知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ＮＥＣソリューションイノベータ株式会社の特許一覧 ▶ 辻 祥太郎の特許一覧 ▶ 辻 真紀子の特許一覧 ▶ 大津 敬の特許一覧
特許5936145ペプチド抗体のスクリーニングに使用する核酸構築物およびそれを用いたスクリーニング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5936145
(24)【登録日】2016年5月20日
(45)【発行日】2016年6月15日
(54)【発明の名称】ペプチド抗体のスクリーニングに使用する核酸構築物およびそれを用いたスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20160602BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20160602BHJP
C12Q 1/68 20060101ALI20160602BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20160602BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 AZNA
C12N15/00 H
C12Q1/68 A
C12P21/08
【請求項の数】17
【全頁数】46
(21)【出願番号】特願2013-536050(P2013-536050)
(86)(22)【出願日】2012年8月10日
(86)【国際出願番号】JP2012070475
(87)【国際公開番号】WO2013046960
(87)【国際公開日】20130404
【審査請求日】2014年3月19日
(31)【優先権主張番号】特願2011-215049(P2011-215049)
(32)【優先日】2011年9月29日
(33)【優先権主張国】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000232092
【氏名又は名称】ＮＥＣソリューションイノベータ株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】510091608
【氏名又は名称】辻 祥太郎
(73)【特許権者】
【識別番号】510091619
【氏名又は名称】辻 真紀子
(73)【特許権者】
【識別番号】506223716
【氏名又は名称】大津 敬
(74)【代理人】
【識別番号】100115255
【弁理士】
【氏名又は名称】辻丸 光一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100129137
【弁理士】
【氏名又は名称】中山 ゆみ
(74)【代理人】
【識別番号】100154081
【弁理士】
【氏名又は名称】伊佐治 創
(72)【発明者】
【氏名】辻 祥太郎
(72)【発明者】
【氏名】辻 真紀子
【審査官】
田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第０２／１０１０３６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１１／０６２１１２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２００３−５２３７７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表平１０−５０４９７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Biochem.Biophys.Res.Commun.,2009,Vol.386,p.227-231
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／６８
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸を有し、
前記（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸は、
前記（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸が、融合転写物として転写され、
前記（ｘ）および（ｙ）のコード核酸が、融合翻訳産物として翻訳されるように連結されていることを特徴とする、抗原に対する抗体候補を発現するための核酸構築物。
（ｘ）ラクダ科由来可変領域ＶＨＨのコード核酸に任意ペプチドのコード核酸が挿入された、抗体候補のコード核酸
（ｙ）ヒスチジンタグのコード核酸
（ｚ）前記ヒスチジンタグに結合する核酸分子のコード核酸
前記（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸は、
前記（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸が、融合転写物として転写され、
前記（ｘ）および（ｙ）のコード核酸が、融合翻訳産物として翻訳されるように連結されていることを特徴とする、抗原に対する抗体候補を発現するための核酸構築物。
（ｘ）ラクダ科由来可変領域ＶＨＨのコード核酸に任意ペプチドのコード核酸が挿入された、抗体候補のコード核酸
（ｙ）ヒスチジンタグのコード核酸
（ｚ）前記ヒスチジンタグに結合する核酸分子のコード核酸
【請求項2】
前記可変領域における超可変領域のコード核酸に、前記任意ペプチドのコード核酸が挿入されている、請求項１記載の核酸構築物。
【請求項3】
前記可変領域ＶＨＨにおけるＣＤＲ３領域のコード核酸に、前記任意ペプチドのコード核酸が挿入されている、請求項２記載の核酸構築物。
【請求項4】
前記核酸構築物が、ベクターである、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項5】
前記ベクターが、コールドショック発現系のベクターである、請求項４記載の核酸構築物。
【請求項6】
前記ペプチドタグに結合する核酸分子が、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む、請求項１〜５記載の核酸構築物。
（ａ）配列番号１７で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド
ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ （配列番号１７）
ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、
１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンタグに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１８で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド
ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１８）
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンタグに結合するポリヌクレオチド
（ａ）配列番号１７で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド
ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ （配列番号１７）
ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、
１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンタグに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１８で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド
ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１８）
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンタグに結合するポリヌクレオチド
【請求項7】
前記（ｙ）ヒスチジンタグのコード核酸、前記（ｘ）抗体候補のコード核酸および前記（ｚ）核酸分子のコード核酸が、この順序で配置されている、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項8】
５’から３’に向かって、前記（ｙ）ヒスチジンタグのコード核酸、前記（ｘ）抗体候補のコード核酸および前記（ｚ）核酸分子のコード核酸が、この順序で配置されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項9】
請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸構築物を使用し、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする、抗体またはそのコード核酸をスクリーニングするスクリーニング方法。
（Ａ）前記核酸構築物を発現させ、前記（ｘ）抗体候補のコード核酸、前記（ｙ）ヒスチジンタグのコード核酸、および前記（ｚ）核酸分子のコード核酸から転写された融合転写産物と、前記（ｘ）抗体候補のコード核酸および前記（ｙ）ヒスチジンタグのコード核酸から翻訳された融合翻訳産物との複合体を形成する工程
（Ｂ）前記複合体と抗原とを接触させる工程
（Ｃ）前記抗原に結合した前記複合体を回収する工程
（Ａ）前記核酸構築物を発現させ、前記（ｘ）抗体候補のコード核酸、前記（ｙ）ヒスチジンタグのコード核酸、および前記（ｚ）核酸分子のコード核酸から転写された融合転写産物と、前記（ｘ）抗体候補のコード核酸および前記（ｙ）ヒスチジンタグのコード核酸から翻訳された融合翻訳産物との複合体を形成する工程
（Ｂ）前記複合体と抗原とを接触させる工程
（Ｃ）前記抗原に結合した前記複合体を回収する工程
【請求項10】
前記（Ｂ）工程において、前記抗原が、固相に固定化された抗原である、請求項９記載のスクリーニング方法。
【請求項11】
さらに、下記（Ｄ）工程を含む、請求項９または１０記載のスクリーニング方法。
（Ｄ）前記複合体における前記融合転写物を鋳型として、前記抗体候補における任意ペプチドのコード核酸を合成する工程
（Ｄ）前記複合体における前記融合転写物を鋳型として、前記抗体候補における任意ペプチドのコード核酸を合成する工程
【請求項12】
前記（Ｄ）工程で得られた前記任意ペプチドのコード核酸を用いて、前記任意ペプチドのコード核酸が挿入された請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸構築物を新たに調製し、再度、前記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程を行う、請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項13】
前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）工程を、繰り返し行う、請求項１１または１２記載のスクリーニング方法。
【請求項14】
さらに、前記（Ｄ）工程で得られた前記任意のペプチドのコード核酸の塩基配列を決定する、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項15】
前記任意のペプチドのコード核酸の塩基配列から、前記任意のペプチドのアミノ酸配列を決定する、請求項１４記載のスクリーニング方法。
【請求項16】
前記核酸構築物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させる、請求項９から１５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項17】
前記核酸構築物を、大腸菌で発現させる、請求項１５記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペプチド抗体のスクリーニングに使用する核酸構築物およびそれを用いたスクリーニング方法に関する。【背景技術】
【0002】
ターゲットを特異的に認識して結合する結合分子は、例えば、検査、診断および治療等の医療分野で幅広く使用されており、疾患および病態の解析において、極めて重要なツールである。中でも、モノクローナル抗体は、ターゲットに対する特異性および親和性、安定性ならびにコスト面に優れることから、最も広く研究されている。しかしながら、通常の動物への免疫法では、低分子抗原に対する抗体または生物種間で高度に保存された抗原に対する抗体の作製が困難であり、必ずしも、ターゲットに対する特異的な抗体が入手できるとは限らない。実際に、疾患に関連する有力なマーカーが報告されているにも関わらず、特異的な抗体が存在しないために、診断および治療に応用できないという問題がある。【0003】
そこで、近年、動物を用いた抗体作製に代わり、人工的にペプチド抗体を作製する方法が報告されている。具体例として、例えば、ファージディスプレイ法、リボゾーム法、ピューロマイシンプローブを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ法（ｍＲＮＡディスプレイ法）、ペプチドアレイ法等があげられる（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。いずれの方法も、免疫法により抗体を得ることができないターゲットについて、人工的な選択によりペプチド抗体を分離できる。【0004】
しかしながら、これらの手法は、例えば、特殊な試薬および装置の使用、効率、コスト等の問題がある。これらの中でも、例えば、ファージディスプレイ法は、比較的実施されているが、いまだ、技術面でノウハウを必要とするため、実験者の経験および知識に影響され、誰でも容易に実施することが困難である。【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２２８：ｐ．１３１５−１３１７
【非特許文献2】Ｍａｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９１：ｐ．９０２２−９０２６
【非特許文献3】Ｋｅｅｆｅ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．４１０：ｐ．７１５−７１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
そこで、本発明の目的は、抗体の候補分子を、簡便にスクリーニングするための新たなツールならびにそれを用いた抗体の候補分子のスクリーニング方法を提供することにある。【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の核酸構築物は、抗原に対する抗体候補を発現するための核酸構築物であり、下記（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸を有し、前記（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸は、前記（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸が、融合転写物として転写され、
前記（ｘ）および（ｙ）のコード核酸が、融合翻訳産物として翻訳されるように連結されていることを特徴とする。
（ｘ）抗体の可変領域のコード核酸に任意ペプチドのコード核酸が挿入された、抗体候補のコード核酸
（ｙ）ペプチドタグのコード核酸
（ｚ）前記ペプチドタグに結合する核酸分子のコード核酸
【0008】
本発明のスクリーニング方法は、抗原に結合する抗体ペプチドまたはそのコード核酸をスクリーニングするスクリーニング方法であり、前記本発明の核酸構築物を使用し、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする。（Ａ）前記核酸構築物を発現させ、前記（ｘ）抗体候補のコード核酸、前記（ｙ）ペプチドタグのコード核酸および前記（ｚ）核酸分子のコード核酸から転写された融合転写産物と、前記（ｘ）抗体候補のコード核酸および前記（ｙ）ペプチドタグのコード核酸から翻訳された融合翻訳産物との複合体を形成する工程
（Ｂ）前記複合体と抗原とを接触させる工程
（Ｃ）前記抗原に結合した前記複合体を回収する工程
【発明の効果】
【0009】
本発明の核酸構築物によれば、前記（ｚ）から転写された前記ペプチドタグに結合する核酸分子と前記（ｙ）から翻訳された前記ペプチドタグとの結合を利用して、前記融合転写産物と前記融合翻訳産物との複合体を形成できる。前記複合体において、前記融合転写産物は、前記任意ペプチドのコード配列の転写産物を有し、前記融合翻訳産物は、前記任意ペプチドを有する。このため、前記複合体が抗原に結合した場合、例えば、前記複合体における前記転写産物の同定により、前記抗原に結合する前記抗体候補を同定できる。このように、本発明によれば、前記複合体を形成させ、前記抗原と結合した複合体を回収するのみで、容易に、前記抗原に結合可能な抗体候補ならびにそのコード核酸を同定できる。また、同定した前記抗体候補およびそのコード核酸の情報から、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体等を構築することも可能である。したがって、本発明は、例えば、医療分野等において、抗原に対する新たな抗体のスクリーニングに、極めて有用なツールならびに方法といえる。【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
＜第１の核酸構築物＞本発明の第１の核酸構築物は、前述のように、抗原に対する抗体候補を発現するための核酸構築物であり、下記（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸を有し、
前記（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸は、
前記（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸が、融合転写物として転写され、
前記（ｘ）および（ｙ）のコード核酸が、融合翻訳産物として翻訳されるように連結されていることを特徴とする。
（ｘ）抗体の可変領域のコード核酸に任意ペプチドのコード核酸が挿入された、抗体候補のコード核酸
（ｙ）ペプチドタグのコード核酸
（ｚ）前記ペプチドタグに結合する核酸分子のコード核酸
【0012】
本発明において、「抗体候補」は、例えば、目的の抗原への結合性を示すか否かを確認する、ペプチド候補（ｐｅｐｔｉｄｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ）を意味する。本発明の第１の核酸構築物は、例えば、目的の抗原に結合可能なペプチドまたはそのコード核酸をスクリーニングするためのスクリーニング用核酸構築物ともいう。【0013】
