特許 5936601 ａｌｋＬ遺伝子産物を用いた生体触媒による酸化法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5936601

(24)【登録日】2016年5月20日

(45)【発行日】2016年6月22日

(54)【発明の名称】ａｌｋＬ遺伝子産物を用いた生体触媒による酸化法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/02 20060101AFI20160609BHJP

   C12P 7/26 20060101ALI20160609BHJP

   C12P 7/40 20060101ALI20160609BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160609BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160609BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/02ZNA

   C12P7/26

   C12P7/40

   C12N1/21

   C12N15/00 A

【請求項の数】14

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2013-505377(P2013-505377)

(86)(22)【出願日】2011年3月15日

(65)【公表番号】特表2013-528361(P2013-528361A)

(43)【公表日】2013年7月11日

(86)【国際出願番号】EP2011053834

(87)【国際公開番号】WO2011131420

(87)【国際公開日】20111027

【審査請求日】2014年2月6日

(31)【優先権主張番号】102010015807.0

(32)【優先日】2010年4月20日

(33)【優先権主張国】DE

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】501073862

【氏名又は名称】エボニック デグサ ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100135633

【弁理士】

【氏名又は名称】二宮 浩康

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】マルクス ペター

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス シュミート

(72)【発明者】

【氏名】ブルノ ビューラー

(72)【発明者】

【氏名】ハンス−ゲオルク ヘネマン

(72)【発明者】

【氏名】マテイス カミール ユルスィング

(72)【発明者】

【氏名】シュテフェン シャファー

(72)【発明者】

【氏名】トーマス ハース

(72)【発明者】

【氏名】マンフレート シュレーヴェ

(72)【発明者】

【氏名】シェフ コーネリセン

(72)【発明者】

【氏名】マーティン ロース

(72)【発明者】

【氏名】ハラルト ヘーガー

【審査官】 原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６３−２７３４８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５０８８３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biotechnology and bioengineering，１９９８年，58, 4，p.356-365

【文献】 BIO/TECHNOLOGY，１９９１年，9, 4，p.367-371

【文献】 Applied and Environmental Microbiology，１９９８年，64, 10，p.3784-3790

【文献】 Journal of Bacteriology，１９９６年，178, 18，p.5508-5512

【文献】 Molecular Microbiology，１９９３年，8, 6，p.1039-1051

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つの酸化酵素及び少なくとも１つのａｌｋＬ遺伝子産物を用いて有機物質を酸化する方法において、該ａｌｋＬ遺伝子産物を、自然に存在する形で該ａｌｋＬ遺伝子を含むａｌｋオペロンによってコードされた少なくとも１つのさらに別の遺伝子産物とは無関係に供給する方法であって、前記遺伝子産物が、ＡｌｋＦ、ＡｌｋＧ、ＡｌｋＨ、及びＡｌｋＫから成る群からの少なくとも１つから選択され、
前記有機物質が、分枝した又は非分枝の、飽和又は不飽和の、場合により置換されたアルカン、アルケン、アルキン、アルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン及びエポキシドからなる群から選択されており、その際、これらは、３〜２２個の炭素原子を有し、
前記ａｌｋＬ遺伝子産物が、シュードモナス・プチダのａｌｋＬ遺伝子によってコードされていることを特徴とする方法。

【請求項2】

前記有機物質が、カルボン酸及び該カルボン酸の相応するエステル、３〜２２個の炭素原子を有する非置換アルカン、３〜２２個の炭素原子を有する非置換アルケン、３〜２２個の炭素原子を有する非置換の一価アルコール、３〜２２個の炭素原子を有する非置換アルデヒド、３〜２２個の炭素原子を有する非置換の一価アミン、並びに、更なる置換基として１つ以上のヒドロキシ基、アミン基、ケト基、カルボキシル基、シクロプロピル基又はエポキシ官能基を有する置換化合物からなる群から選択されていることを特徴とする、請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記有機物質をアルコールへと、アルデヒドへと、ケトンへと又は酸へと酸化することを特徴とする、請求項１または２記載の方法。

【請求項4】

前記有機物質をω位で酸化することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。

【請求項5】

前記酸化酵素が、アルカンモノオキシゲナーゼ、キシレンモノオキシゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。

【請求項6】

前記アルカンモノオキシゲナーゼが、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼであることを特徴とする、請求項５記載の方法。

【請求項7】

前記アルカンモノオキシゲナーゼが、グラム陰性細菌の群から選択された生物由来のａｌｋＢ遺伝子でコードされるａｌｋＢ遺伝子産物であることを特徴とする、請求項５記載の方法。

【請求項8】

前記アルコールデヒドロゲナーゼが、ａｌｋＪ遺伝子でコードされたアルコールデヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項５記載の方法。

【請求項9】

前記ａｌｋＬ遺伝子産物が、シュードモナス・プチダＧＰｏ１及びＰ１由来のａｌｋＬ遺伝子によってコードされたタンパク質、該遺伝子は、配列番号１及び配列番号３によって示される、並びに
ポリペプチド配列の配列番号２若しくは配列番号４を有するタンパク質から成る群から選択されていることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。

【請求項10】

少なくとも１つの微生物において、又は少なくとも１つの微生物を取り囲む培地中で実施されることを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。

【請求項11】

前記酸化酵素及び前記ａｌｋＬ遺伝子産物が、微生物において組み換えられて合成されることを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。

【請求項12】

前記微生物が、グラム陰性細菌の群から選択されていることを特徴とする、請求項１０又は１１記載の方法。

【請求項13】

有機物質を酸化する少なくとも１つの酵素及び少なくとも１つのａｌｋＬ遺伝子産物を増強して合成するように遺伝子工学的に改変された微生物において、該ａｌｋＬ遺伝子産物が、自然に存在する形で該ａｌｋＬ遺伝子を含むａｌｋオペロンによってコードされた少なくとも１つのさらに別の遺伝子産物とは無関係に合成される微生物であって、前記遺伝子産物が、ＡｌｋＦ、ＡｌｋＧ、ＡｌｋＨ及びＡｌｋＫから成る群からの少なくとも１つから選択され、
前記有機物質が、分枝した又は非分枝の、飽和又は不飽和の、場合により置換されたアルカン、アルケン、アルキン、アルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン及びエポキシドからなる群から選択されており、その際、これらは、３〜２２個の炭素原子を有し、
前記ａｌｋＬ遺伝子産物が、シュードモナス・プチダのａｌｋＬ遺伝子によってコードされていることを特徴とする微生物。

【請求項14】

有機物質を酸化する少なくとも１つの酵素の酸化速度を高めるためのａｌｋＬ遺伝子産物の使用において、微生物中で合成された該ａｌｋＬ遺伝子産物が、自然に存在する形で該ａｌｋＬ遺伝子を含むａｌｋオペロンによってコードされた、酸化酵素とは異なる少なくとも１つのさらに別の遺伝子産物とは無関係に、該微生物中又は該微生物を取り囲む培地中で使用される使用であって、前記遺伝子産物が、ＡｌｋＦ、ＡｌｋＧ、ＡｌｋＨ及びＡｌｋＫから成る群からの少なくとも１つから選択され、
前記有機物質が、分枝した又は非分枝の、飽和又は不飽和の、場合により置換されたアルカン、アルケン、アルキン、アルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン及びエポキシドからなる群から選択されており、その際、これらは、３〜２２個の炭素原子を有し、
前記ａｌｋＬ遺伝子産物が、シュードモナス・プチダのａｌｋＬ遺伝子によってコードされていることを特徴とする使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の対象は、ａｌｋＬ遺伝子産物を利用して有機化合物を生体触媒により酸化する方法、並びに該方法で用いられる微生物である。

【背景技術】

【0002】

例えば、シュードモナス・プチダのＯＣＴプラスミドはａｌｋＬ遺伝子を含む。このプラスミドはさらに、アルカン分解の要因となっている遺伝子産物をコードする。これらのアルカン分解遺伝子は、シュードモナスＯＣＴプラスミド上で２つのａｌｋオペロンに配列されている；第一のａｌｋ−オペロンは、遺伝子産物ＡｌｋＢ、ＡｌｋＦ、ＡｌｋＧ、ＡｌｋＨ、ＡｌｋＪ、ＡｌｋＫ、及びＡｌｋＬをコードし、第二のａｌｋオペロンは、ＡｌｋＳ及びＡｌｋＴをコードし、その際、ＡｌｋＳは、第一のａｌｋオペロンの発現に調節作用を及ぼす。詳細な概観及びこれらのａｌｋ−オペロンの更なる遺伝子の作用はＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５ Ｄｅｃ，１７７（２３）：６８９４−９０１を参照されたい。

