539】

さらなる実験において、前記実施例８および９に記載したように、マウスをまずＰＣ−３Ｍ前立腺癌細胞を注射し、４日後に、Ｌｍ−ＦＯＬＨ１、Ｌｍ−ＰＳＣＡ、ＬｍＷＴ１Ａ、またはＰＢＳでワクチン接種し、同一ワクチンでブースター注射する。Ｌｍ−ＦＯＬＨ１およびＬｍ−ＰＳＣＡは前立腺転移を妨げる。

【0540】

かくして、ＦＯＬＨ１−およびＰＳＣＡ生産ＬＭ株およびＬｍ−ＦＯＬＨ１およびＬｍ−ＰＳＣＡ融合は腫瘍保護を誘導する。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]