特許 5936553 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5936553

(24)【登録日】2016年5月20日

(45)【発行日】2016年6月22日

(54)【発明の名称】新規糖転移酵素遺伝子及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160609BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20160609BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20160609BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160609BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20160609BHJP

   A01H 5/00 20060101ALI20160609BHJP

   A01H 5/02 20060101ALI20160609BHJP

   A23L 5/41 20160101ALI20160609BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20160609BHJP

   C12P 19/44 20060101ALI20160609BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20160609BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20160609BHJP

   A61K 8/60 20060101ALI20160609BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A01H5/00 A

   A01H5/02

   A23L1/272

   C12N9/10

   C12P19/44

   A23L1/30 B

   A61K31/7048

   A61K8/60

【請求項の数】16

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2012-552745(P2012-552745)

(86)(22)【出願日】2012年1月11日

(86)【国際出願番号】JP2012050379

(87)【国際公開番号】WO2012096307

(87)【国際公開日】20120719

【審査請求日】2014年10月23日

(31)【優先権主張番号】特願2011-6317(P2011-6317)

(32)【優先日】2011年1月14日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】309007911

【氏名又は名称】サントリーホールディングス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(72)【発明者】

【氏名】田中 良和

(72)【発明者】

【氏名】興津 奈央子

(72)【発明者】

【氏名】松井 啓祐

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５１９９４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１５６２１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／００３００９０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Phytochemistry，１９９８年，Vol.48, No.2，p.389-393

【文献】 Natural Product Reports，２００９年，Vol.26, No.7，p.884-915

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１又は３又は１２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は３又は１２の塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。

【請求項2】

（ａ）配列番号１又は３又は１２の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

（ｃ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

（ｆ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列に対して、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

（ｇ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列に対して、９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

（ｈ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列に対して、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

ＤＮＡである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質。

【請求項9】

請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。

【請求項10】

請求項９に記載のベクターが導入された非ヒト宿主。

【請求項11】

請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを用いてフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を付加する方法。

【請求項12】

請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入され、かつ、該ポリヌクレオチドを含有する、植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。

【請求項13】

切花である、請求項１２に記載の植物の部分。

【請求項14】

請求項１３に記載の切花を用いた切花加工品。

【請求項15】

以下の工程：
請求項１０に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
該非ヒト宿主からフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取する、
を含む、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質の製造方法。

【請求項16】

以下の工程：
請求項１０に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
該非ヒト宿主から、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されたフラボンを採取する、
を含む、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されたフラボンの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

花産業において、新しい形質を持つ花は常に珍重される。特に、花の最も重要な形質である「色」を変化させた植物の開発は産業上重要視され、これまで、古典的な方法である交配による品種改良によってさまざまな色の花が開発されてきた。交配は有効な品種改良方法であるものの、植物に固有の遺伝的制限があるため、交配可能な近縁種が持つ遺伝子資源しか利用することができないという欠点がある。例えば、長年の交配育種にもかかわらず、バラ、カーネーション、キク、ユリには紫色〜青色、リンドウ、アイリスには鮮やかな赤色、ゼラニウム、アサガオには黄色の品種は、これまで作出されていない。

【0003】

花の色は、フラボノイド、カロテノイド、クロロフィル、ベタレインの４種類の色素に起因する。この中で、フラボノイドは黄、赤、紫、青といった多様な色を呈する。赤、紫、青色を呈する１グループはアントシアニンと総称され、アントシアニンの構造の多彩さが花の色が多彩である原因の１つである。アントシアニンはその生合成経路を考慮するとアグリコンの構造に依り、大きく３つのグループに分類することができる。カーネーションやゼラニウムのような鮮やかな赤色の花にはペラルゴニジン型アントシアニンが、青色や紫色の花にはデルフィニジン型アントシアニンが含まれることが多い。バラ、カーネーション、キク、ユリに青や紫色の品種が存在しないのは、これらの植物がデルフィニジン型アントシアニンを合成する能力がないことが原因である。

【0004】

花色が青くなるためにはデルフィニジンが蓄積することに加え、（ｉ）アントシアニンが１つ又は複数の芳香族アシル基により修飾されること、（ｉｉ）アントシアニンがフラボンやフラボノールなどのコピグメントと共存すること、（ｉｉｉ）鉄イオンやアルミニウムイオンがアントシアニンと共存すること、（ｉｖ）アントシアニンが局在する液胞のｐＨが中性から弱アルカリ性に上昇すること、又は（ｖ）アントシアニン、コピグメント、金属イオンが錯体を形成すること（このようなアントシアニンはメタロアントシアニンと呼ばれる）のいずれかが必要であると考えられている（以下、非特許文献１）。

【0005】

フラボノイドやアントシアニン生合成はよく研究され、関連する生合成酵素やそれをコードする遺伝子が同定されている（以下、非特許文献２参照、図１参照）。例えば、デルフィニジンの生合成に必要なフラボノイドのＢ環を水酸化するフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）の遺伝子は多くの植物から得られている。また、これらのＦ３’５’Ｈ遺伝子をカーネーション（以下、特許文献１参照）、バラ（以下、非特許文献３、特許文献２、３参照）、キク（以下、特許文献４参照）に導入することにより、花弁でデルフィニジンを蓄積し、花の色が青く変化した遺伝子組換え植物も作出されている（以下、非特許文献４参照）。このようなカーネーションとバラは市販されている。

【0006】

フラボン(flavone)は、有機化合物の１種で、フラバン誘導体の環状ケトンであり、狭義には化学式Ｃ₁₅Ｈ₁₀Ｏ₂、分子量２２２．２４の化合物、２，３−ジデヒドロフラバン−４−オン(2,3-didehydroflavan-4-one)を指す。広義にはフラボン類に属する誘導体を「フラボン」と称する。広義のフラボン（フラボン類）はフラボノイドのカテゴリーの１つであり、フラボノイドの中でフラボン構造を基本骨格とし、さらに３位に水酸基を持たないものが「フラボン」に分類される。代表的な「フラボン」としてはアピゲニン(apigenin; 4',5,7-trihydroxyflavone)やルテオリン(luteolin; 3',4',5,7-tetrahydroxyflavone）が挙げられる。本願明細書中、用語「フラボン」とは、広義のフラボン、すなわち、フラボン類に属する誘導体を意味する。