【0003】

さらに、ＥＰ２７７６７４からは、６〜１２個の炭素原子を有する無極性の脂肪族化合物を末端ヒドロキシル化するための微生物学的方法、例えば無極性に対して抵抗性があるシュードモナス・プチダ属の微生物による１−オクタノールの製造が公知であり、その際、なかでも、ａｌｋＬ遺伝子を有するプラスミドｐＧＥｃ４７が用いられ、該プラスミドも同様にシュードモナス・プチダ由来の２つのａｌｋオペロンを有している。ａｌｋＬ遺伝子の調節は、陰性オペロンプロモーターの調節下にあり、それゆえ、ａｌｋＢ、ａｌｋＦ、ａｌｋＧ、ａｌｋＨ、ａｌｋＪ及びａｌｋＫと一緒に転写及び翻訳される。

【0004】

ＷＯ２００２０２２８４５は、上述のプラスミドｐＧＥｃ４７を有する大腸菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｅｌｌ）によるＮ−ベンジル−４−ピペリジンのヒドロキシル化によってベンジル−４−ヒドロキシピペリジンを製造する方法を記載している。

【0005】

ＥＰ０５０２５２４は、ａｌｋオペロンの種々の遺伝子産物の製造によって、例えば、ａｌｋＢ、ａｌｋＧ、ａｌｋＨ、ａｌｋＴ及びａｌｋＳの遺伝子産物をコードするが、しかし、ａｌｋＬの遺伝子産物はコードしないプラスミドｐＧＥｃ４１により、５員環又は６員環の複素環式化合物のエチル基を末端ヒドロキシル化する微生物学的方法を記載している。そのうえまた、同出願は、ｐＧＥｃ４１のようにａｌｋＢ、ａｌｋＧ、ａｌｋＨ、ａｌｋＴ及びａｌｋＳを含むが、しかし、ａｌｋＬは含まず、その発現が、しかし、陰性プロモーターのアルカン誘導によってのみならず、ｔａｃプロモーターのＩＰＴＧ誘導によっても可能である（ＵＳ５３０６６２５も参照されたい）プラスミドｐＧＭＫ９２１を記載している。

【0006】

Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ他は、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８ Ｏｃｔ；６４（１０）：３７８４−９０で、シトクロムＰ−４５０ＢＭ−３及び上述のプラスミドｐＧＥｃ４７を用いた大腸菌内での飽和脂肪酸のそのω−１−、ω−２−及びω−３−ヒドロキシ脂肪酸への生物変換反応を記載している。

【0007】

Ｆａｖｒｅ−Ｂｕｌｌｅ他は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，３６７−３７１（Ａｐｒｉｌ １９９１）で、生体触媒として用いられる、ｐＧＥｃ４７を有する大腸菌細菌によるオクタンの生体内変化を介する１−オクタン酸の製造法を記載している。２つのａｌｋオペロンが、記載された方法で完全に発現される。

【0008】

同様の試みを、Ｒｏｔｈｅｎ他が、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１９９８ Ｍａｙ ２０；５８（４）３５６−６５の中で行っている。

【0009】

上記の先行技術の欠点は、所望の酸化プロセスに本質的に寄与しない遺伝子産物が、生体触媒として用いられた細胞から余計に作り出され、ひいてはその効率が低下することである。そのうえまた、不要にも共合成されたａｌｋ遺伝子産物は、場合により、例えば、中間産物が不所望の副産物に流れ出ることによって、所望の産物形成に不利益である不所望の酵素活性を保護する。有機基の所望のω−ヒドロキシル化の場合、ａｌｋＪ遺伝子産物は、相応するアルデヒドの形成をもたらす。例えばａｌｋＨ遺伝子産物が同時に存在する場合、発生するアルデヒドがさらにカルボン酸へと酸化される。そうして、ＥＰ０５０２５２４では、所望のヒドロキシル化された方法生成物の作製に必要とされるのは、単にａｌｋＢ、ａｌｋＧ及びａｌｋＴの遺伝子産物のみであり、それによって、例えば遺伝子ａｌｋＦ、ａｌｋＪ、ａｌｋＨ及びａｌｋＳは余計なものとなる。そのうえ、ここでの欠点とは、更なるａｌｋ遺伝子産物の合成が、宿主の物質代謝能に高い要求を課すことである。例えばＡｌｋＪは、ＦＡＤ含有酵素である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，（１９９５），６８９４−６９０１）。しかしながら、宿主のＦＡＤプールは、同様にＦＡＤを含有するａｌｋＬの不可欠の産生によってすでに負荷されている。例えば大腸菌内でのＦＡＤ合成能は限られており、また同様に極めて重要な細胞代謝のために必要とされることから、細胞はａｌｋＪ産生が不要であれば回避可能に負荷される。

【0010】

さらに、ａｌｋＢ、ａｌｋＪ及びａｌｋＨの遺伝子産物は、細胞膜に位置するか又は細胞膜に会合している。この領域中では呼吸鎖もはびこっている。膜タンパク質の過剰の産生が、細胞膜内の変化から、サイトゾルに移動する膜ベシクルの分離に至るまで引き起こす（Ｎｉｅｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９３）８（６），１０３９−１０５１）。これにより、なおのこと、工業的プロセスにおいて不可欠の高細胞密度発酵において、最終的に細胞の早期の溶解が生じる（Ｗｕｂｂｏｌｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９６），Ｖｏｌ５２，３０１−３０８）。

【0011】

同様に、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ他においては、ａｌｋＢ、ａｌｋＦ、ａｌｋＧ、ａｌｋＨ、ａｌｋＪ、ａｌｋＫ、ａｌｋＳ及びａｌｋＴの遺伝子産物は余計に合成されており、それというのも、所望の反応に用いられる本来の酵素は、シトクロムＰ−４５０ＢＭ−３モノオキシゲナーゼだからである。

【0012】

工業的プロセスに鑑みれば、プラスミドコードされた代謝経路の使用は困難である。発酵槽容量の上昇とともに、プラスミド安定性を改善する選択圧の保持のための抗生物質の使用が、一方では非常に高価となり、かつ他方では廃水が危険なものとなる。それゆえ、大規模な発酵は、ほぼ常に任意の抗生物質を投与することなく行われる。それにも関わらず、人工的な酸化代謝経路の遺伝的安定性を保証するために、使用した遺伝子を宿主生物のゲノムに組み込むことが望ましい。係る試みは、組み込まれるべき遺伝子構造が小さければ小さいほど上手くいく。ここで考察される最小遺伝子セットのａｌｋＢＧＴＬは、すでに相当の大きさを持っているため、必ずしも必要とはされない他のどの塩基配列も回避されるべきである。

【0013】

必要な分子生物学の作業の規模を減らし、その成功の蓋然性を高めるのに加えて、可能な限り小さい構造が、宿主生物のゲノム安定性にも有益である。

【0014】

本発明の課題は、先行技術の上述の少なくとも１つの欠点を克服することができる方法を提供することであった。

【0015】

発明の詳細な説明
意想外にも、以下に記載した方法及び遺伝子工学的に改変させられた細胞が、上で設定された課題の解決に寄与することが見出された。

【0016】

それゆえ、本発明の対象は、請求項１に記載されるように、ａｌｋＬ遺伝子産物を利用して、酸化された有機物質を製造する方法、並びに該方法で用いられる組み換え細胞である。

【0017】

本発明の更なる対象は、酸化速度を高めるためのａｌｋＬ遺伝子産物の使用である。

【0018】

利点は、例えば、細胞代謝に関して、殊に高細胞密度発酵の条件下で、上記方法においてある資源の最適な利用である。

【0019】

本発明は、少なくとも１つの酸化酵素及び少なくとも１つのａｌｋＬ遺伝子産物を用いて有機物質を酸化する方法において、ａｌｋＬ遺伝子産物を、該ａｌｋＬ遺伝子を含むａｌｋオペロンによってコードされた少なくとも１つのさらに別の遺伝子産物とは無関係に供給することを特徴とする方法を記載する。

【0020】

この発明と関連して記載されるａｌｋ遺伝子は、同じようにＡｌｋＸと呼ばれるタンパク質配列をコードする。複数の遺伝子ａｌｋＸ、ａｌｋＹ及びａｌｋＺが同時に記載される場合、命名法ａｌｋＸＹＺ若しくはタンパク質の時と同じようにＡｌｋＸＹＺが用いられる。

【0021】

"有機物質の酸化"との用語は、本発明と関連して、例えば、ヒドロキシル化又はエポキシ化、アルデヒド若しくはケトンへのアルコールの変換、カルボン酸へのアルデヒドの変換又は二重結合の水素化と解される。同様に、これには、殊に複数の酸化酵素の使用によって達成することができる多段階の酸化処理も一括りにされており、例えば、複数の箇所、例えばω位及びω−１位での、種々のモノオキシゲナーゼによって触媒される、アルキル基のヒドロキシル化が挙げられる。

