特許 5935181 創傷治癒用の生体材料およびその調製

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5935181

(24)【登録日】2016年5月20日

(45)【発行日】2016年6月15日

(54)【発明の名称】創傷治癒用の生体材料およびその調製

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/00 20060101AFI20160602BHJP

【ＦＩ】

   A61L27/00 C

   A61L27/00 V

【請求項の数】17

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2012-99204(P2012-99204)

(22)【出願日】2012年4月24日

(65)【公開番号】特開2013-226205(P2013-226205A)

(43)【公開日】2013年11月7日

【審査請求日】2015年2月10日

(73)【特許権者】

【識別番号】510137489

【氏名又は名称】カオシュン メディカル ユニヴァーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(72)【発明者】

【氏名】フイ−ミン ワン

(72)【発明者】

【氏名】メイ−リン ホー

(72)【発明者】

【氏名】グオ−ジャウ ワン

(72)【発明者】

【氏名】ジェ−ケン チャン

(72)【発明者】

【氏名】イ−タン チョウ

(72)【発明者】

【氏名】チン−イン ウー

(72)【発明者】

【氏名】ス−シン リー

【審査官】 ▲高▼岡 裕美

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５１４３１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biomaterials，27 (2006)，2951-2961

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｌ １５／００−３３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンが、コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンのうちのいずれか２つの間にエチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）を介して架橋されている、コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンからなるスキャフォールドを含む生体材料であって、
コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンの合計比率を１００％と仮定すると、前記コラーゲンの比率が３０％〜４５％であり、前記ヒアルロン酸の比率が０．１％〜５％であり、前記ゼラチンの比率が５０％〜７０％である、生体材料であって、
乾燥したスキャフォールドの２０倍以上の膨張率を有する生体材料。

【請求項2】

前記スキャフォールドが、
−（Ｘ−Ｙ−Ｚ）_ｎ−
（式中、Ｘは、ゼラチン−ゼラチン、ゼラチン−コラーゲン、またはゼラチン−ヒアルロン酸であり、Ｙは、コラーゲン−コラーゲン、コラーゲン−ゼラチン、またはコラーゲン−ヒアルロン酸であり、Ｚは、ヒアルロン酸−ゼラチン、ヒアルロン酸−コラーゲン、またはヒアルロン酸−ヒアルロン酸であり、ｎは、１または１より大きい整数である）
を有する、請求項１に記載の生体材料。

【請求項3】

多孔質の３次元生体材料である、請求項１に記載の生体材料。

【請求項4】

１０〜５００μｍの細孔径を有する、請求項１に記載の生体材料。

【請求項5】

前記細孔径が５０〜２００μｍである、請求項４に記載の生体材料。

【請求項6】

創傷治癒に用いられる、請求項１に記載の生体材料。

【請求項7】

線維芽細胞、ケラチノサイト、およびメラノサイトとともにさらに培養すると、皮膚等価物を形成する、請求項１に記載の生体材料。

【請求項8】

請求項１に記載の生体材料を調製するための方法であって、
（ａ）コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンの混合物を調製すること；
（ｂ）工程（ａ）の混合物を凍結乾燥させること；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物をＥＤＣを含む有機溶液中でインキュベートすること；
（ｄ）ＥＤＣを含む有機溶液から前記混合物を除去すること；および
（ｅ）前記混合物を凍結乾燥させて、前記生体材料を形成させること
を含む、方法。

【請求項9】

前記コラーゲンの濃度が１０〜１０００μＭであり、前記ヒアルロン酸の濃度が０．０１２５〜０．２μＭであり、前記ゼラチンの濃度が０．５〜８ｍＭである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記コラーゲンの濃度が５０〜２００μＭであり、前記ヒアルロン酸の濃度が０．０２５〜０．１μＭであり、前記ゼラチンの濃度が１〜４ｍＭである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記有機溶液が、アルカン、アルコール、ケトン、エステル、およびケテンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記有機溶液がエタノールである、請求項８に記載の方法。

【請求項13】

有機溶液中の前記ＥＤＣの濃度が５〜５００ｍＭである、請求項８に記載の方法。

【請求項14】

有機溶液中の前記ＥＤＣの濃度が１０〜２５０ｍＭである、請求項８に記載の方法。

【請求項15】

線維芽細胞のコラーゲン分泌を促進することによって創傷治癒を増進する、請求項６に記載の生体材料。

【請求項16】

前記創傷の好中球浸潤を低下させることによって創傷治癒を増進する、請求項６に記載の生体材料。

【請求項17】

前記創傷における表皮の密度を増大させることによって前記創傷治癒を増進する、請求項６に記載の生体材料。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンのうちのいずれか２つの間にエチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）を介して架橋された、コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンからなるスキャフォールドを含む生体材料に関する。本発明はまた、この生体材料を調製するための方法およびこの生体材料を用いて創傷治癒を増進するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚は、脊椎動物の体で最も大きい器官であるが、これは、血液と神経が複雑に集まった表皮と真皮から構成されており、第３の層では、皮下組織が脂質と疎性結合組織から構成されている。これら３つの層は、多くの化学的または機械的損傷から体を守るのに重要な役割を果たしている（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２３，３１０２−３１１１（２０１０））。真皮組織が大量に失われる火傷患者の創傷は、創傷拘縮および瘢痕組織形成を伴って治癒する。いくつかの実験的研究では、現在の物理的および薬理学的方法または植物療法のいずれかを用いてヒト皮膚細胞増殖を改善する新しいアプローチが扱われている（Ｄａｉｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１，６７−７６（２０１０））。抗原性または恵皮部の制限のために、皮膚置換は、皮膚回復の目的を達成することができず、しかも広くは利用されていない（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１１，１０５２−１０５４（１９８１）；Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ５１，２３１−２４４（２０００）；Ｂｏｙｃｅ，Ｂｕｒｎｓ ２７，５２３−５３３（２００１）；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４，４８３３−４８４１（２００３））。現時点で、皮膚細胞の増殖を強化することは、各年齢層にとって世界的に高額な医療行為である。この数年間に、真皮（または真皮等価物）と表皮との会合を含む、インビトロで再構築されたヒト皮膚等価物の様々なモデルが開発された（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｌａｓｔ Ｓｕｒｇ ５２，５７３−５７８（１９９９）；Ｋｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｌａｓｔ Ｓｕｒｇ ５３，４５９−４６５（２０００）；Ｈｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １０，２６４−２７１（２００１）；Ｓｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ Ｍｅｄ Ｊ １２４，７１−７６（２００６））。皮膚組織工学の１つの重要な要素は、スキャフォールドの構築である。