【0007】

フラボンの生合成に必要なフラボン合成酵素（ＦＮＳ）の遺伝子も多くの植物から得られている。フラボンは、アントシアニンと共存するとアントシアニンの色を青く濃くする効果があることが知られており、これらのＦＮＳ遺伝子は花色改変において注目されていた。Ｆ３’５’Ｈと共にＦＮＳ遺伝子を、フラボンを合成する能力がないバラへ導入することにより、花弁でデルフィニジンを蓄積すると同時に、フラボンも蓄積し、花の色がより一層青く変化した（以下、特許文献５参照）。また、フラボンは、花色青色化以外に、紫外線を吸収することから、植物を紫外線から守ったり、虫媒花では昆虫の視覚へのシグナルとして機能する。また、フラボンは植物と土壌微生物との相互作用にも関係している。さらに、フラボンは健康によい成分として食品や化粧品の素材としても用いられている。 例えば、フラボンは抗癌作用を有するといわれており、フラボンを多く含む食材を摂取することによって、ガンの治療や予防になることも実証されている。

【0008】

また、アントシアニンやフラボンを修飾する遺伝子も多くの植物から得られている。糖転移酵素、アシル基転移酵素、メチル基転移酵素などがあるが、ここでは配糖化反応を触媒する糖転移酵素（ＧＴ）について記載する。例えば、アントシアニンの３位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、リンドウ、シソ、ペチュニア、バラ、キンギョソウなどから単離されている（以下、非特許文献４〜６、特許文献６参照）。アントシアニンの５位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、シソ、ペチュニア、リンドウ、バーベナ、トレニアなどから単離されている（以下、非特許文献５〜７、特許文献７参照）。フラボンの７位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、シロイヌナズナから単離されている（以下、非特許文献８参照）。バイカレンの７位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がコガネバナから単離されており、この遺伝子を大腸菌で発現させたタンパク質がフラボノイドの７位の水酸基にグルコースを転移する活性を示す反応を触媒することも報告されている（以下、非特許文献９参照）。アントシアニンの３’位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、リンドウ、チョウマメ、サイネリアから単離されている（以下、特許文献８参照）。また、アントシアニンのＡ環とC環の異なる２箇所の水酸基に逐次的にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がバラで単離されている（以下、特許文献９参照）。アントシアニンのＢ環の異なる２箇所の水酸基に逐次的にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がチョウマメで単離されている（以下、特許文献１０参照）。

【0009】

前記した糖転移酵素は、ＵＤＰ−グルコースを糖供与体としているが、最近、アシルグルコースを糖供与体とする糖転移酵素も同定されている。アントシアニン−３グルコシドの５位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がカーネーションから、７位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がデルフィニウムから単離されている（以下、非特許文献１０参照）。

【0010】

このように糖転移酵素としては様々な水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質が多数存在している。
しかしながら、その機能が同定されていない糖転移酵素も未だ多数残っていると考えられている。例えば、フラボノイドの４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子や、フラボノイドのＡ環とＢ環の２箇所の水酸基に逐次的に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は未だ同定されていない。リビングストンデージー由来の糖転移酵素遺伝子を大腸菌で発現させたタンパク質が、in vitro においてフラボノイドの４’位又は７位のいずれか一方の水酸基にグルコースを転移する活性を示すことが報告されているが、この糖転移酵素の植物体における本来の活性は、ベタニジンの５位の水酸基にグルコースを転移するものである（以下、非特許文献１１参照）。

【0011】

ところで、ツユクサ、ヤグルマギク、サルビア、ネモフィラの色素に代表されるメタロアントシアニンは、アントシアニン６分子、フラボン６分子、及び金属イオン２原子からなり、各成分が集合して安定な青色色素を形成している（図２、非特許文献１参照）。例えば、ネモフィラのメタロアントシアニンは、ネモフィリン（図３参照）、マロニルアピゲニン４’，７−ジグルコシド（図４参照）、Ｍｇ²⁺、及びＦｅ³⁺から形成されている。サルビアのメタロアントシアニンは、シアノサルビアニン（図５参照）、アピゲニン４’，７−ジグルコシド（図６参照）、及びＭｇ²⁺から形成されている。これまでの研究によって、メタロアントシアニンを形成する青い花はすべて、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されているフラボンを生合成しており、そのフラボンに付加されている糖が、メタロアントシアニン形成における分子認識において、重要な役割を担っていることが分かっている。フラボンの４’位に配位されている糖が形成時の分子認識に重要であり、７位の糖はその安定性に寄与することが示されている（以下、非特許文献１参照）。これら２つの糖がフラボンに付加されてはじめて、メタロアントシアニンが形成され、美しい青色が発現する。また、青いダッチアイリス花弁には４’位に糖が付加したフラボンが含まれている。また、フラボンに糖が２個付加されることによって溶解度が上がり、物性も変わるため、健康食品、医薬品や化粧品素材としての用途が拡がることが期待される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】国際公開第ＷＯ２００６／１０５５９８号パンフレット

【特許文献2】国際公開第ＷＯ２０１０／１２２８４９号パンフレット

【特許文献3】国際公開第ＷＯ２００５／０１７１４７号パンフレット

【特許文献4】国際公開第ＷＯ２００９／０６２２５３号パンフレット

【特許文献5】国際公開第ＷＯ２００８／１５６２１１号パンフレット

【特許文献6】国際公開第ＷＯ２００７／０９４５２１号パンフレット

【特許文献7】国際公開第ＷＯ９９／０５２８７号パンフレット

【特許文献8】国際公開第ＷＯ０１／０９２５０９号パンフレット

【特許文献9】特開２００６−１４９２９３号公報

【特許文献10】特開２００５−９５００５号公報

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Natural Product Reports (2009), 26, 884-915

【非特許文献2】Biosci. Biotechnol. Biochem (2010), 74(9), 1760-1769

【非特許文献3】Plant Cell Physiol (2007), 48(11), 1589-1600

【非特許文献4】Plant Cell Physiol (1996), 37(5), 711-716

【非特許文献5】J. Biol. Chem (1999), 274(11), 7405-7411

【非特許文献6】Plant Molecular Biology (2002), 48, 401-411

【非特許文献7】Journal of Experimental Botany (2008), 59(6), 1241-1252

【非特許文献8】Biosci. Biotechnol. Biochem (2006), 70(6), 1471-1477

【非特許文献9】Planta (2000), 210, 1006-1013

【非特許文献10】Plant Cell (2010), 22(10), 3374-89

【非特許文献11】The Plant Journal (1999), 19(5), 509-519

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

フラボンの物性を変えることは、花の色を変えることや、食品、医薬品、化粧品の素材の開発に必要である。例えば、デルフィニジンを蓄積しているカーネーション、バラ、キクの色は青紫色であるが、この色をさらに青くする研究が行われている。
かかる状況の下、本発明が解決しようとする課題は、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとその使用を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0015】