【0022】

"少なくとも１つの酸化酵素及び少なくとも１つのａｌｋＬ遺伝子産物を用いて"との用語は、本発明と関連して、酵素及び遺伝子産物を目的に合わせて供給すること、具体的には、すべての個々の酵素又は遺伝子産物それ自体を自然界で観察して見出せないような形態において供給することと解される。これは、例えば、細胞内での使用したタンパク質の異種生産若しくは過剰生産によってか、又は少なくとも部分的に精製されたタンパク質の供給によって行われることができる；しかし、この場合、自然界に存在する酵素と比べて変化した環境が含まれており、例えば、酵素を含んでいる自然細胞が変化されて、それが、例えば特定の他のタンパク質を変化した形で、例えば減衰した形で又は増強した形で又は点突然変異を備えた形で作るような環境も含まれている。

【0023】

"ａｌｋＬ遺伝子産物"との用語は、本発明と関連して、以下２つの条件の少なくとも１つを満たすタンパク質と解される：
１．）タンパク質は、ＯｍｐＷタンパク質のスーパーファミリーの一因として同定され（"Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ"（ＮＣＢＩ）の"Ｃｏｎｖｅｒｓｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ"（ＣＤＤ）中のタンパク質ファミリー３９２２）、その際、この分類は、標準検索条件（０．０１より小さい閾値（英語"ｅ−ｖａｌｕｅ"））の利用及びアルゴリズム"ｂｌａｓｔｐ ２．２．２３＋"の使用下で、２０１０年３月２２日までに寄託されたＮＣＢＩのＣＤＤにあるデータバンク登録を有するタンパク質のアミノ酸配列のアライメントによって行われ、
２．）ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴによるＮＣＢＩ ＣＤＤ中の該当するアミノ酸配列中に含まれる保存されたタンパク質ドメインの検索に際して、１×１０^-5より小さい閾値（英語"ｅ−ｖａｌｕｅ"）を有する保存されたドメイン"ＯｍｐＱＷ、Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗ"（ＣＯＧ３０４７）の存在が確かめられる。

【0024】

"ａｌｋＬ遺伝子を含むａｌｋオペロンによってコードされた少なくとも１つのさらに別の遺伝子産物とは無関係に"との用語は、本発明と関連して、自然に存在する形でａｌｋＬ遺伝子産物の発生に結び付いている少なくとも１つのさらに別のａｌｋ遺伝子産物とは無関係であるａｌｋＬ遺伝子産物を提供することと解される。例えば、遺伝子ａｌｋＢＦＧＨＪＫＬを含んでいるオペロン中で、それぞれａｌｋＢＦＧＨＪ及びＫのａｌｋ遺伝子産物はａｌｋＬ遺伝子産物の発生に結び付いており、それというも、これらは同一のプロモーターを介して供給されるからである。

【0025】

全ての百分率による記載値（％）は、別記しない限り、質量パーセントである。

【0026】

本発明による方法は、各々の有機物質の酸化のために使用される酸化酵素に依存して用いられることができ、該有機物質は、この酸化酵素により基質として受容される；有利な有機物質は、有利には、分枝した又は非分枝の、有利には非分枝の、飽和又は不飽和の、有利には飽和の、場合により置換されたアルカン、アルケン、アルキン、アルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン及びエポキシドから成るものを含む群から選択されており、その際、これらは、有利には３〜２２個、殊に６〜１８個、さらに有利には８〜１４個、殊に１２個の炭素原子を有する。

【0027】

本発明による方法における特に有利な有機物質は、有利には、殊に３〜２２個、有利には６〜１８個、特に有利には８〜１４個の炭素原子を有するカルボン酸及び該カルボン酸の相応するエステル、殊にアルカンのカルボン酸、殊にアルカンの非分枝カルボン酸、殊にラウリン酸及びラウリン酸のエステル、殊にラウリン酸メチルエステル及びラウリン酸エチルエステル、デカン酸、デカン酸エステル、ミリスチン酸及びミリスチン酸エステル、
３〜２２個、有利には６〜１８個、特に有利には８〜１４個の炭素原子を有する非置換アルカン、有利には非分枝の、殊に、有利にはオクタン、デカン、ドデカン及びテトラデカンから成るものを含む群から選択されたアルカン、
３〜２２個、有利には６〜１８個、特に有利には８〜１４個の炭素原子を有する非置換アルケン、有利には非分枝の、殊に、有利にはトランス−オクタ−１−エン、トランス−ノン−１−エン、トランス−デカ−１−エン、トランス−ウンデカ−１−エン、トランス−ドデカ−１−エン、トランス−トリデカ−１−エン、トランス−テトラデ−１−セン、シス−オクタ−１−エン、シス−ノン−１−エン、シス−デカ−１−エン、シス−ウンデカ−１−エン、シス−ドデカ−１−エン、シス−トリデカ−１−エン、シス−テトラデ−１−セン、トランス−オクタ−２−エン、トランス−ノン−２−エン、トランス−デカ−２−エン、トランス−ウンデカ−２−エン、トランス−ドデカ−２−エン、トランス−トリデカ−２−エン及びトランス−テトラデカ−２−エン、トランス−オクタ−３−エン、トランス−ノン−３−エン、トランス−デカ−３−エン、トランス−ウンデカ−３−エン、トランスドデカ−３−エン、トランス−トリデカ−３−エン及びトランス−テトラデカ−３−エン、トランス−オクタ−４−エン、トランス−ノン−４−エン、トランス−デカ−４−エン、トランス−ウンデカ−４−エン、トランス−ドデカ−４−エン、トランス−トリデカ−４−エン、トランス−テトラデカ−４−エン、トランス−デカ−５−エン、トランス−ウンデカ−５−エン、トランス−ドデカ−５−エン、トランス−トリデカ−５−エン、トランス−テトラデカ−５−エン、トランス−ドデカ−６−エン、トランス−トリデカ−６−エン、トランス−テトラデカ−６−エン及びトランス−テトラデカ−７−エンから成るものを含む群から選択されたアルケン、特に有利には、トランス−オクタ−１−エン、トランス−デカ−１−エン、トランス−ドデカ−１−エン、トランス−テトラデ−１−セン、シス−オクタ−１−エン、シス−デカ−１−エン、シス−ドデカ−１−エン、シス−テトラデ−１−セン、トランス−オクタ−２−エン、トランス−デカ−２−エン、トランス−ドデカ−２−エン及びトランス−テトラデカ−２−エン、トランス−オクタ−３−エン、トランス−デカ−３−エン、トランス−ドデカ−３−エン及びトランス−テトラデカ−３−エン、トランス−オクタ−４−エン、トランス−デカ−４−エン、トランス−ドデカ−４−エン、トランス−テトラデカ−４−エン、トランス−デカ−５−エン、トランス−ドデカ−５−エン、トランス−テトラデカ−５−エン、トランス−ドデカ−６−エン、トランス−テトラデカ−６−エン及びトランス−テトラデカ−７−エンから成る群から選択されたアルケン、
３〜２２個、有利には６〜１８個、特に有利には８〜１４個の炭素原子を有する非置換の一価アルコール、有利には非分枝の、殊に、有利には１−オクタノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、１−トリデカノール及び１−テトラデカノールから成るものを含む群から選択されたアルコール、
特に有利には１−オクタノール、１−デカノール、１−ドデカノール及び１−テトラデカノールから成るものを含む群から選択されたアルコール、
３〜２２個、有利には６〜１８個、特に有利には８〜１４個の炭素原子を有する非置換アルデヒド、有利には非分枝の、殊に、有利にはオクタノール、ノナナール、デカナール、ドデカナール及びテトラデカナールから成るものを含む群から選択されたアルデヒド、
３〜２２個、有利には６〜１８個、特に有利には８〜１４個の炭素原子を有する非置換の一価アミン、有利には非分枝の、殊に、有利には１−アミノ−オクタン、１−アミノ−ノナン、１−アミノ−デカン、１−アミノ−ウンデカン、１−アミノ−ドデカン、１−アミノ−トリデカン及び１−アミノ−テトラデカンから成るものを含む群から選択されたアミン、
特に有利には１−アミノ−オクタン、１−アミノ−デカン、１−アミノ−ドデカン及び１−アミノ−テトラデカンから成るものを含む群から選択されたアミン、
並びに、殊に更なる置換基として１つ以上のヒドロキシ基、アミン基、ケト基、カルボキシル基、シクロプロピル基又はエポキシ官能基を有する置換化合物、殊に、有利には１、８−オクタンジオール、１，９−ノナンジオール、１，１０−デカンジオール、１，１１−ウンデカンジオール、１，１２−ドデカンジオール、１，１３−トリデカンジオール、１，１４−テトラデカンジオール、８−アミノ−［１−オクタノール］、９−アミノ−［１−ノナノール］、１０−アミノ−［１−ドデカノール］、１１−アミノ−［１−ウンデカノール］、１２−アミノ−［１−ドデカノール］、１３−アミノ−［１−トリデカノール］、１４−アミノ−［１−テトラデカノール］、８−ヒドロキシ−［１−オクタナール］、９−ヒドロキシ−［１−ノナナール］、１０−ヒドロキシ−［１−デカナール］、１１−ヒドロキシ−［１−ウンデカナール］、１２−ヒドロキシ−［１−ドデカナール］、１３−ヒドロキシ−［１−トリデカナール］、１４−ヒドロキシ−［１−テトラデカナール」、８−アミノ−［１−オクタナール］、９−アミノ−［１−ノナナール］、１０−アミノ−［１−デカナール］、１１−アミノ−［１−ウンデカナール］、１２−アミノ−［１−ドデカナール］、１３−アミノ−［１−トリデカナール］、１４−アミノ−［１−テトラデカナール］、８−ヒドロキシ−［１−オクタン酸］、９−ヒドロキシ−［１−ノナン酸］、１０−ヒドロキシ−［１−デカン酸］、１１−ヒドロキシ−［１−ウンデカン酸］、１２−ヒドロキシ−［１−ドデカン酸］、１３−ヒドロキシ−［１−ウンデカン酸］、１４−ヒドロキシ−［１−テトラデカン酸］、８−ヒドロキシ−［１−オクタン酸−メチルエステル］、９−ヒドロキシ−［１−ノナン酸−メチルエステル］、１０−ヒドロキシ−［１−デカン酸−メチルエステル］、１１−ヒドロキシ−［１−ウンデカン酸−メチルエステル］、１２−ヒドロキシ−［１−ドデカン酸−メチルエステル］、１３−ヒドロキシ−［１−ウンデカン酸−メチルエステル］、１４−ヒドロキシ−［１−テトラデカン酸−メチルエステル］、８−ヒドロキシ−［１−オクタン酸−エチルエステル］、９−ヒドロキシ−［１−ノナン酸−エチルエステル］、１０−ヒドロキシ−［１−デカン酸−エチルエステル］、１１−ヒドロキシ−［１−ウンデカン酸−エチルエステル］、１２−ヒドロキシ−［１−ドデカン酸−エチルエステル］、１３−ヒドロキシ−［１−ウンデカン酸−エチルエステル］及び１４−ヒドロキシ−［１−テトラデカン酸−エチルエステル］から成るものを含む群から選択された置換化合物、
特に有利には１，８−オクタンジオール、１，１０−デカンジオール、１，１２−ドデカンジオール、１，１４−テトラデカンジオール、８−アミノ−［１−オクタノール］、１０−アミノ−［１−ドデカノール］、１２−アミノ−［１−ドデカノール］、１４−アミノ−［１−テトラデカノール］、８−ヒドロキシ−［１−オクタナール］、１０−ヒドロキシ−［１−デカナール］、１２−ヒドロキシ−［１−ドデカナール］、１４−ヒドロキシ−［１−テトラデカナール］、８−アミノ−［１−オクタナール］、１０−アミノ−［１−デカナール］、１２−アミノ−［１−ドデカナール］、１４−アミノ−［１−テトラデカナール］、８−ヒドロキシ−［１−オクタン酸］、１０−ヒドロキシ−［１−デカン酸］、１２−ヒドロキシ−［１−ドデカン酸］、１４−ヒドロキシ−［１−テトラデカン酸］、８−ヒドロキシ−［１−オクタン酸−メチルエステル］、１０−ヒドロキシ−［１−デカン酸−メチルエステル］、１２−ヒドロキシ−［１−ドデカン酸−メチルエステル］、１４−ヒドロキシ−［１−テトラデカン酸−メチルエステル］、８−ヒドロキシ−［１−オクタン酸−エチルエステル］、１０−ヒドロキシ−［１−デカン酸−エチルエステル］、１２−ヒドロキシ−［１−ドデカン酸−エチルエステル］及び１４−ヒドロキシ−［１−テトラデカン酸−エチルエステル］、ここで、ラウリン酸及びラウリン酸のエステル、殊にラウリン酸メチルエステル及びラウリン酸エチルエステルが特に有利である、から成るものを含む群から選択されている置換化合物、
から成るものを含む群から選択されている。

