特許 5936213 ＰＤＴ効果増強剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5936213

(24)【登録日】2016年5月20日

(45)【発行日】2016年6月22日

(54)【発明の名称】ＰＤＴ効果増強剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/11 20060101AFI20160609BHJP

   A61K 31/136 20060101ALI20160609BHJP

   A61K 31/197 20060101ALI20160609BHJP

   A61K 41/00 20060101ALI20160609BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160609BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160609BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/11

   A61K31/136

   A61K31/197

   A61K41/00

   A61P43/00 121

   A61P35/00

【請求項の数】8

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2014-520935(P2014-520935)

(86)(22)【出願日】2013年6月13日

(86)【国際出願番号】JP2013003728

(87)【国際公開番号】WO2013187069

(87)【国際公開日】20131219

【審査請求日】2014年12月9日

(31)【優先権主張番号】特願2012-136227(P2012-136227)

(32)【優先日】2012年6月15日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504160781

【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学

(73)【特許権者】

【識別番号】304020292

【氏名又は名称】国立大学法人徳島大学

(73)【特許権者】

【識別番号】508123858

【氏名又は名称】ＳＢＩファーマ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100102255

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤 誠次

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(72)【発明者】

【氏名】遠藤 良夫

(72)【発明者】

【氏名】宇都 義浩

(72)【発明者】

【氏名】堀 均

(72)【発明者】

【氏名】田中 徹

(72)【発明者】

【氏名】石塚 昌宏

(72)【発明者】

【氏名】高橋 究

【審査官】 井上 明子

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭５５−０４５６５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５６−０１２３１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０６３７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１４６０８９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５０２０８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−００２６４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０３６５２７７０（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開昭５４−１２６７３１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００ − ３３／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

光増感剤又はアミノレブリン酸（ＡＬＡ）類と併用することを特徴とする、以下の式（Ｉ）で示される化合物を含む、光線力学的治療（ＰＤＴ）の効果増強剤。

【化1】

［式中、Ｒ^１は−ＣＨＯ又は−ＣＨ＝ＮＲ^７（但し、Ｒ^７は、置換若しくは非置換のフェニル基）を示し、
Ｒ^３，Ｒ^５は、それぞれＨ又はフッ素、塩素、臭素、及びニトロ基から選ばれる電子吸引性基（但し、少なくとも一方は電子吸引性基である。）を示し、
Ｒ^２，Ｒ^４，Ｒ^６は、それぞれＨ又は−ＯＨを示す。］

【請求項2】

式（Ｉ）で示される化合物が、Ｎ−３’，５’−ジクロロ−２’−ヒドロキシベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロアニリン、３，５−ジクロロサリチルアルデヒド、３，５−ジクロロベンツアルデヒド、５−クロロサリチルアルデヒド、及び３−クロロ−２−ヒドロキシベンツアルデヒドから選ばれることを特徴とする請求項１記載の増強剤。

【請求項3】

ＰＤＴが、がんを対象とすることを特徴とする請求項１又は２記載の増強剤。

【請求項4】

がんが、ＡＢＣＧ−２低発現細胞から構成されていることを特徴とする請求項３記載の増強剤。

【請求項5】

光増感剤又はアミノレブリン酸（ＡＬＡ）類と併用する、光線力学的治療（ＰＤＴ）の効果増強剤を調製するための、以下の式（Ｉ）で示される化合物の使用。

【化2】

［式中、Ｒ^１は−ＣＨＯ又は−ＣＨ＝ＮＲ^７（但し、Ｒ^７は、置換若しくは非置換のフェニル基）を示し、
Ｒ^３，Ｒ^５は、それぞれＨ又はフッ素、塩素、臭素、及びニトロ基から選ばれる電子吸引性基（但し、少なくとも一方は電子吸引性基である。）を示し、
Ｒ^２，Ｒ^４，Ｒ^６は、それぞれＨ又は−ＯＨを示す。］

【請求項6】

式（Ｉ）で示される化合物が、Ｎ−３’，５’−ジクロロ−２’−ヒドロキシベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロアニリン、３，５−ジクロロサリチルアルデヒド、３，５−ジクロロベンツアルデヒド、５−クロロサリチルアルデヒド、及び３−クロロ−２−ヒドロキシベンツアルデヒドから選ばれることを特徴とする請求項５記載の使用。

【請求項7】

ＰＤＴが、がんを対象とすることを特徴とする請求項５又は６記載の使用。

【請求項8】

がんが、ＡＢＣＧ−２低発現細胞から構成されていることを特徴とする請求項７記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、光増感剤又は５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、これらを合わせて「ＡＬＡ類」ということがある）と併用される化合物を含む、光線力学的治療（ＰＤＴ）の効果増強剤に関する。

【背景技術】

【0002】

がん（悪性腫瘍）は日本における最大の死因となっており、日本国民の２人に１人が罹患するといわれている。また、他の先進国においても、がんは死因の上位にランクされている。そのため、がんの有効な治療法の開発は、日本国民を始め、世界の人々にとっての悲願である。しかし、がんは患者自身の細胞であるため、副作用を伴わずに、がんを効果的に治療し得る有効な治療剤や治療方法の開発は容易ではなく、未だ十分な治療剤や治療方法は得られていない。

【0003】

近年、広く用いられるようになってきた光線力学的治療（Photodynamic Therapy：以下「ＰＤＴ」ともいう。）は、治療が簡便で、生体侵襲性が小さく、臓器温存が可能であることなどから、近年、ＱＯＬを考慮した新たながん治療法として注目されている。ＰＤＴは、投与されたポルフィリン関連化合物が直接腫瘍組織や新生血管へ特異的に集積した後、レーザー光などの光の励起により生ずる一重項酸素が細胞を変性、壊死に陥らせることにより治療効果を発揮するものである。

【0004】

がん治療を目的に国内で承認されている光増感剤には、ヘマトポルフィリン誘導体のポルフィマーナトリウム（商品名：フォトフリン）や、植物クロロフィル由来のタラポルフィンナトリウム（商品名：レザフィリン）がある。ポルフィマーナトリウムは代謝が遅く、表皮組織付近に集積しやすい性質を持っているため、日光過敏症をおこすことが知られている。

【0005】

一方、５−ＡＬＡは動物や植物や菌類に広く存在する、生体内に含まれる天然アミノ酸の一種であり、クロロフィルやヘムの共通前駆体として細胞内で代謝を受ける。５−ＡＬＡ自体には光感受性はないとされ、ＰＤＴにおいては、投与されたＡＬＡ類がヘム生合成経路の一連の酵素群によりプロトポルフィリンIX（protoporphyrin IX;ＰｐIX）に代謝され、ＰｐIXが、直接腫瘍組織や新生血管へ特異的に集積した後、レーザー光などの光により励起状態になることで生ずる一重項酸素が細胞を変性、壊死に陥らせることにより治療効果を発揮するとされており、ＡＬＡ類を用いた光線力学的療法（ＡＬＡ−ＰＤＴ）の研究が進められている。また、ＰＤＴにおける作用増強剤として、血管拡張性麻酔薬からなる、光線力学的療法用剤のがん細胞壊死作用増強剤が報告されている（例えば、特許文献１参照）。

【0006】

しかしながら、がんの細胞種や悪性度によっては、ＡＬＡ−ＰＤＴの効率が低いいわゆるＡＬＡ−ＰＤＴ耐性の細胞があることも知られている。例えば、がん細胞内でＰｐIX等のポルフィリンを基質とするＡＢＣトランスポーターファミリーの一つであるＡＢＣＧ２が高発現することによりＰｐIXが細胞質へ排出され、ＰｐIXが十分に蓄積しない細胞は、ＡＬＡ−ＰＤＴ効果が低い場合があることが確認されている（非特許文献１参照）。本発明者らは、これまでＡＢＣＧ２阻害剤を併用し、ＡＢＣＧ２自体をブロックしてしまう方法や、ＡＢＣＧ２トランスポーターの基質である抗がん剤と５−アミノレブリン酸とを併用することによって抗がん剤の抗がん作用を増強する手法を考案してきた。

【0007】

しかしながら、すべてのＡＬＡ−ＰＤＴ耐性細胞において、必ずしもＡＢＣＧ２の高発現が認められるというわけではなく、ＡＬＡ−ＰＤＴ耐性の原因がＡＢＣＧ２にあるということはできない。ＡＬＡ−ＰＤＴ耐性を示すがん細胞の中には、かえって、ＡＢＣＧ２の発現が低いものも存在し、当然ながらこれらの細胞には上述のＡＢＣＧ２阻害剤やＡＢＣＧ２のブロック方法による効果は認められず、実質上ＰＤＴによる治療の限界とされていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】再表２００７/０８６３９５号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Tamura, A. et al, (2007) Drug Metabolism and Pharmacokinetics 22, No.6, 428-440

