特許 5934162 インフルエンザＢウイルスを検出するための配列および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5934162

(24)【登録日】2016年5月13日

(45)【発行日】2016年6月15日

(54)【発明の名称】インフルエンザＢウイルスを検出するための配列および方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20160602BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160602BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20160602BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20160602BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   C12N15/00 AZNA

   G01N33/53 M

   G01N33/536 D

【請求項の数】11

【外国語出願】

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2013-189688(P2013-189688)

(22)【出願日】2013年9月12日

(62)【分割の表示】特願2010-510515(P2010-510515)の分割

【原出願日】2008年5月30日

(65)【公開番号】特開2014-30426(P2014-30426A)

(43)【公開日】2014年2月20日

【審査請求日】2013年10月15日

(31)【優先権主張番号】60/941,270

(32)【優先日】2007年5月31日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】595117091

【氏名又は名称】ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】110001243

【氏名又は名称】特許業務法人 谷・阿部特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】トービン ヘルヤー

(72)【発明者】

【氏名】ジェームズ エー．プライス ジュニア

(72)【発明者】

【氏名】エリカ エル．ジョーンズ

【審査官】 鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第９４／０２１７９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０５７０２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第９７／０４１２５７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０５８６２９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０４７７７８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／１２１７７３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）インフルエンザＢが試料中に存在しているときに、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで、インフルエンザＢのマトリックス遺伝子標的核酸を増幅するステップであって、
前記２つのオリゴヌクレオチドプライマーは、
ｉ）前記インフルエンザＢのマトリックス遺伝子標的核酸にハイブリダイズすることができる、配列番号６９のオリゴヌクレオチドであり、および、
ｉｉ）増幅した標的核酸産物を産生するための前記インフルエンザＢのマトリックス遺伝子標的核酸にハイブリダイズすることができる、配列番号７４〜７７のいずれかひとつのオリゴヌクレオチドである、
ステップ、
および
ｂ）インフルエンザＢのマトリックス遺伝子標的核酸の検出が試料中インフルエンザＢの存在を示す、前記インフルエンザＢのマトリックス遺伝子標的核酸を検出するステップ、
を含むことを特徴とする試料中インフルエンザＢの存在を検出するための方法。

【請求項2】

前記インフルエンザＢのマトリックス遺伝子標的核酸の検出が、オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーションすることによって実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記オリゴヌクレオチドプローブがオリゴヌクレオチド配列部分を含み、前記オリゴヌクレオチド配列が配列７０〜７３のひとつを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記インフルエンザＢのマトリックス遺伝子標的核酸がＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって増幅されることを特徴とする請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記オリゴヌクレオチドプローブがさらに検出可能部分を含むレポータープローブであって、
前記検出可能部分は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシサクシニミジル１−ピレン酪酸（ＰＹＢ）、ＦＩＴＣ／エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ＦＩＴＣ／ローダミンＸ、ＦＩＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン、ローダミン、フルオレセイン、³²Ｐ、³⁵Ｓ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ジゴキシゲニン、ビオチンおよび２，４−ジニトロフェニルからなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記オリゴヌクレオチドプローブがさらに制限酵素切断部位を含み、前記制限酵素切断部位は、ＢｓｏＢＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＡｖａＩ、ＮｃｉＩおよびＦｎｕ４ＨＩからなる部位の群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。

【請求項7】

イノシンまたはキサンチンで置換した配列番号７０〜７３の位置２０、
イノシンで置換した配列番号７０〜７３の位置２１、
からなる群から選択される１つまたは複数の置換を含む前記オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチド配列部位、および
イノシンで置換した配列番号７４〜７７の位置１、および
イノシンまたはキサンチンで置換した配列番号７４〜７７の位置１３、
からなる群から選択される１つまたは複数の置換を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、
を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。

【請求項8】

前記インフルエンザＢのマトリックス遺伝子標的核酸が配列番号２６を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項9】

インフルエンザＢのマトリックス遺伝子標的核酸を検出するキットであって、
前記キットは少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、
前記２つのオリゴヌクレオチドプライマーは、
ａ）前記インフルエンザＢのマトリックス遺伝子標的核酸にハイブリダイズすることができる、配列番号６９のオリゴヌクレオチドであり、および、
ｂ）前記インフルエンザＢのマトリックス遺伝子標的核酸にハイブリダイズすることができる、配列番号７４〜７７のいずれかひとつのオリゴヌクレオチドである、
ことを特徴とするインフルエンザＢのマトリックス遺伝子標的核酸を検出するキット。

【請求項10】

前記キットが、さらにオリゴヌクレオチドレポータープローブを含み、前記オリゴヌクレオチドレポータープローブが配列番号７０−７３のオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項９に記載のキット。

【請求項11】

前記オリゴヌクレオチドレポータープローブがさらに検出可能部分を含むレポータープローブであって、
前記検出可能部分は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシサクシニミジル１−ピレン酪酸（ＰＹＢ）、ＦＩＴＣ／エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ＦＩＴＣ／ローダミンＸ、ＦＩＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン、ローダミン、フルオレセイン、³²Ｐ、³⁵Ｓ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ジゴキシゲニン、ビオチンおよび２，４−ジニトロフェニルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢウイルス由来の核酸プライマーおよびプローブ、ならびにインフルエンザＡまたはインフルエンザＢの核酸のいずれかに特異的にハイブリダイズする核酸を使用するインフルエンザの特異的検出方法に関する。開示されるオリゴヌクレオチドおよび方法は、さまざまな増幅およびハイブリダイゼーション反応においてインフルエンザＡおよびインフルエンザＢの標的の検出に有用である。オリゴヌクレオチド配列は、インフルエンザＡまたはインフルエンザＢ核酸への特異的ハイブリダイゼーションを介してインフルエンザＡ株とインフルエンザＢ株とを区別でき、検体中のインフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢの存在の特異的検出を可能にする。

【背景技術】

【0002】

Ａ属、Ｂ属およびＣ属の３種のインフルエンザの属が知られている。インフルエンザは、ミクソウイルスと称されるウイルスのファミリー、より詳細にはオルソミクソウイルスに属する。このファミリーは、「トゴト様」ウイルスも含む。オルソミクソウイルスは脊椎動物に感染する。このファミリーのウイルス病原体は、直鎖、ネガティブセンス、一本鎖ＲＮＡの７から８セグメントを含有するゲノムを有する（図２を参照）。インフルエンザウイルスのゲノムは、長さが１２０００から１５０００ヌクレオチドである。

【0003】

Ａ型およびＢ型インフルエンザは、宿主細胞に結合する表面抗原ヘマグルチニン（Ｈ）、および感染細胞から出芽するウイルスを切断するノイラミニダーゼ（Ｎ）に基づいて区別可能である。インフルエンザＡは、ウイルスがコードするヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質に基づいて、それぞれサブタイプＨ１からＨ１６およびＮ１からＮ９にさらに分類できる。インフルエンザＢウイルスは、サブタイプにさらに分類されない。インフルエンザウイルスゲノムは、絶え間なく変異し、新たな抗原変異体の頻繁な出現を生じ、季節的流行を引き起こす。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許第５５４７８６１号明細書

【特許文献2】米国特許第６６５６６８０号明細書

【特許文献3】米国特許第６７４３５８２号明細書

【特許文献4】米国特許第６３１６２００号明細書

【特許文献5】米国特許第５９２８８６９号明細書

【特許文献6】米国特許第５６４８２１１号明細書

【特許文献7】米国特許第５７４４３１１号明細書

【特許文献8】米国特許第５４５５１６６号明細書

【特許文献9】米国特許第５２７０１８４号明細書

【特許文献10】欧州特許第０６８４３１５号明細書

【特許文献11】米国特許第５６９１１４５号明細書

【特許文献12】米国特許第５８４６７２６号明細書

【特許文献13】米国特許第５９１９６３０号明細書

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Spargo, C. A. et al., Molecular and Cellular Probes, 10:247-256, 1996

【非特許文献2】Nadeau, J. G. et al., Analytical Biochemistry, 276:177-187, 1999

【非特許文献3】Nycz, C.M. et al., Analytical Biochemistry, 259:226-234, 1998

【非特許文献4】Hellyer, T.J. et al., Journal of Clinical Microbiology, 37: 518-523, 1999

【非特許文献5】Walker, G. T. et al., Nucleic Acids Research, 20:1691-1696, 1992

【非特許文献6】Mehrpouyan, M. et al., Molecular and Cellular Probes, 11:337-347, 1997

【非特許文献7】Little, M. C. et al., Clinical Chemistry, 45:777-784, 1999

【非特許文献8】Wang, Sha-Sha et al., Clinical Chemistry, 49:1599-1607, 2003

【非特許文献9】Cha, R.S. and Thilly, W.G., 1995, "Specificity, Efficiency, and Fidelity of PCR," PCR Primer: A Laboratory Manual., at pp. 37-62, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY

【非特許文献10】Roux, K., Id. at pp. 37-62

【非特許文献11】Bustin, S.A. and Nolan, T., 2004, "Basic RT-PCR Considerations," A-Z of Quantitative PCR, at pp. 359-395, International University Line, La Jolla, CA

【非特許文献12】Altshuler, M. L., 2006, PCR Troubleshooting: The Essential Guide, Caister Academic Press, Norfolk, UK

【非特許文献13】Tyagi and Kramer, Nature Biotech., 14:303-308, 1996

【非特許文献14】Walker et al. Nucleic Acids Research, 20:1691-1696, 1998

【非特許文献15】Higgins et al., CABIOS, 5(2):151-153, 1989

【非特許文献16】Hellyer TJ. & Gillespie SH (ed), "Antibiotic Resistance methods and Protocols," Humana, Totowa, NJ, pp. 141-155, 2000