本発明において、以下、前記任意ペプチドを「ランダムペプチド」、そのアミノ酸配列を「任意ペプチド配列」または「ランダムペプチド配列」、前記任意ペプチドのコード核酸を「任意コード核酸」または「ランダムコード核酸」、その核酸配列を「任意コード配列」または「ランダムコード配列」ともいう。本発明において、以下、前記ペプチドタグを「タグ」、そのアミノ酸配列を「ペプチドタグ配列」または「タグ配列」、前記タグのコード核酸を「タグコード核酸」または「ペプチドタグコード核酸」、その核酸配列を「タグコード配列」または「ペプチドタグコード配列」ともいう。本発明において、以下、前記タグに結合する核酸分子を「アプタマー」または「タグアプタマー」、その配列を「アプタマー配列」または「タグアプタマー配列」、前記アプタマーのコード核酸を「アプタマーコード核酸」または「タグアプタマーコード核酸」、その配列を「アプタマーコード配列」または「タグアプタマーコード配列」ともいう。【0014】
本発明において、アンチセンス鎖は、二本鎖のうち、転写の鋳型となる鎖をいい、センス鎖は、二本鎖のうち、前記アンチセンス鎖の相補鎖であって、転写の鋳型とならない鎖をいう。転写産物は、前記アンチセンス鎖と相補的であり、ＴがＵに代わる以外は、前記センス鎖と同じ配列である。「転写産物」は、例えば、ＲＮＡであり、具体的にはｍＲＮＡである。「翻訳産物」は、例えば、ペプチドであり、タンパク質の意味も含む。本発明において、「ペプチド」は、例えば、２個以上のアミノ酸残基が結合したものである。本発明において、前記ペプチドは、例えば、いわゆるポリペプチドの意味を含み、前記ポリペプチドは、いわゆる前記オリゴペプチドの意味を含む。一般的に、前記オリゴペプチドは、例えば、アミノ酸残基数１０個程度以下のペプチドである。本発明において、５’側は、上流側、３’側は、下流側ともいう。【0015】
本発明の第１の核酸構築物は、例えば、一本鎖でもよく、二本鎖でもよく、後者が好ましい。本発明の説明において、センス鎖またはアンチセンス鎖という用語を使用するが、これは、本発明の第１の核酸構築物を二本鎖に限定するものではない。これらの用語の使用は、例えば、各コード核酸の配列およびこれらの位置関係等を説明する際、転写の鋳型となるアンチセンス鎖として説明するか、その相補鎖（センス鎖）として説明するかを明確にするためである。【0016】
本発明の第１の核酸構築物は、例えば、ＤＮＡが好ましく、前記各コード核酸は、例えば、それぞれ、ＤＮＡ配列を含み、好ましくはＤＮＡ配列からなる。【0017】
本発明の第１の核酸構築物は、前記（ｘ）抗体候補コード核酸、前記（ｙ）タグコード核酸および前記（ｚ）アプタマーコード核酸が、融合転写産物として転写可能である。前記融合転写物は、例えば、前記（ｘ）から転写されたｍＲＮＡ、前記（ｙ）から転写されたｍＲＮＡおよび前記（ｚ）から転写されたＲＮＡアプタマーを含む融合転写産物であり、これらのＲＮＡが連結している。また、本発明の第１の核酸構築物は、前記（ｘ）抗体候補コード核酸および前記（ｙ）タグコード核酸が、融合翻訳産物として翻訳可能である。前記融合翻訳産物は、例えば、前記（ｘ）から翻訳された前記抗体候補および前記（ｙ）から翻訳された前記タグを含む融合翻訳産物であり、これらのペプチドが連結している。【0018】
本発明の第１の核酸構築物において、前記（ｘ）抗体候補コード核酸と前記（ｙ）タグコード核酸と前記（ｚ）アプタマーコード核酸との位置関係は、特に制限されない。前記（ｘ）抗体候補コード核酸と前記（ｙ）タグコード核酸との位置関係は、例えば、センス鎖において、前記（ｘ）抗体候補コード核酸の５’側に、前記（ｙ）タグコード核酸を有してもよいし、前記（ｘ）抗体候補コード核酸の３’側に、前記（ｙ）タグコード核酸を有してもよく、好ましくは前者である。前記（ｚ）アプタマーコード核酸の位置は、例えば、センス鎖において、前記（ｘ）抗体候補コード核酸および前記（ｙ）タグコード核酸の５’側でもよいし、３’側でもよく、好ましくは後者である。【0019】
前記（ｘ）抗体候補コード核酸、前記（ｙ）タグコード核酸および前記（ｚ）アプタマーコード核酸は、例えば、センス鎖において、前記（ｙ）タグコード核酸、前記（ｘ）抗体候補コード核酸および前記（ｚ）アプタマーコード核酸が、この順序で配置されていることが好ましい。これらの配列方向は、特に制限されず、例えば、センス鎖において、５’側から３’側に向かって、または、３’側から５’側に向かって、前記（ｙ）タグコード核酸、前記（ｘ）抗体候補コード核酸および前記（ｚ）アプタマーコード核酸が、この順序で配置されてもよい。好ましくは、センス鎖において、５’側から３’側に向かって、前記（ｙ）タグコード核酸、前記（ｘ）抗体候補コード核酸および前記（ｚ）アプタマーコード核酸が、この順序で配置されている。前記（ｚ）アプタマーコード核酸は、例えば、前記核酸構築物において、転写終結点または転写終結点近傍のステムループ構造に含まれることが好ましい。【0020】
前記（ｘ）抗体候補コード核酸は、前述のように、抗体の可変領域コード核酸に前記任意コード核酸が挿入されている。前記（ｘ）抗体候補コード核酸は、例えば、前記任意コード核酸が挿入された前記可変領域コード核酸のみを有してもよいし、前記可変領域を含む抗体全体または抗体の部分断片のコード核酸を有してもよい。【0021】
本発明において、前記任意コード核酸の挿入の形態は、特に制限されない。本発明において、前記任意コード配列の挿入は、例えば、前記可変コード核酸の末端への付加による挿入、前記可変コード核酸の内部への付加による挿入、前記可変コード核酸の部分領域との置換による挿入等の意味を含む。以下、便宜上、末端への付加による挿入を「付加」、内部への付加による挿入を「挿入」、置換による挿入を「置換」として説明する場合もあるが、本発明における「任意コード核酸の挿入」は、いずれであってもよい。【0022】
前記任意コード核酸は、例えば、前記可変領域コード核酸が部分的に欠失することなく、前記可変領域コード核酸の末端に付加されてもよく、および／または、前記可変領域コード核酸の内部に挿入されてもよい。また、前記任意コード核酸は、例えば、前記可変領域コード核酸の少なくとも一部の領域を欠失させ、その欠失部位に挿入されてもよい。この場合、前記任意コード核酸は、例えば、前記抗体候補コード核酸において、前記可変領域コード核酸の少なくとも一部の領域との置換により挿入されているともいえる。本発明において、前記任意コード核酸の挿入は、特に制限されず、例えば、置換による挿入が好ましい。【0023】
前記可変領域の由来となる抗体、例えば、Ｉｇの種類は、何ら制限されない。前記Ｉｇは、例えば、単量体、２量体、５量体等があげられ、Ｉｇのサブタイプは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等があげられる。前記Ｉｇの由来となる種も、特に制限されず、例えば、ヒト、マウス、モルモット等のネズミ科、ウサギ、ラクダ、ラマ等のラクダ科等の哺乳類があげられる。また、前記可変領域は、例えば、人工的に設計された配列でもよい。【0024】
前記可変領域は、特に制限されず、例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＨＨドメイン等があげられる。前記可変領域は、例えば、これらのドメインの組合せでもよい。具体例として、前記可変領域は、例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインとをリンカーペプチド等で連結したｓｃＦｖ／ｓＦｖ、ＶＨドメインと、ＶＬドメインまたはＶｐｒｅＢとを共発現したペプチド等があげられる。【0025】
前記可変領域は、例えば、ＶＨＨドメインが特に好ましい。ＶＨＨドメインは、例えば、前記ラクダ科由来Ｉｇの可変領域であり、前記Ｉｇは、軽鎖を欠失する一本鎖の重鎖抗体である。前記ＶＨＨドメインは、例えば、ジスルフィド結合の形成を防止できることから、例えば、Ｃｙｓ残基を、Ｃｙｓ残基以外のアミノ酸残基に置換した配列であることが好ましい。【0026】
前記可変領域における前記任意コード核酸の挿入部位は、特に制限されず、例えば、抗原の認識領域となる超可変領域が好ましい。前記任意コード核酸を、前述のように付加する場合、付加する部位は、例えば、前記可変領域の末端があげられ、前記任意コード核酸を、前述のように挿入する場合、挿入する部位は、例えば、前記可変領域の内部があげられる。また、前記任意コード核酸を、前述のように置換により挿入する場合、置換する部位は、例えば、前記可変領域全体でもよいし、前記可変領域の部分領域でもよい。つまり、例えば、前記可変領域の全体を前記任意コード核酸で置換してもよいし、前記可変領域の部分領域を前記任意コード核酸で置換してもよい。【0027】
具体例として、前記可変領域がＶＨＨドメインの場合、前記任意コード核酸の挿入部位（付加、挿入および／または置換の部位）は、例えば、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域またはＣＤＲ３領域があげられ、いずれか１領域でもよいし、いずれか２領域または全３領域でもよい。中でも、前記任意コード核酸の挿入部位は、例えば、前記ＣＤＲ３領域が好ましく、特に、前記ＣＤＲ３領域の全体または部分領域に、前記任意コード核酸が挿入されていることが好ましい。前記任意コード核酸は、前述のように、例えば、付加、挿入および置換のいずれでもよく、具体的には、例えば、前記ＣＤＲ３領域の全体または部分領域が、前記任意コード核酸に置換されることで、前記任意コード核酸が挿入されていることが好ましい。【0028】
前記任意コード核酸の配列は、何ら制限されない。前記任意コード核酸は、例えば、ランダムに設計した塩基配列でもよいし、任意のアミノ酸配列に基づいて設計した塩基配列でもよい。前記任意コード核酸の長さは、特に制限されない。前記任意コード核酸を、前記可変領域コード核酸に置換により挿入する場合、例えば、前記可変領域コード核酸における欠失部位の長さに応じて適宜設計できる。前記任意コード核酸の長さは、例えば、３の倍数の塩基長であり、下限は、特に制限されず、例えば、３塩基長、好ましくは１２塩基長、より好ましくは１８塩基長、さらに好ましくは３６塩基長であり、上限は、特に制限されず、例えば、６０塩基長、好ましくは５１塩基長、より好ましくは４５塩基長であり、その範囲は、例えば、３〜６０塩基長、好ましくは１２〜５１塩基長、より好ましくは３６〜４５塩基長である。【0029】
前記任意コード核酸の塩基配列は、例えば、その配列途中において、終止コドンの出現確率が低くなるように設計することが好ましい。このため、センス鎖において、前記任意コード核酸の塩基配列は、例えば、コドンの３番目に当たる塩基をＡ以外の塩基とすることが好ましく、具体的には、コドンの配列を「ＮＮＫ」とすることが好ましい。ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵであり、Ｋは、Ｇ、ＴまたはＵである。さらに、終始コドンの出現を防ぐため、センス鎖において、前記任意コード核酸の塩基配列は、例えば、コドンの１番目に当たる塩基をＴ以外の塩基としてもよく、具体的には、コドンの配列を「ＶＮＫ」とすることができる。ここで、Ｖは、Ａ、ＧまたはＣである。【0030】
前記任意コード核酸は、例えば、前記任意ペプチドのアミノ酸配列に従った読み枠となるように、挿入されていることが好ましい。また、前記任意コード核酸は、例えば、前記可変領域コード核酸の読み枠が変化しないように、また、前記任意コード核酸の読み枠が変化しないように、挿入されていることが好ましい。【0031】
本発明の第１の核酸構築物において、前記（ｘ）抗体候補コード核酸および前記（ｙ）タグコード核酸は、例えば、両方が、それぞれ開始コドンを有してもよく、また、５’側に位置するいずれか一方のコード核酸が開始コドンを有することが好ましい。すなわち、前記（ｘ）抗体候補コード核酸が、前記（ｙ）タグコード核酸の５’側に配置されている場合、前記（ｘ）抗体候補コード核酸は、例えば、その５’側に、開始コドンを含むことが好ましい。また、本発明の第１の核酸構築物において、前記（ｙ）タグコード核酸が、前記（ｘ）抗体候補コード核酸の５’側に配置されている場合、前記（ｙ）タグコード核酸は、例えば、その５’側に、開始コドンを含むことが好ましい。本発明の第１の核酸構築物において、後者がより好ましい。【0032】
５’側から３’側に向かって、前記（ｘ）抗体候補コード核酸、前記（ｙ）タグコード核酸および前記（ｚ）アプタマーコード核酸が、この順序で配置されている場合、例えば、前記（ｘ）抗体候補コード核酸は、終止コドンを有さず、前記（ｙ）タグコード核酸は、その３’側に終始コドンを有することが好ましい。具体的には、前記（ｙ）タグコード核酸において、前記タグのＣ末端アミノ酸残基に対するコドンの３’側に、終止コドンが隣接していることが好ましい。また、５’側から３’側に向かって、前記（ｙ）タグコード核酸、前記（ｘ）抗体候補コード核酸および前記（ｚ）アプタマーコード核酸が、この順序で配置されている場合、例えば、前記（ｙ）タグコード核酸は、終止コドンを有さず、前記（ｘ）抗体候補コード核酸は、その３’側に終始コドンを有することが好ましい。具体的には、前記（ｘ）抗体候補コード核酸において、前記抗体候補のＣ末端アミノ酸残基に対するコドンの３’側に、終止コドンが隣接していることが好ましい。本発明の第１の核酸構築物において、後者がより好ましい。このように、前記（ｚ）アプタマーコード核酸よりも５’側に配置された前記（ｘ）抗体候補コード核酸が終止コドンを有することによって、例えば、前記アプタマーコード核酸の翻訳を十分に防止できる。【0033】
本発明において、前記タグの種類は、特に制限されず、また、前記タグに結合する核酸分子（アプタマー）の種類も、特に制限されず、両者が結合可能であればよい。前記タグと、それに結合可能なアプタマーに設定することで、本発明の第１の核酸構築物により、前記融合転写産物および前記融合翻訳産物が生成された際、前記融合翻訳産物における前記タグと前記融合転写産物における前記アプタマーとの結合により、前記複合体を形成できる。本発明において、「タグ」は、例えば、分子の目印として、前記分子に結合または付加させるペプチドを意味する。【0034】
本発明において、「タグに結合可能である」は、例えば、前記タグに対する結合能を有している、または、前記タグに対する結合活性（タグ結合活性）を有しているということもできる。前記アプタマーと前記タグとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用解析等により決定でき、前記決定には、例えば、ビアコアＸ(商品名、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．)等の装置を使用できる。前記タグに対する前記アプタマーの結合活性は、例えば、前記アプタマーと前記タグとの解離定数で表わすことができる。本発明において、前記アプタマーの解離定数は、特に制限されない。【0035】
前記アプタマーは、例えば、前記タグに特異的に結合可能であることが好ましく、また、前記タグに対する結合力に優れることが好ましい。前記アプタマーは、前記タグに対する結合定数（ＫＤ）が、例えば、１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、より好ましくは、５×１０−１０ｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌである。【0036】
前記アプタマーは、例えば、単独の前記タグに結合する他、前記タグを含む融合ペプチドに、前記タグを介して結合可能である。前記融合ペプチドは、例えば、Ｎ末端側に前記タグを含む融合ペプチド、Ｃ末端側に前記タグを含む融合ペプチド、内部に前記タグを含む融合ペプチド等があげられ、さらに、他のペプチドを含んでもよい。前記アプタマーの長さは、特に制限されず、例えば、２０〜１６０塩基長であり、好ましくは３０〜１２０塩基長であり、より好ましくは４０〜１００塩基長である。【0037】
前記タグは、例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＧＳＴタグ、抗体Ｆｃ領域タグ等があげられ、中でもヒスチジンタグが好ましい。前記タグの長さは、特に制限されず、アミノ酸残基は、例えば、６〜３３０個が好ましく、または、６〜３３個が好ましく、もしくは、６〜３０個が好ましく、より好ましくは６〜１５個であり、さらに好ましくは８〜１５個である。【0038】
本発明の第１の核酸構築物において、前記（ｙ）タグコード核酸は、例えば、前記タグのアミノ酸配列に従った読み枠となるように配置される。また、本発明の第１の核酸構築物において、前記（ｙ）タグコード核酸と前記（ｘ）抗体候補コード核酸は、例えば、翻訳された際に、前記抗体候補に前記タグが付加されるように配置される。翻訳された際、前記タグは、例えば、前記抗体候補に、直接付加されてもよいし、アミノ酸またはペプチド等のリンカーを介して間接的に付加されてもよい。【0039】
本発明において、以下、ヒスチジンを「Ｈｉｓ」、ヒスチジンタグを「Ｈｉｓタグ」、前記Ｈｉｓタグのコード核酸を「Ｈｉｓタグコード核酸」ともいう。また、前記Ｈｉｓタグに結合可能な核酸分子を「Ｈｉｓタグアプタマー」または「アプタマー」、前記Ｈｉｓタグアプタマーのコード核酸を「Ｈｉｓタグアプタマーコード核酸」または「アプタマーコード核酸」ともいう。【0040】
前記Ｈｉｓタグは、通常、複数個のＨｉｓを有するペプチド、すなわち、Ｈｉｓペプチドを意味する。本発明において、前記Ｈｉｓタグは、例えば、複数の連続するＨｉｓを有するペプチドであり、具体的に、複数個の連続したＨｉｓのみからなるペプチドでもよいし、複数の連続したＨｉｓを含むペプチドでもよい。後者の場合、例えば、複数の連続したＨｉｓのＮ末端側およびＣ末端側の少なくとも一方に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、１個のアミノ酸残基でもよいし、２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドでもよい。本発明の第１の核酸構築物において、前記Ｈｉｓタグコード核酸がコードする前記Ｈｉｓタグの長さは、特に制限されない。前記Ｈｉｓタグのアミノ酸残基数は、例えば、６〜３０個であり、好ましくは６〜１５個であり、より好ましくは８〜１５個である。前記ＨｉｓタグにおけるＨｉｓの個数は、例えば、６〜１０個が好ましく、より好ましくは６〜８個であり、連続するＨｉｓの個数は、例えば、６〜１０個が好ましく、より好ましくは６〜８個である。【0041】
前記Ｈｉｓタグコード核酸の配列は、特に制限されず、Ｈｉｓペプチドをコードする配列（以下、「Ｈｉｓペプチドコード配列」という）を有していればよく、具体的には、例えば、Ｈｉｓのコドンを連続して有していることが好ましい。また、前記Ｈｉｓタグは、前述のように、Ｈｉｓペプチドの他に、さらに、前記付加配列を有してもよい。このため、前記Ｈｉｓタグコード核酸は、例えば、前記付加配列をコードする配列（以下、「付加コード配列」という）を、前記Ｈｉｓペプチドコード配列の５’側および３’側の少なくとも一方に有してもよい。前記付加コード配列は、特に制限されない。【0042】
具体例として、前記Ｈｉｓペプチドコード配列の５’側における前記付加コード配列は、例えば、開始コドンを含む配列があげられる。前記開始コドンを含む配列は、例えば、前記開始コドンのみでもよいし、前記開始コドンと、３の倍数の塩基長の配列とを有してもよい。後者の場合、例えば、前記３の倍数の塩基長の配列は、例えば、１以上のアミノ酸残基をコードする配列であり、前記開始コドンの３’側に隣接している。【0043】
