特許 5933321 新規なα−グルコシダーゼとその製造法並びに用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5933321

(24)【登録日】2016年5月13日

(45)【発行日】2016年6月8日

(54)【発明の名称】新規なα−グルコシダーゼとその製造法並びに用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160526BHJP

   C12N 9/26 20060101ALI20160526BHJP

   C12P 19/44 20060101ALI20160526BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20160526BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C12N9/26 ZZNA

   C12P19/44

   C12N1/20 A

【請求項の数】15

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2012-93302(P2012-93302)

(22)【出願日】2012年4月16日

(65)【公開番号】特開2013-5793(P2013-5793A)

(43)【公開日】2013年1月10日

【審査請求日】2015年4月9日

(31)【優先権主張番号】特願2011-116256(P2011-116256)

(32)【優先日】2011年5月24日

(33)【優先権主張国】JP

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-1096

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-1097

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-1098

(73)【特許権者】

【識別番号】000231453

【氏名又は名称】日本食品化工株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504205521

【氏名又は名称】国立大学法人 長崎大学

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(72)【発明者】

【氏名】小島 晃代

(72)【発明者】

【氏名】相沢 健太

(72)【発明者】

【氏名】和田 幸樹

(72)【発明者】

【氏名】佐分利 亘

(72)【発明者】

【氏名】山本 健

(72)【発明者】

【氏名】工藤 俊章

【審査官】 長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／１３５９５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０２−２４２６９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−０６５２５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Database UniProt[online]，２０１１年 ４月 ５日，Accession No. A3YD72，Version 15，検索日２０１６年 １月 ８日，ＵＲＬ，http://www.uniprot.org/uniprot/A3YD72.txt?version=15

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００− ９／９９

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記のａ）〜ｃ）のいずれか１つに記載のタンパク質であるα−グルコシダーゼ：ａ）配列表の配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；ｂ）配列表の配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質；ｃ）配列表の配列番号２又は４に記載のタンパク質と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質。

【請求項2】

ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ８株又はハロモナス・エスピー Ｈ１１株であるハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）属細菌由来である、請求項１に記載のα−グルコシダーゼ。

【請求項3】

下記ａ）〜ｃ）のいずれか１つに記載のＤＮＡ：ａ）配列表の配列番号１又は３のヌクレオチド番号１〜１６１７に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９０％以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；ｃ）配列表の配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項4】

ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ８株又はハロモナス・エスピー Ｈ１１株であるハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）属細菌由来である、請求項３に記載のＤＮＡ。

【請求項5】

ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ８株、ハロモナス・エスピー Ａ１０株又はハロモナス・エスピー Ｈ１１株であるハロモナス属細菌を培養し、得られた培養物からα−グルコシダーゼを精製する工程を含む、α−グルコシダーゼの製造方法。

【請求項6】

糖受容体と糖供与体に、請求項１又は２に記載のα−グルコシダーゼを作用させる工程
を含む、配糖体の製造方法。

【請求項7】

糖供与体がマルトースである、請求項６に記載の配糖体の製造方法。

【請求項8】

糖受容体がアルコール性水酸基を有する化合物又はフェノール性水酸基を有する化合物である、請求項６又は７に記載の配糖体の製造方法。

【請求項9】

糖受容体が、グリセロール、エタノール、アスコルビン酸、１−プロパノール、２−プロパノール、Ｌ−メントール、プロピレングリコール又はハイドロキノンから選ばれる１種又は２種以上の化合物である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の配糖体の製造方法。

【請求項10】

ナトリウムイオン、リチウムイオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン又はセシウムイオンから選ばれる１種類又は２種以上のα−グルコシダーゼ活性化剤存在下で酵素反応を行う、請求項６〜９のいずれか１項に記載の配糖体の製造方法。

【請求項11】

α−グルコシダーゼ活性化剤の濃度が、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１０に記載の配糖体の製造方法。

【請求項12】

糖受容体と糖供与体に、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ１０株由来のα−グルコシダーゼを作用させる工程を含む、配糖体の製造方法。

【請求項13】

ハロモナス属細菌ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ８株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０９６）。

【請求項14】

ハロモナス属細菌ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ１０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０９７）。

【請求項15】

ハロモナス属細菌ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｈ１１株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０９８）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規なα−グルコシダーゼおよび当該酵素の利用法に関し、詳しくはマルトースおよびｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシド（以下、「ｐＮＰＧ」と表記することがある）に対する基質特異性が高くかつ特定の一価カチオンにより著しく活性が上昇する新規なα−グルコシダーゼ、当該酵素の製造方法、当該酵素を生産する微生物および当該酵素を用いた配糖体の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

α−グルコシダーゼは、微生物から動植物まで広く天然界に存在する酵素で、基質の非還元性末端のα−グルコシド結合を加水分解してグルコースを生成する。また、α−グルコシダーゼは加水分解反応のみならず、糖転移反応をも触媒し、様々なオリゴ糖や配糖体の製造に用いられている。中でも、アルコール類、ビタミン類、フラボノイド類並びにフェノール誘導体類をグルコシル化した配糖体は、例えば、特許文献１に挙げられる水溶性、耐光性並びに安定性の改善効果が見られる他、エタノールの配糖体であるエチルグルコシドの美白効果（特許文献２）、グリセロールの配糖体であるグルコシルグリセロールのインスリン様成長因子−１産生促進効果（特許文献３）など、様々な生理機能が知られ、食品、化粧品並びに医薬品工業などに広く用いられている。

【0003】

これら、配糖体の工業的製造に関しては、例えばアルコール類への配糖化については、特許文献４に示されるグルコシルグリセロールまたは特許文献５に示されるエチルグルコシドのように、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｅｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）をはじめとした微生物由来のα−グルコシダーゼが用いられることが知られている。

【0004】

ヘスペリジン、ルチンおよびアスコルビン酸をはじめとするビタミン類ならびにフェノール誘導体等に対する配糖化に関しては、例えば特許文献６（ヘスペリジン）、特許文献７および特許文献８（アスコルビン酸２−グルコシド）、特許文献９（アスコルビン酸５−グルコシド）、特許文献１０（アスコルビン酸６−グルコシド）、特許文献１１（フェノール誘導体）の配糖化法に開示されているように、各種微生物由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼまたはα−グルコシダーゼを作用させる方法が用いられることが知られている。しかしながら、従来の配糖体の製造方法においては、目的配糖体以外の、広範な重合度のオリゴ糖を副産物として生産するため、目的配糖体の収率が低く、副産物のオリゴ糖を除去する工程、それを分離する工程などを要する。

【0005】

副産物のオリゴ糖量を低減させる策として、例えば、グルコシルグリセロールの製造においては、特許文献１２に示されるように反応初期のマルトオリゴ糖濃度をグリセロールに対して少量とし、ある程度反応が進んだ後に、マルトオリゴ糖を適宜追添加する方法が報告されている。しかしながら、本法によっては、副産物の生成は抑えられるが目的配糖体の収量が微量であることに加え、１バッチあたりの反応時間が長く、エネルギー消費、コスト共に生産性が高いとは言い難い。

【0006】

また、特許文献１３には副産物のオリゴ糖量生成を低減させるために、マルトース、ｐＮＰＧには作用するが、マルトトリオース、マルトヘキサオース、イソマルトース、トレハロース、スクロース、可溶性澱粉、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ラクトース、メリビオース、セロビオース、アミロース、シクロデキストリン、イソマルトトリオース、ニゲロース、コージビオースにはほとんど作用しないキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属微生物由来のα−グルコシダーゼを用いた配糖体の製造方法が報告されている。しかしながら、本法では副産物の生成は抑えられるが、酵素活性が不十分であり目的
配糖体の収量が微量であるため、生産性に未だ問題がある。

【0007】

そのような問題から、酵素活性を上昇させる代表的な取り組みとして、酵素自体の比活性を上昇させる試みが検討されてきた。例えば、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング法などのあらゆる遺伝工学的手法を用い、その遺伝子を改変することで、対応するタンパク質自身を改良する手法が取られてきた。

【0008】

その他に、酵素の活性化剤を反応系に加えることにより酵素を活性化させる方法も研究されてきた。例えば、澱粉の糖化に広く用いられるα−アミラーゼの活性化法に関して言えば、酵素反応系に特定のポリマーを添加すること（特許文献１４）、特定のアミラーゼに対して塩素イオンを加えること（非特許文献１）、ｎ−ヘキサンにＴｗｅｅｎ ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を添加して得られる逆相ミセル系を利用して酵素活性を高めるもの（非特許文献２）、酵素反応系に特定のアルキル鎖長を有するアルキル硫酸塩及び／又はアルキルスルホン酸塩を添加して酵素活性を高めること（特許文献１５）などが報告されている。また、予め酵素を電解生成水に溶解させることにより、酵素反応の前段階で酵素を活性化させる方法（特許文献１６）、酵素を発熱性無機塩に溶解することにより活性化する方法（特許文献１７）などが報告されている。

【0009】

また、酵素の活性化剤として特定のイオンを添加することで酵素を活性化させる方法も報告されている。α−グルコシダーゼにおいても特定カチオンにより活性化される報告がこれまでに数例あるものの、その活性化上昇率は、最大でも１５０％程度であり（非特許文献３、非特許文献４、特許文献１８）、活性化剤による上昇率が高いとは言えず、これまでに活性化剤の共存下でα−グルコシダーゼによる反応を行いオリゴ糖製造または配糖体製造を効率化させる例はなかった。

【0010】

このような問題から、配糖体またはオリゴ糖の製造において、少量添加で効果を発揮できる酵素の活性化剤があれば、酵素の添加量を削減可能となると考えられていた。さらに、そのような活性化剤により活性化可能な酵素が目的物質以外の広範囲の重合度の副産物を生成しないものであれば、配糖体またはオリゴ糖の製造効率が改善されることが期待でき、このような酵素が望まれていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】特開平１１−３４６７９２号公報

【特許文献2】特開２００５−３１４３１０号公報

【特許文献3】特開２００９−１６１４７５号公報

【特許文献4】特開平１１−２２２４９６号公報

【特許文献5】特開２００２−１７３９５号公報

【特許文献6】特開平１１−３４６７９２号公報

【特許文献7】特開２０００−６５０９８号公報

【特許文献8】特開平０３−１３５９９２号公報

【特許文献9】特開平５−１１２５９４号公報

【特許文献10】特開昭４８−３８１５８号公報

【特許文献11】国際公開第０１／０７３１０６号パンフレット

【特許文献12】特開２００６−８７０３号公報

【特許文献13】特開２００１−４６０９６号公報

【特許文献14】特表平５−５０７６１５号公報

【特許文献15】特開平８−２５６７６８号公報

【特許文献16】特開２０００−２４５４５３号公報

【特許文献17】特開２０００−３７１８６号公報

【特許文献18】特開２００２−６５２５４号公報

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６，２２４−２２８（１９８３）

【非特許文献2】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２９，９０１−９０２（１９８７）

【非特許文献3】Ａｐｐl．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．,Ｖｏｌ．６５，Ｎｏ．７，ｐ.２９０７−２９１１（１９９９）