【0003】

コラーゲンは、特に、皮膚軟部組織中のヒト結合組織の不可欠な構成成分であり、かつ主要なコンパートメントである（Ｄｕａｎ ａｎｄ Ｓｈｅａｒｄｏｗｎ，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ａ ７５，５１０−５１８（２００５））。過去数十年間、コラーゲン多孔質スキャフォールドは、それらが細胞の浸潤、増殖および分化の支持体および鋳型として働く、皮膚、軟骨、骨および神経などの組織工学において広く用いられてきた。しかしながら、未処理のコラーゲンスキャフォールドの弱い機械的強度や速い生体分解速度は、その用途を制限する重大な問題である。その機械的強度が小さいかまたは調節できないばかりでなく、その三重らせん構造は、熱または生化学的処理で容易に変形して、ランダムコイル構造になる。コラーゲンベースのスキャフォールドの架橋は、機械的特性を最適化し、生体分解速度を調整するための効率的な方法である。

【0004】

ヒアルロン酸（ＨＡ）も皮膚の主要な構成要素であり、組織修復に関連する。それは、１．０Ｍ ｋＤａよりも大きい分子量を有し、３，０００を超える二糖反復単位を含む生体ポリマーである。このポリマーは、反復単位としての（１→３）結合で結合した交互のＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基から構成される。皮膚の組織では、この特徴が水分保持に根本的に重要である（Ｔｏｏｌｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２，８３９−８４４（１９９０））。ＨＡは、天然に存在する最も吸湿性高い分子の１つである。ＨＡは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の不可欠な構成要素の１つとなって、上皮組織、神経組織および結合組織に広く分布し、特に、細胞の分化および増殖に資する。

【0005】

さらに、変性したコラーゲンであるゼラチンは、細胞の接着、増殖、および分化のためのドメインの一部をその天然の形態として保持している（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４，２５０３−２５１１（２００３））。さらに、ゼラチンは、表面特性を修飾するのに好都合なアミン基およびカルボキシル基などの官能基を有する（Ｕｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４，１６５−１７２（２００３））。ゼラチンは、多数のグリシン残基、プロリン残基および４−ヒドロキシプロリン残基を含む。（通常、再生用の組織の特徴に一致させるために）架橋を用いて、分解速度および生体力学的特徴を調整することができるが、それは、生体適合性を損なう可能性がある（Ｚｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０，９２１−９３１（１９９９））。

【0006】

したがって、コラーゲン／ＨＡ／ゼラチンスキャフォールドの架橋処理は、生体多孔質スキャフォールドの最も重大な関心事の１つになった。現在、機械的特性を改善する際に、物理的処理と化学的手法という２種類の架橋方法が用いられることが多い（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｍａｔｅｒ Ｍｅｄ ２１，７４１−７５１（２０１０））。前者は、光酸化方法、脱水熱的方法およびＵＶ照射方法の使用を含み、潜在的な細胞毒性化学残留物の導入を回避し、かつコラーゲン材料の優れた生体適合性を維持することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｙｏｎｓｅｉ Ｍｅｄ Ｊ ４２，１７２−１７９（２００１））。しかし、物理的処理の大部分は、要求を満たすほど十分に高い架橋度を生じさせることができない。そのため、化学的方法による処理がほとんどの場合でやはり必要となる。コラーゲン／ＨＡ／ゼラチン多孔質スキャフォールドの架橋剤を選ぶに当たり、２つの様々なアミノ酸側鎖に直接結合することができる２つの異なる反応基を含むヘテロ二官能性剤が、架橋の度合いを最大化する上で興味深い（Ｐｉｅｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２１，５８１−５９３（２０００））。

【0007】

米国特許出願ＵＳ２００４／０２６７３６２号では、アンカリング部分と生体吸収性ポリマー繊維と中心部分とを含む結合組織スキャフォールドが開示された。この繊維は、コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチンなどから作ることができた。この結合組織スキャフォールドは、損傷を受けたまたは裂けた結合組織を置換または強化するためのインプラントとして有用であった。しかしながら、結合組織および皮膚を移植または置換するための生体材料の必要条件は異なる。したがって、皮膚工学用途に用いられる生体材料が今も必要とされている。

【0008】

組織工学において、細胞生物学者の１つの極めて重要な目的は、洗練された培養条件を用いて細胞増殖を刺激することであった。皮膚等価物の性能は、それらが適用される細胞増殖によって決まる。多くの最近の証拠により、皮膚に見られるケラチノサイト（ＫＣ）、メラノサイト（ＭＣ）および線維芽細胞（ＦＢ）が相互の細胞機能を達成し、かつ相互の調節に積極的に関与することが示されている（Ｒｅｇｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １０９，５１０−５１２（１９９７）；Ｂｅｒｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５８，９４３−９５３（２００１）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ３，ｅ１４１０（２００８））。例えば、メラノサイトは、紫外線放射などの外的要因によって、ならびに線維芽細胞およびケラチノサイトから分泌される内部因子によっても影響を受ける（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０，１４８６−１４８８（２００６））。さらに、いくつかのケラチノサイト由来因子は、単離されたメラノサイトの樹状突起形成を増強する（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ９２，５６５−５７２（１９８９））。興味深い研究により、メラノサイト形質膜とケラチノサイト形質膜の相互作用が、メラノソームの移動に必要とされるケラチノサイト内での一過性の細胞内カルシウムシグナルを誘導することが明らかになった（Ｓｅｉｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２５４，２５−３２（２０００）；Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２０，３８０−３８４（２００７）；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２，２７５５７−２７５６１（２００７））。線維芽細胞が、コラーゲンマトリックスの再編成か、または特定の増殖因子の産生のいずれかによって、ケラチノサイト増殖を刺激することができることも示された。これは、線維芽細胞から生じる増殖因子が、ケラチノサイトおよびメラノサイトの移動、増殖、および分化に対して重要な役割を果たすことを反映するものである（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ｂ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｍａｔｅｒ ８２，３９０−３９９（２００７））。３次元（３Ｄ）皮膚スキャフォールドは、物理的支持および宿主浸潤のための必要な鋳型としてのＥＣＭ類似体を提供し、増殖および標的とされる機能的組織または器官への細胞の移動を導く（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２３，１２０５−１２１２（２００２）；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２６７，１７８−１８１（２０１０））。使用される理想的な皮膚スキャフォールドは、優れた生体適合性、好適な微小構造（例えば、細胞増殖のための１００〜２００μｍの平均細孔径および９０％を上回る空隙率）、調節可能な生体分解性ならびに好適な機械特性という特徴を有するべきである（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４，４８３３−４８４１（２００３））。そのため、好適な皮膚材料はさらに要求水準が高い。適格性に合う生体支持体およびヒト正常皮膚を模倣するケラチノサイト、メラノサイト、および線維芽細胞の共培養物として用いられるより良好な生体材料が今なお必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンのうちのいずれか２つの間にエチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）を介して架橋された、コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンからなるスキャフォールドを含む生体材料を提供する。