また、前記Ｈｉｓペプチドコード配列の３’側における前記付加コード配列は、例えば、３の倍数の塩基長の配列が好ましい。中でも、前記（ｙ）Ｈｉｓタグコード核酸の５’側に、前記（ｘ）抗体候補コード核酸を有する場合、例えば、前記３’側の前記付加コード配列は、終止コドンを有することが好ましい。具体例として、例えば、センス鎖において、５’側から３’側に向かって、前記（ｘ）抗体候補コード核酸、前記（ｙ）Ｈｉｓタグコード核酸および前記（ｚ）アプタマーコード核酸が、この順序で配置されている場合、前述のように、前記（ｙ）Ｈｉｓタグコード核酸は、終止コドンを有することが好ましい。一方、前記（ｙ）Ｈｉｓタグコード核酸の３’側に、前記（ｘ）抗体候補コード核酸を有する場合、前記３’側の前記付加コード配列は、終止コドンを有さないことが好ましい。具体例として、例えば、前記センス鎖において、５’側から３’側に向かって、前記（ｙ）Ｈｉｓタグコード核酸、前記（ｘ）抗体候補コード核酸および前記（ｚ）アプタマーコード核酸が、この順序で配置されている場合、前記３’側の前記付加コード配列は、前記抗体候補コード核酸の翻訳を効率良く行うため、終止コドンを含まないことが好ましい。【0044】
本発明の第１の核酸構築物において、前記（ｚ）アプタマーコード核酸は、特に制限されず、前記タグに結合可能な核酸分子（アプタマー）をコードする核酸であればよい。前記アプタマーコード核酸がコードするアプタマーの具体例は、後述する。【0045】
本発明の第１の核酸構築物は、例えば、２つ以上のタグコード核酸を有してもよい。この場合、１つのタグコード核酸は、前述した、前記アプタマーが結合可能なタグのコード核酸である。このタグコード核酸を、以下、「主ペプチドタグコード核酸」といい、このコード核酸でコードされるタグを「主ペプチドタグ」という。前記主ペプチドタグおよび前記主ペプチドタグコード核酸は、前述のようなタグおよび前記コード核酸があげられ、好ましくは、前記Ｈｉｓタグと前記Ｈｉｓタグコード核酸である。他方、本発明の第１の核酸構築物において、前記主ペプチドタグコード核酸以外のタグコード核酸を、以下、「副ペプチドタグコード核酸」といい、このコード核酸でコードされるタグを「副ペプチドタグ」という。前記副ペプチドタグおよび前記副ペプチドタグコード核酸は、特に制限されず、例えば、Ｔ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒおよびＴ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒのコード配列があげられる。本発明の第１の核酸構築物が、前記主ペプチドタグコード配列と前記副ペプチドタグコード配列とを有する場合、本発明の第１の核酸構築物の転写および翻訳により、例えば、前記主ペプチドタグコード核酸、前記副ペプチドタグコード核酸、前記抗体候補コード核酸および前記アプタマーコード核酸を含む塩基配列の融合転写物と、前記主ペプチドタグ、前記副ペプチドタグおよび前記抗体候補を含む融合翻訳産物との複合体が形成される。前記副ペプチドタグコード核酸の位置は、特に制限されず、例えば、センス鎖において、前記主ペプチドタグコード核酸と隣接していることが好ましく、前記主ペプチドタグコード核酸の５’側および３’側のいずれに配置されてもよく、より好ましくは、前記主ペプチドタグコード核酸の３’側である。【0046】
具体例として、本発明の第１の核酸構築物は、例えば、前記主ペプチドタグコード核酸として、前記Ｈｉｓタグコード核酸を有する他に、さらに、前記副ペプチドタグコード核酸を有してもよい。この場合、本発明の第１の核酸構築物の転写および翻訳により、例えば、前記Ｈｉｓタグコード核酸、前記副ペプチドタグコード核酸、前記抗体候補コード核酸および前記アプタマーコード核酸を含む塩基配列の融合転写物と、前記Ｈｉｓタグ、前記副ペプチドタグおよび前記抗体候補を含む融合翻訳産物との複合体が形成される。前記副ペプチドタグは、例えば、Ｔ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒが好ましく、本発明の第１の核酸構築物は、前記副ペプチドタグコード核酸として、Ｔ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒのコード配列を有することが好ましい。前記副ペプチドタグコード核酸の位置は、特に制限されず、例えば、センス鎖において、前記Ｈｉｓタグコード核酸と隣接していることが好ましく、前記Ｈｉｓタグコード核酸の５’側および３’側のいずれに配置されてもよく、より好ましくは、前記Ｈｉｓタグコード核酸の３’側である。【0047】
本発明の第１の核酸構築物は、例えば、さらに、リンカーをコードする配列（以下、「リンカーコード配列」という）を有してもよい。前記リンカーは、例えば、１個のアミノ酸残基でもよいし、２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドでもよい。前記リンカーコード配列の位置は、特に制限されず、例えば、前記ペプチドタグコード核酸と、前記抗体候補コード核酸または前記アプタマーコード核酸との間、前記抗体候補コード核酸と前記アプタマーコード核酸との間等があげられる。【0048】
本発明の第１の核酸構築物を用いて転写および翻訳を行った際、前述のように、転写により生成される前記アプタマーコード核酸の転写産物（ＲＮＡアプタマー）は、その配列情報に基づいて、ペプチドに翻訳されないことが望ましい。そこで、本発明の第１の核酸構築物は、例えば、さらに、前記アプタマーの翻訳を防止するための配列を有することが好ましい。前記アプタマーの翻訳防止用の配列は、例えば、前述のような終止コドンがあげられる。前記アプタマーの翻訳防止用の配列は、例えば、センス鎖において、前記タグコード核酸および前記抗体候補の３’側に前記アプタマーコード核酸が配置されている場合、前記両者と前記アプタマーコード核酸との間に、配置されていることが好ましい。【0049】
本発明の第１の核酸構築物は、例えば、その構成単位は、特に制限されない。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の第１の核酸構築物は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基とリボヌクレオチド残基のいずれか一方から構成されてもよいし、両方を含んでもよい。本発明の第１の核酸構築物は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡまたはデオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡであることが好ましい。【0050】
本発明の第１の核酸構築物は、例えば、修飾化ヌクレオチド残基を含んでもよい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、糖残基が修飾されているものがあげられる。前記糖残基は、例えば、リボース残基およびデオキシリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、２’−メチルピリミジン残基、２’−フルオロピリミジン等があげられ、具体例として、２’−メチルウラシル（２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基）、２’−メチルシトシン（２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基）、２’−フルオロウラシル（２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基）、２’−フルオロシトシン（２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基）、２’−アミノウラシル（２’−アミノ化−ウラシル−ヌクレオチド残基）、２’−アミノシトシン（２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基）、２’−チオウラシル（２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基）、２’−チオシトシン（２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基）等があげられる。【0051】
前記ヌクレオチド残基における塩基は、例えば、天然塩基（非人工塩基）でもよいし、非天然塩基（人工塩基）でもよい。前記天然塩基は、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕおよびこれらの修飾塩基があげられる。前記非天然塩基は、例えば、修飾塩基および改変塩基等があげられ、前記天然塩基と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）またはウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、２’−メチルウラシル、２’−メチルシトシン、２’−フルオロウラシル、２’−フルオロシトシン、２’−アミノウラシル、２’−アミノシトシン、２’−チオウラシル、２’−チオシトシン等があげられる。本発明において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔおよびｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。【0052】
本発明の第１の核酸構築物は、例えば、前記構成単位として人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等があげられる。前記モノマー残基における塩基は、例えば、前述と同様である。【0053】
本発明の第１の核酸構築物は、例えば、ベクターが好ましい。前記ベクターを、以下、「発現ベクター」ともいう。前記発現ベクターは、例えば、ベクターの基本骨格に、前記抗体候補コード核酸、前記タグコード核酸および前記アプタマーコード核酸を挿入することで構築できる。前記ベクターの基本骨格は、特に制限されず、例えば、従来のベクターが使用できる。以下、前記ベクターの基本骨格を、「基本ベクター」という。前記基本ベクターが、例えば、前記抗体候補および前記タグコード核酸を有している場合、所望の部位に、前記アプタマーコード核酸を挿入することで、前記発現ベクターを構築できる。前記基本骨格となる基本ベクターは、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記プラスミドベクターは、例えば、ｐＣｏｌｄシリーズ（登録商標、タカラバイオ社）、ｐＥＴシリーズ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社他）、ｐＲＳＥＴシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐｃＤＮＡシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＥＦシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等の大腸菌由来プラスミドベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等の枯草菌由来のプラスミドベクター；ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等の酵母由来のプラスミドベクター等があげられる。また、前記ウイルスベクターは、例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等のλファージベクター；Ｍ１３ＫＥ、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ等の繊維状ファージベクター；Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔシリーズ等のＴ７ファージベクター；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等の動物ＤＮＡウイルスベクターまたはＲＮＡウイルスベクター；バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター；植物ウイルスベクター等があげられる。これらの基本ベクターの中でも、例えば、コールドショック発現系のベクターであるｐＣｏｌｄが好ましい。このようなベクターによれば、例えば、大腸菌等の生細胞中で発現されるペプチドの不溶化を防止して、可溶化を促進できるため、発現したペプチドの回収が容易になる。【0054】
本発明の第１の核酸構築物は、例えば、前記融合翻訳物が効率良く発現するように、Ｔ７プロモーター、コールドショック発現プロモーター（ｃｓｐＡプロモーター）、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター等のプロモーターを有することが好ましい。この他にも、例えば、ターミネーター；エンハンサー等のシスエレメント；ポリアデニル化シグナル；複製起点配列（ｏｒｉ）；選択マーカー；ＳＤ配列、ＫＯＺＡＫ配列等のリボソーム結合配列；サプレッサー配列等を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等があげられる。【0055】
本発明の第１の核酸構築物において、前記アプタマーコード核酸の配列は、前述のように、前記タグに結合可能な前記アプタマーをコードする核酸であればよい。以下に、前記アプタマーとして、前記Ｈｉｓタグアプタマーを例示するが、これには制限されない。【0056】
前記Ｈｉｓタグアプタマーは、前記Ｈｉｓタグに結合可能であればよく、その配列は、特に制限されない。前記Ｈｉｓタグアプタマーの解離定数は、特に制限されず、例えば、１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ以下である。一般的に、Ｈｉｓタグに対する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、１×１０−９ｍｏｌ／Ｌを超えることから、前記Ｈｉｓアプタマーは、例えば、抗体よりも優れた結合性を有している。前記Ｈｉｓタグアプタマーの解離定数は、好ましくは、５×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは、１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下である。このようなＨｉｓタグアプタマーを利用することによって、例えば、前記複合転写産物と前記複合翻訳産物との複合体を、非常に安定に形成できる。【0057】
前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、単独のＨｉｓタグに結合する他、Ｈｉｓタグを含む融合ペプチドに、前記Ｈｉｓタグを介して結合可能である。前記融合ペプチドは、例えば、Ｎ末端側にＨｉｓタグを含む融合ペプチド、Ｃ末端側にＨｉｓタグを含む融合ペプチド、内部にＨｉｓタグを含む融合ペプチド等があげられ、さらに、他のペプチド断片を含んでもよい。【0058】
前記Ｈｉｓタグアプタマーの具体例を以下に示す。本発明において、前記アプタマーは、これらの例には制限されない。以下に示す前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、解離定数が１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ以下のアプタマーであり、一般的な抗体よりも、Ｈｉｓタグに対して優れた結合性を有している。以下に示す配列は、前記Ｈｉｓタグアプタマーの配列である。前記Ｈｉｓタグアプタマーのコード核酸の配列は、例えば、以下のＨｉｓタグアプタマーの配列に対して、相補性を示す配列または同一性を示す配列であり、且つ、ＵがＴに代わった配列である。【0059】
前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことが好ましい。（ａ）配列番号１７で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド
ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ （配列番号１７）
ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１８で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド
ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１８）
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合するポリヌクレオチド
【0060】
前記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドは、前記塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。また、前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む核酸でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸でもよい。【0061】
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよいし、前記塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよい。配列番号１７の塩基配列を、以下、「結合モチーフ配列」ともいう。配列番号１７の結合モチーフ配列において、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ａ、Ｇ、ＣまたはＵが好ましく、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、ＵまたはＣが好ましく、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わし、Ｕ、ＣまたはＡが好ましい。前記結合モチーフ配列は、後述する配列番号１〜１６の塩基配列等に共通して見出されるコンセンサス配列である。前記結合モチーフ配列において、ＮｎにおけるＮの個数（ｎ）は、特に制限されず、例えば、１個（Ｎ）、２個（ＮＮ）または３個（ＮＮＮ）のいずれでもよく、Ｎは、それぞれ同じ塩基でもよいし、異なる塩基でもよい。前記結合モチーフ配列において、ＵｍにおけるＵの個数（ｍ）は、特に制限されず、例えば、１個（Ｕ）、２個（ＵＵ）または３個（ＵＵＵ）のいずれでもよい。【0062】
前記（ａ）において、前記結合モチーフ配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、下記（ａ１）〜（ａ４）のポリヌクレオチドがあげられる。【0063】
（ａ１）配列番号８９〜１０４のいずれかで表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド【0064】
前記（ａ１）において、前記配列番号で表わされる塩基配列は、それぞれ、前記結合モチーフ配列を有する。前記（ａ１）のポリヌクレオチドは、例えば、前記配列番号の塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ａ１）のポリヌクレオチドを含む核酸でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸でもよい。下記表１に、配列番号８９〜１０４で表わされる塩基配列を示す。下記表１において、下線部は、配列番号１７の結合モチーフ配列である。以下、下記表１におけるポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含むアプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。【0065】