【非特許文献4】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４０（１０）ｐ.１９２９−１９３６（１９７６）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

そこで本発明の目的は、入手及び取扱いが容易な活性化剤により酵素活性が活性化され、かつ配糖体の製造において、目的範囲外の重合度のマルトオリゴ糖を実質的に生成しない新規なα−グルコシダーゼ、当該酵素の生成方法及び製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡ、当該酵素を生産する微生物、並びにその用途を提供することにある。さらに詳細には、本発明におけるα−グルコシダーゼを用いて、マルトース等の糖供与体および糖受容体を含む反応系において、一価カチオンを添加することにより効率的に糖受容体へグルコシル基をα転移させ配糖体を製造する方法に関する。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明者らは、上記課題を解決するために、様々な生物起源のα−グルコシダーゼを鋭意研究した結果、種々の重合度および結合の糖質の中でもα−１，４結合の二糖すなわちマルトースに高い特異性を有し、さらにその酵素活性が一価カチオンにより２００〜３５００％活性化される産業利用上注目すべき新規なα−グルコシダーゼを見出し、当該酵素を用いることで副産物の生成を抑えかつ高効率で配糖体が生産可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、例えば海洋より単離したハロモナス属に属する微生物が、マルトース等に特異的に作用しグルコースを生じることを見出し、また、マルトースと例えば糖受容体としてグリセロールを含む溶液に作用させるとグリセロールにグルコシル基を転移しグルコシルグリセロールを生じることを見出し、また、いずれの反応系においても重合度４以上のオリゴ糖は実質的に生成されず、さらにはマルトオリゴ糖が実質的に生成されないことを見出し、さらに、反応系に特定の一価カチオンを添加することにより例えばグルコシルグリセロールの生成効率が無添加のときと比較して優れることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0015】

すなわち本発明は以下の通りである。
＜１＞ 下記理化学的性質を有するα−グルコシダーゼ：
（Ａ）酵素活性
カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン又はアンモニウムイオンから選ばれる１種又は２種以上のイオン１０ｍｍｏｌ／Ｌの存在下において、非存在下に対し、酵素活性が２００％以上に活性化される。
（Ｂ）基質特異性
マルトース、ｐＮＰＧ、スクロースに作用しグルコースを遊離させるが、イソマルトース、ニゲロース、コージビオース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、可溶性澱粉には実質的に作用しない。
＜２＞ さらに下記理化学的性質を有する、＜１＞に記載のα−グルコシダーゼ：
カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン又はアンモニウムイオンから選ばれる１種又は２種以上のイオン１０ｍｍｏｌ／Ｌの存在下において、非存在下に対し、酵素活性が３００％以上に活性化される。
＜３＞ さらに下記理化学的性質を有する、＜１＞又は＜２＞に記載のα−グルコシダーゼ。
（Ｃ）分子量
５８０００±２０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
（Ｄ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の保存において、すくなくともｐＨ５．５〜９．５で安定である。
（Ｅ）至適ｐＨ
３０℃、１０分間の反応においてｐＨ５．５〜８．５である。
（Ｆ）温度安定性
ｐＨ７．０、１５分間の保存において、すくなくとも４℃〜４０℃で安定である。
（Ｇ）至適温度
ｐＨ７．０、１０分間の反応において１５℃〜３５℃であり、ｐＨ７．０、１０分間、１０ｍｍｏｌ／Ｌアンモニウムイオン存在下の反応において１５℃〜４５℃である。
＜４＞ ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）属細菌由来である、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のα−グルコシダーゼ。
＜５＞ ハロモナス属細菌が、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ８株、ハロモナス・エスピー Ａ１０株又はハロモナス・エスピー Ｈ１１株である、＜４＞に記載のα−グルコシダーゼ。
＜６＞ 下記のａ）〜ｃ）のいずれか１つに記載のタンパク質であるα−グルコシダーゼ：
ａ）配列表の配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｂ）配列表の配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列を含み、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質；
ｃ）配列表の配列番号２又は４に記載のタンパク質と６０％以上のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質。
＜７＞ 下記ａ）〜ｄ）のいずれか１つに記載のＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１又は３のヌクレオチド番号１〜１６１７に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡと７０％以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
ｄ）配列表の配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜８＞ ハロモナス属細菌を培養し、得られた培養物からα−グルコシダーゼを精製する工程を含む、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のα−グルコシダーゼの製造方法。
＜９＞ 糖受容体と糖供与体に、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを作用させる工程を含む、配糖体の製造方法。
＜１０＞ 糖供与体がマルトースである、＜９＞に記載の配糖体の製造方法。
＜１１＞ 糖受容体がアルコール性水酸基を有する化合物又はフェノール性水酸基を有する化合物である、＜９＞又は＜１０＞に記載の配糖体の製造方法。
＜１２＞ 糖受容体が、グリセロール、エタノール、アスコルビン酸、１−プロパノール、２−プロパノール、Ｌ−メントール、プロピレングリコール又はハイドロキノンから選ばれる１種又は２種以上の化合物である、＜９＞〜＜１１＞のいずれかに記載の配糖体の製造方法。
＜１３＞ ナトリウムイオン、リチウムイオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン又はセシウムイオンから選ばれる１種類又は２種以上のα−グルコシダーゼ活性化剤存在下で酵素反応を行う、＜９＞〜＜１２＞のいずれかに記載の配糖体の製造方法。
＜１４＞ α−グルコシダーゼ活性化剤の濃度が、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、＜１３＞記載の配糖体の製造方法。
＜１５＞ ＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを生産する能力を有するハロモナス属細菌。
＜１６＞ ＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを生産する能力を有するハロモナス属細菌ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ８株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０９６）。
＜１７＞ ＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを生産する能力を有するハロモナス属細菌ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ１０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０９７）。
＜１８＞ ＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを生産する能力を有するハロモナス属細菌ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｈ１１株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０９８）。

【発明の効果】

【0016】

本発明によれば、配糖体の製造において副生成物として広範な重合度のオリゴ糖を実質的に生じさせず、さらに特定一価カチオンにより配糖体の生成効率が上昇することから、従来技術と比較してより効率的に配糖体を製造することが可能となる。さらに、酵素使用量の低減、あるいは反応時間の短縮に功を奏し、得られる配糖体は複雑な精製過程を経ずに飲食物、化粧品、医薬品をはじめとする様々な分野に利用することが可能となることが期待できる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｈ１１株由来酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図（写真）である。

【図2】ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｈ１１株由来酵素におけるｐＨの影響を示す図である。

【図3】ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｈ１１株由来酵素における温度の影響を示す図である。

【図4】ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｈ１１株由来酵素におけるアンモニウムイオン存在下における温度の影響を示す図である。

【図5】ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｈ１１株由来酵素におけるカチオン濃度の影響を示す図である。

【図6】ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｈ１１株由来組換え酵素及び対照酵素によるグルコシルグリセロール生成量におけるアンモニウムイオンの影響を示す図である。

【図7】ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｈ１１株由来組換え酵素及び対照酵素によるエチルグルコシド生成量におけるアンモニウムイオンの影響を示す図である。

【図8】ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ８株由来組換え酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図（写真）である。

【図9】ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ８株由来組換え酵素におけるｐＨの影響を示す図である。

【図10】ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ８株由来組換え酵素における温度の影響を示す図である。

【図11】ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ８株由来組換え酵素におけるアンモニウムイオン存在下における温度の影響を示す図である。

【図12】ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ａ８株由来組換え酵素におけるカチオン濃度の影響を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明における用語「実質的に基質としない」及び「実質的に作用しない」とは、マルトースに対する加水分解活性を１００（％）としたときに、当該基質に対する相対的加水分解活性が１０％以下であること、好ましくは７％以下、より好ましくは５％以下であることをいう。
また、用語「実質的に生成しない」とは、酵素反応溶液の最終生成物において、生成産物が反応系内の固形分全体の５％以下であること、好ましくは３％以下であること、より好ましくは１％以下であることをいう。

【0019】

本発明でいう「α−グルコシダーゼ」（酵素番号：ＥＣ．３．２．１．２０）とはα−グルカンの非還元末端のα−グリコシド結合の加水分解反応を触媒し、α−グルコースを生じさせる酵素全般を意味する。また、α−グルコシダーゼには、加水分解反応とともに糖転移反応を触媒するものが存在し、本発明においては、好ましくは加水分解反応とともに糖転移反応を触媒するα−グルコシダーゼが用いられる。

【0020】

（１）本発明のα−グルコシダーゼ
本発明のα−グルコシダーゼは、下記理化学的性質を有するα−グルコシダーゼである。
（Ａ）酵素活性
カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン又はアンモニウムイオンから選ばれる１種又は２種以上のイオン１０ｍｍｏｌ／Ｌの存在下において、非存在下に対し、酵素活性が２００％以上に活性化される。
（Ｂ）基質特異性
マルトース、ｐＮＰＧ、スクロースに作用しグルコースを遊離させるが、イソマルトース、ニゲロース、コージビオース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、可溶性澱粉には実質的に作用しない。

【0021】

本発明の新規α−グルコシダーゼは、微生物、例えば、ハロモナス属に属する微生物から各種クロマトグラフィーなどの手段を経て分離精製することができる。この分離精製方法の具体例は後述する実施例に示す。又は、本発明において、本発明の新規α−グルコシダーゼの遺伝子配列が明らかにされたため、このような遺伝子配列にコードされるアミノ酸配列を、公知の遺伝子工学的手法により合成することにより、新規α−グルコシダーゼを得ることもできる。

【0022】

（酵素力価の測定）
本発明において、α−グルコシダーゼの酵素力価の測定は、例えば、０.２ｗ／ｖ％マ
ルトースを基質として、ｐＨ７、３０℃、１００μｌの系で、特定量の酵素から生じたグルコース量を測定することにより行うことができる。
具体的には、例えば、上記系にて１０分間の酵素反応後、２ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）を２００μｌ添加することにより酵素反応を終了させ、そこに、グルコーステストワコーＣ ＩＩ（和光純薬製）を１００μｌ添加し３７℃で３０分間インキュベートする。波長４９０ｎｍの吸光度を測定することにより、生じたグルコース量を算出する。上記条件にて１分間に１μｍｏｌのマルトースを加水分解する酵素量を１Ｕと定義する。また、ｐＮＰＧから生ずるｐ−ニトロフェノールの定量は、酵素反応溶液に炭酸ナトリウム溶液を添加して酵素反応を終了させ、波長４０５ｎｍの吸光度を測定することにより行うことができる。