上記課題を解決すべく、本願出願人らは鋭意検討し、実験を重ねた結果、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離し、これを使用することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りのものである。

【0016】

［１］以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１又は３又は１２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は３又は１２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。

【0017】

［２］（ａ）配列番号１又は３又は１２の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。

【0018】

［３］（ｃ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。

【0019】

［４］（ｆ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列に対して、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。

【0020】

［５］（ｇ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列に対して、９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［４］に記載のポリヌクレオチド。

【0021】

［６］（ｈ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列に対して、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［５］に記載のポリヌクレオチド。

【0022】

［７］ＤＮＡである、前記［１］〜［６］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

【0023】

［８］前記［１］〜［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質。

【0024】

［９］前記［１］〜［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。

【0025】

［１０］前記［９］に記載のベクターが導入された非ヒト宿主。

【0026】

［１１］前記［１］〜［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いてフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を付加する方法。

【0027】

［１２］前記［１］〜［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入され、かつ、該ポリヌクレオチドを含有する、植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。

【0028】

［１３］切花である、前記［１２］に記載の植物の部分。

【0029】

［１４］前記［１３］に記載の切花を用いた切花加工品。

【0030】

［１５］以下の工程：
前記［１０］に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
該非ヒト宿主からフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取する、
を含む、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質の製造方法。

【0031】

［１６］以下の工程：
前記［１０］に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
該非ヒト宿主から、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されたフラボンを採取する、
を含む、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されたフラボンの製造方法。

【0032】

［１７］前記［１６］に記載の製造方法により製造された４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されフラボンを含有する食品。

【0033】

［１８］前記［１６］に記載の製造方法により製造された４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されフラボンを含有する医薬品。

【0034】

［１９］前記［１６］に記載の製造方法により製造された４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されフラボンを含有する化粧品。

【発明の効果】

【0035】

本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内で発現させることにより、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に特異的に糖を転移する活性を有するタンパク質を製造することが可能となる。本発明により、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を、植物内で、構成的又は組織特異的に発現させることで、花色の改変に利用することができる。また、本発明により、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加したフラボンの製法、及び該製法によって得られた食品、医薬品、化粧品なども提供される。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】アントシアニンの生合成経路を説明する図である。

【図2】メタロアントシアニンの構造の概要図である。

【図3】ネモフィラ由来のアントシアニン（ネモフィリン）の構造式である。

【図4】ネモフィラ由来のフラボン（マロニルアピゲニン４’，７−ジグルコシド)の構造式である。

【図5】サルビア由来のアントシアニン（シアノサルビアニン）の構造式である。

【図6】サルビア由来のフラボン（アピゲニン４’，７−ジグルコシド）の構造式である。

【図7】花弁抽出液とアピゲニンを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。

【図8】アピゲニン４’，７−ジグルコシドの生合成経路を説明する図である。

【図9】ＮｍＧＴ３タンパク質溶液とアピゲニンを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。

【図10】ＮｍＧＴ４タンパク質溶液とアピゲニンを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。

【図11】ＮｍＧＴ３タンパク質溶液とアピゲニン７−グルコシドを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。

【図12】ＮｍＧＴ４タンパク質溶液とアピゲニン７−グルコシドを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。

【図13】ＮｍＧＴ３タンパク質、ＮｍＧＴ４タンパク質、ＳｕＧＴ５タンパク質とバイカレンの５位に糖を付加する酵素の、各種フラボノイド基質に対する反応性をまとめた図である。

【図14】ＮｍＧＴ３とＮｍＧＴ４のアミノ酸配列を比較するアラインメント図である（同一性３１％、核酸レベルの同一性は５１％）。

【図15】ＮｍＧＴ３とカーネーションのカルコノナリンゲニンの２’位に糖を付加する酵素のアミノ酸配列を比較するアラインメント図である（同一性３２％、核酸レベルの同一性は４７％）。

【図16】ＮｍＧＴ４とコガネバナのフラボノイドの７位に糖を付加する酵素のアミノ酸配列を比較するアラインメント図である（同一性５２％、核酸レベルの同一性は６０％）。

【図17】トレニアへ導入したＮｍＧＴ３、４を含んだコンストラクト（ｐＳＰＢ４５８４〜４５８７）

【図18】ペチュニアへ導入したＮｍＧＴ３、４を含んだコンストラクト（ｐＳＰＢ５４１４、５４２７）

【図19】カーネーションへ導入したＮｍＧＴ３を含んだコンストラクト（ｐＳＰＢ５４３３）

【図20】バラへ導入したＮｍＧＴ３を含んだコンストラクト（ｐＳＰＢ４５８１、４５８２、５４３７、５４４０）

【図21】ＳｕＧＴ５タンパク質溶液とアピゲニンを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。

【図22】ＳｕＧＴ５タンパク質溶液とアピゲニン７−グルコシドを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。

【図23】ＳｕＧＴ５とＮｍＧＴ３のアミノ酸配列を比較するアラインメント図である（同一性３８％、核酸レベルの同一性は４７％）。

【図24】ＳｕＧＴ５とＮｍＧＴ４のアミノ酸配列を比較するアラインメント図である（同一性５１％、核酸レベルの同一性は５８％）。

【発明を実施するための形態】

【0037】

本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１又は３又は１２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は３又は１２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２又は４又は１３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドに関する。

【0038】

本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
本明細書中、用語「ストリジェント条件」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。さらに、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。したがって、用語「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の「同一性」又は「相同性」の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリダイズするような条件を意味する。「ストリンジェント条件」としては、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度150〜900mM、好ましくは600〜900mM、pH 6〜8であるような条件を挙げることができ、具体例としては、5 x SSC (750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、1% SDS、5 x デンハルト溶液50% ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC (15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものを挙げることができる。

【0039】

ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば、植物由来のもの、植物由来以外のものであってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであっても化学合成したＤＮＡでもよい。

【0040】

上記「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
また、本発明に係るＤＮＡは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。

