特許 5933923 新規な複合タンパク質及びペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5933923

(24)【登録日】2016年5月13日

(45)【発行日】2016年6月22日

(54)【発明の名称】新規な複合タンパク質及びペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 17/08 20060101AFI20160609BHJP

   C07K 1/02 20060101ALI20160609BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20160609BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20160609BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20160609BHJP

   C07K 14/745 20060101ALI20160609BHJP

   C07K 14/575 20060101ALI20160609BHJP

【ＦＩ】

   C07K17/08

   C07K1/02

   C07K16/00

   C07K14/47

   C07K14/705

   C07K14/745

   C07K14/575

【請求項の数】15

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2010-528477(P2010-528477)

(86)(22)【出願日】2008年10月8日

(65)【公表番号】特表2010-540677(P2010-540677A)

(43)【公表日】2010年12月24日

(86)【国際出願番号】GB2008003409

(87)【国際公開番号】WO2009047500

(87)【国際公開日】20090416

【審査請求日】2011年10月5日

(31)【優先権主張番号】07253992.7

(32)【優先日】2007年10月9日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】0813339.9

(32)【優先日】2008年7月21日

(33)【優先権主張国】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】510099774

【氏名又は名称】ポリテリクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100068618

【弁理士】

【氏名又は名称】萼 経夫

(74)【代理人】

【識別番号】100104145

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 嘉夫

(74)【代理人】

【識別番号】100104385

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 勉

(74)【代理人】

【識別番号】100163360

【弁理士】

【氏名又は名称】伴 知篤

(72)【発明者】

【氏名】ブロッチーニー，スティーブン

(72)【発明者】

【氏名】ブライアント，ペニー

(72)【発明者】

【氏名】コング，ユエヒュア

(72)【発明者】

【氏名】チョウイ，ジーウォン

(72)【発明者】

【氏名】ゴドウィン，アントニー

(72)【発明者】

【氏名】ポウエル，キース

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００１−５２６２３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５２７３８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第９９／０００６７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第９５／０３４３２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE，２００７年 ８月，Vol.123，P.19-26

【文献】 BIOCONJUGATE CHEMISTRY，２００７年 １月，Vol.18, No.1，P.61-76

【文献】 JOURNAL OF PROTEIN CHEMISTRY，１９９８年 ２月，Vol.7, No.1，P.49-54

【文献】 BIOCONJUGATE CHEMISTRY，１９９０年，Vol.1, No.1，P.36-50

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

一般式

【化1】

（式中、
Ｘ及びＸ’の１つはポリアルキレングリコール及びポリビニルピロリドンから選ばれる水溶性合成ポリマーを表し、そして他方は水素原子を表し、
各Ｑは独立して直接結合、炭素原子数１乃至１０のアルキレン基、又は随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基［それらのいずれかは１個以上の酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ基（式中、Ｒは水素原子又はアルキル基又はアリール基、ケト基、−Ｏ−ＣＯ−基及び／又は−ＣＯ−Ｏ−基を表す。）により終端又は中断されていてもよい］から選ばれる連結基を表し、
ＷはＣＯ基又は

【化2】

を表し、
Ｚはポリヒスチンタグを介してＡ及びＢに連結されたタンパク質又はペプチドを表し、
Ａは炭素原子数１乃至５のアルキレン又はアルケニレン鎖を表し、そして
Ｂは直接結合又は炭素原子数１乃至４のアルキレン又はアルケニレン鎖を表す。）
で表される化合物の調製方法であり、
該方法は
（ｉ）一般式

【化3】

［式中、Ｘ、Ｘ’、Ｑ、Ａ及びＢは上記と同義であり、
Ｗ’はＣＯ基を表し、そして
各Ｌは独立して−ＳＲ、−ＳＯ₂Ｒ、−ＯＳＯ₂Ｒ、−Ｎ⁺Ｒ₃、−Ｎ⁺ＨＲ₂、−Ｎ⁺Ｈ₂Ｒ、ハロゲン原子、又は−ＯΦ｛式中、Ｒは水素原子又はアルキル基又はアリール基を表し、そしてΦは少なくとも１つの置換基を含有する置換アリール基を表し、該少なくとも１つの置換基は−ＣＮ、−ＮＯ₂、−ＣＯ₂Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ
、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ₂Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ₂Ｒ、―ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ₂Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ₂Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ’ＣＯＲ、−Ｎ⁺Ｒ₃、−Ｎ⁺ＨＲ₂、−Ｎ⁺Ｈ₂Ｒ、ハロゲン原子、特に塩素原子又は特にフッ素原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ₂及び−Ｃ＝ＣＨＲ（式
中、Ｒ及びＲ’のそれぞれは水素原子又はアルキル基又はアリール基を表す。）から選ばれる｝から選ばれる脱離基を表す。］
で表される化合物
又は
（ｉｉ）一般式

【化4】

（式中、
Ｘ、Ｘ’、Ｑ、Ｗ’、Ａ及びＬは一般式ＩＩと同義であり、そして
ｍは整数１乃至４を表す。）
で表される化合物
のいずれかを、ポリヒスチジンタグを含有するタンパク質又はペプチドと、複合が前記ポリヒスチジンタグを介して起こるような条件下で、反応させることを含む、方法。

【請求項2】

一般式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物とタンパク質又はペプチドとの反応後、ＣＯ基を還元して

【化5】

を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ポリヒスチジンタグは２乃至１２個のヒスチジン残基を含有する、請求項１又は請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ポリヒスチジンタグは４乃至１０個のヒスチジン残基を含有する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記ポリマーがポリアルキレングリコールである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記ポリマーがＣ₂及び／又はＣ₃単位を含有する、ポリアルキレングリコールである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記タンパク質又はペプチドがポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、酵素、サイトカイン、ケモカイン、レセプター、血液因子、ペプチド・ホルモン、毒素、転写タンパク質、又は多量体タンパク質である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記タンパク質又はペプチドが抗体又は抗体フラグメントである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記タンパク質又はペプチドは、その表面上の感応性基を保護するべく、１つ以上の保護基と反応された天然タンパク質であるか、又は１個以上のポリマー、治療又は診断に用いる小分子、シアル酸、糖類、及び／又は澱粉と付加的に複合するタンパク質である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記Ｑがアルキレン基又は直接結合である、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

一般式

【化1】

（式中、
Ｘ及びＸ’の１つはポリマーを表し、そして他方は水素原子を表し、
各Ｑは独立して連結基を表し、
Ｗは電子求引性部位又は電子求引性部位の還元により調製される部位を表し、
もしくは、Ｘ’がポリマーを表す場合は、Ｘ−Ｑ−Ｗ−は一緒に電子求引性基を表してもよく、そして更に、
もしくは、Ｘがポリマーを表す場合は、中間にある原子と一緒にＸ’及び電子求引性基Ｗは環を形成してもよく、
Ｚはポリヒスチジンタグを介してＡ及びＢに連結されたタンパク質又はペプチドを表し、
Ａは炭素原子数１乃至５のアルキレン又はアルケニレン鎖を表し、そして
Ｂは結合又は炭素原子数１乃至４のアルキレン又はアルケニレン鎖を表す。）
で表される化合物である、前記請求項のうちのいずれか一項に記載の化合物。

【請求項13】

６．８乃至８．５の範囲のｐＨで行われる、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

７．０乃至８．０の範囲のｐＨで行われる、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

７．５乃至８．０の範囲のｐＨで行われる、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規な複合タンパク質及びペプチド、並びにそれらの製法に関する。

【背景技術】

【0002】

多くの治療効果のある分子、例えばタンパク質は、臨床医学的用途において、効力を発揮するために必要とされる特性を有していない。例えば、多くの天然タンパク質は、良い薬にはならない。その理由は、患者への投与時に、（１）タンパク質が血液又は組織中に存在する多くのエンド−及びエキソ−ペプチターゼによって消化される；（２）多くのタンパク質はある程度免疫原性である；並びに（３）タンパク質は腎臓限外ろ過及びエンドサイトーシスにより迅速に排出され得る等を含んだいくつかの固有の欠点があるからである。医学の分野で有効な治療薬としての有用性を発見するかもしれない、いくつかの分子は組織的に有毒であるか又は最適な生物学的利用態及び薬物動態を欠いている。タンパク質がすぐに血液循環から消えてなくなる場合は、タンパク質は一般的に頻繁に患者に投与されなければならない。頻繁な投与はさらに、毒性の危険性、特に免疫学的に生成された毒性を増加する。

【0003】

水溶性、合成ポリマー、特にポリアルキレングルコースは、例えばタンパク質など、治療効果のある分子を複合させるのに幅広く使用される。これらの治療的な複合体は、循環時間を引き延ばすこと及び除去率を減少させること、組織的毒性を減少させること、並びにいくつかの場合では、さらなる臨床的有用性を発揮することにより、薬物動態を優位に変えることが示されている。ポリエチレングリコール、ＰＥＧをタンパク質に共有複合する方法は、“ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）”として一般的に知られている。

【0004】

最適な効力にとってタンパク質ごとに複合ポリマー分子の数は各分子に対して同じである用量一貫性のための投与量を確保すること、及び各タンパク質分子において各タンパク質分子は同じアミノ酸残基と特に共有複合することは重要である。タンパク質分子に沿った部分での非特異的複合は、精製するのに難しく且つ費用がかかる複雑な混合物を生み出すために複合生成物の配分及び頻繁に、非複合タンパク質をもたらす。

【0005】

国際公開２００５／００７１９７号は、一連の新規な複合試薬を開示する。タンパク質−ポリマー複合体を製造するために、これらは生体分子、例えばタンパク質中、求核基と反応するために使用され得る。新規なチオエーテル複合体をもたらすため、これらの試薬にはタンパク質中、ジスルフィド結合から誘導される両硫黄原子と複合する能力に対する特有の有用性を思い出せる。

【0006】

固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、タンパク質及びペプチドの精製に対し標準的な技術である。この技術では、多くの場合、“ｈｉｓ−タグ（ｈｉｓ−ｔａｇ）”（隣接するヒスチジン残基の短鎖、一般的には５又は６個の残基、天然タンパク質中には存在しない）と呼ばれる、ポリヒスチジンタグは、タンパク質、一般的にはアミノ酸鎖の末端の１つへの合成方法により付着される。得られたタンパク質又はペプチドは“ヒスチジンタグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇｇｅｄ）”と言われている。ポリヒスチジンタグは少なくとも２つのヒスチジン残基によって、例えばニッケル及びコバルトなど、金属と強く結合する。ＩＭＡＣでは、ポリヒスチジンタグタンパク質は、ニッケル−又はコバルト−を含有するカラムを通り過ぎる。このポリヒスチジンタグは、カラムと強く結合し、それ故タグタンパク質が混合物から分離することを可能にする。ポリヒスチジンタグは幅広く使用され、広範囲のタンパク質及びペプチド又はそれらから誘導される生成物が、将来、混合物から分離されるようにするために広範囲のタンパク質及びペプ
チドに付着される。

【0007】

普通、ポリヒスチジンタグタンパク質より強くないが、いくつかのタグなしタンパク質は、互いにごく接近してヒスチジン残基を含有し、またそのようなタンパク質もまたニッケル及びコバルトＩＭＡＣカラムと結合してもよい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開２００５／００７１９７号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

我々は、ポリマー、特にＰＥＧをタンパク質及びペプチドに複合する改良された方法を見出した。この方法では、ポリマーはポリヒスチジンタグに複合される。驚くべきことに、ヒスチジン残基と結合可能な試薬は、天然タンパク質中に存在するたった一つのヒスチジン残基よりはむしろ、選択的にポリヒスチジンタグで反応すると考えられている。得られた複合体は新規である。ポリヒスチジンタグを含有するタンパク質及びペプチド、並びに新規な複合体を製造するために天然タンパク質中に類似したヒスチジン構造を含有するタンパク質及びペプチドに対し、国際公開２００５／００７１９７号に記載の試薬は、極めて効果的かつ安定した複合試薬として作用する。