【0010】

本発明はまた、生体材料を調製するための方法であって、（ａ）コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンの混合物を調製すること；（ｂ）工程（ａ）の混合物を凍結乾燥させること；（ｃ）工程（ｂ）の混合物をＥＤＣを含む有機溶液中でインキュベートすること；（ｄ）ＥＤＣを含む有機溶液から混合物を除去すること；および（ｅ）混合物を凍結乾燥させて、生体材料を形成させることを含む、方法を提供する。

【0011】

本発明はさらに、創傷治癒を増進するための方法であって、生体材料を創傷に被覆することを含む、方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1A】生体材料製造、皮膚培養およびマウス皮膚創傷治癒モデルを示す。

【図1B】ＥＤＣを介して架橋されたコラーゲン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、およびゼラチンの提案される模式的表示。

【図1C】コラーゲン／ＨＡ／ゼラチンスキャフォールドのＳＥＭ。細孔径は、１３２．５±８．４μｍであった。

【図1D】コラーゲン／ＨＡ／ゼラチンスキャフォールドのＳＥＭ。細孔径は、１３２．５±８．４μｍであった。

【図2】コラーゲン、ＨＡ、もしくはゼラチンを用いて作製したまたはＥＤＣ（５０ｍＭ）を介して架橋したスキャフォールドの膨張研究を示す（ｎ＝３）。ＥＤＣ架橋反応がないと、スキャフォールドは溶解して水になった（記号：×）。市販の材料と比較する場合、Ｄｕ（ＤｕｏＤＥＲＭ ９Ｃ５２５５２）、Ｈｙ（Ｈｙｄｒｏ Ｃｏｌｌ）、Ｔｅ（Ｔｅｇａｄｅｒｍ Ｍ１６３５）、およびＭＥ（ＭＥＤＰＯＲ（登録商標））が含まれる。

【図3A】リゾチーム（Ａ）の分解率を示す。

【図3B】ヒアルロニダーゼ（Ｂ）の分解率を示す。

【図3C】コラゲナーゼ（Ｃ）の分解率を示す。

【図4A】スキャフォールドに播種したヒト皮膚ＦＢの細胞増殖率を示す（ｎ＝４）。１〜１４日まで、増殖率をＭＴＴアッセイで観察することができた（Ａ）

【図4B】スキャフォールドに播種したヒト皮膚ＦＢの細胞増殖率を示す（ｎ＝４）。１４日間スキャフォールド中に播種したＦＢのＳＥＭ画像（Ｂ）。

【図5】スキャフォールド中で培養されたヒトＫＣ、ＭＣおよびＦＢの明視野位相、蛍光位相および合成位相での撮影画像を示す。蛍光化合物のＰＫＨ−６７（緑）を用いて、細胞を染色した。

【図6】３Ｄヒト皮膚等価物のプロトコルを示す（Ａ）。（Ｂ）明視野の顕微鏡下の３Ｄヒト皮膚等価物のパラフィン切片（４００×）。（Ｃ〜Ｅ）スキャフォールド中で１４日間培養され、ＤＡＰＩ（青）；ＫＣをマーキングするための抗サイトケラチン（緑）；ＭＣ用の抗ｓ−１００（赤）で染色されたＫＣ、ＭＣ、およびＦＢの蛍光画像。（Ｆ）合成画像は、ＫＣ、ＭＣ、およびＦＢを１つ合わせたものである。矢印は、特定の色が付いたＫＣ、ＭＣ、およびＦＢを指す。

【図7】プレート上にまたはスキャフォールドとともに播種されたＦＢから分泌されたコラーゲン量を示す。プレート上またはスキャフォールド中で、最初の７日間ＦＢを育て、その後、ＫＣおよびＭＣをさらに７日間播種した。

【図8】損傷して０、１、２、３、４、５、７および１０日後の、スキャフォールド処置した創傷（Ａ、上）および損傷創傷（Ａ、下）の治癒パターンを示す。スキャフォールドの創傷治癒効力は、全層創傷モデルで評価した。麻酔した後、外科用ナイフで雄Ｗｉｓｔａｒラットの直径２ｃｍの全層切開を作った。切開を作った後、処置群については、スキャフォールドをすぐに創傷に被覆した。損傷群については、比較のために創傷を被覆しなかった。損傷後の最初の日から、損傷群の創傷の治癒は、損傷後１０日まで、スキャフォールドで処置した創傷よりも遅かった。スケールバー＝０．５ｃｍ。（Ｂ）様々な時点でのスキャフォールドおよび損傷の創傷収縮率。決まった日に創傷面積を調べることによって、創傷面積の低下を算出した。熱傷創の表面積を方法に記載したように算出した。創傷面積は、対照と比較したとき、損傷後の最初の日からスキャフォールドの存在下で急速に減少した。対照群の創傷面積は、７日目にもとのサイズの６０％であった。このパーセンテージは、スキャフォールド群で約３日早く達成された。損傷群の創傷とスキャフォールド群の創傷の差は、１０日目で統計的に有意であった。データを平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。損傷群と比較される有意差は、Ｐ＜０．０５と定義した。^＊有意。