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

開示されるオリゴヌクレオチドおよび方法は、さまざまな増幅およびハイブリダイゼーション反応におけるインフルエンザＡおよびインフルエンザＢの核酸標的の検出に有用である。本発明は既に周知の技術（免疫学的方法および培養に基づく方法）と比較して、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢを特異的に検出する、より迅速で高感度な手段を提供する。さらに本発明の核酸は、本明細書においてさらに詳細に記載するとおり種々のヌクレオチド増幅技術において有用である。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢのウイルスゲノム由来のヌクレオチドプライマーおよびプローブ、ならびにハイブリダイゼーションおよび／またはヌクレオチド増幅を介してのインフルエンザＡおよびインフルエンザＢの特異的検出方法を提供する。プライマー−標的結合配列は、さまざまな増幅および検出反応または直接ハイブリダイゼーションアッセイでインフルエンザＡおよびインフルエンザＢのゲノム配列標的を特異的に増幅し、かつ／またはそれとハイブリダイズさせるための方法において有用である。プライマー−標的結合配列は、インフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢの標的核酸の特異的検出を可能にし、インフルエンザＡおよびＢの一方もしくは両方ならびに／または他の無関係なウイルスならびに／または顕微鏡レベルの生物を含有する検体におけるインフルエンザＡもしくはインフルエンザＢの一方または両方の存在の決定を可能にする。本発明のプライマーおよびプローブを含むキットも開示され、本発明の方法の実施において有用である。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1A】鎖置換ＤＮＡ増幅（ＳＤＡ）の模式図である。Ｂ１およびＢ２は、「バンパー」プライマーを表す。Ａ１およびＡ２は、「増幅」プライマーを表す。プライマーＡ１およびＡ２は、例えばＢｓｏＢＩ制限酵素認識部位に対応するヌクレオチド配列５’−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−３’（配列番号１）である、制限酵素認識部位を含有できる。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド存在下でのＳＤＡにおいて生成される相補的ヌクレオチド配列は、制限酵素認識部位に相補的な配列を含有する。この部位がＢｓｏＢＩである場合、生成される相補的配列は５’−Ｃｓ−Ｃｓ−Ｃｓ−Ｇ−Ａ−Ｇ−３’（配列番号２）であり、「ｓ」は好ましくはホスホロチオエート結合を表す。制限酵素ＢｓｏＢＩは、認識配列の５’末端の最初と２番目のヌクレオチドとの間でヌクレオチドを切断するが、ホスホロチオエート結合によって連結したヌクレオチドの間は切断できない。（１）バンパープライマーＢ１は、Ｓ１の上流の一本鎖ＤＮＡ標的配列にハイブリダイズする。（２）Ｂ１およびＡ１の３’末端からのＤＮＡポリメラーゼ伸長は、Ａ１伸長産物の溶液中への移動を生じる。（３）Ａ２および上流Ｂ２は、移動したＡ１伸長産物にハイブリダイズする。（４）Ｂ２の３’末端からの伸長は下流Ａ２伸長産物を置換する。（５）置換されたＡ２伸長産物へのＡ１プライマーのハイブリダイゼーション。（６）ハイブリダイズしたＡ１の３’末端からの伸長は、ニック形成可能な制限部位を両端に有する二本鎖分子の形成を生じる。（７）制限酵素による未修飾ＤＮＡ鎖のニック形成および制限部位からのポリメラーゼ伸長は、両端に部分的制限酵素認識部位を有する一本鎖分子を溶液中に移動させる。次いでこれらの一本鎖分子は、図１Ｂに示すＳＤＡの指数関数期に入り、二本鎖親分子は、再生されて次の回のニック形成、伸長および置換に使用できるようになる。

【図1B】鎖置換ＤＮＡ増幅（ＳＤＡ）の模式図である。指数関数的増幅。（１）図１Ａにおいて示した連続的事象によって生成された置換された一本鎖分子は、増幅プライマーＡ１およびＡ２にハイブリダイズする。（２）増幅プライマーおよび置換された鎖の３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、二本鎖標的断片を産生し、それぞれは順に制限酵素によってニック形成可能な半修飾制限酵素認識部位に隣接する。ニック部位の３’末端からのポリメラーゼ伸長は、二本鎖断片（ニック形成可能な制限部位を含む）を再生し、同時に下流ＤＮＡ鎖を溶液中に移動させる。（３）部分的制限酵素認識部位を両端に有する置換された一本鎖分子は、ステップ（１）に戻って指数関数的増幅をもたらす。

【図1C】鎖置換ＤＮＡ増幅（ＳＤＡ）の模式図である。ユニバーサル検出を伴うＳＤＡ。（１〜３）標的特異的３’配列Ｔおよび、増幅プライマーＡ１の増幅された標的下流にハイブリダイズする５’ジェネリック（または「ユニバーサル」）尾部（アダプター配列）Ｇを含むシグナルプライマーＳ１。シグナルプライマーおよび上流増幅プライマーの両方の３’末端からのＤＮＡポリメラーゼ伸長は、次に相補的増幅プライマーＡ２にハイブリダイズするシグナルプライマー伸長産物の溶液中への移動を生じる。（４）増幅プライマーおよびシグナルプライマー伸長産物の３’末端からの伸長は、５’アダプター尾部配列の相補体および二本鎖制限認識部位を生成する。（５）制限部位のニック形成およびニックからの伸長は、シグナルプライマー相補体の一本鎖複製物を溶液中へ移動させる。（６）移動した配列は、ジェネリック配列Ｇをその３’末端に有する相補的蛍光レポータープローブにハイブリダイズする。（７）レポータープローブおよびその標的配列の３’末端からの伸長は、二本鎖制限認識配列の生成を生じる。（８）最大蛍光は、二本鎖レポータープローブ制限部位の切断による消光剤とフルオロフォアとの完全な分離によって得られる。

【図1D】鎖置換ＤＮＡ増幅（ＳＤＡ）の模式図である。標的特異的レポータープローブでの直接検出。（１）レポータープローブＲは、Ａ１の下流にハイブリダイズする。（２）Ｓ１およびＲの３’末端からのＤＮＡポリメラーゼ伸長。Ｓ１の伸長は、Ｒの下流伸長産物を、それが相補的増幅プライマーＡ２にハイブリダイズする溶液中に移動させる。（３）Ａ２の３’末端からの伸長は、二本鎖制限部位の形成を生じる。（４〜５）蛍光シグナルは、制限部位の切断およびフルオロフォアと消光剤との完全な分離によって生じる。

【図2】インフルエンザＡ（Ａ／香港／１０７３／９９、Ｈ９Ｎ２）およびＢ（Ｂ／メンフィス／１２／９７）ウイルスＲＮＡゲノムの模式図である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００４９０６−ＮＣ００４９１２およびＮＣ＿００４７８３−ＮＣ００４７９０にそれぞれ基づく（出典：ｗｗｗ．ｕｑ．ｅｄｕ．ａｕ／ｖｄｕ／ＶＤＵＩｎｆｌｕｅｎｚａ．ｈｔｍ）。

【図3】インフルエンザＡ ＲＮＡ配列（追加の５’および３’非インフルエンザ配列を含まない）に相補的な領域に対応するプライマーの位置を示す、代表的インフルエンザＡマトリックス遺伝子の部分的ヌクレオチド配列地図である。ＦＡＭ−ＦＢ＝５’バンパープライマー、ＦＡＭ−ＦＰ＝５’増幅プライマー、ＦＡＭ−ＡＤ＝インフルエンザＡのユニバーサル検出用のシグナルプライマー、ＦＡＭ−ＲＰ＝３’増幅プライマー、ＦＡＭ−ＲＢ＝３’バンパープライマー。シグナルプライマーの５’尾部の相補体（アダプター配列）にハイブリダイズするレポータープローブＭＰＣ Ｄ／Ｒは、示していない。

【図4】インフルエンザＲＮＡ配列（追加の５’および３’非インフルエンザ配列を含まない）に相補的な領域に対応するプライマーの位置を示す、インフルエンザＢマトリックス遺伝子の部分的ヌクレオチド配列地図である。ＦＢＭ−ＦＢ＝５’バンパープライマー、ＦＢＭ−ＦＰ＝５’増幅プライマー、ＦＢＭ−ＡＤ＝インフルエンザＲＮＡのユニバーサル検出用のシグナルプライマー、ＦＢＭ−ＲＰ＝３’増幅プライマー、ＦＢＭ−ＲＢ＝３’バンパープライマー。シグナルプライマーの５’尾部の相補体（アダプター配列）にハイブリダイズするレポータープローブＭＰＣ Ｄ／Ｒは、示していない。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明は、以下の例示的実施形態によって説明することができるが、必ずしもこれに限定されるものではない。本発明の任意の一実施形態は、本発明によって提供される利点をすべて示さない場合があるが、異なる実施形態は異なる利点を提供できる。本発明は、本明細書において特定の実施形態で記載されているが、本発明は本開示の精神および範囲内でさらに変更できる。したがって、本発明は、本発明の一般的原理を使用する本発明の任意の変更、使用または適応を含むことを意図する。さらに本発明は、本発明が関連する技術分野において周知または慣行の範囲であり、かつ添付の請求項の限定の範囲内であるような、本開示に対する変更を含む。

【0010】

本発明は、プライマーおよびプローブとして有用な新規オリゴヌクレオチドならびに一方もしくは両方のインフルエンザ株および／または他の無関係なウイルス／顕微鏡レベルの生物を含有する試料中のインフルエンザＡおよびＢを特異的に検出する方法を開示する。本発明は、本発明の方法の実施において有用な本発明の新規オリゴヌクレオチドを含むキットをさらに開示する。本発明のプライマーおよびプローブのヌクレオチド配列は、各株のゲノムに特有であるが、各株中の多数のウイルスにわたって保存もされているインフルエンザＡおよびインフルエンザＢのゲノムの領域に特異的にハイブリダイズするように設計される。したがって本発明の一実施形態は、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢのゲノムのこれらの分類学的に特有な領域に特異的にハイブリダイズし、したがって試料中のインフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢの存在の検出において有用であるオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーである。したがって本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書において記載するアッセイ条件下で他のインフルエンザウイルス型由来の核酸にクロスハイブリダイズしない。さらに本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書において記載するアッセイ条件下でインフルエンザに関係しないウイルス由来の核酸にクロスハイブリダイズしない。

【0011】

本発明のオリゴヌクレオチドは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）または連結介在増幅（ＬＭＡ）などの当技術分野において周知の種々の核酸増幅技術において使用できる。本発明のオリゴヌクレオチドは、増幅することなくウイルス核酸との直接ハイブリダイゼーションを介するインフルエンザＡおよびＢの直接検出のための、あるいはウイルス核酸のＤＮＡもしくはＲＮＡ複製物またはその相補体を検出するための当業者に周知のさまざまな方法においても使用できる。

【0012】

さらに本発明のキットの実施形態は、インフルエンザＡもしくはインフルエンザＢの一方または両方の株の特異的検出を可能にする本発明の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。キットは、他のインフルエンザ型または他のウイルスもしくはインフルエンザとは無関係の生物の核酸とのクロスハイブリダイゼーションによって生じる検出アッセイにおける偽陽性結果が最少となり、好ましくは無くなるようなインフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢの特異的検出を可能にする。