【表1】
【0066】
前記（ａ１）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ａ１−１）のポリヌクレオチドがあげられる。（ａ１−１）配列番号１〜１６のいずれかで表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0067】
前記（ａ１−１）において、前記配列番号で表わされる塩基配列は、それぞれ、前記（ａ１）で述べた配列番号８９〜１０４の塩基配列を含む。前記（ａ１−１）のポリヌクレオチドは、例えば、前記配列番号の塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ａ１−１）のポリヌクレオチドを含む核酸でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸でもよい。下記表２に、配列番号１〜１６で表わされる塩基配列を示す。下記表２において、下線部が、配列番号１７の前記結合モチーフ配列である。以下、下記表２におけるポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含むアプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。【0068】
【表2】
【0069】
（ａ２）配列番号１０５〜１１４、配列番号１１６〜１２４および配列番号１２７〜１４６のいずれかで表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド【0070】
前記（ａ２）において、前記配列番号で表わされる塩基配列は、それぞれ、前記結合モチーフ配列を有する。前記（ａ２）のポリヌクレオチドは、例えば、前記配列番号の塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ａ２）のポリヌクレオチドを含む核酸でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸でもよい。下記表３および表４に、配列番号１０５〜１１４、配列番号１１６〜１２４、配列番号１２７〜１４６で表わされる塩基配列を示す。下記表３および表４において、下線部は、配列番号１７の前記結合モチーフ配列である。以下、下記表３および表４におけるポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含むアプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。【0071】
【表3】
【0072】
【表4】
【0073】
前記（ａ２）のポリヌクレオチドは、例えば、下記（ａ２−１）のポリヌクレオチドがあげられる。（ａ２−１）配列番号２６〜３５、配列番号３７〜４５、配列番号６５〜６８、配列番号１９〜２５および配列番号４８〜５６のいずれかで表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0074】
前記（ａ２−１）において、配列番号２６〜３５、配列番号３７〜４５、配列番号６５〜６８、配列番号１９〜２５および配列番号４８〜５６で表わされる塩基配列は、それぞれ、前述した配列番号１０５〜１１４、配列番号１１６〜１２４および配列番号１２７〜１４６で表わされる塩基配列を含む。前記（ａ２−１）のポリヌクレオチドは、例えば、前記配列番号の塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ａ２−１）のポリヌクレオチドを含む核酸でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸でもよい。下記表５および表６に、配列番号２６〜３５、配列番号３７〜４５、配列番号６５〜６８、配列番号１９〜２５および配列番号４８〜５６で表わされる塩基配列を示す。下記表５および表６において、下線部が、配列番号１７の前記結合モチーフ配列である。以下、下記表５および表６におけるポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含むアプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。【0075】
【表5】
【0076】
【表6】
【0077】
（ａ３）配列番号１４７で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチドＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１４７）
【0078】
配列番号１４７で表わされる塩基配列において、「ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ」は、配列番号１７の前記結合モチーフ配列である。また、配列番号１４７の塩基配列において、「ＧＧＨＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ」は、後述する配列番号１８で表わされる塩基配列（ここで、ＨはＣ）である。配列番号１８の塩基配列は、例えば、アプタマーにおいて、ステムループ構造を形成する領域の塩基配列であり、以下、「ステムループモチーフ配列」ともいう。配列番号１４７の塩基配列において、前記結合モチーフ配列の３’末端の３塩基と、前記ステムループモチーフ配列の５’末端の３塩基とは重複している。【0079】
前記（ａ３）のポリヌクレオチドは、例えば、前記配列番号の塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ａ３）のポリヌクレオチドを含む核酸でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸でもよい。【0080】
配列番号１４７の塩基配列は、例えば、配列番号１４８で表わされる塩基配列があげられる。ＧＧＵＡＵＡＵＵＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１４８）
【0081】
前記（ａ３）のポリヌクレオチドを含む核酸は、例えば、下記（ａ３−１）のポリヌクレオチドがあげられる。（ａ３−１）配列番号２、１２、１４、１５および５５のいずれかで表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0082】
前記（ａ３−１）において、前記配列番号で表わされる塩基配列は、それぞれ、前述した配列番号１４７、具体的には、配列番号１４８で表わされる塩基配列を含む。前記（ａ３−１）のポリヌクレオチドは、例えば、前記配列番号の塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ａ３−１）のポリヌクレオチドを含む核酸でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸でもよい。下記表７に、配列番号２、１２、１４、１５および５５で表わされる塩基配列を示す。下記表７において、下線部が、配列番号１７で表わされる塩基配列であり、四角で囲んだ領域が、配列番号１８で表わされる塩基配列である。また、この他に、配列番号１５７で表わされるアプタマーがあげられ、このアプタマーとＨｉｓタグとの解離定数は、例えば、約４×１０−１２Ｍである。ＧＧＵＡＵＡＵＵＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣＡＧＵＧＣＣ
（配列番号１５７）
【0083】
【表7】
【0084】
前記（ｂ）のポリヌクレオチドは、前述のように、前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能であるポリヌクレオチドである。【0085】
前記（ｂ）のポリヌクレオチドは、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよいし、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドを含む核酸でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸でもよい。【0086】
前記（ｂ）において、「（ａ）の塩基配列」とは、例えば、前述した配列番号１７の塩基配列の他、前記（ａ１）〜（ａ３）に示す各配列番号の塩基配列が該当する（以下、同様）。【0087】
前記（ｂ）において、「１または複数」は、特に制限されず、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、Ｈｉｓタグに結合可能であればよい。前記「１または複数」は、前記配列番号１７の塩基配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。また、「１または複数」は、前記（ａ１）〜（ａ３）の塩基配列において、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。また、「１または複数」は、前記（ａ）のポリヌクレオチドを含むアプタマーの全長塩基配列において、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。【0088】
置換、付加および／または挿入に使用する塩基は、特に制限されず、例えば、前述した各種塩基があげられる。また、塩基の置換、付加および／または挿入は、例えば、前記ヌクレオチド残基の置換、付加および／または挿入により行ってもよいし、前記人工核酸モノマー残基の置換、付加および／または挿入により行ってもよい。以下、同様である。【0089】
前記（ｂ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記表３および表５に示す塩基配列があげられる。具体例としては、例えば、配列番号１１５（＃７３６）または配列番号３６（＃７３６）で表わされる塩基配列があげられる。配列番号３６の塩基配列は、配列番号１１５の塩基配列を含む。また、例えば、配列番号１２５（＃７００９）および配列番号４６（＃７００９）で表わされる塩基配列があげられる。配列番号４６の塩基配列は、配列番号１２５の塩基配列を含む。前記表３および表５において、これらの塩基配列の二重下線部は、配列番号１７の前記結合モチーフ配列に対応し、四角で囲んだ塩基は、配列番号１７の塩基配列と異なる置換塩基である。また、例えば、配列番号１２６（＃７０６２）および配列番号４７（＃７０６２）で表わされる塩基配列があげられる。前記表３および表５において、これらの塩基配列の二重下線部は、配列番号１７の前記結合モチーフ配列に対応し、四角で囲んだ塩基（ＵＵ）のいずれか一方が、配列番号１７の前記結合モチーフ配列のＡとは異なる置換塩基である。また、例えば、配列番号１４３（＃ＡＴ５−５）および配列番号５３（＃ＡＴ５−５）で表わされる塩基配列があげられる。【0090】
前記（ｃ）のポリヌクレオチドは、前述のように、配列番号１８で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチドである。配列番号１８の塩基配列は、前述のように、例えば、前記アプタマーにおいて、ステムループ構造を形成する領域の塩基配列である。ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１８）
【0091】
前記前記（ｃ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよいし、前記塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよい。前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドを含む核酸でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸でもよい。【0092】
前記（ｃ）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列があげられる。これらの塩基配列は、前記表７に示す通りである。【0093】
前記（ｄ）のポリヌクレオチドは、前述のように、前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能であるポリヌクレオチドである。【0094】
前記（ｄ）のポリヌクレオチドは、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよいし、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ｄ）のポリヌクレオチドを含む核酸でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸でもよい。【0095】
前記（ｄ）において、「（ｃ）の塩基配列」とは、例えば、前述した配列番号１８の塩基配列の他、列挙した各配列番号の塩基配列が該当する（以下、同様）。【0096】
前記（ｄ）において、「１または複数」は、特に制限されず、前記（ｄ）のポリヌクレオチドが、Ｈｉｓタグに結合可能であればよい。前記「１または複数」は、配列番号１８の塩基配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。また、「１または複数」は、配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列において、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。また、「１または複数」は、前記（ｄ）のポリヌクレオチドを含むアプタマーの全長塩基配列において、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。前記（ｄ）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１８の塩基配列により形成されるステムループ構造と実質的に同一のステムループ構造を有することが好ましい。【0097】
前記（ｄ）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１３、配列番号６５〜６８、配列番号１６、配列番号５４および配列番号５６で表わされる塩基配列があげられる。これらの塩基配列を、前記表７に示す。前記表７に示す配列番号１３、配列番号６５〜６８、配列番号１６、配列番号５４および配列番号５６の塩基配列において、四角で囲んだ塩基が、配列番号１８のステムループモチーフ配列と比較して、同一部位であり、白抜きで示した塩基が、前記ステムループモチーフ配列と比較して、欠失または置換された部位である。前記表７において、欠失部位は、「−」で示す。前記（ｄ）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１８のステムループモチーフ配列において、７番目および１１番目のＵならびに１５番目のＡが保存されていることが好ましい。【0098】
前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、その他に、下記（ｅ）または（ｆ）のポリヌクレオチドを含む核酸でもよい。（ｅ）前記（ａ）または（ｃ）の塩基配列において、６０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能であるポリヌクレオチド
（ｆ）前記（ａ）または（ｃ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列またはその相補的塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能であるポリヌクレオチド
【0099】
前記（ｅ）および（ｆ）のポリヌクレオチドは、それぞれ、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよいし、前記塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ｅ）または（ｆ）のポリヌクレオチドを含む核酸でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸でもよい。【0100】
前記（ｅ）および（ｆ）において、「（ａ）の塩基配列」とは、例えば、前述した配列番号１７の塩基配列の他、前記（ａ１）〜（ａ３）に示す各配列番号の塩基配列が該当する（以下、同様）。前記（ｅ）および（ｆ）において、「（ｃ）の塩基配列」とは、例えば、前述した配列番号１８の塩基配列の他、列挙した各配列番号の塩基配列が該当する（以下、同様）。【0101】
前記（ｅ）において、前記同一性は、例えば、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。【0102】
前記（ｅ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８の塩基配列により形成されるステムループ構造と実質的に同一のステムループ構造を有することが好ましい。【0103】
前記（ｆ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」は、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。１×ＳＳＣは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムからなる。【0104】
前記（ｅ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８の塩基配列により形成されるステムループ構造と実質的に同一のステムループ構造を有することが好ましい。【0105】
前記（ｂ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）または（ｃ）のポリヌクレオチドの部分配列でもよく、前記（ａ）または（ｃ）のポリヌクレオチドにおける連続する５〜４０塩基長の配列が好ましく、より好ましくは８〜３０塩基長、特に好ましくは１０〜１２塩基長である。【0106】
前記Ｈｉｓタグアプタマーの一例として、図２に、アプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７０１（配列番号１）、＃７１６（配列番号３）、＃７１４（配列番号１０）および＃７４６（配列番号９）の予想される二次構造の模式図を示す。図２において、白抜きの黒四角で示された配列が、これらのコンセンサス配列であり、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。前記結合モチーフ配列は、図２において、ステムの折れ曲がった部分に位置する。本発明は、これには制限されない。【0107】
前記アプタマーの一例として、図３に、さらに、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７０１（配列番号１）、＃７１４（配列番号１０）および＃７４６（配列番号９）の予想される二次構造の模式図を示す。図３において、文字が白抜きの黒四角で示された配列が、配列番号１７で表わされるコンセンサス配列であり、前記コンセンサス配列は、ステムの折れ曲がった部分に位置する。本発明は、これには制限されない。【0108】
また、前記アプタマーは、例えば、前述の例示以外にも、例えば、ＳＥＬＥＸ法等により、調製することもできる。【0109】