【0023】

（酵素の理化学的性質）
本発明のα−グルコシダーゼの具体例としては、例えば、以下の理化学的性質を有するものが挙げられる。
<作用> マルトースを加水分解しグルコースを生じる
<分子量> ５８０００±２０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
<ｐＨ安定性> ４℃、２４時間の保存において、すくなくともｐＨ５．５〜９．５で安定（６５％以上）
<至適ｐＨ> ３０℃、１０分間の反応において、ｐＨ５．５〜８．５
<最適温度> ｐＨ７、１０分間の反応において、１５〜３５℃
ｐＨ７、１０ｍｍｏｌ／Ｌアンモニウムイオン、１０分間の反応において、１５〜４５℃
<温度安定性> ｐＨ７、１５分間の保存において、すくなくとも４〜４０℃で安定である。
<基質特異性> ４ｍｍｏｌ／Ｌのマルトース、イソマルトース、ニゲロース、コージビオース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、１ｗ／ｖ％の可溶性澱粉および２ｍｍｏｌ／ＬのｐＮＰＧを基質とし、ｐＨ７、３０℃の条件で反応させたとき、マルトースに対する加水分解活性を１００％としたときのｐＮＰＧおよびスクロース以外の基質に対する加水分解活性が１０％以下である。すなわち、重合度３以上のα−グルカンおよびマルトース以外のグルコ二糖を実質的に基質としない。
<イオンによる活性化>
リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオンおよびアンモニウムイオンにより選ばれる１種または２種以上のイオンにより酵素活性が活性化される。

【0024】

本発明のα−グルコシダーゼは、具体的には、下記の理化学的性質を有する場合がある。
<イオンによる活性化>
カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオンおよびアンモニウムイオンにより選ばれる１種または２種以上のイオン１０ｍｍｏｌ／Ｌの存在下において、非存在下に対し、２００％以上、好ましくは２００〜３５００％、より好ましくは３００〜３５００％、さらに好ましくは３００〜２０００％、最も好ましくは３００〜１５００％に酵素活性が活性化される。

【0025】

本発明のα−グルコシダーゼは、マルトース、スクロースおよび／またはｐＮＰＧを加水分解しグルコースを生じる。一方で、実質的に基質となり得ないものとしては、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンや、それらを分解または縮合させたアミロデキストリン、マルトデキストリン、およびその他のマルトオリゴ糖が挙げられる。さらに、α−１，４結合以外の二糖、すなわち、トレハロース、コージビオース、ニゲロースおよびイソマルトースも実質的に基質となり得ない。

【0026】

基質としては、例えばマルトースを基質とするときは、マルトース純品でなくてよく、マルトース以外に、他の糖質、脂質、タンパク質等が混在するマルトース溶液でもよい。また、澱粉などにβ−アミラーゼなどを作用させ、マルトースを生じさせ、それと並行または連続して、本酵素を生じたマルトースに作用させることも可能である。

【0027】

さらに、実施例において詳述するが、本発明における酵素は、特定一価カチオンの添加により酵素活性が活性化される。したがって、本発明のα−グルコシダーゼによる配糖体の生成反応系内に、ナトリウムイオン、リチウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、アンモニウムイオンを少なくとも１種類以上添加することにより、配糖体生成反応を促進することができる。すなわち、ナトリウムイオン、リチウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、アンモニウムイオンをα−グ
ルコシダーゼの活性化剤とすることができる。活性化剤の濃度は、本酵素が活性化される範囲で特に限定されず、０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌのカチオンを添加して反応を行うことができる。また、配糖体の精製におけるイオン負荷ならびに資材コストを考慮すると、本酵素が十分に活性化される濃度２〜２００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌであり、さらにより好ましくは１０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである。

【0028】

本発明におけるα―グルコシダーゼの活性化剤としては、水溶液中でナトリウムイオン、リチウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、アンモニウムイオン又はセシウムイオンを解離させうる各種カチオン塩類を用いることができる。すなわち、上記記載カチオンの塩化物、硫酸化物、ヨウ化物、臭化物等を適宜選択すればよい。なお、本明細書でいうナトリウムイオン、リチウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、アンモニウムイオン及びセシウムイオンとは、例えば、それぞれの塩化物、硫酸化物、ヨウ化物又は臭化物等由来の遊離カチオンのことを意味する。

【0029】

（アミノ酸配列）
本発明のα−グルコシダーゼの一例として、例えば、配列表における配列番号２または配列番号４で示されるアミノ酸配列またはそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、マルトース、ｐＮＰＧ、スクロースに作用し、その他のα結合様式の二糖および重合度３以上のα−グルカンを実質的に基質とせず、特定一価カチオンにより、カチオン非存在下に対し、２００％以上活性化されるという酵素活性を保持する範囲で、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列において１個または数個（数個とは、通常、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を示す）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有するものや、配列表における配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは７０％以上、さらに望ましくは８０％以上、よりさらに望ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものが挙げられる。ここで相同性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときの全アミノ酸数に対する同一アミノ酸数の割合（同一性）を示す。

【0030】

なお、上記理化学的性質またはアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼはあくまで一例であって、上記と異なる理化学的性質またはアミノ酸配列を有する酵素も、本発明のα−グルコシダーゼの理化学的性質であるグルコース重合度２のα−１，４結合を有する糖に作用し、その他のα結合様式の二糖および重合度３以上のα−１，４結合のα−グルカンを実質的に基質としないという酵素活性を保持し、特定一価カチオンにより、カチオン非存在下に対し、２００％以上活性化される限り本発明に包含される。例えば、配列表における配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列のうちの一部を含むものであって、α−グルコシダーゼの理化学的性質を維持するものであれば、本発明に包含される。

【0031】

（ＤＮＡ配列）
本発明のＤＮＡは、グルコース重合度２のα−１，４結合を有する糖に作用し、その他のα結合様式の二糖および重合度３以上のα−１，４結合のα−グルカンを実質的に基質とせず、特定一価カチオンにより、非存在下に対し、２００％以上活性化されるという酵素活性を保持するα−グルコシダーゼをコードするものである限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。

【0032】

天然の供給源としては、例えばＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｈ１１株、Ａ８株、Ａ１０株を含むハロモナス属の微生物が挙げられ、これらの微生物から本発明のＤＮＡを含む
遺伝子ＤＮＡを得ることができる。すなわち、微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で半日至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞膜溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどのタンパク質分解酵素を併用したり、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの定法を適用すれば目的の遺伝子ＤＮＡが得られる。本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、当該遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡを鋳型として、例えば、配列表における配列番号１又は３で示されるＤＮＡ配列に基づく適当なプライマーとなる化学合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ合成することで、本発明のＤＮＡを人為的に合成することができる。
また、配列表における配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列に基づいて、公知の遺伝子工学的手法により、化学合成することも有利に実施できる。

【0033】

本発明のＤＮＡの一例としては、例えば、配列表における配列番号１または配列番号３で示される塩基配列またはそれに相同的な塩基配列が挙げられる。配列表における配列番号１または配列番号３で示される塩基配列に相同的な塩基配列を有する変異ＤＮＡとしては、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列番号１または配列番号３で示される塩基配列において１個または２個以上、６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１５個以下の塩基が欠失、置換もしくは付加した塩基配列を有するものが挙げられ、配列番号１または配列番号３で示される塩基配列に対し、通常、７０％以上、さらに望ましくは８０％以上、よりさらに望ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するものが好適である。また、遺伝子コードの縮重に基づき、そのコードする酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個または２個以上の塩基を他の塩基に置換したものも当然、本発明のＤＮＡに包含される。

【0034】

本発明のＤＮＡと相同性の高い塩基配列は、例えばＮＣＢＩ（ナショナルセンターフォーバイオテクノロジーインフォメーション）の提供するＢＬＡＳＴ検索によって配列番号１または配列番号３に示した塩基配列と相同性検索を実施することで入手可能である。また、同様のＢＬＡＳＴ検索により、本発明のα−グルコシダーゼと相同性の高いアミノ酸配列を入手することも当然可能である。このような本発明のＤＮＡと相同性の高い塩基配列も、本発明のＤＮＡに包含される。

【0035】

なお、本発明において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液、５０℃下で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。コードするタンパク質がα−グルコシダーゼ活性を有するか否かは、下記実施例に記載の酵素活性の測定方法にしたがって判定することができる。

【0036】

本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適当なベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。
斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、
φ１０５などのファージベクターが挙げられる。この内、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。
ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子ＤＮＡ及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。

【0037】

このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、ハロモナス属細菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜宿主微生物に導入することができる。すなわち、定法に基づき、形質転換体（組換え微生物）を得ることができる。

【0038】

本発明のα−グルコシダーゼ産生能を有する形質転換体も含めた微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩、ストロンチウム塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。

【0039】

培養は、培養する微生物に適した条件を選択できるが、通常、温度４〜５０℃でｐＨ５〜１２の範囲、好ましくは温度２０〜４０℃でｐＨ６〜１１の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０〜１５０時間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はなく、適宜通気量を調節したり、攪はん速度を調節したりしてよい。また、培養方式は回文培養または連続培養のいずれでもよい。また、前培養をしてもしなくても、よい。

【0040】

（２）本発明の微生物
本発明のα−グルコシダーゼはその供給源によって制限されないものの、好ましい供給源として微生物が挙げられ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ属細菌、とりわけ、本発明者らが海洋より単離した微生物Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｈ１１株、Ｈａｌｏｍｏａｎｓ ｓｐ．Ａ８株またはＨａｌｏｍｏａｎｓ ｓｐ．Ａ１０株が好適に用いられる。以下、本発明におけるα−グルコシダーゼの産生能を有する微生物の同定結果を示す。なお、１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列解析、形態観察および生理・生化学試験の結果から帰属分類群を推定した。

【0041】

<同定結果>
培地 ： マリンブロス２２１６（ベクトン・ディッキンソン製）
培養温度 ： ３０℃
培養時間 ： ２４時間

【0042】

【表1】

【表1-1】

【0043】

以上の菌学的性質に基づき、公知菌との異同を検討した。その結果、Ａ８株およびＨ１１株は、ハロモナス・アクアマリナ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ａｑｕａｍａｒｉｎａ） ＤＭＳ３０１６１、ハロモナス・メリディアナ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｍｅｒｉｄｉａｎａ） ＤＭＳ５４２５、およびハロモナス・アキシャレンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ａｘｉａｌｅｎｓｉｓ） Ａｌｔｈｆ１に近縁であるが、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ属の既知種とその生理試験結果が完全に一致せず、簡易分子系統樹（アポロンＤＢ−ＤＡ、テクノスルガ・ラボ、静岡）においても異なる分枝に属していた。よって、本同定試験結果からは、帰属種の特定が困難であった。以上より、Ａ８株およびＨ１１株をそれぞれ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ａ８株およびＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｈ１１株と命名した。Ａ１０株は、ハロモナス・ヴェヌスタ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｖｅｎｕｓｔａ） ＤＳＭ４７４３に類似していることが明らかとなったが、既知種のＨａｌｏｍｏｎａｓ ｖｅｎｕｓ
ｔａとその生理および１６Ｓ ｒＲＮＡ配列が若干異なっていた。よって、帰属種の特定が困難であった。以上より、Ａ１０株をＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ａ１０株と命名した。