【0028】

本発明による方法では、使用される酸化酵素及び使用される有機物質に依存して様々の酸化産物、殊にアルコール、アルデヒド、ケトン及びカルボン酸を製造することができる。これらの酸化産物は、例えば、本発明による方法によって、以下にリストアップした有機物質の変換によって得られることができる：
− アルカン／アルケン／アルキンからアルコール（例えばモノオキシゲナーゼを用いて）
− アルコールからアルデヒド（例えばアルコールデヒドロゲナーゼ又はアルコールオキシダーゼを用いて）
− アルコールからケトン（例えばアルコールデヒドロゲナーゼ又はアルコールオキシダーゼを用いて）
− アルデヒドからカルボン酸（例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いて）
− エポキシドからシアンヒドリン（例えばハロヒドリンデハロゲナーゼを用いて）。

【0029】

これと関連して、アルコール及びアルデヒド、有利にはアルコール、殊にω−アルコール、極めて有利にはω−ヒドロキシカルボン酸の、本発明による方法を用いた、殊にヒドロキシル化反応の形態での製造が有利である。

【0030】

本発明による方法において、有機物質、殊にカルボン酸及びカルボン酸エステルは、好ましくはω位で酸化されることができる。

【0031】

本発明による方法において、当業者に公知の全ての公知の酸化酵素が用いられることができ、それというのも、供給されるａｌｋＬ遺伝子産物の働きは、これとは無関係だからである。係る酵素は、オキシドレダクターゼの用語で当業者によく知られており、国際生化学分子生物学連合の酵素委員会の体系的命名法の酵素分類ＥＣ １．Ｘ．Ｘ．Ｘに見出される。

【0032】

有利には、本発明による方法において、酸化酵素としてアルカンモノオキシゲナーゼ、キシレンモノオキシゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼ、好ましくはアルカンモノオキシゲナーゼが用いられる。キシレンモノオキシゲナーゼの適した遺伝子は、例えばｘｙｌＭ遺伝子又はｘｙｌＡ遺伝子であり、その際、これら両方の遺伝子を含んでいるプラスミドが、ＧＥＮＢＡＮＫ−Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ−Ｎｕｍｂｅｒ Ｍ３７４８０を有する。

【0033】

特に有利なアルカンモノオキシゲナーゼは、これと関連して、それが、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍ−Ｐ４５０−Ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅｎ）、酵母、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、例えばカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）又はカンジダ・マレトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）由来の、又は植物、例えばヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ Ｌ．）由来の、又は哺乳類、例えばドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、殊にＣＹＰ４Ａ１であることを特徴としている。カンジダ・トロピカリス由来の適したシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの遺伝子配列は、例えばＷＯ−Ａ−００／２０５６６に開示されており、その一方で、ヒヨコマメ（Ｋｉｃｈｅｒｅｒｂｓｅ）由来の適したシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの遺伝子配列は、例えばＢａｒｚ他から"Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｉｇｈｔ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｃＤＮＡｓ ｆｒｏｍ ｃｈｉｃｋｐｅａ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ Ｌ．）ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ"，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．１５５の第１０１頁〜第１０８頁（２０００）の中で参照されることができる。

【0034】

更なる有利なアルカンモノオキシゲナーゼは、シュードモナス・プチダＧＰｏ１由来のａｌｋオペロンのａｌｋＢ遺伝子によりコードされる。

【0035】

ａｌｋＢ遺伝子配列の分離は、例えばｖａｎ Ｂｅｉｌｅｎ他より"Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｌｋａｎｅ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ"，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８４（６）の第１．７３３頁〜第１．７４２頁（２００２）に記載されている。ａｌｋＢ遺伝子の更なる相同体はまた、ｖａｎ Ｂｅｉｌｅｎ他から"Ｏｉｌ ＆ Ｇａｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ"，Ｖｏｌ．５８（４）の第４２７頁〜第４４０頁（２００３）の中で参照されることができる。