【図9】皮膚創傷の形態学的評価のためのヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した切片を示す。損傷１０日後に、ラットを屠殺し、創傷皮膚を４％のパラホルムアルデヒドで固定した。組織学的観察のために、皮膚をＨ＆Ｅで染色した。好中球の計数のために、各試料由来のランダムに選択した１０カ所の真皮部分を４００倍の倍率で調べた。損傷後１０日のスキャフォールド群（Ａ）、損傷群（Ｂ）および対照（Ｃ）の創傷。スキャフォールド群および損傷群の創傷は両方とも肉芽組織を有する。処置群の表皮は、損傷表皮よりも高密度であった。処置群の創傷は、損傷群と比較して好中球の浸潤が少なかった（Ｄ）。スケールバー＝２００μｍ。ＥＰ、上皮層、ＧＴ、肉芽組織。^＊対照群と比較したとき、ｐ＜０．０５。^＊＊損傷群および対照群と比較したとき、ｐ＜０．０５。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明は、コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンのうちのいずれか２つの間にエチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）を介して架橋された、コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンからなるスキャフォールドを含む生体材料を提供する。ＥＤＣは、ヘテロ二官能性のゼロ長架橋試薬である。これは、それ自体をコラーゲン、ＨＡおよびゼラチンの巨大分子内に取り込むことなく、２つのアミノ酸間に架橋を形成する。スキャフォールドは、
（化１）
−（Ｘ−Ｙ−Ｚ）_ｎ−
を有し、Ｘは、ゼラチン−ゼラチン、ゼラチン−コラーゲン、またはゼラチン−ヒアルロン酸であり、Ｙは、コラーゲン−コラーゲン、コラーゲン−ゼラチン、またはコラーゲン−ヒアルロン酸であり、Ｚは、ヒアルロン酸−ゼラチン、ヒアルロン酸−コラーゲン、またはヒアルロン酸−ヒアルロン酸であり、ｎは、１または１より大きい整数である。生体材料は、多孔質の３次元構造体である。コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンの合計比率を１００％と仮定すると、コラーゲンの比率は３０％〜４５％であり、ヒアルロン酸の比率は０．１％〜５％であり、ゼラチンの比率は５０％〜７０％である。好ましい実施形態では、生体材料の細孔径は、約１０〜５００μｍである。より好ましい実施形態では、生体材料の細孔径は、約５０〜２００μｍである。架橋剤の選択は、様々な構造の生体材料を生じさせる多孔質生体材料を調製するのに重要である。細孔径は、様々なニーズによって様々に異なり得る。生体材料の厚さも、材料の体積および重量／体積濃度のパーセンテージを制御することによって調節することができる。一実施形態では、生体材料の厚さは、ヒト皮膚の表皮層および真皮層の実際の厚さを模倣するために、平均約１ｍｍである。本発明の生体材料は、高い水分吸収力を有する。生体材料の膨張率は、乾燥したスキャフォールドの約２０倍強である。好ましい実施形態では、生体材料の膨張率は、乾燥したスキャフォールドの２５倍強である。したがって、生体材料は、その水分含有能を高める大きな多孔質層状マトリックス間隙を有する。架橋後の多孔質形態は、細胞がスキャフォールド内に接種され得る可能性を提供する。生体材料内で相互接続した細孔は、ケラチノサイト、メラノサイトおよび真皮線維芽細胞などの細胞によって放出されるサイトカインと増殖因子の相互作用の機会を提供する。

【0014】

本発明の生体材料は、線維芽細胞のコラーゲン分泌を促進する。それはさらに、創傷部位での好中球浸潤を低下させ、かつ創傷部位での表皮の密度を増大させる。したがって、本発明の生体材料はさらに、創傷治癒または人工皮膚に用いることができる。

【0015】

生体材料は優れた生体適合性を有する。生体材料はさらに、線維芽細胞、ケラチノサイト、およびメラノサイトとともに培養すると、皮膚等価物を形成する。線維芽細胞は、ケラチノサイトおよびメラノサイトの前に播種された。ケラチノサイトおよびメラノサイトは、線維芽細胞とともに生体材料上で成長し、増殖する。３次元構造は生理的環境を模倣しており、これはさらに、実験室応用および臨床的応用を含む、皮膚関連の実験に用いることができる。例えば、皮膚細胞との相互作用を研究し、その調節機構を解明するための大規模な化合物のスクリーニングを、本発明の生体材料によって形成される３次元構造により実施することができる。

【0016】

本発明はまた、本発明の生体材料を調製するための方法であって、（ａ）コラーゲン、ヒアルロン酸、およびゼラチンの混合物を調製すること；（ｂ）工程（ａ）の混合物を凍結乾燥させること；（ｃ）工程（ｂ）の混合物をＥＤＣを含む有機溶液中でインキュベートすること；（ｄ）ＥＤＣを含む有機溶液から混合物を除去すること；および（ｅ）混合物を凍結乾燥させて、生体材料を形成させることを含む、方法を提供する。工程（ａ）の混合物中のコラーゲン、ヒアルロン酸およびゼラチンの濃度は、それぞれ、約０．５〜２０００μＭ、０．００２５〜１μＭおよび０．１〜４０ｍＭである。有機溶液中のＥＤＣの濃度は約２．５〜１０００ｍＭである。本発明における有機溶液としては、限定するものではないが、以下の溶媒：アルカン、アルコール、ケトン、エステル、ケテンおよびそれらの組合せが挙げられる。

【0017】

好ましい実施形態では、コラーゲンの濃度は約１０〜１０００μＭであり、ヒアルロン酸の濃度は約０．０１２５〜０．２μＭであり、ゼラチンの濃度は約０．５〜８ｍＭである。より好ましい実施形態では、コラーゲンの濃度は約５０〜２００μＭであり、ヒアルロン酸の濃度は約０．０２５〜０．１μＭであり、ゼラチンの濃度は約１〜４ｍＭである。

