特許 5934102 ＰＵＦＡ誘導体による酸化ストレス障害の緩和

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5934102

(24)【登録日】2016年5月13日

(45)【発行日】2016年6月15日

(54)【発明の名称】ＰＵＦＡ誘導体による酸化ストレス障害の緩和

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/201 20060101AFI20160602BHJP

   A61K 31/202 20060101ALI20160602BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160602BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20160602BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20160602BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20160602BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20160602BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20160602BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20160602BHJP

   A61K 31/231 20060101ALI20160602BHJP

   A61K 31/232 20060101ALI20160602BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/201

   A61K31/202

   A61P43/00 123

   A61P9/10

   A61P3/06

   A61P9/10 101

   A61P43/00 105

   A61P25/00

   A61P19/00

   A61P21/00

   A61P3/00

   A61K31/231

   A61K31/232

【請求項の数】18

【全頁数】51

(21)【出願番号】特願2012-537152(P2012-537152)

(86)(22)【出願日】2010年10月29日

(65)【公表番号】特表2013-509439(P2013-509439A)

(43)【公表日】2013年3月14日

(86)【国際出願番号】US2010054866

(87)【国際公開番号】WO2011053870

(87)【国際公開日】20110505

【審査請求日】2013年10月29日

(31)【優先権主張番号】61/256,815

(32)【優先日】2009年10月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510247526

【氏名又は名称】レトロトップ、 インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＴＲＯＴＯＰＥ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】シチェピノフ、 ミハイル エス．

【審査官】 中尾 忍

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０６４１７２３３（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 Shchepinov,M.S.，“Reactive Oxygen Species, Isotope Effect, Essential Nutrients, and Enhanced Longevity”，Rejuvenation Res.，２００７年 ３月，Vol.10，No.1，pp.47-59

【文献】 J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1，１９９１年，No.3，pp.581-587

【文献】 Biochim. Biophys. Acta - Lipids and Lipid Metabolism，１９８５年 ７月３１日，Vol.835，No.3，pp.421-425

【文献】 Shchepinov,M.S.，“Reactive Oxygen Species, Isotope Effect, Essential Nutrients, and Enhanced Longevity”，Rejuvenation Res.，２００７年 ３月，Vol.10，No.1，P.47-59

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／２０１

Ａ６１Ｋ ３１／２０２

Ａ６１Ｋ ３１／２３１

Ａ６１Ｋ ３１／２３２

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＣＡ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

有効成分として同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルのみを含有する、対象のミトコンドリア欠損疾患またはミトコンドリア呼吸欠損疾患の進行の治療または予防において使用するための医薬組成物であって、該同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルが、投与時に対象のミトコンドリア膜に組み込まれ、該同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルにおける同位体が、天然に存在する量よりも豊富に存在し、該同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルが、少なくとも１つの重水素を有する式ＩＩの化合物

【化1】

（式中、
Ｒは水素またはＣ_３Ｈ_７であり、
Ｒ^１は水素またはアルキルであり、
Ｙはそれぞれ独立に重水素または水素であり、
Ｘはそれぞれ独立に重水素または水素であり、
ｎは１〜５であり、
ｍは１〜１０であり、
ｐは１〜１０である。）
であることを特徴とする医薬組成物。

【請求項2】

前記対象が補酵素Ｑ欠損を有する、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記対象が、ａ）神経系疾患を有するかもしくは神経系疾患にかかりやすい、ｂ）ジスキネジアを有するかもしくはジスキネジアにかかりやすい、ｃ）運動失調を有するかもしくは運動失調にかかりやすい、ｄ）筋骨格疾患を有するかもしくは筋骨格疾患にかかりやすい、ｅ）筋力低下を有するかもしくは筋力低下を起こしやすい、ｆ）神経筋疾患を有するかもしくは神経筋疾患にかかりやすい、またはｇ）代謝性疾患を有するかもしくは代謝性疾患にかかりやすい、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

有効成分として同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルのみを含有する、先天性代謝異常の対象において酸化ストレスの低減に使用するための医薬組成物であって、該同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルが、投与時に対象の脳および／または神経組織に組み込まれ、該同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルにおける同位体が、天然に存在する量よりも豊富に存在し、該同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルが、少なくとも１つの重水素を有する式ＩＩの化合物

【化2】

（式中、
Ｒは水素またはＣ_３Ｈ_７であり、
Ｒ^１は水素またはアルキルであり、
Ｙはそれぞれ独立に重水素または水素であり、
Ｘはそれぞれ独立に重水素または水素であり、
ｎは１〜５であり、
ｍは１〜１０であり、
ｐは１〜１０である。）
であることを特徴とする医薬組成物。

【請求項5】

前記先天性代謝異常がダウン症候群である、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記組成物がヒトの摂取に適しており、および
前記同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルが、対象による摂取もしくは取込み後に対象の体成分に組み込まれる時にその化学的同一性を保持することができる、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルが、１１，１１，Ｄ２−リノール酸、１１−Ｄ−リノール酸、１１，１１，１４，１４，Ｄ４−リノール酸、１１，１４，Ｄ２−リノール酸、１１，１１，Ｄ２−リノレン酸、１１−Ｄ−リノレン酸、１４−Ｄ−リノレン酸、および１４，１４−Ｄ２−リノレン酸からなる群から選択される同位体修飾された多価不飽和脂肪酸、もしくは該同位体修飾された多価不飽和脂肪酸のエチルエステル又はグリセリルエステルである、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルが、前ビスアリル位において重水素をさらに含む、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルが、５０％〜９９％の同位体純度を有する同位体修飾された多価不飽和脂肪酸である、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルが、ビスアリル位または前ビスアリル位において酸化に対して安定化している、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルが、酸化感受性位において酸化に対して安定化されている、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルが、ビスアリルの炭素原子と水素原子の酸化感受性位において酸化に対して安定化されている、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記対象が、自動酸化に抵抗するのに十分な濃度の同位体修飾された多価不飽和脂肪酸を維持するための十分な量の該同位体修飾された多価不飽和脂肪酸を投与される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記対象が運動失調を有するかまたは運動失調にかかりやすい、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記同位体修飾された多価不飽和脂肪酸エステルが、１１，１１，Ｄ２−リノール酸、１１−Ｄ−リノール酸、１１，１１，１４，１４，Ｄ４−リノール酸、１１，１４，Ｄ２−リノール酸、１１，１１，Ｄ２−リノレン酸、１１−Ｄ−リノレン酸、１４−Ｄ−リノレン酸、または１４，１４−Ｄ２−リノレン酸のエチルエステル又はグリセリルエステルである、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記同位体修飾された多価不飽和脂肪酸エステルが、１１，１１，Ｄ２−リノール酸、１１−Ｄ−リノール酸、１１，１１，１４，１４，Ｄ４−リノール酸、１１，１４，Ｄ２−リノール酸、１１，１１，Ｄ２−リノレン酸、１１−Ｄ−リノレン酸、１４−Ｄ−リノレン酸、または１４，１４−Ｄ２−リノレン酸のエチルエステルである、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記同位体修飾された多価不飽和脂肪酸エステルが、１１，１１，Ｄ２−リノール酸、１１−Ｄ−リノール酸のエチルエステルである、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記同位体修飾された多価不飽和脂肪酸エステルが、１１，１１，Ｄ２−リノール酸のエチルエステルである、請求項１に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国仮出願番号第６１／２５６，８１５号の優先権を主張する。

【0002】

同位体修飾された多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）および他の修飾されたＰＵＦＡは、特定の疾患を治療する方法において有用である。

【背景技術】

【0003】

関連技術の説明
本願と同じ譲受人に譲渡された米国出願番号第１２／２８１，９５７号は、正常な体成分と機能的に等しいが、活性酸素種（ＲＯＳ）、活性窒素種（ＲＮＳ）または放射線によって媒介されるプロセスなどの分解／有害プロセスに対してより高い耐性を有する体成分、例えば脂肪を摂取時に形成する化合物のクラスに言及する。参照によって本明細書に組み込まれるこの出願文書は、少なくとも１つの交換可能なＨ原子が^２Ｈであり、かつ／または少なくとも１つのＣ原子が^１３Ｃである必須栄養素に言及する。この出願文書はまた、１１,１１ジジュウテロリノール酸を開示している。

【0004】

重水素化メチレン基のＣ原子が^１３Ｃであり得る、１１,１１ジジュウテロリノール酸および１１,１１,１４,１４Ｄ４リノレン酸ならびに類似の化合物が開示されている。Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ,Ｍ、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｉｓｏｔｏｐｅ ＥＦＦＥＣＴ,Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ、Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ.１０、Ｎｏ.１（２００７年）（非特許文献１）。この論文は、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0005】

酸化ストレスは様々な疾患に関連し得るが、どの抗酸化剤が様々な疾患の治療において成功するかは予測不可能である。したがって当技術分野では、様々な疾患に対して成功する治療が必要とされている。したがって当技術分野では、様々な疾患の治療に有用なさらなる同位体修飾された多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）および他の修飾されたＰＵＦＡが必要とされている。

【0006】

ＰＵＦＡの特定の位置を置き換えることは、ＰＵＦＡが関与する有益な代謝プロセスを予防し、または減速させることもあり、したがって当技術分野では、これらの代謝プロセスを十分に維持すると同時に有害な酸化プロセスに抵抗する、修飾されたＰＵＦＡを決定することが有益となり得る。

【0007】

また当技術分野では、有害な酸化プロセスを予防するのに必要な重原子置換の最小量を決定して、重原子置換の費用を節約することが有益となり得る。本明細書では、これらおよび他の態様に対処する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国特許第７２７１３１５号明細書

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ,Ｍ、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｉｓｏｔｏｐｅ ＥＦＦＥＣＴ,Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ、Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ.１０、Ｎｏ.１（２００７年）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本開示は、これらの必要性、およびさらなる同位体修飾された多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、その模倣薬（ｍｉｍｅｔｉｃ）またはエステルプロドラッグの必要性に対処するものである。さらに本開示は、ヒト対象などの対象において修飾されたＰＵＦＡを使用する、特定の疾患の新しい治療方法および予防方法の必要性に対処するものである。

【0011】

いくつかの実施形態は、神経変性疾患を有するか、または神経変性疾患にかかりやすい対象を選択するステップと、投与時に対象の脳および／または神経組織に組み込まれる有効量の同位体修飾された多価不飽和脂肪酸、その模倣薬またはエステルプロドラッグを対象に投与するステップとを含む、神経変性疾患の進行を治療または予防する方法を含む。神経変性疾患を有する患者には、他の疾患の中でも、ａ）アルツハイマー病を有するか、またはアルツハイマー病にかかりやすい、ｂ）軽度認知障害を有するか、または軽度認知障害にかかりやすい、ｃ）パーキンソン病を有するか、またはパーキンソン病にかかりやすい、ｄ）統合失調症を有するか、または統合失調症にかかりやすい、ｅ）双極性障害を有するか、または双極性障害にかかりやすい、ｆ）筋萎縮性側索硬化症を有するか、または筋萎縮性側索硬化症にかかりやすい対象が含まれ得る。

【0012】

いくつかの実施形態は、眼の酸化的疾患を有するか、または眼の酸化的疾患にかかりやすい対象を選択するステップと、投与時に対象の眼組織に組み込まれる有効量の少なくとも１つの同位体修飾された多価不飽和脂肪酸、その模倣薬またはエステルプロドラッグを対象に投与するステップとを含む、眼の酸化的疾患の進行を治療または予防する方法を含む。眼の酸化的疾患を有する対象には、他の疾患の中でも、網膜疾患を有するかもしくは網膜疾患にかかりやすい、加齢性黄斑変性症を有するかもしくは加齢性黄斑変性症にかかりやすい、糖尿病性網膜症を有するかもしくは糖尿病性網膜症にかかりやすい、または網膜色素変性症を有するかもしくは網膜色素変性症にかかりやすい対象が含まれ得る。

【0013】

さらなる実施形態は、高密度リポタンパク質レベルの増大および／または低密度リポタンパク質レベルの減少を必要としている対象を選択するステップと、投与時に高密度リポタンパク質レベルが増大され、かつ／または低密度リポタンパク質レベルが低減される、有効量の同位体修飾された多価不飽和脂肪酸、その模倣薬またはエステルプロドラッグを対象に投与するステップとを含む方法を含む。対象には、他の疾患の中でも、アテローム硬化性血管疾患を有するかまたはアテローム硬化性血管疾患にかかりやすい対象が含まれ得る。

【0014】

さらなる実施形態は、補酵素Ｑ１０欠損などのミトコンドリア欠損もしくはミトコンドリア呼吸欠損疾患を有するか、またはミトコンドリア欠損もしくはミトコンドリア呼吸欠損疾患にかかりやすい対象を選択するステップと、投与時に対象のミトコンドリア膜に組み込まれる有効量の同位体修飾された多価不飽和脂肪酸、その模倣薬またはエステルプロドラッグを対象に投与するステップとを含む、補酵素Ｑ１０欠損などのミトコンドリア欠損またはミトコンドリア呼吸欠損疾患の進行を治療または予防する方法を含む。他のミトコンドリア欠損またはミトコンドリア呼吸欠損疾患を有する対象には、ａ）神経系疾患を有するかもしくは神経系疾患にかかりやすい、ｂ）ジスキネジアを有するかもしくはジスキネジアにかかりやすい、ｃ）運動失調を有するかもしくは運動失調にかかりやすい、ｄ）筋骨格疾患を有するかもしくは筋骨格疾患にかかりやすい、ｅ）筋力低下を有するかもしくは筋力低下を起こしやすい、ｆ）神経筋疾患を有するかもしくは神経筋疾患にかかりやすい、またはｇ）代謝性疾患を有するかもしくは代謝性疾患にかかりやすい対象が含まれる。

【0015】

諸方法はまた、先天性代謝異常を有する対象を選択するステップと、投与時に対象の脳および／または神経組織に組み込まれる有効量の同位体修飾された多価不飽和脂肪酸、その模倣薬またはエステルプロドラッグを対象に投与するステップとを含む、先天性代謝異常を治療する方法を含む。先天性代謝異常は、例えばダウン症候群であり得る。

【0016】

いくつかの実施形態では、一方法は、対象の細胞または組織が、ＰＵＦＡの自動酸化を維持するのに十分な濃度の同位体修飾されたＰＵＦＡを維持する、十分な量の同位体修飾されたＰＵＦＡを対象に投与するステップを含む。

【0017】

ビスアリル位において少なくとも１つの^１３Ｃまたは少なくとも２つの重水素原子を含む同位体修飾された多価不飽和脂肪酸、その模倣薬もしくはエステルプロドラッグ、またはその模倣薬もしくは模倣薬エステルを含む多価不飽和脂肪酸組成物であって、該組成物がヒトの食用に適しており、同位体修飾された多価不飽和脂肪酸もしくはそのエステル、またはその模倣薬もしくは模倣薬エステルが、対象による摂取もしくは取込み後に対象の体成分に組み込まれる場合、その化学的同一性を保持することができるか、または対象において多価不飽和脂肪酸もしくはその模倣薬の高級同族体への変換を受けることができ、同位体修飾された多価不飽和脂肪酸における同位体の量が、天然に存在する存在量レベルを超え、ただし、同位体修飾された多価不飽和脂肪酸は、１１,１１,１４,１４,Ｄ４−リノレン酸または１１,１１,Ｄ２−リノール酸ではない組成物などの化合物および組成物も企図される。同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはその模倣薬は、１１,１１,１４,１４,Ｄ４−リノール酸、１１,１１,Ｄ２−リノレン酸および１４,１４,Ｄ２−リノレン酸からなる群から選択される同位体修飾された多価不飽和脂肪酸であり得る。同位体修飾された多価不飽和脂肪酸、その模倣薬またはエステルプロドラッグは、前ビスアリル位において重水素をさらに含む、同位体修飾された多価不飽和脂肪酸であり得る。同位体修飾された多価不飽和脂肪酸、その模倣薬またはエステルプロドラッグは、

【0018】

【化1-1】

【0019】

【化1-2】

【0020】

【化1-3】

【0021】

またはそのエステルプロドラッグからなる群から選択される模倣薬であり得る。いくつかの実施形態では、これらの化合物および組成物は、本明細書に開示の疾患または障害のいずれかを治療するために使用することができる。

【0022】

同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはそのエステルプロドラッグは、約５０％〜９９％の同位体純度を有する同位体修飾された多価不飽和脂肪酸またはエステルであり得る。

【0023】

他の態様では、多価不飽和脂肪酸組成物は、特定の疾患機構の予防に有効となるように化学的に修飾されている、天然に存在する多価不飽和脂肪酸、その模倣薬またはエステルプロドラッグを含み、化学修飾は、天然に存在する多価不飽和脂肪酸、その模倣薬またはエステルプロドラッグの元素組成を変化させず、ただし、同位体修飾された多価不飽和脂肪酸は、１１,１１,１４,１４,Ｄ４−リノレン酸または１１,１１,Ｄ２−リノール酸ではない。例えば、天然に存在する多価不飽和脂肪酸、模倣薬またはエステルプロドラッグは、酸化感受性位などにおいて酸化に対して安定であり得る。ある場合には、安定化は、重同位体置換を介して行われる。酸化感受性位には、ビスアリルの炭素原子と水素原子における置換が含まれ得る。

【0024】

これらおよび他の実施形態を、本明細書においてより詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】（Ａ）ＲＯＳによって生じるＰＵＦＡの酸化、（Ｂ）毒性のあるカルボニル化合物の形成の図である。