【0036】

さらに有利なアルカンモノオキシゲナーゼは、グラム陰性細菌の群から選択された、殊にシュードモナス類の群から、そこではシュードモナス属、特にシュードモナス・メンドシナ属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）、オセアニコウリス（Ｏｃｅａｎｉｃａｕｌｉｓ）属、有利にはオセアニコウリス・アレクサンドリイ（Ｏｃｅａｎｉｃａｕｌｉｓ ａｌｅｘａｎｄｒｉｉ）ＨＴＣＣ２６３３、カウロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、有利にはカウロバクター ｓｐ．Ｋ３１、マリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｏｒ）、有利にはマリノバクター・アクアエオレイ（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｏｒ ａｑｕａｅｏｌｅｉ）、特に有利にはマリノバクター・アクアエオレイ ＶＴ８、アルカニボラックス属（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）、有利にはアルカニボラックス・ホルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アシディフィラム属（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ）、アシドボラックス属（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、アエロミクロビウム属（Ａｅｒｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、アルカリリムニコラ属（Ａｌｋａｌｉｌｉｍｎｉｃｏｌａ）、アルテロモナダレス属（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アロマトレウム属（Ａｒｏｍａｔｏｌｅｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚｏａｒｃｕｓ）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｂｉｕｍ）、シトレイセラ属（Ｃｉｔｒｅｉｃｅｌｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コルウェリア属（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、コネキシバクタ−属（Ｃｏｎｅｘｉｂａｃｔｅｒ）、コングレギバクター属（Ｃｏｎｇｒｅｇｉｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カプリアビダス属（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）、デルフチア属（Ｄｅｌｆｔｉａ）、デスルホミクロビウム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、デスルホホナトロノスピラ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｏｒｏｎｏｓｐｉｒａ）、デチオバクター属（Ｄｅｔｈｉｏｂａｃｔｅｒ）、ジノロセオバクター属（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ）、エリスロバクター属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、グラシエコラ属（Ｇｌａｃｉｅｃｏｌａ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、グリモンチア属（Ｇｒｉｍｏｎｔｉａ）、ハヘラ属（Ｈａｈｅｌｌａ）、ハロテリゲナ属（Ｈａｌｏｔｅｒｒｉｇｅｎａ）、ハロチオバチルス属（Ｈａｌｏｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ホエフレア属（Ｈｏｅｆｌｅａ）、ヒポモナス属（Ｈｙｐｏｍｏｎａｓ）、ジャニバクター属（Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ）、ヤナシア属（Ｊａｎｎａｓｃｈｉａ）、ヨンクエテラ属（Ｊｏｎｑｕｅｔｅｌｌａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、レギオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、リムノバクター属（Ｌｉｍｎｏｂａｃｔｅｒ）、ルチエラ属（Ｌｕｔｉｅｌｌａ）、マグネトスピリラム属（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、メチリビウム属（Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロファーガ属（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈａｇａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ネンジュモ属（Ｎｏｓｔｏｃ）、ノボスフィンゴビウム属（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、オクタデカバクター属（Ｏｃｔａｄｅｃａｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、パルブラルクラ属（Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｒｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フェオバクター属（Ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒ）、フェニロバクテリウム属（Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、シュードアルテロモナス属（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、シュードビブリオ属（Ｐｓｅｕｄｏｖｉｂｒｉｏ）、サイクロバクター属（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、サイクロフレクサス属（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｅｘｕｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｕｃｃｕｓ）、ロドフェラックス属（Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ）、ロドミクロビウム属（Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドスピリルム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ロゼオバクター属（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ）、ロゼオバリウス属（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ）、ルエゲリア属（Ｒｕｅｇｅｒｉａ）、サギツラ属（Ｓａｇｉｔｔｕｌａ）、シェワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、シリシバクター属（Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、スチグマテラ属（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、スルフィトバクター属（Ｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒ）、スルフリモナス属（Ｓｕｌｆｕｒｉｍｏｎａｓ）、スルフロバム属（Ｓｕｌｆｕｒｏｖｕｍ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、タラシオビウム属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｂｉｕｍ）、サーモコッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモノスポラ属（Ｔｈｅｒｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、チオアルカリビブリオ属（Ｔｈｉｏａｌｋａｌｉｖｉｂｒｉｏ）、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、チオミクロスピラ属（Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ）、チオモナス属（Ｔｈｉｏｍｏｎａｓ）、ツカムレラ属（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）又はサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）の群から選択された生物由来のａｌｋＢ遺伝子よりコードされるａｌｋＢ遺伝子産物であり、その際、アルカニボラックス・ホルクメンシス、オセアニコウリス・アレクサンドリイＨＴＣＣ２６３３、カウロバクター ｓｐ．Ｋ３１及びマリノバクター・アクアエオレイ ＶＴ８由来のものが特に有利である。これと関連して、ＡｌｋＢに加えてａｌｋＧ−及びａｌｋＴ遺伝子産物が供給されると好ましい；これらは、ａｌｋＢ遺伝子産物に寄与する生物から分離可能な遺伝子産物であるか、又は、しかし、シュードモナス・プチダＧＰｏ１由来のａｌｋＧ及びａｌｋＴであってもよい。

【0037】

有利なアルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、ａｋｌＪ遺伝子よりコードされた酵素（ＥＣ １．１．９９．８）、殊にａｌｋＪ遺伝子よりコードされたシュードモナス・プチダＧＰｏ１由来の酵素である（ｖａｎ Ｂｅｉｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），（１９９２）６（２１），３１２１−３１３６）。シュードモナス・プチダＧＰｏ１、アルカニボラックス・ホルクメンシス、ボルデテラ・パラペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ホルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）由来又はロゼオバクター・デニトリフィカンス（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来のａｌｋＪ遺伝子の遺伝子配列は、例えばＫＥＧＧ遺伝子データバンク（京都遺伝子ゲノム百科事典）より参照することができる。さらに有利なアルコールデヒドロゲナーゼは、グラム陰性細菌の群から選択された、殊にシュードモナス類の群から、そこではシュードモナス属、特にシュードモナス・メンドシナ属、オセアニコウリス属、有利にはオセアニコウリス・アレクサンドリイＨＴＣＣ２６３３、カウロバクター属、有利にはカウロバクター ｓｐ．Ｋ３１、マリノバクター属、有利にはマリノバクター・アクアエオレイ、特に有利にはマリノバクター・アクアエオレイ ＶＴ８、アルカニボラックス属、有利にはアルカニボラックス・ホルクメンシス、アセトバクター属、アクロモバクター属、アシディフィラム属、アシドボラックス属、アエロミクロビウム属、アルカリリムニコラ属、アルテロモナダレス属、アナベナ属、アロマトレウム属、アゾアルカス属、アゾスピリルム属、アゾトバクター属、ボルデテラ属、ブラディリゾビウム属、バークホルデリア属、クロロビウム属、シトレイセラ属、クロストリジウム属、コルウェリア属、コマモナス属、コネキシバクタ−属、コングレギバクター属、コリネバクテリウム属、カプリアビダス属、シアノセイス属、デルフチア属、デスルホミクロビウム属、デスルホホナトロノスピラ属、デチオバクター属、ジノロセオバクター属、エリスロバクター属、フランシセラ属、グラシエコラ属、ゴルドニア属、グリモンチア属、ハヘラ属、ハロテリゲナ属、ハロチオバチルス属、ホエフレア属、ヒポモナス属、ジャニバクター属、ヤナシア属、ヨンクエテラ属、クレブシエラ属、レギオネラ属、リムノバクター属、ルチエラ属、マグネトスピリラム属、メソリゾビウム属、メチリビウム属、メチロバクテリウム属、メチロファーガ属、マイコバクテリウム属、ナイセリア属、ニトロソモナス属、ノカルディア属、ネンジュモ属、ノボスフィンゴビウム属、オクタデカバクター属、パラコッカス属、パルビバクラム属、パルブラルクラ属、ペプトストレプトコッカス属、フェオバクター属、フェニロバクテリウム属、フォトバクテリウム属、ポラロモナス属、プレボテラ属、シュードアルテロモナス属、シュードビブリオ属、サイクロバクター属、サイクロフレクサス属、ラルストニア属、ロドバクター属、ロドコッカスバクター属、ロドフェラックス属、ロドミクロビウム属、ロドシュードモナス属、ロドスピリルム属、ロゼオバクター属、ロゼオバリウス属、ルエゲリア属、サギツラ属、シェワネラ属、シリシバクター属、ステノトロホモナス属、スチグマテラ属、ストレプトマイセス属、スルフィトバクター属、スルフリモナス属、スルフロバム属、シネココッカス属、タラシオビウム属、サーモコッカス属、サーモノスポラ属、チオアルカリビブリオ属、チオバチルス属、チオミクロスピラ属、チオモナス属、ツカムレラ属、ビブリオ属又はサントモナス属の群から選択された生物由来のａｌｋＪ遺伝子よりコードされるものである。