【0013】

さらなる実施形態において本発明のオリゴヌクレオチドは、試料中にインフルエンザＡだけが存在するのかどうかを決定するための種々の増幅および／またはハイブリダイゼーション検出反応のいずれにおいても利用できる。増幅および／またはハイブリダイゼーション技術を介してインフルエンザＡだけの特異的検出を提供するキットも開示される。

【0014】

さらなる実施形態において本発明のオリゴヌクレオチドは、試料中にインフルエンザＢだけが存在するのかどうかを決定するために述べられた種々の増幅および／または検出反応のいずれにおいても利用できる。増幅および／またはハイブリダイゼーション技術を介してインフルエンザＢだけの特異的検出を提供するキットも開示される。

【0015】

核酸材料が検査される検体は、それだけに限らないが、鼻咽頭、鼻および喉の拭き取り検体ならびに鼻咽頭吸引物および洗浄物などの任意の生物学的検体であってもよい。検体は、より効率的なウイルス核酸の検出を可能にするために検査に先だって予備処理（いくつかの予備処理手順は周知である）を受けてもよい。例えば試料は、ウイルスを安定化するために輸送培地に回収および添加することができる。鼻咽頭、鼻および喉の拭き取り検体は、好ましくは輸送培地に入れられる。鼻咽頭吸引物および洗浄物は、輸送培地の添加によって安定化されても、されなくてもよい。検査室で受領されるとウイルスは不活性化され、ウイルスＲＮＡを遊離するために溶解されてもよい。次いで核酸は、潜在的な阻害物質または後のアッセイ段階に干渉する他の物質を除くために任意選択で抽出されてもよい。本発明の方法を実施するためにウイルス核酸は、インフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢの特異的検出に必須の成分と混合されてもよい。

【0016】

本発明のオリゴヌクレオチドは、検出可能部分を含むオリゴヌクレオチドも含む。例えば、本発明において有用な検出可能部分として、それだけに限らないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシサクシニミジル１−ピレン酪酸（ＰＹＢ）、ＦＩＴＣ／エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ＦＩＴＣ／ローダミンＸ、ＦＩＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）などの供与体−消光剤色素対を挙げることができる。Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は、フルオレセイン、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレンまたはローダミンなどの隣接するフルオロフォア由来の蛍光を効果的に消光する非蛍光消光色素である。他の好ましいオリゴヌクレオチド標識として、それだけに限らないが、フルオレセインおよびローダミンなどの単一フルオロフォア、³²Ｐおよび³⁵Ｓなどの放射性標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼまたはルシフェラーゼなどの酵素ならびにジゴキシゲニン、ビオチンおよび２，４−ジニトロフェニルなどのハプテンが挙げられる。

【0017】

本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜２４および２７〜７７ならびに、アッセイ条件下で配列番号３〜２４および２７〜７７の相補体である配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。アッセイ条件には、例えば、５２．５℃で実施されるｔＳＤＡ反応に使用されるもの：１４３ｍＭビシン、８２ｍＭ ＫＯＨ、２４．５ｍＭ ＫＰＯ₄、１２．５％ＤＭＳＯ、１．６７％グリセロール、１００ｎｇ／μｌ ＢＳＡ、２ｎｇ／μｌ酵母ＲＮＡ、１００ｎＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５００ｎＭ ｄＣｓＴＰおよび６．７ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。

【0018】

本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１９〜２４および２７〜７７などの標的結合配列を含む。これらの配列は、Ａ型またはＢ型インフルエンザのいずれかにおいて高度に保存されているインフルエンザＡおよびＢマトリックス遺伝子配列に対応する。例えば配列番号１９、２０、２３および２４はインフルエンザＡ型において高度に保存されている。配列番号１９のヌクレオチド配列は、図３で示されるとおり、配列番号２５として提供されるインフルエンザＡマトリックス遺伝子のヌクレオチド１１９〜１３３に対応する。さらに配列番号２０の標的結合配列は、ヌクレオチド１個が変更されていること以外は配列番号１９と同じである。したがって本質的にこれらの配列からなるプライマーは、配列番号２５の同じ領域に相補的な配列にハイブリダイズする。さらに配列番号２３は、配列番号２５のヌクレオチド位置１１７〜１３１に対応し、配列番号２４は、配列番号２５のヌクレオチド位置１５９〜１７３に対応する。インフルエンザＡマトリックス遺伝子内のこれらの標的結合領域は、配列番号２５中あるいは任意のインフルエンザＡマトリックス遺伝子内のこの配列に対応する領域の５’もしくは３’方向の一方または両方向での１２個ものヌクレオチドによって調整できることならびに本発明と同じ結果が達成できることが予想される。配列番号２６のヌクレオチド位置２２〜３７および９２〜１０６に対応するインフルエンザＢ標的結合配列、配列番号２１および２２に関して、これらの領域に特異的にハイブリダイズするように設計された本発明のオリゴヌクレオチドは、長さ１２個までのヌクレオチドまたは配列番号２６中あるいは任意の対応するインフルエンザＢマトリックス遺伝子内のこの配列に対応する領域の５’もしくは３’方向の一方または両方向のいずれかの位置によって調整できること、ならびにインフルエンザＢ型にハイブリダイズするのに同じ特異性が達成できることが予想される。

【0019】

さらに下記の表１に列挙する、標的結合配列ＣＴＴＴＣＣＣＡＣＣＧＡＡＣＣ（配列番号２１）に対応する下線付き部分を有する、３’増幅プライマーに対応する例えば配列番号９などのこれらの標的結合配列を含む本発明のオリゴヌクレオチドは、同様に、この下線付き部分の５’もしくは３’方向の一方またはその両方への伸長または移動によって、いずれかの方向に１２個までの追加のヌクレオチドを含むように変更されるこの標的結合配列に対応する配列を有することができる。これは、配列番号７〜１０に対応するオリゴヌクレオチドなどの本発明の標的結合配列を含む任意のオリゴヌクレオチドに応用される。

【0020】

本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明による方法において使用できるバンパープライマーも含む。配列番号３による配列から本質的になるバンパープライマーは、５’バンパープライマーの例であり、インフルエンザＡの存在を特異的に検出する検出方法において使用でき、インフルエンザＡマトリックス遺伝子（配列番号２５）のヌクレオチド４９〜６５に対応する。本明細書において例として開示する他のバンパープライマーは、インフルエンザＡマトリックス遺伝子（配列番号２５）のヌクレオチド１９０〜２０６に対応する配列番号４、インフルエンザＢマトリックス遺伝子（配列番号２６）のヌクレオチド２〜１８に対応する配列番号５およびインフルエンザＢマトリックス遺伝子（配列番号２６）のヌクレオチド１７０〜１８７に対応する配列番号６を含む。上で考察した標的結合配列および増幅プライマーと同様に、これらのバンパープライマーのそれぞれが、約１２個またはそれ以上のヌクレオチドによって５’もしくは３’方向の一方またはその両方で調整でき、所望の方法の結果を達成するために、すなわちインフルエンザＡもしくはインフルエンザＢの一方またはその両方の存在を特異的に検出するために依然として機能することが予想される。

【0021】

すなわち、例えばインフルエンザＡ型についての配列番号１９、２０、２３および２４ならびにインフルエンザＢ型についての２１および２２による、インフルエンザＡまたはインフルエンザＢのマトリックス遺伝子配列のいずれかに特異的にハイブリダイズするように設計された本発明のオリゴヌクレオチドは、位置および長さについて調整されてもよく、かつインフルエンザＡまたはインフルエンザＢのマトリックス遺伝子への特異的ハイブリダイゼーションを依然として達成することが予想される。本発明のオリゴヌクレオチドは、そのような変更されたオリゴヌクレオチドを使用しても特異性が獲得できることを当業者が周知であるこれらの変異体を包含する。

【0022】

本発明のオリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーションおよび／または増幅は、好熱性ＳＤＡ、中温性ＳＤＡおよびＰＣＲ条件を使用して広範囲の化学的および熱的条件にわたって達成できる。好熱性ＳＤＡがＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列にハイブリダイズおよび増幅するために使用されているいくつかの例が報告されている。（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３および非特許文献４を参照）。

【0023】

中温性ＳＤＡを使用するハイブリダイゼーションおよび／または増幅のための反応条件を記載する例も報告されている。中温性ＳＤＡは、増幅プライマーおよびレポータープローブ内の５’（非ハイブリダイゼーション領域）配列の改変、および好熱性ＳＤＡと比較して低い温度で最適に機能する例えばＡｖａＩなどの別の制限酵素の使用、ならびに所望の範囲内に至適温度を有するポリメラーゼ酵素（例えばおよそ３５〜４２℃の間の温度に対するエキソクレノウポリメラーゼ）の使用を必要とする。別の制限酵素の使用はまた、例えばＨｉｎｃＩＩ制限酵素での中温性ＳＤＡは、好熱性ＢｓｏＢＩに基づくアッセイ系で使用されるｄＣｓＴＰの代わりにチオエート−ｄＡＴＰの使用を必要とするなどの別の修飾ヌクレオチドの取り込みを必要とする。（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７および非特許文献８を参照）。

【0024】

本発明のオリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズし、かつ／またはそれを増幅するための広範囲のＰＣＲ条件においても使用できる。そのような条件は、ＰＣＲ条件の設計および標的配列のハイブリダイゼーションおよび／または増幅を最適化するために使用できるトラブルシューティング技術に関して既に報告されている。（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１および非特許文献１２を参照）。

【0025】

当業者は、核酸がハイブリダイズするために完全な相補性を必要としないことを既知である。したがって本明細書において開示するプローブおよびプライマー配列は、インフルエンザマトリックス遺伝子特異的プローブおよびプライマーとしての有用性を失うことなく改変できる。当業者は、１００％相補的ではない相補体および核酸配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェンシーを高めるまたは低めるハイブリダイゼーション条件の調整によって得られることも既知である。それに反する記載が無ければ、開示される配列のそのような小さな変更およびインフルエンザウイルスの特異性を維持するために必要な任意のハイブリダイゼーション条件の調整は、本発明の範囲内の変更であると考えられる。