【0044】

Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ａ８株は、平成２３年５月２日付けで、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０９６で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されている。
Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ａ１０株は、平成２３年５月２日付けで、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０９７で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されている。
Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｈ１１株は、平成２３年５月２日付けで、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０９８で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されている。

【0045】

本発明のα−グルコシダーゼ産生能を有する微生物には、上記菌はもとより、その変異体、更には、α−グルコシダーゼ酵素産生能を有する組換え微生物およびその変異株なども包含される。

【0046】

（３）本発明のα−グルコシダーゼの製造方法
本発明のα−グルコシダーゼの製造方法は、本発明のα−グルコシダーゼ産生能を有する微生物、例えばハロモナス属細菌を培養し、得られた培養物からα−グルコシダーゼを精製する工程を含む、α−グルコシダーゼの製造方法である。

【0047】

すなわち、本発明のα−グルコシダーゼ産生能を有する天然又は組換え微生物を培養した後、酵素を含む培養物を回収する。酵素活性は、例えば培養微生物がハロモナス属微生物の場合、菌体内および菌体外に認められ、菌体、培養物の除菌液、または培養液全体を回収し粗酵素液として用いることができる。例えば、菌体を利用する場合には、菌体を回収し、溶菌剤、界面活性剤、超音波破砕またはビーズショッカーなどを用いて菌体細胞を破砕し、そのままもしくは不溶性画分を分離したものを粗酵素液とすればよい。また、粗酵素液をそのまま用いても、濃縮してから用いてもよい。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトンおよびアルコール沈殿法、平膜、中空膜法などを採用することができる。

【0048】

さらに、本発明によるα−グルコシダーゼ活性を有する溶液およびその濃縮物を用いて、適宜方法により固定化酵素とすることもできる。例えば、イオン交換体への結合法、樹脂および膜などの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。

【0049】

上記のように、本発明のα−グルコシダーゼは、粗酵素液をそのまままたは濃縮して用いることができるものの、必要に応じてカラムクロマトグラフィー等により分離・精製して利用することもできる。例えば、培養液の上清または破砕処理物を『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ』樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、『ブチル−トヨパール６５０Ｍ』樹脂を用いた疎水クロマトグラフィー、続いて、『ｒｅｓｏｕｒｃｅ−Ｑ』樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製することにより、本発明のα−グルコシダーゼを、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素として得ることができる。

【0050】

本発明におけるα−グルコシダーゼは組換え型酵素である場合には、宿主の種類によっては酵素が菌体内に蓄積したり、培養液に蓄積したりすることがある。このような場合にも、前記のように、菌体またはその培養物をそのまま使用してもよいが、必要に応じて、細胞を破砕したものを用いてもよい。

【0051】

このようにして得られる本発明のα−グルコシダーゼは、グルコース重合度２のα−１，４結合の糖に作用し、グルコース重合度３以上のα−グルカンを実質的に基質としないと推察される。

【0052】

（４）本発明のα−グルコシダーゼによる配糖体の製造方法
本発明のα−グルコシダーゼによる配糖体の製造方法は、糖受容体と糖供与体に、本発明のα−グルコシダーゼを作用させる工程を含む、配糖体の製造方法である。なお、糖受容体と糖供与体に本発明のα−グルコシダーゼを発現する微生物を作用させてもよい。

【0053】

糖供与体と糖受容体を含む溶液に本酵素を作用させることにより、糖受容体にグルコシル基がひとつ転移した配糖体を作製することができる。
糖供与体としては、本発明のα−グルコシダーゼにより加水分解され、α−グルコースを生成するものであれば、いずれでもよい。より具体的には、前述の通り好ましくはマルトース、スクロースおよびｐＮＰＧが挙げられ、より好ましくはマルトースが挙げられる。

【0054】

この際、基質濃度に特に制限はなく、マルトース等の基質濃度は１〜飽和％で、酵素が作用する範囲内で、配糖体の製造が可能であると考えられる。マルトースの結晶が析出している飽和％以上においても反応可能である。ただし、ハンドリング並びに糖転移反応効率を考慮すると、反応液中においてマルトース濃度は５〜４０ｗ／ｖ％が好ましく、さらに好ましくは１０〜４０ｗ／ｖ％である。

【0055】

糖受容体としては、本発明のα−グルコシダーゼによりグルコシル基が転移する水酸基を有する化合物であれば、いずれでもよい。具体的には、アルコール類（例えばエタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、Ｌ−メントール、１−ブタノ―ル、２−ブタノ―ル）、ポリオール類（例えばグリセロール、プロピレングリコール）、ビタミン類（例えばＬ−アスコルビン酸、レチノール、イノシトール、トコフェロール）、フラボノイド類（例えばケルセチン、カテキン、ルチン、ヘスペリジン）、フェノール誘導体（例えばハイドロキノン）、糖類（例えばガラクトース、マンノース）等を用いることができ、水酸基を有した化合物であれば特に限定されない。特に、後の実施例で詳述するが、本酵素は低温における活性が高いことから、温度に対し不安定な糖受容体に対して、有効に糖を転移し配糖体を作製可能であることが容易に想像できる。また、糖受容体が酸化されやすい場合は、必要に応じて還元剤を反応系に添加しておくことも有効である。

【0056】

また、本酵素の活性を保持する範囲で糖受容体の濃度を適宜選択することができ、１〜飽和％の範囲での反応が可能である。配糖体の生成効率および回収工程を考慮すると、反応液中において受容体濃度は５ｗ／ｖ％以上が好ましく、さらに好ましくは７ｗ／ｖ％以上、より一層好ましくは１０ｗ／ｖ％以上である。

【0057】

配糖体の生成反応は、水系の液相による反応でも良く、例えば、糖受容体がＬ−メントールまたはレチノールのように難水溶性である場合は、油相と水相の界面における反応を適宜選択できる。また、酵素を適当な担体に固定化し、カラム方式により単管反応もしくは循環反応を行い、配糖体を得ることができる。

【0058】

配糖体の生成反応中のｐＨは、本発明におけるα−グルコシダーゼの活性を示す範囲で自由に選択可能であり、好ましくは、ｐＨ５〜９であり、より好ましくはｐＨ５〜８であり、さらにより好ましくはｐＨ６〜８である。また、温度に関しても酵素の活性を示す範囲で自由に選択可能であり、４℃〜５５℃の範囲で反応が可能であり、好ましくは４℃〜５０℃、より好ましくは４℃〜４５℃である。なお、糖受容体の安定性や溶解度を考慮し
、反応条件を適宜選択すれば良い。反応に用いる緩衝液は特に制限されず、例えば、グッド緩衝液、リン酸緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩衝液、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液等が挙げられ、適宜選択すればよい。

【実施例】

【0059】

以下に実施例を挙げて本発明の詳細を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、各測定数値は下記のような条件で測定した値である。

【0060】

（活性測定）
まず、０．５ｗ／ｖ％マルトース水溶液４０μｌと０．１ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）４０μｌを含む溶液に、酵素試料２０μｌを添加して、３０℃で１０分間酵素反応させた。この反応液に２ｍｏｌ／ＬのＴｒｉs−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７）を添加して
反応を停止した。前記反応液に、グルコーステストワコーＣ ＩＩ溶液（和光純薬製）を１００μｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベートし発色させた。このうち２００μｌを９６ウェルマイクロプレートに移液し、マイクロプレートリーダー（『Ｍｏｄｅｌ ６８０』Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）にて波長４９０ｎｍの吸光度を測定することにより生じたグルコースを定量した。グルコースの標準曲線は、０〜０．０１ｗ／ｖ％グルコース水溶液を用いて作成した。酵素単位１Ｕは、前記条件で、１分間に１μｍｏｌのマルトースを分解させる酵素量と定義した。以下の実施例においても、特に示さない限り、同様である。

【0061】

（タンパク質の定量）
タンパク質の定量は、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を使用して、添付のプロトコルに従って行った。タンパク質の標準曲線は０〜１ｍｇ／ｍｌのｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を用いて作成した。以下の実施例においても、特に示さない限り、同様である。

【0062】

（タンパク質の純度）
タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｏｌｙ−Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により評価した。ポリアクリルアミドゲル（１２．５％）は、アトー社製の商品名『ｅ−ＰＡＧＥＬ』を使用した。サイズマーカーはインビトロジェン社製の『Ｍａｒｋ１２ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ』を使用した。電気泳動は、２５ｍＡの定電流で行った。タンパク質の染色は、関東化学社製の商品名『ラピッド ＣＢＢ Ｋａｎｔｏ』を使用して、添付のプロトコルに従って行った。以下の実施例においても、特に示さない限り、同様である。

【0063】

＜実施例１：Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｈ１１からのα−グルコシダーゼ精製＞
可溶性澱粉（関東化学製）１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、和光純薬製）５ｇ／Ｌ、酵母抽出物（商品名『イーストエキストラクト』、ベクトン・ディッキンソン製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム（和光純薬製）３５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム（関東化学製）１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物（関東化学製）０．２ｇ／Ｌ、および水からなるｐＨ７の液体培地２Ｌを５Ｌのバッフル付きフラスコに調製し、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し冷却した。

【0064】

次いで、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｈ１１菌株のグリセロールストックを１０μｌディスポループ１エーゼ分植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。培養液を冷却遠心機にて遠心分離し（４℃、５，８００ｘｇ、３０分間）、得られた菌体細胞を２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）で懸濁した後、再度上記と同様の条件で遠心分離することにより菌体を洗浄した。上清を取り除き、菌体細胞を同緩衝液５
０ｍｌに懸濁し、超音波破砕機（ｍｉｃｒｏｓｏｍ（商標） ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）にて細胞を破砕した（出力：４ワット、全出力時間： ２
０分間）。細胞破砕液を遠心分離し（４℃，５，８００ｘｇ，３０分間）、回収した上清を菌体内粗酵素液とした。なお、全ての操作は氷上で行った。本粗酵素液について、タンパク質量とα−グルコシダーゼ活性を測定したところ、８３３ｍｇのタンパク質、１９．４Ｕの酵素活性が含まれており、比活性は０．０２３Ｕ／ｍｇであった。

【0065】

前記粗酵素液５０ｍｌに１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を１ｍｌ加えることによりｐＨ５とし、２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）で平衡化されたイオン交換カラムに、以下の条件で供し、塩化ナトリウム濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ付近に溶出された画分（部分精製酵素１）を回収した。

【0066】

（条件）
カラム ： ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー株式会社製）
カラムサイズ： φ１５ｍｍ×１７０ｍｍ
ゲル量 ： ３０ｍＬ
溶出液 ： ２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５）
塩化ナトリウム濃度０ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌのリニアグラジエント
流速 ： ２ｍＬ／ｍｉｎ
溶出液量 ： １２０ｍＬ