＜スクリーニング方法＞本発明のスクリーニング方法は、前述のように、抗原に結合可能な抗体またはそのコード核酸をスクリーニングするスクリーニング方法であり、前記本発明の第１の核酸構築物を使用し、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）前記核酸構築物を発現させ、前記（ｘ）抗体候補のコード核酸、前記（ｙ）ペプチドタグのコード核酸、および前記（ｚ）核酸分子（アプタマー）のコード核酸から転写された融合転写産物と、前記（ｘ）抗体候補のコード核酸および前記（ｙ）ペプチドタグのコード核酸から翻訳された融合翻訳産物とのとの複合体を形成する工程
（Ｂ）前記複合体と抗原とを接触させる工程
（Ｃ）前記抗原に結合した前記複合体を回収する工程
【0110】
前記（Ａ）工程は、前記任意コード核酸が挿入された前記本発明の第１の核酸構築物を発現させる。これによって、前記抗体候補コード核酸、前記タグコード核酸および前記アプタマーコード核酸から、これらの融合転写物が転写され、さらに、前記抗体候補および前記タグを含む融合翻訳産物が翻訳される。そして、前記アプタマーは、前記タグに結合可能であることから、前記融合転写産物における前記アプタマーが、前記融合翻訳産物における前記タグと結合する。これによって、前記融合転写産物と、前記融合翻訳産物との複合体が形成される。本発明において形成される複合体は、例えば、ファージディスプレイ法と比較して、非常に小さい分子サイズで安定した複合体を形成できる。このため、例えば、後述する（Ｂ）工程において、前記複合体と前記抗原とが接触する確率をさらに増加でき、また、非特異的吸着をさらに抑制できると考えられる。【0111】
前記複合体は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成させる。この場合、例えば、生細胞等の細胞を使用し、これに前記核酸構築物を導入し、前記細胞内で前記核酸構築物の発現を行い、前記複合体を形成することが好ましい。前記細胞に前記核酸構築物を導入すると、例えば、前記細胞内で前記核酸物のクローンが増加し、各クローンから前記複合体が形成できる。また、例えば、無細胞タンパク質合成系等を使用して、前記核酸構築物の発現を行ってもよい。本発明においては、例えば、操作が簡易であることから、細胞を使用することが好ましい。【0112】
前記細胞の種類は、特に制限されず、例えば、種々の宿主があげられる。前記宿主は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属の細菌；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母があげられる。前記宿主は、例えば、ｔｒｘＢ／ｇｏｒ変異株である、Ｏｒｉｇａｍｉ（登録商標）（メルク社製）等も好ましい。また、前記宿主は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞；Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞等も使用できる。【0113】
前記宿主は、例えば、前記核酸構築物のベクターの種類に応じて適宜決定できる。前記宿主とベクターとの組み合わせは、特に制限されず、例えば、ペプチド（タンパク質の意味を含む）の発現誘導、トランスフェクションの効率等に優れるものが好ましい。具体例として、例えば、宿主は、大腸菌が好ましく、前記ベクターは、大腸菌由来のベクターが好ましく、さらに、低温での前記誘導が可能であることから、コールドショック発現系のベクターであるｐＣｏｌｄが好ましい。前記コールド発現系のベクターは、前述のように、例えば、大腸菌等の細胞中で発現されるペプチドの不溶化を防止して、可溶化を促進できるため、発現したペプチドの回収が容易である。また、ペプチドの不溶化は、例えば、ペプチドの封入体が形成されることが原因であるため、前記封入体を破壊して、ペプチドを取り出す必要がある。しかしながら、前記ベクターを用いれば、このような処理も不要であるため、例えば、前記封入体の破壊に伴う、前記複合体における前記融合転写産物と前記融合翻訳産物との結合の解離も十分に防止できる。また、前記コールドショック発現系のベクターは、例えば、低温での発現誘導により、宿主由来のペプチドの発現を抑制できるため、前記核酸構築物由来のペプチドを効率良く合成できる。【0114】
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏでの前記核酸構築物の発現は、例えば、前記細胞に、前記核酸構築物をトランスフェクションし、トランスフェクション後の前記細胞について、ペプチドの発現誘導を行うことで実現できる。【0115】
前記核酸構築物のトランスフェクションの方法は、特に制限されず、例えば、前記細胞の種類、前記ベクターの種類等によって、適宜設定できる。前記トランスフェクションの方法は、例えば、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、Ｈａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクター等を用いた感染導入法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、バクテリオファージ等を用いた感染導入法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等があげられる。【0116】
前記ペプチドの発現誘導の方法は、特に制限されず、例えば、前記トランスフェクション後の細胞の培養によって行うことができる。前記培養条件は、特に制限されず、前記細胞の種類、前記ベクターの種類等によって、適宜決定できる。具体例として、前記細胞が大腸菌の場合、培養条件は、例えば、培養温度２０〜４０℃、培養時間０．５〜６時間であることが好ましく、より好ましくは培養温度３０〜３７℃、培養時間１〜３時間である。使用する培地は、例えば、ＬＢ培地、ＮＺＹＭ培地、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地、ＳＯＢ培地、ＳＯＣ培地、２×ＹＴ培地等があげられる。【0117】
また、前記核酸構築物における前記基本ベクターがｐＣｏｌｄの場合、例えば、低温での発現誘導が可能である。このため、発現誘導時の培養条件は、例えば、培養温度４〜１８℃、培養時間１〜２４時間とすることが好ましく、より好ましくは培養温度１０〜１６℃、培養時間１２〜２４時間である。また、前記細胞および前記ベクターの種類に応じて、前記培養の際、適宜、発現を誘導する誘導物質を培地に添加してもよい。前記誘導物質は、特に制限されず、例えば、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−ガラクトシド）等があげられ、培地における前記誘導物質の濃度は、例えば、０．１〜２ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．５〜１ｍｍｏｌ／Ｌである。【0118】
前記宿主には、例えば、前記任意コード核酸の配列が異なる複数の前記核酸構築物を導入してもよい。具体例としては、例えば、それぞれ異なるランダムな任意コード核酸を有する、複数の核酸構築物を含むライブラリーを、前記細胞に導入してもよい。このように、前記核酸構築物のライブラリーを導入すれば、例えば、前記宿主内で、各核酸構築物のクローンが増加し、且つ、各核酸構築物に由来する異なる複数の前記複合体が形成される。したがって、複数の核酸構築物についてのスクリーニングが可能となるため、結果的に、抗原に結合する前記抗体候補のスクリーニング効率が、さらに向上する。【0119】
前記（Ｂ）工程は、前記（Ａ）工程で得られた前記複合体と、目的の抗原とを接触させる工程である。前記複合体は、前述のように、融合転写産物と融合翻訳産物との複合体であり、前記融合翻訳産物における任意ペプチドが前記抗原に結合可能であれば、例えば、前記抗原に、前記任意ペプチドを介して、前記複合体が結合する。【0120】
前記（Ａ）工程において、前記複合体を細胞内で形成させた場合、例えば、前記細胞の内部から前記複合体を回収して、前記抗原と接触させる。前記細胞からの前記複合体の回収方法は、何ら制限されず、前記細胞の種類に応じて適宜選択できる。【0121】
また、前記（Ａ）工程において、前記無細胞タンパク質合成系等を使用した場合、例えば、前記無細胞タンパク質合成系等から前記複合体を回収して、前記抗原と接触させる。【0122】
前記抗原の種類は、何ら制限されず、タンパク質等のペプチド、ホルモン、核酸、低分子化合物、有機化合物、無機化合物、糖類、脂質、ウイルス、細菌、細胞、生体組織等のいずれでもよい。前記抗原は、例えば、取扱いが容易であることから、固相に固定化された固定化ターゲットが好ましい。前記固相は、特に制限されず、例えば、ウェルプレート、マイクロプレート等のプレート、チップ、マイクロスフェア等のビーズ、ゲル、レジン、セルロース膜等のメンブレン、フィルム、試験管、マイクロチューブ、プラスチック容器、前記抗原を含む細胞、組織またはパラフィン固定切片、粒子等があげられる。【0123】
前記固相は、例えば、不溶性であることが好ましい。前記不溶性材料は、特に制限されず、例えば、有機樹脂材料、無機材料等があげられる。前記有機樹脂材料は、例えば、天然物でもよく、合成物でもよく、具体例としては、例えば、アガロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、ポリスチレン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ樹脂、ポリフッ化ビニル、ポリアミンメチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、６−ナイロン、６，６−ナイロン、ラテックス等があげられる。前記無機材料は、例えば、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂等があげられる。前記固相は、例えば、前記不溶性材料のいずれか一種類を含んでもよいし、二種類以上を含んでもよい。【0124】
前記固相が前記粒子の場合、例えば、磁性粒子が好ましい。前記固相が磁性粒子であれば、例えば、磁力によって、容易に前記磁性粒子を回収できる。【0125】
前記抗原は、例えば、前記固相に、直接結合してもよいし、間接的に結合してもよい。前記抗原の前記固相への固定化は、例えば、物理的な結合でも化学的な結合でもよく、具体例としては、例えば、吸着、共有結合等の化学結合等があげられる。【0126】
前記複合体と前記抗原との接触条件は、特に制限されず、例えば、前記抗原の種類に応じて適宜決定できる。前記接触条件は、例えば、温度４〜３７℃、ｐＨ４〜１０、時間１０分〜６０分が好ましく、より好ましくは、温度４〜２０℃、ｐＨ６〜９、時間１５〜３０分である。前記両者の接触は、例えば、溶媒中で行うことが好ましく、前記溶媒は、例えば、水性溶媒であり、具体例として、ＨＥＰＥＳ緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。【0127】
前記（Ｃ）工程は、前記抗原に結合した前記複合体を回収する工程である。前記複合体は、その融合翻訳産物における任意ペプチドを介して、前記抗原に結合している。したがって、前記抗原に結合した複合体を回収すれば、前記抗原に結合可能なペプチドならびに前記ペプチドのコード核酸を選択できる。【0128】
前記抗原に結合した複合体は、例えば、前記抗原に結合した状態で回収してもよいし、前記抗原から遊離させた状態で回収してもよい。【0129】
前記抗原に結合した前記複合体の回収は、例えば、前記抗原の洗浄により行える。このように、前記抗原の洗浄によって、例えば、前記抗原に結合しない複合体を除去し、前記抗原に結合した複合体のみを回収できる。この場合、前記抗原は、前述のように、前記固相に固定化されていることが好ましい。前記固相を洗浄することで、例えば、前記固相に固定化された前記抗原に未結合の複合体が除去される。そして、前記固相上には、固定化された前記抗原に結合した複合体が残るため、前記抗原に結合した状態で前記複合体を回収できる。前記固相は、特に制限されず、いわゆる基材があげられ、具体例として、プレート、シート、フィルム等の基板；ウェルプレート、チューブ等の容器；ビーズ、粒子、フィルター、ゲル等があげられる。【0130】
前記（Ｃ）工程は、例えば、さらに、前記抗原から、前記抗原に結合した複合体を遊離させる工程を含んでもよい。前記抗原からの前記複合体の遊離方法は、特に制限されない。【0131】
また、前記（Ｃ）工程は、例えば、さらに、前記複合体から、前記複合体を構成する前記融合転写産物を遊離させる工程を含んでもよい。前記融合転写物は、例えば、前記抗原から前記複合体を回収した後に遊離させてもよいし、前記抗原に結合した前記複合体から遊離させてもよい。前記複合体から前記融合転写産物を遊離させる方法は、何ら制限されず、例えば、フェノール等を含む溶出液が使用できる。前記フェノールを含む溶出液は、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（商品名、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等が使用できる。【0132】
本発明のスクリーニング方法は、さらに、下記（Ｄ）工程を含むことが好ましい。（Ｄ）前記複合体における前記融合転写物を鋳型として、前記抗体候補における任意ペプチドのコード核酸を合成する工程
【0133】
このように、さらに、前記抗原に結合した前記複合体における、前記融合転写物を鋳型として、具体的には、前記融合転写物における前記任意コード核酸の転写物を鋳型として、前記任意コード核酸を合成することにより、前記抗原に結合可能な任意ペプチドおよびそのコード核酸を同定できる。前記合成した前記任意コード核酸は、例えば、クローニングしてから、同定してもよい。前記任意コード核酸について、例えば、その塩基配列を同定すれば、間接的に、前記任意ペプチドのアミノ酸配列を同定できる。【0134】
前記（Ｄ）工程において、前記任意コード核酸の合成は、例えば、ＲＴ（Reverse Transcription）−ＰＣＲにより行うことが好ましい。具体的には、例えば、前記融合転写物（ＲＮＡ）を鋳型として、逆転写反応により前記任意コード核酸（ＤＮＡ）を合成し、さらに、合成した前記任意コード核酸を増幅することが好ましい。【0135】
前記任意コード核酸の合成は、例えば、前記任意コード核酸の転写産物が前記複合体に含まれる状態で行ってもよいし、前記複合体から前記融合転写産物を遊離させた状態で行ってもよい。【0136】
本発明のスクリーニング方法によれば、前述のように、例えば、前記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程により、前記抗原に結合可能な任意ペプチドおよびそのコード核酸を選択でき、さらに、前記（Ｄ）工程によって、前記任意ペプチドおよびそのコード核酸を同定できる。【0137】
また、本発明のスクリーニング方法によれば、前記抗原に結合可能な前記任意ペプチドおよびそのコード核酸の配列情報を同定できる。このため、これらの情報に基づいて、例えば、キメラ抗体、ヒト型抗体、ヒト化抗体等を構築することもできる。【0138】
また、本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記（Ｄ）工程で得られた前記任意コード核酸を用いて、前記任意ペプチドコード核酸が挿入された本発明の第１の核酸構築物を新たに調製し、再度、前記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程を実行することが好ましく、より好ましくは、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）工程を、繰り返し行うことが好ましい。繰り返しの回数は、特に制限されず、２回以上が好ましい。【0139】
前述のように、前記核酸構築物のライブラリーを前記細胞に導入すると、異なる核酸構築物が導入された複数の形質転換体（クローン）が得られる。そして、前記複数の形質転換体が混在する状態で培養を行うと、前記各形質転換体由来の複合体が混在する複合体ミックスが得られる。この複合体ミックスについて、前記（Ｂ）および（Ｃ）工程を実行すると、例えば、前記抗原に結合する複数の複合体が回収される。そこで、前記（Ｄ）工程において、前記（Ｃ）工程で回収した複数の複合体について、例えば、それぞれの前記任意コード核酸を合成する。そして、合成した前記任意コード核酸を用いて、前記任意コード核酸が挿入された、複数の核酸構築物のライブラリーを作製し、同様に、前記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程を実行することが好ましい。これによって、前記抗原に結合する任意ペプチドならびにそのコード核酸を、さらに濃縮して、前記抗原への結合能に優れる任意ペプチドならびにそのコード核酸を選択可能となる。前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）工程を１サイクルとした場合、サイクル数は、特に制限されず、例えば、２サイクル以上が好ましい。【0140】
また、前記核酸構築物のライブラリーを前記細胞に導入した場合、例えば、複数の形質転換体を、各クローンに分離し、または、数種のクローンを含む複数のグループに分離してから、前記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程、さらに、前記（Ｄ）工程を行ってもよい。前記クローンまたは前記グループへの分離は、例えば、１サイクルの段階で行ってもよいし、２サイクル以降の段階で行ってもよい。【0141】
このように分離されたクローンは、例えば、前記抗原に結合可能な試薬として、例えば、そのまま使用することも可能であり、また、前記クローンを用いて大量に前記複合体を合成し、前記タグを用いた精製により使用することもできる。【0142】
前記抗原に対する前記複合体の結合性の評価方法は、特に制限されない。具体例として、例えば、標識物質で標識化した標識抗タグ抗体を使用する方法があげられる。この方法では、例えば、前記抗原と前記複合体とが結合したものに、前記標識タグ抗体を接触させた後、前記標識抗タグ抗体の検出を行う。前記標識抗タグ抗体の検出によって、前記タグの有無が確認できる。すなわち、前記抗原に前記複合体が結合していれば、前記複合体におけるタグに前記標識抗タグ抗体が結合する。このため、前記標識抗タグ抗体の検出により、間接的に、前記抗原に前記複合体が結合していると判断できる。一方、前記抗原に前記複合体が結合していなければ、前記タグは存在しない。このため、前記標識抗タグ抗体を検出できず、前記抗原に複合体は結合していないと判断できる。前記標識抗タグ抗体の標識は、例えば、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等があげられ、前記ＨＲＰの検出試薬は、例えば、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）等の発色試薬があげられる。また、例えば、前記抗原の分子量が増加しているか否かによって、複合体の結合を確認することもできる。【0143】
本発明のスクリーニング方法において、前記結合性の評価は、例えば、前記（Ｃ）工程において行ってもよいし、前記抗体候補および前記候補コード核酸を選択した後に、行ってもよい。【0144】