【0026】

例えばＳＤＡ反応において使用できる本発明の一実施形態のオリゴヌクレオチドは、表１に示されるとおりである。インフルエンザＲＮＡ配列に相補的な領域に下線を付け、制限酵素認識部位（例えばＢｓｏＢＩ）をイタリック体にする。インフルエンザシグナルプライマーと対比して内部標準シグナルプライマーに作製した意図的変異を太字にし、それは、標的配列の増幅を模倣し、かつ同じ増幅プライマーおよびバンパープライマーを使用するようにアッセイに任意選択で添加される内部核酸にハイブリダイズするように設計される。

【0027】

【表1】

【0028】

一実施形態において本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１９〜２４の中から選択される配列からなってもよく、さらに特に制限酵素認識部位（ＲＥＲＳ）などの追加のヌクレオチドを含むことができる。本発明の一実施形態においてＲＥＲＳは、ＢｓｏＢＩ部位である。本発明において有用である他の制限酵素部位として、それだけに限らないが例えばＨｉｎｃＩＩ、ＡｖａＩ（ＢｓｏＢＩのイソ制限酵素）、ＮｃｉＩおよびＦｎｕ４ＨＩが挙げられる。

【0029】

他の実施形態において本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜２４および２７〜７７のヌクレオチド配列を有する１つまたは複数のポリヌクレオチドからなるか、または本質的にそれからなることができる。さらに他の実施形態において配列番号３〜２４による核酸配列を有するオリゴヌクレオチドは、試料中にインフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢが存在するかどうかを決定するためのＳＤＡ反応において使用できる。（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４において開示のＮａｄｅａｕらの方法を参照。）ＳＤＡは、図１Ａおよび１Ｂに模式的に表されている。例えば開示のプライマーおよびプローブは、特許文献１に記載されているシグナルプライマー反応と同様のやり方でＳＤＡにおいて使用できる。

【0030】

本質的に、３’標的結合配列および非相補性５’尾部を有するシグナルプライマー（Ｓ１）は、増幅プライマー（Ａ１）より下流から標的配列にハイブリダイズする（図１Ｃ、ステップ（１））。図１Ｃに表すとおり、シグナルプライマーのハイブリダイゼーション部位全体は、増幅プライマーのハイブリダイゼーション部位より下流である。しかし標的上のシグナルプライマーおよび増幅プライマーのハイブリダイゼーション部位は、本発明の方法に顕著に影響することなく部分的に（典型的にはいくつかのヌクレオチドだけで、好ましくは約１から約１２ヌクレオチド）重なってもよい。本明細書において使用する用語「より下流」は、標的上のシグナルプライマーおよび増幅プライマーのハイブリダイゼーション部位に関して、一般的には標的中の重なっていないおよび部分的に重なっている配列を包含する。

【0031】

図１Ｃのステップ（２）において増幅プライマーおよびシグナルプライマーは、ポリメラーゼ反応によって同時に伸長される。増幅プライマーの伸長は、一本鎖シグナルプライマー伸長産物を置換する（図１Ｃ、ステップ（２））。第３のステップにおいて、第２の増幅プライマー（Ａ２）は、シグナルプライマー伸長産物にハイブリダイズする（図１Ｃ、ステップ（３））。ステップ（４）は、一方の端に半修飾ＲＥＲＳを有する二本鎖の第２の増幅産物を産生するための増幅プライマーおよびシグナルプライマー伸長産物の伸長をもたらす（図１Ｃ、ステップ（４））。ＲＥＲＳの未修飾Ｓ２鎖のニック形成、ニックからの伸長および下流鎖の置換は、シグナルプライマーの相補体を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを産生し（図１Ｃ、ステップ（５））、それは次にレポータープローブの３’尾部にハイブリダイズする（図１Ｃ、ステップ（６））。レポータープローブおよびシグナルプライマー相補体の３’末端からの伸長は、二本鎖制限部位の形成を生じる（図１Ｃ、ステップ（７））。蛍光シグナルは、制限部位の二本鎖の切断およびフルオロフォアと消光剤部分との分離を介して生じる（図１Ｃ、ステップ（８））。シグナルプライマーの相補体および二本鎖の第２の増幅産物は、標的が存在し、かつ増幅される場合にだけ産生される。したがってこれらのオリゴヌクレオチドは、標的増幅の指標として検出できる。

【0032】

図１Ｃに示す検出方法により、二本鎖の第２の増幅産物は検出できる。しかしこれは、検出方法のこの一形式のいくつかの可能な実施形態のうち１つの例示を意味するに過ぎない。本発明のオリゴヌクレオチドが有用であってもよい多数のさまざまな可能な検出方法がある。

【0033】

例えば図１Ｂにより示される方法の他の実施形態において、ステップ（３）の一本鎖オリゴヌクレオチドは、レポーター分子へのハイブリダイゼーションによって直接検出できる（図１Ｄ）。

【0034】

図１によって示される方法のさらなる実施形態において、典型的には色素である供与体／消光剤の対で標識されたヘアピンレポーター検出可能部分は、供与体蛍光がＳＤＡ反応において消光されるように利用できる（例えば特許文献５を参照）。検出可能部分が検出されるために完全に二本鎖となるようにする必要がなくてもよいことは、当業者に理解される。例えばヘアピン構造の部分的な相補体は、ヘアピンの基部の腕を相互にハイブリダイズさせないために十分であることができる。

【0035】

本明細書において使用する「二本鎖レポーター部分」は、それらがレポーター部分を検出可能にするために十分に二本鎖であるとの条件で、完全におよび部分的にの両方での二本鎖のレポーター部分を包含することを意味する。レポーター部分がプライマー伸長反応において二本鎖にされる場合、ヘアピンは、アンフォールドされる。アンフォールディングにおいて、供与体および消光剤は、消光剤による供与体蛍光の消光が低減または除去されるように空間的に十分に分離される。結果として得られる供与体蛍光での増大または蛍光の消光における変化に伴う他の蛍光パラメーターにおける変化（例えば蛍光寿命、蛍光偏光または消光剤／受容体の発光における変化など）は、標的配列の増幅の指標として検出できる。

【0036】

加えて、複数の検出可能なレポーター部分は、単一のレポータープローブ内に組み合わせることができる。例えば標識されたヘアピンは、一本鎖「ループ」中に一本鎖ＲＥＲＳを含むことができる。この実施形態においてレポーター部分の相補体の合成は、蛍光の増大をもたらすためにヘアピンをアンフォールドするだけでなく、同時にＲＥＲＳを切断可能またはニック形成可能にし、追加の蛍光の増大をもたらすことができる。

【0037】

他の実施形態においてレポータープローブの折りたたまれた検出可能なレポーター部分（例えばヘアピン）は、アダプター配列の相補体にハイブリダイズしない。しかし選択的実施形態においてアダプター配列は、その相補配列がレポータープローブの折りたたまれたレポーター部分の全体または一部にハイブリダイズするように選択できる。この実施形態においてハイブリダイゼーションは単独で、ハイブリダイゼーション後のポリメラーゼ触媒伸長の必要なくシグナルを産生するためにレポーター部分をアンフォールドするかまたは部分的にアンフォールドする。この実施形態における折りたたまれた検出可能なレポーター部分は、レポータープローブの配列の全体または一部を含むことができる。そのような実施形態の一例においてレポータープローブは、分子ビーコン、ビーコンヘアピンのループがアダプター配列の全体または一部を含むヘアピンオリゴヌクレオチドであってもよい。（例えば非特許文献１３を参照）。アダプター配列の相補体が標的の増幅中に合成される際に、それは分子ビーコンに結合し、構造をアンフォールドし、蛍光の増大を生じる。

【0038】

特許文献６および特許文献７に記載の好熱性鎖置換アッセイは、本発明の核酸を使用して実施することもできる。使用される酵素が熱不安定性（すなわち温度感受性）であることから、Ｗａｌｋｅｒら（非特許文献１４）によって記載のとおり従来の中温性ＳＤＡは、約３７℃から４２℃の間の一定の温度で実施される。増幅反応を進める酵素は、反応温度が上昇すると不活性化される。しかし、制限酵素ＢｓｏＢＩおよびＢｓｔＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性酵素を使用して高温で等温性ＳＤＡを実施する能力は、いくつかの有利点を有する。例えば高い温度での増幅は、増幅プライマーと鋳型ＤＮＡとの間のよりストリンジェントなアニーリングを可能にし、したがって増幅工程の特異性を改善し、バックグラウンド反応を低下させる可能性がある。バックグラウンド反応の重要な原因は、増幅プライマーが互いに相互作用する際に生成される短い「プライマー二量体」であり、律速薬剤の消費を介して標的配列の所望の増幅の効率を損なう。そのようなプライマー二量体の形成は、反応のストリンジェンシーの低下が、限定的な相同性を有する配列間の一過的ハイブリダイゼーションの可能性を増大させることから低温でより生じやすい。高温でＳＤＡを実施する能力は、プライマー二量体相互作用の可能性を低下させ、バックグラウンド増幅を抑制し、かつ特異的標的の増幅効率を改善する。加えて、５０℃から７０℃の範囲の高温での増幅は、ポリメラーゼによる鎖置換を促進する可能性があり、次いで標的増幅の効率を増大させ、増幅産物の収率の増加をもたらす。

【0039】

したがって本発明のいくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、熱安定性酵素の使用に適切な条件下でその目的の標的にアニールする。少なくとも特異的標的結合配列に関して、アニーリングは、温度約５０℃から約７０℃で約５０から約５００ｍＭアルカリ金属イオン（通常カリウムイオン）、好ましくは約１００から２００ｍＭアルカリ金属イオンの溶液中、または同等の溶液条件においてインフルエンザＡ特異的オリゴヌクレオチドが、インフルエンザＡ核酸にアニールするがインフルエンザＢ核酸、インフルエンザＣ核酸またはインフルエンザではない核酸にはアニールしない程度には特異的であると考えられる。

【0040】

本発明の方法の他の実施形態においてレポータープローブは、一本鎖配列と折りたたまれたレポーター部分の全体または一部との両方が増幅中に産生されると共にアダプター配列に相補的な配列にハイブリダイズするように、一本鎖配列の３’から折りたたまれたレポーター部分を含んで設計できる。