【0041】

本明細書中、用語「同一性」及び「相同性」とは、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、２つのポリペプチド配列又は２つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」及び「相同性」は容易に算出できる。２つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」及び「相同性」は、当業者には周知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991)等参照)。

【0042】

また、本明細書に記載される「同一性」及び「相同性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン９．５、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて算出される数値である。

【0043】

本発明のポリヌクレオチド（核酸、遺伝子）は、着目のタンパク質を「コードする」ものである。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。

【0044】

生来の塩基配列を有する遺伝子は、以下の実施例に記載するように、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。

【0045】

また、得られたポリヌクレオチドを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られたポリヌクレオチドがフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードすることを確認することができる。さらに、当該ポリヌクレオチドを発現させることにより、ポリヌクレオチド産物であるフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を得ることができる。あるいは配列番号２又は４又は１３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体を用いてもフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を取得することができ、かかる抗体を用いて他の生物由来のフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローン化することもできる。

【0046】

本発明は、前記したポリヌクレオチドを含む（組換え）ベクター、特に発現ベクター、さらに該ベクターによって形質転換された宿主にも関する。
宿主としては、原核生物又は真核生物を用いることがきる。原核生物としては細菌、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えば、バシルス・スブシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など常用の宿主を用いることができる。真核生物としては、下等真核生物、例えば、真核微生物、例えば、真菌である酵母又は糸状菌が使用できる。

【0047】

酵母としては、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが挙げられ、また糸状菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物が挙げられる。宿主としては、さらに動物細胞又は植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒトなどの細胞系が使用され、さらに、昆虫細胞、例えば、カイコ細胞、カイコの成虫それ自体も宿主として使用される。

【0048】

本発明の発現ベクターは、それらを導入する宿主の種類に依存して発現制御領域、例えば、プロモーター、ターミネーター、複製起点などを含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーターなどが使用され、そして糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼプロモーター、ｔｒｐＣプロモーターなどが使用される。また、動物細胞宿主用のプロモーターとしては、ウイルス性プロモーター、例えば、ＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーターなどが使用される。植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、rbcSプロモーター、mac-1プロモーター等が挙げられる。また、組織特異的な遺伝子発現のためには、その組織で特異的に発現する遺伝子のプロモーターを用いることができる。
発現ベクターの作製は、制限酵素、リガーゼなどを用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行うことができる。

【0049】

前記発現ベクターによって形質転換された宿主を培養、栽培又は生育させ、培養物又は培地から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどにより回収・精製して、目的とするタンパク質を得ることができる。
本明細書では、ネモフィラ又はサルビア由来のフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子について述べているが、本発明に係るポリヌクレオチドは、ネモフィラ又はサルビア由来の遺伝子に限定されるものではなく、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の起源としては植物でも動物でも微生物であってもよく、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有している限り、起源を問わず、植物における花色の変更に利用可能である。

【0050】

本発明は、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを植物に導入し、これを該植物内に含有させることにより得られる、植物若しくはその子孫又はこれらの部分若しくは組織にも関する。該部分若しくは組織の形態としては切花であることができる。本発明に係るフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、フラボンの４’位と７位の両方を配糖化したり、又はフラボンの４’位と７位の両方の配糖化を抑制することができ、その結果として植物における花色を変更することができる。

【0051】

現在の技術水準の下では、植物にポリヌクレオチドを導入し、そのポリヌクレオチドを構成的又は組織特異的に発現させる技術を利用することができる。植物へのＤＮＡの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。

【0052】

形質転換可能な植物の例としては、バラ、カーネーション、キク、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコキキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリプ、アンセリウム、コチョウラン、イネ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、ダイズ、アルファルサ、ルービン、トウモロコシ、カリフラワー、ダリアなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。

【0053】

本発明は、上記切花を用いた加工品（切花加工品）にも関する。ここで、切花加工品としては、当該切花を用いた押し花、プリザードフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。

【0054】

また、本発明の製造方法により製造された４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されたフラボンは、食品、医薬品、化粧品の製造方法などの用途に使用することができる。

【0055】

本発明においては、アンチセンス法、コサプレッション法、ＲＮＡｉ法などによって、植物内で目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。目的の遺伝子の発現を抑制する方法は、当業者に公知の方法に従って行なうことができるが、例えば、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［Biotechnology,9, 358 (1992)、Trends in Biotechnology,10, 87 (1992) 、Trends in Biotechnology,10, 152 (1992)］、トリプル・ヘリックス技術［Trends in Biotechnology,10, 132 (1992)］等が挙げられる。例えば、遺伝子の発現の抑制は、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなる一本鎖核酸分子を用いて行なわれる。このような方法はアンチセンス法として知られている。アンチセンス法では、発現を抑制したい遺伝子に相補的な配列をもつＲＮＡを高レベルで発現させることにより、標的遺伝子の発現が抑制される。この方法では、本発明に係るポリヌクレオチド（遺伝子）のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることができる。また、上記の方法では、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の一部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることもできる。このような部分的な一本鎖ＲＮＡは本発明による遺伝子の発現を抑制しうるものであればよく、当業者であれば適宜設計することができるが、好ましくは本発明による遺伝子に特異的なものとされ、その鎖長は、好ましくは５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１０〜２０ヌクレオチドとされる。

【0056】

遺伝子の発現の抑制は、本発明に係る遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなる一本鎖核酸分子を用いて行なわれる。すなわち、このセンス一本鎖核酸は、上記のアンチセンス一本鎖核酸と同様に、本発明による遺伝子の発現の抑制に用いることが可能である。この方法では、本発明による遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることができる。また、上記の方法では、遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の一部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることもできる。このような部分的な一本鎖ＲＮＡは本発明による遺伝子の発現を抑制しうるものであればよく、当業者であれば適宜設計することができるが、好ましくは本発明による遺伝子に特異的なものとされ、その鎖長は、好ましくは５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１０〜２０ヌクレオチドとされる。

【0057】

さらに、遺伝子の発現の抑制は、本発明による遺伝子と同一のヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなる二本鎖核酸分子を用いて行なわれる。例えば、この二本鎖核酸分子を用いることにより、被子植物において本発明による遺伝子のアンチセンス又はセンス一本鎖核酸を発現させることができる。本発明による二本鎖核酸分子は、好ましくはＤＮＡとされ、その鎖長及び具体的なヌクレオチド配列は、目的とする一本鎖核酸分子の鎖長およびヌクレオチド配列に対応するものとされる。例えば、上記アンチセンス一本鎖核酸を発現させる場合には、本発明による二本鎖核酸分子は、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖をコード鎖として含むものとされる。また、上記センス一本鎖核酸を発現させる場合には、本発明による二本鎖核酸分子は、本発明による遺伝子のセンス鎖をコード鎖として含むものとされる。