【0038】

本発明による方法において用いられる有利なａｌｋＬ遺伝子産物は、ａｌｋＬ遺伝子産物の作製が野生の宿主においてジシクロプロピルケトンによって誘発されることを特徴としている；これと関連して、ａｌｋＬ遺伝子の発現が遺伝子の一群として、例えばオペロンといったレギュロン内で起こることがさらに有利である。

【0039】

本発明による方法において用いられるａｌｋＬ遺伝子産物は、有利には、グラム陰性細菌の群から、殊に、有利にはシュードモナス、特にシュードモナス・プチダ、殊にシュードモナス・プチダ、殊にシュードモナス・プチダＧＰｏ１及びＰｌ、アゾトバクター、デスルフィトバクテリウム（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バークホルデリア、有利にはバークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、サントモナス、ロドバクター、ラルストニア、デルフチア及びリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、オセアニコウリス属、有利にはオセアニコウリス・アレクサンドリイＨＴＣＣ２６３３、カウロバクター属、有利にはカウロバクター ｓｐ．Ｋ３１、マリノバクター属、有利にはマリノバクター・アクアエオレイ、特に有利にはマリノバクター・アクアエオレイ ＶＴ８及びロドシュードモナス属から成るものを含む群から選択された生物由来のａｌｋＬ遺伝子によりコードされる。

【0040】

ａｌｋＬ遺伝子産物が、本発明により用いられる酸化酵素とは別の生物に由来する場合に好ましい。

【0041】

これと関連して、極めて有利なａｌｋＬ遺伝子産物は、シュードモナス・プチダＧＰｏ１及びＰ１由来のａｌｋＬ遺伝子によってコードされており（これらは、配列番号１及び配列番号３によって示される）、並びにポリペプチド配列の配列番号２若しくは配列番号４を有するタンパク質、又は配列番号２若しくは配列番号４に対してアミノ酸残基の６０％まで、有利には２５％まで、特に有利には１５％まで、殊に１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％までが欠失、挿入、置換又はそれらの組合せによって改変されており、かつ、それぞれ配列番号２若しくは配列番号４の基準配列を有するタンパク質の活性の、なお少なくとも５０％、有利には６５％、特に有利には８０％、殊に９０％超を有するポリペプチド配列を有するタンパク質であり、その際、基準タンパク質の活性１００％とは、生体触媒として用いられた細胞の活性の上昇、つまり、基準タンパク質なしの生体触媒の活性と比較した、使用された細胞量を基準とした単位時間当たりに変換された物質量（細胞乾燥重量（ｃｅｌｌ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ）１グラム当たりの単位［Ｕ／ｇＣＤＷ］）と解され、具体的には、酸化酵素としてＰ．Ｐｕｔｉｄａ ＧＰｏ１由来のａｌｋＢＧＴの遺伝子産物を、大腸菌細胞内でラウリン酸メチルエステルを１２−ヒドロキシラウリン酸メチルエステルへと変換させるために用いている実施例において記載される系でのものと解される。酸化速度を測定するための選択法は、実施例から読み取ることができる。ここでは、単位の定義に関して、酵素反応速度において通常用いられる定義が当てはめられる。１単位の生体触媒が、１μｍｏｌの基質を１分間で産物に変換する。

【0042】

１Ｕ＝１μｍｏｌ／ｍｉｎ

【0043】

所与のポリペプチドの特性及び作用に本質的な変化をもたらさない、所与のポリペプチド配列のアミノ酸残基の改変は当業者に公知である。例えば、しばしば、多くのアミノ酸は、問題なく互いに交換されることができる；係る適したアミノ酸置換の例は以下のものである：ＡｌａとＳｅｒ；ＡｒｇとＬｙｓ；ＡｓｎとＧｌｎ又はＨｉｓ；ＡｓｐとＧｌｕ；ＣｙｓとＳｅｒ；ＧｌｎとＡｓｎ；ＧｌｕとＡｓｐ；ＧｌｙとＰｒｏ；ＨｉｓとＡｓｎ又はＧｌｎ；ＩｌｅとＬｅｕ又はＶａｌ；ＬｅｕとＭｅｔ又はＶａｌ；ＬｙｓとＡｒｇ又はＧｌｎ又はＧｌｕ；ＭｅｔとＬｅｕ又はＩｌｅ；ＰｈｅとＭｅｔ又はＬｅｕ又はＴｙｒ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＴｈｒとＳｅｒ；ＴｒｐとＴｙｒ；ＴｙｒとＴｒｐ又はＰｈｅ；ＶａｌとＩｌｅ又はＬｕｅ。

【0044】

同様に、例えばアミノ酸の挿入又は欠失の形態における、ポリペプチドの特にＮ末端又はＣ末端の改変は、しばしば、ポリペプチドの機能に本質的な影響を及ぼさないことが知られている。本発明により有利な方法は、さらに別の遺伝子産物が、ＡｌｋＢ，ＡｌｋＦ、ＡｌｋＧ、ＡｌｋＨ、ＡｌｋＨＪ、及びＡｌｋＫから成る群から、殊にＡｌｋＦ、ＡｌｋＧ、ＡｌｋＨ、ＡｌｋＪ、及びＡｌｋＬＫから成る群からの少なくとも１つから選択されており、その際、さらに別の遺伝子産物は、殊に、有利には遺伝子組合せ：ａｌｋＢＦ、ａｌｋＢＧ、ａｌｋＦＧ、ａｌｋＢＪ、ａｌｋＦＪ、ａｌｋＧＴ、ａｌｋＢＨ、ａｌｋＦＨ、ａｌｋＧＨ、ａｌｋＪＨ、ａｌｋＢＫ、ａｌｋＦＫ、ａｌｋＧＫ、ａｌｋＪＫ、ａｌｋＨＫ、ａｌｋＢＦＪ、ａｌｋＢＦＨ、ａｌｋＢＦＫ、ａｌｋＢＧＪ、ａｌｋＦＧＪ、ａｌｋＢＧＨ、ａｌｋＦＧＨ、ａｌｋＢＧＫ、ａｌｋＦＧＫ、ａｌｋＢＪＨ、ａｌｋＦＪＨ、ａｌｋＧＪＨ、ａｌｋＢＪＫ、ａｌｋＦＪＫ、ａｌｋＧＪＫ、ａｌｋＦＨＫ、ａｌｋＢＨＫ、ａｌｋＦＨＫ、ａｌｋＧＨＫ、ａｌｋＢＧＪＨ、ａｌｋＢＧＪＫ、ａｌｋＢＧＨＫ、ａｌｋＢＦＧＪ、ａｌｋＢＦＧＨ、ａｌｋＦＧＪＨ、ａｌｋＢＦＧＫ、ａｌｋＦＧＪＫ、ａｌｋＧＪＨＫ、ａｌｋＢＦＪＨ、ａｌｋＢＦＪＫ、ａｌｋＦＪＨＫ、ａｌｋＢＦＨＫ、ａｌｋＢＦＧＪＨ、ａｌｋＢＦＧＪＫ及びａｌｋＢＦＧＪＨＫ、殊にａｌｋＦＨＪＫ及びａｌｋＢＦＧＨＪＫから成るものを含む群から選択されている。

【0045】

本発明による方法にとって、酸化酵素及びａｌｋＬ遺伝子産物が微生物によって供給される場合に好ましい。その際、２つの酵素はそれぞれ別個に、それぞれ１つの微生物で供給するか、又は一緒に１つの微生物で供給してよく、その際、後者が好ましい。それゆえ、本発明による有利な方法は、酸化酵素及びａｌｋＬ遺伝子産物を供給する少なくとも１つの微生物中で又は該少なくとも１つの微生物を取り囲む培地中で実施されることを特徴としている。

【0046】

これと関連して、酸化酵素及びａｌｋＬ遺伝子産物が少なくとも１つの微生物で組み換えられて供給されることが有利である。

【0047】

ここで、組み換え製造に関する以下の説明は、酸化酵素にもａｌｋＬ遺伝子産物にも関係している。

【0048】

基本的に、組み換え製造は、タンパク質をコードする１つの遺伝子配列若しくは複数の遺伝子配列のコピー数を向上させ、遺伝子の改変プロモーターを使用し、遺伝子のコドン利用を改変し、様々な手法でｍＲＮＡ又は酵素の半減期を向上させ、遺伝子の発現を調節するか又は相応するタンパク質をコードする遺伝子又は対立遺伝子を利用し、かつ場合によってはこれらの措置を組み合わせることによって行われることができる。

【0049】

係る遺伝子を備えた細胞は、例えば、形質転換、形質導入、コンジュゲーション又はこれら方法の組み合わせによって、ベクターを用いて作製され、該ベクターは、所望の遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子又はこの部分及びこの遺伝子の発現を可能にするプロモーターを含有する。この非相同発現は、殊に細胞の染色体中への遺伝子又は対立遺伝子の挿入、又は染色体外で複製するベクターによって実現される。