【0010】

したがって、本発明はポリマーをポリヒスチジンタグを含有するタンパク質又はペプチドに複合する方法を提供し、該方法は前記ポリヒスチジンタグによって、複合が起きるような条件下、ポリマー複合試薬を前記タンパク質又はペプチドと反応させることを含む。本発明はさらに、ポリマーをタンパク質又はペプチドに複合する方法を提供し、該方法は前記タンパク質又はペプチドにヒスチジンタグを導入し、そしてその後に前記ポリヒスチジンタグによって、複合が起きるような条件下、前記タンパク質又はペプチドをポリマー複合試薬と反応させることを含む。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明のポリマー複合体は新規であり、それ故に本発明はタンパク質又はペプチドに複合させたポリマーを含む化合物を提供し、前記複合はヒスチジンタグ自体による。そのような化合物は、一般式によって表される：

【化1】

（式中、
Ｘはポリマーを表し、
Ｑ’は連結基を表し、
（ｈｉｓ）_uはｕ個のヒスチジン単位を含有するポリヒスチジンタグを表し、そして
Ｚは前記ヒスチジンタグを介して結合したタンパク質又はペプチドを表す。）

【0012】

ヒスチジンタグと結合可能なあらゆるポリマー複合試薬は、本発明の方法で使用されてもよい。そのような試薬は、ポリヒスチジンタグと結合するのと同様に、国際公開２００５／００７１９７号に記載の二官能性試薬を含み、天然タンパク質又はペプチド（例えば、ヒスチジンタグには存在しない）中に存在する２つのヒスチジン残基と結合可能であることもまた見出され、天然タンパク質又はペプチドにおいては、そのような残基は両ヒスチジン残基に官能性試薬の複合を可能にするために天然構造中で十分に互いのすぐ近くに配置される。

【0013】

したがって、本発明はさらに、一般式

【化2】

（式中、
Ｘ及びＸ’の１つはポリマーを表し、そして他方は水素原子を表し、
各Ｑは独立して連結基を表し、
Ｗは電子求引性部位又は電子求引性部位の還元により調製される部位を表し、
もしくは、Ｘ’がポリマーを表す場合は、Ｘ−Ｑ−Ｗ−は一緒に電子求引性基を表
してもよく、そして更に、
もしくは、Ｘがポリマーを表す場合は、中間にある原子と一緒にＸ’及び電子求引
性基Ｗは環を形成してもよく、
Ｚは各ヒスチジン残基によってＡ及びＢに連結されたタンパク質又はペプチドを表
し、
Ａは炭素原子数１乃至５のアルキレン又はアルケニレン鎖を表し、そして
Ｂは結合又は炭素原子数１乃至４のアルキレン又はアルケニレン鎖を表す。）
で表される化合物を提供する。

【0014】

本発明に従う新規化合物のさらなる群は、一般式

【化3】

（式中、
Ｘはポリマーを表し、
Ｑは連結基を表し、
Ｗは電子求引性基又は電子求引性部位の還元により調整される部位を表し、
ｖは０又は１乃至４の整数を表し、
ｖ’は１乃至８の整数を表し、そして
Ｚはポリヒスチジンタグを介して結合したタンパク質又はペプチドを表す。）
によって表される。

【0015】

これらの化合物では、ｖ’は好ましくは１乃至６の整数、好ましくは１乃至４、例えば１を表す。好ましくは、ｖは０である。
また本発明は、以下の［１］乃至［１５］に記載された方法を提供する。
［１］一般式

【化6】

（式中、
Ｘ及びＸ’の１つはポリアルキレングリコール及びポリビニルピロリドンから選ばれる水溶性合成ポリマーを表し、そして他方は水素原子を表し、
各Ｑは独立して直接結合、炭素原子数１乃至１０のアルキレン基、又は随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基［それらのいずれかは１個以上の酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ基（式中、Ｒは水素原子又はアルキル基又はアリール基、ケト基、−Ｏ−ＣＯ−基及び／又は−ＣＯ−Ｏ−基を表す。）により終端又は中断されていてもよい］から選ばれる連結基を表し、
ＷはＣＯ基又は

【化7】

を表し、
Ｚはポリヒスチンタグを介してＡ及びＢに連結されたタンパク質又はペプチドを表し、
Ａは炭素原子数１乃至５のアルキレン又はアルケニレン鎖を表し、そして
Ｂは直接結合又は炭素原子数１乃至４のアルキレン又はアルケニレン鎖を表す。）
で表される化合物の調製方法であり、
該方法は
（ｉ）一般式

【化8】

［式中、Ｘ、Ｘ’、Ｑ、Ａ及びＢは上記と同義であり、
Ｗ’はＣＯ基を表し、そして
各Ｌは独立して−ＳＲ、−ＳＯ₂Ｒ、−ＯＳＯ₂Ｒ、−Ｎ⁺Ｒ₃、−Ｎ⁺ＨＲ₂、−Ｎ⁺Ｈ₂Ｒ、ハロゲン原子、又は−ＯΦ｛式中、Ｒは水素原子又はアルキル基又はアリール基を表し、そしてΦは少なくとも１つの置換基を含有する置換アリール基を表し、該少なくとも１つの置換基は−ＣＮ、−ＮＯ₂、−ＣＯ₂Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ
、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ₂Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ₂Ｒ、―ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ₂Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ₂Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ’ＣＯＲ、−Ｎ⁺Ｒ₃、−Ｎ⁺ＨＲ₂、−Ｎ⁺Ｈ₂Ｒ、ハロゲン原子、特に塩素原子又は特にフッ素原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ₂及び−Ｃ＝ＣＨＲ（式
中、Ｒ及びＲ’のそれぞれは水素原子又はアルキル基又はアリール基を表す。）から選ばれる｝から選ばれる脱離基を表す。］
で表される化合物
又は
（ｉｉ）一般式

【化9】

（式中、
Ｘ、Ｘ’、Ｑ、Ｗ’、Ａ及びＬは一般式ＩＩと同義であり、そして
ｍは整数１乃至４を表す。）
で表される化合物
のいずれかを、ポリヒスチジンタグを含有するタンパク質又はペプチドと、複合が前記ポリヒスチジンタグを介して起こるような条件下で、反応させることを含む、方法。
［２］一般式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物とタンパク質又はペプチドとの反応後、ＣＯ基を還元して

【化10】

を形成することをさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］前記ポリヒスチジンタグは２乃至１２個のヒスチジン残基を含有する、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記ポリヒスチジンタグは４乃至１０個のヒスチジン残基を含有する、［３］に記載の方法。
［５］前記ポリマーがポリアルキレングリコールである、［１］乃至［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］前記ポリマーがＣ₂及び／又はＣ₃単位を含有する、ポリアルキレングリコールである、［５］に記載の方法。
［７］前記ポリマーがポリエチレングリコールである、［６］に記載の方法。
［８］前記タンパク質又はペプチドがポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、酵素、サイトカイン、ケモカイン、レセプター、血液因子、ペプチド・ホルモン、毒素、転写タンパク質、又は多量体タンパク質である、［１］乃至［７］のいずれか１つに記載の方法。［９］前記タンパク質又はペプチドが抗体又は抗体フラグメントである、［８］に記載の方法。
［１０］前記タンパク質又はペプチドは、その表面上の感応性基を保護するべく、１つ以上の保護基と反応された天然タンパク質であるか、又は１個以上のポリマー、治療又は診断に用いる小分子、シアル酸、糖類、及び／又は澱粉と付加的に複合するタンパク質である、［１］乃至［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］前記Ｑがアルキレン基又は直接結合である、［１］乃至［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］前記Ｘがポリマー、及びＸ’−Ｑ−がＨ−である、［１］乃至［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］６．８乃至８．５の範囲のｐＨで行われる、［１］乃至［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］７．０乃至８．０の範囲のｐＨで行われる、［１３］に記載の方法。
［１５］７．５乃至８．０の範囲のｐＨで行われる、［１４］に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は特定の試薬を使用した複合体の製法を表す図である。

【図2】図２は図１の方法によって調製される別の複合体を表す図である。

【図3】図３は本発明に従う新規な複合体を表す図である。

【図4】図４は実施例１の結果を示す図である。

【図5】図５は実施例１におけるゲルをヨウ化バリウムで染色した結果を示す図である。

【図6】図６は実施例２の結果を示す図である。

【図7】図７は実施例２におけるゲルをヨウ化バリウムで染色した結果を示す図である。

【図8】図８は実施例３の結果を示す図である。

【図9】図９は実施例３におけるゲルをヨウ化バリウムで染色した結果を示す図である。

【図10】図１０は実施例３における比較反応の結果を示す図である。

【図11】図１１は実施例４の結果を示す図である。

【図12】図１２は実施例４におけるゲルをヨウ化バリウムで染色した結果を示す図である。

【図13】図１３は実施例５の結果を示す図である。

【図14】図１４は実施例６の結果を示す図である。

【図15】図１５は実施例７の結果を示す図である。

【図16】図１６は実施例８の結果を示す図である。

【図17】図１７は実施例９の結果を示す図である。

【図18】図１８は実施例１０の結果を示す図である。

【図19】図１９は実施例１１の結果を示す図である。

【図20】図２０は実施例１３の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明の方法で使用される他の試薬は、アシル化又はアルキル化可能な試薬を含む。そのような試薬は単又は多官能性であってもよく、また例えばＰＥＧ炭酸塩類（例を挙げると、ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル炭酸塩、ＰＥＧ−スクシンイミジル炭酸塩、ＰＥＧ−ベンゾトリアゾリル炭酸塩）、ＰＥＧカルボン酸塩類及びＰＥＧエステル類（例を挙げると、ＰＥＧ−スクシンイミジルエステル及びＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルエステル並びにそれらの誘導体）、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧ−トレシル基又はトシル基、ＰＥＧ−ジクロロトリアジン又は−クロロトリアジン、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧマレイミド及びＰＥＧ−ヨードアセトアミド、そしてＰＥＧ以外のポリマーを含有する対応する試薬を含んでいてもよい。

【0018】

本発明の新規な複合体において、Ｚはタンパク質又はペプチドから誘導され得る。本明細書中、用語“タンパク質”は便宜上使用され、そして文脈上他の意味に解すべき場合を除き、“タンパク質”への言及は“タンパク質又はペプチド”への言及を意味していると理解すべきである。

【0019】

上記式Ｉａで表される新規な複合体部分を形成するタンパク質は、少なくとも２個のヒスチジン残基を含有しなければならない。これら２個の残基は天然タンパク質中に存在していてもよいが、もしそうだとしたら、２個の残基は群Ａ及びＢを複合可能にするために天然構造中で十分にすぐ近くに配置されなければならない。２個のヒスチジン残基がタンパク質鎖中でお互いに隣接している場合、又はタンパク質の折り畳みの結果として、それらはすぐ近くにある可能性がある場合に、これは起きる可能性がある。そのようなタンパク質は一般的にＩＭＡＣカラムと結合する。例えば、原核生物大腸菌はヨダ（ＹＯＤＡ）として知られている１つのタンパク質を有し、ＩＭＡＣカラムとの結合は起こり得る。しかしながら、好ましくは、２個のヒスチジン残基はポリヒスチジンタグの部分を形成し、例えば天然タンパク質又はペプチドには見られない、ヒスチジン鎖、該ポリヒスチジンタグは適当な手段、例えば化学的手段、ポリヒスチジンタグ又はポリヒスチジンタグを含有する部位と共に翻訳後の標識化、又は標的タンパク質との融合においてヒスチジン配列を挿入することによるタンパク質工学、例えば、所望の長さのポリヒスチジンタグをコードする短コード配列を有する遺伝子の使用、によってタンパク質又はペプチドに付着される。