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の課題は、ＰＤＴを行うに際し、標的細胞、特にＡＢＣＧ２の発現が低いＡＬＡ−ＰＤＴ耐性がん細胞に対して、ＰＤＴ効果を増強することのできる増強剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、１８種類の化合物のＡＬＡ−ＰＤＴにおける作用効果増強作用を、ＡＢＣＧ２の発現が低い５−ＡＬＡ−ＰＤＴ耐性がん細胞であることが確認されているヒト胃がん細胞のＭＫＮ−４５細胞を用いて検討したところ、ＡＬＡ−ＰＤＴにおいて、Ｎ−３’，５’−ジクロロ−２’−ヒドロキシベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロアニリン、３，５−ジクロロサリチルアルデヒド、３，５−ジクロロベンツアルデヒド、５−クロロサリチルアルデヒド、又は３−クロロ−２−ヒドロキシベンツアルデヒドを、ＡＬＡ類と併用して用いると、顕著にＰＤＴの効果を増強することを見いだし、さらに、本発明の増強剤は、正常細胞には作用を及ぼさないことを確認して、本発明を完成するに至った。

【0012】

すなわち、本発明は、［１］光増感剤又はアミノレブリン酸（ＡＬＡ）類と併用することを特徴とする、以下の式（Ｉ）

【0013】

【化1】

【0014】

［式中、Ｒ^１は−ＣＨＯ又は−ＣＨＯに変換可能な基を示し、Ｒ^３，Ｒ^５は、それぞれＨ又は電子吸引性基（但し、少なくとも一方は電子吸引性基である。）を示し、Ｒ^２，Ｒ^４，Ｒ^６は、それぞれＨ又は−ＯＨを示す］で示される化合物を含む、光線力学的治療（ＰＤＴ）の効果増強剤に関する。

【0015】

また、本発明は、［２］式（Ｉ）における−ＣＨＯに変換可能な基が、−ＣＨ＝ＮＲ^７、−ＣＨ＝ＮＯＲ^８、又は−ＣＨ（ＯＲ^９）ＯＲ^１０であって、Ｒ^７は、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルキル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルケニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルケニル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルキニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜９の複素環基、置換若しくは非置換のフェニル基、あるいは置換若しくは非置換のナフチル基を示し、Ｒ^８は、水素、メタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、又はパラトルエンスルホニル基を示し、Ｒ^９，Ｒ^１０は、それぞれ置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルキル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルケニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルケニル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルキニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜９の複素環基を示し、あるいは、Ｒ^９，Ｒ^１０は１つのジオール分子を構成するものでもよく、その場合、Ｒ^９及びＲ^１０は、置換若しくは非置換の炭素数２〜１０のアルカンジオール基、又は置換若しくは非置換のカテコール基を示す上記［１］記載の増強剤や、［３］式（Ｉ）で示される化合物が、Ｎ−３’，５’−ジクロロ−２’−ヒドロキシベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロアニリン、３，５−ジクロロサリチルアルデヒド、３，５−ジクロロベンツアルデヒド、５−クロロ−２−ヒドロキシベンツアルデヒド（５−クロロサリチルアルデヒド）、及び３−クロロ−２−ヒドロキシベンツアルデヒド（３−クロロサリチルアルデヒド）から選ばれることを特徴とする上記［１］記載の増強剤や、［４］ＰＤＴが、がんを対象とすることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載の増強剤や、［５］がんが、ＡＢＣＧ−２低発現細胞から構成されていることを特徴とする上記［４］記載の増強剤に関する。

【0016】

さらに、本発明は、［６］光増感剤又はアミノレブリン酸（ＡＬＡ）類と併用して、上記式（Ｉ）［式中、Ｒ^１は−ＣＨＯ又は−ＣＨＯに変換可能な基を示し、Ｒ^３，Ｒ^５は、それぞれＨ又は電子吸引性基（但し、少なくとも一方は電子吸引性基である。）を示し、Ｒ^２，Ｒ^４，Ｒ^６は、それぞれＨ又は−ＯＨを示す。］で示される化合物を対象に投与することを特徴とする光線力学的治療（ＰＤＴ）の効果を増強する方法や、［７］上記式（Ｉ）［式中、Ｒ^７は、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルキル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルケニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルケニル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルキニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜９の複素環基、置換若しくは非置換のフェニル基、あるいは置換若しくは非置換のナフチル基を示し；Ｒ^８は、水素、メタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、又はパラトルエンスルホニル基を示し；Ｒ^９，Ｒ^１０は、それぞれ置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルキル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルケニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルケニル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルキニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜９の複素環基を示し、あるいは、Ｒ^９，Ｒ^１０は１つのジオール分子を構成するものでもよく、その場合、Ｒ^９及びＲ^１０は、置換若しくは非置換の炭素数２〜１０のアルカンジオール基、又は置換若しくは非置換のカテコール基を示す。］における−ＣＨＯに変換可能な基が、−ＣＨ＝ＮＲ^７、−ＣＨ＝ＮＯＲ^８、又は−ＣＨ（ＯＲ^９）ＯＲ^１０であることを特徴とする上記［６］記載の方法や、［８］上記式（Ｉ）で示される化合物が、Ｎ−３’，５’−ジクロロ−２’−ヒドロキシベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロアニリン、３，５−ジクロロサリチルアルデヒド、３，５−ジクロロベンツアルデヒド、５−クロロサリチルアルデヒド、及び３−クロロ−２−ヒドロキシベンツアルデヒドから選ばれることを特徴とする上記［６］記載の方法や、［９］ＰＤＴが、がんを対象とすることを特徴とする上記［６］記載の方法や、［１０］がんが、ＡＢＣＧ−２低発現細胞から構成されていることを特徴とする上記［９］記載の方法に関する。

【0017】

さらに、本発明は、［１１］光増感剤又はアミノレブリン酸（ＡＬＡ）類と併用する、光線力学的治療（ＰＤＴ）の効果を増強するための、上記式（Ｉ）［式中、Ｒ^１は−ＣＨＯ又は−ＣＨＯに変換可能な基を示し、Ｒ^３，Ｒ^５は、それぞれＨ又は電子吸引性基（但し、少なくとも一方は電子吸引性基である。）を示し、Ｒ^２，Ｒ^４，Ｒ^６は、それぞれＨ又は−ＯＨを示す。］で示される化合物や、［１２］上記式（Ｉ）［式中、Ｒ^７は、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルキル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルケニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルケニル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルキニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜９の複素環基、置換若しくは非置換のフェニル基、あるいは置換若しくは非置換のナフチル基を示し；Ｒ^８は、水素、メタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、又はパラトルエンスルホニル基を示し；Ｒ^９，Ｒ^１０は、それぞれ置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルキル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルケニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルケニル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルキニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜９の複素環基を示し、あるいは、Ｒ^９，Ｒ^１０は１つのジオール分子を構成するものでもよく、その場合、Ｒ^９及びＲ^１０は、置換若しくは非置換の炭素数２〜１０のアルカンジオール基、又は置換若しくは非置換のカテコール基を示す。］における−ＣＨＯに変換可能な基が、−ＣＨ＝ＮＲ^７、−ＣＨ＝ＮＯＲ^８、又は−ＣＨ（ＯＲ^９）ＯＲ^１０であることを特徴とする上記［１１］記載の化合物や、［１３］上記式（Ｉ）で示される化合物が、Ｎ−３’，５’−ジクロロ−２’−ヒドロキシベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロアニリン、３，５−ジクロロサリチルアルデヒド、３，５−ジクロロベンツアルデヒド、５−クロロサリチルアルデヒド、及び３−クロロ−２−ヒドロキシベンツアルデヒドから選ばれることを特徴とする上記［１１］記載の化合物や、［１４］ＰＤＴが、がんを対象とすることを特徴とする上記［１１］〜［１３］のいずれか記載の化合物や、［１５］がんが、ＡＢＣＧ−２低発現細胞から構成されていることを特徴とする上記［１４］記載の化合物に関する。

【0018】

さらに、本発明は、［１６］光増感剤又はアミノレブリン酸（ＡＬＡ）類と併用する、光線力学的治療（ＰＤＴ）の効果増強剤を調製するための、上記式（Ｉ）［式中、Ｒ^１は−ＣＨＯ又は−ＣＨＯに変換可能な基を示し、Ｒ^３，Ｒ^５は、それぞれＨ又は電子吸引性基（但し、少なくとも一方は電子吸引性基である。）を示し、Ｒ^２，Ｒ^４，Ｒ^６は、それぞれＨ又は−ＯＨを示す。］で示される化合物の使用や、［１７］上記式（Ｉ）［式中、Ｒ^７は、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルキル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルケニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルケニル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルキニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜９の複素環基、置換若しくは非置換のフェニル基、あるいは置換若しくは非置換のナフチル基を示し；Ｒ^８は、水素、メタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、又はパラトルエンスルホニル基を示し；Ｒ^９，Ｒ^１０は、それぞれ置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルキル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルケニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルケニル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルキニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜９の複素環基を示し、あるいは、Ｒ^９，Ｒ^１０は１つのジオール分子を構成するものでもよく、その場合、Ｒ^９及びＲ^１０は、置換若しくは非置換の炭素数２〜１０のアルカンジオール基、又は置換若しくは非置換のカテコール基を示す。］における−ＣＨＯに変換可能な基が、−ＣＨ＝ＮＲ^７、−ＣＨ＝ＮＯＲ^８、又は−ＣＨ（ＯＲ^９）ＯＲ^１０であることを特徴とする上記［１６］記載の使用や、［１８］上記式（Ｉ）で示される化合物が、Ｎ−３’，５’−ジクロロ−２’−ヒドロキシベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロアニリン、３，５−ジクロロサリチルアルデヒド、３，５−ジクロロベンツアルデヒド、５−クロロサリチルアルデヒド、及び３−クロロ−２−ヒドロキシベンツアルデヒドから選ばれることを特徴とする上記［１６］記載の使用や、［１９］ＰＤＴが、がんを対象とすることを特徴とする上記［１６］〜［１８］のいずれか記載の使用や、［２０］がんが、ＡＢＣＧ−２低発現細胞から構成されていることを特徴とする上記［１９］記載の使用に関する。