【図2】例１〜４に記載の重水素化ＰＵＦＡの^１Ｈ−および^１３Ｃ−ＮＭＲ分析の図である。

【図3】は、リノレン酸を用いる処理に対するｃｏｑヌル変異体の感受性が、同位体強化によって抑制されることを示す図である。酵母ｃｏｑ３、ｃｏｑ７およびｃｏｑ９ヌル変異体を、Ｗ３０３酵母遺伝的背景（ＷＴ）で調製した。酵母菌株を、ＹＰＤ培地（１％Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、２％Ｂａｃｔｏペプトン、２％デキストロース）で増殖させ、対数期増殖の間に集菌した（ＯＤ_{６００ｎｍ}＝０．１〜１．０）。細胞を滅菌水で２回洗浄し、リン酸緩衝液（０．１０Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、０．２％デキストロース）に再懸濁して、ＯＤ_{６００ｎｍ}＝０．２にした。試料を除去し、０．２０ＯＤ／ｍｌから開始した１：５連続希釈物を、ＹＰＤプレート培地上に蒔いて、０時間の未処理対照を提供した（左上パネルに示す）。指定の脂肪酸を、リン酸緩衝液中２０ｍｌの酵母に添加して最終濃度２００ｕＭにした。２時間、４時間および１６時間目に試料を除去し、１：５連続希釈物を調製し、ＹＰＤプレート培地上にスポットした。３０℃で２日間増殖させた後、写真を撮った。このパネルは、異なる日に実施した２つの独立なアッセイの代表である。

【図4】同位体強化したＤ４−リノレン酸で処理した酵母ｃｏｑ変異体が、ＰＵＦＡ媒介性の細胞死滅に耐性を有することを示す図である。アリコート１００ｕｌを、１、２および４時間目に除去し、希釈した後にＹＰＤプレート上に広げたことを除き、図６−１に記載の通り、脂肪酸高感度アッセイを実施した。２〜２．５日後に写真を撮り、コロニー数を計数した。酵母菌株は、野生型（○）、ａｔｐ２（△）またはｃｏｑ３（□）を含み、脂肪酸処理は、オレイン酸Ｃ１８：１（実線）、リノレン酸、Ｃ１８：３、ｎ−３（破線）または１１，１１，１４，１４−Ｄ４−リノレン酸、Ｃ１８：３、ｎ−３（点線）を含む。

【図5】ＧＣ−ＭＳによる脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）標準の分離および検出を示す図である。ＦＡＭＥを記載の通り調製し（Ｍｏｓｓ ＣＷ、Ｌａｍｂｅｒｔ ＭＡ、Ｍｅｒｗｉｎ ＷＨ.Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.１９７４年；１、８０〜８５頁）、指示量の遊離脂肪酸およびＣ１７：０（内部標準）２００μｇを、メチル化および抽出にかけた。試料分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０−６９７５ＧＣ−ＭＳによりＤＢ−ワックスカラム（０．２５ｍｍ×３０ｍ×フィルムの厚さ０．２５ｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ１２２−７０３１）で実施した。

【図6】外因的に供給した脂肪酸の酵母による取込みを示す図である。ＷＴ（Ｗ３０３）酵母を、対数期に集菌し、０時間または４時間のいずれかにわたって、２００μＭの指定の脂肪酸存在下でインキュベートした。酵母細胞を集菌し、滅菌水で２回洗浄し、次いでアルカリメタノリシスおよび鹸化にかけ、記載の通り脂質を抽出した（Ｍｏｓｓ ＣＷ、Ｌａｍｂｅｒｔ ＭＡ、Ｍｅｒｗｉｎ ＷＨ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７４年；１、８０〜８５頁（Ｓｈａｗ、１９５３年 Ｓｈａｗ、Ｗ.Ｈ.Ｃ.；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ，Ｊ.Ｐ. Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ｙｅａｓｔ.Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２５：１１３０；１９５３年）。各指定の脂肪酸を、μｇ／ＯＤ_{６００ｎｍ}酵母として表し、Ｃ１７：０内部標準の回収に対して補正した。

【図7】ＧＣ−ＭＳ分析にかけた酵母抽出物のクロマトグラムである。異なるトレースは、それぞれ０時間および４時間のインキュベーションを表す。各ＦＡＭＥ（Ｃ１８：１、Ｃ１８：３およびＤ４−リノレン酸）のピーク面積を、Ｃ１７：０標準のピーク面積で割り、較正曲線で定量化した。内因性の１６：０および１６：１の変化は非常に少なく、外因的に添加した脂肪酸では著しく高かった。

【図8】パラコートによる急性中毒後のＨ−ＰＵＦＡおよびＤ−ＰＵＦＡ処理したＭＶＥＣ細胞の生存率を示す図である。試験したすべての細胞型について、Ｄ−ＰＵＦＡは、対照と比較して、ＭＶＥＣ細胞について図に示したものと類似の保護作用を有していた。

【図9】Ｄ−ＰＵＦＡが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＰＴＰ誘発性の線条体ドーパミン枯渇を部分的に減弱することを示す図である。８週齢のマウスに、Ｄ−ＰＵＦＡまたはＨ−ＰＵＦＡのいずれかを栄養補助した無脂肪食を６日間与え、４０ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰ、ｉ.ｐ.または生理食塩水に曝露し、Ｄ−ＰＵＦＡまたはＨ−ＰＵＦＡ食を継続して、６日後に屠殺した。線条体のドーパミンを、ＨＰＬＣによって測定した。ＭＰＴＰは、Ｈ−ＰＵＦＡを与えたマウスでは強い枯渇をもたらしたが（７８％）、Ｄ−ＰＵＦＡを与えた群では著しく少なかった（４７％）。

【図10】Ｄ−ＰＵＦＡが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＰＴＰ誘発性の黒質ａ−ｓｙｎ蓄積を部分的に減弱することを示す図である。８週齢のマウスに、Ｄ−ＰＵＦＡまたはＨ−ＰＵＦＡのいずれかを栄養補助した無脂肪食を６日間与え、４０ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰ、ｉ.ｐ.または生理食塩水に曝露し、Ｄ−ＰＵＦＡまたはＨ−ＰＵＦＡ食を継続して、６日後に屠殺した。ａ−ｓｙｎの免疫反応性を、コホートの黒質からの切片で観測した。生理食塩水で処理した両方の群で神経網染色が明らかになったが、Ｈ−ＰＵＦＡを与え、ＭＰＴＰ処理したマウスでは、強い細胞体染色が見られた。Ｄ−ＰＵＦＡを与え、ＭＰＴＰ処理した群では、ａ−ｓｙｎ−陽性細胞体の強度および数の明らかな減少が比較によって観測された。縮尺バー＝２５μｍ。

【発明を実施するための形態】

【0026】

好ましい実施形態の詳細な説明
導入として、脂質を形成する脂肪酸は、生細胞の主成分の１つとして周知である。したがって、これらは数々の代謝経路に関与し、様々な病理において重要な役割を果たす。必須多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、脂肪酸の重要なサブクラスである。必須栄養素は、直接的にまたは変換により必須の生物学的機能に役立ち、内因的には産生されず、または必要量を満たすのに十分な量では産生されない食品成分である。恒温動物では、２つの厳密に必須のＰＵＦＡは、リノール酸(ｃｉｓ,ｃｉｓ−９,１２−オクタデカジエン酸；(９Ｚ,１２Ｚ)−９,１２−オクタデカジエン酸；ＬＡ；１８：２；ｎ−６）および過去にビタミンＦとして公知のα−リノレン酸（ｃｉｓ,ｃｉｓ,ｃｉｓ−９,１２,１５−オクタデカトリエン酸；（９Ｚ,１２Ｚ,１５Ｚ）−９,１２,１５−オクタデカトリエン酸；ＡＬＡ；１８：３；ｎ−３）である（Ｃｕｎｎａｎｅ ＳＣ. Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００３年；４２：５４４〜５６８頁）。ＬＡは、さらなる酵素的不飽和化および伸長によって、アラキドン酸（ＡＡ；２０：４；ｎ−６）などの高級ｎ−６ＰＵＦＡに変換され、ＡＬＡは、それに限定されるものではないが、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５；ｎ−３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；２２：６；ｎ−３）を含む高級ｎ−３シリーズを生じさせる（Ｇｏｙｅｎｓ ＰＬ.ら、Ａｍ.Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｎｕｔｒ.２００６年；８４：４４〜５３頁）。ＰＵＦＡまたはＰＵＦＡ前駆体の本質的な性質のために、それらの欠損には多くの実例がある。これらは、しばしば病状と関連している。特定の病気に対する有効性が証明されている多くのＰＵＦＡ栄養補助剤が、店頭で利用可能である（例えば、米国特許第７２７１３１５号(特許文献１)、米国特許第７３８１５５８号）。

【0027】

脳組織は、脳の神経細胞膜内のリン脂質の３５％を構成するＰＵＦＡに特に富んでいる(Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＪＡ.ら、Ｊ.Ｍｏｌ.Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.２００７年；３３：２〜１１頁)。神経細胞膜内に豊富にある３つの特に重要な脂肪酸は、カルジオリピンを構成するＬＡ；その欠損が脳の発達を妨げ、最適な脳機能を損なう可能性があるＤＨＡ；必須であるが潜在的に毒性のある代謝産物をもたらすＡＡである。

【0028】

ＰＵＦＡは、膜、特にミトコンドリア膜に、最適な酸化的リン酸化性能に必要な適切な流動性を付与する。ＰＵＦＡはまた、酸化ストレスの開始および伝播において重要な役割を果たす。ＰＵＦＡは、元の事象を増幅する鎖反応を介して、ＲＯＳと反応する(Ｓｕｎ Ｍ、Ｓａｌｏｍｏｎ ＲＧ、Ｊ.Ａｍ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ.２００４年；１２６：５６９９〜５７０８頁）。電子伝達複合体Ｉ活性に極めて重要なミトコンドリア膜に特異的なＰＵＦＡに富んだリン脂質であるカルジオリピンには、特に重要である(Ｐａｒａｄｉｅｓ Ｇら、Ｇｅｎｅ ２００２年；８６：１３５〜１４１頁）。

【0029】

高レベルの脂質ヒドロペルオキシドの非酵素的形成は、いくつかの有害な変化をもたらすことが公知である。非酵素的形成は、膜の流動性および透過性に負の影響を及ぼし、膜タンパク質の酸化をもたらし、これらのヒドロペルオキシドは、数多くの高度反応性カルボニル化合物に変換され得る。後者には、アクロレイン、マロンジアルデヒド、グリオキサール、メチルグリオキサールなどの反応種が含まれる（Ｎｅｇｒｅ−Ｓａｌｖａｙｒｅ Ａら、Ｂｒｉｔ.Ｊ.Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.２００８年；１５３：６〜２０頁）。しかし、ＰＵＦＡ酸化の最も有名な産物は、α,β−不飽和アルデヒドである４−ヒドロキシノン−２−エナール（４−ＨＮＥ；ＬＡまたはＡＡなどのｎ−６ＰＵＦＡから形成される）、４−ヒドロキシヘキセ−２−エナール（４−ＨＨＥ；ＡＬＡまたはＤＨＡなどのｎ−３ＰＵＦＡから形成される）、および対応するケトアルデヒドである（Ｅｓｔｅｒｆｂａｕｅｒ Ｈら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄ.Ｂｉｏｌ.Ｍｅｄ.１９９１年；１１：８１〜１２８頁；Ｌｏｎｇ ＥＫ、Ｐｉｃｋｌｏ ＭＪ.Ｆｒｅｅ Ｒａｄ.Ｂｉｏｌ.Ｍｅｄ.２０１０年；４９：１〜８頁）。これらの反応性カルボニルは、マイケル付加またはシッフ塩基の形成経路を介して(生体)分子を架橋し、数多くの病理学的プロセス、加齢性および酸化ストレスに関係する状態、ならびに老化に関与するとされてきた。重要なことに、ＰＵＦＡは、１,４−ジエン系のメチレン基(ビスアリル位)が、ＲＯＳならびにシクロゲナーゼ(cyclogenase)およびリポキシゲナーゼ(lipoxygenase)などの酵素に対してアリルメチレンよりも実質的に不安定であることから、ある場合には特定の部位で酸化すると思われる。

【0030】

それに限定されるものではないが、神経学的疾患、糖尿病、高濃度の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に関連する疾患およびＡＭＤを含む、酸化ストレスに関係する多くの疾患がある。多くのかかる疾患の正確な病因論には、さらなる解明が必要であるが、ＰＵＦＡ酸化およびその後の反応性カルボニルによる架橋または誘導体化は、しばしば際立った役割を果たす。加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）における酸化ストレスの役割は、かなり重要であることが公知である（Ｂｅａｔｔｙ Ｓら、Ｓｕｒｖｅｙ Ｏｐｈｔａｌｍ．２０００年；４５：１１５〜１３４頁；（ｄｅ Ｊｏｎｇ Ｐａｕｌｕｓ Ｔ Ｖ Ｍ Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００６年；３５５（１４）：１４７４〜８５頁）；Ｗｕ Ｊ、Ｓｅｒｅｇａｒｄ Ｓら、Ｓｕｒｖｅｙ Ｏｐｈｔａｌｍ.２００６年；５１：４６１〜４８１頁）。ほぼすべての主な神経学的疾患は、酸化ストレスに関連することが公知である。例えば、酸化膜成分は、β−およびα−シヌクレイン凝集を、それぞれ共有結合性および非共有結合性の機構によって促進するが、これらはアルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）ならびにシヌクレイン病に関連している。ＰＵＦＡ過酸化の反応産物は、臨床的に最も重要な神経学的脳疾患である孤発性アミロイド疾患において、タンパク質の誤った折り畳みを誘発し得る（Ｂｉｅｓｃｈｋｅ Ｊ.ら、Ａｃｃ.Ｃｈｅｍ.Ｒｅｓ.２００６年；３９：６１１〜６１９頁）。

【0031】

ＰＵＦＡの過酸化および過酸化したＰＵＦＡから形成される反応性化合物に関する障害のいくつかの例には、それに限定されるものではないが以下が含まれる。

【0032】

加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜色素変性症（ＲＰ）および糖尿病性網膜症（ＤＲ）
高酸素レベル、日光への曝露および高ＰＵＦＡ含量は、眼組織のＰＵＦＡ過酸化の増大をもたらす。酸化ストレスは、ＡＭＤの病変形成において主な役割を果たす（Ｂｅａｔｔｙ Ｓら、Ｓｕｒｖｅｙ Ｏｐｈｔａｌｍ．２０００年；４５：１１５〜１３４頁）。網膜におけるＨＮＥおよびＨＨＥなどのＰＵＦＡ過酸化産物のレベルの増大が報告されている(Ｌｏｎｇ ＥＫら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄ.Ｂｉｏｌ.Ｍｅｄ.２０１０年；４９：１〜８頁)。ＰＵＦＡ過酸化産物は、網膜色素上皮(ＲＰＥ)リポフスチンの形成に主な役割を果たすが、リポフスチンは、それ自体、可視光線への照射時にＲＯＳを発生させることがあり、ＡＭＤの病因において主な役割を果たす(Ｋａｔｚ ＭＬ、Ａｒｃｈ.Ｇｅｒｏｎｔｏｌ.Ｇｅｒｉａｔｒ.２００２年；３４：３５９〜３７０頁）。ＭＤＡを含むＰＵＦＡ過酸化産物は、ＰＵＦＡ過酸化がヒトの白内障の病変形成における開始ステップであることが公表されたように、白内障の形成を含む水晶体の病理において際立った役割を果たす（Ｂｏｒｃｈｍａｎ Ｄ.ら、Ｊ.Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ.２０１０年；５１：２４７３〜２４８８頁）。翼状片および円錐角膜を含むヒトの角膜の疾患の病態生理学におけるＰＵＦＡ過酸化産物の役割も、同様に重要である（Ｓｈｏｈａｍ Ａら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄ.Ｂｉｏｌ.Ｍｅｄ.２００８年；４５：１０４７〜１０５５頁）。糖尿病性網膜症も、酸化ストレスおよびＰＵＦＡ過酸化に関連する（Ｂａｙｎｅｓ ＪＷ、Ｔｈｏｒｐｅ ＳＲ.Ｄｉａｂｅｔｅｓ１９９９年；４８：１〜９頁）。

【0033】

いくつかの態様では、ＡＭＤ、ＲＰまたはＤＲを有するか、またはそれにかかりやすい対象の同定は、蛍光眼底造影検査などの当技術分野で公知の診断試験によって、または血管プロセスの異常の同定によって決定することができる。さらに、光干渉断層撮影診断を使用して、かかる対象を同定することができる。