【0020】

ポリヒスチジンタグはどんな所望の数のヒスチジン残基、例えば約１２個までの残基を含有していてもよい。それらは少なくとも２個の残基を含有しなければならず、好ましくは少なくとも３個の残基、特に４乃至１０個、特に５乃至８個、例えば５又は６個の残基
を含有する。それらはヒスチジン残基のみを含有してもよく、またはヒスチジン残基に加えて、１個以上のスペーサー残基又は配列も含んでいても良い。

【0021】

本発明の複合体中に存在する結合の正確な性質は、現在のところ正確に知られていない。１つの考えられる複合体の製法は、特定の試薬（各ＳＯ₂Ｒは脱離基を表し、そしてＲ
は好ましくは、アルキル基、アリール基、アルカリル基又はアラルキル基、特にトリル基を表す。）を使用して説明され、添付図面の図１に示される。図２（ａ）及び２（ｂ）は図１の方法によって調製される別の複合体を示す。図１及び２において結合は隣接したヒスチジン残基にあるが、もし間隔が複合体の形成を妨げるほど大きくない場合は、間隙を介したヒスチジン残基への結合は不可能ではないと考えられる。

【0022】

ポリヒスチジンタグを保持するのに加えて、タンパク質は、必要に応じて、誘導体化又は官能化されてもよい。特に、複合前に、その表面上の感応性基を保護するべく、天然タンパク質を様々な保護基と反応させてもよく、または本発明の方法かそれとも代わりの方法を使用して、１個以上のポリマー又は他の分子を前もって複合させてもよい。さらに、本発明の複合体は本発明に従う複合後、タンパク質に複合される１個以上の追加のポリマー（タンパク質を含む）又は他の分子を有していてもよい。本発明に従う新規な複合体、タンパク質は１又は２個の追加のポリマーに複合される、は添付図面のそれぞれ図３（ａ）、３（ｂ）及び３（ｃ）に示される。これらの図では、連結基と一緒にポリマーはＡ、Ｂ及びＣとして概略的に示される、一方、ｘ、ｙ及びｚはヒスチジン残基によってタンパク質に結合して複合されたポリマーＡ、Ｂ及びＣの総数を表す。もちろん、ヒスチジン以外の残基によって１個以上のポリマーの複合もまた可能である。１個以上の追加のポリマー（タンパク質を含む）に複合されるのと同様に、タンパク質は、例えば、小分子、例えば治療又は診断に用いる；シアル酸；糖類；及び澱粉から選ばれる１個以上の分子と複合されてもよい。図３におけるＢ及びＣは、それ故、そのような分子を表してもよい。さらに、図３はお互いに近傍に配置されたＡ、Ｂ及びＣを示すが、これはただ単に概略に過ぎず、そしてそれらはお互いに離れて配置されていてもよい。

【0023】

タンパク質はＩＭＡＣ法により前もって精製されるか、それともタンパク質自体又はタンパク質から誘導された生成物の精製を補助しなければならないので、商業的に提供されている多くのタンパク質は、ヒスチジンタグを含む。タンパク質をポリマーに複合することが望ましいならば、ポリヒスチジンタグへの複合は、以前は想像がつかなかった、とても便利な手段を提供する。複合された生成物、具体的にはＰＥＧ化生成物は、高度の一貫性で得られうる。２つのヒスチジン残基に複合をもたらす、国際公開２００５／００７１９７号に記載された複合試薬の使用は、一般的に高収率で得られる、特に安定的かつ選択的な複合体を導きながら、結果として大員環をもたらす。

【0024】

ポリヒスチジンタグはタンパク質表面、通常タンパク質鎖の一方の端に一般的に付着し、タンパク質の所望の部位に位置づけられ得るので、タンパク質の生物活性は、ポリヒスチジンタグの導入法の後に、及びポリマーへのポリヒスチジンタグでの部位特異的複合の次の処理後にも大いに維持される。これら理由に対し、本発明は扱いにくい従来の複合方法ということを前もって証明したタンパク質の複合体を形成するために使用され得る。

【0025】

ポリヒスチジンタグは十分な数のヒスチジン残基を含有するという条件で、本発明の複合体はＩＭＡＣを使用して精製され得る。これが効率的であるように、ポリヒスチジンタグにおいて、少なくとも２個、好ましくはより多くのヒスチジン残基が非複合体のままであり、ＩＭＡＣカラム中ニッケルとの結合に利用可能である必要がある。遊離ヒスチジン残基ポスト複合の数の低下は、非複合ペプチド又はタンパク質と複合誘導体の間のＩＭＡＣカラムとの結合において選択性を可能にする。多数の複合が同じ生体分子で起きる場合、ＩＭＡＣは多数複合された誘導体の分離を可能にする。

【0026】

本発明（例えばＸ又はＸ’）の複合体におけるポリマーは、例えばポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、例えばポリアクリロイルモルホリン、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド又はポリメタクリルアミド、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、又はＨＰＭＡのような、ホスファチジルコリンペンダント基と共に、ポリカルボキシメタクリルアミド又はポリアクリレート又はポリメタクリレートでもよい。さらに、ポリマーは酵素又は加水分解を受けやすくてもよい。そのようなポリマーは、例えば、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカルボネート、ポリ（イミノカルボネート）、及びポリ（アミノ酸）のような、ポリアミドを含む。前記ポリマーはホモポリマー、ランダムコポリマー又は例えばブロックポリマーのような構造的に定義されたコポリマーでもよい。例えば、それは２つ以上のアルキレンオキシド、又はポリ（アルキレンオキシド）から及びポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、又はポリ（アミノ酸）のいずれかから誘導されるブロックコポリマーでよい。使用され得る多官能性ポリマーはジビニルエーテル−無水マレイン酸及びスチレン−無水マレイン酸の共重合体を含む。

【0027】

天然高分子、例えばキチン、デキストラン、デキストリン、キトサン、澱粉、セルロース、グリコーゲン、ポリ（シアル酸（ｓｉａｌｙｌｉｃ ａｃｉｄ））のような多糖類及びそれらの誘導体なども使用され得る。タンパク質はポリマーとして使用され得る。これは１つのタンパク質、例えば抗体又は抗体フラグメントを、第２のタンパク質、例えば酵素又は別の活性タンパク質への複合を許す。また、触媒配列を含有するペプチド、例えばグリコシルトランスフェラーゼに対するＯ−グリカン受容体部位が使用される場合、基質又はその後の酵素反応に対する標的の取り込みを許す。例えばポリグルタミン酸のようなポリマーもまた使用してもよく、例えばサッカリド又はアミノ酸のような天然モノマー及び例えばエチレンオキサイド又はメタクリル酸のような合成モノマーから誘導される水素化物ポリマーのように使用してもよい。

【0028】

ポリマーがポリアルキレングリコールの場合は、これは好ましくはＣ₂及び／又はＣ₃単位を含有し、特にポリエチレングリコールである。ポリマー、特にポリエチレングリコールは、単一線状鎖を含有してもよく、または分岐した形態を有していてもよく、そして小なり大なりの何れか多くの鎖からなり得る。いわゆる、プルロニックはＰＥＧブロックコポリマーの重要な類である。これらはエチレンオキサイド及びポリプロピレンオキサイドブロックから誘導される。置換ポリアルキレングリコール、例えばメトキシポリエチレングリコールは使用され得る。本発明の好ましい実施例では、単一鎖のポリエチレングリ
コールは適当な基、例えばアルコキシ基、具体的にはメトキシ基、アリールオキシ基、カルボキシ基又はヒドロキシ基により開始され、そして以下に述べるように鎖の反対側の端で連結基Ｑ又はＱ’に結合される。

【0029】

ポリマーは所望の方法で、随意に誘導体化又は官能化されてもよい。反応基はポリマー末端、又は末端基、ペンダントリンカーに設けられたポリマー鎖に沿って、連結されても良い。その場合、ポリマーは、例えばポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、又は無水マレイン酸コポリマーである。１個以上の生体分子を含有する多量複合体は、相乗的かつ付加的な利益をもたらすことができる。必要なら、従来の方法を使用して、ポリマーは担体と共役されてもよい。

【0030】

ポリマーの最適な分子量は、当然対象とする用途によって決まる。好ましくは、数平均分子量は２５０ｇ／ｍｏｌ、例えば、５００ｇ／ｍｏｌ、から約７５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内である。一般式Ｉで表される化合物が血液循環に残り、組織に浸透することを目的としている場合、例えば悪性腫瘍、感染症又は自己免疫疾患に、または外傷に起因する
炎症治療用のために、２０００乃至３０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲でより低分子量のモノマーを使用するのが有利である。有用性のために、一般式Ｉで表される化合物が血液循環中にある場合には、より高分子量のモノマー、例えば２０，０００乃至７５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内で使用するのが有利である。

【0031】

複合体が目的用途のために溶剤に溶解するように、使用されるポリマーは選択されるべきである。生物学的応用、特に診断的適用及び哺乳類への臨床治療的な投与に対する治療への応用のために、複合体は水媒体に可溶となる。酵素のような多くのタンパク質は、例えば化学反応を触媒するために、工業での有用性がある。そのような用途で使用するための複合体に対し、複合体が水及び有機媒体のいずれか又は両方に可溶である必要があるかもしれない。ポリマーは当然、タンパク質の対象とする機能をひどく低下させるべきではない。

【0032】

好ましくはポリマーは合成ポリマーであり、そして好ましくは水溶性ポリマーである。水溶性ポリエチレングリコールの使用は特に多くの用途にとって好ましい。

【0033】

連結基によってポリマーはポリヒスチジンタグと適切に共有連結している。式Ｉ中の連結基Ｑ’は基Ｗ（例えば、Ｑ’は式Ｉａで表される−Ｑ−Ｗと同等であってもよい）を含んでいてもよい。連結基Ｑ’又はＱは例えば直接結合、アルキレン基（好ましくは炭素原子数１乃至１０のアルキレン基）、又は随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基、そしてそれらのいずれかは１個以上の酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ基（式中、Ｒは下記の意味である。）、ケト基、−Ｏ−ＣＯ−基及び／又は−ＣＯ−Ｏ−基により終端又は中断されてもよい。適切なアリール基はフェニル基及びナフチル基を含み、一方、適切なヘテロアリール基はピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピ
ラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンを含む。ポリマーへの連結は、加水分解に不安定な結合法により、又は非不安定な結合によりされてもよい。

【0034】

随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基に存在してもよい置換基は−ＣＮ、−ＮＯ₂、―ＣＯ₂Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣ
Ｏ₂Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ₂Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ₂Ｒ、
−ＮＲ’ＣＯ₂Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝
Ｎ−ＮＲ’ＣＯＲ、―Ｎ⁺Ｒ₃、−Ｎ⁺Ｈ₃、―Ｎ⁺ＨＲ₂、―Ｎ⁺Ｈ₂Ｒ、ハロゲン原子、例えばフッ素原子又は塩素原子、―Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ₂及び−Ｃ＝ＣＨＲ｛式中、各Ｒ又
はＲ’は独立して水素原子又はアルキル基（好ましくは炭素原子数１乃至６のアルキル基）又はアリール基（好ましくはフェニル基）を表す。｝から選ばれる同一又は異なった置換基を例えば１個以上含む。電子求引置換基の存在は特に好ましい。

【0035】

好ましくは、式Ｉａで表される化合物において、水素原子と連結する基Ｑはアルキレン基又は直接結合である。最も好ましくは、式ＩａにおいてＸはポリマーであり、またＸ’−ＱはＨ−である。