【発明の効果】

【0019】

本発明によれば、ＰＤＴにおける光増感剤等の投与量を軽減することができ、ＰＤＴの標的細胞がＡＬＡ−ＰＤＴ耐性細胞である場合にもＰＤＴの治療効果を増強することができ、患者の負担を軽減することができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】イソボログラムによる評価方法の模式図を示す。Ａ剤とＢ剤の２つの薬剤を併用した場合に５０％細胞増殖抑制を示す薬剤濃度をグラフにプロットしたとき、これらのポイントが曲線より低濃度側にある場合を相乗効果がある（synergistic）と判定できる。

【図2】濃度が０，０．４１，１．２３，３．７０，１１．１，３３．３，及び１００μＭとなるように調製したＮ−３’，５’−ジクロロ−２’−ヒドロキシベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロアニリン（ＴＸ−８１６）と、濃度が０，５０，１００，２００μＭとなるように調製したＡＬＡとを添加して５−ＡＬＡ−ＰＤＴを行った場合の結果を示す図である。

【図3】ＴＸ−８１６の５−ＡＬＡ−ＰＤＴ増強効果をイソボログラムによって検討した結果を示す図である。ＴＸ−８１６の５−ＡＬＡ−ＰＤＴ増強効果は、相乗効果の範疇に属することが確認された。

【図4】ＴＸ−８１６の各濃度における細胞増殖抑制率（inhibition ratio:ＩＲ）を片変数グラフにプロットしたグラフを示す図である。ＩＣ_５０（５０％阻害濃度）値は３６．５μＭと計算された。

【図5】（ａ）ＴＸ−８１６、（ｂ）３，５−ジクロロサリチルアルデヒド（ＤＣＳＡ）、（ｃ）２−クロロ−４−ニトロアニリン（ＣＮＡ）のそれぞれの構造を示す図である。

【図6】表３に表される被検化合物（化合物番号：３，６，７，８，１１，１２）について、ＩＲの比較を示す図である。

【図7】表５に表される被検化合物（整理番号：７−２、７−３、７−４、７−５、７−６、７−７）について、ＩＲの比較を示す図である。

【図8】ＤＣＳＡと3-fluorosalicylaldehyde（３−ＦＳＡ）とのＩＲの比較を示す図である。

【図9】５０μＭの５−ＡＬＡ単独処理（ａ）と、５０μＭの５−ＡＬＡと１００μＭのＤＣＳＡとの同時処理（ｂ）とにおける、ＭＫＮ−４５細胞への細胞内ＰｐIXの蓄積を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本発明のＰＤＴの効果増強剤としては、光増感剤又はアミノレブリン酸（ＡＬＡ）類と併用する、上記式（Ｉ）で示される化合物を含むものであれば特に制限されず、本発明のＰＤＴの効果増強方法としては、光増感剤又はアミノレブリン酸（ＡＬＡ）類と併用して、上記式（Ｉ）で示される化合物を対象に投与する方法であれば特に制限されず、本発明の化合物としては、光増感剤又はアミノレブリン酸（ＡＬＡ）類と併用する、光線力学的治療（ＰＤＴ）の効果を増強するための、上記式（Ｉ）で示される化合物であれば特に制限されず、本発明の使用としては、光増感剤又はアミノレブリン酸（ＡＬＡ）類と併用する、光線力学的治療（ＰＤＴ）の効果増強剤を調製するための、上記式（Ｉ）で示される化合物の使用であれば特に制限されないが、上記ＰＤＴとは、光増感剤やＡＬＡ類の投与により、光に反応する化合物が蓄積した病変部の標的細胞に光を照射することにより治療を行う方法であり、ＡＬＡ−ＰＤＴは、それ自身は光増感作用を有さないＡＬＡ類を投与し、色素生合成経路を経て誘導されたＰｐIXを標的細胞内に特異的に蓄積させ、光の照射によりＰｐIXが周囲の酸素分子を励起し、その結果生成する一重項酸素が、その強い酸化力により殺細胞効果を奏することを利用する治療方法であり、上記ＰｐIXを励起させる光の波長としては、４００ｎｍ〜７００ｎｍ、好ましくは６２５ｎｍ〜６４２ｎｍを挙げることができ、なかでも６３５ｎｍが好ましい。

【0022】

上記式（Ｉ）中、Ｒ^１は−ＣＨＯ又は−ＣＨＯに変換可能な基を示し、Ｒ^３、Ｒ^５は、それぞれＨ又は電子吸引性基（但し、少なくとも一方は電子吸引性基である。）を示し、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６は、それぞれＨ又は−ＯＨを示す。

【0023】

本発明における−ＣＨＯに変換可能な基は、加水分解により−ＣＨＯへと変換される基であり、具体的には−ＣＨ＝ＮＲ^７で示されるイミン、−ＣＨ＝ＮＯＲ^８で示されるオキシム、又は−ＣＨ（ＯＲ^９）ＯＲ^１０で示されるアセタールを挙げることができる。

【0024】

上記Ｒ^３，Ｒ^５における電子吸引基としては、それぞれフッ素、塩素、臭素、トリフルオロメチル基、ニトロ基、スルホニル基、カルボニル基、カルボキシル基、シアノ基を挙げることができ、フッ素、塩素、臭素、及びニトロ基が好ましく、フッ素又は塩素がより好ましい。

【0025】

上記Ｒ^７としては、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルキル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルケニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルケニル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルキニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜９の複素環基、置換若しくは非置換のフェニル基、あるいは置換若しくは非置換のナフチル基を挙げることができ、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基、置換若しくは非置換のフェニル基、あるいは置換若しくは非置換のナフチル基が好ましく、置換若しくは非置換のフェニル基がより好ましい。

【0026】

上記Ｒ^８としては、水素、メタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、又はパラトルエンスルホニル基を挙げることができる。

【0027】

上記Ｒ^９、Ｒ^１０としては、それぞれ置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルキル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルケニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルケニル基、置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルキニル基、置換若しくは非置換の炭素数３〜９の複素環基を挙げることができ、
あるいは、Ｒ^９、Ｒ^１０は１つのジオール分子を構成するものでもよく、その場合、Ｒ^９及びＲ^１０としては、置換若しくは非置換の炭素数２〜１０のアルカンジオール基、又は置換若しくは非置換のカテコール基を挙げることができる。

【0028】

上記Ｒ^７、Ｒ^９、Ｒ^１０において、それぞれ置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、シクロブチルメチル基、へキシル基、メチルペンチル基、エチルブチル基、３，３−ジメチル−ブチル−２−イル基、シクロペンチルメチル基、２’，２’−ジメチルシクロプロピルメチル基、１−メチルシクロプロピルメチル基、及びこれらのフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン置換体を挙げることができる。

【0029】

上記Ｒ^７，Ｒ^９，Ｒ^１０において、それぞれ置換若しくは非置換の炭素数３〜６の環状のアルキル基としては、具体的には、シクロプロピル基、シクロブチル基、１−メチルシクロプロピル基、シクロペンチル基、２’，２’−ジメチルシクロプロピル基、１−メチルシクロブチル基、シクロヘキシル基、１−メチルシクロペンチル基、及びこれらのフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン置換体を挙げることができ、シクロヘキシル基が好ましい。

【0030】

上記Ｒ^７，Ｒ^９，Ｒ^１０において、それぞれ置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基、クロトニル基、ブテニル基、クロトノニトリル基、ペンテニル基、２−オキソ−３−ペンテニル基、ヘキセニル基、シクロペンテニルメチル基、及びこれらのフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン置換体を挙げることができ、アリル基が好ましい。

【0031】

上記Ｒ^７，Ｒ^９，Ｒ^１０において、それぞれ置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数３〜６の環状のアルケニル基としては、シクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、２−オキソ−シクロヘキセニル基、及びこれらのフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン置換体を挙げることができ、シクロヘキセニル基が好ましい。

【0032】

上記Ｒ^７，Ｒ^９，Ｒ^１０において、それぞれ置換若しくは非置換の直鎖又は分岐鎖の炭素数２〜６のアルキニル基としては、エチニル基、プロパルギル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、及びこれらのフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン置換体を挙げることができ、プロパルギル基が好ましい。