【0067】

部分精製酵素１には２４．８ｍｇのタンパク質と、２．２Ｕの酵素活性が含まれており、比活性は０．０９０Ｕ／ｍｇであった。前記粗酵素液からの精製度は３．８倍であった。

【0068】

前記部分精製酵素１に、硫酸アンモニウムを少量ずつ加え、終濃度１．５ｍｏｌ／Ｌとした。これを１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した疎水カラムに、以下の条件で供した。そして、硫酸アンモニウム濃度１．０ｍｏｌ／Ｌ付近で溶出された画分（部分精製酵素２）を回収した。

【0069】

（条件）
カラム ： ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＢＵＴＨＹＬ−６５０Ｍ（東ソー株式会社製）
カラムサイズ ： φ１５ｍｍ×２００ｍｍ
ゲル量 ： ３５ｍＬ
溶出液 ： ２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）
硫酸アンモニウム濃度１．５ｍｏｌ／Ｌ〜０ｍｏｌ／Ｌのリニアグラジエント
流速 ： ２ｍＬ／ｍｉｎ
溶出液量 ： １２０ｍＬ

【0070】

部分精製酵素２には、７．９ｍｇのタンパク質と、１９．７Ｕの酵素活性が含まれており、比活性は２．５Ｕ／ｍｇであった。

【0071】

前記部分精製酵素２を限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ、ろ過分子量１０，０００、ミリポア社製）にて脱塩・濃縮した後、溶媒を２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）に置換した。

【0072】

脱塩・濃縮した部分精製酵素２には、６．５ｍｇのタンパク質と、７．１Ｕの酵素活性が含まれており、比活性は１．１Ｕ／ｍｇであった。脱塩・濃縮前の部分精製酵素２に比べ比活性が低下したのは、限外ろ過において、本酵素活性を活性化する一価カチオン（アンモニウムイオン等）が除去されたためと考えられる。

【0073】

当該サンプルを２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７）で平衡化したイオン交換カラムに、以下の条件で供し、塩化ナトリウム濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ付近に溶出した画分を回収（精製酵素）し、上記と同様の限外ろ過膜で脱塩・濃縮し、以後の実験に使用した。

【0074】

（条件）
カラム ： ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ（ＧＥヘルスケア社製）
カラムサイズ ： φ６．４ｍｍ×３０ｍｍ
ゲル量 ： １ｍＬ
溶出液 ： ２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）
塩化ナトリウム濃度０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌのリニアグラジエント
流速 ： ３ｍＬ／ｍｉｎ
溶出液量 ： ３０ｍＬ

【0075】

前記画分は０．９２ｍｇのタンパク質と１．１Ｕの酵素活性が含まれており、比活性は１．２Ｕ／ｍｇであった。前記粗酵素液からの精製度は５１倍、回収率は５．６％であった。この画分を１μｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。この結果を図１に示す。レーン１は分子量マーカーであり、レーン２は前記画分の結果である。図１のレーン２に示すように、１本のバンドのみが検出されたことから、前記画分において、酵素は単一に精製されていることが分かった。得られた精製酵素について、各種特性を調査した。

【0076】

下記表２に本酵素α−グルコシダーゼの精製の概要を示す。下記表２において、比活性はタンパク質１ｍｇあたりの酵素活性（Ｕ／ｍｇ）を示し、回収率は、粗酵素液の総活性に対する酵素活性の残存率（％）を示し、精製度は、粗酵素液の比活性に対する倍率（倍）を示す（以下の実施例でも同様である）。なお、疏水カラム精製後の酵素(工程３)の比活性及び精製度が高いのは、溶出液中に含まれる硫酸アンモニウムの影響によるものと考えられる。

【0077】

【表2】

【0078】

＜実施例２：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定＞
実施例１の方法で得た精製α−グルコシダーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、サイズマーカーと比較して分子量を測定したところ、本発明のα−グルコシダーゼは分子量５８，０００±２０００ダルトンであった（図１）。

【0079】

＜実施例３：至適ｐＨおよびｐＨ安定性評価＞
実施例１の方法で得た精製α−グルコシダーゼを用いて、酵素活性および酵素安定性におよぼすｐＨの影響を調べた。本酵素の活性測定時に用いる反応緩衝液を４０ｍｍｏｌ／Ｌのブリトン・ロビンソン緩衝液（ｐＨ３〜１２）に置き換えることにより、至適ｐＨを求めた。最も高い活性を示したｐＨにおける活性を１００（％）とし、各ｐＨにおける相対活性を算出した。ｐＨ安定性は、１０ｍｍｏｌ／Ｌのブリトン・ロビンソン緩衝液（ｐＨ３〜１２）および０．３６ｍｇ／ｍｌの精製酵素からなる溶液を４℃にて２４時間インキュベートした後、活性測定を行った。最も高い活性を示したｐＨにおける活性を１００（％）とし、各処理ｐＨにおける残存活性（％）を算出した。

【0080】

これらの結果を図２に示した。図２において、横軸はｐＨであり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は相対活性（至適ｐＨ）の結果、白丸（○）は残存活性（ｐＨ安定性）の結果を示す。図２に示すように、本発明におけるＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｈ１１株由来のα−グルコシダーゼの至適ｐＨは６〜８の範囲であった。また、ｐＨ５．５〜１２の範囲で、残存活性６５％以上であった。

【0081】

＜実施例４：至適温度および温度安定性評価＞
実施例１で得た精製α−グルコシダーゼを用いて至適温度および温度安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液を４〜６０℃の各温度に１５分間保持した後、活性測定を行うことにより求めた。最も高い活性を示した温度における活性を１００（％）とし、各保管温度における残存活性（％）を算出した。至適温度は、４〜６０℃の各温度で活性測定を行うことにより求めた。最も高い活性を示した温度における活性を１００（％）とし、各温度における相対活性を算出した。

【0082】

これらの結果を図３に示した。図３において、横軸は温度であり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は相対活性（至適温度）の結果、白丸（○）は残存活性（温度安定性）の結果を示す。図３に示すように、本発明におけるＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｈ１１株由来のα−グルコシダーゼの至適温度は、２０℃〜３５℃であり、温度安定性は４℃〜４５℃であることがわかった。

【0083】

さらに、アンモニウムイオン１０ｍｍｏｌ／Ｌ存在下で至適温度を調べた。その結果を図４に示した。図４から明らかなように、本発明のα−グルコシダーゼは、硫酸アンモニウム１０ｍｍｏｌ／Ｌ存在下で、至適温度が２５〜４５℃になることが判明した。

【0084】

＜実施例５：基質特異性評価＞
各基質溶液（４ｍｍｏｌ／Ｌ）としてα−結合からなる各種グルコオリゴ糖（マルトース、イソマルトース（東京化成工業製）、トレハロース（日本食品化工製）、ニゲロース（和光純薬工業製）、コージビオース（和光純薬製）、マルトトリオース（日本食品化工製）、マルトテトラオース（生化学工業製）、マルトペンタオース（生化学工業製）およびマルトヘキサオース（生化学工業製））、スクロース（関東化学製）、メチル−α−Ｄ−グルコシド（田岡化学製）、ｐＮＰＧ（シグマ社製）及び可溶化澱粉（ナカライテスク製）を基質とし、酵素添加量０．７２μgにて通常の活性測定法と同様に活性測定を行っ
た。ただし、可溶化澱粉に関しては基質濃度を１ｗ／ｖ％とし、ｐＮＰＧに関しては基質濃度を２ｍｍｏｌ／Ｌとし、１ｍｏｌ／Ｌの炭酸ナトリウム水溶液を反応容量の２倍量添加することにより反応を停止した。マイクロプレートリーダーにて波長４０５ｎｍの吸光度を測定することにより遊離のｐ−ニトロフェノール濃度を求め、１分間に１μｍｏｌのｐＮＰＧを加水分解する活性を１Ｕとした。標準曲線の作成には、ｐ−ニトロフェノール（和光純薬製）０〜０．２ｍｍｏｌ／Ｌを使用した。

【0085】

表３に、マルトースに対する加水分解活性を１００％としたときのその他の基質に対す
る分解活性を相対値（％）で示した。表３から明らかなように、本発明におけるα−グルコシダーゼは、イソマルトース、トレハロース、ニゲロース、コージビオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、メチルグルコシドおよび可溶性澱粉を実質的に加水分解しないことが判明した。
一方、スクロースに対して約３３％、ｐＮＰＧに対して約７７％の相対活性を示した。

【0086】

【表3】

【0087】

＜実施例６：酵素活性におよぼす各種イオンの影響＞
実施例１の方法で得た精製α−グルコシダーゼを用いて、酵素活性におよぼす各種イオンの影響を調べた。ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ・６Ｈ₂Ｏ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ₂、ＭｎＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、ＦｅＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、ＣｕＣｌ、ＺｎＣｌ₂、Ｒ
ｂＣｌ、ＡｇＮＯ₂、ＣｓＣｌおよびＮＨ₄Ｃｌまたは（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄（全て関東化学製
）をカチオン濃度として２００ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう純水に溶解し、各種カチオン水溶液を調製した。各種カチオン水溶液を酵素反応液中のカチオン濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう添加し、ｐＨ７、３０℃において酵素活性を測定した。カチオン無添加における酵素活性を１００（％）とし、各種カチオン１０ｍｍｏｌ／Ｌ存在時の相対酵素活性（％）を算出した。結果を表４に示す。

【0088】

【表4】

【0089】

表３から明らかなように、カチオン非存在下と比較しＫ⁺、Ｒｂ⁺、ＮＨ₄⁺、Ｃｓ⁺、Ｌ
ｉ⁺およびＮａ⁺の存在下にて相対活性が上昇し、それぞれ５９２％、５６４％、５０３％、３１９％、１５１％および１１６％となった。反対に、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｃｏ²⁺およびＺｎ²⁺においてはそれぞれ３０、２０、１および０％に低下した。以上より、本発明におけるα−グルコシダーゼは、一価のアルカリ金属イオンおよびアンモニウムイオンにより活性化されることが判明した。

【0090】

カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオンおよびアンモニウムイオン０．００１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ存在下において、それぞれ活性測定を行い、カチオン濃度の酵素比活性に及ぼす影響を調べた。結果を図５に示す。

【0091】

図５から明らかなように、各カチオン濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌにおいてそれぞれの活性化効果はほぼ飽和に達し、それ以上の濃度においても酵素の比活性は殆ど変化しなかった。また、カチオン０．００１ｍｍｏｌ／Ｌの存在下においても活性化が認められた。以上のことから、本酵素を十分に活性化するためにはカチオン濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上が好ましいが、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ程度でも効果があることが明らかとなった。

【0092】

＜実施例７：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実施例１の方法で得た精製α−グルコシダーゼを用いて、本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサーモデルＰｒｏｃｉｓｅ ４９２ｃＬＣ（アプライドバイオシステムズ製）により解析したところ、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜２０、すなわち、ＭＱＤＮＭＭＷＷＲＧＧＶＩＹＱＩＹＰＲＳであることが判明した。