【0036】

Ｗは例えば、ケト基又はアルデヒド基ＣＯ、エステル基−Ｏ−ＣＯ−又はスルホン基−ＳＯ₂−、又は例えばＣＨ．ＯＨ基、エーテル基ＣＨ．ＯＲ、エステル基ＣＨ．Ｏ．Ｃ（
Ｏ）Ｒ、アミン基ＣＨ．ＮＨ₂、ＣＨ．ＮＨＲ又はＣＨ．ＮＲ₂、又はアミド基ＣＨ．ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ又はＣＨ．Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）₂、のような基を還元して得られる基を表す。Ｘ
−Ｑ−Ｗ−が一緒に電子求引基を表す場合、この基は例えばシアノ基でもよい。

【0037】

本発明の複合方法に用いられる正確な条件は、当然用いられる複合試薬、及び複合されるタンパク質又はペプチドによって決まる。そのような条件は、当業者にとって周知の事実の範囲内である。例えば、反応に対するｐＨは一般的に４乃至１０の間であり、通常は
約６乃至約８．５の間であり、例えば約６．５乃至８．０であり、好ましくは約７．０乃至約７．５である。反応混合物中、タンパク質又はペプチドの濃度は一般的に０．２０ｍｇ／ｍＬ以上であり、通常は０．４ｍｇ／ｍＬ以上であり、例えば０．５ｍｇ／ｍＬ乃至１．５ｍｇ／ｍＬである。前記方法が国際公開２００５／００７１９７号に記載の二官能性試薬を使用する場合、該方法は（ｉ）一般式

【化3】

（式中、
Ｘ及びＸ’の一方はポリマーを表し、他方は水素原子を表し、
Ｑは連結基を表し、
Ｗ’は電子求引基、例えばケト基、エステル基−Ｏ−ＣＯ−又はスルホン基−ＳＯ₂−
、又は、Ｘ’がポリマーを表す場合は、Ｘ−Ｑ−Ｗ’と一緒に電子求引基を表し、
Ａは炭素原子数１乃至５のアルキレン又はアルケニレン鎖を表し、
Ｂは結合又は炭素原子数１乃至４のアルキレン又はアルケニレン鎖を表し、そして
各Ｌは独立して脱離基を表す。）
で表される化合物
又は
（ｉｉ）一般式

【化4】

（式中、
Ｘ、Ｘ’、Ｑ、Ｗ’、Ａ及びＬは一般式ＩＩと同義であり、さらにＸがポリマーを表す場合は、中間にある原子と一緒にＸ’及び電子求引性基Ｗ’は環を形成してもよく、
そして
ｍは請求１乃至４を表す。）
で表される化合物
のいずれかを、少なくとも２個のヒスチジン残基を含有するタンパク質又はペプチドと反応させることを含む。

【0038】

複合試薬ＩＩ及びＩＩＩはお互いに化学的に同等であり、国際公開２００５／００７１９７号に記載されている。それらは、２つの求核試薬に対して選択的である、橋かけ官能化された、潜伏的橋かけ複合化された、ビス−アルキル化された部位を有することを特徴とする。複合されるタンパク質において前記試薬が２つのヒスチジン残基と結合するような条件下で反応は行われる。２つのヒスチジン残基への高選択性が得られたことは驚くべきことである。他の複合方法は生成物の混合物を製造する傾向があり、例えば、リジン残基よりもむしろヒスチジン残基との選択的結合は難しいことが前もって知られていた。

【0039】

この又は各脱離基Ｌは、例えば−ＳＲ、−ＳＯ₂Ｒ、−ＯＳＯ₂Ｒ、−Ｎ⁺Ｒ₃、−Ｎ⁺Ｈ
Ｒ₂、−Ｎ⁺Ｈ₂Ｒ、ハロゲン原子、又は−ＯΦ［式中、Ｒは上記と同義で有り、そしてΦ
は置換されたアリール基、特に少なくとも１個の電子求引基、例えば−ＣＮ、−ＮＯ₂、
−ＣＯ₂Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ₂Ｒ、−
ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ₂Ｒ、―ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ₂Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ₂Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ’
ＣＯＲ、−Ｎ⁺Ｒ₃、−Ｎ⁺ＨＲ₂、−Ｎ⁺Ｈ₂Ｒ、ハロゲン原子、特に塩素原子、特にフッ素原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ₂及び−Ｃ＝ＣＨＲ（式中、Ｒ及びＲ’は上記と同義であ
る。）］を含有するフェニル基を表す。

【0040】

Ｘ’及びＷ’が一緒に環を形成する典型的な構造は、

【化6】

（式中、ｎは整数１乃至４を表す。）
、及び

【化7】

を含む。

【0041】

１つの好ましい実施形態では、本発明に従う方法は、一般式：

【化8】

で表される新規な複合体を製造するために、一般式：

【化9】

で表される試薬を使用する。

【0042】

本発明の方法のこの実施形態の重要な特徴は、α−メチレン脱離基及び二重結合がマイケル活性化部位として機能する電子求引基と橋かけ複合されることである。橋かけ官能化試薬において、脱離基が直接置換よりもむしろ脱離する傾向にあり、また電子求引基がマイケル反応に対し最適な活性部位である場合、その結果、一連の分子内ビスアルキル化は連続的なマイケル反応及びレトロ−マイケル反応により起こり得る。脱離部位は、最初のアルキル化が起こった後まで、曝露されなかった潜在的な複合二重結合を覆う働きをし、ビス−アルキル化はＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７９，１０１，３０９８−３１１０及びＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８８，１１０，５２１１−５２１２に記載されているような一連の相互作用的マイケル反応及びレトロ−マイケル反応に由来する。ビス−アルキル化が一連のマイケル反応及びレトロ−マイケル反応により起こりうるように、電子求引基及び脱離基は適切に選ばれる。二重結合に複合される追加の多重結合と又はＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８８，１１０，５２１１−５２１２に記載されているような脱離基と電子求引基の間で橋かけ官能アルキル化試薬を調製することも可能である。

【0043】

本発明に従う新規な複合体のいくつかの例は、以下の

【化10】

を含む。

【0044】

本発明に従う方法で使用され得る試薬のいくつかの例は、以下の、

【化11】

を含む。

【0045】

タンパク質に対して、ヒスチジン残基は天然タンパク質又はポリヒスチジンタグのいずれかにおいて、互いにごく接近して位置しており、好ましくは互いに隣接している。もちろん、ポリエチレングリコール以外のポリマーは、上記式でＰＥＧを取り替えてもよい。理論に束縛されることを望むことなく、ヒスチジン残基への結合は以下の式：

【化12】

に示されるが、ヒスチジン中の他の窒素原子との結合もまた可能である。

【0046】

上記方法の即時生成物は一般式Ｉａ（式中、Ｗは電子求引基を表す。）で表される化合物である。そのような化合物はそれら自身に有用性がある。なぜなら、本発明の方法は適切な条件下、可逆的であり、さらに式Ｉａで表される化合物（式中、Ｗは電子求引部位を表す。）は遊離タンパク質の放出に必要とされる適用における有用性（例えば直接の臨床的応用）を有するからである。しかしながら、電子求引基Ｗはたんぱく質の放出を妨げる部位を生み出すために還元されてもよく、またそのような化合物は多くの臨床的、産業上及び診断用用途にもまた有用性を有する。さらに、いったんＷを還元させた場合、可逆反応はもはや起こらないという事実は、より強い求核試薬が加えられたとしても、交換が一
切見られないことを意味する。それ故に、例えばポリヒスチジンタグによるＰＥＧ化、Ｗの還元、それからタンパク質中のジスルフィド結合の還元、そして還元されたジスルフィド結合の至る所での一連のＰＥＧ化を行うことが可能である。いくつかのタンパク質に対し、基Ｗの還元をしないで、そのような方法を実行することは可能である。

【0047】

このように、例えば、ケト基を含有する部位Ｗは、ＣＨ（ＯＨ）基を含有する部位Ｗに還元されてもよく、エーテル基ＣＨ．ＯＲはエーテル化剤とヒドロキシ基の反応により得られてもよく、エステル基ＣＨ．Ｏ．Ｃ（Ｏ）Ｒはアシル化剤とヒドロキシ基の反応により得られてもよく、アミン基ＣＨ．ＮＨ_２、ＣＨ．ＮＨＲ又はＣＨ．ＮＲ_２は還元性アミノ化によりケトン又はアルデヒドから調製されてもよく；またアミドＣＨ．ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ又はＣＨ．Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）_２はアミンのアシル化により形成されてもよい。シアノ基である基Ｘ−Ｑ−Ｗ−はアミノ基に還元してもよい。

【0048】

前記方法は、全ての反応物質が溶解できる溶媒又は溶媒の混合物中で行われ得る。タンパク質は水性反応媒体中、一般式ＩＩ又ＩＩＩで表される化合物と直接反応させてもよい。求核試薬のｐＨ要件によって、この反応媒体は緩衝されてもよい。この反応に対する最適なｐＨは一般的に少なくとも６．０であり、通常、約６．８から約８．５の間であり、例えば６．５又は７．０乃至８．０であり、例えば約７．５−８．０であるが、好ましくは約７．０乃至７．５である。ＰＥＧ化の方法が記載された文献は、リシン残基へのＰＥＧ化を含めて、塩基性条件は非選択的ＰＥＧ化を引き起こすこと、及びヒスチジンへのＰＥＧ化はｐＨ６．０乃至６．５が最適であることを提案するけれども、本発明に従う方法は、塩基性のｐＨでのヒスチジン残基（特にポリヒスチジンタグにおいて）との結合に選択的であることは驚くべきことである。その場合にも、文献に記載の方法は、リシンへのＰＥＧ化を含めて、非選択的なＰＥＧ化を提案する。最適な反応条件は当然、使用される具体的な反応物質によって決まるが、一般的に、上記範囲の下端の方でのｐＨの使用は、ヒスチジン結合に関する選択性を増加させる傾向がある、一方、上記範囲の上端の方でのｐＨの使用は収率を増加させる傾向がある。

【0049】

３乃至３７℃間での反応温度は一般的に最適であり、これらの方法が起きるかもしれない温度で複合反応が行われるなら、タンパク質は障害機能を分解する又は変性するかもしれない。有機媒体（例えば、ＴＨＦ、酢酸エチル、アセトン）中で行われる反応は、通常室温以下の温度で行われる。

【0050】

多くの他の試薬と違って、タンパク質は試薬の化学量当量又は僅かな過剰を用いて所望の試薬と効率的に複合され得る。しかしながら、試薬は溶媒和タンパク質に用いられる水性媒体と競合反応を受けないので、過剰な化学量の試薬と複合反応を行うことは可能である。過剰の試薬及び生成物は、タンパク質の通常の精製の間、イオン交換クロマトグラフィーにより、又はニッケルを使用した分離により、容易に分離され得る。

【0051】

ポリヒスチジンタグとの複合に対し有用である化合物の別の類は、一般式：

【化13】

（式中、
Ｘ、Ｑ、Ｖ及びＶ’は上記と同義であり、
Ｗ’は電子求引基を表し、そして
Ｌは脱離基を表す。）
で表される化合物によって表される。
そのような複合方法に由来する直接的な生成物は、式Ｉｂ（Ｗは電子求引基を表す。）
で表される化合物である。必要に応じて、この結果として生じる式Ｉｂで表される化合物は、他の所望の生成物に変換され得る。具体的には、上述のように、電子求引基は還元されてもよい。