以下に、本発明のスクリーニング方法の一例について、図１を用いて説明する。図１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体を形成させたスクリーニング方法の概略を示す模式図である。この例において、本発明の第１の核酸構築物は、ベクターとし、前記タグは、前記Ｈｉｓタグとした。【0145】
まず、図１（Ａ）に示すように、前記Ｈｉｓタグコード核酸（Ｈ）と前記アプタマーコード核酸（Ａ）とを有するベクターに、前記任意コード核酸が挿入された可変領域コード核酸（以下、ランダムＤＮＡという）を挿入して、組換えベクターを作製する（図１（Ｂ））。この際、Ｈｉｓタグコード核酸（Ｈ）と、ランダムＤＮＡとは、正しい読み枠となるように配置される。【0146】
そして、前記組換えベクターを宿主に導入して、形質転換を行う（図１（Ｃ））。続いて、得られた形質転換体を増幅させ（図１（Ｄ））、さらに、ペプチドの発現誘導を行う（図１（Ｅ））。図１（Ｅ）に示すように、発現誘導によって、まず、前記組換えベクターにおける前記Ｈｉｓタグコード核酸（Ｈ）と前記ランダムＤＮＡと前記アプタマーコード核酸（Ａ）とから、それぞれの転写産物を含む融合転写産物（融合ｍＲＮＡ）が形成される。さらに、前記融合転写産物に基づいて、前記Ｈｉｓタグと前記ランダムＤＮＡがコードするランダムペプチドとを含む融合翻訳産物（融合ペプチド：Ｈｉｓ−ｐｅｐ）が形成される。そして、前記融合ｍＲＮＡにおけるＲＮＡアプタマーは、前記Ｈｉｓタグに結合可能であることから、図１（Ｆ）に示すように、前記融合ｍＲＮＡにおけるＲＮＡアプタマーが、前記融合ペプチドにおけるＨｉｓタグに結合し、複合体が形成される。【0147】
続いて、前記形質転換体の内部から、前記複合体およびその他のタンパク質を取り出し、固相に固定化した抗原と接触させる。その結果、前記複合体における前記ランダムペプチドが前記抗原に結合可能であれば、前記ランダムペプチドを介して、前記複合体が、前記固定化抗原に結合する（図１（Ｇ））。ここで、前記固定化抗原に結合した前記ランダムペプチドには、Ｈｉｓタグが結合しており、前記Ｈｉｓタグには、前記アプタマーを介して、前記融合ｍＲＮＡが結合している。この融合ｍＲＮＡにおける前記ランダムＤＮＡの転写産物は、前記固定化抗原に結合したランダムペプチドをコードするｍＲＮＡである。したがって、前記固定化抗原に結合した前記複合体における前記融合転写産物（図１（Ｈ））を選択することにより、前記固定化抗原に結合するランダムペプチドならびにそのコード核酸の情報を得ることができる。【0148】
具体的には、前記複合体における前記融合転写産物を鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ランダムＤＮＡのｍＲＮＡに基づきｃＤＮＡを合成する（図１（Ｉ））。これによって、前記抗原に結合可能なペプチドのコード核酸の塩基配列、ならびに、前記ペプチドのアミノ酸配列の情報が得られる。また、ＲＴ−ＰＣＲにより得られるｃＤＮＡを、再度、前記ベクターに導入して（図１（Ａ））、一連の処理を繰り返すことによって、前記抗原に結合可能なペプチドのコード核酸を、さらに選択できる。【0149】
つぎに、本発明のスクリーニング方法について、前記細胞が大腸菌であり、前記核酸構築物として、ランダムＤＮＡを有するプラスミドライブラリーを導入して、スクリーニングを行う一例をあげて説明する。なお、以下の方法は、あくまでも一例であって、本発明は、これには制限されない。【0150】
まず、プラスミドライブラリーをエレクトロポレーション等により大腸菌に導入し、振盪培養する。前記培養の培地は、例えば、アンピシリンを含むＬＢ培地があげられる。前記大腸菌の培養は、例えば、ＯＤ６００ｎｍの吸光度が０．５〜０．６になるまで行うことが好ましい。そして、前記プラスミドライブラリーのベクターが、前記コールドショック発現系のベクターの場合は、例えば、１５℃で１８時間、０．５〜１ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ存在下で、コールドショック発現誘導を行うことが好ましい。【0151】
つぎに、培養した大腸菌を遠心により集菌し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む生理食塩水５０ｍＬに懸濁して、再度、遠心により集菌する。回収した大腸菌を、２０％スクロース、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液５ｍＬに懸濁し、１０ｍｇのリゾチームを加え、氷上で１時間インキュベートすることにより、細胞壁を溶解する。続いて、終濃度２ｍｍｏｌ／ＬになるようにＭｇ２＋を加え、遠心により、集菌する。そして、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウムを含む生理食塩水５０ｍＬに懸濁し、再度、遠心することにより、スフェロプラストを回収する。【0152】
前記回収したスフェロプラストを、０．０５〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ、０．１％ ＨＳＡまたはＢＳＡ（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ）、プロテアーゼインヒビターを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液２．５〜５ｍＬに速やかに懸濁し、溶菌させた後、機械的剪断、またはＤＮａｓｅ Ｉにより、大腸菌のゲノムＤＮＡを細断する。そして、終濃度１５０ｍｍｏｌ／ＬになるようにＮａＣｌを加えて５分放置し、遠心により、前記複合体を含む上清を得る。前記上清は、例えば、ターゲットに対する結合の評価を行うまで、例えば、−８０℃で保管できる。【0153】
前記複合体を含む上清を、抗原に接触させ、４℃で１０〜３０分間インキュベートする。前記抗原は、前述のように、前記固相に固定化されていることが好ましい。前記抗原が固定化された固相は、特に制限されず、例えば、前記抗原が固定されたゲル、前記抗原が固定されたプラスチック容器、または、前記抗原を含む細胞または組織があげられる。前記抗原が固定化された固相は、例えば、前記溶菌の際に添加したのと同じ、ＨＳＡまたはＢＳＡにより、予めブロックキングしておくことが好ましい。【0154】
続いて、前記固相を洗浄液により洗浄して、前記抗原に未結合の複合体を除去する。前記洗浄液は、例えば、０．０５〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム、１００〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液があげられる。【0155】
つぎに、前記固相に固定化された前記抗原から、前記溶出液により、前記複合体を遊離して回収する。前記溶出液は、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｉｓｏｇｅｎ（Ｗａｋｏ社）、８ｍｏｌ／Ｌ ｕｒｅａ、６ｍｏｌ／Ｌ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ、１％ ＳＤＳ等の変性剤を含む緩衝液、前記変性剤の他に、さらに、例えば、０．０５〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００、１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む緩衝液があげられる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液があげられる。【0156】
つぎに、得られた複合体から、融合転写産物（ＲＮＡ）を精製する。前記ＲＮＡの精製は、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（商品名、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等が使用できる。また、エタノール沈澱の場合は、例えば、ｔＲＮＡ、グリコーゲン、Ｅｔｈａｔｉｎｍａｔｅ（商品名、Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社）等の沈殿補助剤を使用することが好ましい。前記ＲＮＡの精製においては、例えば、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅのＤＮａｓｅを用いて、３７℃で３０分間インキュベートしてから、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行うのが好ましい。【0157】
続いて、精製したＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡは、例えば、相補的な二本鎖を形成させるために、さらに、ＰＣＲを行うことが好ましい。任意コード核酸として複数のランダムＤＮＡを使用した場合、例えば、前記ＲＴ−ＰＣＲによって、前記任意コード核酸における５’側領域と３’側領域とが共通し、中間領域の配列が異なる複数のｃＤＮＡが合成され、ヘテロの二本鎖ｃＤＮＡが形成される場合がある。そこで、ＲＴ−ＰＣＲにより合成したｃＤＮＡについて、さらに、ＰＣＲを行うことによって、相補鎖を伸長し、相補的な二本鎖ｃＤＮＡを増幅することが好ましい。前記相補的な二本鎖ｃＤＮＡを増幅する方法は、特に制限されず、例えば、前記ＲＴ−ＰＣＲの反応液に、さらに、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを添加し、熱変性の後、アニーリング反応および伸長反応を繰り返し行うことで実行できる。前記反応液に添加するプライマーの量は、特に制限されず、例えば、各プライマーを、終濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましい。また、熱変性は、例えば、９５℃で３０秒処理した後、９４℃で３分間処理することが好ましく、アニーリング反応は、例えば、６３．２℃で３分間、伸長反応は、例えば、７２℃で３分間であり、前記アニーリング反応と前記伸長反応を、例えば、５回繰り返すことが好ましい。このようにして、相補的な二本鎖ｃＤＮＡを得ることができる。【0158】
得られた二本鎖ｃＤＮＡは、再度、前述したプラスミド等のベクターに挿入して、前述した一連の工程を繰り返し行うことが好ましい。これによって、抗原に結合可能な任意プラスミドを、さらに選択できる。【0159】
また、選択効率を向上させるため、例えば、大腸菌に、前記核酸構築物を導入した後、前記大腸菌を、マルチウェルプレートに分注し、クローンの限定を行ってもよい。具体的には、前記プレート内で前記大腸菌の増殖を行い、培養した大腸菌の一部を保存した後、発現誘導と溶菌を行う。前記溶菌は、例えば、前記プレートにおいて、大腸菌を集菌した後、０．０５〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍＬ リゾチームおよび１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液を加えることによって行える。このようにして調製した溶菌液を、前記抗原を固定したプレートに添加して、前記溶菌液中の複合体と、前記抗原とを結合させる。その後、前記プレートを、０．０５〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００および１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した後、前記抗原に結合した複合体を、前述のように、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓタグ抗体等を用いて検出する。これによって、前記抗原に結合する複合体を形成するクローンを多く含むウェルを特定する。そして、予め保存した大腸菌から、対応するウェルのものを選択して増殖させ、引き続き、一連の処理により、選択を行う。【0160】
＜第２の核酸構築物＞本発明の第２の核酸構築物は、前記任意コード核酸が挿入可能な核酸構築物であり、例えば、実験者が設定した前記任意コード核酸を挿入することによって、前記本発明の第１の核酸構築物を調製可能である。すなわち、本発明の第２の核酸構築物は、抗体候補を発現するための核酸構築物であって、下記（ｘ’）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸を有し、前記（ｘ’）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸は、前記（ｘ’）、（ｙ）および（ｚ）のコード核酸が、融合転写物として転写され、前記（ｘ’）および（ｙ）のコード核酸が、融合翻訳産物として翻訳されるように連結されていることを特徴とする。
（ｘ’）任意ペプチドのコード核酸が挿入可能な、抗体の可変領域のコード核酸
（ｙ）ペプチドタグのコード核酸
（ｚ）前記ペプチドタグに結合可能なアプタマーのコード核酸
【0161】
本発明の第２の核酸構築物は、前記（ｘ’）のコード核酸に、前記任意コード核酸が挿入可能であればよく、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の第２核酸構築物は、特に示さない限り、前記第１の核酸構築物と同様であり、その記載を援用できる。【0162】
本発明の第２の核酸構築物において、前記可変領域およびそのコード核酸は、前記第１の核酸構築物の記載を援用できる。【0163】
前記（ｘ’）コード核酸は、例えば、前記可変領域コード核酸そのものでもよいし、部分的に欠失した可変領域コード核酸でもよい。前者の場合、前記任意コード核酸は、例えば、前記（ｘ’）可変領域コード核酸の末端および／または内部に、付加により挿入されてもよい。また、前記任意コード核酸は、例えば、前記（ｘ’）可変領域コード核酸において、少なくとも一部の領域を欠失させ、その欠失部位に、挿入してもよい（置換）。他方、後者の場合、前記任意コード核酸は、例えば、前記（ｘ’）可変領域コード核酸の欠失部位に、付加により挿入してもよい。このようにして、本発明の第２の核酸構築物に前記任意コード核酸を挿入することで、前記第１の核酸構築物を調製できる。【0164】
＜スクリーニング用キット＞本発明のスクリーニング用キットは、前記本発明のスクリーニング方法に使用するためのキットであり、本発明の第２の核酸構築物を含むことを特徴とする。本発明のスクリーニング用キットは、本発明の第２の核酸構築物を含むことが特徴であって、その他の構成等は、何ら制限されない。本発明のスクリーニング用キットは、例えば、本発明の第１の核酸構築物を含んでもよい。
【0165】
本発明のキットは、さらに、前記核酸構築物を導入するための生細胞を含んでもよい。また、本発明の各キットは、例えば、前記核酸構築物を生細胞に導入するための試薬、使用説明書等を含んでもよい。【実施例】
【0166】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。【0167】
（実施例１）タグペプチドとＶＨＨとの融合タンパク質（ＨＴＸ−ＶＨＨ）を発現し、前記タグに対するアプタマーが前記融合タンパク質に結合する、プラスミドベクターを構築した。
【0168】
（１）ＶＨＨ人工遺伝子ラマ由来ＶＨＨのアミノ酸配列に基づいて、以下に示すＣＤＲ３領域を含まないＶＨＨ人工遺伝子（配列番号５７）を合成した。
【0169】
【表8】
【0170】
前記配列において、５’側の二重下線部が、ＣＤＲ１のコード核酸配列（ACCTTCAGTAGCTATGGCATGGGC：配列番号５８）であり、３’側の二重下線部が、ＣＤＲ２のコード核酸配列（TTCGTCGCAGCGATCAGCTGGTCTGGCGGTTCCACCTAC：配列番号５９）である。また、３’側の一重下線部は、上流側がＰｓｔＩの認識部位、下流側がＮｏｔＩの認識部位であり、この認識部位の間に、後述するようにして、ランダム配列を挿入する。また、５’末端からの一重下線部の配列は、ｐＲＳＥＴ（商品名、インビトロジェン社）由来のＨＴＸタグのコードＤＮＡである。前記ＨＴＸタグは、Ｈｉｓタグ、ＴタグおよびＸｐｒｅｓｓタグが連結されたタグペプチドである。ＨｉｓタグのコードＤＮＡは、連続した６個のＨｉｓを含むＨｉｓタグ（ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧ：配列番号６０）のコードＤＮＡ（ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGT：配列番号６１）である。前記ＴタグコードＤＮＡは、１０アミノ酸残基のＴ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒを含むペプチドタグ（ＭＡＳＭＴＧＧＧＧＭＧ：配列番号６２）のコードＤＮＡ（ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGT：配列番号６３）である。前記ＸｐｒｅｓｓタグコードＤＮＡは、１４アミノ酸残基のＸｐｒｅｓｓＴＭＥｐｉｔｏｐｅ（ＲＤＬＹＤＤＤＤＫＤＲＷＧＳ：配列番号６４）のコードＤＮＡ（CGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCGATGGGGATCC：配列番号１５５）である。【0171】
（２）ＶＨＨ人工遺伝子を含むプラスミドベクターの構築前記Ｈｉｓタグに結合可能なアプタマーのコードＤＮＡを異なる部位に挿入した、３種類のプラスミドベクターを構築した。
【0172】
（２−１）ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ１ｐＣｏｌｄ（登録商標）４ベクター（商品名、タカラバイオ社）のＮｄｅＩ−ＸｂａＩに、配列番号１５６で表わされるＤＮＡを挿入した。なお、下記配列において、３’側の二重下線部のＴは、挿入時にＴからＡに置換された。下記配列において、大文字領域は、前記ＶＨＨ人工遺伝子であり、一重下線部は、配列番号１５７のアプタマーのコードＤＮＡ(配列番号１５８)であり、配列番号１０２のｓｈｏｔ４７ｓｓｓのコードＤＮＡを含む。下記配列において、四角で囲んだ領域は、制限酵素認識部位であり、上流側がＰｓｔＩ、下流側がＮｏｔＩである。このようにして得られたベクターを、ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ１という。
【0173】
【表9】
【0174】
（２−２）ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ３ｐＣｏｌｄ（登録商標）４ベクター（商品名、タカラバイオ社）のＮｄｅＩ−ＣｌａＩに、配列番号６９で表わされるＤＮＡを挿入した。下記配列において、大文字領域は、前記ＶＨＨ人工遺伝子であり、一重下線部は、アプタマーコードＤＮＡである。下記配列において、四角で囲んだ領域は、制限酵素認識部位であり、上流側がＰｓｔＩ、下流側がＮｏｔＩである。このようにして得られたベクターを、ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ３という。
【0175】
【表10】
【0176】
（２−３）ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ４ｐＣｏｌｄ（登録商標）４ベクター（商品名、タカラバイオ社）のＮｈｅＩ−ＸｂａＩに、配列番号７０で表わされるＤＮＡを挿入した。なお、下記配列において、５’末端から６番目の二重下線部のＣは、挿入時にＣからＴに置換された。下記配列において、一重下線部は、アプタマーコードＤＮＡ、大文字領域は前記ＶＨＨ人工遺伝子である。下記配列において、四角で囲んだ領域は、制限酵素認識部位であり、上流側がＰｓｔＩ、下流側がＮｏｔＩである。このようにして得られたベクターを、ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ４という。