【0058】

二本鎖核酸分子は、当業者に公知の方法を用いて植物中で発現させることができる。例えば、プロモーター、本発明による二本鎖核酸分子、及び転写ターミネーター等を含む発現ベクター、目的とする植物中に導入し、得られた植物体を栽培することにより、二本鎖核酸分子を発現させることができる。植物への発現ベクターの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。

【0059】

本発明による核酸分子を用いた遺伝子発現の抑制法の他の例としては、コサプレッション法が挙げられる。この方法では、本発明による遺伝子の全ヌクレオチド配列を有するセンス二本鎖ＤＮＡが目的の植物中に導入される。これにより、本発明によるセンス一本鎖ＲＮＡが発現され、このＲＮＡにより該遺伝子の発現が極端に抑制される（Plant Cell 9: 1357-1368, 1997）。

【実施例】

【0060】

以下、実施例に従って発明を具体的に説明する。
［実施例１：ネモフィラ花弁におけるフラボンの４’位と７位の水酸基に糖を転移する活性の検出］
ネモフィラ（Nemophila menziesii)の花弁を、以下のように定義した発達段階に分けて採取し、液体窒素で凍らせ、−８０℃冷凍庫で保存した：
ステージ１：色が付いていない堅く閉じたつぼみ（約２−５ｍｍ）；
ステージ２：有色の堅く閉じたつぼみ（約２−５ｍｍ）；
ステージ３：有色の閉じたつぼみ、がく片がちょうど開こうとしているつぼみ（約５−１０ｍｍ）；
ステージ４：花弁が開こうとしているつぼみ（約１０−１５ｍｍ）
ステージ５：完全にひらいた花

【0061】

＜ネモフィラ花弁抽出液の調製＞
アントシアニンが生合成される前の花弁のステージ１と２で、フラボン糖転移酵素活性が検出されることが期待される。そこで、ステージ１と２の花弁を用いて、花弁抽出液を調製した。５００ｍｇの花弁サンプル(−８０℃で保存していたステージ１と２のサンプル２５０ｍｇずつ)を液体窒素で冷やしながら乳鉢ですりつぶし、１．５ｍｌの抽出バッファー（組成；リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）：１００ｍＭ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１ｍＭ、ポリビニルピロリドン４０：５０ｍｇ／ｍｌ、スクロース：１００ｍｇ／ｍｌ）に溶かした。得られたタンパク質溶液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）し、回収した上清に３０％の飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加えた。４℃で１時間撹拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニウムを飽和濃度７０％となるように添加し、４℃で１時間撹拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して沈澱を得た。この沈澱を５００μｌの溶出バッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）：２．５ｍＭ、ＤＴＴ：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に溶かし、ＮＡＰ−５Ｃｏｌｕｍｓ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてカラム精製を行って、硫酸アンモニウムを取り除いた。この液を「花弁抽出液」とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２６ＸＰ（ローター：ＪＡ−２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。

【0062】

＜酵素活性測定＞
４０μｌの花弁抽出液、２０μｌの５ｍＭ ＵＤＰ−グルコース、２０μｌの１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μｌの５００ｎｇ／μｌ アピゲニンを混合し、水で２００μｌになるように氷上で調整した反応液を、３０℃で１時間保持した。その後、２００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれに続く５分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。コントロールとして、花弁抽出液を１００℃２０分で熱処理した花弁抽出液を用いて同じ条件下で酵素反応させた反応液を用いた。
その結果、アピゲニン４’，７−ジグルコシド精製品と同じ保持時間・吸収極大を示すフラボンが生合成された（図７参照）。ＵＤＰ−グルコースを加えずに酵素反応したときには、何も生合成されなかった。これらの結果より、ネモフィラ花弁には、ＵＤＰ−グルコースに依存したフラボンの４’位と７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質が存在することが分かった。

【0063】

［実施例２：アピゲニン４’ −グルコシドの保持時間・吸収極大の決定］
フラボン４’，７−ジグルコシドの生合成経路を明らかにするためにアピゲニン４’ −グルコシドの保持時間・吸収極大を決定することにした。
実施例１におけるアピゲニン４’，７−ジグルコシドが生合成される過程で、アピゲニン４’ −グルコシドとアピゲニン７−グルコシドが中間生成物として生合成されるはずである（図８参照）。実施例１の解析結果において、標品があるアピゲニン７−グルコシド、アピゲニン４’，７−ジグルコシド以外のピークが現れることを期待した。
その結果、アピゲニン７−グルコシドと近い保持時間を示すフラボンが生合成されており、これがアピゲニン４’ −グルコシドであると判断された（図７参照）。アピゲニン４’ −グルコシドの保持時間・吸収極大を決定することができた。

【0064】

［実施例３：フラボンの４’位と７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子の取得］
＜ｔｏｔａｌＲＮＡの単離＞
Ｐｌａｎｔ ＲＮＡｅａｓｙ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、製造者に推奨されているプロトコールに従い、ネモフィラのステージ１と２の花弁からｔｏｔａｌＲＮＡを単離した。
＜ネモフィラの花弁由来のｃＤＮＡの発現解析＞
３０μｇのネモフィラの花弁由来ｔｏｔａｌＲＮＡの逆転写反応を行った後、均一化ｃＤＮＡライブラリーを作製した。作製したライブラリーをエマルジョンＰＣＲによって、クローンごと増幅した後、ゲノムシークエンサーＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｊａｐａｎ株式会社）により塩基配列の決定を行った。また、得られた配列データをアミノ酸配列に翻訳し、リンドウのアントシアニン３’−糖転移酵素のアミノ酸配列と相同性を示す配列を抽出した。これらの配列をアセンブルし、糖転移酵素をコードする候補遺伝子を得た。