【0033】

上記Ｒ^７，Ｒ^９，Ｒ^１０において、それぞれ置換若しくは非置換の炭素数３〜９の複素環基としては、ピロリジニル基、Ｎ−メチルピロリジニル基、Ｎ−エチルピロリジニル基、Ｎ−アセチルピロリジニル基、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルピロリジニル基、テトラヒドロフラニル基、２−オキソテトラヒドロフラニル基、２，５−ジオキソテトラヒドロフラニル基、３，４−ジヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルテトラヒドロフラニル基、テトラヒドロチオフェニル基、ピロリル基、フリル基、チオフェニル基、２−チオフェンカルボン酸メチル−３−イル基、４−メチル−２−チオフェンカルボン酸メチル−３−イル基、ピペリジニル基、Ｎ−メチルピペリジニル基、Ｎ−エチルピペリジニル基、Ｎ−イソプロピルピペリジニル基、４−ピロリジニルピペリジニル基、２，２，６，６−テトラメチルピペリジニル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロピラニル基、２−オキソテトラヒドロピラニル基、２，５−ジオキソテトラヒドロピラニル基、３−アセチルアミノ−４，５−ジヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルテトラヒドロピラニル基、３，４，５−トリヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルテトラヒドロピラニル基、テトラヒドロチオピラニル基、ピリジニル基、メチルピリジニル基、エチルピリジニル基、メトキシピリジニル基、エトキシピリジニル基、メトキシカルボニルピリジル基、ニトロピリジニル基、シアノピリジニル基、３−ニトロ−４−メチルピリジニル基、２−ニトロ−５−メチルピリジニル基、イミダゾリル基、Ｎ−メチルイミダゾリル基、メチルイミダゾリル基、シアノイミダゾリル基、ニトロイミダゾリル基、ピラゾイル基、Ｎ−メチルピラゾイル基、Ｎ−フェニルピラゾイル基、メチルピラゾイル基、ｔｅｒｔ−ブチルピラゾイル基、フェニルピラゾイル基、チアゾリル基、ニトロチアゾリル基、メチルチアゾリル基、ジメチルチアゾリル基、メトキシチアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ニトロベンゾチアゾリル基、メチルベンゾチアゾリル基、ジメチルベンゾチアゾリル基、メトキシベンゾチアゾリル基、シアノイミダゾリル基、ピラジニル基、メチルピラジニル基、インドリル基、メチルインドリル基、ベンゾイミダゾリル基、ニトロベンゾイミダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、クロメニル基、イソクロメニル基、及びこれらのフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン置換体を挙げることができ、ピリジニル基、クロロピリジニル基、ニトロピリジニル基、クロロニトロピリジニル基が好ましい。

【0034】

上記Ｒ^７において、置換若しくは非置換のフェニル基としては、フェニル基、トリル基、ジメチルフェニル基、トリメチルフェニル基、メトキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、トリメトキシフェニル基、エチルフェニル基、ジエチルフェニル基、トリエチルフェニル基、エトキシフェニル基、ジエトキシフェニル基、トリエトキシフェニル基、エチニルフェニル基、ニトロフェニル基、ジニトロフェニル基、トリニトロフェニル基、３−メトキシ−２−メチルフェニル基、メチルニトロフェニル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル基、プロピルフェニル基、イソプロピルフェニル基、イソプロポキシフェニル基、２，３−メチレンジオキシフェニル基、３，４−メチレンジオキシフェニル基、ブチルフェニル基、ｓｅｃ−ブチルフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、２−メチル−６−エチルフェニル基、２−メチル−５−イソプロピルフェニル基、２−ｔｅｒｔ−ブチル−６−メチルフェニル基、ビフェニル基、インダニル基、及びこれらのフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン置換体を挙げることができ、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２−ニトロ−４−クロロフェニル基、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ニトロ−４−クロロフェニル基、２，４，６−トリクロロフェニル基、２−クロロ−４−シアノフェニル基、２−シアノ−４−クロロフェニル基、２，６−ジクロロ−４−シアノフェニル基、２，６−シアノ−４−クロロフェニル基が好ましく、２−クロロ−４−ニトロフェニル基がより好ましい。

【0035】

上記Ｒ^７において、置換若しくは非置換のナフチル基としては、ナフチル基、メチルナフチル基、ジメチルナフチル基、トリメチルナフチル基、メトキシナフチル基、ジメトキシナフチル基、トリメトキシナフチル基、エチルナフチル基、ジエチルナフチル基、トリエチルナフチル基、エトキシナフチル基、ジエトキシナフチル基、トリエトキシナフチル基、ニトロナフチル基、ジニトロナフチル基、トリニトロナフチル基、メチルニトロナフチル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノナフチル基、テトラヒドロキシナフチル基、及びこれらのフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン置換体を挙げることができ、ニトロナフチル基、クロロナフチル基、クロロニトロナフチル基が好ましい。

【0036】

上記Ｒ^９、Ｒ^１０において、Ｒ^９，Ｒ^１０が１つのジオール分子を構成する場合、置換若しくは非置換の炭素数２〜１０のアルカンジオール基としては、エチレンジオール基、１，２−プロパンジオール基、１，３−プロパンジオール基、１，２−ブタンジオール基、１，３−ブタンジオール基、１，４−ブタンジオール基、２，３−ブタンジオール基、１，２−ジヒドロキシ−２−メチルプロパン基、２−メチル−１，３−プロパンジオール基、２−メチル−１，４−ブタンジオール基、１，２−ペンタンジオール基、１，３−ペンタンジオール基、１，４−ペンタンジオール基、１，５−ペンタンジオール基、２，３−ペンタンジオール基、２，４−ペンタンジオール基、１，２−ヘキサンジオール基、１，３−ヘキサンジオール基、１，４−ヘキサンジオール基、１，５−ヘキサンジオール基、１，６−ヘキサンジオール基、２，３−ヘキサンジオール基、２，４−ヘキサンジオール基、２，５−ヘキサンジオール基、３，４−ヘキサンジオール基、１，５−ジヒドロキシ−２−メチルペンタン基、１，２−ヘプタンジオール基、１，３−ヘプタンジオール基、１，４−ヘプタンジオール基、１，５−ヘプタンジオール基、１，６−ヘプタンジオール基、１，７−ヘプタンジオール基、２，３−ヘプタンジオール基、２，４−ヘプタンジオール基、２，５−ヘプタンジオール基、２，６−ヘプタンジオール基、３，４−ヘプタンジオール基、３，５−ヘプタンジオール基、１，２−オクタンジオール基、１，３−オクタンジオール基、１，４−オクタンジオール基、１，５−オクタンジオール基、１，６−オクタンジオール基、１，７−オクタンジオール基、１，８−オクタンジオール基、２，３−オクタンジオール基、２，４−オクタンジオール基、２，５−オクタンジオール基、２，６−オクタンジオール基、２，７−オクタンジオール基、３，４−オクタンジオール基、３，５−オクタンジオール基、３，６−オクタンジオール基、及びこれらのフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン置換体を挙げることができ、エチレンジオール基、１，２−プロパンジオール基、１，３−プロパンジオール基、１，２−ブタンジオール基、１，３−ブタンジオール基、２，３−ブタンジオール基、１，２−ペンタンジオール基、１，３−ペンタンジオール基、２，３−ペンタンジオール基、２，４−ペンタンジオール基、１，２−ヘキサンジオール基、１，３−ヘキサンジオール基、２，３−ヘキサンジオール基、２，４−ヘキサンジオール基、３，４−ヘキサンジオール基が好ましく、エチレンジオール基、１，２−プロパンジオール基、１，３−プロパンジオール基、１，３−ブタンジオール基、２，４−ペンタンジオール２，４−ヘキサンジオール基がより好ましい。

【0037】

上記Ｒ^９、Ｒ^１０において、Ｒ^９、Ｒ^１０が１つのジオール分子を構成する場合、置換若しくは非置換のカテコール基としては、カテコール基、メチルカテコール基、エチルカテコール基、ビニルカテコール基、プロピルカテコール基、アリルカテコール基、ブチルカテコール基、メトキシカテコール基、エトキシカテコール基、プロポキシカテコール基、ブトキシカテコール基、フルオロカテコール基、クロロカテコール基、ブロモカテコール基、アセチルカテコール基、ニトロカテコール基、シアノカテコール基、α，β−ジヒドロキシナフチル基、及びこれらのフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン置換体を挙げることができ、カテコール基、メチルカテコール基、メトキシカテコール基、エトキシカテコール基、プロポキシカテコール基、α，β−ジヒドロキシナフチル基が好ましく、メトキシカテコール基がより好ましい。

【0038】

上記式（Ｉ）において、Ｒ^１が−ＣＨ＝ＮＲ^７であり、Ｒ^２がＯＨであり、Ｒ^３及びＲ^５が塩素であり、Ｒ^４及びＲ^６が水素であり、Ｒ^７が２−クロロ−４−ニトロフェニルであるＮ−３’，５’−ジクロロ−２’−ヒドロキシベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロアニリンや、Ｒ^１が−ＣＨＯであり、Ｒ^２がＯＨであり、Ｒ^３及びＲ^５が塩素であり、Ｒ^４及びＲ^６が水素である３，５−ジクロロサリチルアルデヒドや、Ｒ^１が−ＣＨＯであり、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^６が水素であり、Ｒ^３及びＲ^５が塩素である、３，５−ジクロロベンツアルデヒドや、
Ｒ^１が−ＣＨＯであり、Ｒ^２がＯＨであり、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^６が水素であり、Ｒ^５が塩素である５−クロロサリチルアルデヒドや、Ｒ^１が−ＣＨＯであり、Ｒ^２がＯＨであり、Ｒ^３が塩素であり、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６が水素である３−クロロ−２−ヒドロキシベンツアルデヒドや、
Ｒ^１が−ＣＨＯであり、Ｒ^２がＯＨであり、Ｒ^３がフッ素であり、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６が水素である３−フルオロ−２−ヒドロキシベンツアルデヒドを特に好適に挙げることができる。