【0018】

好ましい実施形態では、有機溶液中のＥＤＣの濃度は約５〜５００ｍＭである。より好ましい実施形態では、有機溶液中のＥＤＣの濃度は約１０〜２５０ｍＭである。別の好ましい実施形態では、有機溶液はエタノールである。

【0019】

本発明はさらに、創傷治癒を増進するための方法であって、本発明の生体材料を創傷に被覆することを含む、方法を提供する。生体材料は、線維芽細胞のコラーゲン分泌を促進し、創傷の好中球浸潤を低下させ、かつ創傷における表皮の密度を増大させることによって、創傷治癒を増進する。

【実施例】

【0020】

以下の実施例は非限定的なものであり、かつ本発明の様々な態様および特徴の単なる代表例である。

【実施例1】

【0021】

生体材料の調製およびその特徴の評価
コラーゲン／ＨＡ／ゼラチンスポンジ生体多孔質スキャフォールドでできた生体材料の製造
コラーゲン（カタログ番号Ｃ７７７４、ＭＷ：６４，０００）、ゼラチン（カタログ番号Ｇ９５３９、ＭＷ：５，０００）およびＮ−エチル−Ｎ’−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）（カタログ番号Ｅ１７６９）は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＨＡ（グレードＦＣＨ−２００、ＭＷ：２〜２．１ＭＤａ）は、Ｋｉｂｕｎ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から入手した。コラーゲン／ＨＡ／ゼラチンの溶液は、それぞれ、９３．７５μＭ、０．０５μＭ、および２ｍＭの最終濃度で混合したものであった。この混合溶液を６ｃｍ培養ディッシュに穏やかに入れ、−２０℃で４８時間凍結させた。この混合溶液を２４時間凍結乾燥させることにより、コラーゲン／ＨＡ／ゼラチンスポンジを構築した。

【0022】

次に、それを、５０ｍＭのＥＤＣを含む純エタノールにて２５℃で２４時間、化学的にインキュベートした。２４時間後、ＥＤＣ溶液を除去することにより反応を停止させ、蒸留Ｈ_２Ｏで数回洗浄して、未反応の化学物質（ＥＤＣ）を全て除去した。スキャフォールドをさらに４８時間凍結乾燥させ、酸化エチレンガスで滅菌した。乾燥したコラーゲン／ＨＡ／ゼラチンスキャフォールドをさらなる研究用に好適なサイズで製造した。図１は、均質相での確立された反応経路から導かれる反応に従って描かれた。

【0023】

生体材料の膨張率アッセイ
コラーゲン／ＨＡ／ゼラチン（３０ｍｇ）のスキャフォールド試料を２５℃で２４時間滅菌水に別々に浸漬させた。水から取り出した後、漬け水が見られなくなるまでスキャフォールドを吊し、その後、重量を量った。膨張したスキャフォールド内の水分吸収を以下の方程式により算出した：
（数１）
水分吸収＝（Ｗ_ｗ−Ｗ_ｄ）／Ｗ_ｄ
Ｗ_ｗは、膨張したスキャフォールドの重量であり、Ｗ_ｄは、乾燥したスキャフォールドの重量である。結果を他の４つの市販の創傷被覆材とも比較した。

【0024】

水分吸収は、生命維持に必要な栄養摂取を得るために細胞増殖にとって必要である。吸収率を図２に示した。ＥＤＣと架橋した３つの構成要素は、乾燥したスキャフォールドの約１５〜３０倍の吸収力を示し、ＨＡおよびゼラチンも同様であった。ＨＡがない場合、吸収率は１５倍にまで減少した。これは、ＨＡが高い水分吸収特性を有する重要因子であり、周知の事実と一致していたこと示す。ＨＡやゼラチンだけのスキャフォールドは高い膨張率を示したが、コラーゲンが、真皮の重要な構成要素である。したがって、スキャフォールドを製造するためにコラーゲンも取り入れた。３つの構成要素の濃度を低下させて、膨張率に対する影響を評価した。結果は、水分吸収の大きい変化を示さなかった。架橋反応がないと、スキャフォールドは水に溶解し、吸収力を測定することができなかった。比較のために４つの市販の皮膚被覆材を適用したが、その膨張率は全て１０倍未満であった。これにより、スポンジ状スキャフォールドが、その水分含有能を高める大きな多孔質層状マトリックス間隙を保持していることが明らかになった。通常、３つの構成要素は、その骨格中に負の電荷を帯びた多数のカルボン酸基を有し、親水性であった。

【0025】

リゾチーム、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼによる生体材料の分解率の評価
生体材料（ｎ＝６）の重量を正確に量り、０．０５ＭのＣａＣｌ_２を含み、１０および２０ＵのコラゲナーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）を含有する、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１ｍｌに３７℃で浸漬させた。特定の時間間隔の後、０．２５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を計０．２ｍｌ添加して、消化を終了させた。残ったスキャフォールドを滅菌水中で３回洗浄し、最後に凍結乾燥させた。生体材料分解を残存スキャフォールドの重量によって決定し、もとの重量のパーセンテージとして表した。同様のプロトコルをヒアルロニダーゼおよびリゾチームに適用した。スキャフォールド試料を３０または５０Ｕ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含有するＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に懸濁し、３７℃で１、３、５、および７日間インキュベートした。スキャフォールドをリゾチーム（１０，０００および３０，０００Ｕ／ｍｌ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて３７℃で最大２１日間インキュベートして、生体材料の分解をリゾチームにより試験した。分解期間の最後に、試料を取り除き、次の測定を行なうために洗浄した。比較解析用に生体材料の残存重量を生体材料の初期重量に対して割り算することによって、架橋していない生体材料（ｎ＝６）の分解率を算出した。

【0026】

リゾチーム、ヒアルロニダーゼ、およびコラゲナーゼを別々に用いるインビトロ分解試験によって、コラーゲン／ＨＡ／ゼラチンの生物学的安定性を試験した。図３Ａに示すように、生体材料は、７日後、３０，０００Ｕ／ｍｌのリゾチームによって完全には分解されなかった。図３Ｂでは、生体材料は、７日後、３０と５０Ｕ／ｍｌの両方のヒアルロニダーゼによって完全に分解された。生体材料は、２０Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ中で３時間インキュベートした後、完全に分解された（図３Ｃ）。