【0034】

アルツハイマー病（ＡＤ）および軽度認知障害（ＭＣＩ）
Ｃｏｏｐｅｒ ＪＬ．Ｄｒｕｇｓ ＆ Ａｇｉｎｇ ２００３年；２０：３９９〜４１８頁参照。アミロイド斑および神経原線維変化は、ＡＤの神経病理学的特徴であるが、これらが疾患の原因であるか結果であるかは、まだ議論の余地がある。酸化ストレスおよび関連炎症は、ＡＤプロセスに関与する。ＡＤにおける酸化ストレスの増大を支持する直接的な証拠は、（１）ＡＤ脳におけるＲＯＳ刺激性Ｆｅ、ＡｌおよびＨｇの増大、（２）ＡＤ脳におけるＰＵＦＡ過酸化の増大およびＰＵＦＡの減少、ならびにＡＤ脳室液の４−ＨＮＥの増大、（３）ＡＤ脳におけるタンパク質およびＤＮＡの酸化増大、（４）ＡＤ脳におけるエネルギー代謝の減退およびチトクロムｃオキシダーゼの減少、（５）神経原線維変化における最終糖化産物（ＡＧＥ）、ＭＤＡ、カルボニル、ペルオキシ亜硝酸、ヘムオキシゲナーゼ−１およびＳＯＤ−１、ならびに老人斑におけるＡＧＥ、ヘムオキシゲナーゼ−１、ＳＯＤ−１、ならびに（６）アミロイドβペプチドがＲＯＳを発生し得ることを示す研究である（Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｙ ＷＲ.Ｆｒｅｅ Ｒａｄ.Ｂｉｏｌ.Ｍｅｄ.１９９７年；２３：１３４〜１４７頁）。

【0035】

脂質代謝異常は、ＡＤにおいて顕著な役割を果たす。アミロイド前駆体タンパク質プロセシングおよびＡｂペプチド産生に関与するすべてのタンパク質は、内在性膜タンパク質である。さらに、Ａｂを産生するｃ−セクレターゼの切断は、膜の中心部で起こり、したがって切断酵素の脂質環境は、Ａｂの産生およびＡＤ病変形成に影響を及ぼす（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｔ.ら、Ｊ.Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ.２００７年；１０３：１５９〜１７０頁）。脂肪過酸化は、高レベルのマロンジアルデヒド、イソプロスタン、ならびにＨＮＥおよびアクロレインによる高レベルのタンパク質修飾を特徴とする（Ｓａｙｒｅ ＬＭら、Ｃｈｅｍ.Ｒｅｓ.Ｔｏｘｉｃｏｌ.２００８年；２１：１７２〜１８８頁；Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ ＤＡら、Ｂｉｏｃｈｉｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ ２０１０年；１８０１：９２４〜９２９頁）。食事性ＰＵＦＡは、遅発性の孤発性ＡＤの発症の主な危険因子である。ＰＵＦＡの飽和度および最初の二重結合の位置は、ＡＤの危険性を決定付ける最も重要な因子であり、不飽和脂肪およびｎ−３二重結合は保護を付与するが、過剰の飽和脂肪またはｎ−６二重結合は危険性を増大する。ＤＨＡおよびＡＡは、特にＡＤに関連する（Ｌｕｚｏｎ−Ｔｏｒｏ Ｂら、Ｎｅｕｒｏｌ.Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ. ２００４年；１１：１４９〜１６０頁）。ＤＨＡは、興奮性膜の主成分であり、乳児の成熟を促進し、成人脳における強力な神経保護薬でもあり、ＡＤの予防において潜在的な役割を有する。ＡＡは、多くの神経伝達物質系におけるセカンドメッセンジャーとして作用するエイコサノイドの重要な供給源である。食事性ＰＵＦＡとアポリポタンパク質Ｅイソ型の相互作用は、細胞膜内の持続性自動過酸化の危険性および速度、ならびに膜修復有効性を決定付けることができる。

【0036】

脂肪過酸化は、ＭＣＩ患者の脳内に存在することが報告されている。いくつかの研究によって、酸化的損傷は、ＡＤの病変形成における初期事象として、疾患の進行またはおそらくはその発症を減速するための治療標的として働き得ることが確立されている（Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｙ ＷＲ.Ａｒｃｈ.Ｎｅｕｒｏｌ.２００７年；６４：９５４〜９５６頁）。ＭＣＩはまた、ＭＤＡ、ＨＮＥ、アクロレインおよびイソプロスタンなどの脂肪過酸化産物によって形成される高レベルの共役体を特徴とし得る（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ ＤＡら、Ｂｉｏｃｈｉｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ２０１０年；１８０１：９２４〜９２９頁）。

【0037】

アルツハイマー病を有するか、またはアルツハイマー病にかかりやすい対象の同定は、当技術分野で公知である。例えば対象は、国立神経疾患脳卒中研究所（ＮＩＮＣＤＳ）−アルツハイマー病関連障害協会（ＡＤＲＤＡ）によって設定された基準を使用して同定され得る。基準は、記憶、言語、知覚技能、注意力、建設的能力、方向付け、問題解決および機能的能力に関係するものである。類似の診断試験を使用してＭＣＩ患者を同定することもできる。

【0038】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
ＡＬＳは、運動神経細胞に影響を及ぼす遅発性の進行性神経変性疾患であり（上位および下位運動神経細胞の喪失）、結果的に筋肉の消耗および呼吸不全による死亡に至る（Ｂｏｉｌｌｅｅ Ｓ.ら、Ｎｅｕｒｏｎ ２００６年；５２：３９〜５９頁）。ほとんどのＡＬＳ症例の病因は、依然として不明であるが、ＡＬＳは酸化ストレスと強い関連があると認識されている。家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）は、変異ＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ）の酸化によって引き起こされる（Ｋａｂａｓｈｉ Ｅ.ら、Ａｎｎ.Ｎｅｕｒｏｌ.２００７年；６２：５５３〜５５９頁）。ｆＡＬＳに関連する１００を超えるＳＯＤの変異が存在する（Ｂａｒｎｈａｍ ＫＪら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ.Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ.２００４年；３：２０５〜２１４頁）。第１のステップはＳＯＤの「単量体化」であり、次いでＳＯＤモノマーが凝集し、次いでそれらの間に異常なＳ−Ｓ結合が形成され（Ｋａｂａｓｈｉ Ｅ.ら、Ａｎｎ.Ｎｅｕｒｏｌ.２００７年；６２：５５３〜５５９頁）、毒性のある集合体が生成される（それらが誤って折り畳まれるか、物体をつまらせるか、またはその両方により（Ｂａｒｎｈａｍ ＫＪら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ.Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００４年；３：２０５〜２１４頁）。

【0039】

ｆＡＬＳに関連するＳＯＤ１変異は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ依存性のＲＯＳ産生における酸化還元センサー機能の喪失に関連し、制御されないＲＯＳの発生によって媒介されるミクログリアの神経毒性のある炎症反応をもたらすことが示された（Ｌｉｕ Ｙ、Ｈａｏ ＷＬら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２００９年；２８４：３６９１〜３６９９頁）。孤発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）は、より一般的である（症例の９０％）。

【0040】

ＡＬＳ症例の病因論は、依然として不明であるが、ＡＬＳは酸化ストレスおよび炎症と関連があることが認識されている。タンパク質の酸化は、ある試験ではｓＡＬＳ患者の８５％にものぼる（Ｃｏｙｌｅ ＪＴ.ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３年；２６２：６８９〜６９５頁）。また、中枢神経系（ＣＮＳ）組織、髄液および血清における脂肪過酸化およびＨＮＥ形成の両方の増大が、家族性および孤発性の両方のＡＬＳ症例について報告された（Ｓｉｍｐｓｏｎ ＥＰら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００４年；６２：１７５８〜１７６５頁）。ＡＬＳにおける酸化ストレスの源は、明らかになっていないが、興奮毒性、ミトコンドリアの機能障害、鉄蓄積または免疫活性化を含むいくつかのプロセスから生じ得る（Ｓｉｍｐｓｏｎ ＥＰら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００４年；６２：１７５８〜１７６５頁）。共にＡＬＳの酸化ストレスの誘因および標的であるｆＡＬＳおよびｓＡＬＳにおいて、ミトコンドリアが重要な役割を果たすという証拠がある（Ｂａｃｍａｎ ＳＲら、Ｍｏｌｅｃ.Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ.２００６年；３３：１１３〜１３１頁）。ＣＯＸ−２阻害は、脊髄神経変性を低減し、ＡＬＳ遺伝子導入マウスの生存を延長することが報告されているが（Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ Ｌ. Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ２００４年；６３：９０１〜９１０頁）、このことは、ＡＬＳの病因におけるＰＵＦＡ酸化産物の役割を強調している。ＡＬＳ患者におけるＨＨＥ−タンパク質共役の増大の証拠もある(Ｌｏｎｇ ＥＫ、Ｐｉｃｋｌｏ ＭＪ. Ｆｒｅｅ Ｒａｄ.Ｂｉｏｌ.Ｍｅｄ.２０１０年；４９：１〜８頁）。酸化ストレスがＡＬＳに関連しているにも関わらず、抗酸化剤療法の試みは、まだ成功していない（Ｂａｒｂｅｒ ＳＣら、Ｂｉｏｃｈｉｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ２００６年；１７６２：１０５１〜１０６７頁）。

【0041】

ＡＬＳを有するか、またはその危険性がある対象の同定は、当技術分野で公知の診断方法を使用して決定することができる。例えば、片方の肢における上位および下位運動神経の徴候、筋電図検査(ＥＭＧ)、末梢神経障害およびミオパチーを排除するための神経伝導速度(ＮＣＶ)測定、磁気共鳴画像(ＭＲＩ)、ならびに／または他の疾患の可能性を排除するための血液および尿検査などの試験の１つまたは組合せを使用することができる。

【0042】

本明細書に開示の化合物によって治療することができる他のＣＮＳ疾患も企図され、それには、中でもヤコブソン(Ｊａｃｏｂｓｏｎ)症候群、脊髄性筋萎縮症および多系統萎縮症などの変形性の神経疾患および神経筋疾患および障害が含まれる。

【0043】

アテローム硬化性血管疾患（ＡＳＶＤ）
血管に影響を及ぼす脂肪材料の蓄積の結果であるこの状態は、心筋梗塞および脳卒中を含む多くの病理をもたらす。ＰＵＦＡ過酸化産物は、低密度リポポリタンパク質（ＬＤＬ、「悪玉脂肪」）の形成および蓄積において非常に重要な役割を果たす（Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ Ｈら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄ.Ｂｉｏｌ.Ｍｅｄ.１９９１年；１１：８１〜１２８頁；Ｒｅｑｕｅｎａ ＪＲら、Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ.１９９７年；３２２：３１７〜３２５頁）。アテローム硬化性血管疾患を有する対象を同定するために、数々の診断試験が利用可能である。

【0044】

いくつかの実施形態では、ＨＤＬとＬＤＬの比は、本明細書に記載の修飾されたＰＵＦＡの投与時に著しく上昇する。例えば以下の表３では、Ｈ−ＰＵＦＡの投与時のＨＤＬ：ＬＤＬ比と比較して、Ｄ−ＰＵＦＡの投与時には、約８６％のＨＤＬ：ＬＤＬ比の上昇が見られた。この百分率は、（ＬＤＬレベル）＝（総コレステロール）−（ＨＤＬレベル）−（トリグリセリドレベルの２０％）の計算に基づく。いくつかの態様では、ＨＤＬ−ＬＤＬ比は、修飾されたＰＵＦＡの投与時に（投与プロトコルのプロセスなどにわたって）、投与前のＨＤＬ：ＬＤＬ比と比較して少なくとも約５％、例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％またはそれ以上上昇する。

【0045】

補酵素Ｑ１０欠損（Ｑ１０−）などのミトコンドリア疾患
ミトコンドリア欠損またはミトコンドリア呼吸欠損疾患には、膜内で生じるミトコンドリア呼吸欠損などのミトコンドリア膜要素の酸化によって引き起こされる疾患および障害が含まれる。膜の機能性は、全体的なミトコンドリア機能にとって重要である。

【0046】

補酵素Ｑ欠損は、神経系疾患（ジスキネジア、運動失調）、筋骨格疾患（筋力低下、神経筋疾患）、代謝性疾患等を含む多くの疾患に関連している。Ｑ１０は、酸化ストレスの制御において重要な役割を果たす。Ｑ１０−は、ＰＵＦＡ過酸化および形成された産物の毒性によるＰＵＦＡ毒性の増大に関連することが示されている（Ｄｏ ＴＱら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １９９６年；９３：７５３４〜７５３９頁）。補酵素Ｑ１０欠損を有する対象を同定するための数々の診断試験が、当技術分野で公知である。

【0047】

ダウン症候群（ＤＳ）
ＤＳ（染色体２１のトリソミー）は、アルツハイマー病に類似の早計の老化および精神遅滞に関連する。自己免疫疾患および白内障の発生率も高く、このことはＤＳの個体における酸化ストレスの増大を示している（Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ ＳＶら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄ.Ｂｉｏｌ.Ｍｅｄ.１９９８年；２５：１０４４〜１０４８頁）。染色体２１は、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤおよびアミロイドβ−ペプチドをコードし、したがってＤＳは、これらの遺伝子産物および代謝産物のオーバーフローを特徴とし、特に過剰のＨ_２Ｏ_２を伴う、カタラーゼに対するＳＯＤ比の上昇を特徴とする（Ｓｉｎｅｔ ＰＭ.Ａｎｎ.ＮＹ Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.１９８２年；３９６：８３〜９４頁）。ＤＳの個体では、タンパク質および脂質酸化のマーカー（ＭＤＡ、ＨＮＥ等）、ならびに最終糖化産物および脂肪過酸化(lipoxidation)最終産物が著しく増大する（Ｂｕｓｃｉｇｌｉｏ Ｊ、Ｙａｎｋｎｅｒ ＢＡ. Ｎａｔｕｒｅ １９９５年；３７８：７７６〜７７９頁；Ｏｄｅｔｔｉ Ｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍ.１９９８年；２４３：８４９〜８５１頁）。ＤＳにおける酸化ストレスの重要性は、抗酸化剤を用いることによって酸化の副作用を低減するための広範な試みをもたらしたが、最近の無作為化試験では、抗酸化剤栄養補助剤の有効性を示す証拠は見られていない（Ｅｌｌｉｓ ＪＭら、Ｂｒｉｔ.Ｍｅｄ.Ｊ.２００８年；３３６：５９４〜５９７頁）。ダウン症候群の対象は、標準の染色体試験によって同定することができる。

【0048】

パーキンソン病（ＰＤ）
ＰＤは、ＲＯＳによって引き起こされる酸化ストレスに関連し、ＲＯＳは、ＰＤにおけるドーパミン細胞変性をもたらすカスケードに寄与する。しかし酸化ストレスは、ミトコンドリアの機能障害、興奮毒性、一酸化窒素毒性および炎症などの疾患および変形性プロセスの他の成分と密接に関連している。細胞内の毒性のある脂質ペルオキシドの形成は、毒性のある細胞カスケードの活性化を介して、黒質神経細胞における損傷に直接的に関連するとされている。ＰＤに関連する酸化的損傷は、ＰＵＦＡレベルで始まり、次いでタンパク質ならびに核ＤＮＡおよびｍｔＤＮＡに伝わり（例えば、シヌクレインプロセシング／レビー小体形成において）、ＨＮＥおよびＭＤＡなどの酸化的損傷の毒性のあるカルボニル産物は、タンパク質とさらに反応して、細胞生存能を損なう可能性がある。一酸化窒素は、スーパーオキシドと反応して、ペルオキシ亜硝酸および最終的にはヒドロキシル基を生成することが公知である。タンパク質分解の変化は、ＰＤにおけるドーパミン作用性の細胞死にとって非常に重要なものとして関連付けられている。酸化ストレスは、これらのプロセスを直接的に損なう可能性があり、ＨＮＥなどの酸化的損傷の産物は、２６Ｓプロテアソームに損傷を与える可能性がある。ＨＮＥは、ＰＤの病変形成に直接関連するとされている（Ｓｅｌｌｅｙ ＭＬ． Ｆｒｅｅ Ｒａｄ.Ｂｉｏｌ.Ｍｅｄ.１９９８年；２５：１６９〜１７４頁；Ｚｉｍｎｉａｋ Ｐ、Ａｇｅｉｎｇ Ｒｅｓ.Ｒｅｖ.２００８年；７：２８１〜３００頁）。さらに、プロテアソーム機能の機能障害は、フリーラジカルの発生および酸化ストレスをもたらす（Ｊｅｎｎｅｒ Ｐ. Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｕｒｏｌ.２００３年；５３：Ｓ２６〜Ｓ３６頁）。ＰＤの病因に関連するＲＯＳのさらなる源は、ドーパミン作用性神経細胞内のドーパミン(ＤＡ)の代謝回転である（Ｈａｓｔｉｎｇｓ ＴＧ、Ｊ Ｂｉｏｅｎｅｒｇ.Ｂｉｏｍｅｍｂｒ.２００９年；４１：４６９〜７２頁）。ＰＵＦＡ過酸化産物を介して媒介される核酸への酸化的損傷も、ＰＤの病因に寄与する（Ｍａｒｔｉｎ ＬＪ、Ｊ.Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ.Ｅｘｐ.Ｎｅｕｒｏｌ.２００８年；６７：３７７〜８７頁；Ｎａｋａｂｅｐｐｕ Ｙ.ら、Ｊ.Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.Ｒｅｓ、２００７年；８５：９１９〜３４頁）。酸化ストレスが、ＰＤの原因または結果であろうとなかろうと、酸化ストレスの低減は、疾患の進行に影響を及ぼす可能性が高い。

【0049】

パーキンソン病を有するか、またはパーキンソン病にかかりやすい対象の同定は、当技術分野で公知の様々な試験によって決定することができる。例えば、試験および診断の組合せは、例えばレボドパに対する陽性反応を含む、医学的病歴および神経学的検査を基にすることができる。さらに、対象の同定は、動作緩慢および強剛性および／または静止時振戦および／または姿勢の不安定性などの、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅの診断基準に従って決定することができる。