【0093】

＜実施例８：遺伝子配列の同定＞
（ゲノムの調製）
実施例１で示した培地１０ｍＬに、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｈ１１株のグリセロールストックを接種し、３７℃、１５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養液を１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに１ｍＬずつ分注し遠心分離（４℃、１４，０００ｒｐｍ、２分間）し上清を取り除いた。５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（生化学工業製）、ＴＥ（ｐＨ８）溶液をチューブ１本当たり３５０μＬ添加し、３７℃にて１時間保持した。１０％ＳＤＳ溶液を５０μＬ添加し転倒混和し３７℃にて３０分間保持した。ＴＥ飽和フェノールを４００μＬ添加し穏やかに転倒混和した後遠心分離（室温、１４，０００ｒｐｍ、５分間）した。上層を新たなエッペンドルフチューブに移した後、フェノールクロロホルム溶液を４００μＬ添加し穏やかに転倒混和し、上記と同様に遠心分離した。それぞれの上層を一つのエッペンドルフチューブに移し、３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム水溶液および９５（ｖ／ｖ％）冷エタノールを、それぞれ溶液の１／１０容量および２倍容量添加し遠心分離（４℃、１４，０００ｒｐｍ、１５分間）した。得られた沈殿物を７０％エタノールにてリンス洗浄し風乾した。０．２ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ／ＴＥ溶液を４００μＬ添加し、３５℃にて３０分間保持した。フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿法を上記と同様に行い、乾燥させた沈殿物をＴＥ１００μＬに溶解し、ゲノム溶液とした。

【0094】

（Ｎ末端配列にもとづいたＤＮＡプライマーの合成）
実施例７において示された本発明のα−グルコシダーゼにおけるＮ末端アミノ酸配列に基づき、第１から８番目のアミノ酸残基に対応する、５´−ＡＴＧＣＡＲＧＡＹＡＡＹＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧ−３´（以下、「ＰＦＧ−Ｆ１Ａ−８Ｇ」と表記する）（配列番号５）、および第５番目から１１番目のアミノ酸に対応する５´−ＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＮＧＧＮＧＧ−３´（以下、「ＰＦＧ−５Ａ−１１Ｇ（ＣＧＮ）」と表記する）（配列番号６）で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成した。なお、塩基配列におけるＮはＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの混合塩基を示す。以下同じ。

【0095】

（カセットＰＣＲによる配列決定）
Ｔａｋａｒａ ＬＡ ＰＣＲ^TM ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を使用し、遺伝子配列を決定した。前記で調製したゲノムを、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩ（いずれもタカラバイオ製）で処理し、キット付属のカセットＤＮＡに連結させた。

【0096】

１ｓｔ ＰＣＲのプライマーとして、表５に示したＰＦＧ−Ｆ１Ａ−８Ｇとｃａｓｓｅｔｔｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｃ１ｓのセット、ＰＦＧ−Ｆ´１とｃａｓｓｅｔｔｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｃ１ｓのセット、およびＰＦＧ−Ｒ´３とｃａｓｓｅｔｔｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｃ１ｓのセットを使用した。この際、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ ｐｌｕｓ ｖｅｒ．
２（東洋紡製）またはＥｘ Ｔａｑ（タカラバイオ製）を用いたこと以外は添付説明書に従い行った。２ｎｄ ＰＣＲでは、各１ｓｔ ＰＣＲの反応液を水で１０倍希釈したもの１μＬを鋳型とし、プライマーとしてそれぞれＰＦＧ−５Ａ−１１Ｇ（ＣＧＮ）とｃａｓｓｅｔｔｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｃ２ｓのセット、ＰＦＧ−Ｆ´２とｃａｓｓｅｔｔｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｃ２ｓのセット、およびＰＦＧ−Ｒ´２とｃａｓｓｅｔｔｅ ｐｒｉｍｅｒ
Ｃ２ｓのセットを使用した。この際、ＤＮＡポリメラーゼとしてＥｘ Ｔａｑを使用したこと以外は添付説明書に従った。

【0097】

２ｎｄ ＰＣＲで増幅の認められた各断片を市販のキット（ＧＥヘルスケア製、商品名『ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ^TM ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ』、以後、「ＧＦＸ」と表記する）にて精製した。精製した増幅断片を市販のライゲーションキット（タカラバイオ製、商品名『ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ）』）を用いてＴベクター（プロメガ製、『ｐＧＥ
Ｍ Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ』）に連結させた。上記ライゲーション反応液で通常のコンピテントセルＤＨ５αをヒートショック法により形質転換した。それを５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）および２μｇ／ｍＬ Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドシル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢプレートに塗布し３７℃で静置培養した。得られた白色コロニーを無作為につまようじで一掻きし、減菌水３０μＬに懸濁し、そのうち１μＬをコロニーＰＣＲの鋳型とした。コロニーＰＣＲは、表４に示したプライマーｐＧＥＭ−ｕｐ−ＦおよびｐＧＥＭ−ｄｎ−Ｒのセットを使用し、ＤＮＡポリメラーゼとしてＥｘ Ｔａｑを使用し２０μＬの系で行った。９４℃に２分間保持し、９４℃に３０秒間、５５℃に３０秒間、７２℃に２分間からなるプログラムを３０回繰り返し、最後に７２℃に３分間保持した。増幅バンドが認められたものに関してＰＣＲ反応液を上記と同様にＧＦＸにて精製した。
これを鋳型として表５に示したシーケンシング用プライマー（ＰＦＧ−Ｆ´３〜Ｆ´６、ＰＦＧ−Ｒ´１、Ｒ´３）で適宜シーケンス反応させ配列解析に供した。シーケンス反応はＤＴＣＳ ｗｉｔｈ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（ベックマン・コールター製）を用い、操作は添付のプロトコルに従った。

【0098】

【表5】

【0099】

上記カセットＰＣＲにおいては、ＳａｌＩ−カセットを鋳型とした２ｎｄ ＰＣＲにおいて、約５００ｂｐの増幅断片が認められた。この断片を上記記載の方法にてＴベクターに連結させ、大腸菌を形質転換した後、定法に従いプラスミドを調製した。これを鋳型として、表５記載のオリゴヌクレオチドｐＧＥＭ−ｕｐ−ＦおよびｐＧＥＭ−ｄｎ−Ｒにてシーケンス解析したところ、５´−ＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＮＧＧＮＧＧ−３´（配列番号６）を含む塩基配列が含まれていた。また、含まれていた配列をアミノ酸に翻訳したところ、実施例７において明らかとなった、本発明のＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｈ１１株のα−グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列中の４番目から２０番目のアミノ酸
配列（配列番号２の４〜２０番目のアミノ酸配列）であるＭＭＷＷＲＧＧＶＩＹＱＩＹＰＲＳと一致した。このことから、本塩基配列が、本発明のα−グルコシダーゼに対応する遺伝子の一部であることが明らかとなった。その塩基配列を基に、表５に示すオリゴヌクレオチドＰＦＧ−Ｆ´１、ＰＦＲ−Ｆ´２、ＰＦＧ−Ｆ´３、ＰＦＧ−Ｒ´１、ＰＦＲ−Ｒ´２およびＰＦＧ−Ｒ´３を合成した。

【0100】

ＰｓｔＩ−カセットを鋳型として、ＰＦＧ−Ｆ´１とｃａｓｓｅｔｔｅ ｐｒｉｍｅｒ
Ｃ１ｓのセットおよびＰＦＧ−Ｒ´３とｃａｓｓｅｔｔｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｃ１ｓのセットで１ｓｔ ＰＣＲを行った。そのＰＣＲ産物を鋳型として、それぞれＰＦＧ−Ｆ´２とｃａｓｓｅｔｔｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｃ２ｓのセットおよびＰＦＧ−Ｒ´２とｃａｓｓｅｔｔｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｃ２ｓのセットで２ｎｄ ＰＣＲを行ったところ、それぞれ約２．５ｋｂｐおよび約１．５ｋｂｐの増幅断片が認められた。上記方法に従い、これらのＤＮＡ断片のシーケンス解析を行ったところ、本発明におけるα−グルコシダーゼ遺伝子のＤＮＡ配列は、配列番号１に示す配列であることが明らかとなった。配列番号１に示すＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列は、配列番号２に示す配列である。

【0101】

＜実施例９：形質転換体の作製＞
実施例８で調製したＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｈ１１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表６に記載のクローニング用オリゴヌクレオチド、ＰＦＧ−Ｆ−ＮｄｅＩおよびＰＦＧ−Ｒ−ＸｈｏＩを用いてα−グルコシダーゼをクローニングした。すなわち、鋳型１００ｎｇ、１０×ＫＯＤ ｖｅｒ．２ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ５μＬ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭgＳＯ₄ ３μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌのプライマー溶液
各１ｍＬ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １μＬを混合し、水で５０μＬにメスアップした。ＰＣＲ条件は以下の通りである。９４℃に２分間保持した後、９４℃に３０秒間、５５℃に３０秒間、７２℃に２分間からなるサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃に３分間保持した。このうち４μlを電気泳動に供し、約１．５ ｋｂの増幅断
片を確認した。当該断片をＧＦＸにて精製した。これを、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（いずれもタカラバイオ製）で酵素処理し、ＧＦＸにて精製した。本ＤＮＡ断片を、上記と同様にＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで制限酵素処理したｐＥＴ２２ｂ(ノバジェン製)に、通常のライゲーション反応にて連結させ発現用プラスミドを作製した。プラスミドの調製には、ＤＨ５αを使用し、表６に示したシーケンス解析用オリゴヌクレオチドにてクローニングが正しく行われていることを確認した。以上のようにして作製したプラスミドを『ｐＥＴ２２ｂ−ＰＦＧ』と命名した。

【0102】

【表6】

【0103】

＜実施例１０：形質転換体によるα−グルコシダーゼの産生＞
上記ｐＥＴ２２ｂ−ＰＦＧで、ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ ＲＩＬ（ノバジェン製）を形質転換した。
５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地３ｍＬに、上記形質転換体を接種し、３７℃で一晩前培養した。このうち１ｍＬを６００ｍＬの同培地に接種し、３７℃で３時間培養した。それを氷冷し、０．１ｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧを６００μＬ添加した。これを１６℃で２４時間回転振盪培養した。得られた培養物を、定法に従い、遠心分離して菌体を回収した。菌体を２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）約４０ｍＬに懸濁して、実施例１に示した方法にて超音波破砕した。これを遠心分離した上清を粗酵素液とした。

【0104】

粗酵素液のα−グルコシダーゼ活性を、通常の活性測定法および系内に２０ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸アンモニウムを含んだ活性測定法により測定した。その結果、前者および後者において、それぞれ１．６７Ｕ／ｍｌおよび１６．２Ｕ／ｍｌのα−グルコシダーゼ活性が認められた。このことから、アンモニウムイオンにより活性化される特徴を有した、本発明におけるα−グルコシダーゼが形質転換体により産生されていることが明らかとなった。