【0039】

式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｒ^１が−ＣＨＯに変換可能な基である−ＣＨ＝ＮＲ^７であるとき、これらはＲ^１が−ＣＨＯである式（Ｉ）で表される化合物とＲ^７ＮＨ_２との脱水縮合反応で得ることができる。具体的には、Ｒ^１が−ＣＨＯである式（Ｉ）で表される化合物とＲ^７ＮＨ_２とをジクロロメタン等の有機溶媒に溶解し、脱水剤を加えることで目的の化合物を得ることができる。このとき、脱水剤としては、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、中性アルミナ、塩基性アルミナなどを用いることができる。前記反応で、目的化合物が得られない場合若しくは得にくい場合は、ベンゼン又はトルエンを反応溶媒とし、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸等の不揮発性の酸を触媒として用い、ディーン・スターク反応装置を用いることで目的の化合物を得ることができる。

【0040】

式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｒ^１が−ＣＨＯに変換可能な基である−ＣＨ＝ＮＯＲ^８であるとき、これらはＲ^１が−ＣＨＯである式（Ｉ）で表される化合物とヒドロキシルアミン塩酸塩をジクロロメタン等の有機溶媒に溶解し、トリエチルアミン等の有機塩基を加えることで、Ｒ^８が水素である目的の化合物を得ることができる。この化合物を単離した後に、再度ジクロロメタン等の有機溶媒に溶解し、トリエチルアミン等の有機塩基の存在下、塩化メタンスルホニル、塩化トリフルオロメタンスルホニル、塩化ベンゼンスルホニル、又は塩化パラトルエンスルホニルのいずれかを加えることで、Ｒ^８がメタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、又はパラトルエンスルホニル基である目的の化合物を得ることができる。

【0041】

式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｒ^１が−ＣＨＯに変換可能な基である−ＣＨ（ＯＲ^９）ＯＲ^１０であるとき、これらはＲ^１が−ＣＨＯである式（Ｉ）で表される化合物とＲ^９ＯＨ、Ｒ^１０ＯＨとの脱水反応により得ることができる。具体的には、Ｒ^１が−ＣＨＯである式（Ｉ）で表される化合物とＲ^９ＯＨ、Ｒ^１０ＯＨとをベンゼン又はトルエンに溶解し、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸等の不揮発性の酸を触媒として用い、ディーン・スターク反応装置を用いることで目的の化合物を得ることができる。

【0042】

本発明における増強作用としては、相加作用と相乗作用を挙げることができるが、相乗作用が好ましく、相乗作用は、例えば、２種類の薬剤を併用した場合、ある特定の作用について、２種類の薬剤の作用が合わさった効果（相加効果）を超えた効果（相乗効果）を奏する作用である。２種類の薬剤がいかなる相互作用を有するかは、具体的にはSteel et al.（1979）らにより提案されたイソボログラムによる評価に基づき決定することができる。すなわち、例えば、Ａ剤とＢ剤の２つの薬剤を併用した場合、Ａ剤単独でのＩＣ_５０、ＩＣ_４０、ＩＣ_３０、ＩＣ_２０、ＩＣ_１０をそれぞれａ５、ａ４、ａ３、ａ２、ａ１とし、同様にＢ剤単独でのＩＣ_５０、ＩＣ_４０、ＩＣ_３０、ＩＣ_２０、ＩＣ_１０をそれぞれｂ５、ｂ４、ｂ３、ｂ２、ｂ１とし、次にグラフ上のＹ軸上に（０，ａ５）をプロットし、Ｘ軸上に（ｂ５，０）をプロットし、さらに(ｂ５−ｂ１，ａ１)、(ｂ５−ｂ２，ａ２)、(ｂ５−ｂ３，ａ３)、(ｂ５−ｂ４，ａ４)、(ｂ１，ａ５−ａ１)、(ｂ２，ａ５−ａ２)、(ｂ３，ａ５−ａ３)、(ｂ４，ａ５−ａ４)の値を同じグラフ上にプロットして各ポイントを結ぶ曲線を描き、Ａ剤とＢ剤の２つの薬剤を併用し、５０％細胞増殖抑制を示す薬剤濃度を前述のグラフにプロットした場合に、これらのポイントが曲線より低濃度側にあるときに相乗効果がある（synergistic）と判定し、曲線内にあるときに相加効果がある（additive）と判定し、曲線より高濃度側にあるときに一つの薬剤が他剤の作用を打ち消す場合の効果があるとして拮抗効果（antagonistic）があると判定することにより、相乗効果を奏する濃度を決定することができる。模式図を図１に示す。

【0043】

本発明の増強剤や式（Ｉ）で示される化合物の投与対象としては、哺乳動物を挙げることができ、具体的にはヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌを挙げることができ、なかでもヒトを好適に例示することができる。

【0044】

上記投与対象における標的細胞としては、ＰＤＴが適用可能な細胞であれば特に制限されず、がん細胞、いぼ、異形成、細菌・真菌感染部位細胞、ウイルス感染細胞を挙げることができるが、がん細胞が好ましく、ＰＤＴ耐性がん細胞がより好ましく、ＡＬＡ−ＰＤＴ耐性がん細胞がさらに好ましく、ＰＥＰＴ１発現・ＡＢＣＧ２低発現ＡＬＡ−ＰＤＴ耐性がん細胞がさらに好ましく、ＡＢＣＧ−２阻害剤と併用してもＰＤＴ増強作用がみられないＰＥＰＴ１発現・ＡＢＣＧ−２低発現ＡＬＡ−ＰＤＴ耐性がん細胞が特に好ましい。

【0045】

上記がんとしては、悪性黒色腫（メラノーマ）、皮膚がん、肺がん、気管及び気管支がん、口腔上皮がん、食道がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、大腸がん、肝臓及び肝内胆管がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、脳腫瘍等の上皮細胞などが悪性化したがん・腫瘍や、筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫等の支持組織を構成する細胞である筋肉や骨が悪性化したがん・腫瘍や、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫、バーキットリンパ腫等の造血細胞由来のがん・腫瘍などを挙げることができる。

【0046】

本発明の増強剤は、インビトロの系、インビボの系のいずれであっても、ＰＤＴの効果を増強することができる。インビトロの系で使用する方法としては、（ａ）上記投与対象の生物種由来の標的がん細胞に、本発明の増強剤と、本発明における光増感剤又はＡＬＡ類（以下、「光増感剤等」ともいう。）とを添加した後、ＰＤＴを行う工程を含む方法を挙げることができ、上記工程（ａ）としては、（ａ１）標的がん細胞を含む培地に本発明の増強剤を添加・混合し、光増感剤等を添加して混合後、５分間〜２５時間、より好ましくは１０分間から１５時間、さらに好ましくは２時間〜７時間、特に好ましくは３〜６時間培養し、次いで、本発明の増強剤及び光増感剤等を含む培地を除去した後、あらたに培地を加えてＰＤＴを行う工程を例示することができる。

【0047】

上記インビトロ系における本発明の増強剤の使用量としては、本発明の増強効果が得られる限り特に制限されないが、ＡＬＡ−ＰＤＴ感受性の標的細胞を培養する培地中の最終濃度として、例えばＡＬＡは２５μＭ〜１２５μＭを挙げることができ、２５μＭ〜５０μＭが好ましく、ＡＬＡ−ＰＤＴ低感受性の標的細胞ではＡＬＡは３００μＭ以上が好ましい。ＤＣＳＡは１０μＭ〜１００μＭを挙げることができ、３０μＭ〜１００μＭがより好ましい。

【0048】

本発明の増強剤や式（Ｉ）で示される化合物をインビボの系で使用する場合の投与経路としては、静脈内、筋肉内、動脈内等への注射投与；経口投与；経皮投与；経粘膜投与；経直腸投与；経腔投与；脳等への局所投与を例示することができ、なかでも、静脈内、筋肉内、動脈内等への注射投与；経口投与；経皮投与を好適に例示することができる。本発明の増強剤や式（Ｉ）で示される化合物の投与経路と、本発明における光増感剤等の投与経路は、同一であっても異なっていてもよい。また、本発明の増強剤や式（Ｉ）で示される化合物と、光増感剤等とは、対象に同時に投与してもよいし、いずれかを先に投与してもよいが、より優れた本発明の増強効果を得る観点から、本発明の増強剤や式（Ｉ）で示される化合物を先に投与し、光増感剤等を後で投与する態様を好適に例示することができる。