【0041】

他の代替の実施形態において他のレポーター部分は、図１に示す反応スキームにおいて置換できる。例えば、Ｇ−カルテットなどの他の折りたたまれた核酸構造は、蛍光の消光を低下させるために同様の標的依存的方法で置換およびアンフォールドできる。別法として、特殊化した直鎖配列を例えばＲＥＲＳであるレポーター部分として図１Ｃに示すとおり使用できる。ＲＥＲＳをレポーター部分として使用する場合、供与体および消光剤は、ＲＥＲＳが二重鎖になり、かつ標的依存的方法において切断される際に供与体および消光剤が別々の核酸断片に分離されるように、切断部位に隣接して連結される。これらの代替構造は、ＧカルテットにおけるＲＥＲＳなどの特殊化した配列と組み合わせることもできる。ＲＥＲＳは、二重鎖形態において切断可能であるよりも代替としてニック形成可能にできる。修飾ヌクレオチドの取り込みおよびニック形成可能なＲＥＲＳの産生がＳＤＡ法での増幅反応に不可欠な部分であることから、これは、ＳＤＡにおける使用のために特に適切な実施形態である。

【0042】

これらの実施形態は、本発明のオリゴヌクレオチドを利用する無数の異なる検出方法の変更法に過ぎず、インフルエンザゲノムの特異的検出および／または増幅のために当業者に利用可能である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）または連結介在増幅（ＬＭＡ）の標準的方法のさらなる変更法も、増幅または直接ハイブリダイゼーションによる他の検出方法と同様に利用できる。

【0043】

例えば、配列番号２７〜７７のヌクレオチド配列の１つまたは複数からなるか、または本質的になるオリゴヌクレオチドは、インフルエンザＡ ＤＮＡもしくはインフルエンザＢ ＤＮＡの一方またはその両方を、２種のウイルスもしくは１種だけのウイルスまたはウイルスを含まない（対照として）混合物を含有する試料中において特異的に増幅するために設計されたＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用できる。これらのオリゴヌクレオチドに加えて、縮重部位にキサンチンおよび／またはイノシンなどの類似物を含むオリゴヌクレオチドも使用できる。そのような実施形態は、標準的ＰＣＲ技術を使用して試料中のこれらのウイルスの高感度かつ特異的な検出を可能にする。

【0044】

他の実施形態においてインフルエンザＡおよびインフルエンザＢは、単一の多重反応において検出される。例えばインフルエンザＡおよびＢは、各生物に特異的な増幅およびシグナルプライマーを使用して同じＳＤＡ反応において検出できる。例えばさまざまな色素で標識したレポータープローブは、次いで同じ反応容器中の２つの異なる種由来の増幅産物の検出および識別を可能にする。

【0045】

さらに他の実施形態において内部増幅対照が同じ反応物中に、すなわち三重反応物で、内部増幅対照の検出がアッセイの性能を確認するために使用できるように含まれる。特異的分析物（すなわちインフルエンザＡおよびＢ）のいずれかが無い場合に増幅対照の検出は、条件が反応の成功のために適切であったことを確認するために役立つ。

【0046】

他の実施形態においてインフルエンザＡおよびＢの検出は、例えば、コロナウイルス類（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）（例えば重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルスを含む）、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）１、２、３および４、呼吸器多核体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス類（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス類（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス類（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス類（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、ノロウイルス類（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス類（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）およびエンテロウイルス類（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）などの他のウイルス性の呼吸器および／または非呼吸器分析物の検出のためのプライマーおよびプローブも含有する反応混合物中で実施できる。

【0047】

さらなる実施形態においてインフルエンザＡおよびＢの検出は、それだけに限らないが、レジオネラ菌種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、連鎖球菌菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、マイコプラズマ菌種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、クラミジア菌種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）、ボルデテラ菌種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ．）、肺炎連鎖球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、クリプトコッカス菌種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、カンジダ菌種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）およびニューモシスチス菌種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．）などの呼吸器および／または非呼吸器細菌もしくは真菌分析物の検出のためのプライマーおよびプローブも含有する反応混合物において実施される。

【0048】

本発明の他の実施形態においてインフルエンザＡおよびＢの検出は、特異的捕捉プローブをコートしたマイクロアレイを使用して実施できる。さまざまなウイルス、細菌または真菌分析物のためのさまざまな捕捉プローブがアレイ表面の異なる位置に沈着される。目的の分析物から単離された核酸はマイクロアレイの表面に直接ハイブリダイズさせるか、または本明細書において既に開示のとおりＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡまたはローリングサークル型増幅などの当技術分野において周知の方法によって増幅することができる。核酸の特異的捕捉プローブへのハイブリダイゼーションは、それだけに限らないが、蛍光標識されたレポータープローブ、化学発光および電気化学の使用が挙げられる種々の異なる方法によって検出できる。これらの実施形態において本発明の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、捕捉プローブとしてまたは検出薬剤として使用できる。

【0049】

定義
インフルエンザＡおよびＢは、セグメント化したマイナス鎖ＲＮＡからなるエンベロープを有するウイルスであり、流行性の高い急性呼吸器疾患を引き起こす病原体である。インフルエンザＡおよびＢウイルスは、形態学的に識別不能である。これらのウイルスは、核タンパク質（ＮＰ）およびマトリックス（Ｍ）タンパク質における抗原性の差異に基づいて分類される。インフルエンザＡウイルスは、ウイルス表面に発現される２つの主な糖タンパク質、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの特性によってサブタイプにさらに分類される。

【0050】

「増幅プライマー」は、標的配列へのハイブリダイゼーション後のプライマーの伸長による標的配列の増幅のためのプライマーである。ＳＤＡについては、増幅プライマー（標的結合配列）の３’末端は、標的結合配列の３’末端で目的の標的にハイブリダイズする。増幅プライマーは、その５’末端付近に制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むことができる。認識部位は、例えば特許文献８、特許文献９および特許文献１０に記載されているとおり、認識部位が半修飾（「ニック形成」）されている場合にＤＮＡ二重鎖の１本の鎖を切断する制限エンドヌクレアーゼのものである。増幅反応を進めるために特殊な配列または構造は必要とされないことから、ＰＣＲ用の増幅プライマーは、標的結合配列だけからなることができる。反対に３ＳＲおよびＮＡＳＢＡのための増幅プライマーは、５’末端付近にＲＮＡポリメラーゼプロモーターをさらに含んでもよい。プロモーターは、標的結合配列に追加され、標的の複数のＲＮＡ複製物を転写させることによって増幅反応を進めるために役立つ。増幅プライマーは長さおよそ１０〜７５ヌクレオチド、好ましくは長さ約１５〜５０ヌクレオチドである。典型的には長さ約１０〜２５ヌクレオチドの近接するヌクレオチド範囲が標的にハイブリダイズし、増幅プライマーにハイブリダイゼーションの特異性を与える。

【0051】

本発明による「シグナルプライマー」は、標的中の相補的配列にハイブリダイズする３’標的結合配列を含み、さらに標的に相補的でない５’尾部配列（アダプター配列）を含む。アダプター配列は、その相補性配列が下記のレポータープローブの３’末端にハイブリダイズするように選択される。本発明のいくつかの実施形態においてシグナルプライマーは、検出可能な標識を含まない。シグナルプライマーは、典型的には長さおよそ１０〜７５ヌクレオチド、好ましくは長さ約１５〜５０ヌクレオチドである。シグナルプライマーの典型的な長さは、それが使用される方法に依存する。例えばＳＤＡのためのシグナルプライマーの長さは、典型的には約２５〜５０ヌクレオチドである。シグナルプライマーの３’末端は、標的結合配列であり、標的配列にハイブリダイズする。典型的には長さ約１０〜２５ヌクレオチドの近接するヌクレオチド範囲が標的にハイブリダイズし、シグナルプライマーにハイブリダイゼーションの特異性を与える。シグナルプライマーの特異性は、同じアッセイで使用される増幅プライマーの特異性とは異なっていてもよい。例えば増幅プライマー標的結合配列がインフルエンザＡまたはＢに特異的であってもよい一方で、シグナルプライマー標的結合配列は、インフルエンザＡおよびＢに特異的であってもよい。

【0052】

ＳＤＡ型の方法において本発明によるシグナルプライマーは、標的に相補的でない５’尾部配列、いわゆる「アダプター配列」を含んでもよい。アダプター配列は、その相補的配列がレポータープローブの３’末端にハイブリダイズし、検出可能な標識を構成できるように選択される。本発明の種々の実施形態においてアダプター配列は、その相補的配列がレポータープローブの３’末端およびレポータープローブのレポーター部分中の配列の両方に結合するように選択される。本発明のいくつかの実施形態においてシグナルプライマーは、検出可能な標識を含まない。

【0053】

プライマーの「標的結合配列」は、プライマーの標的特性を決定する部分である。すなわち標的特異的配列の必須の機能は、標的核酸に特異的に結合するまたはハイブリダイズすることである。標的結合配列の末端に特殊化した配列を必要としない増幅方法用には、増幅プライマーは一般に本質的には標的結合配列だけからなる。例えば本発明によりＰＣＲを使用する標的配列の増幅は、本質的に標的結合配列からなる増幅プライマーを使用できる。そのような場合、増幅プライマーは、フルオロフォアまたは放射性同位元素などの直接検出可能な標識、酵素、またはハプテンもしくはペプチドエピトープなどの免疫性タグで標識できる。いくつかの増幅方法は、ニック形成可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位およびＳＤＡにおける使用のための適切なプライマーの尾部、または例えば３ＳＲ、ＮＡＳＢＡもしくはＴＡＳのためのＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどの標的結合配列に付加される特殊化した配列を必要とし、必要とされる特殊化した配列は、プライマーのハイブリダイゼーション特異性を変えることなく通常のオリゴヌクレオチド調製法を使用して標的結合配列に連結できる。

【0054】

本明細書において使用する用語「プライマー」および「プローブ」は、オリゴヌクレオチドの機能を意味する。プライマーは典型的にはポリメラーゼ酵素によってまたは標的配列へのハイブリダイゼーション後の連結によって伸長される。プローブは、伸長されてもされなくてもよい。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、標的配列を捕捉または検出するために使用される場合にはプローブとして機能し、同じオリゴヌクレオチドが増幅プライマーの標識結合配列として使用される場合はプライマーとして機能できる。したがって、インフルエンザの増幅、検出または定量のために本明細書において開示される任意の標的結合配列が、検出または増幅のためにプライマー中でハイブリダイゼーションプローブとしてまたは標的結合配列としてのいずれでも使用でき、選択した増幅反応に必要とされるかまたは検出を促進するために特殊化した配列に任意選択で連結できることが理解される。