【0065】

［実施例４：フラボンの４’位と７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列の取得］
実施例３では糖転移酵素遺伝子の配列が２５種得られた。その内１０個の遺伝子（ＮｍＧＴ０〜９）について完全長ｃＤＮＡ配列を取得するための実験を行った。
完全長ｃＤＮＡ配列の取得は、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って行った。実施例３で得られたｃＤＮＡ部分配列の中からそのクローンに特異的な領域を選び、この領域の配列に基づいてＲＡＣＥ用プライマーを設計し、ＲＡＣＥ ＰＣＲによって５’，３’末端配列を得た。この配列をもとに、完全長ｃＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーを設計し、ネモフィラｃＤＮＡを鋳型にして、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社） を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、５０μｌでＰＣＲ反応を行った（９４℃で２分間保持し、９４℃１５秒間、５５℃３０秒間、６８℃で２分間のサイクルを３０サイクル繰り返した後、４℃で保持した）。ネモフィラのｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、実施例２で単離したｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型にして、製造者に推奨されているプロトコールに従って合成した。プライマーは、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＮｍＧＴ０〜９遺伝子を挿入できるよう、完全長ｃＤＮＡの両端に制限酵素サイトが含まれるように設計した。このＰＣＲ生成物を用いて、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って、ＮｍＧＴ遺伝子の完全長を含むプラスミド（ｐＴＯＰＯ−ＮｍＧＴ０〜９）を取得した。プラスミドに挿入された塩基配列を解析し、フラボンの４’位と７位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子（ＮｍＧＴ０〜９）の完全長ｃＤＮＡ配列を取得した（ＮｍＧＴ３：配列番号１、ＮｍＧＴ４：配列番号３）。

【0066】

［実施例５：フラボンの４’位と７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質候補の酵素活性測定実験（粗酵素を用いた場合）］
＜大腸菌発現コンストラクトの作製＞
それぞれ３μｇのｐＴＯＰＯ−ＮｍＧＴ０〜９を該当する制限酵素で処理し、得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。２μｇのベクターｐＥＴ１５ｂも制限酵素で処理し、得られたＤＮＡ断片とライゲーションさせて、大腸菌発現コンストラクト（ｐＥＴ−ＮｍＧＴ０〜９）を作製した。

【0067】

＜糖転移酵素の大腸菌での発現＞
ｐＥＴ−ＮｍＧＴ０〜９を、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、大腸菌株ＢＬ２へ導入し、形質転換大腸菌を取得した。この大腸菌をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液２ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、５０ｍｌの培養液に加え、２７℃で一晩本培養した。
一晩本培養した大腸菌液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した菌体を５ｍｌのソニックバッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．０）：２．５ｍＭ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を粉砕した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して、上清を回収した。その上清を粗酵素液とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２６ＸＰ（ローター：ＪＡ−２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。

【0068】

＜酵素活性測定＞
８０μｌの粗酵素液、２０μｌの５ｍＭ ＵＤＰ−グルコース、２０μｌの１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μｌの５００ｎｇ／μｌ のアピゲニンを混合し、水で２００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で３０分間保持した。その後、２００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれに続く５分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。コントロールとして、インサートを挿入しないｐＥＴベクターを導入した大腸菌の粗酵素液を用いて同じ条件化で酵素反応させた反応液を用いた。
その結果、ＮｍＧＴ３、ＮｍＧＴ４について、基質以外のピークがみられた。ＮｍＧＴ３、ＮｍＧＴ４は、７，３’ＧＴクラスターに含まれていた。
以下、実施例６〜１０は、ＮｍＧＴ３とＮｍＧＴ４（それぞれ、配列番号１と３）について記載する。

【0069】

［実施例６：フラボンの４’位と７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質の酵素活性測定実験（Ｈｉｓ−Ｔａｇを付加したタンパク質を精製した場合）］
＜糖転移酵素の大腸菌での発現とタンパク質精製＞
実施例５で記載したｐＥＴ−ＮｍＧＴ３、ｐＥＴ−ＮｍＧＴ４を導入した大腸菌株ＢＬ２をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液８ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、２００ｍｌの培養液に加え、２５℃で一晩本培養した。
一晩本培養した大腸菌液を遠心分離（１０００×ｇ、４℃、１０分間）し、集菌した菌体を２０ｍｌの緩衝液（組成；ＮａＣｌ：０．５Ｍ、ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．９）：２０ｍＭ、イミダゾール：５ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を粉砕した後、遠心分離（１４００×ｇ、４℃、２０分）して、上清を回収した。その上清を０．４５μｍフィルターに通し、Ｐｒｏｆｉｎｉａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って、Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製した。得られた精製タンパク質溶液を、ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ）（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ社）を用いて、遠心分離（７５００×ｇ、４℃、１５分間）し、その濃縮されたタンパク質溶液を「ＮｍＧＴ３タンパク質溶液」、「ＮｍＧＴ４タンパク質溶液」とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２６ＸＰ（ローター：ＪＡ−２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。

【0070】

＜酵素活性測定＞
２０μｌのタンパク質溶液、２０μｌの５ｍＭ ＵＤＰ−グルコース、２０μｌの１ＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μｌの５００ｎｇ／μｌ アピゲニンを混合し、水で２００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で２０分間保持した。その後、２００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれに続く６分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。

【0071】

その結果、アピゲニン４’，７−ジグルコシド精製品と同じ保持時間・吸収極大を示すフラボンが生合成されていた（図９、１０参照）。基質を５００ｎｇ／μｌのアピゲニン７−グルコシドに代えて、同じ反応条件下で酵素反応を行っても、アピゲニン４’，７−ジグルコシド精製品と同じ保持時間・吸収極大を示すフラボンが生合成された（図１１、１２参照）。さらに、基質をアピゲニン４’ −グルコシドに代えて、同じ反応条件下で酵素反応を行っても、アピゲニン４’，７−ジグルコシド精製品と同じ保持時間・吸収極大を示すフラボンが生合成された（図示せず）。これらの結果より、ＮｍＧＴ３タンパク質溶液、ＮｍＧＴ４タンパク質溶液は、アピゲニン、アピゲニン４’ −グルコシド、アピゲニン７−グルコシドを基質として、アピゲニン４’，７−ジグルコシドを生合成することができるフラボンの４’位と７位に糖を転移する活性を有するタンパク質であることが証明された。さらに、図１３に示すように、各種フラボノイド化合物、及びベタニジンに対する反応性を調べたところ、ＮｍＧＴ３、４タンパク質は、アピゲニンやその配糖化物だけではなく、ルテオリンやその配糖化物、フラボノールやその配糖化物に対しても活性を有し、これらを配糖化することが明らかとなった。