【0052】

一般式：

【化14】

で表される新規な複合体を製造するために、
一般式ＩＶで表される特に好ましい試薬は、一般式ＩＶａ：

【化15】

（式中、
Ａｒは未置換の又は置換されたアリール基、特にフェニル基を表し、ここで
は任意の置換基は連結基Ｑに含有されるアリール基に対し、上述で言及された
ものから選ばれ、そして
Ｒ、Ｗ’、ｖ及びｖ’は上記と同義である。）
を有する。

【0053】

これらの好ましい化合物において、好ましくはｖは０であり、そして好ましくはｖ’は１乃至４の整数、特に１を表す。好ましくはＷ’はＣＯ基を表し、そしてＷはＣＯ基又はＣＨ．ＯＨ基を表す。好ましくはＲは炭素原子数１乃至４のアルキル−アリール基、特にｐ−トリル基を表す。好ましくはＡｒは未置換のフェニル基を表す。好ましくはＸはポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコールを表す。

【0054】

一般式ＩＶで表される試薬を扱うとき、その使用に対する最適な反応条件は、試薬ＩＩ及びＩＩＩとの関連において上記と同じである。

【0055】

一般式

【化16】

（式中、Ｘ、Ｑ、Ｗ’、Ｖ及びＶ’は上記と同義である。）
で表される中間化合物の形成により、上記式ＩＶで表される試薬を用いた複合方法が進行すると考えられる。複合させるための分子の存在下、式Ｖで表される化合物を発生させることが好ましい場合、相対的に高いｐＨは最適に完全に使用される。あるいは、単離段階で上記式Ｖで表される化合物を発生させ、そして複合させるために頻繁に分子を加えることが好ましい場合、初期段階は相対的に高いｐＨ（例えば、７．５乃至８．０）で最適に行われ、一方、次の段階はより低いｐＨ（例えば、６．０乃至６．５）で最適に行われる。

【0056】

上述の通り、存在するヒスチジン残基の数によって決まるので、２つ以上のポリマーは最適なタンパク質と複合されてもよい、そしてこれは図３に概略的に示される。例えば、２つのポリマーは６個の残基ヒスチジンタグと複合され得る。これは多数のポリマー残基をタンパク質に付着させる有用な方法を提供する。低分子量ＰＥＧを用いて高分子量生成物を得たいとき、例えば３つの２０ｋＤのＰＥＧ鎖を用いて６０ｋＤの分子量生成物を得たいとき、または複数の効果を得るため又は例えば単一段階でグリコシル化及びＰＥＧ化
を達成するために、２つの相違するポリマー、例えばタンパク質とＰＥＧ、を別のタンパク質に加えることを望むとき、これは望ましい。そのような多量複合は従来の複合技術で実現するのは多くの場合、困難である。

【0057】

多くのタンパク質は遊離システイン残基及び／又はジスルフィド架橋を含有し、本発明の新規な複合体を調整するのに使用される複合試薬は曝露されたシステイン残基及び還元されたジスルフィド架橋ともまた反応し得る。反応条件及びタンパク質の構造によって決まるので、それらはポリヒスチジンタグにおいてヒスチジン残基と反応するよりもむしろそのような部位と反応し得る。それ故、そのような部位及びポリヒスチジンタグを含有するタンパク質を複合することを望む場合、必要ならば最適なブロッキング手段を使用してもよい。例えば、そのような部位は、ポリマーは相対的に低分子量部位である、上述した一般式ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶに相当する試薬との複合によりブロックされてもよい。ヒスチジン残基との複合はその後、望ましい試薬を用いて行ってもよい。

【0058】

一般式Ｉで表される化合物は、多くの有用性がある。それらは、例えば患者への直接的な臨床的応用に使用され、そしてその結果、本発明はさらに薬学的に受容可能なキャリヤーと共に本発明の化合物を含む薬学的組成物を提供する。本発明はさらに治療での使用、及び患者への本発明に従う薬学的有効量の化合物又は薬学的組成物の投与を含む患者を処置する方法に本発明の化合物を提供する。望ましい薬学的効果、例えば心的外傷処置、酵素補充、タンパク製剤の補充、創傷管理、毒素除去、抗炎症薬、抗感染薬、免疫調整予防接種、又は制癌は、適切なタンパク質の選択により得られる。

【0059】

本発明の化合物は非臨床的応用でもまた使用してもよい。例えば、酵素のような多くの生理的に活性な化合物は、有機溶媒中反応に触媒作用を及ぼすことができ、そして本発明の化合物はそのような用途に使用してもよい。さらに、本発明の化合物は診断用ツールとして使用されてもよい。本発明の化合物は、生体内で化合物の追跡を可能にするため、造影剤、例えばラジオヌクレオチドを含んでいてもよい。

【0060】

タンパク質は、例えばペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、酵素、サイトカイン、ケモカイン、レセプター、血液因子、ペプチド・ホルモン、毒素、転写タンパク質、又は多量体タンパク質でもよい。

【0061】

望ましい用途により決まるので、本発明における有用性を有する、下記のいくつかの具体的なタンパク質が挙げられる。酵素は糖質−特異的酵素、タンパク質分解酵素などを含む。一般的及び治療への応用において、産業上（有機型反応）及び生物学的応用に対する、興味のある酵素は、特にＵＳ４，１７９，３３７号に開示されているオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼを含む。興味ある具体的な酵素は、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アデノシン、デアミナーゼ、スーパーオキシド、ジスムターゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、ビリルビン、オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルタミナーゼを含む。

【0062】

本発明の化合物で使用されるタンパク質は、例えば因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ又はＩＸ及び他の血液因子、インスリン、ＡＣＴＨ、グルカゴン（ｇｌｕｃａｇｏｎ）、ソマトスタチン、ソマトトロピン、サイモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、黄体形成ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、ヘモグロビン、サイトカイン、抗体、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン及び組織プラスミノゲン活性化因子を含む。

【0063】

前記インターロイキン、インターフェロン及びコロニー刺激因子もまた非グルコシル化形態で存在し、普通、組み換えタンパク質技術による調整の結果である。非グルコシル化型は本発明で使用されてもよい。

【0064】

他の興味あるタンパク質は、ポリ（アルキレンオキサイド）のようなポリマーと複合され、そしてその結果として寛容誘導物質としての使用に適しているとき、還元されたアレルギー誘発性を有するとしてＤｒｅｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９９０）６ ３１５ ３６５に開示されているアレルゲンタンパク質である。開示されているアレルギー誘発物質はブタクサ抗原性薬剤Ｅ、ミツバチ毒、ダニ・アレルゲンなどである。

【0065】

免疫グロブリン、オボアルブミン、リパーゼ、グルコセレブロシダーゼ、レクチン、組織プラスミノゲン活性化因子及びグルコシル化（ｇｌｙｃｏｓｉｌａｔｅｄ）インターロイキン、インターフェロン及びコロニー刺激因子のようなグリコポリペプチドは、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ，ＩｇＤ及びそれらのフラグメントのような免疫グロブリンとして興味ある。

【0066】

特に興味あるのは、診断及び治療目的に対する臨床医学において使用されるレセプター及びリガンド結合タンパク質及び抗体及び抗体フラグメントである。抗体は単独で使用されてもよいし又はラジオアイソトープ又は細胞毒性／抗感染症薬のような別の原子又は分子と共有複合（“充填される”）されてもよい。免疫原性のポリマー−タンパク質複合体を製造するために、エピトープはワクチン接種に用いられてもよい。

【実施例】

【0067】

以下の実施例は、本発明を説明する。実施例の結果は添付の図面４乃至２０に示されている。実施例では、６個のヒスチジン残基のポリヒスチジンタグを含有するタンパク質ｐｒｏ−ＢＮＰ、及び８個のヒスチジン残基のポリヒスチジンタグを含有するベータシヌクレインを使用した。心臓組織では、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を１３４個のアミノ酸前駆物質（ｐｒｅｐｒｏ−ＢＮＰ）として合成し、そして１０８個のアミノ酸ｐｒｏ−ＢＮＰを形成するため、プロテアーゼにより開裂した。ベータシヌクレインは小さく、可溶性タンパク質は、主として心臓組織で見つかり、そしてシャペロン様活性を有する。使用された他のタンパク質は、インターフェロン α−２ｂ、エンドスタチン、抗ＴＨＦ−アルファ―ドメイン抗体フラグメントである。

【0068】

実施例１：Ｈｉｓ₆−ｐｒｏＢＮＰの１２ｋＤａ ＰＥＧ化

【化17】

１２ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホン（構造（２））を５時間、ｐＨ７．８、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍｇ／ｍＬ）において、ＰＥＧビス−スルホン（構造（１））のインキュベーションにより調整した。ｐＨ７．８、５０ｍＭリン酸ナトリウム（１０μＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）において、Ｃ末端の６個のヒスチジンタグＰｒｏＢＮＰ（アブカム（Ａｂｃａｍ）、ａｂ４１４０２、１３ｋＤａ）の２つのアリコートを氷上で冷やし、その後１２ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホンを（タンパク質濃度に対して）１モル当量又は３モル当量のいずれかを加えた（各々１．６μＬ又は４．８μＬ）。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、１６時間放置した。
得られた反応混合物を構成物質のサイズ依存分離のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、そしてインスタントブルーステイン（ノベクサン（Ｎｏｖｅｘｉｎ））で染色後得られたゲルを図４に示す。図４では、レーンＭは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン１において標識Ｂが付されたバンドは、供給されたＨｉｓ₆−ｐｒｏＢＮＰのサンプル（アブカム（Ａｂｃ
ａｍ）、１ｍｇ／ｍＬ）である。バンドＡは不純物である。レーン２は、１当量の１２ｋＤａ ＰＥＧ反応混合物から得られ、そしてモノ−ＰＥＧ化生成物、ジ−ＰＥＧ化生成物及びトリ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｃ、Ｄ及びＥが付されたバンドを示す。標識Ａ及びＢが付された下側のバンドは提供されたサンプルにおいて、未反応のＨｉｓ₆−ｐｒｏＢＮＰ及び不純物にそれぞれ相当する。レーン３は、３当量の１２ｋＤａ Ｐ
ＥＧ反応混合物から得られ、そしてモノ−ＰＥＧ化生成物、ジ−ＰＥＧ化生成物及びトリ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｃ、Ｄ及びＥが付されたバンドを示す。標識Ｂ及びＡが付された下側のバンドは提供されたサンプルにおいて、未反応のＨｉｓ₆−ｐｒ
ｏＢＮＰ及び不純物にそれぞれ相当する。
その後、ゲルもまた図５に示される結果と共にＰＥＧを可視化するためにヨウ化バリウムで染色した。レーン１におけるバンドは標識Ｃが付された未反応のＰＥＧ試薬、そしてモノ−ＰＥＧ化生成物、ジ−ＰＥＧ化生成物及びトリ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｄ、Ｅ及びＦが付されたバンドに相当する。標識Ｂ及びＡが付された下側のバンドは提供されたサンプルにおいて、それぞれ未反応のＨｉｓ₆−ｐｒｏＢＮＰ及び不純物に
相当する。１２ｋＤａ ＰＥＧ反応混合物の３当量から得られたレーン３は、未反応のＰＥＧ試薬に相当する標識Ｃが付されたバンドとモノ−ＰＥＧ化生成物、ジ−ＰＥＧ化生成物及びトリ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｄ、Ｅ及びＦが付されたバンドを示す。標識Ｂ及びＡが付された下側のバンドは提供されたサンプルにおいて、未反応のＨｉｓ₆−ｐｒｏＢＮＰ及び不純物にそれぞれ相当する。