【0050】

統合失調症および双極性障害（ＢＰ）
ＰＵＦＡは、神経発達および統合失調症などのいくつかの精神疾患に影響を及ぼすことが公知である。ＤＨＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびＡＡは、これに関して特定の重要性がある。統合失調症では、ＥＰＡの補給といくつかの症状の改善との間に正の相関関係がある（Ｌｕｚｏｎ−Ｔｏｒｏ Ｂら、Ｎｅｕｒｏｌ.Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ.Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ.２００４年；１１：１４９〜１６０頁）。統合失調症およびＢＤの両方において、酸化ストレスおよびＨＮＥレベルは著しく上昇する（Ｗａｎｇ ＪＦら、Ｂｉｐｏｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ２００９年；１１：５２３〜５２９頁）。シナプス機能障害は、ＡＤ、ＡＬＳ、ＰＤなどの神経病理における初期の病原性事象であることが公知である（ＬｏＰａｃｈｉｎ ＲＭら、Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌ.２００８年；２９：８７１〜８８２頁）。このシナプス毒性の分子機構は未知であるが、刊行されている証拠によって、これらの疾患は、酸化ストレス、ＰＵＦＡ過酸化（図１）、ならびにその後のアクロレインおよび４−ＨＮＥなどのα,β−不飽和カルボニル誘導体の遊離に関する共通の病態生理学的カスケードを特徴とすることが示唆されている。

【0051】

統合失調症または双極性障害を有する対象を同定するための数々の診断試験が、当技術分野では公知である。

【0052】

最新の研究は、神経障害を含む酸化ストレス関連疾患の病因に対して最も強力な有害作用が、酸化ストレスまたはＲＯＳによってではなく、特に反応性カルボニル化合物の求電子的毒性によってもたらされることを示唆している(Ｚｉｍｎｉａｋ Ｐ、Ａｇｅｉｎｇ Ｒｅｓ.Ｒｅｖ.２００８年；７：２８１〜３００頁)。これらのカルボニル化合物は、シナプス前タンパク質と付加物を形成することによって、神経終末損傷を引き起こし得る。したがって、特定の脳領域の酸化的ストレスを受けた神経細胞におけるアクロレインおよびＨＮＥの内因的発生は、神経変性状態に関連するシナプス毒性と機構的に関係している。

【0053】

さらに、アクロレインおよびＨＮＥは、タイプ２のアルケンとして公知の大型クラスの構造的に関連する化学物質のメンバーである。このクラスの化学物質（例えば、アクリルアミド、メチルビニルケトンおよびメチルアクリレート）は、ヒト環境における広汎性の汚染物質であり、新しい研究は、これらのα，β−不飽和カルボニル誘導体も神経終末にとって毒性があることを示している。多くの神経変性疾患の初期段階中に発生する局所的シナプス毒性は、酸化ＰＵＦＡからの反応性カルボニル化合物の内因的発生によって媒介される。さらに、この神経病原性(neuropathogenic)プロセスの発生および進行は、他のタイプ２のアルケンへの環境曝露によって促進される。

【0054】

高濃度の４−ＨＮＥ（５〜１０ｍＭ）および他の反応性カルボニルは、いくつかの変性疾患の病変形成に関与しており、したがって、酸化ストレスの誘発物質およびメディエーターとして広く認められている（Ｕｃｈｉｄａ Ｋ.Ｐｒｏｇ.Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ.２００３年；４２：３１８〜３４３頁）。しかし、多種多様な細胞プロセスをモジュレートし、数々のシグナル伝達経路を活性化するためには、正常な生理的（０．１〜０．３ｍＭ）濃度の細胞４−ＨＮＥが必要とされる（Ｃｈｅｎ Ｚ．−Ｈ．ら、ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ２００６年；５８：３７２〜３７３頁；Ｎｉｋｉ Ｅ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄ.Ｂｉｏｌ.Ｍｅｄ.２００９年；４７：４６９〜４８４頁）。したがって、濃度を低下させるが、細胞から反応性カルボニルを完全には除去しないことが望ましい。

【0055】

ＰＵＦＡの酵素的酸化は、いくつかの重要なクラスの生物学的メディエーターを含むエイコサノイド、特にプロスタノイドを生じる。これらのメディエーターのいくつか、特にω−６ＰＵＦＡから形成されるもの（プロスタグランジンおよびトロンボキサン）は、強力な炎症促進性作用を有し、血液凝固を開始し得る。アスピリンなどの既存の薬物は望ましくない副作用を有するため、ＰＵＦＡの酵素的酸化を下方制御し、したがってそれらの形成を下方制御するための新しい手法の開発が望ましい。

【0056】

多くの神経学的障害および他の障害の発症および進行における必須ＰＵＦＡの酸化の重要性は、酸化ストレスおよび反応性カルボニルによって与えられる関連の損傷を低減するように設計される介入の開発を促進するのに役立った。かかる手法は、酸化種の中和に焦点を当てるものである（抗酸化剤栄養補助剤）。かかる介入の成功は制限されてきた。かかる手法のいくつかの欠点には、（それに限定されるものではないが）小分子および酵素的抗酸化剤の両方に関連する以下の点が含まれる。（ａ）生細胞中に既に存在するほぼ飽和量の抗酸化剤は、抗酸化剤の量の任意のさらなる増加が、それがたとえ実質的でも、残りのＲＯＳレベルに対して、あるとしても漸増的な効果しかもたらし得ないことを意味すること(Ｚｉｍｎｉａｋ Ｐ、Ａｇｅｉｎｇ Ｒｅｓ.Ｒｅｖ.２００８年；７：２８１〜３００頁)、（ｂ）ＲＯＳは、細胞シグナル伝達において重要な役割を果たしており、その妨害は有害作用を有し得ること（Ｐａｃｋｅｒ Ｌ、Ｃａｄｅｎａｓ Ｅ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄ.Ｒｅｓ.２００７年；４１：９５１〜９５２頁）、（ｃ）特定の生理的状態／特定の部位において、ＲＯＳは、抗酸化剤によって減弱され得る保護機能を有すること（Ｓａｌｇａｎｉｋ ＲＩ. Ｊ.Ａｍ.Ｃｏｌｌ.Ｎｕｔｒ.２００１年；２０：４６４Ｓ〜４７２Ｓ頁）、（ｄ）抗酸化剤の酸化形態は、それら自体が有害になり得ること（Ｚｉｍｎｉａｋ Ｐ、Ａｇｅｉｎｇ Ｒｅｓ.Ｒｅｖ.２００８年；７：２８１〜３００頁）、（ｅ）適度なレベルのＲＯＳは、保護機構の気密性(hormetic)（適応性）の上方制御に寄与すること（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ ＥＪら、Ｔｏｘｉｃｏｌ.Ａｐｐｌ.Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.２００７年；２２２：１２２〜１２８頁）、（ｆ）ＨＮＥおよびＨＨＥなどの反応性カルボニル化合物には、フリーラジカルの性質がなく、したがって抗酸化剤によって中和することができないこと。しかしこれらは、グルタチオン（ＧＳＨ）などの細胞のスルフヒドリル化合物を枯渇させることによって、やはり細胞の酸化還元状態を著しく変えることができる。

【0057】

いくつかの反応の速度は、結合が連結する原子の同位体の性質によって影響を受ける。一般に、重同位体において終結する結合は、より軽い同位体において終結する結合よりも切断されにくい。水素原子と他の原子との間の結合は、水素が^１Ｈではなく^２Ｈである場合に切断されにくいという特徴がある。炭素原子と別の原子との間の結合の切断率を比較すると、^１３Ｃとの結合は、^１２Ｃとの結合よりも切断されにくいという類似の効果が見られる。これは同位体効果として公知であり、十分に説明されているものである。多くの同位体は、「化学反応の同位体効果」において記載の通り、この効果を示すことが公知である。（Ｃｏｌｌｉｎｓ ＣＪ、Ｂｏｗｍａｎ ＮＳ(ｅｄｓ)１９７０年 Ｉｓｏｔｏｐｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）。

【0058】

本発明のいくつかの態様は、以下の、（１）必須ＰＵＦＡは、脂質膜、特にミトコンドリア膜が適切に機能するのに極めて重要であるが、それらの固有の欠点、すなわち有害な転帰を伴うＲＯＳによって酸化される傾向は、多くの神経学的疾患に関与しているという理解、（２）抗酸化剤は、そのプロセスの確率的性質および抗酸化剤による治療に対するＰＵＦＡ過酸化産物（反応性カルボニル）の安定性に起因して、ＰＵＦＡ過酸化の悪影響を解消し得ないこと、ならびに（３）ＰＵＦＡ内の酸化されやすい部位がＲＯＳによって受ける損傷は、それらの部位がかかる酸化を受けにくくなるようにする手法を使用することによって、それらの有益な物理的特性のいずれも損なうことなく克服できることから生じる。本発明のいくつかの態様は、最も酸化の問題となる必須ＰＵＦＡおよびＰＵＦＡ前駆体の部位のみにおいてこのことを達成する同位体効果の使用を説明するものであり、他の態様では、最も酸化の問題となる部位に加えて、他の部位も企図する。

【0059】

他の化学的な手法を使用してＰＵＦＡ内の酸化されやすい位置を保護することによって、同じ効果が達成され得ることが、当業者には理解されよう。特定のＰＵＦＡ模倣薬は、天然のＰＵＦＡと構造的な類似性を有するにもかかわらず、構造的強化に起因してＲＯＳによる酵素的酸化に対して安定になる。

【0060】

したがっていくつかの実施形態では、同位体修飾された多価不飽和脂肪酸または模倣薬は、化学的に、または１つもしくは複数の同位体、例えば^１３Ｃおよび／もしくは重水素を用いた強化によって安定にされている、天然に存在するＰＵＦＡと構造的な類似性を有する化合物を指す。一般に、重水素が強化に使用される場合、メチレン基上の両方の水素が強化され得る。

【0061】

本発明のいくつかの態様は、重同位体によって１つ、いくつか、またはすべてのビスアリル位が置換されている必須ＰＵＦＡの類似体である化合物を提供する。いくつかの実施形態では、酵素的変換時にＰＵＦＡのビスアリル位になるＣＨ_２基は、ＰＵＦＡ酸化が因子となる神経障害の予防または治療に有用な重同位体で置換されている。

【0062】

ビスアリル位は、一般に、１，４−ジエン系のメチレン基に相当する、多価不飽和脂肪酸またはその模倣薬の位置を指す。前ビスアリル位は、酵素的不飽和化の際にビスアリル位になるメチレン基を指す。

【0063】

いくつかの実施形態では、ＰＵＦＡの化学的同一性、すなわち化学的構造は、同位体置換または同位体置換を模倣する置換に関係なく、摂取時に同じままである。例えば、必須ＰＵＦＡ、すなわちヒトなどの哺乳動物が一般に合成しないＰＵＦＡの化学的同一性は、摂取時に同じままであり得る。しかしある場合には、ＰＵＦＡは、哺乳動物においてさらなる伸展／不飽和化を受け、したがって摂取時にそれらの化学的同一性が変化することがある。化学的同一性は、模倣薬に関しても同様に未変化のままであり得、または類似の伸展／不飽和化を受け得る。いくつかの実施形態では、伸展され、任意選択により不飽和化されるＰＵＦＡは、摂取およびさらなる代謝時に、高級同族体と呼ばれ得る。

【0064】

いくつかの実施形態では、天然に存在する存在量レベルは、自然の同位体の天然存在量と比較され得る、ＰＵＦＡに組み込むことができる同位体、例えば^１３Ｃおよび／または重水素のレベルを指す。例えば^１３Ｃは、すべての炭素原子において約１％の^１３Ｃ原子の天然存在量を有する。したがって、ＰＵＦＡにおいて天然存在量を超える^１３Ｃを有する炭素の相対的百分率は、そのすべての炭素原子のうち^１３Ｃで強化されたものが２％などの約１％を超える天然存在量レベルを有することができるが、好ましくは各ＰＵＦＡ分子内の１つまたは複数の炭素原子に対して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％超または１００％が^１３Ｃである。

【0065】

水素に関して、いくつかの実施形態では、重水素は、地球上の海洋においてすべての天然に存在する水素の約０．０１５６％の天然存在量を有する。したがって、重水素のその天然存在量を超える存在量を有するＰＵＦＡは、このレベルを超えるか、またはその水素原子のうち重水素で強化されたものが０．０２％などの約０．０１５６％を超える天然存在量レベルを有することができるが、好ましくは各ＰＵＦＡ分子内の１つまたは複数の水素原子に対して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％超または１００％が重水素である。

【0066】

いくつかの態様では、ＰＵＦＡの組成物は、同位体修飾されたＰＵＦＡおよび同位体修飾されていないＰＵＦＡの両方を含有する。同位体純度は、ａ）同位体修飾されたＰＵＦＡ分子の相対数と、ｂ）同位体修飾されたＰＵＦＡおよび重原子を伴わないＰＵＦＡの両方のすべての分子、との間の比較である。いくつかの実施形態では、同位体純度は、重原子を除いてその他は同じであるＰＵＦＡを指す。

【0067】

いくつかの実施形態では、同位体純度は、同位体修飾されたＰＵＦＡと重原子を伴わないＰＵＦＡの分子の総数に対する、組成物中の同位体修飾されたＰＵＦＡ分子の百分率を指す。例えば、同位体純度は、同位体修飾されたＰＵＦＡと重原子を伴わないＰＵＦＡの分子の総数に対して、同位体修飾されたＰＵＦＡ分子が約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＵＦＡの同位体純度は、組成物中のＰＵＦＡ分子の総数の約５０％〜９９％であり得る。同位体修飾されたＰＵＦＡと重原子を伴わないＰＵＦＡの合計１００個のすべての分子のうち、２個の同位体修飾されたＰＵＦＡ分子は、その２個の同位体修飾された分子が含有する重原子の数にかかわらず、２％の同位体純度を有することになる。

【0068】

いくつかの態様では、同位体修飾されたＰＵＦＡ分子は、メチレン基の２個の水素が、共に重水素によって置き換えられる場合など、２個の重水素原子を含有し、したがって「Ｄ２」ＰＵＦＡと呼ぶことができる。同様に、同位体修飾されたＰＵＦＡ分子は、４個の重水素原子を含有し、「Ｄ４」ＰＵＦＡと呼ぶことができる。

【0069】

分子内の重原子の数または同位体負荷は変わり得る。例えば、同位体負荷が相対的に低い分子は、２個または４個の重水素原子を含有することができる。負荷が非常に高い分子では、それぞれの水素が重水素で置き換えられ得る。したがって同位体負荷は、各ＰＵＦＡ分子の重原子の百分率を指す。例えば、同位体負荷は、同種の重原子を伴わないＰＵＦＡと比較して、同種の原子の数が約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％であり得る（例えば、水素は、重水素と「同種」であり得る）。意図しない副作用は、ＰＵＦＡ組成物内の同位体純度が高いが、所与の分子内の同位体負荷が低い場合に減少すると期待される。例えば、代謝経路は、同位体純度は高いが同位体負荷が低いＰＵＦＡ組成物を使用することによって受ける影響が少なくなる。

【0070】

いくつかの態様では、同位体修飾されたＰＵＦＡは特定の組織においてある量の重原子を付与する。したがっていくつかの態様では、重分子の量は組織における同種の分子の特定の百分率となる。例えば、重分子の数は同種の分子の総量の約１％〜１００％であり得る。いくつかの態様では、分子の１０〜５０％が同種の重分子で置換されている。

【0071】

いくつかの実施形態では、必須ＰＵＦＡと同じ化学的結合構造であるが、特定の位置に異なる同位体組成を有する化合物は、非置換化合物とは著しく有益に異なる化学特性を有することになる。酵素的酸化またはＲＯＳによる酸化などの酸化に関する特定の位置は、図１に示す通り、必須の多価不飽和脂肪酸およびそれらの誘導体のビスアリル位を含む。以下に示す、ビスアリル位において強化された必須ＰＵＦＡ同位体は、酸化に対してより安定になる。したがって、本発明のいくつかの態様は、式（１）の化合物を使用する特定の方法を提供する（その部位は炭素−１３でさらに強化され得る。Ｒ１＝アルキルまたはＨ；ｍ＝１〜１０；ｎ＝１〜５であり、各ビスアリル位において、両方のＹ原子は重水素原子である）。例えば、

【0072】

【化2】

【0073】

１１,１１−ジジュウテロ−ｃｉｓ,ｃｉｓ−オクタデカジエン酸（１１,１１−ジジュウテロ−(９Ｚ,１２Ｚ)−９,１２−オクタデカジエン酸；Ｄ_２−ＬＡ）；および１１,１１,１４,１４−テトラジュウテロ−ｃｉｓ,ｃｉｓ,ｃｉｓ−９,１２,１５−オクタデカトリエン酸(１１,１１,１４,１４−テトラジュウテロ−(９Ｚ,１２Ｚ,１５Ｚ)−９,１２,１５−オクタデカトリエン酸；Ｄ_４−ＡＬＡ）。いくつかの実施形態では、前記位置は、重水素化に加えて炭素−１３によって、それぞれ天然に存在する存在量レベルを超える同位体存在量のレベルで、さらに強化され得る。ＰＵＦＡ分子におけるすべての他の炭素−水素結合は、任意選択により天然存在量レベル以上で重水素および／または炭素−１３を含有することができる。