【0105】

上記で得た粗酵素液を、さらに実施例１に示した方法に準じて、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍゲル、ブチルトヨパール６５０Ｍゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、さらにこの精製酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量５８，０００±２，０００ダルトンの単一バンドが認められた。本組換え酵素の理化学的性質は実質的に実施例１で精製された野生株由来の精製酵素と同一であった。なお、アンモニウムイオンによる活性化率が野生株由来の精製酵素と若干異なったことは、酵素失活および緩衝液の構成成分からなるナトリウムイオンの影響であるものと考えられた。本精製酵素を以後、精製ｒＰｆＧと表記することがある。

【0106】

＜実施例１１：粗酵素によるグリセロールの配糖化＞
２０ｗ／ｖ％マルトース、２０ｗ／ｖ％グリセロール、５ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムおよび２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）を含む溶液において、α−グル
コシダーゼ活性として１．５Ｕ／ｇマルトースとなるように、実施例１の方法にて調製した粗酵素液を添加し反応液量１ｍＬとした。４０℃にてインキュベートし、２週間後にサンプリングした。また、対照として、特許文献４（特開平１１−２２２４９６号公報）に記載された方法に準じてＡｓｐｅｒｇｅｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のα−グルコシダーゼを用いた反応を行った。すなわち、３０ｗ／ｖ％マルトース、３０ｗ／ｖ％グリセロール、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を含む溶液に２．５Ｕ／ｇマルトースとなるようにトランスグルコシダーゼアマノ（アマノエンザイム製、以下、「ＴＧアマノ」と表記することがある）を添加し４０℃にて２週間反応させた。各反応溶液を熱失活させ、５ｗ／ｖ％程度に希釈し、イオン交換樹脂（アンバーライト ＭＢ４、オルガノ製）により脱塩、フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＨＰ φ１３ｍｍ、膜孔０．４５μｍ、ミリポア製）でろ過した後、以下のＨＰＬＣ条件にて測定した。なお、得られたＨＰＬＣピーク面積比をそのサンプル中の固形分重量比とみなした。

【0107】

（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム ： Ｕｌｔｒｏｎ ＰＳ−８０Ｎ．Ｌ （φ８．０×５００ ｍｍ）、信和化工製
溶媒 : 純水
流速 : ０．９ ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度 ： ５０℃
注入量 : １０μＬ
検出器 : 示差屈折計

【0108】

その結果、本発明におけるα−グルコシダーゼの粗酵素における反応溶液において、反応前には見られなかった溶出時間１１．１分付近の生成物（生成物Ｘ）が３２．９％含まれていた。本生成物Ｘは、特許文献４で示される方法（本実施列の対照実験）で生成したα−Ｄ−グルコピラノシル−グリセロール（以下、「グルコシルグリセロール」と表記する）と同溶出時間の物質であった。

【0109】

そこで、上記と同様のＨＰＬＣ条件にて５ｗ／ｖ％の各サンプルを９９μＬ注入し、注入後１０〜１２分間に検出器の出力ラインから２０秒毎に溶離液を分取した。それを３〜５セット繰り返し、分取した画分の糖組成を同条件にて分析した。溶出時間１１．１分の物質純度が９０％以上の画分を回収しスピードバック遠心濃縮機にてＢｒｉｘ１０程度まで濃縮した。当該サンプル５μＬにＴＭＳＩ−Ｃ（ＧＬサイエンス製）を５００μＬ添加し、６０℃にて１０分間保持したものを試料として、特許文献４記載の方法と同様の条件でガスクロマトグラフ（ＧＣ）分析した。

【0110】

その結果、物質Ｘは、ＧＣ分析においても対照実験で調製したグルコシルグリセロールと同溶出時間に検出され、対照と同様の、３つの異性体ピークが検出された。以上より、物質Ｘは、トランスグルコシダーゼアマノにより生成されるものと同様のグルコシルグリセロールであることが明らかとなった。また、本発明のα−グルコシダーゼにより生成したグルコシルグリセロールの異性体割合を、ＧＣによるピーク面積比より算出したところ、２−Ｏ−α−Ｄ-グルコシルグリセロール：（２Ｒ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコシルグ
リセロール：（２Ｓ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコシルグリセロールは１０：５２：３８であった。

【0111】

一方、上記ＨＰＬＣ条件において、反応液の固形分組成を分析したところ、表７に示すように、全固形分に占めるグルコシルグリセロールの割合は３２．９％であり、副生成物のグルコース（Ｇ１）および重合度３のオリゴ糖（Ｇ３）がそれぞれ２６．３％および０．７％であった。トランスグルコシダーゼアマノにおける反応溶液においては、上記成分の割合はそれぞれ、２４．９％、２５．４％および７．２％であった。なお、以下の高純
度化の実験結果から、これらの重合度２のオリゴ糖（Ｇ２）およびＧ３には分岐糖（イソマルトース、パノースおよびイソマルトトリオース）が含まれていることが示唆された。

【0112】

このことから、本発明におけるα−グルコシダーゼを用いた配糖化反応においては、重合度３のオリゴ糖を実質的に生成しないことがわかった。また、グルコシルグリセロールの生成効率を表すグルコシルグリセロール／グルコース値は、１．２５であった。本数値は、トランスグルコシダーゼアマノを使用したときの０．９８よりも、優れていた。粗酵素液を使用した反応溶液の、その他の占める成分は粗酵素液に含まれる残渣であった。したがって、本発明におけるα−グルコシダーゼは、既知酵素よりもグリセロールを効率的に配糖化可能であることに加え、目的の配糖体の収量が多く、さらには粗酵素液中に含まれる夾雑タンパク質は配糖化反応に全く悪影響を及ぼさないことが示され、粗酵素であっても配糖化反応に使用可能であることが明らかとなった。

【0113】

表７中におけるＧ１はグルコース、Ｇｌｃ−Ｇｌｙはグルコシルグリセロール、Ｇ２はマルトースおよびイソマルトースの総量、Ｇ３はマルトトリオース、パノースおよびイソマルトトリオースの総量のことを言う。

【0114】

【表7】

【0115】

さらに、上記反応物を、グルコアミラーゼ処理工程を経ずに、高純度化可能かを検討した。すなわち、上記反応物を水でＢｒｉｘ２０に希釈し、固形分１ｇあたり１ｇとなるように酵母（ダイヤイーストＹＳＴ，協和発酵フーズ製）を添加した。これを３０℃で１５時間インキュベートした。煮沸して酵母を死滅させ、発酵により生じたエタノールをエバポレーターにより除去した後、通常の分析と同様に脱イオンおよびフィルターろ過して上記と同様のＨＰＬＣ分析に供した。なお、この際に使用する酵母は、特に制限されず、一般的なパン酵母、醸造用酵母ならびに実験用酵母等、グルコースを資化するものであれば何を用いてもよい。

【0116】

その固形分分析結果を表８に示す。表８から明らかなように、両反応液において、酵母がグルコースを消費し、本発明におけるα−グルコシダーゼおよびトランスグルコシダーゼアマノの反応液においてグルコース含量がそれぞれ０．８％および０．５％に減少した。一方、酵母の発酵によりグリセロールが生じたため、反応前（表７）と比較してグリセロール含量が増加した。一方、Ｇ２およびＧ３含量は、本発明におけるα−グルコシダーゼを用いた場合はそれぞれ１．２％および０．６％と低いのに対して、トランスグルコシダーゼアマノの場合は、生じた副産物の分岐糖が酵母により資化されないため、それぞれ５．６％および１０．０％と高い値を示した。目的生成物のグルコシルグリセロールは、前者においては後者の１．４倍であった。このことから、本発明におけるα−グルコシダーゼを使用することにより、副産物のオリゴ糖を除去するグルコアミラーゼ処理を要さず、さらには、酵母または適当方法によりグルコースおよびＧ２を除去することにより目的
配糖体がより容易に高純度化可能であることがわかった。それぞれのその他に占める成分は、酵素溶液および酵母由来の高分子であった。

【0117】

【表8】

【0118】

本発明におけるα−グルコシダーゼを用いて配糖化反応を行い、続いて、例えば上記のように酵母処理を施した反応液には、従来、例えばオリゴ糖の分離に一般的に用いられるＮａまたはＣａフォーム等のクロマト分離用陽イオン交換クロマトグラフィーや、膜分画等で目的配糖体との分離が困難であるとされるＧ１、Ｇ２およびＧ３が実質的に含まれていないために、然る分離手段を選択することにより、従来法よりも容易に高純度化可能であることが期待できる。さらには、Ｇ１、Ｇ２およびＧ３が実質的に含まれていないゆえに目的配糖体の含量が多い。

【0119】

実施例１と同様の方法にて調製したＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ａ８株およびＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ａ１０株の粗酵素においても、本実施例に示される方法によりグリセロールの配糖化を試みた。Ｈａｌｏｍｏｎａｓ Ａ８株およびＡ１０株の粗酵素添加量をマルトース１ｇに対してそれぞれ０．０７Ｕおよび０．１Ｕとした以外の反応条件は上記と同様である。反応４日後の糖組成を表９に示す。

【0120】

表９から明らかなように、いずれの粗酵素においてもＧｌｃ−Ｇｌｙが生成し、Ｇ３が実質的に生成されていなかった。なお、これらＡ８及びＡ１０株においてマルトース（Ｇ２）が消費されきれなかったのは、粗酵素中の酵素活性が低かったことから、反応が十分に進まなかったことが原因であると考えられた。酵素量と反応時間には密接な関係があることから、適切に反応させることによりＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｈ１１株の粗酵素のものと同等の反応を行うことが可能であると考えられる。なお、Ａ８及びＡ１０株の反応溶液共に、その他の占める成分は粗酵素液に含まれる残渣であった。

【0121】

【表9】

【0122】

さらに、グリセロールは、グルコシルグリセロールと全く異なる分子量であることから
、上記のような分離手段を用いれば容易に目的配糖体と分離可能である。したがって、本実施例に示したような、グルコシルグリセロールの製造においては、グリセロールを含む画分を回収して、糖転移反応の受容体として繰り返し使用することが可能である。

【0123】

＜実施例１２：各種α−グルコシダーゼによるグリセロールの配糖化能比較＞
各種α−グルコシダーゼによるグリセロールの配糖化能を比較した。２０ｗ／ｖ％マルトース、２０ｗ／ｖ％グリセロール、０または５ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム（硫安）および４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）を含む溶液において、α−グルコ
シダーゼ活性として１Ｕ／ｇマルトースとなるように、実施例１０の方法にて調製した精製組換え酵素（精製ｒＰｆＧ）を添加し反応液量１ｍＬとした。対照として、トランスグルコシダーゼアマノおよびテイスターゼの反応では上記と同様の基質濃度、０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムおよび４０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）とし、アクレオニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．）由来のα−グルコシダーゼ（テイスターゼ、キリン製）の反応では緩衝液をＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）としたこと以外は上記と同様である。これらを４０℃にてインキュベートし、実施例１１と同様にＨＰＬＣ条件で糖組成を分析した。