【0072】

尚、リビングストンデージー由来の糖転移酵素遺伝子（Ｄｂｓ５ＧＴ；betanidin5GT）は、本来、ベタニジンの５位の水酸基にグルコースを転移するものであるが、in vitro においてフラボノイドの４’位又は７位のいずれか一方の水酸基にグルコースを転移する活性を示すことが報告されている。このリビングストーンデージー由来の糖転移酵素は、本発明のＮｍＧＴ３、４タンパク質と、フラボノイド化合物やベタニジンに対する反応性が大きく異なることを明らかとした（図１３参照）。

【0073】

ＮｍＧＴ３とＮｍＧＴ４のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２と４）の同一性は３１％、相同性は４７％であった（図１４参照）。この解析には、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン９．５、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いた。尚、ＮｍＧＴ３とＮｍＧＴ４の核酸レベルの同一性は５１％であった。
既に同定されている糖転移酵素の中で、ＮｍＧＴ３と最も同一性が高いアミノ酸配列は、カーネーションのカルコノナリンゲニンの２’位に糖を付加する酵素（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＤ５２００６）であった。ＮｍＧＴ３とカーネーションのカルコノナリンゲニンの２’位に糖を付加する酵素のアミノ酸配列の同一性は３２％であった（図１５参照）。尚、ＮｍＧＴ３とカーネーションのカルコノナリンゲニンの２’位に糖を付加する酵素の核酸レベルの同一性は４７％であった。
既に同定されている糖転移酵素の中で、ＮｍＧＴ４と最も同一性が高いアミノ酸配列は、コガネバナのフラボノイドの７位に糖を付加する酵素（非特許文献９に記載）であった。ＮｍＧＴ４とコガネバナのフラボノイドの７位に糖を付加する酵素のアミノ酸配列の同一性は５２％であった（図１６参照）。尚、ＮｍＧＴ４とコガネバナのフラボノイドの７位に糖を付加する酵素の核酸レベルの同一性は６０％であった。

【0074】

［実施例７：フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のトレニアにおける発現］
本発明のＮｍＧＴ３遺伝子とＮｍＧＴ４遺伝子が、植物内でフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を翻訳するかどうかを確かめるため、ＮｍＧＴ３、ＮｍＧＴ4を発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ４５８４〜４５８７を構築し、トレニア（サマーウェーブ）へ導入した。導入したコンストラクトの詳細を以下に示す（図１７参照）。
＜コンストラクトの作製＞
ｐＳＰＢ４５８４は、植物導入用バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎＥｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅｒｃｈ ４，ｐ２８８）を基本骨格とし、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター上流にエンハンサー配列を２回繰り返してもつＥｌ２３５Ｓプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，ｐ４９）と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ３とｍａｓターミネーターが含まれている。
ｐＳＰＢ４５８５は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ４とｍａｓターミネーターを含んでいる。
ｐＳＰＢ４５８６は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格として、２つの発現カセット（１．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とｍａｓターミネーター、２．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ３とｍａｓターミネーター）が含まれている。
ｐＳＰＢ４５８７は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、２つの発現カセット（１．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とｍａｓターミネーター、２．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ４とｍａｓターミネーター）が含まれている。

【0075】

＜組織特異的発現解析＞
カナマイシンを含む選択培地でシュートを形成し、発根が見られた個体を馴化し、それぞれの形質転換体のガク割れしていないつぼみの花弁を用いて、遺伝子発現解析を行った。ｔｏｔａｌＲＮＡ単離は実施例３に記載した方法と同様にして、ｃＤＮＡ合成は実施例４に記載した方法と同様にして行った。逆転写ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡを鋳型として、ＥｘＴａｑ ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、３０μｌで行った（９４℃で２分間保持し、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分間保持のサイクルを２５サイクル繰り返した後、４℃で保持した）。それぞれの完全長ｃＤＮＡが特異的に増幅するようなプライマーを設計した。その結果、トレニアにおけるＮｍＧＴ３とＮｍＧＴ４の転写が確認された。

【0076】

［実施例８：フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のペチュニアにおける発現］
ＮｍＧＴ３を発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５４１４、５４２７を構築し、ペチュニア（サフィニアブーケレッド）へ導入した。導入したコンストラクトの詳細を以下に示す（図１８参照）。
＜コンストラクトの作製＞
ｐＳＰＢ５４１４は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、４つの発現カセット（１．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡパンジーＦ３’５’Ｈ（ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１９５８に記載、配列番号５参照）と、異種遺伝子の植物での発現に極めて有効である熱ショックタンパク質ターミネーター（ＨＳＰターミネーター）（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（２０１０）５１，３２８−３３２）、２．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６１６００に記載、配列番号７参照）とＨＳＰターミネーター、３．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とＨＳＰターミネーター、４．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ３とＨＳＰターミネーター）が含まれている。
ｐＳＰＢ５４２７は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、３つの発現カセット（１．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とＨＳＰターミネーター、２．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とＨＳＰターミネーター、３．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ３とＨＳＰターミネーター）が含まれている。

【0077】

＜組織特異的発現解析＞
カナマイシンを含む選択培地でシュートを形成し、発根が見られた個体を馴化し、それぞれの形質転換体の葉を用いて、実施例７に記載した方法と同様にして、遺伝子発現解析を行った。その結果、ペチュニアにおけるＮｍＧＴ３とＮｍＧＴ４の転写が確認された。

【0078】

［実施例９：フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のカーネーションにおける発現］
ＮｍＧＴ３を発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５４３３を構築し、カーネーション（クリームシンデレラ）へ導入した。導入したコンストラクトの詳細を以下に示す（図１９参照）。
ｐＳＰＢ５４３３は、植物導入用バイナリーベクターｐWTT２１３２（DNA Plant Technologies, USA=DNAP）を基本骨格とし、４つの発現カセット（１．キンギョソウカルコン合成酵素プロモーター（ＰＣＴ／ＡＵ９４／００２６５に記載）と完全長ｃＤＮＡパンジーＦ３’５’ＨとＨＳＰターミネーター、２．キンギョソウカルコン合成酵素プロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とＨＳＰターミネーター、３．カーネーションアントシアニン合成酵素プロモーター（ＰＣＴ／ＡＵ／２００９／００１６５９に記載）と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とＨＳＰターミネーター、４．カーネーションアントシアニン合成酵素プロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ３とＨＳＰターミネーター）が含まれている。