【実施例2】

【0027】

細胞は多孔質スキャフォールド内で増殖する
ヒト皮膚初代培養
ヒトケラチノサイトを包皮初代培養物から培養した。この包皮初代培養物は、台湾の高雄医学大学付属中和記念病院（Ｃｈｕｎｇ−Ｈｏ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎ）から入手したものである。ヒトケラチノサイトを、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ、カタログ番号１３０２８−０１４）、およびＥＧＦヒト組換え体（カタログ番号１０４５０−０１３）を補充したケラチノサイト−ＳＦＭ（１０７２４；ＧＩＢＣＯ（商標））中で培養した。ケラチノサイト用の培地および増殖補助因子は、γ−表皮増殖因子、ＢＰＥ、インスリン、線維芽細胞増殖因子およびカルシウム（０．０９ｍＭ）を含有していた。新生児の包皮初代ヒト表皮メラノサイト（ＨＥＭｎ−ＭＰ）をＣａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（商標）から購入し、Ｍｅｄｉｕｍ ２５４（Ｍ−２５４−５００；Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（商標））中で培養し、ヒトメラノサイト増殖補助因子（ＨＭＧＳ、カタログ番号Ｓ−００２−５）を補充した。Ｍｅｄｉｕｍ ２５４は、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、有機化合物、微量ミネラル、ならびに無機塩を含有する基本培地であった。ヒトメラノサイト増殖補助因子は、ウシ下垂体抽出物、胎仔ウシ血清、ウシインスリン、ウシトランスフェリン、塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、およびホルボール１２−ミリステート１３−アセテートを含有していた。ヒト皮膚線維芽細胞の初代培養物は、Ｃｈｉｎｇ−Ｙｉｎｇ Ｗｕ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から無償で提供されたものであった。どのタイプの細胞も、５％ＣＯ_２雰囲気の加湿インキュベーターにて３７℃でインキュベートした。

【0028】

トリパンブルーアッセイ
全ての細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１×トリプシン−ＥＤＴＡ（ＢｉｏＷｅｓｔ）でトリプシン処理し、０．５ｍｌを無菌的にＰＢＳ中に希釈し、０．５ｍｌの溶液トリパンブルー（０．４％ｗ／ｖ）を添加した。染色された細胞をパスツールピペットで試料採取し、毛細管現象によって血球計算盤に導入した。合計少なくとも５００個の細胞を計数し、青い細胞を個別に計数した。

【0029】

細胞接着率および生存率
スキャフォールドを酸化エチレンガスで滅菌し、予め湿らせて残存する酸化エチレンを排除した後、２４ウェルプレートに入れた。１００μｌの（５×１０^５細胞／１００μｌ）細胞懸濁液を、予め湿らせておいた各々のスキャフォールドの上面に載せ、スキャフォールドの中に透過させた。次に、細胞を接着させるために、細胞／スキャフォールド構築物を、５％ＣＯ_２条件下、３７℃で４時間インキュベートした。細胞が接着した後、ウェルの底の失われた細胞を除去するために、細胞／スキャフォールド構築物を新しい２４ウェルプレートに移し、細胞／スキャフォールド構築物を含む各々の新しいウェルに０．５ｍｌの培養培地を添加した。培養培地を２日毎に交換し、培養期間中、培養プレートを振盪させた。表示した全ての時間間隔で、さらなる実験解析のために、細胞／スキャフォールド構築物を回収した。

【0030】

３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）アッセイを用いて、スキャフォールド上に播種された細胞の細胞生存率および増殖率を研究した（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１，Ｒ５７（２００９））。ＭＴＳアッセイは、生細胞によって摂取され、デヒドロゲナーゼ酵素によって還元され、黄色いホルマザン産物として培養培地中に再び放出された。４９０ｎｍの吸光度で測定されるホルマザン産物の量は、培養物中の生細胞の数に正比例した。１００μｌ培地中の細胞を、製造元の指示に従って、２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ３５８２）に３時間曝露させた。分光計プレートリーダーを用いて、４９０ｎｍでの吸光度を記録した。

【0031】

スキャフォールド上の細胞の接着率を保証するために、細胞生存率を試験することにより、スキャフォールド内に播種されたヒト線維芽細胞の細胞適合性を検討した。２４ウェルプレート上に直接播種された同量の細胞と比較したとき、播種された細胞の約７５％がスキャフォールドにうまく接着することが示された（図４Ａ）。スポンジ状スキャフォールド上でのヒト線維芽細胞の生存細胞数をＭＴＳアッセイで測定した。培養物の播種後１４日で、スキャフォールド内で増殖した線維芽細胞の細胞密度は大きな増強を示し、本発明の生体材料でできたスキャフォールドが、細胞の増殖、分化および生存性の利点を有することを示した。

【0032】

多孔質スキャフォールド／生体材料の形態（ＳＥＭ画像）
多孔質スキャフォールドの形態学的な特徴を走査電子顕微鏡画像（ＳＥＭ，ＪＥＯＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて観察した。スキャフォールドを２．５％のグルタルアルデヒドを含む０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中で一晩固定し、１％の四酸化オスミウム中で１時間後固定し、エタノール（３０、５０、７５、および９９．５％）中で脱水し、臨界点乾燥させた。乾燥した試料に、スパッタコーターによって周囲温度で金をコーティングした。スキャフォールドの顕微鏡写真を適切なサイズ（１００倍、および２００倍）で撮影した。細孔径分布を０．０１μｍ〜１０００μｍの範囲でＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ３２装置によって測定した。各々のＳＥＭ写真および合計５つのＳＥＭ写真上の３０個の細孔の細孔径を測定し、その後、平均細孔径を算出した。