【0177】
【表11】
【0178】
前記３種類のプラスミドベクターの概略を、図４の模式図に示す。前記ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄ ｖ１は、ＶＨＨ遺伝子の下流であって、且つ、ターミネーターの上流に、前記アプタマーＤＮＡを挿入した。前記ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄ ｖ３は、ＶＨＨ遺伝子の下流であって、ターミネーターの領域内に、前記アプタマーＤＮＡを挿入した。前記ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄ ｖ４は、ＨＴＸタグのコードＤＮＡの上流に、前記アプタマーＤＮＡを挿入した。【0179】
（３）ライブラリーベクターの作製図５にＶＨＨの構成の概略を示す。図５に示すように、ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を有する。そこで、前記「２．」で作製した各プラスミドベクターについて、ＶＨＨのＣＤＲ３領域のコードＤＮＡ内をランダム配列に置換して、ランダム配列を有するライブラリーベクターを作製した。
【0180】
（３−１）ライブラリー用インサートまず、ランダム領域（下線部）を含むオリゴヌクレオチドＡ１（配列番号７１）およびオリゴヌクレオチドＡ２（配列番号７２）、ならびに、相補鎖のオリゴヌクレオチドＢ１（配列番号７３）およびオリゴヌクレオチドＢ２（配列番号７４）を、それぞれ合成した。下記配列において、Ｖは、Ａ、ＣまたはＧ、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ、Ｋは、ＧまたはＴとした。コドンをＶＮＫとすることで、停止コドン、Ｃｙｓ残基、疎水性の高いＰｈｅ残基、Ｔｒｐ残基の出現を抑制し、残りのアミノ酸の出現確率を比較的均等にした。なお、下記オリゴヌクレオチドＡ１およびオリゴヌクレオチドＡ２は、それぞれ四角で囲んだ部位に、チロシンのコドンを設定した。
【0181】
【表12】
【0182】
５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＡ１、５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＡ２、および、１０００ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＢ１またはＢ２を混合し、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社）を用いて、計１００μＬの反応液を調製した。前記反応液を、９８℃で３０秒加熱した後、６０℃ １分および７２℃ １分を１サイクルとして、５サイクル繰り返した。前記反応液から、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、５０ ｕｎｉｔｓのｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社）で３７℃ ７時間処理し、一本鎖ＤＮＡを消化した。前記回収したＤＮＡを、フェノール・クロロフォルム抽出した後、エタノール沈殿した。得られた二本鎖ＤＮＡを、３０ ｕｎｉｔｓのＰｓｔＩおよび３０ ｕｎｉｔｓのＮｏｔＩで、３７℃ １８時間消化した。消化断片を、３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、電気泳動により分離し、１００ ｂｐ付近のバンドを切り出し、ＡｇａｒＡＣＥ ｅｎｚｙｍｅ（商品名、プロメガ社）を用いてＤＮＡ抽出した。抽出したＤＮＡについて、さらに、フェノール抽出、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行った。得られたＤＮＡを、そのまま、または、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）（商品名、タカラバイオ社）を用いた酵素処理、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、ライブラリー用インサートとした。【0183】
（３−２）ライブラリー用ベクター前記「２．」で作製したプラスミドベクター（ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ１、ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ３、またはＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ４）２０μｇを、３０ ｕｎｉｔｓのＰｓｔＩにより、３７℃で８時間処理した後、３０ ｕｎｉｔｓのＮｏｔＩを加えて、さらに３７℃で１８時間消化した。消化断片を、３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、電気泳動により分離し、５０００ｂｐ付近のバンドを切り出し、ＡｇａｒＡＣＥ ｅｎｚｙｍｅ（商品名、プロメガ社）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡについて、さらに、フェノール抽出、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ断片を、ライブラリー用ベクターとした。以下、ランダム領域を含む前記オリゴヌクレオチドを未挿入のベクターを、「ライブラリー用ベクター」といい、前記オリゴヌクレオチドを挿入したベクターを、「ライブラリーベクター」という。
【0184】
（３−３）ライブラリー用ベクターへのライブラリー用インサートの挿入ライブラリー用インサート０．２μｇおよび前記ライブラリー用ベクター１μｇを混合し、１７５０ｕｎｉｔｓのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、１４℃で１８時間ライゲーション反応を行った。前記反応は、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、７ｍｍｏｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ジチオスレイトール、１ｍｍｏｌ／Ｌ スペルミジン、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌおよび６ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２を含む、６ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）中で行った。これにより、前記ライブラリー用ベクターに前記ライブラリー用インサートを挿入し、ランダム領域が挿入されたライブラリーベクターを構築した。
【0185】
前記反応液に、１０μｇのｔＲＮＡ（パン酵母由来、シグマ社）を添加し、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＴＥ １０μＬに溶解した。得られた溶液全量を、大腸菌に混合し、トランスフォームを行った。前記トランスフォームは、大腸菌として、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α Ｅｌｅｃｔｏｒｏ−ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社）１００μＬを使用し、エレクトロポレーター（ＢＲＬライフテクノロジー社）を用いて、３８０Ｖ、４ｋΩ／３３０μＦの条件で行った。トランスフォームした前記大腸菌を、ＳＯＣ ６ｍＬに懸濁し、３７℃で１時間振盪培養した後、少量を採取し、ライブラリーの複雑度を測定した。残りの培養液に、終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１４ｍＬのＬＢを加え、３７℃で５時間振盪培養した。得られた培養液を４ｍＬに分け、０．２８ｍＬのＤＭＳＯを加えて混合した後、速やかに液体窒素にて凍結し、−８０℃で保存した。なお、この方法１回あたりのライブラリーの複雑度は、５×１０６〜１０×１０６ｃｆｕであった。【0186】
（４）ライブラリーベクターの選択（４−１）タンパク質の発現
前記「３．」で作製した、各種ライブラリーベクターをトランスフォームした凍結大腸菌のライブラリーを、終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む４６ｍＬのＬＢで、急速に溶解し、６００ｎｍの吸光度が０．５となるまで、３７℃で振盪培養した。得られた培養液を１０℃で３０分冷却し、終濃度０．５ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧを加え、１０℃で１８時間振盪培養した。得られた培養液を、６，５００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、回収した菌体を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む生理食塩水５０ｍＬに懸濁した後、６，５００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、菌体を洗浄した。前記菌体を２０％スクロースおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）５ｍＬに懸濁し、０．１ｇ／ｍＬの卵白リゾチーム（シグマ社）を１００μＬ加えて撹拌し、氷上で１時間処理した。さらに、１ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２を含む１ｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウムを５μＬ加え、６，５００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、スフェロプラストを回収した。回収したスフェロプラストを、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウムおよび０．９％ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）５０ｍＬに懸濁し、氷上で５分静置後、遠心して洗浄した。前記洗浄後のスフェロプラストの沈殿に、溶菌試薬を添加し、４℃で激しく撹拌して、溶菌させた。前記溶菌試薬は、１００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ（パン酵母由来、シグマ社）、０．１％ ヒト血清アルブミン（シグマ社）、５０ｕｎｉｔｓ ＲＮａｓｅ Ａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）、２１０ｕｎｉｔｓ ＤＮａｓｅ Ｉ（インビトロジェン社）、１／６ピースのｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔｓ（ロシュ社）、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００および０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）２ｍＬを使用した。前記溶菌液を、２７ゲージの注射針をセットしたシリンジで吸引排出し、スフェロプラストの破壊促進およびゲノムＤＮＡの剪断を行った後、氷上で５分静置し、１７，０００×ｇで１０分間遠心して、上清を回収した。
【0187】
（４−２）タンパク質発現量の測定ＨＴＸ−ＶＨＨタンパク質の発現量を、以下に示すサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。前記サンドイッチＥＬＩＳＡの概略図を、図６（Ａ）に示す。図６（Ａ）に示すように、ＨＴＸ-ＨＶＶタンパク質を、固定化した抗ラマＩｇＧ抗体でトラップし、さらに、前記ＨＴＸ−ＨＶＶタンパク質におけるＨｉｓタグに、標識抗Ｈｉｓタグ抗体を結合させることで、前記ＨＴＸ−ＨＶＶタンパク質の発現量を測定できる。
【0188】
まず、９６穴プレート（旭硝子社）に、５μｇ／ｍＬのヤギ抗ラマＩｇＧ抗体を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１ウェルあたり８０μＬ加え、室温で３時間静置して、前記抗体を吸着させた。その後、前記ウェルを、１％ ヒト血清アルブミン（シグマ社）および０．９％ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）２００μＬでブロッキングした。他方、陰性コントロールとして、ブロッキングのみを行ったウェルを用意した。これらのウェルに、前記「４．」で得られた、各種ライブラリーベクターを使用した大腸菌のライブラリーの溶菌液を、２００μＬ加え、４℃で１時間培養した。前記ウェルを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０および０．９％ ＮａＣｌを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．６）で４回洗浄し、１／２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗Ｈｉｓタグ抗体（キアゲン社）、０．２％ ウシ血清アルブミンおよび０．９％ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液（ｐＨ７．６）を加え、室温で１時間反応させた。前記ウェルを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０および０．９％ＮａＣｌを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．６）で４回洗浄し、１ Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（商品名、サーモサイエンティフィック社）を加えて発色反応を行い、硫酸で反応を停止した後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【0189】
この結果を、図６（Ｂ）に示す。図６（Ｂ）は、ＨＴＸ−ＶＨＨタンパク質の発現量を示すグラフである。図６（Ｂ）に示すように、いずれのライブラリーベクターを使用した場合も、ＨＴＸ−ＶＨＨタンパク質の発現が確認された。【0190】
（４−３）結合ｍＲＮＡの測定ＨＴＸ−ＶＨＨタンパク質に結合したｍＲＮＡの量を、以下の方法により測定した。ｍＲＮＡ測定の原理を、図７（Ａ）の概略図に示す。大腸菌内で、前記ライブラリーベクターを発現させると、アプタマーを含む融合ｍＲＮＡが転写され、ＨＴＸ-ＨＶＶタンパク質が翻訳される。前記アプタマーは、Ｈｉｓタグに結合するため、前記アプタマーとＨｉｓタグとの結合を介して、前記融合ｍＲＮＡと前記ＨＴＸ-ＨＶＶタンパク質とが結合する。このため、図７（Ａ）に示すように、前記ＨＴＸ-ＨＶＶタンパク質を、固定化した抗ラマＩｇＧ抗体でトラップすることにより、前記ＨＴＸ-ＨＶＶタンパク質に結合した前記融合ｍＲＮＡを測定できる。
【0191】
９６穴プレート（旭硝子社）に、５μｇ／ｍＬのヤギ抗ラマＩｇＧ抗体を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１ウェルあたり１２０μＬ加え、室温で３時間静置して、前記抗体を吸着させた。その後、前記ウェルを、１％ ヒト血清アルブミン（シグマ社）および０．９％ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）２００μＬでブロッキングした。他方、陰性コントロールとして、ブロッキングのみを行ったウェルを用意した。これらのウェルに、前記「４．」で得られた、各種ライブラリーベクターを使用した大腸菌のライブラリーの溶菌液を、２００μＬ加え、４℃で１時間培養した。前記ウェルを、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）で４回洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、インビトロジェン社）１５０μＬ加え、ｍＲＮＡを回収した。回収したｍＲＮＡに、アルコール沈殿用キャリアとしてＥｔｈａｔｉｎｍａｔｅ（商品名、ニッポンジーン社）１μＬを加え、そのプロトコルに従って、ＲＮＡの精製を行った。得られたＲＮＡを、５ｕｎｉｔｓのＤＮａｓｅ Ｉ（プロメガ社）を用いて３７℃で３０分処理し、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、精製ＲＮＡを得た。【0192】
前記精製ＲＮＡを全量用いて、Ｏｎｅｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（商品名、キアゲン社）により、ＲＴ−ＰＣＲを行った。条件は、アニーリング温度を５５℃とし、サイクル数を１５サイクルまたは２０サイクルとした。プライマーは、以下の二種類を併用した（配列番号７５および７６）。プライマーＣ１（配列番号７５）
ＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＡ
プライマーＣ２（塩基配列７６）
ＧＧＣＡＧＧＧＡＴＣＴＴＡＧＡＴＴＣＴＧ
【0193】
前記ＲＴ−ＰＣＲの反応液を、１．５％アガロースを用いて電気泳動に供し、臭化エチジウムによりＰＣＲ断片を染色した。この電気泳動の結果を、図７（Ｂ）の写真に示す。図７（Ｂ）において、ｖ１、ｖ３およびｖ４は、使用したライブラリーベクターの種類であり、ＢＳＡは、陰性コントールの結果、Ｉｇが、ヤギ抗ラマＩｇＧ抗体を固定化した結果である。図７（Ｂ）の２０サイクルの結果に示すように、いずれのプラスミドベクターにおいても、ＢＳＡの結果と比較して、Ｉｇは、濃いバンドが確認された。【0194】
これらの結果から、いずれの部位に前記アプタマーＤＮＡを挿入した場合でも、融合タンパク質と融合ｍＲＮＡとの複合体が形成できることがわかった。【0195】
（実施例２）前記実施例１で作製したＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ１を使用して、ヒトインテレクチン−１に結合する可変領域のスクリーニングを行った。
【0196】
（１）ライブラリーの構築ライブラリー用ベクターは、前記ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ１を使用した。また、ライブラリー用インサートは、前記オリゴヌクレオチドＡ１（配列番号７１）およびＡ２（配列番号７２）と相補鎖オリゴヌクレオチドＢ１（配列番号７３）とから、前記実施例１と同様に調製した。そして、前記実施例１の「３．（３−３）」と同様にして、ランダム領域が挿入されたライブラリーベクターの構築、および、これをトランスフォームした凍結大腸菌のライブラリーの調製を行った。
【0197】