【0074】

必須ＰＵＦＡは、不飽和化および伸長によって高級同族体に生化学的に変換される。したがって、前駆体ＰＵＦＡにおいてビスアリルではないいくつかの部位は、生化学的変換時にビスアリルになる。次いで、かかる部位は、酵素的酸化またはＲＯＳによる酸化に対して感受性が高くなる。さらなる一実施形態では、既存のビスアリル部位に加えてかかる前駆ビスアリル部位が、以下に示す通り同位体置換によって強化される。したがって、本発明のこの態様は、式（２）の化合物の使用を提供する（各ビスアリル位および各前ビスアリル位において、両方のＸまたは両方のＹ原子が重水素原子であり得る。Ｒ１＝アルキルまたはＨ；ｍ＝１〜１０；ｎ＝１〜５；ｐ＝１〜１０である）。

【0075】

【化3】

【0076】

前記位置は、重水素化に加えて炭素−１３によって、それぞれ天然に存在する存在量レベルを超える同位体存在量のレベルで、さらに強化され得る。ＰＵＦＡ分子におけるすべての他の炭素−水素結合は、任意選択により天然存在量レベル以上で重水素および／または炭素−１３を含有することができる。

【0077】

異なるビスアリル部位におけるＰＵＦＡの酸化は、酵素的酸化またはＲＯＳによって生じる酸化の際に、異なる組の産物をもたらす。例えば、４−ＨＮＥはｎ−６ＰＵＦＡから形成され、４−ＨＨＥはｎ−３ＰＵＦＡから形成される（Ｎｅｇｒｅ−Ｓａｌｖａｙｒｅ Ａら、Ｂｒｉｔ.Ｊ.Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.２００８年；１５３：６〜２０頁）。かかる酸化産物は、様々な制御特性、毒性、シグナル伝達特性等の特性を有する。したがって、かかる酸化の相対的程度を制御することが望ましい。したがって、本発明のいくつかの態様は、異なる部位における酸化の相対的収率を制御するために、以下に示す通り、ＰＵＦＡのビスアリルまたは前ビスアリル位におけるＹ^１−Ｙ^ｎおよび／またはＸ^１−Ｘ^ｍの対のいずれかが重水素原子になるように、選択されたビスアリルまたは前ビスアリル位において安定な重同位体で特異的に強化された式（３）の化合物の使用を提供する。Ｒ１＝アルキルまたはＨ；ｍ＝１〜１０；ｎ＝１〜６；ｐ＝１〜１０である。

【0078】

【化4】

【0079】

前記位置は、重水素化に加えて炭素−１３によってさらに強化され得る。ＰＵＦＡ分子におけるすべての他の炭素−水素結合は、天然存在量レベル以上で重水素を含有することができる。先に示した構造における破断線は、様々な数の二重結合、様々な数のすべての炭素、ならびに同位体強化されたビスアリルおよび前駆ビスアリル部位の様々な組合せを有するＰＵＦＡを表すことを理解されよう。

【0080】

酸化を減速するために使用される、同位体強化されたｎ−３（ω−３）およびｎ−６（ω−６）必須多価不飽和脂肪酸、ならびに不飽和化／伸長によってそれらから生化学的に生成されたＰＵＦＡの両方を提供する、先に例示した化合物の正確な構造を以下に示す。ＰＵＦＡは、酸化感受性部位において同位体強化されている。Ｒは、Ｈまたはアルキルであり得、^＊は、^１２Ｃまたは^１３Ｃのいずれかを表す。

【0081】

Ｄ−リノール酸には、以下が含まれる。

【0082】

【化5】

【0083】

以下の過重水素化リノール酸は、微生物学的方法によって、例えばＤおよび１３Ｃを含有する培地で増殖させることによって、生成することができる。

【0084】

【化6】

【0085】

Ｄ−アラキドン酸には、以下が含まれる。

【0086】

【化7】

【0087】

以下の過重水素化アラキドン酸は、微生物学的方法によって、例えばＤおよび１３Ｃを含有する培地で増殖させることによって、生成することができる。

【0088】

【化8】

【0089】

Ｄ−リノレン酸には、以下が含まれる。

【0090】

【化9-1】

【0091】

【化9-2】

【0092】

【化9-3】

【0093】

以下の過重水素化リノレン酸は、Ｄおよび１３Ｃを含有する培地で増殖させるなどの微生物学的方法によって、生成することができる。

【0094】

【化10】

【0095】

本発明のいくつかの態様では、必須であるかどうかにかかわらず、食事から摂取され、体内で使用され得る任意のＰＵＦＡを利用することができる。必須または非必須ＰＵＦＡまたは前駆体の場合、栄養補助された安定化材料は、他の食事による取込みおよび生体内生産(bio-manufacture)と競合して、疾患を引き起こす利用可能な種の濃度を低減することができる。

【0096】

本発明のいくつかの態様では、先の構造を用いて記載の通り酸化感受性位置において同位体強化されたＰＵＦＡは、適切な同位体、重水素および／または炭素−１３の天然存在量と比較して、前記位置において重同位体強化されている。

【0097】

いくつかの実施形態では、開示の化合物は、９９％以上の同位体純度まで濃縮されている。いくつかの実施形態では、前記位置における重同位体強化は、５０％〜９９％が重水素および／または炭素−１３である。

【0098】

本発明のさらなる一実施形態では、ビスアリル位において同位体強化されているＰＵＦＡまたはそれらの必須前駆体は、酸化ストレスに関連する神経学的疾患に対する予防のための化合物として使用される。

【0099】

本発明のさらなる一実施形態では、ビスアリル位においてまたは生化学的不飽和化の際にビスアリルになる位置において同位体強化されているＰＵＦＡまたはそれらの必須前駆体は、酸化ストレスに関連する神経学的疾患に対する予防のための化合物として使用される。

【0100】

本発明のさらなる一実施形態では、ビスアリル位において同位体強化されているＰＵＦＡまたはそれらの必須前駆体は、酸化ストレスおよびＡＭＤに関連する神経学的疾患に対する治療として使用される。

【0101】

本発明のさらなる一実施形態では、ビスアリル位においてまたは生化学的不飽和化の際にビスアリルになる位置において同位体強化されているＰＵＦＡまたはそれらの必須前駆体は、酸化ストレスおよびＡＭＤに関連する神経学的疾患に対する治療として使用される。

【0102】

いくつかの実施形態では、修飾された脂肪酸は、食事を介して薬物または栄養補助剤として投与される場合、エチルエステルまたはグリセリルエステルなどの、親脂肪酸または模倣薬の非毒性の薬学的に適切なエステルとしてのプロドラッグとして投与することができる。このエステルは、腸内の薬物の耐性の一助になり、消化を助け、吸収される薬物の活性な酸形態にエステルプロドラッグを脱エステル化する腸内の高レベルのエステラーゼに依存する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書の修飾された脂肪酸のプロドラッグエステルを包含する。市場、栄養および臨床試験の文献におけるこのクラスの薬物の例には、Ｇｌａｘｏ’ｓ Ｌｏｖａｚａ（ω３脂肪酸エステル、ＥＰＡ、ＤＨＡおよびα−リノレン酸の混合物）、Ａｂｂｏｔｔ’ｓ Ｏｍａｃｏｒ（ω−３−脂肪酸エステル）およびほとんどの魚油栄養補助剤（ＤＨＡおよびＥＰＡエステル）が含まれる。いくつかの態様では、組織または細胞へのエステルプロドラッグの組込みは、修飾された親ＰＵＦＡが体成分として使用されるときのその組込みを指す。

【0103】

いくつかの実施形態では、安定化組成物は、それらの元素組成を変化させることなく、天然に存在する脂肪酸を模倣する。例えば、置換基は、化学的な原子価殻を保持することができる。いくつかの実施形態は、特定の疾患機構の防止に有効になるように化学的に修飾されるが、材料の元素組成を変化させない（同位体置換など）ように修飾される天然に存在する脂肪酸、模倣薬およびそれらのエステルプロドラッグを含む。例えば重水素は、同じ元素の水素の形態である。いくつかの態様では、これらの化合物は元素組成を維持し、酸化に対して安定化されている。酸化に対して安定ないくつかの化合物は、酸化感受性位において安定になる。いくつかの化合物は、重同位体置換により酸化に対して安定になり、次いでビスアリルの炭素水素結合等において安定になる。

【0104】

いくつかの態様では、本発明の組成物には、米国特許出願第１２／２８１，９５７号に開示の化合物は含まれない。

【0105】

さらなる一実施形態では、ＰＵＦＡの酸化されやすいビスアリル部位は、以下に示す通り、ビスアリル水素を活性化する二重結合の距離をさらに離し、したがってビスアリル位を排除すると同時に、特定のＰＵＦＡ流動性を保持することによって、水素引き抜き反応から保護され得る。これらのＰＵＦＡ模倣薬は、ビスアリル位をもたない。

【0106】

【化11】

【0107】

さらなる一実施形態では、ＰＵＦＡの酸化されやすいビスアリル部位は、以下に示す通り、ＩＩ価のヘテロ原子を使用し、したがってビスアリル水素を排除することによって、水素引き抜き反応から保護され得る。これらのＰＵＦＡ模倣薬は、やはりビスアリル水素を有していない。

【0108】

【化12】

【0109】

さらなる一実施形態では、ＰＵＦＡ模倣薬、すなわち天然のＰＵＦＡに構造的に類似しているが、構造的差異に起因して酸化を受けることがない化合物を、前述の目的で使用することができる。ＰＵＦＡの酸化されやすいビスアリル部位は、以下に示す通り、ジメチル化によって水素引き抜き反応から保護され得る。これらのＰＵＦＡ模倣薬は、ビスアリル部位においてジメチル化される。

【0110】

【化13】

【0111】

さらなる一実施形態では、ＰＵＦＡの酸化されやすいビスアリル部位は、以下に示す通り、アルキル化によって水素引き抜き反応から保護され得る。これらのＰＵＦＡ模倣薬は、ビスアリル部位においてジアルキル化される。

【0112】

【化14】

【0113】

さらなる一実施形態では、以下に示す通り、二重結合の代わりにシクロプロピル基を使用することによって、酸に特定の流動性を付与すると同時に、ビスアリル部位を排除することができる。これらのＰＵＦＡ模倣薬は、二重結合の代わりにシクロプロピル基を有する。

【0114】

【化15】

【0115】

さらなる一実施形態では、以下に示す通り、適切な立体構造内に二重結合の代わりに１，２−置換シクロブチル基を使用することによって、酸に特定の流動性を付与すると同時に、ビスアリル部位を排除することができる。これらのＰＵＦＡ模倣薬は、二重結合の代わりに１，２−シクロブチル基を有する。

【0116】

【化16】

【0117】

二重結合の代わりに１，２−シクロブチル基を有する模倣薬の先の実施形態の修飾では、適切な立体構造内に二重結合の代わりに１，３−置換シクロブチル基を使用することによって、酸に特定の流動性を付与すると同時に、ビスアリル部位を排除することができる。以下のＰＵＦＡ模倣薬は、二重結合の代わりに１，３−シクロブチル基を有する。

【0118】

【化17】

【0119】

本発明のいくつかの態様の化合物は、記載の通り（Ｒａｐｏｐｏｒｔ ＳＩら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２００１年；４２：６７８〜６８５頁）、適切な条件下で神経細胞および組織によって取り込まれると予測され、したがって、これらの細胞または組織を酸化ストレスから保護するのに有用となる。

【0120】

強化されたＰＵＦＡまたはそれらの前駆体の送達は、改変された食事を介して行うことができる。あるいは、強化されたＰＵＦＡまたはそれらの前駆体は、それら自体、食物もしくは食品栄養補助剤として、またはそれに限定されるものではないがアルブミンとの複合体を含む、「担体」との複合体として投与することができる。

【0121】

薬物送達および医薬品送達のために一般に使用される方法などの、強化されたＰＵＦＡまたはそれらの前駆体の他の送達方法を使用することもできる。これらの方法には、それに限定されるものではないが、経口送達、局所送達、経鼻送達などの経粘膜送達、篩板を介する経鼻送達、静脈内送達、皮下送達、吸入または点眼薬を介するものが含まれる。

【0122】

それに限定されるものではないが、リポソーム送達法を含む、標的送達法および徐放による方法を使用することもできる。

【0123】

本発明のさらなる一態様は、式（１〜３）の化合物、ならびに酸化ストレスが病因となるＡＭＤおよび神経学的疾患の治療のための先に例示の化合物の使用を提供する。

【0124】

化合物が投与される期間中、対象の細胞および組織が高レベルの同位体修飾された化合物を含有する期間にわたって、本明細書に記載の同位体修飾された化合物が投与され得ることを企図する。

【0125】

重水素化されていないＰＵＦＡなどのすべての同位体修飾されていないＰＵＦＡを、重水素化されているＰＵＦＡなどの同位体修飾されたＰＵＦＡで置換する必要はない。いくつかの実施形態では、自己酸化の鎖反応を維持することによってＨ−ＰＵＦＡなどの非修飾ＰＵＦＡを予防するために、膜内にＤ−ＰＵＦＡなどの十分に同位体修飾されたＰＵＦＡを有することが好ましい。自己酸化中、１つのＰＵＦＡが酸化し、その近くに酸化されていないＰＵＦＡが存在する場合、酸化されていないＰＵＦＡは、酸化したＰＵＦＡによって酸化され得る。これも、自動酸化と呼ぶことができる。ある場合には、低濃度の、例えばＤ−ＰＵＦＡを有する膜内に「希薄な」Ｈ−ＰＵＦＡが存在する場合、この酸化サイクルは、Ｈ−ＰＵＦＡ間の距離に起因して中断し得る。いくつかの実施形態では、同位体修飾されたＰＵＦＡの濃度は、自動酸化鎖反応を維持するのに十分な量で存在する。自動酸化鎖反応を中断させるための膜内の同種の分子の合計は、例えば１〜６０％、５〜５０％または１５〜３５％である。これは、ＩＲＭＳ（同位体比質量分析法）によって測定することができる。

【0126】

本発明のさらなる一態様は、活性な化合物の食事、栄養補助剤または医薬組成物を提供する。

【0127】

活性成分を含有する組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁液、水中油エマルジョン、分散性散剤もしくは顆粒、エマルジョン、硬質もしくは軟質カプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤として、経口使用に適した形態であってよい。かかる組成物は、増量剤、可溶化剤、矯味剤、安定剤、着色剤、保存剤および医薬製剤の技術者に公知の他の薬剤などの添加剤を含有することができる。さらに、経口形態は、本明細書に記載の化合物を含有する食品または食品栄養補助剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、食品または対象の食事に含有される主要な脂肪に応じて、ω−３またはω−６脂肪酸などのＰＵＦＡの１種が食品に添加され、または栄養補助剤として使用され得るように、オーダーメイドすることができる。さらに組成物は、治療を受ける疾患に応じてオーダーメイドすることができる。例えばＬＤＬに関連する状態は、リノール酸から生成されるカルジオリピンが酸化されるので、より多量のＤ−リノール酸を必要とし得る。他の実施形態では、網膜疾患および神経学的／ＣＮＳ状態などは、Ｄ−ω−３脂肪酸がこれらの疾患の治療に関連性が高いので、Ｄ−リノレン酸などのω−３脂肪酸をより多量に必要とし得る。いくつかの態様では、疾患がＨＮＥに関連する場合、Ｄ−ω−６脂肪酸が処方されるべきであり、ＨＨＥについてはＤ−ω−３脂肪酸が処方されるべきである。

【0128】

組成物はまた、スプレー、クリーム、軟膏、ローションとして、またはパッチ、包帯もしくは創傷用包帯材への成分もしくは添加剤として、局所適用によって送達するのに適していてよい。さらに、本化合物は、機械的な手段によって疾患部位に送達することができるか、または正常な組織には豊富でないか、もしくは存在しない疾患状態の組織の態様と親和性のあるアルブミンなどの、リポソーム（疾患状態の組織との親和性をリポソームに提供する化学修飾を伴うか、または伴わない）、抗体、アプタマー、レクチンもしくは化学的リガンドなどの全身標的技術の使用によって、疾患部位を標的にすることができる。いくつかの態様では、化粧品の局所適用は、パッチなどによって皮膚を介して送達するための、本明細書に記載の同位体修飾された化合物または模倣薬である担体の使用を含み得る。眼の障害は、点眼薬で治療することができる。

【0129】

医薬組成物は、注射による投与に適した形態であってもよい。かかる組成物は、溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態であってよい。かかる組成物は、安定化剤、抗菌剤、または医薬品の機能を改善するための他の材料を含むことができる。本発明のいくつかの態様はまた、注射による投与または経口もしくは局所使用に適した溶液、懸濁液またはエマルジョンに容易に形成または再構成することができる、ドライ、乾燥(dessicated)または凍結乾燥形態の化合物を包含する。注射による送達は、全身送達に適しており、眼に関係する障害を治療するための眼への注射などの局所送達にも適していてよい。

【実施例】

【0130】

実験：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、ＰＥ−ＡＢＩ Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ遅延引き出し機器で記録した。スペクトルは、加速電圧２５ＫＶおよび遅延１００ｍｓにより正イオンモードで得た。別段特定されない限り、１ＨのＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ２００ＭＨｚ分光計で記録した。ＨＰＬＣはＷａｔｅｒｓ系で実施した。化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（ＵＳＡ）、Ａｖｏｃａｄｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＵＫ）、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｌｔｄ（ＵＫ）およびＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）から得た。シリカゲル、ＴＬＣプレートおよび溶媒は、ＢＤＨ／Ｍｅｒｃｋから得た。ＩＲスペクトルは、Ｖｅｒｔｅｘ ７０分光計を用いて記録した。^１Ｈおよび^１３ＣのＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣ ４００機器を用いて、ＣＤＣｌ_３中、それぞれ４００ＭＨｚおよび１００ＭＨｚで得た（内部標準として、^１Ｈについてはδ＝０．００におけるＴＭＳまたはδ＝７．２６におけるＣＨＣｌ_３および^１３Ｃについてはδ＝７７．０におけるＣＨＣｌ_３）。

