特許 5936818 細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体および臓器移植拒絶および自己免疫疾患の治療または予防における該抗体の使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5936818

(24)【登録日】2016年5月20日

(45)【発行日】2016年6月22日

(54)【発明の名称】細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体および臓器移植拒絶および自己免疫疾患の治療または予防における該抗体の使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20160609BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160609BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20160609BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20160609BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   A61K39/395 U

   A61P37/06

   C12P21/08

【請求項の数】6

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2010-504896(P2010-504896)

(86)(22)【出願日】2008年4月30日

(65)【公表番号】特表2010-526052(P2010-526052A)

(43)【公表日】2010年7月29日

(86)【国際出願番号】IB2008001072

(87)【国際公開番号】WO2008132601

(87)【国際公開日】20081106

【審査請求日】2011年4月22日

【審判番号】不服2014-14899(P2014-14899/J1)

【審判請求日】2014年7月30日

(31)【優先権主張番号】07290545.8

(32)【優先日】2007年4月30日

(33)【優先権主張国】EP

【微生物の受託番号】CNCM  I-3755

【微生物の受託番号】CNCM  I-3756

(73)【特許権者】

【識別番号】506344675

【氏名又は名称】イミュテップ

【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＴＥＰ

(73)【特許権者】

【識別番号】591100596

【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(72)【発明者】

【氏名】トリーベル、フレデリック

(72)【発明者】

【氏名】バンオーブ、ベルナール

(72)【発明者】

【氏名】オードブール、トーマス

【合議体】

【審判長】 鈴木 恵理子

【審判官】 ▲高▼ 美葉子

【審判官】 高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０００−５０８２２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０００−５０９０１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００６／１２５０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２００４）Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．３，ｐ．１３０−１３５

【文献】 Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２００３）Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１０，ｐ．１２７５−１２８０

【文献】 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ（２００５）Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１，ｐ．１７−２９

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N15/00-90

C07K16/00-46

CAPLUS

BIOSIS

MEDLINE

JSTPLUS

JMEDPLUS

JST7580

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＬＡＧ−３^＋活性化Ｔ細胞の欠乏を引き起こす細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体であって、
アクセス番号ＣＮＣＭ Ｉ−３７５５の下ＣＮＣＭに２００７年４月２７日に寄託されたハイブリドーマにより生産される、細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体。

【請求項2】

ＬＡＧ−３^＋活性化Ｔ細胞の欠乏を引き起こす細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体であって、
アクセス番号ＣＮＣＭ Ｉ−３７５６の下ＣＮＣＭに２００７年４月２７日に寄託されたハイブリドーマにより生産される、細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体。

【請求項3】

臓器移植拒絶を治療もしくは予防するかまたは自己免疫疾患を治療するための、医薬の製造のための請求項１または２に記載の細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体の使用。

【請求項4】

前記自己免疫疾患は、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患である、請求項３に記載の使用。

【請求項5】

前記自己免疫疾患は、全身性紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ、および多発性硬化症から選択される、請求項３に記載の使用。

【請求項6】

単一用量で３０〜３００ｍｇの請求項１または２に記載の細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体と、
哺乳動物への投与用の医薬として許容される担体および希釈剤の少なくとも一方と、
を含有する医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は免疫療法の分野である。より詳細には、本発明は、臓器移植拒絶の治療もしくは予防または自己免疫疾患の治療に関する。本発明はＬＡＧ−３タンパク質に結合し、ＬＡＧ−３⁺活性化Ｔ細胞の欠乏を引き起こす分子に関する。より詳細には、本発明は細胞
傷害性ＬＡＧ−３特異的モノクローナル抗体またはその断片に関する。

【背景技術】

【0002】

リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３、ＣＤ２２３）はＴ細胞活性化の初期段階に上方制御されている。本発明は、選択されたＬＡＧ−３モノクローナル抗体が低用量（＜０．１μｇ／ｍｌ）でＬＡＧ−３⁺活性化エフェクターＴ細胞の欠乏に有効であるという、
急性心臓同種移植片拒絶（インビボ動物試験）でのおよびインビトロ試験での、ＬＡＧ−３に対する細胞傷害活性抗体の作用の分析に基づいている。