前記凍結大腸菌のライブラリーを、終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１００ｍＬのＬＢで、急速に溶解し、６００ｎｍの吸光度が０．６となるまで、３７℃で振盪培養した。得られた培養液を、１０℃で３０分冷却し、終濃度１ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧを加え、１０℃で１時間振盪培養した。得られた培養液を、６，５００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、回収した菌体を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む生理食塩水５０ｍＬに懸濁した後、６，５００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、菌体を洗浄した。前記菌体を、２０％スクロースおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）５ｍＬに懸濁し、０．１ｇ／ｍＬの卵白リゾチーム（シグマ社）を１００μＬ加えて撹拌し、氷上で１時間処理した。さらに、１ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２を含む１ｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウムを５μＬ加え、６，５００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、スフェロプラストを回収した。回収したスフェロプラストを、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウムおよび０．９％ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）５０ｍＬに懸濁し、氷上で５分静置後、遠心して洗浄した。前記洗浄後のスフェロプラストの沈殿に、溶菌試薬を添加し、４℃で激しく撹拌して溶菌させた。前記溶菌試薬は、１００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ（パン酵母由来、シグマ社）、０．１％ ヒト血清アルブミン（シグマ社）、５０ｕｎｉｔｓ ＲＮａｓｅ Ａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）、２１０ｕｎｉｔｓ ＤＮａｓｅ（インビトロジェン社）、１／２ピースのｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔｓ（ロシュ社）、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）４ｍＬを使用した。前記溶菌液を、２７ゲージの注射針をセットしたシリンジで吸引排出し、スフェロプラストの破壊促進およびゲノムＤＮＡの剪断を行った後、氷上で５分静置し、１７，０００×ｇで１０分間遠心して、上清を回収した。この上清を溶菌液とした。【0198】
（２）複合体からのＲＮＡの回収セレクションビーズを、予め以下のようにして作製した。まず、Ｐｏｌｙｂｅａｄ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ １．０ｍｉｃｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（ポリサイエンス社）２０μＬを、１ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌ ほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）で３回遠心洗浄し、４００μｇ／ｍＬのヒトインテレクチン−１を含む０．１ｍｏｌ／Ｌ ほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）４０μＬに懸濁した。この懸濁液を、振盪しながら室温で１８時間インキュベートした後、遠心して前記ビーズを回収した。前記ビーズを、１０ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ ほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）１００μＬに懸濁し、振盪しながら室温で３０分インキュベートした後、遠心して前記ビーズを回収し、同様の操作を計３回繰り返した。そして、回収した前記ビーズを、１０ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンおよび０．９％ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）４０μＬに懸濁して保存した。これをセレクションビーズとして使用した。
【0199】
つぎに、前記セレクションビーズ３μＬに、前記溶菌液１．５〜４ｍＬを加え、４℃で３０分撹拌した後、１７，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、前記ビーズを回収した。回収した前記ビーズを、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）で計４回遠心洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、インビトロジェン社）１５０μＬを加え、室温で５分静置した後、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（０．２２μｍ、ミリポア社）を用いて、ｍＲＮＡを含む可溶性画分を回収した。前記可溶性画分についてクロロフォルム抽出を行い、水層を回収し、Ｅｔｈａｔｉｎｍａｔｅ（商品名、ニッポンジーン社）１μＬを加え、イソプロパノール沈殿を行った。得られた沈殿を、５ｕｎｉｔｓのＤＮａｓｅ Ｉ（プロメガ社）を用いて、３７℃で３０分処理し、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、精製ＲＮＡを得た。【0200】
（３）新たなライブラリーの構築前記精製ＲＮＡの半量を用いて、Ｏｎｅｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（商品名、キアゲン社）により、ＲＴ−ＰＣＲを行った。条件は、アニーリング温度を５７℃とし、サイクル数を２０サイクルとした。プライマーは、以下の二種類を併用した（配列番号７７、７８）。
プライマーＤ１（配列番号７７）
CGGAAGACACGGCCGTTTATTACGC
プライマーＤ２（配列番号７８）
TCTAGATTAGCGGCCGCTGGAAACG
【0201】
２０サイクルのＲＴ-ＰＣＲ後、前記ＲＴ−ＰＣＲの反応液に、１００μｍｏｌ／Ｌの前記プライマーＤ１および１００μｍｏｌ／Ｌの前記プローブＤ２を、それぞれ、前記反応液量の１／１０ずつ加えた。そして、前記反応液を、９５℃で３０秒、９４℃で３分加熱した後、５７℃で１分および７２℃で１分を１サイクルとして計５回繰り返した。反応後、前記反応液からエタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、２５ｕｎｉｔｓのｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社）を用いて、３７℃で３時間処理し、過剰なプライマーを消化した。そして、前記回収ＤＮＡについて、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、得られた二本鎖ＤＮＡを１０μＬのＴＥに溶解した。このＤＮＡ溶液１μＬを、１５ ｕｎｉｔｓのＰｓｔＩおよび１５ｕｎｉｔｓのＮｏｔＩを用いて、３７℃で７時間消化した後、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収した。前記ＤＮＡ断片を、そのまま、または、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ） （タカラバイオ社）処理後、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、選別断片とした。【0202】
前記選別断片の１／３量と、前記実施例１「３．（３−２）」で作製したライブラリー用ベクター（ＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ１）１μｇとを混合し、１７５０ｕｎｉｔｓのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、１４℃で１８時間ライゲーション反応を行った。前記反応は、０．１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、７ｍｍｏｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ジチオスレイトール、１ｍｍｏｌ／Ｌ スペルミジン、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌおよび６ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２を含む６ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）中で行った。これにより、前記ライブラリー用ベクターに前記ライブラリー用インサートとして前記選別断片を挿入し、ランダム領域が挿入されたライブラリーベクターを、新たに構築した。【0203】
前記反応液に、１０μｇのｔＲＮＡ（パン酵母由来、シグマ社）を添加し、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＴＥ ５μＬに溶解した。得られた溶液全量を、大腸菌に混合し、トランスフォームを行った。トランスフォームの条件は、前記実施例１と同様とした。トランスフォームした前記大腸菌を、ＳＯＣ ３ｍＬに懸濁し、３７℃で１時間振盪培養した後、終濃度１００μｇ／ｍＬになるようにアンピシリンを加え、３７℃で５時間振盪培養した。この培養液に、０．２１ｍＬのＤＭＳＯを加えて混合した後、速やかに液体窒素にて凍結し、−８０℃で保存した。【0204】
以上に記載した、ライブラリーベクターの構築、ＨＴＸ−ＨＶＶタンパク質の回収、前記タンパク質に結合したＲＮＡの回収、ランダム領域を含むＤＮＡの増幅、ＤＮＡ増幅物の断片化および前記ＤＮＡ断片のライブラリー用ベクターへの挿入という工程を、合計２〜３回繰り返し行った。そして、トランスフォームした大腸菌の一部を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレートに播種し、コロニーを形成させた。得られたコロニーを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む０．５ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。前記培養には、９６穴ディープウェルプレート（サーモサイエンティフィック社）を用いた。得られた培養液を、１０℃で３０分冷却し、終濃度０．５ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを加え、１０℃で１８時間振盪培養した。この培養液を、１，８００×ｇ、室温で１５分間遠心して菌体を回収し、液体窒素で凍結した。凍結菌体を室温で溶解した後、５，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（メルク社）、１２．５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社）、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００および１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）２００μＬを加え、振盪しながら室温で１５分間インキュベートして、溶菌させた。この混合液を、液体窒素を用いて凍結し、再度融解した後、終濃度２．５ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸マグネシウムを添加し、撹拌した後、室温で１０分間静置することによって、溶菌液を得た。【0205】
（４）スクリーニング前記溶菌液を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２％ ウシ血清アルブミン（シグマ社）および０．９％ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液（ｐＨ７．６）で、２倍に希釈した。スクリーニングには、この希釈溶菌液を使用した。
【0206】
結合クローンのスクリーニングは、以下に示すＥＬＩＳＡにより測定した。まず、９６穴プレート（旭硝子社）に、抗原として１μｇ／ｍＬのヒトインテレクチン−１を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１ウェルあたり５０μＬ加え、室温で３時間静置して、前記抗原を吸着させた。その後、前記ウェルを、１％ ウシ血清アルブミン（シグマ社）および０．９％ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液（ｐＨ７．６）２００μＬでブロッキングした。前記ウェルに、前記希釈溶菌液を５０μＬ加え、室温で１．５時間培養した。前記ウェルを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０および０．９％ＮａＣｌを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．６）で４回洗浄し、１／２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗Ｈｉｓタグ抗体（キアゲン社）、０．２％ ウシ血清アルブミンおよび０．９％ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液（ｐＨ７．６）を５０μＬ加え、室温で１時間反応させた。前記ウェルを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０および０．９％ＮａＣｌを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．６）で４回洗浄し、１ Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（商品名、サーモサイエンティフィック社）を加えて発色反応を行い、硫酸で反応を停止した後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。そして、陽性クローンについて、シークエンスを行い、前記抗原に結合性を示した結合クローンのアミノ酸配列を決定した。得られた陽性クローンのうち、代表的なクローンの可変部領域のアミノ酸配列およびＥＬＩＳＡの結果を、図８に示す。【0207】
図８において、左側は、各クローンから発現したＨＴＸ−ＨＶＶタンパク質のヒトインテレクチン−１に対する結合を示すグラフであり、右側は、各クローンから発現したランダム領域およびその周囲のアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は、上から順に、配列番号いたスクリーニング方法によれば、前述の工程を繰り返すことのみによって、抗原に対して結合性を示すペプチドをスクリーニングできる。このため、本発明によれば、例えば、従来のように動物への免疫等を行うことなく、抗原に対して結合性を示す可変領域のペプチドを得ることができ、これに基づいて、例えば、ヒト化抗体等も容易に設計可能である。【0208】
（実施例３）前記実施例１で作製したＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ１を使用して、ヒトＴＮＦ−αに結合する可変領域のスクリーニングを行った。
【0209】
セレクションビーズの作製において、ヒトインテレクチン−１に代えて、ヒトＴＮＦ−α（ペプロテック社）を使用し、ＲＴ−ＰＣＲのプライマーとして、前記プライマーＤ２に代えて、下記プライマーＤ３を使用した以外は、前記実施例２と同様の処理を行い、ヒトＴＮＦ−αに特異的に結合するクローンを得た。プライマーＤ３（配列番号７９）
CTAGTAGCGGCCGCTTATCTACCGCTGGAAACGGTCACCTGGGT
【0210】
この結果を、下記表１３に示す。下記表１３において、Ａ〜Ｈおよび１〜１２は、プレートのウェル番号を示し、各マスの値は、前記実施例２と同様に、ＥＬＩＳＡの測定値を示す。このように、本発明によれば、前記プレートのウェルにおけるＥＬＩＳＡの測定値から、抗原への結合性を示すクローンを選択することが可能である。【0211】
【表13】
【0212】
（実施例４）前記実施例１で作製したＨＴＸ−ＶＨＨ−ｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄｖ１を使用して、ヒトインテレクチン−１に結合する可変領域のスクリーニングを行った。
【0213】
ライブラリー用インサートの調製において、前記相補鎖オリゴヌクレオチドＢ１（配列番号７３）に代えて、前記相補鎖オリゴヌクレオチドＢ２（配列番号７４）を使用し、ＲＴ−ＰＣＲのプライマーとして、前記プライマーＤ２に代えて、下記プライマーＤ４を使用した以外は、前記実施例２と同様の処理を行い、ヒトインテレクチン−１に特異的に結合するクローンを得た。プライマーＤ４（配列番号８０）
CACTTAGCGGCCGCTCACGTAGGC
【0214】
この結果を、下記表１４に示す。下記表１４において、Ａ〜Ｈおよび１〜１２は、プレートのウェル番号を示し、各マスの値は、前記実施例２と同様に、ＥＬＩＳＡの測定値を示す。このように、本発明によれば、前記プレートのウェルにおけるＥＬＩＳＡの測定値から、抗原への結合性を示すクローンを選択することが可能である。【0215】
【表14】
【0216】
このように、本発明によれば、前記ペプチドタグとそれに対するアプタマーとの結合を利用することで、抗原に結合する抗体候補のコード核酸情報を容易に解析でき、その解析結果から、前記抗体候補のアミノ酸配列を決定できる。このため、本発明によれば、例えば、免疫法等による抗体の取得のように、多大な時間および労力を費やすことなく、抗体候補の選択を行うことができる。【0217】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。【0218】
この出願は、２０１１年９月２９日に出願された日本出願特願２０１１−２１５０４９を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。【産業上の利用可能性】
【0219】
本発明の核酸構築物によれば、転写された前記アプタマーと翻訳された前記ペプチドタグとの結合を利用して、前記融合転写産物と前記融合翻訳産物との複合体を形成できる。前記複合体において、前記融合転写産物は、前記任意ペプチドのコード配列の転写産物を有し、前記融合翻訳産物は、前記任意ペプチドを有する。このため、前記複合体が抗原に結合した場合、例えば、前記複合体における前記転写産物の同定により、前記抗原に結合可能な前記抗体候補および前記任意ペプチドを同定できる。このように、本発明によれば、本発明の第１の核酸構築物に前記任意ペプチドのコード核酸を挿入して、前記複合体を形成させ、前記抗原と結合した複合体を回収するのみで、容易に、前記抗原に結合可能な抗体候補ならびにそのコード核酸を同定できる。したがって、本発明は、例えば、医療分野等において、抗原に対する新たな抗体のスクリーニングに、極めて有用なツールならびに方法といえる。【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]