【0055】

「バンパープライマー」は、ＳＤＡなどの等温性増幅反応においてプライマー伸長産物を置換するために使用されるプライマーである。特許文献７に記載されているとおり、バンパープライマーは、バンパープライマーの伸長が下流増幅プライマーおよびその伸長産物を置換するように増幅プライマーの上流の標的配列にアニールする。本発明の他の実施形態においてバンパープライマーの伸長は、特許文献４に記載されているとおりシグナルプライマーの下流伸長産物を置換するためにも使用できる。バンパープライマーは、任意選択で標的特異的であってもよい。

【0056】

用語「標的」または「標的配列」は、増幅または検出される核酸配列を意味する。これらは、増幅される元の核酸配列、その相補体および元の配列の複製物のいずれかの鎖を含み、複製または増幅によって産生される。これらの複製物は、増幅プライマーがハイブリダイズする配列の複製物を含有していることからさらに増幅可能な標的として作用する。増幅反応中に生成された標的配列の複製物は、「増幅産物」、「アンプライマー」または「単位複製配列」と称される。本発明の内容において用語、標的または標的配列は、プライマーまたはプローブがハイブリダイズし、かつインフルエンザＡもしくはインフルエンザＢのいずれかのゲノムの一部分またはこれらのウイルスの１つ（もしくは場合により両方）の転写物またはクローンに相同性または相補性を示す特異的核酸配列を意味する。加えて標的配列は、陽性対照としてまたは定量的アッセイにおける正規化の対照として作用するためにいくつかの他の供給源にも由来できる。さらに多重形式のアッセイにおいては、インフルエンザＡでなく、インフルエンザＢでもない分析物を含んでもよい複数の分析物が試料中に存在してもよく、プライマーおよびプローブ配列はそのような追加の標的のために適切に導かれることができる。

【0057】

用語「伸長産物」は、標的配列および鋳型としてそれに隣接する配列を使用するプライマーのハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長によって産生される標的配列の複製物を意味する。

【0058】

用語「アッセイプローブ」は、核酸配列の検出または同定を促進するために使用される任意のオリゴヌクレオチドを意味する。上に記載のシグナルプライマーならびに下に記載の検出プローブ、検出プライマー、捕捉プローブおよびレポータープローブは、アッセイプローブの例である。

【0059】

用語「単位複製配列」、「増幅産物」および「アンプライマー」は、増幅プライマーの対の一方または両方の伸長を介して生成される増幅反応の産物を意味する。単位複製配列は、標的配列にハイブリダイズする２つ以上のプライマーによって生成された指数関数的に増幅された核酸を含有できる。別法として単位複製配列は、標的配列への単一プライマーのハイブリダイゼーションによる直鎖増幅によって生成できる。したがって用語単位複製配列は、本明細書において総称的に使用され、指数関数的に増幅された核酸の存在を示唆しない。

【0060】

本発明による「レポータープローブ」は、好ましくは少なくとも１つの供与体／消光剤色素の対、すなわち蛍光供与体色素および供与体フルオロフォアに対する消光剤である標識を含む。標識は、標的配列に直接ハイブリダイズしないレポータープローブ中の構造（レポーター部分）に連結される。この構造は、ヌクレオチド配列であってもよい。

【0061】

本発明の一実施形態において、レポータープローブの３’からレポーター部分の配列は、シグナルプライマーアダプター配列の相補体にハイブリダイズするように選択される。一般にこの実施形態において、レポータープローブの３’末端は、標的配列に顕著な相補性を有する配列を含まない。しかし場合によっては、レポータープローブは、アダプター相補体にハイブリダイズする配列および標的相補体の短いセグメントにハイブリダイズする他の短い配列を３’末端に含むことができる。この場合標的相補性の領域は、レポータープローブのアダプター特異的領域の同時ハイブリダイゼーション以外の顕著なハイブリダイゼーションを許容する十分な大きさではない。レポータープローブの標識は、それを二重鎖にするレポーター部分の相補体の存在の指標として検出され、したがって標的の存在または増幅を示す。

【0062】

本発明の方法により生成される相補体の存在が標的配列の存在を示すように標識できる任意の核酸配列または構造は、レポータープローブのレポーター部分として作用することができる。好ましくはレポーター部分は、供与体／消光剤色素の対で、供与体蛍光は標的の検出前は消光され、かつ供与体蛍光の消光が標的の存在の指標として低下するように標識される。レポーター部分は、例えば特許文献５に記載のステムループ（またはヘアピン）または例えば特許文献１１に記載のＧ４重鎖などのレポータープローブの５’末端の２次構造であってもよい。２次構造は、２次構造が折りたたまれる場合に供与体と消光剤とが近接近であり、供与体蛍光の消光を生じるように標識できる。標的の存在下で２次構造は、次いで標的依存的プライマー伸長反応でアンフォールドされることができ、その結果供与体と消光剤との間の距離が増大する。これが消光を減少させ、かつ標的配列の存在の指標として検出できる供与体蛍光の増大を生じる。

【0063】

別法としてレポーター部分は、消光を生じるために十分に近接近である供与体および消光剤で標識され、特許文献１２および特許文献１３に記載のとおり一本鎖ＲＥＲＳを含有するレポータープローブの５’末端の一本鎖配列であることができる。一本鎖レポータープローブにおいてＲＥＲＳは切断できない。しかし標的の存在下で一本鎖ＲＥＲＳは標的依存性プライマー伸長反応で二本鎖形態に変換され、したがって切断可能になる。適切な制限エンドヌクレアーゼでの処理は、ＲＥＲＳを２つの色素の間で切断し、それらを別々の核酸断片に分離する。色素間の距離の関連する増大は、標的配列の存在の指標として検出できる供与体蛍光の消光の減少を生じる。さらなる実施形態において、特許文献１２および特許文献１３に教示されるとおりＲＥＲＳレポーター部分は、標的依存的プライマー伸長反応でニック形成可能にできる。この実施形態においてＲＥＲＳが二本鎖にされる場合制限エンドヌクレアーゼは、供与体と消光剤とが連結する鎖にニックを入れる。ポリメラーゼはニックから伸長し、色素の内の１つに連結する一本鎖断片をレポータープローブから置換する。これも、供与体と消光剤との間の距離を増大させ、消光の減少による供与体蛍光における増大を生じる。

【0064】

レポータープローブ（例えばＴＡＱＭＡＮ（登録商標）検出、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ、Ｌｔｄ．独占的実施権者Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡを介して）のリアルタイムハイブリダイゼーションによるＰＣＲを使用する検出などのいくつかの実施形態において、レポータープローブは、単位複製配列のいずれかの鎖に存在する配列と同一である配列を含有できる。そのような実施形態においてレポータープローブは、標的配列に特異的な配列を有することができるか、またはインフルエンザウイルスのゲノムに共通の配列などの増幅された核酸のクラスに共通の配列を有することができる。後者の実施形態において特定の株などの検出の特異性は、特異的プライマー配列の使用によって得ることができる。レポータープローブの標識は、レポータープローブの相補体の存在の指標として検出され、したがって標的の存在または増幅を示す。

【0065】

本発明のＳＤＡ実施形態において、レポータープローブの３’末端は、キャップを形成してポリメラーゼによる伸長を阻止することもでき、または３’末端ヒドロキシル基の組み込みを介して伸長可能にもできる。キャップ形成は、バックグラウンドシグナルおよび、プライマー二量体の形成および他の誤刺激事象から生じる偽副反応における非生産的な薬剤の消費を低下させることによってＳＤＡ実施形態における性能を増強することができる。ポリメラーゼ酵素によるレポータープローブの３’伸長を抑制するキャップの例は、３’−ヒドロキシルのリン酸基での置換、３’−ビオチン化またはプローブの３’末端での伸長不可能に転化したヌクレオチド塩基（３’−５’連結）の組み込みを含む。

【0066】

本発明の方法によって生成される相補体の存在が標的配列の存在を示すように標識できる任意の核酸配列または構造は、レポータープローブの基礎として作用できる。

【0067】

さらなる実施形態においてＲＥＲＳレポーター部分は、例えば特許文献１２および特許文献１３において教示されるように、標的依存的プライマー伸長反応においてニック形成可能にできる。この実施形態において、ＲＥＲＳが二重鎖にされる場合制限エンドヌクレアーゼは、供与体および消光剤が連結する鎖にニックを入れる。ポリメラーゼはニックから伸長し、フルオロフォアまたは消光剤に連結する一本鎖断片をレポータープローブから置換する。これも、供与体と消光剤との間の距離を増大させ、消光の減少による蛍光シグナルの増大を生じる。

【0068】

単位複製配列の直接検出を使用する実施形態において、レポーター部分は、例えば蛍光または化学発光分子などの直接発光部分であることができる。レポーター部分は、代替として標的配列とは異なる短いヌクレオチド配列であることができ、またはレポーターが複合体形成の測定によって検出または定量されるような複合体の一員である分子であることもできる。そのような実施形態の例は、ハプテン−抗体複合体およびペプチド−アプタマー複合体を含む。

【0069】

典型的には本発明のプライマーは、好ましくは、実施例４および５に記載の反応条件下でアニーリング領域について４４℃、ＳＤＡ用の至適温度での使用のためには５２．５℃の最低融解温度（Ｔ_m）で設計される。

【実施例】

【0070】

本発明は、以下の実施例によって例示される。本明細書において説明する実施例は、単なる例示であり本発明の範囲を限定することを全く意図しない。

【実施例1】

【0071】

プライマー設計
表１に列挙されるものによって例示される本発明のプライマーおよびプローブは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ソフトウェアＶ５．０６（ＤＮＡＳｔａｒ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を使用して公表されたマトリックス遺伝子配列の配列比較によって設計する。３０３１個のインフルエンザＡおよび７１個のインフルエンザＢのマトリックス遺伝子配列をそれぞれの種の中での相同性の保存領域を同定するためにＣｌｕｓｔａｌＷ法によって配列比較した。（非特許文献１５を参照）。インフルエンザＡについては、供給源となる３種：ヒト（７サブタイプにわたる１３９２配列）、ブタ（９サブタイプにわたる１６２配列）およびトリ（９５サブタイプにわたる１４７７配列）のそれぞれについて別々の配列比較を実施し、インフルエンザＢについては単一の配列比較事象（７１配列）を実施した。これらの株は、インフルエンザＡおよびＢのＲＴ−ＳＤＡ設計それぞれにおいてすべての関連するインフルエンザ株についての増幅効率を最大化するためにインフルエンザＡおよびＢの配列比較に含めるために選択した。