【0069】

実施例２：Ｈｉｓ₆−ｐｒｏＢＮＰの３０ｋＤａ ＰＥＧ化

３０ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホン（実施例１における構造（２））を５時間、ｐＨ７．８、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍｇ／ｍＬ）において、ＰＥＧビス−スルホン（実施例１における構造（１））のインキュベーションにより調整した。ｐＨ７．８、５０ｍＭリン酸ナトリウム（１０μＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）において、Ｃ末端の６個のヒスチジンタグＰｒｏＢＮＰ（アブカム（Ａｂｃａｍ）、ａｂ５１４０２）の２つのアリコートを氷上で冷やし、その後３０ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホンを（タンパク質濃度に対して）１モル当量又は３モル当量のいずれかを加えた（各々２．０μＬ又は６．０μＬ）。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、１６時間放置した。
得られた反応混合物を構成物質のサイズ依存分離のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、そしてインスタントブルーステイン（ノベクサン（Ｎｏｖｅｘｉｎ））で染色後得られたゲルを図６に示す。レーンＭは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン１において標識Ｂが付されたバンドは、供給されたＨｉｓ₆−ｐｒｏＢＮＰのサンプル（アブカム（Ａｂｃａｍ）、１
ｍｇ／ｍＬ）である。バンドＡは不純物である。レーン２は、１当量の３０ｋＤａ ＰＥ
Ｇ
反応混合物から得られ、そしてモノ−ＰＥＧ化生成物に相当する標識Ｃが付されたバンド並びに、提供されたサンプルにおいて、未反応のＨｉｓ₆−ｐｒｏＢＮＰ及び不純物にそ
れぞれ相当する標識Ａ及びＢが付された下側のバンドを示す。レーン３は、３当量の３０ｋＤａ ＰＥＧ反応混合物から得られ、そしてモノ−ＰＥＧ化生成物及びジ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｃ及びＤ及が付されたバンド並びに提供されたサンプルにおいて、未反応のＨｉｓ₆−ｐｒｏＢＮＰ及び不純物に相当する標識Ａ及びＢが付された下
側のバンドを示す。
その後、ゲルもまたＰＥＧを可視化するためにヨウ化バリウムで染色し、結果として生じたゲルを図７に示す。レーンＭは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン１において標識Ｂが付されたバンドは、提供されたＨｉｓ₆−ｐｒｏＢＮＰのサンプル（アブカム（Ａｂｃａｍ）、１ｍ
ｇ／ｍＬ）である。バンドＡは不純物である。レーン２は、１当量の３０ｋＤａ ＰＥＧ反応混合物から得られ、そして未反応のＰＥＧ試薬に相当する標識Ｃが付されたバンド、Ｐ
ＥＧ不純物に相当する標識Ｆが付されたバンド、モノ−ＰＥＧ化生成物及びジ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｄ及びＥが付されたバンド、そして提供されたサンプルにおいて、未反応のＨｉｓ₆−ｐｒｏＢＮＰ及び不純物にそれぞれ相当する標識Ｂ及びＡが
付された下側のバンドを示す。レーン３は３当量の３０ｋＤａ ＰＥＧ反応混合物から得られ、未反応のＰＥＧ試薬に相当する標識Ｃが付されたバンド、ＰＥＧ不純物に相当する標識Ｆが付されたバンド、モノ−ＰＥＧ化及びジ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｄ及びＥが付されたバンド、提供されたサンプルにおいて未反応のＨｉｓ₆−ｐ
ｒｏＢＮＰ及び不純物にそれぞれ相当する標識Ｂ及びＡが付された下側のバンドを示す。

【0070】

実施例３：Ｈｉｓ₈−ベータシヌクレインの１２ｋＤａ ＰＥＧ化及び非ヒスチジンタグ
ベータシヌクレインとの比較反応

１２ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホン（実施例１における構造（２））を５時間、ｐＨ７．８、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍｇ／ｍＬ）において、ＰＥＧビス−スルホン（実施例１における構造（１））のインキュベーションにより調整した。ｐＨ７．８、５０ｍＭリン酸ナトリウム（１０μＬ、０．３９ｍｇ／ｍＬ）において、Ｎ末端の８個のヒスチジンベータシヌクレイン（アブカム（Ａｂｃａｍ）、ａｂ４０５４５、１５ｋＤａ）の２つのアリコートを氷上で冷やし、その後１２ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホンを（タンパク質濃度に対して）１モル当量又は３モル当量のいずれかを加えた（各々１．６μＬ又は４．８μＬ）。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、１６時間放置した。
得られた反応混合物を構成物質のサイズ依存分離のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、そしてインスタントブルー（ノベクサン（Ｎｏｖｅｘｉｎ））で染色後得られたゲルを図８に示す。レーンＭは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質
マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン１において標識Ｂが付されたバンドは、アブカム（Ａｂｃａｍ）により、提供されたＨｉｓ₈−ベータシヌクレインのサンプル
（０．８ｍｇ／ｍＬ）である。バンドＡは不純物である。レーン２は、１当量の１２ｋＤａ ＰＥＧ反応混合物から得られ、そしてモノ−ＰＥＧ化生成物及びジ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｃ及びＤが付されたバンド並びに提供されたサンプルにおいて、未反応のＨｉｓ₈−ベータシヌクレイン及び不純物にそれぞれ相当する標識Ａ及びＢが付
された下側のバンドを示す。レーン３は、３当量の１２ｋＤａ ＰＥＧ反応混合物から得られ、そしてモノ−ＰＥＧ化生成物、ジ−ＰＥＧ化生成物、トリ−ＰＥＧ化生成物及びテトラ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦが付されたバンド並びに提供されたサンプルにおいて、未反応のＨｉｓ₈−ベータシヌクレイン及び不純物にそれ
ぞれ相当する標識Ａ及びＢが付された下側のバンドを示す。
その後、ゲルもまたＰＥＧを可視化するためにヨウ化バリウムで染色し、結果として生じたゲルを図９に示す。図９において、レーンＭは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を示す。レーン１は、アブカム（Ａｂｃａｍ）により提供されたＨｉｓ₈−ベータシヌクレインから得られる。レーン２は
、１当量の１２ｋＤａ ＰＥＧ反応混合物から得られ、そしてモノ−ＰＥＧ化生成物、ジ−ＰＥＧ化生成物及びトリ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｃ、Ｄ及びＥが付されたバンド並びに提供されたサンプルにおいて、未反応のＨｉｓ₈−ベータシヌクレイン
及び不純物にそれぞれ相当する標識Ｂ及びＡが付された下側のバンドを示す。レーン３は３当量の１２ｋＤａ ＰＥＧ反応混合物から得られ、そしてモノ−ＰＥＧ化生成物、ジ−ＰＥＧ化生成物、トリ−ＰＥＧ化生成物、及びテトラ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｄ、Ｅ及びＦが付されたバンド並びに提供されたサンプルにおいて、未反応のＨｉｓ₈−ベータシヌクレイン及び不純物にそれぞれ相当する標識Ｂ及びＡが付された下側の
バンドを示す。バンドＣはＰＥＧ不純物である。
比較の１２ｋＤａ ＰＥＧ化の研究は、ｐＨ７．０において１当量のＰＥＧ試薬（２）を使用してＨｉｓ₈−ベータシヌクレインと非ヒスチジンタグベータシヌクレイン（アブ
カム（Ａｂｃａｍ）、ｃａｔ．ｎｏ．ａｂ４８８５３）との間で行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１０に示す。レーンＭは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（ＮｏｖｅｘＳｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。Ｈｉｓ₈−ベータシヌクレインの結果を
標識レーン１に示す。レーン１において、標識Ｂが付されたバンドは未反応のＨｉｓ₈−
ベータシヌクレインであり、標識Ｃが付されたバンドはモノ−ＰＥＧ化Ｈｉｓ₈−ベータ
シヌクレインである。標識２が付されたレーンは非ヒスチジンタグベータシヌクレイン反応を示し、そして可視バンドのみ標識Ａが付され、非ヒスチジンタグベータシヌクレインである。レーン２にはＰＥＧ化タンパク質バンドはなかった。

【0071】

実施例４：Ｈｉｓ₈−ベータシヌクレインの３０ｋＤａ ＰＥＧ化

３０ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホン（実施例１における構造（２））を５時間、ｐＨ７．８、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍｇ／ｍＬ）において、ＰＥＧビス−スルホン（実施例１における構造（１））のインキュベーションにより調整した。ｐＨ７．８、５０ｍＭリン酸ナトリウム（１０μＬ、０．３９ｍｇ／ｍＬ）において、Ｎ末端の８個のヒスチジンベータシヌクレイン（アブカム（Ａｂｃａｍ）、ｃａｔ．ｎｏ．ａｂ４０５４５、１５ｋＤａ）の２つのアリコートを氷上で冷やし、その後３０ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホンを（タンパク質濃度に対して）１モル当量加えた（１．６μＬ）。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、１６時間放置した。
得られた反応混合物を構成物質のサイズ依存分離のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、そしてインスタントブルー（ノベクサン（Ｎｏｖｅｘｉｎ））で染色後得られたゲルを図１１に示す。図１１において、レーンＭは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン１は、アブカム（Ａｂｃａｍ）より提供されたＨｉｓ₈−ベータシヌクレインのサンプル（０．８ｍｇ／ｍ
Ｌ）から得られ、標識Ｂが付されたバンドはポリヒスチジンタグタンパク質である、しかし一方、標識Ａが付されたバンドは不純物である。レーン２は１当量の３０ｋＤａ ＰＥＧ反応混合物から得られ、モノ−ＰＥＧ化生成物に相当する標識Ｃが付されたバンド及び提供されたサンプルにおいて、未反応のＨｉｓ₈−ベータシヌクレイン及び不純物にそれ
ぞれ相当する標識Ａ及びＢが付された下側のバンドを示す。
その後、ゲルもまたＰＥＧを可視化するためにヨウ化バリウムで染色し、結果として生じたゲルを図１２に示す。図１２において、レーンＭは校正として用いられるノヴェック
ス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン１は、アブカム（Ａｂｃａｍ）より提供されたＨｉｓ₈−ベータシヌクレインから得られる。レーン
２は、１当量の３０ｋＤａ ＰＥＧ反応混合物から得られ、そして未反応のＰＥＧ試薬に相当する標識Ｃが付されたバンド、ＰＥＧ不純物に相当する標識Ｅ及びＧが付されたバンド、モノ−ＰＥＧ化生成物及びジ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｄ及びＦが付されたバンド、提供されたサンプルにおいて、未反応のＨｉｓ₈−ベータシヌクレイン及
び不純物にそれぞれ相当する標識Ｂ及びＡが付された下側のバンドを示す。

【0072】

実施例５：１０ｋＤａ及び２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬３とＣ末端上の８個のヒスチジン配列とインターフェロン（ＩＦＮ） α−２ｂにおけるヒスチジン上のＰＥＧ化

【化18】

【0073】

第１段階：ｐ−カルボキシ−３−ピペリジノプロプリオフェノンヒドロクロライド ３（２）の合成

【化19】

２５０ｍＬの丸底フラスコをｐ−アセチル安息香酸（１５．０ｇ、３（１））、塩酸ピペリジン １１．１１ｇ及びｐ−ホルムアルデヒド ８．２３ｇで充填した。その後、無水エタノール（９０ｍＬ）及び濃塩酸（１ｍＬ）を加え、アルゴン下で撹拌させがら、得られた懸濁液を１０時間加熱還流した。還流を止めた後、アセトン（１５０ｍＬ）を加え、この反応混合物を室温まで冷却した。得られた白色の沈殿物をガラスフィルター（Ｇ３）で単離し、冷やしたアセトンで２回洗浄した。その後、固形物を真空下で乾燥し、白色の結晶粉末（３（２）、９．７２ｇ）を得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ₆）
δ １．７９，２．９６，３．４５（ｂｒ ｍ，ピペリジン部位のＣＨ₂），３．３６（
ｔ，２Ｈ，ＣＯＣＨ₂），３．７４（ｔ，２Ｈ，ＮＣＨ₂），８．０９（ｍ，４Ｈ，ＡｒＨ）