【0049】

上記インビボ系における本発明の増強剤や式（Ｉ）で示される化合物の使用量としては、本発明の増強効果が得られる限り特に制限されないが、本発明のＤＣＳＡ換算で成人１人１回のＰＤＴあたり、好ましくは１ｍｇ〜１００００ｍｇ、より好ましくは３ｍｇ〜３０００ｍｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ〜１０００ｍｇを好適に例示することができる。

【0050】

本発明の増強剤や式（Ｉ）で示される化合物には、本発明の増強効果が得られる限り、必要に応じてＰＤＴ効果を増強する他の任意成分を含むことができ、また、薬効成分、賦形剤等の他の成分を加えることができる。本発明の増強剤や式（Ｉ）で示される化合物をインビボの系で使用する場合の剤型としては、注射剤、点滴剤、膀胱内注入剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、シロップ剤、発布剤、座薬等を例示することができる。これらは溶剤、分散媒、増量剤、賦形剤等を適宜用い、常法に従って製剤することができる。

【0051】

本発明の増強剤や式（Ｉ）で示される化合物の構造がもたらすＰＤＴ効果の増強作用機序は不明であるが、細胞内ＰｐIX集積性から類推される効果を超えたＰＤＴによる殺細胞効果からすると、効果増強作用のうちの一つは細胞内ＰｐIX蓄積の上昇作用にある。

【0052】

本発明における光増感剤は、可視光を吸収して蛍光を発し、また、腫瘍組織や新生血管へ特異的に集積し、一重項酸素を発生することができる。これら光増感剤としては、ＰＤＴに使用されている光増感剤であれば使用することができるが、テトラピロール系化合物を例示することができ、具体的には、ＰｐIX、ポルフィマーナトリウム（フォトフリン）、タラポルフィンナトリウム（レザフィリン）、ベンゾポルフィリン、フォスキャン、クロリン、ウロポルフィリンI、ウロポルフィリンIII、ヘプタカルボキシルポルフィリンI、ヘプタカルボキシルポルフィリンIII、ヘキサカルボキシルポルフィリンI、ヘキサカルボキシルポルフィリンIII、ペンタカルボキシルポルフィリンI、ペンタカルボキシルポルフィリンIII、コプロポルフィリンI、コプロポルフィリンIII、イソコプロポルフィリン、ハルデロポルフィリン、イソハルデロポルフィリン、ヘマトポルフィリン、メソポルフィリン、エチオポルフィリン、ピロポルフィリン、デューテロポルフィリンIX、ペンプトポルフィリン、ＡＴＸｓ−１０、テトラ(ｍ−ヒドロキシフェニル)クロリン、スズ(IV)クロリンｅ６、フェオフォルビド、ピロフェオフォルビド、バクテリオクロリン、フタロシアニン、フェノチアジン、エチルエチプルプリンスズ、プルプリンイミドを挙げることができる。

【0053】

上記ＡＬＡ類としては、一般式（II）Ｒ^２Ｒ^１ＮＣＨ_２ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＲ^３で示される化合物、又はそれらの塩を挙げることができ、上記式（II）中、Ｒ^１及びＲ^２は各々独立に、水素原子、炭素数１〜２４のアルキル基、炭素数１〜１２のアシル基、炭素数２〜１３のアルコキシカルボニル基、炭素数６〜１６のアリール基又は炭素数７〜２２のアラルキル基を示し；Ｒ^３はヒドロキシ基、炭素数１〜２４のアルコキシ基、炭素数１〜１２のアシルオキシ基、炭素数２〜１３のアルコキシカルボニルオキシ基、炭素数６〜１６のアリールオキシ基、炭素数７〜２２のアラルキルオキシ基又はアミノ基である、５−ＡＬＡ若しくはその誘導体、又はそれらの塩が好ましい。

【0054】

式（II）における炭素数１〜２４のアルキル基としては、炭素数１〜２４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を挙げることができ、炭素数１〜１８のアルキル基が好ましく、特に炭素数１〜６のアルキル基が好ましい。炭素数１〜６のアルキル基として具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等を挙げることができる。

【0055】

式（II）における炭素数１〜１２のアシル基としては、炭素数１〜１２の直鎖又は分岐鎖のアルカノイル基、炭素数３〜１２の直鎖又は分岐鎖アルケニルカルボニル基、炭素数５〜１２の単環式若しくは多環式アロイル基又は炭素数５〜１２の単環式若しくは多環式アリールオキシカルボニル基を挙げることができ、特に炭素数１〜６のアルカノイル基が好ましく、具体的には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ペンタノイル基等を挙げることができる。なお、上記炭素数１〜１２のアシル基における炭素数には、カルボニル炭素が含まれる。

【0056】

式（II）における炭素数２〜１３のアルコキシカルボニル基としては、炭素数２〜７のアルコキシカルボニル基が好ましく、具体的には、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ペンチルオキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、ヘプチルオキシカルボニル基、オクチルオキシカルボニル基、ノニルオキシカルボニル基、デシルオキシカルボニル基、ウンデシルオキシカルボニル基、ドデシルオキシカルボニル基等を挙げることができる。なお、上記炭素数２〜１３のアルコキシカルボニル基における炭素数には、カルボニル炭素が含まれる。

【0057】

式（II）における炭素数６〜１６のアリール基としては、単環式又は多環式アリール基を挙げることができ、具体的には、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、ピレニル基等を挙げることができる。

【0058】

前記式（II）における炭素数７〜２２のアラルキル基としては、上記炭素数６〜１６のアリール基と上記炭素数１〜６のアルキル基とからなる基を挙げることができ、具体的には、ベンジル基、フェネチル基等を挙げることができる。

【0059】

式（II）における炭素数１〜２４のアルコキシ基としては、炭素数１〜２４の直鎖又は分岐鎖のアルコキシ基を挙げることができ、炭素数１〜１６のアルコキシ基が好ましく、特に炭素数１〜１２のアルコキシ基が好ましい。具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、オクチルオキシ基、デシルオキシ基、ドデシルオキシ基等を挙げることができる。

【0060】

式（II）における炭素数１〜１２のアシルオキシ基としては、炭素数１〜１２の直鎖又は分岐鎖のアルカノイルオキシ基を挙げることができ、炭素数１〜６のアルカノイルオキシ基が好ましい。具体的には、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ブチリルオキシ基、ペンタノイルオキシ基等を挙げることができる。

【0061】

式（II）における炭素数２〜１３のアルコキシカルボニルオキシ基としては、炭素数２〜７のアルコキシカルボニルオキシ基が好ましく、具体的にはメトキシカルボニルオキシ基、エトキシカルボニルオキシ基、ｎ−プロポキシカルボニルオキシ基、イソプロポキシカルボニルオキシ基、ブトキシカルボニルオキシ基、ペンチルオキシカルボニルオキシ基、ヘキシルオキシカルボニルオキシ基等を挙げることができる。なお、上記炭素数２〜１３のアルコキシカルボニルオキシ基における炭素数には、カルボニル炭素が含まれる。

【0062】

式（II）における炭素数６〜１６のアリールオキシ基としては、単環式又は多環式アリールオキシ基を挙げることができ、具体的には、フェノキシ基、ナフチルオキシ基、アントリルオキシ基、フェナントリルオキシ基、ピレニルオキシ基等を挙げることができる。炭素数７〜２２のアラルキルオキシ基としては、前記アラルキル基を有するものが好ましく、具体的には、ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基等を挙げることができる。

【0063】

式（II）において、Ｒ^１及びＲ^２としては水素原子が好ましい。Ｒ^３としてはヒドロキシ基、アルコキシ基又はアラルキルオキシ基が好ましく、ヒドロキシ基又は炭素数１〜１２のアルコキシ基がより好ましく、メトキシ基又はヘキシルオキシ基が特に好ましい。

【0064】

式（II）において、Ｒ^１及びＲ^２が水素原子であり、Ｒ^３がヒドロキシ基である化合物は５−ＡＬＡであり、特に好ましく挙げることができる。５−ＡＬＡ以外の５−ＡＬＡ誘導体の好適な例として、５−ＡＬＡメチルエステル、５−ＡＬＡエチルエステル、５−ＡＬＡプロピルエステル、５−ＡＬＡブチルエステル、５−ＡＬＡペンチルエステル、５−ＡＬＡヘキシルエステル等の５−ＡＬＡエステルを挙げることができ、特に５−ＡＬＡメチルエステル又は５−ＡＬＡヘキシルエステルが好ましく挙げることができる。なお、５−ＡＬＡのエステル体が、５−ＡＬＡと同様の生理的効果を示すことは、例えば特表平１１−５０１９１４号公報に開示されている。

【0065】

５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡ誘導体の薬理学的に許容される塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を挙げることができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を挙げることができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を挙げることができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を挙げることができる。

【0066】

５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡ誘導体は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産のいずれの方法によっても製造することができる。例えば、５−ＡＬＡ誘導体のアミノ基におけるアシル基や、カルボキシル基におけるエステル基等は、化学合成の常法により、アミノ基のアシル化や、カルボキシル基のエステル化等により製造することができる。また、５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡ誘導体の塩を取得したいとき、一般式（II）で示される化合物が塩の形で得られる場合には、そのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られる場合には、適当な有機溶媒に溶解若しくは懸濁させ、酸又は塩基を加えて通常の方法により塩を形成させればよい。５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡ誘導体は、水又は各種溶媒との付加物の形で存在することもできる。