【0050】

イソクエン酸リアーゼの例を用いた細胞内での組み換え製造の可能性についての概観をＥＰ０８３９２１１が示し、該文献は参照によって組み入れ、また該文献の開示内容は、細胞内での組み換え製造の可能性に関して、本発明の開示内容の一部を成す。

【0051】

前述の、そして後述の全てのタンパク質若しくは遺伝子の供給若しくは製造若しくは発現は、１次元及び２次元ゲル電気泳動、並びに引き続き相応する評価ソフトウェアを用いたゲル中でのタンパク質濃度の光学的同定によって検出可能である。見出された発現能が、もっぱら相応する遺伝子の発現の増大に基づく場合、組み換え発現の定量化は簡単に１次元若しくは２次元タンパク質によって野生型と遺伝子工学的に改変された細胞との間で測定されることができる。コリネフォルム細菌にてタンパク質ゲルを調製するための及び該タンパク質を同定するための慣例の方法は、Ｈｅｒｍａｎｎ他（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２：１７１２．２３（２００１）によって記載された手法である。タンパク質濃度は、同様に、検出されるべきタンパク質に特化した抗体を用いたウエスタンブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ＵＳＡ，１９８９）及び引き続く濃度測定のための相応するソフトウェアを用いた光学的評価によって分析されることができる。

【0052】

組み換え発現が、タンパク質の合成の向上によって行われる場合、例えば、相応する遺伝子のコピー数を向上させるか、又はプロモーター領域及び調節領域若しくはリボソーム結合部位（構造遺伝子の上流に存在する）を突然変異させる。誘発可能なプロモーターによって、さらに、すべの任意の時点で発現を高めることが可能である。そのうえ、タンパク質遺伝子には調節配列として、一方で、いわゆる"エンハンサー"も組み込まれていてよく、これは同様に、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの改善された相互作用により、高められた遺伝子発現を引き起こす。ｍＲＮＡの寿命を延ばすことによって、同様に発現は改善される。

【0053】

そのつどの遺伝子の組み換え発現を向上させるために、例えばエピソーム性プラスミドが用いられる。プラスミド若しくはベクターとして、原則的に、当業者にこの目的のために提供される全ての実施形態が考慮に入れられる。この種のプラスミド及びベクターについては、例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ又はＧｉｂｃｏ ＢＲＬのパンフレットを参照することができる。更なる有利なプラスミド及びベクターは、以下に見出すことができる：Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（１９８５），ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｔ（ｅｄｓ）（１９８８），Ｖｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，１７９−２０４，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．（１９９０），Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，３−７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．；Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。

【0054】

増幅されるべき遺伝子を含有するプラスミドベクターを、引き続きコンジュゲーション又は形質転換によって所望の菌株に移す。コンジュゲーションの方法は、例えばＳｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０：７５６−７５９（１９９４）に記載されている。形質転換のための方法は、例えばＴｈｉｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：３５６−３６２（１９８８），Ｄｕｎｉｃａｎ及びＳｈｉｖｎａｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１０６７−１０７０（１９８９）及びＴａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２３：３４３−３４７（１９９４）に記載されている。"交差"事象による相同性組み換え後に、結果生じる菌株は、当該遺伝子の少なくとも２つのコピーを含む。

【0055】

それゆえ、本発明による方法においては、組み換え微生物を用いることが有利であり、良好な遺伝作業に基づき、微生物は、有利には、細菌、殊にグラム陰性細菌の群から、特に、有利には大腸菌、シュードモナス・エスピー、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・アシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシドボラックス・エスピー、アシドボラックス・テンペランス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｔｅｍｐｅｒａｎｓ）、アシネトバクター・エスピー（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、バークホルデリア・エスピー、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｋｔｅｒｉｅｎ）、クレブシエラ・エスピー、サルモネラ・エスピー、リゾビウム・エスピー及びリゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）から成るものを含む群から選択されており、その際、大腸菌が特に有利である。

【0056】

本発明による方法において用いられる細胞も、同じように本発明の構成部分を成す。

【0057】

したがって、有機物質を酸化する少なくとも１つの酵素及び少なくとも１つのａｌｋＬ遺伝子産物（その際、該ａｌｋＬ遺伝子産物は、該ａｌｋＬ遺伝子を含むａｌｋオペロンによってコードされた少なくとも１つのさらに別の遺伝子産物とは無関係に合成される）を大いに合成するように遺伝子工学的に改変された微生物は、本発明の対象である。

【0058】

有利な酸化酵素は、これと関連して、本発明による方法において有利には使用される同じ酸化酵素である；同じことが、有利なａｌｋＬ遺伝子産物、有利には該ａｌｋＬ遺伝子を含むａｌｋオペロンによってコードされた遺伝子産物、有利な有機物質、並びに有利な微生物に当てはめられる。

【0059】

もう一つの本発明の対象は、有機物質を酸化する少なくとも１つの酵素の酸化速度を高めるために、有利には微生物における、ａｌｋＬ遺伝子産物の使用であって、該ａｌｋＬ遺伝子産物は、該ａｌｋＬ遺伝子を含むａｌｋオペロンによってコードされた少なくとも１つのさらに別の遺伝子産物とは無関係に使用されることを特徴とする。

【0060】

これと関連して、酸化は、有利にはアルデヒド又はアルコール、殊にアルコールを得るための有機物質の酸化である。したがって、これと関連して、有利にはヒドロキシル化の度合いが、殊にカルボン酸の場合にはω位で、有利にはカルボン酸及びそのエステルを、相応するω−ヒドロキシル化化合物へと変換すること、殊にドデカン酸メチルエステルをヒドロキシドデカン酸メチルエステルへと変換することに関して高められる。有利な酸化酵素は、これと関連して、本発明による方法で有利には使用される同じ酸化酵素である；同じことが、有利なａｌｋＬ遺伝子産物、有利には該ａｌｋＬ遺伝子を含むａｌｋオペロンによってコードされた遺伝子産物、有利な有機物質、並びに有利な微生物に当てはめられる。

【0061】

以下に記載した実施例は、本発明を例示的に説明するものであって、本発明（その適用の幅は、明細書の全開示内容及び特許請求の範囲からもたらされる）は、該実施例に挙げた実施形態に制限されるべきではない。

【0062】

後続の図は、例の一部を構成する：

【図面の簡単な説明】

【0063】

【図1】大腸菌プラスミド"ｐＢＴ１０＿ａｌｋＬ"を示す図

【実施例】

【0064】

比較例１：ＡｌｋＢＧＴの発現ベクター
ａｌｋＬを有さないシュードモナス・プチダＧＰｏ１由来のアルカンヒドロキシラーゼ系の発現ベクター

【0065】

ｐＣＯＭ系（Ｓｍｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００１ プラスミド ６４：１６−２４）から出発して、構造ｐＢＴ（配列番号５）を製造し、これは、シュードモナス・プチダ由来の３つの成分アルカンヒドロキシラーゼ（ＡｌｋＢ）、ルブレドキシン（ＡｌｋＧ）及びルブレドキシン−レダクターゼ（ＡｌｋＴ）を有する。これら３つの遺伝子の発現のために、ａｌｋＢＦＧ遺伝子配列を、ａｌｋＢプロモーターの制御下におき、かつａｌｋＴ遺伝子をａｌｋＳプロモーターの制御下においた。ａｌｋＢ及びａｌｋＧのクローニングを簡素化するために、その間にある遺伝子ａｌｋＦをａｌｋＢ及びａｌｋＧと一緒に増幅し、かつクローン化した。ＡｌｋＦは、触媒されるべき反応にとって重要でない。ベクターｐＢＴ１０の製造の詳細な説明は、ＷＯ２００９０７７４６１を参照することができる。

【0066】

例１：ａｌｋＬを有するシュードモナス・プチダＧＰｏ１由来のＡｌｋＢＧＴアルカンヒドロキシラーゼの発現ベクター
更なる試みでは、目的に合わせてａｌｋＬ遺伝子を、酸化に必要とされる最小の酵素群と一緒にそれを合成できるように、ａｌｋＢＦＧオペロンにクローン化した。そのために、ｐＧＥｃ４７のａｌｋＬ遺伝子（Ｅｇｇｉｎｋ） ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２，１７７１２−１７７１８）をＰＣＲで増幅した。

【0067】

そのために使用したプライマーＰ１及びＰ２は、プラスミドｐＢＴ１０のＳａｌＩ切断部位にクローン化するために、目標配列の外側で同様にＳａｌＩ切断部位を有する。そのうえ、フォワードプライマーＰ１に停止コドンをＳａｌＩ切断部位の後方で導入して、ａｌｋＨ残基の可能な翻訳を終えた。