【0003】

活性化Ｔリンパ球を選択的に欠乏させると、免疫抑制性誘発処理を示し、そのため調節細胞が発達し、これがマウスおよび霊長類での同種器官の長期存続を支持する可能性がある（１）。これは、Ｆｃ依存性機構によりインビボで活性化Ｔ細胞を欠乏させる抗ＣＤ４０Ｌ抗体により実際に証明されている（２）。しかしながら、抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、ヒトの活性化血小板も標的とするため、動脈血栓の安定性に影響する（３）。したがってＴ細胞活性化に特異的な他の分子に対するモノクローナル抗体の開発により、免疫抑制を達成しようという試みがなされている。そのような１つの分子がＬＡＧ−３であり、ＬＡＧ−３は高い親和性で樹状細胞（ＤＣ）上のクラスＩＩに係合し、ＤＣを活性化させる（４−６）。ＬＡＧ−３タンパク質は、インビボでは、炎症性二次リンパ器官または組織に存在する活性化ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺リンパ球で発現しているが、脾臓、胸腺または血液では発現していない（７）。さらに、ＬＡＧ−３は、初期活性化での初期事象を阻害することにより、活性化ヒトＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の負の調節因子として機能し得る（８）。

【発明の概要】

【0004】

本発明は、ＬＡＧ−３タンパク質に結合し、ＬＡＧ−３⁺により活性化されＴ細胞（以
下、ＬＡＧ−３⁺活性化Ｔ細胞と称する）の欠乏を引き起こす分子を提供する。かかる欠
乏は、組織または器官における末梢血リンパ球数の変化により測定可能である。

【0005】

好ましい実施形態では、ＬＡＧ−３タンパク質に結合する分子は、ＬＡＧ−３⁺活性化
Ｔ細胞の欠乏を引き起こす細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体またはその断片であり、該抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＭ（またはマウスＩｇＧ２ａ）のサブクラスのＦｃ断片と、ＬＡＧ−３タンパク質に結合するＦＡｂ断片とを有し、該抗体は、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）のうちの少なくとも一方を示す。

【0006】

本発明は、臓器移植拒絶を治療もしくは予防するか、または自己免疫疾患を治療する方法をさらに提供する。かかる方法は、哺乳動物である対象に、治療上有効量の細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体またはその断片を投与することからなる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】心臓同種移植片（Ａ）、脾臓（Ｂ）、およびリンパ節（Ｃ）におけるＬＡＧ−３ ｍＲＮＡの発現。５日目の心臓移植片におけるＬＡＧ−３ ｍＲＮＡの発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定し、ハウスキーピングＨＰＲＴ転写物の発現と比較した。拒絶：処理を施さない同種移植片（allograft）。シンジェニック：同系移植片（isograft）。寛容：免疫寛容（ＣｓＡ＋抗ＣＤ２８抗体）処理を受けたレシピエントの同種移植片。^＊＊：ｐ＜０．０５ シンジェニックおよび寛容と、拒絶とを比較した場合。

【図2】補体依存性細胞傷害活性アッセイにおける抗ＬＡＧ−３抗体の特徴付け。ＣｏｎＡ刺激した標的細胞を⁵¹Ｃｒで標識し、図示した希釈率でウサギ補体および抗ＬＡＧ−３（実線）または免疫前（点線）血清と混合した。細胞傷害活性（％）は以下のように計算される：（アッセイのＣＰＭ−自発的ＣＰＭ放出）／細胞溶解後に得られる最大放出ＣＰＭ。

【図3】抗ＬＡＧ−３抗体のインビトロ欠乏活性。脾臓由来のＴ細胞をＣｏｎＡで４８時間活性化させてＬＡＧ−３の発現を引き起こし、ＣＦＳＥで標識した。レシピエントは放射線照射を（４．５Ｇｙ）行った３日後に、１０⁵個の細胞をレシピエントに静脈注射した。注射の２４時間後に、レシピエントを屠殺し、脾臓のＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺コンパートメント中のＣＦＳＥ⁺細胞の存在をフローサイトメトリーで測定した。

【図4】抗ＬＡＧ−３抗体投与後の心臓移植片の生存率。Ｌｅｗ．１Ａ 完全に同種（クラスＩおよびＩＩミスマッチ）のレシピエント、Ｌｅｗ．１Ｗ 心臓を、０日目および３日目に２００μｌ（鎖線）もしくは６００μｌ（実線）のウサギ抗ＬＡＧ−３血清、または６００μｌの免疫前血清（点線）を注射することにより処理した。移植片の生存率を、心拍を毎日評価することにより求めた。Ｐ＜０．００２、６００μｌウサギ抗ＬＡＧ−３血清対前免疫血清。