【0131】

例１．１１，１１−Ｄ２−リノール酸の合成

【0132】

【化18】

【0133】

１,１−ジジュウテロ−オクト−２−イン−１−オール（２）。ブロモエタン（１００ｍｌ）、１，２−ジブロモエタン（１ｍｌ）および削り状マグネシウム（３１．２ｇ）から調製した臭化エチルマグネシウムの乾燥ＴＨＦ（８００ｍｌ）溶液に、ヘプチン−１（（１）；１７０ｍｌ）をアルゴン下で３０〜６０分間かけて滴下添加した。反応混合物を１時間撹拌し、次いでジュウテロパラホルム(Deuteroparaform)（３０ｇ）を、一度に注意深く添加した。反応混合物を穏やかに２時間還流させ、−１０℃に冷却し、次いで水５〜７ｍｌをゆっくり添加した。混合物をクラッシュアイススラリー０．５ｋｇおよび濃硫酸４０ｍｌに注ぎ、ヘキサン０．５Ｌで洗浄した。有機相を分離し、残りの水相を５：１ヘキサン：酢酸エチルで抽出(３×３００ｍｌ)した。混合有機画分を、飽和ＮａＣｌ(１×５０ｍｌ)、飽和ＮａＨＣＯ_３(１×５０ｍｌ)で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を真空中で蒸発させて、無色油１１９．３ｇ（９９％）を得、それをさらなる精製なしに使用した。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_８Ｈ_１２Ｄ_２Ｏの計算値：１２８．１１６８；実測値：１２８．１１７３。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：２．１８（ｔ，Ｊ＝７．０，２Ｈ）、１．５７（ｓ，１Ｈ）、１．４７（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）、１．３１（ｍ，４Ｈ）、０．８７（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。

【0134】

１,１−ジジュウテロ−１−ブロモ−オクト−２−イン（３）。（２）（３．４８ｇ；２７．２ｍｍｏｌ）およびピリジン（１９ｍｌ）の乾燥ジエチルエーテル（３００ｍｌ）溶液に、ジエチルエーテル３５ｍｌ中ＰＢｒ_３３６ｍｌを、アルゴン下で撹拌しながら−１５℃で３０分かけて滴下添加した。反応混合物を室温まで徐々に温め、次いで撹拌しながら３時間還流させ、撹拌なしに１時間還流させた。次いで、反応混合物を−１０℃に冷却し、氷水５００ｍｌを添加した。残渣が溶解したら、飽和ＮａＣｌ（２５０ｍｌ）およびヘキサン（２５０ｍｌ）を添加し、有機層を分離した。水性画分をヘキサン（２×１００ｍｌ）で洗浄し、混合有機画分をＮａＣｌ（２×１００ｍｌ）で洗浄し、微量のヒドロキノンおよびトリエチルアミンの存在下で、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を、大気圧において蒸留によって、その後回転蒸発によって除去した。残渣を減圧蒸留（３ｍｍＨｇ）によって分留して、薄黄色油１４７．４ｇを得た（ジュウテロパラホルムで計数して８２％）。ｂ．ｐ．７５℃。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_８Ｈ_１１Ｄ_２Ｂｒの計算値：１９０．０３２４；実測値：１８９．０３０１、１９１．０３２１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：２．２３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．５０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．３３（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２）、０．８９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。

【0135】

１１,１１−ジジュウテロ−オクタデカ−９,１２−ジイン酸メチルエステル（５）。ＣｕＩ（１３３ｇ）を、ＤＭＦ（ＣａＨ_２で新しく蒸留した）４００ｍｌに急速に添加し、その後乾燥ＮａＩ（１０６ｇ）、Ｋ_２ＣＯ_３（１４３ｇ）を添加した。次いで、デカ−９−イン酸メチルエステル（（４）；６５ｇ）を一度に添加し、その後臭化物（３）（６７ｇ）を添加した。追加のＤＭＦ２５０ｍｌを使用してフラスコ壁から試薬をすすぎ、反応混合物のバルクに入れ、次いで１２時間撹拌した。次いで、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液５００ｍｌを撹拌しながら添加し、その後数分以内に飽和ＮａＣｌ水溶液を添加し、次いでヘキサン：ＥｔＯＡｃの５：１混合物（３００ｍｌ）を添加した。混合物をさらに１５分間撹拌し、次いで細かいメッシュのＳｃｈｏｔｔガラスフィルターを介して濾過した。残渣を、ヘキサン：ＥｔＯＡｃミックスで数回洗浄した。有機画分を分離し、水相をさらに抽出した（３×２００ｍｌ）。混合有機画分を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、微量のヒドロキノンおよびジフェニルアミンを添加し、溶媒を真空中で蒸発させた。残渣を１ｍｍＨｇですぐに蒸留して、沸点１６５〜１７５℃の画分７９ｇ（７７％）を得た。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_１９Ｈ_２８Ｄ_２Ｏ_２の計算値：２９２．２３６９；実測値：２９２．２３６５。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：３．６７（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３）、２．３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．１４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，４Ｈ，ＣＨ_２）、１．６３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．４７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２）、１．３（ｍ，１０Ｈ，ＣＨ_２）、０．８８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。

【0136】

１１,１１−ジジュウテロ−ｃｉｓ,ｃｉｓ−オクタデカ−９,１２−ジエン酸メチルエステル（６）。酢酸ニッケル四水和物（３１．５ｇ）の９６％ＥｔＯＨ（４００ｍｌ）懸濁液を、塩が溶解するまで撹拌しながら約５０〜６０℃に加熱した。フラスコを水素でフラッシュし、次いでＮａＢＨ_４溶液（ＥｔＯＨ（１７０ｍｌ）中ＮａＢＨ_４懸濁液（７．２ｇ）を１５分撹拌し、その後濾過することによって調製した）１３０ｍｌを、撹拌しながら２０〜３０分間かけて滴下添加した。１５〜２０分以内にエチレンジアミン（３９ｍｌ）を一度に添加し、その後５分以内にＥｔＯＨ（２００ｍｌ）中（５）（７５ｇ）を添加した。反応混合物を、水素（１気圧）下で激しく撹拌した。水素吸収は約２時間で停止した。反応混合物に、ヘキサン９００ｍｌおよび氷冷したＡｃＯＨ５５ｍｌを添加し、その後水（１５ｍｌ）を添加した。ヘキサン（４００ｍｌ）を添加し、混合物を分離させた。水性画分を、ヘキサン：ＥｔＯＡｃの５：１ミックスによって抽出した。抽出の完了をＴＬＣによって監視した。混合有機相を希釈したＨ_２ＳＯ_４溶液で洗浄し、その後飽和ＮａＨＣＯ_３および飽和ＮａＣｌで洗浄し、次いでＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。シリカゲル（シリカゲル６０、Ｍｅｒｃｋ；１６２ｇ）を、硝酸銀（４３ｇ）の無水ＭｅＣＮ（３６０ｍｌ）溶液に添加し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。得られた含浸シリカゲルを、５０℃で３時間乾燥させ（吸引ポンプ）、次いで油ポンプで８時間乾燥させた。生成物１グラム当たり、このシリカを３０ｇ使用した。反応混合物を少量のヘキサンに溶解し、銀修飾シリカゲルに適用し、１〜３％勾配のＥｔＯＡｃで予洗した。非極性汚染物質を洗い流したら（ＴＬＣによる制御）、生成物を１０％ＥｔＯＡｃで溶出し、溶媒を真空中で蒸発させて、標題エステル（６）５２ｇを無色液体として得た。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_１９Ｈ_３２Ｄ_２Ｏ_２の計算値：２９６．２６８２；実測値：２９６．２６７６。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝１７４０ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：５．３２（ｍ，４Ｈ）、３．６６（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３）、２．２９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．０２（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２）、１．６０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．３０（ｍ，１４Ｈ，ＣＨ_２）、０．８８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。

【0137】

１１,１１−ジジュウテロ−ｃｉｓ,ｃｉｓ−オクタデカ−９,１２−ジエン酸（７）。ＫＯＨ（４６ｇ）の水（１１５ｍｌ）溶液を、エステル（６）（４６ｇ）のＭｅＯＨ（６０ｍｌ）溶液に添加した。反応混合物を４０〜５０℃で２時間撹拌し（ＴＬＣによる制御）、次いで水２００ｍｌで希釈した。溶媒の３分の２を除去した（ロータリーエバポレーター）。希硫酸をｐＨ２になるまで残渣に添加し、その後少量のペンタンと共にジエチルエーテルを添加した。有機層を分離し、水層を少量のペンタンと共にジエチルエーテルで洗浄した。混合有機画分を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いでＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を蒸発させて、４３ｇの（７）（９９％）を得た。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝１７４１、１７１１ｃｍ^−１。

【0138】

例２．１１，１１，１４，１４−Ｄ４−リノレン酸の合成

【0139】

【化19】

【0140】

１,１−ジジュウテロ−ペンタ−２−イン−１−オール（９）。ブロモエタン（１００ｍｌ）および削り状マグネシウム（３１．３ｇ）から調製した臭化エチルマグネシウムの乾燥ＴＨＦ（８００ｍｌ）溶液中、ブチ−１−イン（８）を浴（−５℃）上でゆっくり発泡させた。時々発泡を停止し、ブチ−１−インを入れたシリンダーを秤量して、消費速度を測定した。多量の沈殿物が形成して間もなく、アルキンの供給を停止した（消費されたアルキンの測定質量は１２５ｇであった）。反応混合物を３０分かけて室温まで温め、次いで１５分間撹拌した。次いで、混合物を３０℃まで加熱すると、その時点で沈殿物が溶解し、次いで室温でさらに３０分間撹拌した。ジュウテロパラホルム（２８ｇ）を一度に添加し、混合物を３時間還流させて、透明溶液を形成した。それを室温に冷却し、クラッシュアイス（８００ｇ）および濃Ｈ_２ＳＯ_４５０ｍｌの混合物に注いだ。ヘキサン（４００ｍｌ）を添加し、有機層を分離した。水相をＮａＣｌで飽和させ、ヘキサン：ＥｔＯＡｃの４：１混合物（１Ｌ）で抽出した。抽出プロセスの完了を、ＴＬＣによって監視した。混合有機相を、飽和ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、再度ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を、大気圧において蒸留によって除去した（最大蒸気温度１０５℃）。残渣（７０．５ｇ；９４％）を、さらなる精製なしに使用した。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_５Ｈ_６Ｄ_２Ｏの計算値：８６．０６９９；実測値：８６．０７５１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：２．２１（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．９３（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、１．１２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：８７．７、７７．６、１３．７、１２．３（ＣＤ_２のシグナルは欠けている）。

【0141】

１,１−ジジュウテロ−１−ブロモ−ペンタ−２−イン（１０）。（９）（７０．５ｇ）およびピリジン（１６．５ｍｌ）の乾燥ジエチルエーテル（２８０ｍｌ）溶液に、ジエチルエーテル５０ｍｌ中ＰＢｒ_３３２．３ｍｌを、アルゴン下で撹拌しながら−１０℃で３０分かけて滴下添加した。反応混合物を１時間かけて室温まで徐々に温めた。少量のヒドロキノンを添加し、次いで混合物を４．５時間還流させた。次いで反応混合物を−１０℃に冷却し、氷水３５０ｍｌを添加した。残渣が溶解したら、飽和ＮａＣｌ（３５０ｍｌ）およびヘキサン（３００ｍｌ）を添加し、有機層を分離した。水性画分をジエチルエーテル（２×１５０ｍｌ）で洗浄し、混合有機画分をＮａＣｌ（２×５０ｍｌ）で洗浄し、微量のヒドロキノンおよびトリエチルアミンの存在下で、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を大気圧で除去し、次いで沸点１４７〜１５５℃の画分を留去した。あるいは、１００℃に達した後、大気圧での蒸留を停止させ、生成物を７７〜８４℃で留去した（２５ｍｍＨｇ）。収率：１０７ｇの澄明液体。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_５Ｈ_５Ｄ_２Ｂｒの計算値：１４７．９８５５；実測値：１４６．９８１４、１４８．９８３５。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝２２５１ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：２．２３（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．１１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：８９．３、７４．５、１３．４、１２．６（ＣＤ_２のシグナルは欠けている）。

【0142】

１,１,４,４−テトラジュウテロ−オクタ−２，５−ジイン−１−オール（１２）。乾燥ＴＨＦ４００ｍｌ中、臭化エチル（５３ｍｌ）および削り状マグネシウム（１５．８ｇ）から調製した臭化エチルマグネシウムを、乾燥ＴＨＦ３５０ｍｌに少量ずつ添加すると同時に、激しく撹拌しながらこの混合物中にアセチレンを発泡させた（約２５Ｌ／時間の速度で）。グリニャール試薬溶液を、２〜５分当たり約１０ｍｌで混合物に供給した。すべての臭化エチルマグネシウムを添加したら（約２．５時間後）、その系中にアセチレンをさらに１５分間発泡させた。ジュウテロパラホルム（１７．３ｇ）およびＣｕＣｌ（０．２ｇ）をアルゴン下で添加し、ジュウテロパラホルムが溶解するまで反応混合物を撹拌なしに２．５時間還流させて、（１１）の溶液を得た。乾燥ＴＨＦ２５０ｍｌ中、マグネシウム１４．８ｇおよび臭化エチル５０ｍｌから調製した臭化エチルマグネシウム溶液を、２０分かけて反応混合物に滴下添加した。ガスの発生が停止したらコンデンサーを取り付け、溶媒２５０ｍｌを留去した。次いで、反応混合物を３０℃に冷却し、ＣｕＣｌ（１．４ｇ）を添加し、その後臭化物（１０）（６９ｇ）を１５分かけて滴下添加した。次いで、反応混合物を５時間還流させ、わずかに冷却し（冷却が速すぎると沈殿物が形成することになる）、クラッシュアイススラリー（１〜１．２ｋｇ）および濃Ｈ_２ＳＯ_４４０ｍｌに注いだ。混合物をヘキサン（６００ｍｌ）で洗浄した。有機画分を分離し、水性画分を５：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃ（２×４００ｍｌ）でさらに抽出した。混合有機画分を飽和ＮａＣｌで洗浄し、その後飽和ＮａＨＣＯ_３およびＮａＣｌで洗浄した。溶媒のバルクを、微量のヒドロキノンおよびトリエチルアミンの存在下で大気圧において除去した。残渣を、シリカゲル１００ｍｌでフラッシュした（溶離液：７：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃ）。溶媒のバルクを大気圧において除去し、残りをロータリーエバポレーターで除去した。得られた標題化合物４９．５ｇ（８５％）を、さらなる精製なしに使用した。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_８Ｈ_６Ｄ_４Ｏの計算値：１２６．０９７９；実測値：１２６．０８９９。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝３６２２ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：２．１６（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．８５（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、１．１１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：８２．３、８０．４、７８．３、７２．６、１３．７、１２．２。

【0143】

１,１,４,４−テトラジュウテロ−１−ブロモ−オクタ−２,５−ジイン（１３）を、臭化物（３）について記載の通り合成した。アルコール（１２）５４．２ｇに対して、ピリジン２ｍｌ、ＰＢｒ_３１４ｍｌおよびジエチルエーテル２５０ｍｌを使用した。生成物を、４ｍｍＨｇで蒸留することによって精製した。収率：５３ｇ（６５％）の（１３）；ｂ．ｐ．１００〜１１０℃。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_８Ｈ_５Ｄ_４Ｂｒの計算値：１８８．０１３５；実測値：１８７．０１３６、１８９．０１４３。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝２２５５ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：２．１３（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）；１．０７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：８２．５、８１．８、７５．０、７２．０、１３．６、１２．２。

【0144】

１１,１１,１４,１４−テトラジュウテロ−オクタデカ−８,１２,１５−トリイン酸メチルエステル（１５）を、１１,１１−ジジュウテロ−オクタデカ−９,１２−ジイン酸メチルエステル（５）について記載のものと類似の方法で合成した。ＣｕＩ（９７ｇ）を、ＤＭＦ４００ｍｌ（ＣａＨ_２で新しく蒸留した）に急速に添加し、その後乾燥ＮａＩ（７７．５ｇ）、Ｋ_２ＣＯ_３（１０４．５ｇ）を添加した。次いで、デカ−９−イン酸メチルエステル（（１４）；４７．５ｇ）を一度に添加し、その後臭化物（１３）（４８．５ｇ）を添加した。追加のＤＭＦ２５０ｍｌを使用してフラスコ壁から試薬をすすぎ、反応混合物のバルクに入れ、次いで１２時間撹拌した。次いで、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液５００ｍｌを撹拌しながら添加し、その後数分以内に飽和ＮａＣｌ水溶液（３００ｍｌ）を添加し、その後ヘキサン：ＥｔＯＡｃの５：１混合物（３００ｍｌ）を添加した。混合物をさらに１５分間撹拌し、次いで細かいメッシュのＳｃｈｏｔｔガラスフィルターを介して濾過した。残渣を、ヘキサン：ＥｔＯＡｃミックスで数回洗浄した。有機画分を分離し、水相をさらに抽出した（３×２００ｍｌ）。混合有機画分を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、微量のヒドロキノンおよびジフェニルアミンを添加し、溶媒を真空中で蒸発させた。残渣を１ｍｍＨｇですぐに蒸留して、沸点１７３〜１８０℃の画分４５．８ｇ（６２％）を得た。さらなる結晶化を以下の通り実施した。エステル（１５）をヘキサン（５００ｍｌ）に溶解し、−５０℃に冷却した。形成した結晶を、冷却したヘキサンで洗浄した。このステップの収率は８０％である。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_１９Ｈ_２２Ｄ_４Ｏ_２の計算値：２９０．２１８０；実測値：２９０．２２００。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：３．６６（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３）、２．２９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．１５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２）、１．６１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．４７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．３０（ｍ，６Ｈ，ＣＨ_２）、１．１１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：１７４．１、８２．０、８０．６、７４．７、７４．６、７３．７、７３．０、５１．３、３３．９、２８．９、２８．６、２８．５２、２８．４９、２４．８、１８．５、１３．７、１２．２。