【0124】

反応１７時間目における各反応溶液の糖組成を表１０に示す。表中の数値はＨＰＬＣ分析における面積（％）を表し、−は検出限界以下であることを表す。

【0125】

【表10】

【0126】

上記表１０から明らかなように、精製ｒＰｆＧによる反応においては、反応１７時間後においてトランスグルコシダーゼアマノまたはテイスターゼよりもＧｌｃ−Ｇｌｙの生成量が多いことが明らかとなった。さらに、硫酸アンモニウムを５ｍｍｏｌ／Ｌ（０．６７５ｇ／Ｌ）となるように添加した反応系においては、無添加のときと比較してＧｌｃ−Ｇｌｙの生成量が多いことが明らかとなった。また、反応４８時間までの糖組成の経時変化をとったところ、硫酸アンモニウムの添加によりＧｌｃ−Ｇｌｙの生成反応が促進されることが明らかとなった（図６）。

【0127】

＜実施例１３：エタノールの配糖化＞
２０ｗ／ｖ％マルトース、１０ｖ／ｖ％エタノール、５ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムおよび２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）を含む溶液において、α−グルコ
シダーゼ活性として１．０Ｕ／ｇマルトースとなるように、実施例１０の方法にて調製した精製ｒＰｆＧを添加し、純水で反応液量１ｍＬとした。４０℃にてインキュベートし、１週間後にサンプリングした。また、対照として、特許文献５（特開２００２−１７３９
５号公報）に記載された方法に準じてＡｓｐｅｒｇｅｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のα−グルコシダーゼを用いた反応を行った。すなわち、上記と同様のマルトースおよびエタノール濃度で、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を含む溶液に１.０Ｕ／ｇ
マルトースとなるようにトランスグルコシダーゼアマノ（アマノエンザイム製）を添加し４０℃にてインキュベートした。上記と同様に、1週間後にサンプリングした。各反応溶
液を熱失活させ、水で１０倍希釈し、イオン交換樹脂（アンバーライト ＭＢ４、オルガノ製）により脱塩、フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＨＰ φ１３ｍｍ、膜孔０．４５μｍ、ミリポア製）でろ過した後、以下のＨＰＬＣ条件にて分析した。標品として１ｗ／ｖ％のエチル−α−Ｄ−グルコシド（和光純薬製、以下、「エチルグルコシド」と表記する）を同様に分析した。

【0128】

（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム ： Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−４２Ａ （φ７．８×３００ ｍｍ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製
溶媒 : 純水
流速 : ０．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度 ： ７５℃
注入量 : １０μＬ
検出器 : 示差屈折計

【0129】

反応液のＨＰＬＣ分析結果を表１１に示した。表中の数値はＨＰＬＣ分析における面積（％）を表し、−は検出限界以下を表す。

【0130】

【表11】

【0131】

本発明におけるα−グルコシダーゼの精製ｒＰｆＧにおける反応溶液において、反応前には見られなかった溶出時間２１分付近の生成物が１５．０％含まれていた。本生成物は、標品のエチルグルコシドと同溶出時間であり、エタノールの水酸基はひとつであることから、本生成物はエチルグルコシドであると判断した。また、本反応において、副生したＧ３は０．７％であり、実質的に生成されていないことが明らかとなった。
一方、トランスグルコシダーゼアマノによる本実施列の対照実験においては、エチルグルコシドのピークは目視において認められたものの、機器の検出限界以下であった。また、Ｇ２およびＧ３（面積（％））は、それぞれ２６．８％および２９．８％と高かった。

【0132】

以上より、本発明におけるα−グルコシダーゼを用いてエタノールを配糖化することによれば、既存技術よりもエチルグルコシドを効率的に調製可能であり、さらに、オリゴ糖を分解する工程を経ることなく、実施例１１に示したような方法または特許文献５で示さ
れるようなグルコースオキシダーゼによりＧ１を除去し、エタノールを適当な蒸留装置により除去することにより、エチルグルコシドをより高純度化可能であることが期待できる。この際、エタノールを含む成分を冷却し回収すれば、それをリサイクルすることが可能である。

【0133】

さらに、前記実施例１１に記載した方法のように、エタノールを除去した後、さらに適当な分画操作を経ることにより、より高度に目的成分を高純度化することが可能である。

【0134】

＜実施例１４：各種α−グルコシダーゼによるエタノールの配糖化＞
各種α−グルコシダーゼによるエタノールの配糖化能を比較した。２０ｗ／ｖ％マルトース、１０ｖ／ｖ％エタノール、０または５ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムおよび４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）を含む溶液において、α−グルコシダーゼ活性
として１Ｕ／ｇマルトースとなるように、実施例１０の方法にて調製した精製ｒＰｆＧを添加し反応液量１ｍＬとした。対照として、トランスグルコシダーゼアマノおよびテイスターゼの反応では上記と同様の基質濃度、０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムおよび４０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）とし、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼ（テイスターゼ、キリン製）の反応では緩衝液をＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）としたこと以外は上記と同様である。これらを４０℃にてインキュベートし、実施例１３と同様にＨＰＬＣ条件で糖組成を分析した。
４８時間後の糖組成を表１２に示す。表中の数値はＨＰＬＣ分析における面積（％）を表し、−は検出限界以下であることを表す。

【0135】

【表12】

【0136】

上記表１２から明らかなように、精製ｒＰｆＧによる反応においては、反応４８時間後においてトランスグルコシダーゼアマノまたはテイスターゼよりもエチルグルコシドの生成量が多いことが明らかとなった。さらに、硫酸アンモニウムを５ｍｍｏｌ／Ｌ（０．６７５ｇ／Ｌ）となるように添加した反応系においては、無添加のときと比較してエチルグルコシドの生成量が多いことが明らかとなった。以上より、硫酸アンモニウムの添加によりエチルグルコシドの生成反応が促進されることが明らかとなった（図７）。

【0137】

＜実施例１５：各種糖受容体に対する配糖化＞
本発明におけるα−グルコシダーゼが、ハイドロキノン、Ｌ−メントール、プロピレングリコール、１−プロパノール、２−プロパノールおよびアスコルビン酸に対して糖転移可能か否かを調べた。すなわち、上記各受容体１〜５ｗ／ｖ％、マルトース１０ｗ／ｖ％
、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）および５ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムの系に、実施例１０で精製したｒＰｆＧを１Ｕ／ｇマルトースとなるよう添加した。コントロールとして、酵素の代わりに水を添加したものを調製した。３０〜４０℃にて２４〜７２時間反応させ、アスコルビン酸以外の生成物に関してはＴＬＣにて確認した。ＴＬＣは、ハイドロキノンの反応液には１−ブタノール：エタノール：水＝５：３：２（ｖ／ｖ）、Ｌ−メントールの反応液にはクロロホルム：メタノール：水＝６：４：１（ｖ／ｖ）、その他の反応液には１−ブタノール：２−プロパノール：水＝２：２：１（ｖ／ｖ）を展開溶媒として使用した。１０ｗ／ｖ％硫酸／メタノール溶液を噴霧しオーブンで加熱することにより、糖組成を確認した。アスコルビン酸の生成物は以下のＨＰＬＣ条件において確認した。

【0138】

（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム ： Ｗａｋｏｐａｋ−ＷＴ−Ｂ−３０ （φ１０ｍｍ×３００ ｍｍ）、和光純薬製
溶媒 : ７０ｐｐｍ硝酸／水
流速 : ０．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度 ： ３０℃
検出器 : 示差屈折計およびＵＶ検出器（検出波長２３８ｎｍ）

【0139】

その結果、ハイドロキノン、Ｌ−メントール、プロピレングリコール、１−プロパノール、２−プロパノールの反応溶液において、反応前溶液およびコントロールには見られないスポット、すなわち生成物が確認された。また、アスコルビン酸の反応溶液においては、Ｌ−アスコルビン酸とは異なる溶出時間に波長２３８ｎｍに吸光ピークを有する生成物が現れた。なお、Ｌ−アスコルビン酸は、波長２３８ｎｍに吸光ピークを有する。このことから、本発明におけるα−グルコシダーゼは、ハイドロキノン、Ｌ−メントール、プロピレングリコール、１−プロパノール、２−プロパノールおよびアスコルビン酸に対しても糖転移反応を起こすことが明らかとなった。本結果および実施例１１〜１４の結果に基づき、本発明のα―グルコシダーゼにより配糖化可能な糖受容体を表１３に纏めた。表中の白丸（○）は生成物が認められたことを意味する。

【0140】

【表13】

【0141】

上記結果より、本発明におけるα−グルコシダーゼは少なくともグリセロール、エタノール、ハイドロキノン、Ｌ−メントール、プロピレングリコール、１−プロパノール、２−プロパノールおよびアスコルビン酸の配糖体製造に利用可能であることが明らかとなった。

【0142】

＜実施例１６：Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ａ８株由来α−グルコシダーゼの精製および組換え酵素の調製＞
実施例１と同様の方法にて、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ａ８株からα−グルコシダーゼを精製し、実施例７と同様の方法にて精製酵素のＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｈ１１株と同様の配列、すなわち、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜２０、ＭＱＤＮＭＭＷＷＲＧＧＶＩＹＱＩＹＰＲＳであることが判明した。そこで、さらに、実施例８と同様の方法により、α−グルコシダーゼをコードする遺伝子配列を同定したところ、配列表の配列番号３に示すＤＮＡ配列であることが明らかとなった。配列番号３に示すＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列は、配列番号４に示す配列である。

【0143】

＜実施例１７：Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ａ８株由来α−グルコシダーゼの諸性質の検討＞
実施例９の方法と同様に組換え酵素を大腸菌により調製し、精製した。以後、本精製酵素を用いて、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ａ８株のα−グルコシダーゼの諸性質を調べた。

【0144】

実施例２〜６と同様の方法で、実施例１６で精製した組換え酵素の諸性質を調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、本酵素の分子量は５８０００±２０００であった（図８：レーン１は分子量マーカー、レーン２は本酵素の結果）。至適ｐＨは５〜８．５であった（図９：白丸（○））。ｐＨ５．５〜９．５で安定であった（図９：白三角（△））。
至適温度は、カチオン無添加においては１５〜３０℃であり（図１０：白丸（○））、５ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム存在下においては１５〜３５℃であった（図１１：白三角（△））。また、４０℃以下で安定であった（図１０：白三角（△））。

【0145】

基質特異性の結果を表１４に示した。表１４から明らかなように、本酵素はマルトース、スクロースおよびｐＮＰＧ以外を実質的に基質としないことが明らかとなった。

【0146】

【表14】

【0147】

実施例１６で精製した組換え酵素を用いて各種カチオン（リチウムイオン（○）、ナトリウムイオン（△）、カリウムイオン（◆）、ルビジウムイオン（□）、セシウムイオン（黒三角）、アンモニウムイオン（●））濃度を０〜１００ｍＭとしたときの活性を測定した。カチオン非存在下のときの活性を１００（％）としたときの相対活性を図１２に示す。カリウムイオン１００ｍＭのときの相対活性は、３１５０％であった。

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図1】

【図8】

【配列表】

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