【0074】

第２段階：４−（３−（ｐ−トリルチオ）プロパノイル）安息香酸 ３（５）の合成

ｐ−カルボキシ−３−ピペリジノプロプリオフェノンヒドロクロライド ３（２）（１．０ｇ）及び４−メチルベンゼンチオール（４１７ｍｇ、３（３））を無水エタノール（７．５ｍＬ）及びメタノール（５ｍＬ）の混合物中で懸濁した。その後、ピペリジン（５０μＬ）を加え、この懸濁液をアルゴン雰囲気下６時間撹拌させながら加熱還流した。室温まで冷却後、得られた白色の沈殿物をガラスフィルター（Ｇ３）で濾過し、冷やしたアセトンで注意い深く洗浄し、固形物を真空下で乾燥し、３（３）（６１４ｍｇ）を得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ₆）
δ ２．２７（ｓ，３Ｈ，フェニル−ＣＨ₃），３．２４，３．３９（ｔ，２Ｈ×２，Ｃ
Ｈ₂），７．１４，７．２６（ｄ，２Ｈ×２，トリル基部位のＡｒＨ），８．０３（ｍ，
４Ｈ，カルボン酸部位のＡｒＨ）

【0075】

第３段階：４−（３―トシルプロパノイル）安息香酸 ３（４）の合成

４−（３―（ｐ−トシルチオ）プロパノイル）安息香酸 ３（４）（１６０ｍｇ）を水（１０ｍＬ）及びエタノール（１０ｍＬ）の混合物中で懸濁した。氷浴で冷却後、オキソン（７２０ｍｇ、アルドリッチ社製）を加え、一晩中（１５時間）撹拌させながら、この反応混合物を室温まで温めた。得られた懸濁液がほぼ均一になり、その後混合物をクロロホルム（合計１００ｍＬ）で３回抽出できるように、得られた懸濁液を追加の水で希釈した。溜まったクロロホルム抽出物を食塩水で洗浄し、その後硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄）で乾燥させた。３０℃での真空下、揮発性物質の蒸発により、白色の固形物を得た３
（４）（１４９ｍｇ）。
¹Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ₆）
δ ２．４１（ｓ，３Ｈ，フェニル−ＣＨ₃），３．４２（ｔ，２Ｈ，ＣＯ−ＣＨ₂），３．６４（ｔ，２Ｈ，ＳＯ₂−ＣＨ₂），７．４６，７．８２（ｄ，２Ｈ×２，トリル基部位のＡｒＨ），８．０３（ｍ，４Ｈ，カルボン酸部位のＡｒＨ）

【0076】

第４段階：ＰＥＧ化４−（３―トシルプロパノイル）安息香酸、ＰＥＧ試薬３の合成

４−（３―トシルプロパノイル）安息香酸３（４）（１３３ｍｇ）及びｏ−２−アミノエチル）−ｏ’−メチル−ＰＥＧ（ＭＷ １０ｋＤａ、５０２ｍｇ、バイオ べクトラ社製（ＢｉｏＶｅｃｔｒａ））を乾燥したトルエン（５ｍＬ）に溶解させた。加熱しないで真空下で溶媒を除去し、乾燥した固形残渣をアルゴン下で乾燥したジクロロメタン（１５ｍＬ）に再溶解させた。得られた溶液を氷浴で冷やし、アルゴン下でジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ、６０ｍｇ）をゆっくりと加えた。その後、この反応混合物を一晩（１５時間）室温で撹拌させた。それから、揮発性物質を真空下（３０℃、水浴）で除去し、アセトン中（２０ｍＬ）微温（３５℃）で再溶解させた固形残渣を得た。不溶性物質を除去するため、溶液を非吸収性コットンウールで濾過した。その後、溶液をドライアイス浴で冷却し、遠心分離（４６００ｒｐｍ、３０分間）により分離された白色の沈殿物を得た。液相をデカントし、この沈殿操作を３回繰り返した。その後、得られた純白でない固体を真空下で乾燥し、ＰＥＧ試薬 ３（４３７ｍｇ）を得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）
δ ２．４６（ｓ，３Ｈ，フェニル−ＣＨ₃），３．３８（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧ−ＯＣＨ₃），３．４４−３．８２（ｂｒ ｍ，ＰＥＧ），７．３８，７．８３（ｄ，２Ｈ×２，トリル基部位のＡｒＨ），７．９５（ｍ，４Ｈ，カルボン酸部位のＡｒＨ）

【0077】

第５段階：Ｃ末端のｈｉｓ₈タグＩＦＮ α―２ｂのヒスチジン上のＰＥＧ化

ＩＦＮ α―２ｂ（ｐＨ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液において１．１３ｍｇ／ｍＬ）の２０μＬ溶液に１モル当量の１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬３（脱イオン水中６ｍｇ／ｍＬ溶液の１．８μＬ）を加え、得られた溶液を室温で一晩、インキュベートした。１モル当量の２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬でも繰り返し行い、再び前述した（脱イオン水中６．６ｍｇ／ｍＬ溶液の３．３μＬ）ような類似の方法により調製した。その後、両サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ニューページ ノーべックス ４−１２％ ビス−トリスゲル、ＭＥＳ ランニングバッファー（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓｇｅｌｓ、ＭＥＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）、全てインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）、及びインスタントブルーステイン（イクスペデオン（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＳＢ１Ｌ））により分析した。その結果を図１３に示す。レーン１はタンパク質マーカーである。レーン２は出発ＩＦＮのみである。レーン３は１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬反応の結果を示す。複合された１乃至５個のＰＥＧ鎖と共にＩＦＮに相当する３０と１６０ｋＤａ タンパク質マーカーとの間に５つのはっきりと区別できるバンドがある。レーン４は２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬反応の結果を示す。複合された１乃至３つのＰＥＧ鎖と共にＩＦＮに相当する６０と１１０ｋＤａ タンパク質マーカーとの間に３つのはっきりと区別できるバンドがある。レーン５は染色していない２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬であり、そのためバンドは可視的ではない。レーン６は染色していない１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬であり、そのためバンドは可視的ではない。

【0078】

実施例６：Ｈｉｓ₈−ベータシヌクレインの５ｋＤａ ＰＥＧ化

【化20】

５ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホン（構造（５））を３時間、ｐＨ７．８、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（５ｍｇ／ｍＬ）において、ＰＥＧビス−スルホン（構造（４））のインキュベーションにより調整した。ｐＨ７．４、５０ｍＭリン酸ナトリウム（１０μＬ、０．３８ｍｇ／ｍＬ）において、Ｎ末端の８個のヒスチジンタグベータシヌクレイン（アブカム（Ａｂｃａｍ）、ｃａｔ．ｎｏ．ａｂ４０５４５、１５．４ｋＤａ）の２つのアリコートを氷上で冷やし、その後５ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホン（５）を（タンパク質濃度に対して）１モル当量又は３モル当量のいずれかを加えた（各々０．２５μＬ又は０．７４μＬ）。対照として、ベータシヌクレイン（アブカム（Ａｂｃａｍ）、ｃａｔ．ｎｏ．ａｂ４８８５３、１４．３ｋＤａ）の２つのアリコートを同じように扱い、５ｋＤａ
ＰＥＧモノ−スルホンの１モル当量（０．１８μＬ）又は３モル当量（０．５２μＬ）のいずれかを加えた。その後反応は室温で６時間インキュベートした。得られた反応溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、図１４に示すようにインスタントブルー（エクスペデオン（ｅｘｐｅｄｅｏｎ））で染色した。レーンＭは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン１及び２はそれぞれ１当量の５ｋＤａ ＰＥＧ反応混合物及び３当量のＰＥＧ反応混合物から得られる。標識Ａが付されたバンドはＨｉｓ₈−ベータシヌクレインである。標識Ａより下のか
すかなバンドはアブカム（Ａｂｃａｍ）より提供されたタンパク質からの不純物である。Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを標識化したバンドは、モノ−ＰＥＧ化、ジ−ＰＥＧ化、トリ−ＰＥＧ化、及びテトラ−ＰＥＧ化タンパク質生成物にそれぞれ相当する。

【0079】

実施例７：異なったｐＨでのＨｉｓ₆−抗ＴＮＦ−α ドメイン抗体フラグメントの１０
ｋＤａ ＰＥＧ化

１０ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホン（実施例１における構造（２））を３時間、ｐＨ７．８、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（５ｍｇ／ｍＬ）において、ＰＥＧビス−スルホ
ン（実施例１における構造（１）、１０ｍｇ／ｍＬ）のインキュベーションにより調整した。５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩酸ナトリウム及び２ｍＭ ＥＤＴＡにおいて、Ｃ末端の６個のヒスチジンタグ抗ＴＮＦアルファドメイン抗体フラグメント（１２．７ｋＤａ）溶液（０．６ｍｇ／ｍＬ）を４つの異なるｐＨ（ｐＨ６．２、ｐＨ６．７、ｐＨ７．０及びｐＨ７．４）で調製した。３モル当量の１０ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホン（構造（２）、１．４１μＬ）を４つの異なったｐＨそれぞれにおいてＨｉｓ₆−ドメイ
ン溶液に加えた（１０μＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ）。その後、反応を室温で３時間インキュベーションした。
得られた反応溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、図１５に示すようにインスタントブルー（エクスペデオン（ｅｘｐｅｄｅｏｎ））で染色した。レーンＭはノヴェックス
シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン１乃至４はそれぞれｐＨ６．２、ｐＨ６．７、ｐＨ７．０及びｐＨ７．４において、３当量の１０ｋＤａ ＰＥＧを用いて反応混合物から得られる。標識Ａが付されたバンドは未反応のＨｉｓ₆−抗ＴＮＦアルファドメイン抗体フラグメントである。標識Ｂが付されたバンドは、モ
ノ−ＰＥＧ化ドメイン生成物である。標識Ｃ及びＤが付されたバンドは、ジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ドメインフラグメントにそれぞれ相当する。ＰＥＧ化は４つのｐＨごとに見られ、ｐＨが増加するにつれてＰＥＧ化の大きさも増加する。

【0080】

実施例８：１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａを用いたＨｉｓ₆−抗Ｔ
ＮＦ−α ドメイン抗体フラグメントのＰＥＧ化

１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａ ＰＥＧビス−スルホン（実施例１における構造（１））を室温において３時間、ｐＨ７．８、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（５ｍｇ／ｍＬ）で、別々にインキュベーションし、対応するＰＥＧモノ−スルホン（実施例１における構造（２））を得た。ＰＥＧの濃度は１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａ ＰＥＧそれぞれに対して、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ及び４０ｍｇ／ｍＬである。５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩酸ナトリウム及び２ｍＭ ＥＤＴＡにおいて、Ｃ末端の６個のヒスチジンタグ抗ＴＮＦドメイン抗体（１２．７ｋＤａ）溶液（１．２５ｍｇ／ｍＬ、５μＬ）の４つのアリコートに、その後１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホン（０．７４μＬ、１．５モル当量）を加えた。それから、反応を４℃で８時間インキュベーションした。その後、反応溶液を図１６に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。レーンＭは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン１は参照用にＨｉｓ₆−抗ＴＮＦドメイン抗体フラグメン
トである。レーン２乃至５は１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａ ＰＥＧの反応からそれぞれ得られる。標識Ａが付されたバンドは未反応のＨｉｓ₆−抗ＴＮＦ
ドメインである。標識Ｂ（Ｂ１０、Ｂ２０、Ｂ３０及びＢ４０）が付されたバンドは、１０、２０、３０及び４０ｋＤａ ＰＥＧに対するモノ−ＰＥＧ化ドメインフラグメントにそれぞれ相当する。標識Ｃ１０が付されたバンドは１０ｋＤａ ＰＥＧ反応に対するジ−ＰＥＧ化生成物に相当し、Ｃ２０バンドは２０ｋＤａ ＰＥＧ反応に対するジ−ＰＥＧ化生成物に相当する。