【0145】

１１,１１,１４,１４−テトラジュウテロ−ｃｉｓ,ｃｉｓ,ｃｉｓ−オクタデカ−８,１２,１５−トリエン酸メチルエステル（１６）を、１１,１１−ジジュウテロ−ｃｉｓ,ｃｉｓ−オクタデカ−９,１２−ジエン酸メチルエステル（「６」）について記載のものと類似の方法で合成した。酢酸ニッケル四水和物（４２ｇ）の９６％ＥｔＯＨ（４００ｍｌ）懸濁液を、塩が溶解するまで約５０〜６０℃にして撹拌しながら加熱した。フラスコを水素でフラッシュし、次いでＮａＢＨ_４溶液（ＥｔＯＨ（１７０ｍｌ）中ＮａＢＨ_４懸濁液（７．２ｇ）を１５分間撹拌し、その後濾過することによって調製した）１３０ｍｌを、撹拌しながら２０〜３０分間かけて滴下添加した。１５〜２０分以内にエチレンジアミン（５２ｍｌ）を一度に添加し、その後５分以内にＥｔＯＨ（２００ｍｌ）中（１５）（７３ｇ）を添加した。反応混合物を、水素（１気圧）下で激しく撹拌した。水素吸収は約２時間で停止した。反応混合物に、ヘキサン９００ｍｌおよび氷冷したＡｃＯＨ５５ｍｌを添加し、その後水（１５ｍｌ）を添加した。ヘキサン（４００ｍｌ）を添加し、混合物を分離させた。水性画分を、ヘキサン：ＥｔＯＡｃの５：１ミックスによって抽出した。抽出の完了をＴＬＣによって監視した。混合有機相を希釈したＨ_２ＳＯ_４溶液で洗浄し、その後飽和ＮａＨＣＯ_３および飽和ＮａＣｌで洗浄し、次いでＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。精製のためのシリカゲルを、（６）に記載の通り調製した。生成物１グラム当たりこのシリカを３０ｇ使用した。反応混合物を少量のヘキサンに溶解し、銀修飾シリカゲルに適用し、１〜５％勾配のＥｔＯＡｃで予洗した。非極性汚染物質を洗い流したら（ＴＬＣによる制御）、生成物を１０％ＥｔＯＡｃで溶出し、溶媒を真空中で蒸発させて、標題エステル（１６）４２ｇを無色液体として得た。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_１９Ｈ_２８Ｄ_４Ｏ_２の計算値：２９６．２６４９；実測値：２９６．２６５２。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝１７４０ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：５．４（ｍ，６Ｈ，ＣＨ−二重結合）、３．６８（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３）、２．３３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．０９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２）、１．６２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．３３（ｍ，８Ｈ，ＣＨ_２）、０．９７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：１７４．１、１３１．９、１３０．２、１２８．２、１２８．１、１２７．７、１２６．９、５１．３、３４．０、２９．５、２９．０４、２９．０２、２７．１、２５．５、２４．９、２０．５、１４．２。

【0146】

１１,１１,１４,１４−テトラジュウテロ−ｃｉｓ,ｃｉｓ,ｃｉｓ−オクタデカ−８,１２,１５−トリエン酸（１７）。ＫＯＨ（１．５ｇ、２７ｍｍｏｌ）の水（２．６ｍｌ）溶液を、エステル（１６）（１．００ｇ、３．４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１５ｍｌ）溶液に添加した。反応混合物を４０〜５０℃で２時間撹拌し（ＴＬＣによる制御）、次いで水２０ｍｌで希釈した。溶媒の３分の２を除去した（ロータリーエバポレーター）。希硫酸をｐＨ２になるまで残渣に添加し、その後少量のペンタンと共にジエチルエーテルを添加した（５０ｍｌ）。有機層を分離し、水層を少量のペンタンと共にジエチルエーテルで洗浄した（３×３０ｍｌ）。混合有機画分を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いでＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を蒸発させて、０．９５ｇの（１７）（１００％）を得た。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝１７４１、１７１１ｃｍ^−１。

【0147】

例３．１４，１４−Ｄ２−リノレン酸の合成

【0148】

【化20】

【0149】

４,４−ジジュウテロ−オクタ−２,５−ジイン−１−オール（１９）。臭化エチル（９．２ｍｌ、１２３．４ｍｍｏｌ）および削り状マグネシウム（２．７４ｇ、１１２．８ｍｍｏｌ）から調製した臭化エチルマグネシウムの乾燥ＴＨＦ４０ｍｌ溶液に、氷浴上で撹拌しながら、ＴＨＦ（５ｍｌ）中プロパルギルアルコール（３．１６ｇ、５６．４ｍｍｏｌ）を１０〜１５分間かけて滴下添加した。反応混合物を室温まで温め、時に４０℃まで温めながらさらに２時間撹拌した。こうして生成されたジアニオンに、ＣｕＣｌ０．１３ｇを添加し、その後ＴＨＦ（２０ｍｌ）中臭化物（１０）（６．９ｇ）をゆっくり（１５分かけて）添加した。次いで、反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで５時間還流させた。次いで、反応混合物を５時間還流させ、わずかに冷却し（冷却が速すぎると沈殿物が形成することになる）、クラッシュアイススラリーおよび濃Ｈ_２ＳＯ_４２．５ｍｌに注いだ。混合物をヘキサン（６００ｍｌ）で洗浄した。有機画分を分離し、水性画分を５：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃでさらに抽出した。混合有機画分を飽和ＮａＣｌで洗浄し、その後飽和ＮａＨＣＯ_３およびＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒のバルクを、微量のヒドロキノンおよびトリエチルアミンの存在下で大気圧において除去した。生成物を、ＣＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１５：１）によって精製して、３．４５ｇ（５９％）の生成物１９を得た。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_８Ｈ_８Ｄ_２Ｏの計算値：１２４．０８５５；実測値：１２４．０８４９。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝３６２２ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：４．２１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．４（ｍ，１Ｈ，ＯＨ）、２．１６（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．１１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：８２．３、８０．４、７８．３、７２．６、５１．０、１３．７、１２．２。

【0150】

４,４−ジジュウテロ−１−ブロモ−オクタ−２,５−ジイン（２０）を、すべての溶媒をロータリーエバポレーターで除去したことを除き、（３）について記載の通り合成した。３．４ｇの（１９）（２７ｍｍｏｌ）から、臭化物（２０）３．９ｇ（７５％）を得、それをさらなる精製なしに使用した。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_８Ｈ_７Ｄ_２Ｂｒの計算値：１８６．００１１；実測値：１８５．００１９、１８７．００１２。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝２２５５ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：３．８８（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．１３（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．０７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：８２．５、８１．８、７５．０、７２．０、１４．８、１３．６、１２．２。

【0151】

１４,１４−ジジュウテロ−オクタデカ−８,１２,１５−トリイン酸メチルエステル（２１）を、（５）について記載の通り合成した。ＣｕＩ９．７ｇ、ＮａＩ７．８ｇ、Ｋ_２ＣＯ_３１０．５ｇ、臭化物（２０）４．８５ｇ、メチルエステル（１４）４．７５ｇおよび無水ＤＭＦ４０ｍｌから得られた生成物を、ＣＣ（２５：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、標題化合物４．５ｇ（６０％）を得た。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_１９Ｈ_２４Ｄ_２Ｏ_２の計算値：２８８．２０５６；実測値：２８８．２０４６。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：３．６６（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３）、３．１２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．２９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．１５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２）、１．６１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．４７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．３０（ｍ，６Ｈ，ＣＨ_２）、１．１１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：１７４．１、８２．０、８０．６、７４．７、７４．６、７３．７、７３．０、５１．３、３３．９、２８．９、２８．６、２８．５２、２８．４９、２４．８、１８．５、１３．７、１２．２、９．７。

【0152】

１４,１４−ジジュウテロ−ｃｉｓ,ｃｉｓ,ｃｉｓ−オクタデカ−８,１２,１５−トリエン酸メチルエステル（２２）を、リノール酸誘導体（６）について記載の通り合成した。４．５ｇの（２１）の還元のために、酢酸ニッケル四水和物２．６ｇおよびエチレンジアミン３．２ｍｌを使用した。生成物を、（６）について記載の通りＡｇＮＯ_３を含浸させたシリカゲルで精製した。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_１９Ｈ_３０Ｄ_２Ｏ_２の計算値：２９４．２５２６；実測値：２９４．２５２９。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝１７４０ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：５．３７（ｍ，６Ｈ，ＣＨ−二重結合）、３．６８（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３）、２．８２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．３３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．０９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２）、１．６２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．３３（ｍ，８Ｈ，ＣＨ_２）、０．９７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：１７４．１、１３１．９、１３０．２、１２８．２、１２８．１、１２７．７、１２６．９、５１．３、３４．０、２９．５、２９．１、２９．０４、２９．０２、２７．１、２５．５、２４．９、２０．５、１４．２。

【0153】

１４,１４−ジジュウテロ−ｃｉｓ,ｃｉｓ,ｃｉｓ−オクタデカ−８,１２,１５−トリエン酸（２３）。（２２）（１ｇ、３．４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１５ｍｌ）溶液に、ＫＯＨ（１．５ｇ、２７ｍｍｏｌ）の水（２．６ｍｌ）溶液を一度に添加した。次いで、反応混合物を（７）について記載の通り処理して、標題の酸０．９４ｇ（９９％）を得た。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝１７４１、１７１１ｃｍ^−１。

【0154】

例４．１１，１１−Ｄ２−リノレン酸の合成

【0155】

【化21】

【0156】

ペンタ−２−イン−１−オール（２４）ブチン−１（（８）；１０．４ｇ）を、ＴＨＦ（１００ｍｌ）中ブロモエタン（１１．２ｍｌ）および削り状マグネシウム（３．６ｇ）から調製した氷冷溶液中で発泡させた。反応混合物を室温まで温め、次いで１５分間撹拌した。次いで、混合物を３０℃まで加熱すると、その時点ですべての沈殿物が溶解した。熱を除去し、混合物をさらに３０分間撹拌し、次いでパラホルム（３ｇ）を一度に添加した。反応混合物を３時間還流させ（すべてのパラホルムが溶解した）、次いで室温に冷却し、クラッシュアイス（８０ｇ）および濃Ｈ_２ＳＯ_４８ｍｌの混合物に注ぎ、ジエチルエーテルで抽出した。有機相を、飽和ＮａＨＣＯ_３およびＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣（７．５６ｇ；９０％）をさらなる精製なしに使用した。ＨＲＭＳ、Ｃ_５Ｈ_８Ｏのｍ／ｚ算出値：８４．０５７５；実測値：８４．０５８３。

【0157】

１−ブロモ−ペンタ−２−イン（２５）。（２４）（１１．７ｇ）およびピリジン（２．６６ｍｌ）の乾燥ジエチルエーテル（３４ｍｌ）溶液に、ジエチルエーテル５ｍｌ中ＰＢｒ_３５．２ｍｌを、アルゴン下で撹拌しながら−１０℃で３０分かけて滴下添加した。反応混合物を１時間かけて室温まで徐々に温めた。触媒量のヒドロキノンを添加し、次いで混合物を４．５時間還流させた。次いで、反応混合物を−１０℃に冷却し、氷水３５ｍｌを添加した。残渣が溶解したら、飽和ＮａＣｌ（３５ｍｌ）およびジエチルエーテル（３０ｍｌ）を添加し、有機層を分離した。水性画分をジエチルエーテル（２×１５ｍｌ）で洗浄し、混合有機画分をＮａＣｌ（２×４００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を、大気圧に次いで減圧下（２５ｍｍＨｇ）で除去し、６０〜９０℃の画分を収集した。収率：１１．１ｇ（８４％）。ＨＲＭＳ、Ｃ_５Ｈ_７Ｂｒのｍ／ｚ算出値：１４５．９７３１；実測値：１４４．９７５０、１４６．９７５７。

【0158】

１,１−ジジュウテロ−オクタ−２,５−ジイン−１−オール（２６）を、収率８７％で（１２）について記載の通り合成した。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_８Ｈ_８Ｄ_２Ｏの計算値：１２４．０８５５；実測値：１２４．０８６８。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝３６２２ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：２．６５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．４（ｍ，１Ｈ，ＯＨ）、２．１（ｑ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．０９（ｔ，３Ｈ，ＣＨ_３）。

【0159】

１,１−ジジュウテロ−１−ブロモ−オクタ−２,５−ジイン（２７）を、すべての溶媒をロータリーエバポレーターで除去したことを除き、（３）について記載の通り合成した。生成物を、減圧下で蒸留によって精製した。収率：８６％（ｂ．ｐ．１００〜１０５℃、４ｍｍ Ｈｇ）。（ＨＲＭＳ，ｍ／ｚ Ｃ_８Ｈ_７Ｄ_２Ｂｒの計算値：１８６．００１１；実測値：１８４．９９４８、１８７．９９９９。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝２２５５ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：２．６６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．１（ｑ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．０９（ｔ，３Ｈ，ＣＨ_３）。

【0160】

１１,１１−ジジュウテロ−オクタデカ−８,１２,１５−トリイン酸メチルエステル（２８）を、（５）について記載の通り合成した。ＣｕＩ７．１ｇ、ＮａＩ５．６６ｇ、Ｋ_２ＣＯ_３７．６５ｇ、臭化物（２７）３．５５ｇ、メチルエステル（４）３．４７ｇおよび無水ＤＭＦ３０ｍｌから得られた生成物を、ＣＣ（２５：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、標題化合物３．７ｇを得た。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_１９Ｈ_２４Ｄ_２Ｏ_２の計算値：２８８．２０５６；実測値：２８８．２０６９。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：３．７（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３）、３．１５（ｂｒ． ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．３５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．１７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２）、１．６１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．４８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．３５（ｍ，６Ｈ，ＣＨ_２）、１．１１（ｔ，３Ｈ，ＣＨ_３）。

【0161】

１１,１１−ジジュウテロ−ｃｉｓ,ｃｉｓ,ｃｉｓ−オクタデカ−８,１２,１５−トリエン酸メチルエステル（２９）を、リノール酸誘導体（６）について記載の通り合成した。３．７ｇの（２８）の還元のために、酢酸ニッケル四水和物２．１６ｇおよびエチレンジアミン２．６２ｍｌを使用した。生成物を、（６）について記載の通りＡｇＮＯ_３を含浸させたシリカゲルで精製して、１．５ｇを得た。ＨＲＭＳ、ｍ／ｚ Ｃ_１９Ｈ_３０Ｄ_２Ｏ_２の計算値：２９４．２５２６；実測値：２９４．２４０２。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝１７４０ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：５．３７（ｍ，６Ｈ，ＣＨ−二重結合）、３．６（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３）、２．８２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．３３（ｔ，ｏ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．０９（ｍ ４Ｈ，ＣＨ_２）、１．６２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．３３（ｍ，８Ｈ，ＣＨ_２）、０．９７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：１７４．１、１３１．９、１３０．２、１２８．２、１２８．１、１２７．７、１２６．９、５１．３、３４．０、２９．５、２９．１、２９．０４、２９．０２、２７．１、２５．５、２４．９、２０．５、１４．２。

【0162】

１１，１１−ジジュウテロ−ｃｉｓ,ｃｉｓ,ｃｉｓ−オクタデカ−８,１２,１５−トリエン酸（３０）。（２９）（１．５ｇ、５．１ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（７．５ｍｌ）溶液に、ＫＯＨ（１．５ｇ、２７ｍｍｏｌ）の水（３ｍｌ）溶液を一度に添加した。次いで、反応混合物を（１７）について記載の通り処理して、標題の酸０．９ｇを得た。ＩＲ（ＣＣｌ_４）：ν＝１７４１、１７１１ｃｍ^−１。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：１１．２（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ）、５．３７（ｍ，６Ｈ，ＣＨ−二重結合）、２．８３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．３５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．０６（ｍ ４Ｈ，ＣＨ_２）、１．６３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、１．３２（ｍ，８Ｈ，ＣＨ_２）、０．９７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δ）：１８０．４、１３１．９、１３０．２、１２８．３、１２８．１、１２７．６、１２７．１、３４．１、２９．５、２９．１、２９．０３、２８．９８、２７．２、２５．５、２４．６、２０．５、１４．２。