【0067】

本発明における光増感剤等の投与量としては、本発明の増強剤や式（Ｉ）で示される化合物による増強効果が得られる限り特に制限されず、例えば、光増感剤等がＡＬＡ類である場合の経口投与量としては、５−ＡＬＡ換算で体重１ｋｇあたり、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜３０ｍｇ、さらに好ましくは１５ｍｇ〜２５ｍｇであるが、本発明の増強剤と併用するにあたっては通常のＰＤＴで推奨される量の１０〜９０％、好ましくは２０〜８０％、より好ましくは３０〜７０％、さらに好ましくは４０〜６０％を挙げることができる。また、ＡＬＡ類を溶液の形態で使用する場合は、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意して調製することが好ましい。アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって有効成分の分解を防ぐことができる。

【0068】

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

【実施例】

【0069】

［実施例１］
［新規ＰＤＴ作用効果増強剤の探索１］
徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀均教授及び宇都義浩准教授より提供された１８種類の被検化合物について、各被検化合物と５−ＡＬＡ塩酸塩とを用いたＰＤＴ（５−ＡＬＡ−ＰＤＴ）を行い、ＰＤＴの効果増強作用を検討した。

【0070】

がん細胞として、ヒト胃がん細胞株であるＭＫＮ−４５細胞を用いた。かかるＭＫＮ−４５細胞は、１０％（v/v）非働化ウシ胎児血清（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）と５０μｇ／ｍＬカナマイシン（明治製菓株式会社製）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬社製）（１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ）中で、３７℃にて５％ＣＯ_２インキュベーター内で培養して継代維持した。細胞は、０．２５％トリプシン−２ｍＭのＥＤＴＡ溶液で浮遊細胞として実験に供した。上記ＭＫＮ−４５細胞は、ＡＬＡの取込みトランスポーター（ＰＥＰＴ１）を発現しているがＡＢＣＧ２トランスポーターの発現が低く、かつＡＢＣＧ−２阻害剤との併用によるＰＤＴ効果の増強がみられない細胞であることが、既に発明者により確認されている。

【0071】

上記ＭＫＮ−４５細胞は、５×１０^３細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種後、一晩３７℃にて培養した。培地として、１０％ＦＢＳ（HyClone Laboratories社製、South Logan, UT, USA）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を使用した。培養後培地を除去し、あらたに１８９μＬの１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩをウェルに添加し、ＤＭＳＯに溶解して２ｍＭ及び２０ｍＭとなるように調製した各被検化合物をＤＭＳＯにより段階希釈して１μＬ／ウェル添加し、ミキサーにより混合した（培地中での終濃度１０μＭ及び１００μＭ）。ついで、注射用蒸留水に溶解して２ｍＭとなるように調製した５−ＡＬＡ塩酸塩を１０μＬ添加してミキサーにより混合後（終濃度１００μＭ）、ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて４時間培養した。

【0072】

培養後、各被検化合物及び５−ＡＬＡ塩酸塩を含む培地を除去し、あらたに２００μＬの１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩを添加し、９６ウェルプレート用ＰＤＴ照射装置により、波長６２８．１ｎｍにて５分間照射し、ＰＤＴを行った。コントロール群としてＡＬＡ未添加のウェル（ＡＬＡ（−））及び／又は被検化合物未添加のウェルを設け、同様にＰＤＴを行った。

【0073】

殺細胞効果の測定については、Cell-Counting Kit-8（同仁化学研究所社製）を用いて水溶性フォルマザンを生成するテトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を発色基質として用い、生成したＭＴＴフォルマザン濃度を測定するＭＴＴ改良法により行った。すなわち、５−ＡＬＡ−ＰＤＴ処置７２時間経過後に、培地を除去し、２００μＬのＰＢＳで洗浄し、４０倍に希釈したCell-Counting Kit-8溶液を各ウェルに２００μＬ分注し、さらにＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて１時間培養した。生成したＭＴＴフォルマザン濃度について、イムノリーダー（日本インターメッド社製）を用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、以下の式を用いてＩＲを算出した。結果を以下の表１に示す。

【0074】

［数１］
ＩＲ（％）＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００
（但し、Ｔは５−ＡＬＡ塩酸塩と各被検化合物を添加した各ウェルの平均吸光度、Ｃはコントロール群のウェルの平均吸光度である。）

【0075】

【表1】

【0076】

（結果）
表１から明らかなとおり、５−ＡＬＡ塩酸塩を添加せずに化合物ＴＸ−８１６を１０μＭ添加してＰＤＴを行った場合には、ＭＫＮ−４５細胞について３％のＩＲしか示さなかったのに対し、１００μＭの５−ＡＬＡ塩酸塩を添加し、化合物ＴＸ−８１６を１０μＭ添加してＰＤＴを行った場合には８０％近いＩＲを示し、上記１８種類の被検化合物の中で最大の効果的な５−ＡＬＡ−ＰＤＴ増強作用を示した。なお、被検化合物を添加せず、１００μＭの５−ＡＬＡ塩酸塩を添加してＰＤＴを行ったコントロールでは、３３％のＩＲを示した。

【0077】

［実施例２］
［ＴＸ−８１６の作用効果の検討］
上記ＴＸ−８１６について、ＡＬＡ−ＰＤＴ効果増強作用をさらに詳細に検討した。終濃度が０、０．４１、１．２３、３．７０、１１．１、３３．３、及び１００μＭとなるように調製したＴＸ−８１６（終濃度１００μＭの場合は２０ｍＭ）を１μＬ／ウェル添加し、注射用蒸留水に溶解して終濃度が０、５０、１００、２００μＭになるように調製したＡＬＡ（終濃度２００μＭの場合は４ｍＭ）を１０μＬ添加してミキサーにより混合後、５時間培養し、実施例１と同様の手順で５−ＡＬＡ−ＰＤＴを行い、ついでＭＴＴ改良法を行った。ＴＸ−８１６の各濃度におけるＩＲを片変数グラフにプロットし、ＩＣ_５０（５０％阻害濃度）値を求めた。結果を図２〜４に示す。

【0078】

（結果）
図２から明らかなとおり、ＴＸ−８１６は濃度依存的にＡＬＡ−ＰＤＴ効果を増強することが確認され、５−ＡＬＡ塩酸塩が５０μＭの場合に最も濃度依存的ＰＤＴ作用増強効果を奏することが確認された。

【0079】

図３から明らかなとおり、イソボログラム法による併用効果の判定を行った結果、ＴＸ−８１６のＡＬＡ−ＰＤＴ増強効果は、相乗効果であることが確認された。

【0080】

図４から明らかなとおり、ＴＸ−８１６の７２時間持続接触によるＭＫＮ−４５細胞に対する増殖抑制効果におけるＩＣ_５０値は３６．５μＭと計算され、長時間の持続接触でも低毒性の濃度で相乗効果を発揮できることが確認された。

【0081】

（考察）
ＭＫＮ−４５細胞は、ＡＬＡ−ＰＤＴ耐性細胞であるが、ＡＢＣＧ２の発現は低く、かつ、ＡＬＡの取り込みトランスポーター（ＰＥＰＴ１）が発現していることが確認されているので、今回の実験に用いた細胞に、５−ＡＬＡが取り込まれていないという事象は考えにくい。また、細胞内に取り込まれたＡＬＡがポルフィリンに代謝される過程において段階的に働く代謝酵素をコードする遺伝子群の発現についても検討したが、特に異常な発現プロファイルはみられなかった（データ特に示さず）。したがって、ＴＸ−８１６は、ＡＬＡ類と併用することでＡＬＡ−ＰＤＴ耐性細胞におけるＰＤＴの作用効果を相乗的に増強することができるといえる。

【0082】

［実施例３］
［ＤＣＳＡ及びＣＡＮの作用効果の検討］
ＴＸ−８１６は、図５に示すとおり、ジクロロフェノールとクロロニトロベンゼンがシッフ塩基として結合したＮ−３’，５’−ジクロロ−２’−ヒドロキシベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロアニリン（図５（ａ）参照）である。ＴＸ−８１６は水溶性が低いため、本願の検討においてはＤＭＳＯに溶解して用いたが、ＤＭＳＯ中で、ＤＣＳＡ（図５（ｂ）参照）とＣＮＡ（図５（ｃ）参照）に分解することが、発明者らの解析により明らかになった。それゆえ、本発明のＰＤＴ作用効果増強剤の活性本体はＤＣＳＡ又はＣＮＡのいずれか一方である可能性があり、ＤＣＳＡ、ＣＡＮ、ＴＸ−８１６を比較して、ＭＫＮ−４５細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴ効果増強作用を検討した。濃度が１１．１、３３．３、及び１００μＭとなるように調製したＤＣＳＡ、ＣＮＡ、及びＴＸ−８１６をそれぞれ１μＬ／ウェル添加し、ＤＭＳＯに溶解して終濃度が０、３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００μＭになるように調製した１０μＬの５−ＡＬＡ塩酸塩をさらに添加してミキサーにより混合後、５時間培養し、実施例１と同様の手順で５−ＡＬＡ−ＰＤＴを行い、ついでＭＴＴ改良法を行い、ＩＲを算出した。結果を以下の表２に示す。