【0072】

逆転写酵素−ＳＤＡ（ＲＴ−ＳＤＡ）のためのプライマーおよびプローブの配列は、インフルエンザＡおよびＢのすべての株の検出を可能にし、インフルエンザＡとインフルエンザＢとの識別を可能にするように設計される。配列比較した配列を、ＢｓｏＢＩ制限酵素を使用するＳＤＡに基づく増幅系におけるそれらの使用を妨げるＢｓｏＢＩ制限認識部位について選別する。（＋）鎖および（−）鎖ウイルスＲＮＡの両方が臨床検体中に存在してもよいことから、相補的増幅プライマーは、ＲＮＡの両方の鎖について設計され、ｃＤＮＡ合成を促進する。ＲＴ−ＳＤＡにおいて、逆転写酵素による増幅プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長は、シグナルプライマーの下流伸長産物の溶液中への移動を導き、したがって続く増幅を促進する。（非特許文献１６を参照）。

【0073】

インフルエンザＡおよびインフルエンザＢの両方について増幅プライマーは、プライマーと標的配列との間の不適正塩基対の数が最小であるようなマトリックス遺伝子の保存領域を増幅するために設計する。インフルエンザＡおよびＢの両方についてオリゴヌクレオチドプライマーは、標的配列のどの不適正塩基対もハイブリダイゼーション領域の３’末端から離れた場所であるような位置にする。したがってこれらの可能な不適正塩基対はプライマー伸長効率にわずかな影響しか有さない。加えてＳＤＡ単位複製配列の長さは、最適な増幅効率を提供するために最小化する。プライマーは、ＯＬＩＧＯ（登録商標）Ｖ６．６７ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｓｃａｄｅ ＣＯ）を使用して潜在的二量体形成について選別する。配列番号３〜１４、１７および１８として列挙して例示するプライマーは、実施例４および５に記載の反応条件下でアニーリング領域について４４℃、ＳＤＡ用の至適温度での使用のためには５２．５℃の最低融解温度（Ｔ_m）で設計される。

【実施例2】

【0074】

インフルエンザＡ標的配列のクローニング
核酸は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｌｕｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（培養番号ＶＲ−５４７）から得たインフルエンザＡウイルスストックから、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ウイルスＲＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して単離する。オリゴヌクレオチドＦＡＭ−ＢＬおよびＦＡＭ−ＲＢ（それぞれ配列番号３および４）を逆転写ＰＣＲにより１５８塩基対断片を増幅するために使用する。

【0075】

増幅したＤＮＡは、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用して大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）にクローン化する。クローン化したプラスミドＤＮＡを精製し、ＥｃｏＲＶ制限酵素での消化により直線化する。制限酵素を除くためのＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）スピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を使用する再精製に続いて、ＤＮＡは次いでＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＳＰ６キット（ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物の生成のために鋳型として使用する。簡潔にはＲＮＡポリメラーゼを、クローン化したインフルエンザ標的配列の上流のＳＰ６プロモーター部位で始まり、直線化したプラスミドの３’末端まで伸びているＤＮＡ鋳型の複数のＲＮＡ複製物を生成するために使用する。次いでＲＮＡ転写物を紫外線分光法によって定量し、担体として酵母ＲＮＡ １０ｎｇ／μｌを含有する水中に実際に使用する濃度まで希釈する。

【実施例3】

【0076】

インフルエンザＢ標的配列のクローニング
核酸は、ＡＴＣＣ（培養番号Ｂ／ＨＩＣ／５／７２）から得たインフルエンザＢウイルスストックから、ＱＩＡＡＭＰ（登録商標）ウイルスＲＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を使用して単離する。オリゴヌクレオチドＦＢＭ−ＬＢおよびＦＢＭ−ＲＢ（それぞれ配列番号５および６）を次いで逆転写ＰＣＲにより１８７塩基対断片を増幅するために使用する。

【0077】

増幅したＤＮＡを、ｐＣＲ ＩＩ−ＴＯＰＯベクターに挿入する。プラスミドＤＮＡを精製し、ＢａｍＨＩ制限酵素での消化により直線化する。次いでＤＮＡをＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）スピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を使用して再精製し、紫外線分光法によって定量する。

【0078】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を次いでＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ Ｔ７キット（ＡＭＢＩＯＮ（登録商標））を使用して、ＢａｍＨＩ消化インフルエンザＢプラスミドから生成する。ＲＮＡを紫外線分光法によって定量し、担体として酵母ＲＮＡ １０ｎｇ／μｌを含有する水中に実際に使用する濃度まで希釈する。

【実施例4】

【0079】

クローン化したインフルエンザＡおよびインフルエンザＢのＲＮＡの増幅
インフルエンザＡ
トリ骨髄芽球症ウイルス−ＲＴ（ＡＭＶ−ＲＴ）、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質およびインフルエンザＡ ＲＮＡのＲＴ−ＳＤＡに必要なすべてのオリゴヌクレオチドを含むマイクロタイタープレートウェルの予熱ステップに続いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物ＲＮＡの７５コピーを最初にｃＤＮＡにＡＭＶ−ＲＴを使用して複製し、次いで従来のＳＤＡ反応で増幅する２ステップＲＴ−ＳＤＡアッセイを実施する。１２０ｍＭビシン、２５ｍＭ ＫＯＨ、４３．５ｍＭ ＫＰＯ₄、５％グリセロール、５％ＤＭＳＯ、１５０ｎｇ／μｌ ＢＳＡ、６ｎｇ／μｌ酵母ＲＮＡ、５ｍＭ酢酸マグネシウム、３００ｎＭの以下の各ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１５００ｎＭ ｄＣｓＴＰ、３００ｎＭ増幅プライマーＦＡＭ−ＢＬ（配列番号２）、３００ｎＭ増幅プライマーＦＡＭ−ＲＢ（配列番号３）、１５００ｎＭシグナルプライマーＦＡＭ−ＬＰ（配列番号７）、３００ｎＭシグナルプライマーＦＡＭ−ＲＰ（配列番号８）、７５０ｎＭアダプタープライマーＦＡＭ−ＡＤ（配列番号１１）、７５０ｎＭアダプタープライマーＦＡＭＩＣＡ．２（配列番号１３）、９００ｎＭ標的検出ｍｐｃ．ＤＲ（配列番号１５）ならびに９００ｎＭ内部標準検出ｍｐｃ２．ＦＤ（配列番号１６）を含む緩衝液中のＡＭＶ−ＲＴ １０単位で、逆転写をマイクロタイターウェル中で実施する。

【0080】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでクローン化した内部標準転写物をインフルエンザＡ逆転写反応に１μＬあたり７．５コピーで組み込む。ｉｎ ｖｉｔｒｏでクローン化した内部標準転写物をインフルエンザＢ逆転写反応に１μＬあたり２．０コピーで組み込む。

【0081】

インフルエンザＡ内部標準分子は、実施例２に記載のインフルエンザＡ標的領域のクローンの逆ＰＣＲ部位特異的変異誘発によって構築する。外向きＰＣＲプライマーの設計は、インフルエンザＡシグナルプライマーハイブリダイゼーション領域の３’末端に７塩基の変異を組み込む。逆ＰＣＲをＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））で実施し、産物の末端を環状プラスミド分子を生成するために連結する。次いで環状プラスミド分子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に電気穿孔する。次いで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をコンフルエンスまで増殖させ、プラスミドを単離し、精製する。ＥｃｏＲ Ｖ制限酵素を使用してクローン化したプラスミドを直線化し、Ａｍｂｉｏｎ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＰ６キットを製造者の手順書に従って使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を実施し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を生成する。得られた内部増殖対照転写物は、増幅し、かつ天然のインフルエンザＡ標的ＲＮＡと同様の効率で検出できるが、２者は異なる色素で標識した特異的シグナルプライマーおよびレポータープローブを使用する同じＲＴ−ＳＤＡ反応において同時増幅すると区別できる。インフルエンザＡ内部増殖対照の検出のためにシグナルプライマーＦＡＭＩＣＡ．２（配列番号１３）およびレポータープローブｍｐｃ２．ＦＤ（配列番号１６）は、上に記載のとおり反応混合物に含まれる。

【0082】

逆転写反応物を５２℃、５分間でインキュベートし、次いで条件をＳＤＡに適するもの（１４３ｍＭビシン、８２ｍＭ ＫＯＨ、２４．５ｍＭ ＫＰＯ₄、１２．５％ＤＭＳＯ、１．６７％グリセロール）に変更するために緩衝液１００μｌを加える。ＡＭＶ−ＲＴ酵素を変性させ、プライマーの非特異的ハイブリダイゼーションを減らすためにマイクロタイタープレートウェルを速やかに７２℃に１０分間移す。反応物（１００μｌ）を次いで、最終条件を１４３ｍＭビシン、８２ｍＭ ＫＯＨ、２４．５ｍＭ ＫＰＯ₄、１２．５％ＤＭＳＯ、１．６７％グリセロール、１００ｎｇ／μｌ ＢＳＡ、２ｎｇ／μｌ酵母ＲＮＡ、１００ｎＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５００ｎＭ ｄＣｓＴＰ、６．７ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｎＭ増幅プライマーＦＡＭ−ＢＬ（配列番号３）、１００ｎＭ増幅プライマーＦＡＭ−ＲＢ（配列番号４）、５００ｎＭシグナルプライマーＦＡＭ−ＬＰ（配列番号７）、１００ｎＭシグナルプライマーＦＡＭ−ＲＰ（配列番号８）、２５０ｎＭアダプタープライマーＦＡＭ−ＡＤ（配列番号１１）、２５０ｎＭアダプタープライマーＦＡＭＩＣＡ．２（配列番号１３）、３００ｎＭ標的レポーターｍｐｃ．ＤＲ（配列番号１５）、３００ｎＭ内部標準レポーターｍｐｃ２．ＦＤ（配列番号１６）、Ｂｓｔおよそ８００単位およびＢｓｏＢＩおよそ２６５単位にするためにＢｓｔポリメラーゼおよびＢｓｏＢＩ制限酵素を含む５２℃に予熱したウェルに移す。