【0068】

Ｐ１ ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＴＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＡＡＡＣＧＡＧＧＧＴＡＧ（配列番号６）
Ｐ２ ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＧＡＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＣＣＴＧ（配列番号７）

【0069】

増幅のために、Ｆｉｎｎｚｙｍｅ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（フィンザイムのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた。

【0070】

製造規程に従って、３４μＬのＨ₂Ｏ、１０μＬの５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液、１μＬのｄＮＴＰｓ（それぞれ１０ｍＭ）、１．２５μＬのＰ１、１．２５μＬのＰ２（０．５ｍＭのエンド−プライマー−濃度）、２μＬのｐＧＥｃ４７プラスミド溶液（１５０ｎｇ／μＬ）及び０．５μＬのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを混合し、かつ薄壁のＰＣＲ−エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）−容器中でＰＣＲのために用いた。

【0071】

以下のＰＣＲプログラムを、ポリメラーゼ製造の示唆に則ってプログラミングした：
［９８℃／３０秒］、（［９８℃／１０秒］［７２℃／６０秒］）３０サイクル、［７２℃／１０分］

【0072】

７５４ｂｐの長さを有する生じたＰＣＲ産物を、"ｐｅｑＧＯＬＤ ｃｙｃｌｅ ｐｕｒｅ Ｋｉｔｓ"（ＰＥＱＬＡＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧｍｂＨ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ在）を用いて、製造規定に則って精製し、かつＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。そのために、該精製より得られたＰＣＲ産物溶液を、２μＬのＡＴＰ溶液（１００ｍＭ）、２μＬのキナーゼ緩衝液及び１μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと混ぜ、３７℃で２０分間培養した。引き続き、この酵素を１０分間７５℃に加熱することによって死滅させた。

【0073】

そのようにして準備したＰＣＲ産物を製造規定に則って、それからＬｕｃｉｇｅｎ社のｐＳＭＡＲＴベクターにライゲーションした。このライゲーションバッチ２μｌを、ヒートショック（４２℃で４５秒間）によって大腸菌ＤＨ５αケミカリーコンピテントセルに形質転換した。

【0074】

カナマイシンプレートで選択したコロニーの一晩培養後に、液体培養（カナマイシン３０μｇ／ｍＬを有する５ｍＬ ＬＢ培地）において培養し、かつプラスミドをｐｅｑＧＯＬＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔｓ（ＰＥＱＬＡＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧｍｂＨ（Ｅｒｌａｎｇｅｎ））を用いて分離した。

【0075】

ＳａｌＩによる制限切断(Restriktionsspaltung)及び引き続くゲル電気泳動によって、正しくライゲーションされたプラスミドを同定した。

【0076】

係るプラスミドを、より多量に調製し、かつＳａｌＩで切断した。生じる６９３ｂｐ断片を、Ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ（アガロースゲル）（ｐｅｑＧＯＬＤ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）からの精製によって分離した。

【0077】

プラスミドｐＢＴ１０も同様に、より多量に調製し、ＳａｌＩで切断し、かつ最後にアルカリ性ホスファターゼ（仔ウシ腸由来の［アルカリ］ホスファターゼ、ＣＩＰ）（ＮＥＢ）で脱リン酸化した。

【0078】

これらの手順を、反応容器中で実施した。そのために、１３．３μＬのプラスミドＤＮＡを、４μＬの緩衝液、１９．２μＬの水、２μＬのアルカリ性ホスファターゼ及び１．５μＬのＳａｌＩ（ＮＥＢ）と混ぜ、そして３７℃で２時間培養した。切断し、かつ脱リン酸化したベクターを、同様に上記の通りＡｇａｒｏｓｅｇｅｌにより精製した。

【0079】

ライゲーションにおけるベクターとインサートとの正しい比を調整するために、相応するＤＮＡ溶液の濃度をアガロースゲル電気泳動によって確かめた。

【0080】

ライゲーションのために、１０μＬの切断したベクターＤＮＡ溶液を、ＤＮＡ質量比１：５となるように５μＬのインサートＤＮＡ溶液と混ぜ、２μＬのリガーゼ緩衝液、１μＬの水並びに１μＬのリガーゼを加え、引き続き２２℃で２時間、かつ、その後に一晩中４℃で培養した。

【0081】

このバッチの５μＬを、電気穿孔法により大腸菌細胞ＤＨ５αに形質転換した。

【0082】

カナマイシン耐性コロニーを、抗生物質を含む５ｍＬ ＬＢ培地中で一晩培養し、かつプラスミドを上記の通り調製した。

【0083】

ＥｃｏＲＶによる５つのクローンからのプラスミドＤＮＡの制限切断により、３つの場合において、それぞれ８２４８Ｂｐ、２２３４Ｂｐ及び１２６６Ｂｐのバンドが示された。

【0084】

得られたプラスミドをｐＢＴ１０＿ａｌｋＬ（図１を参照されたい）とし、これは配列番号８を有する。

【0085】

例２：ラウリン酸メチルエステルからω−ヒドロキシラウリン酸メチルエステルへの変換
生体内変化のために、プラスミドｐＢＴ１０又はｐＢＴ＿ａｌｋＬを、４２℃で２分間のヒートショックによって大腸菌種Ｗ３１１０ケミカリーコンピテントに形質転換した（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ，ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｖａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１０９−１３５）。ヒドロキシラウリン酸メチルエステルの合成のために、大腸菌Ｗ３１１０−ｐＢＴ１０及びＷ３１１０−ｐＢＴ１０＿ａｌｋＬを一晩中３０℃及び１８０ｒｐｍにて、３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを有する１００ｍＬのＭ９培地（Ｎａ_２ＨＰＯ₄ ６ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ １ｇ／Ｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．１ｍＭ ＣａＣｌ₂、グルコース０．５％）中で培養し、かつ遠心分離によって集菌した。バイオマスの一部を、無菌でグルコース０．５％及びカナマイシン３０ｍｇ／Ｌを有する２５０ｍＬのＭ９培地に再懸濁してＯＤ４５０＝０．２とし、かつ振盪フラスコ内で３０℃及び１８０℃ｒｐｍにてさらに培養した。ａｌｋ遺伝子の発現を、４時間の生長時間後に０．０２５％（ｖ／ｖ）のジシクロプロピルケトンの添加によって誘発し、かつ培養物を同じ条件下でさらに４時間振盪した。細胞を引き続き遠心分離除去し、細胞ペレットをＫＰｉ緩衝液に再懸濁し、かつ３０℃に調温したバイオリアクターに加えた。約１．８ｇＣＤＷ／Ｌのバイオマス濃度を設定した。力強い撹拌（１５００ｍｉｎ^-1）及び２ｖｖｍ（体積及び１分当たりの体積の）の通気量の下で、基質のラウリン酸メチルエステルを１：２の比において細胞懸濁液に加えた（１００ｍｌの細胞懸濁液、５０ｍｌのラウリン酸メチルエステル）。温度は３０℃で一定に保った。

【0086】

ヒドロキシラウリン酸メチルエステルの形成は、反応バッチのＧＣ分析によって検出した。そのために、０分後にＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌとして及び１５０分後にサンプルを、スポイトを用いて反応器の上昇管を通して採取し、かつ２ｍＬのエッペンドルフ容器においてエッペンドルフ卓上型遠心分離機を使って１３２００ｒｐｍにて相分離のために５分間のあいだ遠心分離した。有機相は、ガスクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ ＧＣ Ｕｌｔｒａ）によって分析した。カラムとして、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ．ＦａｃｔｏｒＦｏｕｒＴＭ ＶＦ−５ｍ、長さ：３０ｍ、膜厚：０．２５μｍ、内径：０．２５ｍｍを用いた。

【0087】

分析条件：
炉温度 ８０〜２８０℃
昇温速度 １５℃／ｍｉｎ
スプリット比(Splitratio) １５
注入量 １μｌ
キャリアー流量(Carrierflow) １．５ｍｌ／ｍｉｎ
ＰＴＶインジェクター １５℃／ｓで８０〜２８０℃
検出器基準温度： ３２０℃

【0088】

ここで、１２−ヒドロキシラウリン酸メチルエステルの測定された形成率は、生体触媒の活性に換算することができ、かつ使用した細胞マスを基準とすることができる。

【0089】

変換速度の線形領域中では、活性に関して、活性［Ｕ］＝変換した物質量［μｍｏｌ］／時間［ｍｉｎ］が当てはめられる。

【0090】

酵素の説明に通常用いられるこの単位"Ｕ"は、反応の開始時の係る生体触媒の性能の尺度である。

【0091】

【表1】

【0092】

初期活性は、付加的に発現されたａｌｋＬによって２６．７倍上昇させることができた。

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]