【0083】

【表2】

【0084】

（結果）
上記表２から明らかなとおり、ＤＣＳＡはＴＸ−８１６と同程度の効果増強作用を示す一方、ＣＮＡには全く増強作用が認められず、ＤＣＳＡがＡＬＡ−ＰＤＴ効果増強作用を有する化合物であることが確認された。

【0085】

［実施例４］
［新規ＰＤＴ作用効果増強剤の探索２］
ＰＤＴ効果増強作用を有するさらなる化合物探索のための検討対象として、ＤＣＳＡの類縁化合物及び誘導体である、以下の表３に示した１８化合物をピックアップした。その内、６化合物（化合物番号：３，６，７，８，１１，１２）について、被検化合物として、ＭＫＮ−４５細胞におけるＡＬＡ−ＰＤＴ効果増強作用をＤＣＳＡ（化合物番号：１）と比較して検討した。終濃度が０、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００μＭとなるように調製した各被検化合物を１μＬ／ウェル添加し、終濃度が０、５０μＭになるように調製した１０μＬの５−ＡＬＡ塩酸塩をさらに添加してミキサーにより混合後、５時間培養し、実施例１と同様の手順で５−ＡＬＡ−ＰＤＴを行い、ついでＭＴＴ改良法を行い、ＩＲを算出した。結果を図６に示す。

【0086】

【表3】

【0087】

（結果）
ＤＣＳＡ類縁化合物の内、上記表３に示された化合物のうち、化合物６（３，５−ジクロロベンツアルデヒド），７（５−クロロサリチルアルデヒド），及び８（３−クロロ−２−ヒドロキシベンツアルデヒド）等のアルデヒド基を有する化合物において、ＤＣＳＡに匹敵する増強作用が認められた（図６参照）。一方、アルデヒド基がカルボキシル基に置換された化合物３では活性がなく、アルデヒド基がアミド基に置換された化合物１２や、アルデヒド基を有さない化合物１１では活性が低いことから、アルデヒド基が活性発現に重要であることが確認された。このことから、ベンツアルデヒドへアルデヒド基の求電子性を高める置換基を導入することで、さらなる活性の向上が期待できる。
アルデヒド基が活性発現に重要であることが確認された。

【0088】

［比較例１］
（正常細胞における増強効果）
がん細胞として前記ＭＫＮ−４５細胞を、正常細胞としてヒト臍帯血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ細胞(C2517A; Lonza社製, Walkersville, MD, USA)をそれぞれ用いて、本発明の増強剤共存下での５−ＡＬＡ−ＰＤＴ感受性の比較を行った。

【0089】

ＭＫＮ−４５細胞及びＨＵＶＥＣ細胞はそれぞれ１×１０^４個／ウェルを９６ウェルプレートに播種後一晩３７℃にて培養した。細胞毎の専用培地として、ＭＫＮ−４５細胞には１０％ＦＢＳ（HyClone Laboratories社製、South Logan, UT, USA）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（10％FBS-RPMI; 日水製薬社製）を、ＨＵＶＥＣ細胞には内皮細胞培地キット−２（EGM-2 BulletKit; CC-3162, Lonza社）をそれぞれ使用した。

【0090】

培養後各上記専用培地を除去し、各細胞について、あらたに１８９μＬのそれぞれの上記専用増殖培地をウェルに添加後、ＤＭＳＯに溶解して終濃度３０μＭ又は１００μＭになるように調製したＤＣＳＡをそれぞれ１μＬ／ウェル添加し、注射用蒸留水に溶解して段階希釈したＡＬＡをさらに添加してミキサーにより混合し、実施例１と同様の手順で５−ＡＬＡ−ＰＤＴを行い、ついでＭＴＴ改良法を行い、ＩＣ_５０を算出した。結果を以下の表４に示す。

【0091】

【表4】

【0092】

（結果）
上記表４に示されるとおり、ＨＵＶＥＣ細胞は５−ＡＬＡ−ＰＤＴ感受性は低いことから、正常細胞に対するＤＣＳＡの作用は、がん細胞に対する作用効果とは明確な相違があった。

【0093】

［比較例２］
［新規ＰＤＴ作用効果増強剤の探索３］
ＤＣＳＡ類縁化合物として、以下の表５に表される被検化合物（整理番号：７−２、７−３、７−４、７−５、７−６、７−７）について、ＤＣＳＡ（整理番号：７−１）と比較したＡＬＡ−ＰＤＴ効果増強作用を検討した。ＤＭＳＯに溶解して培地中での終濃度が０、０．４１、１．２３、３．７０、１１．１、３３．３、及び１００μＭとなるように調製した各化合物を１μＬ／ウェル添加し、注射用蒸留水に溶解して終濃度が０、５０μＭになるように調製した１０μＬのＡＬＡをさらに添加してミキサーにより混合後、５時間培養し、実施例１と同様の手順で５−ＡＬＡ−ＰＤＴを行い、ついでＭＴＴ改良法を行い、ＩＲを算出した。結果を図７に示す。

【0094】

【表5】

【0095】

（結果）
上記化合物の中には消炎・解熱・鎮痛作用や抗血小板作用を持つサリチル酸やアセチルサリチル酸(アスピリン)も含む。図７より明らかなとおり、3-hydroxybenzaldehyde（ＨＢＡ）、benzaldehyde（ＢＡ）やsalicylaldehyde（ＳＡ）はアルデヒド基を有していても効果増強作用はみられなかった。ＡＬＡ−ＰＤＴ効果増強作用においてはアルデヒド基と水酸基や塩素原子などの導入置換基の位置関係が重要であることが明らかになった。また、サリチル酸やアセチルサリチル酸には効果増強作用はなく、サリチル酸系非ステロイド性抗炎症薬におけるプロスタグランジン（ＰＧ）合成抑制作用とは異なる作用機序を有することが推察される。

【0096】

［実施例５］
［新規ＰＤＴ作用効果増強剤の探索４］
3−chloro-2-hydroxy-benzaldehydeにおける塩素原子の代わりにフッ素原子を導入した3-fluorosalicylaldehyde（３−ＦＳＡ）を用いてＡＬＡ−ＰＤＴ効果増強作用を検討した。６ｍＭ（終濃度３０μＭ）のＤＣＳＡ、６ｍＭ（終濃度３０μＭ）の３−ＦＳＡ、２０ｍＭ（終濃度１００μＭ）の３−ＦＳＡを１μＬ／ウェル添加し、注射用蒸留水に溶解して終濃度が０、７．８、１５．６、３１、６３、１２５、２５０μＭになるように調製した１０μＬのＡＬＡをさらに添加してミキサーにより混合後、５時間培養し、実施例１と同様の手順で５−ＡＬＡ−ＰＤＴを行い、ついでＭＴＴ改良法を行い、細胞抑制率とＩＣ_５０を算出した。結果を図８に示す。

【0097】

（結果）
図８より明らかなとおり、１００μＭの活性は３０μＭのＤＣＳＡに相当する活性を示した。３−ＦＳＡの活性はＤＣＳＡの約３分の１と評価された。

【0098】

［実施例６］
［細胞内のＰｐIX蓄積の検討］
ＤＣＳＡのＡＬＡ−ＰＤＴ効果増強作用の機序を検討する目的でＬＬＳ−４０５ＶＩＳＬＥＤ光源とＳＥＣ２０００−ＶＩＳ／ＮＩＲスペクトロメーターＳＬＩＴ２００蛍光測定装置（ビー・エス・エイ社製）とを用いて、ＭＫＮ−４５細胞の細胞内のＰｐIX蓄積に与えるＤＣＳＡの効果を解析した。１５ｃｍディッシュに５×１０^６個のＭＫＮ−４５細胞を播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。細胞が十分に増殖したところで１９ｍＬの加温した新鮮な１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１４６０培地を添加した。ＤＭＳＯに溶解したＤＣＳＡを終濃度３０μＭ又は１００μＭ（ＤＭＳＯ終濃度は０．５％）になるように培地に加えたのち、１ｍＭ又は２ｍＭの５-ＡＬＡを１ｍＬ（終濃度５０μＭ及び１００μＭ）を添加した。５時間培養した後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡにより回収した後に、１０ｍＬの１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１４６０培地に懸濁し、細胞数を計数した。遠心後ＰＢＳで２回洗浄し、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により細胞を溶解した。１５，０００ｒｐｍにて１５分間の遠心後、上清を回収し、ＳＥＣ２０００−ＶＩＳ／ＮＩＲスペクトロメーターにより蛍光強度を測定した。結果を図９に示す。

【0099】

（結果）
図９に示したとおり、５０μＭの５−ＡＬＡ単独処理時（ａ）に比べて、５０μＭの５−ＡＬＡと１００μＭのＤＣＳＡとを同時処理した場合（ｂ）、細胞内ＰｐIXが約５．５倍も増加した。本発明の増強剤による効果増強作用のうちの一つは、本発明の増強剤自身の細胞内ＰｐIX蓄積の上昇効果作用にあると推測される。

【産業上の利用可能性】

【0100】

本発明の増強剤は、ＰＤＴを用いる医療分野において有用である。

【図1】

【図2】

【図4】

【図5】

【図3】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】