【0083】

反応物を密封し、５２℃で６０分間ＢＤ ＰＲＯＢＥＴＥＣ（商標）ＥＴ蛍光リーダー（ＢＥＣＴＯＮ−ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ（登録商標）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳ）中でインキュベートする。蛍光を装置での６０を超える通過（ｐａｓｓ）でモニターし、結果をＰＡＴスコア（６０−（相対蛍光シグナルが予め定めた閾値を超えるために必要な通過の数）として定義する）を単位として表す。ＰＡＴ値０を陰性と考え、０より大きいＰＡＴスコアを陽性と考える。結果を表２および４に示す。

【0084】

インフルエンザＢ
２ステップＲＴ−ＳＤＡアッセイを、インフルエンザＡについて上に記載のとおり、ＲＮＡをＡＭＶ−ＲＴを使用して最初にｃＤＮＡに複製して実施する。反応は、バンパープライマーＦＢＭ−ＬＢ（配列番号５）およびＦＢＭ−ＲＢ（配列番号６）、増幅プライマーＦＢＭ−ＬＰ（配列番号１０）およびＦＢＭ−ＲＰ（配列番号１１）ならびにシグナルプライマーＦＢＭ−ＡＤ（配列番号１２）およびＦＢＭＩＣＡ．２（配列番号１４）を対応するインフルエンザＡ特異的プライマーから替えることを除いて、本質的にインフルエンザＡについて上に開示のとおり実施する。

【0085】

インフルエンザＢ内部対照を設計およびクローニングする手法は、インフルエンザＡ ＲＴ−ＳＤＡアッセイのために採用する手法と同様である。インフルエンザＢ内部増幅対照分子は、インフルエンザＢ特異的シグナルプライマーハイブリダイゼーション領域の３’末端に対応する６塩基配列の逆ＰＣＲ変異誘発によって構築する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物は、ＡＭＢＩＯＮ ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｔ７キットを製造者による記載のとおり使用して生成する。インフルエンザＢ内部増幅対照の検出のために、シグナルプライマーＦＢＭＩＣＡ．２（配列番号１４）およびレポータープローブｍｐｃ２．ＦＤ（配列番号１６）を、反応混合物に含める。結果を表３および５に示す。

【実施例5】

【0086】

インフルエンザＡおよびＢのＲＴ−ＳＤＡアッセイの特異性
ＲＮＡは、インフルエンザＡおよびＢの培養ストックから、緩衝液ＡＷ１での最初の洗浄ステップ後にＲＮＡ分解酵素フリーＤＮＡ分解酵素Ｉ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳ）２７．３クニッツ単位を使用するカラム上でのＤＮＡ分解酵素処理を含むように改変したＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＱＩＡＡＭＰ（登録商標）ウイルスＲＮＡミニキットの手順を使用して抽出する。最初の緩衝液ＡＷ１洗浄ステップの後に１５分間の外気温でのＤＮＡ分解酵素インキュベーションを実施する。ＤＮＡ分解酵素でのインキュベーションに続いて、２回目の緩衝液ＡＷ１洗浄ステップを実施し、精製された核酸が緩衝液ＡＶＥ ８０μＬに溶出されることを除いて標準的ＱＩＡＡＭＰ（登録商標）ウイルスＲＮＡミニキットの手順を続ける。

【0087】

核酸を一般に呼吸器感染症を生じる他のウイルスおよび細菌のストックから、細菌性の種についてはＤＮＡ分解酵素処理を行わないこと（したがって２回目の緩衝液ＡＷ１洗浄ステップは無い）以外は、同様に単離する。精製した核酸は、ＲＴ−ＳＤＡインフルエンザＡおよびインフルエンザＢアッセイのそれぞれについて、逆転写の前にマイクロウェルのプレインキュベーションを実施しないこと以外は実施例４に記載したものと同様のやり方で検査する。

【0088】

インフルエンザＡおよびＢの精製ＲＮＡをそのそれぞれのアッセイにおいて、インフルエンザＡについては検査１回あたりおよそ５００ゲノム等価物で、およびインフルエンザＢについては検査１回あたり２５０ゲノム等価物で検査する。すべての他の精製核酸ストックを１反応あたりおよそ１０⁶ゲノム等価物で検査する。インフルエンザＡおよびＢのアッセイを実施例４に記載したのと同様のやり方で実施する。

【0089】

一般的結論
インフルエンザＡアッセイにおいて検査したインフルエンザＡの全ストックは、１検査あたり５００粒子で、インフルエンザＢを含むインフルエンザＡではない生物からの偽陽性シグナルを伴わずに陽性結果をもたらした。（表２〜９を参照）。同様にインフルエンザＢアッセイにおいて検査したインフルエンザＢの全ストックは、１検査あたり２５０粒子で、インフルエンザＡを含むインフルエンザＢではない生物によって引き起こされる偽陽性結果を伴わずに陽性結果をもたらした。（表２〜９を参照）。

【実施例6】

【0090】

クローン化されたインフルエンザＡおよびインフルエンザＢのＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる特異的増幅
インフルエンザＡ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡの１０、１００、５００および１０００コピーを複製して関連するｃＤＮＡを形成し、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）ＱＲＴ−ＰＣＲマスターミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して単一ステップ、均一反応で増幅するＲＴ−ＰＣＲを実施する。インフルエンザＡゲノムのマトリックス遺伝子内の標的配列を含有するＲＮＡ転写物を実施例２に記載のとおりプラスミドＤＮＡクローンから調製する。標的転写ＲＮＡの希釈物をヌクレアーゼを含まない水（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．）中で調製する。ＰＣＲプライマーおよびＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブ（配列番号２７〜７７）、逆転写酵素ミックスならびにＰＣＲマスターミックスを標的ＲＮＡ転写物と単一のＰＣＲチューブ内で合計反応物容量５０μＬで混合する。プライマーＦｌｕＡＴＭＬＰ１（例えば、配列番号２７〜３０のいずれか１つ）、プライマーＦｌｕＡＴＭＲＰ２（例えば、配列番号６５〜６８のいずれか１つ）およびＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブＦｌｕＡＴＭＰｒｏｂｅ３（例えば、配列番号４７〜６２のいずれか１つ）の最終濃度は、それぞれ２００ｎＭ、２００ｎＭおよび１００ｎＭである。逆転写酵素を含まない反応混合物を標的転写物の親プラスミドクローン由来の混入ＤＮＡの存在について管理するために含める。ＲＴ−ＰＣＲをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置で実施する。逆転写を４８℃、３０分間で実施し、その後ＰＣＲ増幅を以下の周期パラメーターで実施する：９５℃で１０分間、次いで９５℃で１５秒間および５９℃で１分間を４０サイクル。

【0091】

結果を周期閾値（Ｃｔ）；バックグラウンド補正蛍光シグナルが予め定めた閾値に交差する点で表す。Ｃｔ値を算出するために使用するアルゴリズムは、実施部分のデータ曲線のすべてが蛍光での指数関数的増加を示す増幅プロットの一部を最初に同定し、次いで所与の反復セット内でＣｔ値についての標準偏差を最小化する閾値を算出する。≧１００ＲＮＡ転写物を含有するすべて（１００％）の反応は、平均Ｃｔ値３４．３で陽性結果をもたらした。「逆転写酵素を含まない」対照の反復物で陽性結果を示したものは無かった。

【0092】

これらのデータは、開示のプライマーおよび検出プローブを使用してインフルエンザＡマトリックス遺伝子の標的配列を検出する能力を経験的に示す。

【0093】

インフルエンザＢ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡの１０、１００、５００および１０００コピーを複製してｃＤＮＡにし、ＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（商標）ＱＲＴ−ＰＣＲマスターミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して単一ステップ、均一反応で増幅したＲＴ−ＰＣＲを実施する。インフルエンザＢゲノムのマトリックス遺伝子内の標的配列を含有するＲＮＡ転写物を実施例２に記載のとおりプラスミドＤＮＡから調製する。標的転写ＲＮＡの希釈物をヌクレアーゼを含まない水（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．）中で調製する。ＰＣＲプライマー、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブ、逆転写酵素ミックスおよびＰＣＲマスターミックスを標的ＲＮＡ転写物と単一のＰＣＲチューブ内で合計反応物容量５０μＬで混合する。プライマーＦｌｕＢＴＭＬＰ１（配列番号６９）、プライマーＦｌｕＢＴＭＲＰ１（例えば、配列番号７４〜７７のいずれか１つ）およびＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブＦｌｕＢＴＭＰｒｏｂｅ３（例えば、配列番号７０〜７３のいずれか１つまたは複数）の最終濃度は、それぞれ２００ｎＭ、２００ｎＭおよび１００ｎＭである。逆転写酵素を含まない反応混合物を標的転写物の親プラスミドクローン由来の混入ＤＮＡの存在について管理するために含める。ＲＴ−ＰＣＲをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置で実施する。逆転写を４８℃、３０分間で実施し、その後ＰＣＲ増幅を以下の周期パラメーターで実施する：９５℃で１０分間、次いで９５℃で１５秒間および５９℃で１分間を４０サイクル。

【0094】

結果を周期閾値（Ｃｔ）、バックグラウンド補正蛍光シグナルが予め定めた閾値に交差する点、で表す。Ｃｔ値を算出するために使用するアルゴリズムは、実施部分のデータ曲線のすべてが蛍光で指数関数的増加を示す増幅プロットの一部を最初に同定し、次いで所与の反復セット内でＣｔ値についての標準偏差を最小化する閾値を算出する。≧１００ＲＮＡ転写物を含有するすべて（１００％）の反応は、平均Ｃｔ値３１．４で陽性結果をもたらした。「逆転写酵素を含まない」対照の４つの反復物の内の２つは、Ｃｔスコア＞３７で陽性閾値を交差し、低レベルの混入ＤＮＡの存在を示した。増幅効率を２と仮定するとこれらの結果は、これらの試料と転写ＲＮＡ複製物１００個を含有する試料との間の投入標的レベルにおけるおよそ６４倍の差異を示唆する。

【0095】

これらのデータは、開示のプライマーおよび検出プローブを使用してインフルエンザＢマトリックス遺伝子の標的配列を検出する能力を示す。

【0096】

本明細書において引用する刊行物、特許および特許出願を含むすべての参考文献は、各文献の開示が、参考により組み込まれたことが個々にかつ具体的に示され、かつその全体が本明細書において説明されたのと同程度に参考により本明細書に組み込まれる。

【0097】

【表2】

【0098】

【表3】

【0099】

【表4】

【0100】

【表5】

【0101】

【表6】

【0102】

【表7】

【0103】

【表8】

【0104】

【表9】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]