【0163】

例５．例１〜４に記載の重水素化ＰＵＦＡの^１Ｈ−および^１３Ｃ−ＮＭＲ分析（図２）
^１Ｈおよび^１３Ｃスペクトルに特徴的な面積、すべての値をｐｐｍで表す。（パネルＡ）１１位におけるＬｉｎ酸の重水素化は、^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルのピークの消失によって確認される。Ｈ原子が存在しないことに起因して、δ_Η２．７６４におけるピークの消失が予測される（^１Ｈ ＮＭＲ）。δ_Ｃ２５．５におけるピークの消失は、核オーバーハウザー効果と、この特定の炭素原子がＬｉｎ酸の重水素化形態における２個のＤ原子によって五重線に分裂することの組合せに起因して生じる。（パネルＢ）^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、部位特異的に重水素化されたαＬｎｎのＣ１１位およびＣ１４位におけるＨ原子が同時発生し（δ_Η２．８０１）、したがっていずれかの部位（１１,１１−Ｈ_２、１４,１４−Ｄ_２または１１,１１−Ｄ_２、１４,１４−Ｈ_２）における重水素化は、このピークの積分を５０％減少させるが、両方の部位(１１,１１,１４,１４−Ｄ_４)における重水素化は、δ_Ｈ２．８０１のピークの完全な消失をもたらすことを示している。しかし、Ｃ１１位およびＣ１４位について観測されるピークは、小さいが検出可能な差異によって分離されるので、^１３Ｃ ＮＭＲ実験によって３つの重水素化形態の間を明確に区別することができる。したがって、Ｃ１１位またはＣ１４位のいずれかにおける重水素化は、それぞれδ_Ｃ２５．６８またはδ_Ｃ２５．６０のピーク消失をもたらすが、両方の部位における重水素化は、２つの対応するピークの消失をもたらす。

【0164】

例６．ＰＵＦＡ過酸化を停止させることができる同位体強化
Ｑ値が小さい酵母（ｃｏｑ変異体）は、脂肪酸のインビボ自動酸化を評価するための理想的な系を提供する。補酵素Ｑ（ユビキノンまたはＱ）は、低分子親油性抗酸化剤、ならびにミトコンドリア内膜の呼吸鎖における電子シャトルとして働く。補酵素Ｑの生合成および機能のためには１０種の出芽酵母遺伝子（ＣＯＱ１〜ＣＯＱ１０）が必要とされ、いずれかが欠失すると、呼吸欠損が生じる（Ｔｒａｎ ＵＣ、Ｃｌａｒｋｅ ＣＦ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ２００７年；７Ｓ，Ｓ６２頁）。ｃｏｑ酵母変異体は、ＰＵＦＡの自動酸化産物に対して非常に感受性であることが示された（Ｄｏ ＴＱら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １９９６年；９３：７５３４〜７５３９頁；Ｐｏｏｎ ＷＷ、Ｄｏ ＴＱ、Ｍａｒｂｏｉｓ ＢＮ、Ｃｌａｒｋｅ ＣＦ.Ｍｏｌ.Ａｓｐｅｃｔｓ Ｍｅｄ.１９９７年；１８，ｓ１２１頁）。出芽酵母はＰＵＦＡを産生しないが（Ｐａｌｔａｕｆ Ｆ、Ｄａｕｍ Ｇ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９２年；２０９：５１４〜５２２頁）、出芽酵母は、外因的に提供される場合にはＰＵＦＡを利用することができ、したがってそれらの内容物を操作することができる（Ｐａｌｔａｕｆ Ｆ、Ｄａｕｍ Ｇ.Ｍｅｔｈ.Ｅｎｚｙｍｏｌ.１９９２年；２０９：５１４〜５２２頁）。リノレン酸による４時間の処理後では、Ｑ値が小さい（ｃｏｑ２、ｃｏｑ３およびｃｏｑ５）酵母変異体の１％未満が生存可能である（Ｄｏ ＴＱら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １９９６年；９３：７５３４〜７５３９頁；Ｐｏｏｎ ＷＷ、Ｄｏ ＴＱ、Ｍａｒｂｏｉｓ ＢＮ、Ｃｌａｒｋｅ ＣＦ.Ｍｏｌ.Ａｓｐｅｃｔｓ Ｍｅｄ.１９９７年；１８、ｓ１２１頁）。それとは対照的に、この処理を受けた野生型（親の遺伝的背景は、菌株Ｗ３０３−１Ｂである）細胞の７０％は、生存可能なままである。Ｑ値が小さい酵母は、容易に酸化する他のＰＵＦＡ（アラキドン酸など）にも過敏性であるが、一不飽和オレイン酸による処理に対して、野生型の親の菌株と同じ挙動をする（Ｄｏ ＴＱら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １９９６年；９３：７５３４〜７５３９年）。ｃｏｒ１またはａｔｐ２変異体酵母（それぞれｂｃｌ複合体またはＡＴＰ合成酵素が欠如している）は、ＰＵＦＡ処理に対して野生型耐性を示すため、Ｑ値が小さい酵母変異体の過敏性は、呼吸不能の二次的効果ではない（Ｄｏ ＴＱら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １９９６年；９３：７５３４〜７５３９頁；Ｐｏｏｎ ＷＷ、Ｄｏ ＴＱ、Ｍａｒｂｏｉｓ ＢＮ、Ｃｌａｒｋｅ ＣＦ.Ｍｏｌ.Ａｓｐｅｃｔｓ Ｍｅｄ.１９９７；１８、ｓ１２１頁）。

【0165】

プレート希釈アッセイを使用して、ＰＵＦＡ感受性を評価することができる。このアッセイは、連続５倍希釈物のアリコートをＹＰＤプレート培地上にスポットすることによって実施され得る（図３）。異なる菌株の感受性は、各スポットにおける細胞密度の視覚的検査によって観測することができる。

【0166】

リノレン酸による処理は、ｃｏｑヌル変異体の生存能の劇的な喪失を引き起こす。全く対照的に、Ｄ４−リノレン酸で処理したｃｏｑ変異体は死滅せず、オレイン酸で処理した酵母と類似の生存能を保持していた。定量的コロニー計数によって、オレイン酸およびＤ４−リノレン酸で処理した細胞の生存能は類似するが（図４）、ｃｏｑ変異体の生存能は、標準のリノレン酸による４時間の処理後に１００倍を超えて減少したことが明らかになった。これらの結果は、過敏性のｃｏｑ変異体の細胞死滅に対する耐性によって証明される通り、同位体で強化されたリノレン酸が、標準のリノレン酸よりもはるかに自動酸化に対して耐性があることを示している。

【0167】

ＧＣ−ＭＳは、酵母細胞における脂肪酸およびＰＵＦＡを検出することができる。酵母はＰＵＦＡを合成しないが、酵母は、外因的に供給されたリノール酸およびリノレン酸を実際に組み込む（Ａｖｅｒｙ ＳＶら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.１９９６年；６２、３９６０頁；Ｈｏｗｌｅｔｔ ＮＧら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.１９９７年；６３、２９７１頁）。

【0168】

したがって、酵母は、外因的に供給されたＤ４−リノレン酸も組み込み得る可能性が高いと思われる。しかし、リノレン酸およびＤ４−リノレン酸に対する特異的な感受性は、自動酸化よりも細胞への統合の差異に起因し得る可能性が高い。その通りであるかどうかを試験するために、この脂肪酸の取込み度を監視した。最初に、Ｃ１８：１、Ｃ１８：３、Ｄ４−１８：３およびＣ１７：０（内部標準として使用される）の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の分離状態を決定した。図５に示すＧＣ−ＭＳクロマトグラムは、これらの脂肪酸メチルエステル標準の分離および検出の感受性の両方を裏付けている。

【0169】

野生型酵母を対数期増殖中に集菌し、脂肪酸感受性アッセイについて記載の通り、リン酸緩衝液と０．２０％デキストロースの存在下、外因的に添加した脂肪酸の存在下でインキュベートした（０または４時間）。細胞を集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄し、次いで酵母細胞ペレットを前述の通りアルカリメタノリシスによって処理した。Ｃ１７：０を内部標準として添加して、ＧＣ−ＭＳ後に脂肪酸をメチルエステル（ＦＡＭＥ）として検出する（図６）。４時間のインキュベーション後に検出された１８：３およびＤ４の量を、較正曲線から外挿した。これらの結果は、４時間のインキュベーション期間中に、酵母がリノレン酸およびＤ４−リノレン酸の両方を貪欲に組み込むことを示唆している。これらの結果に基づくと、Ｄ４−Ｃ１８：３による処理に対するｃｏｑ変異酵母の強化された耐性は、取込みの欠如に起因しないことが明らかである。

【0170】

Ｄ２−リノレン酸、１１，１１−Ｄ２−リノレン酸および１４，１４−Ｄ２−リノレン酸も、この酵母モデルに対して使用し、それに匹敵する保護をもたらした。

【0171】

例７．酸化ストレスを軽減し、ＡＭＤおよび糖尿病性網膜症の病理に関与する網膜細胞における生存率を増大するＤ−ＰＵＦＡ
微小血管内皮（ＭＶＥＣ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）および網膜神経細胞（網膜神経節細胞）を含むいくつかの細胞型を、細胞培養における生存について試験した。細胞を、水素化（対照）または重水素化Ｄ２−リノール酸（ω−６；ＬＡ）およびＤ４−リノレン酸（ω３；ＡＬＡ）（２０μＭ；ω−６対ω−３比：１：１または２：１）のいずれかを含有する培地中で、７２時間維持した。細胞へのＰＵＦＡの組込みを、ＧＣによって監視した。ＭＶＥＣへのＰＵＦＡの組込みを示す表１によれば、ＰＵＦＡは、細胞によって容易に取り込まれることが示された。

【0172】

【表1】

【0173】

次いで、細胞を、一般的な酸化ストレス発生化合物であるパラコート（ＰＱ；５００μＭ）で処理した。生存率の測定のために、血球計算器およびトリパンブルー排除法を使用して細胞を計数した。図８は、パラコートによる急性中毒後のＨ−ＰＵＦＡおよびＤ−ＰＵＦＡ処理したＭＶＥＣ細胞の生存率を示す。試験したすべての細胞型について、Ｄ−ＰＵＦＡは、対照と比較して、ＭＶＥＣ細胞について図８に示したものと類似の保護作用を有していた。

【0174】

例８．脳組織のリン脂質膜へのＤ−ＰＵＦＡの急速な組込みを確認する同位体比質量分析法
Ｄ２−ＬＡおよびＤ４−ＡＬＡを食事補給によって送達する場合、前記ＰＵＦＡは、哺乳動物においてさらに伸展／不飽和化され、したがってそれらの化学的同一性が変化し得るので、動物組織への組込みは、クロマトグラフィー系の分析技術では監視することができない。本発明者らは、脂質膜における重水素組成のすべての増加を測定することができる同位体比質量分析技術を使用し、したがってＤ２−ＬＡ、Ｄ４−ＡＬＡおよびこれらの２つに由来する任意の他のＰＵＦＡの組込みについて報告した。この方法を使用して、マウス脳組織へのＤ−ＰＵＦＡの実質的な取込みを検出した。マウスに、ＰＵＦＡの唯一の供給源としてＤ−ＰＵＦＡまたはＨ−ＰＵＦＡを６日間栄養補助し、４０ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰ（（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）または生理食塩水ビヒクルに急激に曝露し、同じ食事をさらに６日間継続した。ＭＰＴＰは、パーキンソン病のマウスにおいて十分に認識されているモデルである。脳を取り出し、解剖し、生理食塩水で処理したマウスからのホモジネート試料を、重水素含量について分析した。ＭＳを異なる濃度のＤ２−ＬＡおよびＤ４−ＡＬＡで較正し、Ｈ−ＰＵＦＡベースラインと比較した（表２）。表２は、脳組織のリン脂質膜へのＤ−ＰＵＦＡの組込みについての同位体比質量分析測定を示す。

【0175】

データは、重水素レベルのＭＳ標準であるウィーン標準平均海水（Ｖ−ＳＭＯＷ）レベルに対して測定した試料における重水素ピーク面積のδと、水素ピークの面積比の比（ｄＤ／Ｈ）としてパーミル（‰）で表される。Ｄ−ＰＵＦＡを与えたマウスは、参考文献と一致する１日３〜８％の重水素レベルを組み込んだ。高次ＰＵＦＡの濃度は、単回用量のＬＡおよびＡＬＡを投与して８時間以内に脳内でピークに達し、そのＬＡおよびＡＬＡは、高級ＰＵＦＡが存在しない場合には必要に応じて酵素的に不飽和化され、伸長される。

【0176】

【表2】

【0177】

先の３つの試料のそれぞれは、Ｄ２−リノレン酸：Ｄ４−リノレン酸１：１比の混合物を含有する。

【0178】

例９．Ｄ−ＰＵＦＡを栄養補助したマウスの毒性学研究−主な血液バイオマーカーにおける明らかな異常なし
より長期の投与パラダイム（すなわち、３週間の食事の置き換え）を用いたＨ−ＰＵＦＡおよびＤ−ＰＵＦＡを栄養補助したマウスの血清の化学的分析（ＵＣ Ｄａｖｉｓで実施した）では、Ｈ−ＰＵＦＡ／Ｄ−ＰＵＦＡ生理食塩水で処理したマウスについて腎臓機能、肝機能、血液脂質等の主なバイオマーカーにおいて差異は明らかにならなかった。この例では、Ｄ−ＰＵＦＡは、Ｄ２−リノール酸：Ｄ４−リノレン酸の２：１混合物である。

【0179】

試験したパラメータには、表３のトリグリセリド、総タンパク質、総ビリルビン、リン、遊離脂肪酸、ＨＤＬ、グルコース、クレアチン、コレステロール、カルシウム、血液尿素窒素、アルカリホスファターゼ、アルブミン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ等の測定が含まれていた。

【0180】

【表3】

【0181】

例１０．ＨＤＬレベルを増大し、ＬＤＬレベルを低減するＤ−ＰＵＦＡによる栄養補助
食事性ＰＵＦＡの唯一の供給源としてＤ−ＰＵＦＡを３週間栄養補助したマウスは、Ｈ−ＰＵＦＡ（１０１ｍｇ／ｄｌ）を投与した対照コホートと比較して、わずかに高レベルのＨＤＬ（１１５ｍｇ／ｄｌ；例９）を有する。Ｄ−ＰＵＦＡコホートはまた、Ｈ−ＰＵＦＡ対照群（１８１ｍｇ／ｄｌ）と比較して低レベルのコレステロール（１５８ｍｇ／ｄｌ）を有する。Ｈ−ＰＵＦＡコホートに関するＬＤＬレベル、すなわちコレステロールレベルとＨＤＬの差異は８０ｍｇ／ｄｌであり、またはＤ−ＰＵＦＡコホートの４３ｍｇ／ｄｌと比較してほぼ２倍高い。（Ｄ−ＰＵＦＡは、Ｄ２−リノール酸：Ｄ４−リノレン酸の１：１混合物である。）
例１１．パーキンソン病のマウスＭＰＴＰモデル：ドーパミン喪失を保護するＤ−ＰＵＦＡ補給
ビスアリル位におけるＰＵＦＡの同位体強化は、酸化ストレスに関係する傷害を予防し、したがって神経保護薬になる。マウスに、Ｄ−ＰＵＦＡまたはＨ−ＰＵＦＡのいずれかを６日間与え（無脂肪食(ＭＰＢｉｏ)に、１０％脂肪を栄養補助した(１０％(すなわち総脂肪の１％)がＬＡ：ＡＬＡ（１：１）またはＤ２−ＬＡ：Ｄ４−ＡＬＡ（１：１）混合物である飽和および一不飽和（オレイン酸））、次いでＭＰＴＰまたは生理食塩水を用いてチャレンジした。神経化学的分析によって、Ｄ−ＰＵＦＡを与えたマウスから、７７．８±１３．１（Ｄ−ＰＵＦＡ；ｎ＝４）対２８．３±６．３（Ｈ−ＰＵＦＡ；ｎ＝３）ｎｇ／ｍｇのタンパク質のほぼ３倍高い値と共に、線条体のドーパミンの著しい神経保護が明らかになった。（Ｄ−ＰＵＦＡは、Ｄ２−リノレン酸：Ｄ４−リノレン酸の１：１混合物である）。ＤＡの代謝産物である３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）レベルの著しい改善も、Ｄ−ＰＵＦＡ群、ならびにウエスタンブロット分析によるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の線条体の免疫反応性において見られた。重要なことに、生理食塩水で処理したマウスにおいて、線条体のＤＡレベルの上昇傾向（１１％）が、Ｄ−ＰＵＦＡ対Ｈ−ＰＵＦＡを与えたコホートに見られた（ｐ＝０．０５３；図９）。

【0182】

例１２．Ｄ−ＰＵＦＡ補給によるα−シヌクレイン(Cynuclein)凝集の減弱
ａ−ｓｙｎ発現の増大は、ヒトにおけるパーキンソン症候群および動物モデルのＰＤ様の病理を誘発し得る。野生型タンパク質の発現を強化するＳＮＣＡの増殖変異であるａ−ｓｙｎ遺伝子は、常染色体優性パーキンソニズムに必然的に関連する。タンパク質レベルの増大は、形成されるプロテイナーゼ−Ｋに耐性のある凝集同属種および病原性作用を媒介するニトリル化／リン酸化形態と共に、ａ−ｓｙｎの自己組織化を促進する。先の例に記載の通り、Ｄ−ＰＵＦＡ対Ｈ−ＰＵＦＡの投与は、Ｄ−ＰＵＦＡ対Ｈ−ＰＵＦＡで処理し、ＭＰＴＰに曝露したマウスの黒質細胞体における毒性のあるａ−ｓｙｎの蓄積を低減する（図１０）。Ｄ−ＰＵＦＡは、Ｄ２−リノレン酸：Ｄ４−リノレン酸の１：１混合物である。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図3】