【0081】

実施例９：Ｈｉｓ₆−エンドスタチンの２ｋＤａ ＰＥＧ化及びポリヒスチジンタグを有
さないエンドスタチンとの比較反応

２ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホン（実施例１における構造（２））を４時間、ｐＨ７．８、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１ｍｇ／ｍＬ）において、ＰＥＧビス−スルホン（実施例１における構造（１））のインキュベーションにより調整した。ｐＨ６．２、５
０ｍＭリン酸ナトリウム（３０μＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）において、Ｃ末端の６個のヒスチジンタグエンドスタチン（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）ｃａｔ．ｎｏ．３２４７４３）の２つのアリコートを氷上で冷やし、その後２ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホンを（タンパク質濃度に対して）１モル当量又は３モル当量のいずれかを加えた（各々１．４μＬ又は４．２μＬ）。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、１６時間放置した。
ｐＨ６．２、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１０μＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ）において、非タグエンドスタチン（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）ｃａｔ．ｎｏ．３２４７６９）の２つのアリコートもまた氷上で冷やし、その後２ｋＤａ ＰＥＧモノ−スルホン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を（タンパク質濃度に対して）１モル当量又は３モル当量のいずれかを加えた（各々２．０μＬ又は６．０μＬ）。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、１６時間放置した。
得られた反応混合物を構成物質のサイズ依存分離のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、そしてインスタントブルー（エクスペデオン（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ））で染色後得られたゲルを図１７に示す。図１７では、標識Ｍが付されたスポットの左側のカラムはノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン１はＨｉｓ₆−エンドスタチン反応と共に１当量の２ｋＤａ ＰＥＧのサンプルから得られ、
未反応のタンパク質及びモノ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｂ及びＣが付されたバンドを示す。レーン２はＨｉｓ₆−エンドスタチン反応と共に３当量の２ｋＤａ Ｐ
ＥＧのサンプルから得られ、未反応のタンパク質及びモノ−ＰＥＧ化生成物にそれぞれ相当する標識Ｂ及びＣが付されたバンドを示す。レーン３及び４はそれぞれ、エンドスタチン反応と共に１当量の２ｋＤａ ＰＥＧ及びエンドスタチン反応と共に３当量の２ｋＤａ
ＰＥＧから得られる。未反応のタンパク質に相当する標識Ａ及びＢがそれぞれ付された１個のバンドにのみ、２ｋＤａ ＰＥＧだけがＨｉｓ₆−エンドスタチンと反応すること
を示す両反応に存在する。

【0082】

実施例１０：Ｈｉｓ₈−インターフェロン アルファの１０、２０ｋＤａ及び３０ｋＤａ
ＰＥＧ化及び非ヒスチジンタグインターフェロン アルファとの比較反応

Ｎ末端の８個のヒスチジンタグインターフェロン α−２ｂの溶液（２．６３ｍＬ／、１．１４ｍｇ／ｍＬ）を１５０ｍＭ塩酸ナトリウム（ＰＢＳ）を含有する、ｐＨ７．４、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で調製し、その後（タンパク質濃度に対して）１．７モル当量の２０ｋＤａ ＰＥＧビス−スルホン（実施例１における構造（１））を加えた（脱イオン水において１１．５ｍｇ／ｍＬ ２０ｋＤａ ＰＥＧビス−スルホン溶液の４２０μＬ）。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、１８時間放置した。得られた反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、その結果を図１８に示す。図１８において、レーンＭは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン１は、標識Ａが付されたバンドが未反応のＩＦＮに、標識Ｂが付されたバンドがモノ−ＰＥＧ化ＩＦＮに、標識Ｃが付されたバンドがジ−ＰＥＧ化ＩＦＮに及び標識Ｄが付されたバンドがトリ−ＰＥＧ化ＩＦＮに相当する反応溶液を示す。
０．５ｍｇ／ｍＬにおける１当量の３０ｋＤａ ＰＥＧとの二次反応及びＮ末端の８個のヒスチジン溶液は、ｐＨ７．５においてインターフェロン α−２ｂ（３．２ｍＬ、０．７９３ｍｇ／ｍＬ）をタグ付けした。その結果は、６０と８０ｋＤａ タンパク質マーカー間の可視的なモノ−ＰＥＧ化ＩＦＮバンドとの２０ｋＤａ反応、ジ−ＰＥＧ化ＩＦＮに相当する１１０と１６０ｋＤａ間のバンド及びトリ−ＰＥＧ化ＩＦＮに相当する１６０と２６０ｋＤａ タンパク質マーカー間の第三のバンドと似ている。非ヒスチジンタグＩＦＮ α−２ｂとの対比は、図１８のレーン２に示される結果と共に、１８時間後及び同じ条件下、１当量のＰＥＧ試薬（１）との反応を示さなかった。

【0083】

実施例１１：Ｎ末端の８個のヒスチジンタグインターフェロン アルファへの複合に対するポリ（ビニルピロリジン）（ＰＶＰ ビス−スルホン）の使用

＜末端アミノ基を有するＰＶＰの調製＞
圧力管にシステアミン（０．０４２ｇ）、ジオキサン（８ｍＬ）及びマグネチックスターバーを充填した。溶液を形成するために穏やかな加熱後、溶液を室温で５分間アルゴンでパージした。パージしながら、１−ビニル−２−ピロリドン（２．０ｇ）をその後加え、さらに５分後、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（０．０８９ｇ）を加えた。さらに２分後、アルゴン下で圧力管をねじぶたで封し、撹拌しながら２３時間オイルバスの中に置いた。チューブと内容物を室温まで冷ました後、ポリマー生成物の沈殿物を得るため、ジエチルエーテル（１５ｍＬ）を加えた。液相をデカントし固体残渣をアセトン（３ｍＬ）に再溶解した。その後、得られたアセトン溶液を迅速に撹拌されているジエチルエーテル（２５ｍＬ）に一滴ずつ加え、沈殿物を真空のほんの僅かなバーストと共にｎｏ．２ 焼結ガラス漏斗で単離した。固形物を未乾燥のジエチルエーテル（１０ｍＬ）で洗浄し、その後室温で真空下乾燥させた（質量＝１．２４ｇ、白色の固体）。

＜ＰＶＰ−アミンへのタンパク質反応末端基の複合＞
ＰＶＰ−アミン（５００ｍｇ）、４−［２，２−ビス［（ｐ−トリルスルホニル）メチル］アセチル］−安息香酸（１２５ｍｇ）、及び４−ジメチルアミノピリジン（６ｍｇ）をアルゴン下、無水ジクロロメタン（１０ｍｌ）で混合し、その後撹拌しながら、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（８０μＬ）を加えた。得られた混合物を室温で２０時間撹拌し、その後非吸収性コットン−ウールを通して濾過した。それから濾液にジエチルエーテル（２０ｍＬ）を加え、得られた沈殿物を遠心分離（２，０００ｒｐｍ、２分間、２℃）により単離した。液相をデカントし、残りの残渣を数分間、酢酸エチル（５ｍＬ）でボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。酢酸エチル層をデカント後、固形残渣をジクロロメタン（５ｍＬ）に再溶解し、その後酢酸エチル（１５ｍＬ）を加えた。溶液を１５分間ドライアイス内に置き、その後遠心分離（２，０００ｒｐｍ、２分間、２℃）により単離された固形物の沈殿物を得た。得られた粘着性の残渣を未乾燥の酢酸エチル（５ｍＬ）でボルテックスし、その後室温で真空下乾燥した（質量＝０．１１８ｇ）。

＜ＰＶＰ ビス−スルホンの分別＞
上述の段階で得られた固形物をｐＨ ４．０、水性の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌで混合し、その後澄明な液が可視的になるまで１３，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけた。液相を固形残渣から除去し、その後溶出ピークの間１分ごとに留分を集めることにより１ｍＬ／ｍｉｎにおいて２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ、ｐＨ４．０を稼動させながら、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標） ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で分別した。７２〜８０分の間で溶出した留分はタンパク質複合に使用される。

＜Ｎ末端の８個のヒスチジンタグＩＦＮ アルファへのＰＶＰ複合化＞
ＩＦＮ（０．０２５ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍＬ）を１５０ｍＭ塩酸ナトリウム（ＰＢＳ）を含有するｐＨ７．５、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で調製した。ＩＦＮ（２５μｇ、０．５ｍｇ／ｍＬ）の５０μＬに分別ＰＶＰ ビス−スルホン（留分７２分、７４分、７８分及び８０分）を５０μＬ加えた。得られた溶液を静かに混合し、４℃で一晩放置した。結果として得られた反応溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、その結果を図１９に示す。図１９において、レーンＭは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン２乃至５は使用された異なった
サイズのＰＶＰ試薬留分からの反応溶液を示す（２〜５それぞれからの７２〜８０分のＰＶＰ留分）。標識Ｂが付されたバンドは得られたモノ−及び多量ＰＶＰ化ＩＦＮを示す。

【0084】

実施例１２：Ｎ末端の８個のヒスチジンタグインターフェロン アルファを用いてインターフェロン アルファとインターフェロン アルファの多量複合

【化21】

Ｎ末端の８個のヒスチジンタグインターフェロン α−２ｂ（５０μＬ、１．１４ｍｇ／ｍＬ）の溶液を１５０ｍＭ塩酸ナトリウム（ＰＢＳ）を含有するｐＨ７．５、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で調製し、その後（タンパク質濃度に対して）０．１２５モル当量の１０ｋＤａ ＰＥＧ二官能性のＰＥＧ試薬（６）を加えた（水において（６）の８ｍｇ／ｍＬ溶液の０．４７μＬ）。反応を室温で１８時間放置した。得られた反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＩＦＮ−ＰＥＧ−ＩＦＮ融合複合体に相当するインスタントブルー（エクスペデオン（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ））で撹拌後、得られたゲルは５０ｋＤａと６０ｋＤａ ノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の間のバンドを示した。

【0085】

実施例１３：遊離システインを含有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とＮ末端の８個のヒスチジンタグインターフェロン アルファの多量複合

１５０ｍＭ塩酸ナトリウム（ＰＢＳ）を含有するｐＨ７．５、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で調製したＮ末端の８つのヒスチジンタグインターフェロン α−２ｂ（１ｍＬ、１．１４ｍｇ／ｍＬ）の溶液にヒト血清アルブミン（ＩＦＮに対して３モル当量、１０．７７ｍｇ）を加え、溶解させた。この溶液に１０ｋＤａ ＰＥＧビス（ビス−スルホン）（実施例１２における構造（６））（ＩＦＮに対して１モル当量、水において８ｍｇ／ｍＬ １０ｋＤａ ＰＥＧビス（ビス−スルホン）（６）溶液の７５μＬ）を加えた。この反応混合物を室温で１８時間放置した。得られた反応混合物をイオン交換クロマトグラフィー、続いて金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、その結果を図２０に示す。図２０において、レーンＭは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す。レーン１は、標識Ａが付されたバンドは未反応のＩＦＮであり、標識Ｂが付されたバンドはモノ−ＰＥＧ化ＩＦＮであり、標識Ｃが付されたバンドはＩＦＮ−ＰＥＧ−ＩＦＮであり、そして標識Ｄが付されたバンドはＩＦＮ−ＰＥＧ−アルブミンである精製された反応溶液を示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】