【0033】

ＳＥＭによって記録されたコラーゲン／ＨＡ／ゼラチンスキャフォールドの形態学的特徴を図４Ｂに示した。スキャフォールドは相互接続した高多孔質構造を見せ、線維芽細胞で処理されなかった細孔壁の表面は、滑らかで均質であるように見えた。スポンジ状スキャフォールドのＳＥＭ画像により、このスポンジ状スキャフォールドが、細孔径が１３２．５±８．４μｍの範囲の、隙間の空いた巨大な多孔質構造を有することが示された。線維芽細胞で細胞処理したスキャフォールド（１４日）について、ＳＥＭ画像を図４Ｂに示した。細胞処理したスキャフォールドの細孔壁の表面は、起伏があり、おそらく線維芽細胞によって分解されたものと思われる破砕物でできていることが特徴付けられた。

【0034】

３Ｄヒト皮膚細胞のための共培養
インビトロ細胞培養および蛍光研究
皮膚分布を検出するために、スキャフォールド内に播種する前に、細胞をＰＫＨ６７で染色した。（製造元のプロトコルに従って）細胞を５μＭのＰＫＨ−６７（選択的分配によって脂肪族化合物レポーター分子を細胞膜に取り込む緑色蛍光化合物；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに２５℃で５分間インキュベートし、３０秒毎に穏やかにボルテックス処理した。細胞を完全培地で洗浄することによって、取り込まれなかったＰＫＨ−６７を除去した。ＰＫＨ−６７標識細胞を１×１０^５／ｃｍ^２の密度でスキャフォールド表面に再プレーティングし、その後、様々な培養期間間隔で回収した。

【0035】

コラーゲン／ＨＡ／ゼラチンスキャフォールド内のヒト皮膚細胞の培養物を蛍光染色後に蛍光顕微鏡で検討した。（図５）３種類の皮膚細胞は全て、その材料が細胞増殖にとって利点があることが証明されているコラーゲン／ＨＡ／ゼラチンスキャフォールドの存在下で正常に増殖した。架橋の程度は、スキャフォールド中での多孔質構造の分布と水分含有力とに関連することが確認された。生体材料から形成されるスキャフォールドは、ヒト皮膚細胞増殖のための適切な孔径と水分吸収力を有していた。

【0036】

皮膚等価物パラフィン切片の免疫蛍光研究
５×１０^５個の線維芽細胞を事前に７日間播種しておいたスキャフォールド上に１０^６個のケラチノサイトと１０^５個のメラノサイトを播種することによって、ヒト皮膚等価物を作製した。ケラチノサイトとメラノサイトを播種した後、細胞をさらに７日間インキュベートし、培地を２日毎に交換した。共培養中、培地は、細胞の量に対して同じ比率で混合した。

【0037】

プロトコルは、若干の変更を加えて、公表されているプロトコルに従った（Ｄａｉｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１，６７−７６（２０１０）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１，６３１−６４０（２０１０））。共培養したケラチノサイト、メラノサイト、および線維芽細胞を含むスキャフォールドの標本を、ＰＢＳ中に調製した４％ホルムアルデヒドで室温にて２４時間固体した。標本をパラフィンに包埋し、切断して５μｍの切片にした。切片を脱ろうした後、ＰＢＳ中の３％Ｈ_２Ｏ_２で室温にて１５分間透過処理し、その後、線維芽細胞を１時間ブロッキングし、サイトケラチンに対する一次抗体（ケラチノサイト用）またはｓ−１００に対する一次抗体（メラノサイト用）とともにインキュベートした。その後、切片を洗浄し、ｃｙ３−コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＦＩＴＣ−コンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とともに室温で３０分間インキュベートし、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で対染色した。免疫蛍光画像を撮影した（ＴＥ３００；Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）。細胞の局在を調べるために、切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ染料）でも染色した。

【0038】

実際のヒト皮膚病をシミュレートすることができるモデルを構築するために、３Ｄヒト皮膚等価物用の共培養プロトコルを構築した（図６Ａ）。線維芽細胞を事前に７日間播種しておいたスキャフォールド上にケラチノサイトとメラノサイトを播種することによって、皮膚等価物を作製した。共培養した細胞をさらに７日間インキュベートした後、試料を上下方向に薄切し、免疫蛍光で染色し、顕微鏡下で観察した。図６Ｂでは、それは、明視野下にある皮膚等価物のパラフィン切片であった。図６Ｃでは、ＤＡＰＩで染色した細胞を示した。図６Ｄでは、ケラチノサイトは、ＦＩＴＣにコンジュゲートした抗サイトケラチンでマーキングされた。ケラチノサイトは緑色の蛍光を示した。図６Ｅでは、メラノサイトは、ｃｙ３にコンジュゲートした抗ｓ１００タンパク質で染色され、赤色を示した。図６Ｃ〜Ｅの画像を合成すると、図６Ｆが現われた。図６Ｆに示すように、メラノサイトとケラチノサイトは、上に分布し、抗サイトケラチンまたは抗ｓ１００タンパク質によってではなく、ＤＡＰＩで染色された細胞が線維芽細胞であった。

【0039】

コラーゲン量
スキャフォールド中の線維芽細胞によって合成されたコラーゲンの総量を測定するために、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ色素（Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｄ；Ｓｉｇｍａ）を用いて、全コラーゲンを染色した。４８ウェルプレート上またはスキャフォールド中でインキュベートされた線維芽細胞によって分泌されたコラーゲンと２Ｄウェル表面上またはスキャフォールド中の線維芽細胞、ケラチノサイト、およびメラノサイトの共培養物によって分泌されたコラーゲンを比較した。表示した時間間隔の後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。１００μｌの０．１％Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色剤（ピクリン酸５０ｍｌ当たりＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ粉末０．０５ｇ）を各ウェルに添加し、室温で１時間保持した。付着しなかった染色剤を除去し、２００μｌの０．１Ｎ ＨＣｌで５回洗浄した。付着した染色剤を１００μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで抽出し（１５分）、よく混合した。染色剤を９６ウェルプレートに入れ、マイクロプレートリーダーを用いて５４０ｎｍでの吸光度を読み取った。