【0079】

［実施例１０：フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のバラにおける発現］
ＮｍＧＴ３を発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ４５８１、４５８２、５４３７、５４４０を構築し、バラ（ノブレス、リタパヒューメラ）へ導入した。導入したコンストラクトの詳細を以下に示す（図２０参照）。
ｐＳＰＢ４５８１は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、４つの発現カセット（１．シソアントシアニン３−アシル基転位酵素プロモーター（ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５３９０９に記載）と完全長ｃＤＮＡパンジーＦ３’５’Ｈとｍａｓターミネーター、２．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とｍａｓターミネーター、３．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とｍａｓターミネーター、４．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ３とｍａｓターミネーター）が含まれている。
ｐＳＰＢ４５８２は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、４つの発現カセット（１．パンジーＦ３’５’Ｈプロモーター（ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５３９０９）と完全長ｃＤＮＡパンジーＦ３’５’Ｈとｍａｓターミネーター、２．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とｍａｓターミネーター、３．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とｍａｓターミネーター、４．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ３とｍａｓターミネーター）が含まれている。
ｐＳＰＢ５４３７は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、５つの発現カセット（１．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡパンジーＦ３’５’ＨとＨＳＰターミネーター、２．シソアントシアニン３−アシル基転位酵素染色体遺伝子（ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５３９０９に記載、配列番号９参照）、３．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とＨＳＰターミネーター、４．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とＨＳＰターミネーター、５．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ３とＨＳＰターミネーター）が含まれている。
ｐＳＰＢ５４４０は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、５つの発現カセット（１．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡパンジーＦ３’５’ＨとＨＳＰターミネーター、２．Ｅｌ２３５ＳプロモータープロモーターとｃＤＮＡラベンダーアントシアニン３−アシル基転位酵素（ＰＣＴ／ＪＰ／１９９６／０００３４８に記載、配列番号１０参照）とＨＳＰターミネーター、３．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素とＨＳＰターミネーター、４．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８とＨＳＰターミネーター、５．Ｅｌ２３５Ｓプロモーターと完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ３とＨＳＰターミネーター）が含まれている。

【0080】

［実施例１１：サルビアウルギノーサ由来のフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子の取得］
サルビアウルギノーサの花弁は、アピゲニン４’，７−ジグルコシド（図６参照）を主要のフラボンとして含有する。よって、サルビアウルギノーサはフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有することが期待される。そこで、サルビアウルギノーサのつぼみから花弁を取得し、ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１０５００に記載した方法と同様にして、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子をスクリーニングした。２４個の陽性クローンの塩基配列を決定した結果、７，３’ＧＴクラスターに含まれているｃＤＮＡ配列を３種取得した（ＳｕＧＴ２、５、１０）。これらの遺伝子について、実施例４に記載した方法と同様にして、ｃＤＮＡ完全長を含むプラスミド（ｐＴＯＰＯ−ＳｕＧＴ２、５、１０）を作製した。プラスミドに挿入された塩基配列を解析し、サルビアウルギノーサ由来のフラボンの４’位と７位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子（ＳｕＧＴ２、５、１０）の完全長ｃＤＮＡ配列を取得した（ＳｕＧＴ５、配列番号１２参照）。

【0081】

［実施例１２：サルビアウルギノーサ由来のフラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質候補の酵素活性測定実験（（Ｈｉｓ−Ｔａｇを付加したタンパク質を精製した場合））］
＜大腸菌発現コンストラクトの作製＞
実施例５に記載した方法と同様にして、大腸菌発現コンストラクト（ｐＥＴ−ＳｕＧＴ２、５、１０）を作製した。

【0082】

＜糖転移酵素の大腸菌での発現とタンパク質精製＞
実施例５に記載した方法と同様にして、「ＳｕＧＴ２タンパク質溶液」、「ＳｕＧＴ５タンパク質溶液」、「ＳｕＧＴ１０タンパク質溶液」を調整した。

【0083】

＜酵素活性測定＞
２０μｌのタンパク質溶液、２０μｌの５ｍＭ ＵＤＰ−グルコース、２０μｌの１ＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μｌの５００ｎｇ／μｇのアピゲニンを混合し、水で２００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で９０分間保持した。その後、２００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノールル水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれに続く６分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。

【0084】

その結果、ＳｕＧＴ５タンパク質溶液を用いたときにアピゲニン４’，７−ジグルコシド精製品と同じ保持時間・吸収極大を示すフラボンが生合成されていた（図２１参照）。基質を５００ｎｇ／μｇのアピゲニン７−グルコシドに代えて、同じ反応条件下で酵素反応を行っても、アピゲニン４’，７−ジグルコシド精製品と同じ保持時間・吸収極大を示すフラボンが生合成された（図２２参照）。これらの結果より、ＳｕＧＴ５タンパク質溶液は、アピゲニン、アピゲニン７−グルコシドを基質として、アピゲニン４’，７−ジグルコシドを生合成することができるフラボンの４’位と７位に糖を転移する活性を有するタンパク質であることが証明された。

【0085】

ＳｕＧＴ５は、前述のＮｍＧＴ３、４タンパク質と同様、アピゲニンやその配糖化物だけではなく、ルテオリンやその配糖化物、フラボノールやその配糖化物に対しても活性を有し、これらを配糖化することが明らかとなった。一方、リビングストーンデージー由来の糖転移酵素とは、フラボノイド化合物やベタニジンに対する反応性が大きく異なっていた（図１３参照）。

【0086】

ＳｕＧＴ５とＮｍＧＴ３のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２と６）の同一性は３８％、相同性は４７％であった（図２３参照）。この解析には、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン９．５、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いた。尚、ＳｕＧＴ５とＮｍＧＴ３の核酸レベルの同一性は４７％であった。
ＳｕＧＴ５とＮｍＧＴ４のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号４と６）の同一性は５１％、相同性は６６％であった（図２４参照）。尚、ＳｕＧＴ５とＮｍＧＴ４の核酸レベルの同一性は５８％であった。

【産業上の利用可能性】

【0087】

本発明において、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが初めて同定された。本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内で発現させることにより、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に特異的に糖を転移する活性を有するタンパク質を製造することが可能となる。本発明により、フラボンの４’位と７位の両方の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を、植物内で、構成的又は組織特異的に発現させることで、花色の改変に利用することができる。また、本発明により、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加したフラボンの製法、及び該製法によって得られた食品、医薬品、化粧品なども提供される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]