【0040】

ＥＣＭ中のコラーゲンは組織に対して適当な機械的強度を付与するが、線維芽細胞によるＥＣＭの産生に対するコラーゲンの効果も重要である。Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ色素を用いて、スキャフォールド中のコラーゲンと線維芽細胞によって分泌されたコラーゲンの両方を染色した。ケラチノサイトとメラノサイトが線維芽細胞によるコラーゲン分泌に影響を及ぼすかどうかを調べるために、スキャフォールドのみ、スキャフォールド内部で７日間育てられた線維芽細胞のコラーゲン量と、４８ウェルプレート中に７日間播種された線維芽細胞の場合、および線維芽細胞が７日間播種され、ケラチノサイトとメラノサイトがさらに７日間播種されたスキャフォールドの場合のコラーゲンの量とを比較した。図７では、スキャフォールド中に線維芽細胞を播種する場合、線維芽細胞によって分泌されるコラーゲンは、ウェル上に播種されるよりも約３０％多い。コラーゲンは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の重要な構成要素である。細胞増殖、組織体形成、および組織体形状は、コラーゲン濃度に依存的であった。したがって、創傷治癒促進の可能性を検出するために、コラーゲンの分泌量は重要な指標である。スキャフォールドは線維芽細胞のコラーゲン分泌を促進する潜在能力を有していたので、これは、創傷治癒時の組織工学のための優れた
材料であり得る。

【実施例3】

【0041】

ラットモデルでの創傷治癒
動物調製
雄のＷｉｓｔａｒラット（２５０〜２８５ｇ）を本研究の全ての実験に用いた。ラットを、１２時間／１２時間の明暗スケジュールにした、温度調節された（２２±１℃）部屋のＰｌｅｘｉｇｌａｓケージの中で、食餌と水を自由に摂らせて飼育した。６匹のラットを損傷群と処置群の２つの群にランダムに分けた。切開創傷治癒試験を（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｙａｎｇ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ３４６，３８−４６（２００８））から改変した。麻酔後、背側の毛を電気カミソリで剃り、外科用ナイフで直径２ｃｍの全層切開を作った。切開を作った後、同じサイズの生体材料を生理食塩水ですすぎ、創傷を直接被覆した。損傷群については、比較のために創傷を被覆しなかった。手術後、回復させるために、ラットを個別のケージに入れた。

【0042】

創傷サイズの評価
損傷後１、２、３、４、５、７および１０日で、同じパラメータ（Ｆ７．２，１／６０）でデジタルカメラ（Ｃｏｏｌｐｉｘ Ｐ６０００，Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）を用いて写真を撮影した。ＳＰＯＴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＩ，ＵＳＡ）ソフトウェアを用いて、各々の創傷の面積を測定した。創傷治癒の程度は、
（数２）
（Ｎ日目の創傷面積／０日目の創傷面積）×１００％
として算出される、創傷面積のパーセントとして表した。

【0043】

スキャフォールドの創傷治癒効率を全層創傷モデルで評価した。損傷群と処置群の両方の創傷面積は、時間とともに小さくなった（図８）。損傷後１、２、３、４、５、および７日での処置群の創傷面積は、それぞれ、７９．７±３．４％、７３．４±３．５％、６６．８±２．２％、６０．７±５．０％、５８．３±６．１％および４４．９±４．３％であった。これらは全て、損傷群の創傷面積（９７．４±５．５％、８６．３±２．２％、７５．３±３．７％、７１．４±３．８％、６７．９±８．１％および６２．２±９．４％）よりも小さい。損傷後１日以降、処置群の創傷面積は、損傷群の創傷よりも小さく、この傾向は、損傷後１０日まで一貫していた。処置群の創傷は、損傷群の創傷よりも早く閉鎖した。損傷後１０日目で、スキャフォールドの場合の創傷の面積は、２４．０±２．１％であった。その場合、損傷群の創傷面積は４１．８±５．３％であり、このスキャフォールドは、創傷閉鎖速度を顕著に高めることができた。スキャフォールドで処置した創傷治癒は、最初の７日間で４５％強の創傷閉鎖を達成し、１０日以内にほぼ７５％の創傷閉鎖を達成した。

【0044】

組織学的研究
Ｈ＆Ｅ染色後の皮膚切片の組織学的検査（図９）により、処置群と損傷群の両方の皮膚に肉芽組織が見られ、スキャフォールドが創傷治癒を妨害しないことが示された。処置群の表皮は損傷群の表皮よりも高密度であった。スキャフォールドは、創傷治癒の間に皮膚の強度を高めることができた。損傷群と比較して、処置群の創傷は、好中球浸潤が少なかった。創傷治癒過程の間、好中球は、ケラチノサイト分化および創傷閉鎖遅延を加速する物質を分泌した。このスキャフォールドを適用することによって、好中球浸潤が減少し、創傷閉鎖を加速した。

【0045】

このスキャフォールドは、治癒速度を向上させ、表皮の密度を高め、好中球浸潤を低下させることができる。これらの証拠は、このスキャフォールドが切開創傷治癒に好適であることを示している。

【0046】

損傷１０日後、過剰に麻酔をかけることによってラットを屠殺した。創傷皮膚を４％のパラホルムアルデヒドで固定した。組織学的観察のために、皮膚をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。組織学的解析のために、Ｌｅｉｃａ ＤＭ−６０００顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＳｐｏｔ Ｘｐｌｏｒｅｒ ＣＣＤ積算カメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＩ，ＵＳＡ）で画像を取り込んだ。組織学的解析は、Ｂａｙａｔら（２００５）を改変したものであった。好中球の計数のために、各試料由来のランダムに選択した１０カ所の真皮部分を４００倍の倍率で調べた。組織学的検査は盲検で実施した。

【0047】

本発明は、当業者がそれを作製し、使用することができるほど十分詳細に記載され、例示されているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な改変、変更、および改良が明白になるはずである。

【0048】

当業者は、本発明をうまく適合させると、目的が実行され、記述された結果および利点、ならびに本明細書に固有の結果および利点が得られることを容易に理解する。それらを作製するためのプロセスおよび方法は、好ましい実施形態を代表するものであり、例示的なものであって、本発明の範囲に対する限定として意図されるものではない。当業者には、本明細書における変更および他の使用が思い当たるであろう。これらの変更は本発明の精神の範囲内に包含され、かつ特許請求の範囲によって定義される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】