【図5】グラフト浸潤性細胞（ＧＩＣ）の分析。ＧＩＣを５日目に対照で処理または抗ＬＡＧ−３抗体で処理したレシピエントの心臓の同種移植片から取り出した。細胞をＬＡＧ−３発現についてフローサイトメトリーで計数し、分析した。白色バー：ＧＩＣの総数。黒色バー：フローサイトメトリーにより測定されたＬＡＧ−３⁺ＧＩＣ（ｐ＜０．０１）。全ＲＮＡをＧＩＣから抽出し、ＨＰＲＴ発現レベルに対するＩＮＦγのメッセンジャーをｑＰＣＲにより計量した（網掛け線バー；ｐ＜０．０５）。

【図6】ＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞および活性化ヒトＴ細胞に対する、Ａ９Ｈ１２の、参照ＬＡＧ−３特異的１７Ｂ４モノクローナル抗体との結合の比較。

【0008】

Ａ）陽イオンキレート剤を含むＶｅｒｓｅｎｅ緩衝液を使用して培養プラスチックからｈＬＡＧ−３をインフェクトしたＣＨＯを分離し、図示した濃度のＡ９Ｈ１２または１７Ｂ４モノクローナル抗体と４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、次にＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（５μｇ／ｍｌ、Ｃｏｕｌｔｅｒ社）と４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用してフローサイトメトリーにより分析し、蛍光強度の測定値を抗体濃度の関数としてプロットした。

【0009】

Ｂ）Ｔ細胞でのＬＡＧ−３発現を誘導するために、健常ボランティアから得たＰＢＭＣをＳＥＢ（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）で２日間刺激した。ＰＢＭＣは上述のように染色した。データは、抗体濃度の関数としてプロットした、ＰＢＭＣ中のＬＡＧ−３⁺細胞の割合×ＬＡＧ−３⁺細胞の蛍光強度の平均として計算した加重割合を表す。

【図7】Ａ９Ｈ１２ ＬＡＧ−３モノクローナル抗体により誘導された補体依存性細胞傷害活性。

【0010】

Ａ）ｈＬＡＧ−３トランスフェクトＣＨＯ細胞と野生型ＣＨＯ細胞を、ＦＩＴＣ共役抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体（１７Ｂ４）で標識し、細胞表面のＬＡＧ−３発現をＦＡＣＳＣａｎｔｏを使用してフローサイトメトリーにより分析した。ヒストグラムプロットは、野生型ＣＨＯ（灰色）およびＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ（黒色）の平均蛍光強度を表わす。

【0011】

Ｂ）ｈＬＡＧ−３トランスフェクトＣＨＯ細胞および野生型ＣＨＯ細胞を、完全培地（
１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補給したＭＥＭ）で洗浄し、０．１μｇ／ｍｌのＡ９Ｈ１２ ＬＡＧ−３モノクローナル抗体またはｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照モノクローナル抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含む完全培地で４℃、３０分間インキュベートした。その後、細胞を、完全培地（補体を含まない、つまり−補体）か、１０％の新鮮な再懸濁したウサギ血清（Ｃｅｒｄａｌａｎｅ社）ＭＥＭ（補体を含む、つまり＋補体）で、インキュベートした。洗浄後、細胞を室温で１５分間７−ＡＡＤ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で染色し、その直後にフローサイトメトリーにより分析し、死細胞に対応する７−ＡＡＤ陽性細胞の割合を決定した。データは、ｈＬＡＧ−３トランスフェクトＣＨＯ細胞および野生型ＣＨＯ細胞の各条件における死細胞の割合を示している（図示）。

【0012】

Ｃ）ＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞を、図示した濃度のＡ９Ｈ１２ ＬＡＧ−３モノクローナ
ル抗体で、４℃、３０分間インキュベートし、次に、２５％のウサギ血清を補給したＭＥＭで３７℃、１時間インキュベートした。洗浄後、細胞を７−ＡＡＤ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。細胞傷害活性比の割合は以下の式に従って計算される。

【0013】

（サンプルの死 − 自発的な死） × １００
（最大の死 − 自発的な死）
サンプルの死は、各条件における７−ＡＡＤ陽性細胞の割合である。自発的な死は、モノクローナル抗体がない場合の７−ＡＡＤ陽性細胞の割合である。最大の死は、１０μｇ／ｍｌモノクローナル抗体を用いた場合の７−ＡＡＤ陽性細胞の割合である。

【0014】

Ｄ）ＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞を、０．１μｇ／ｍｌ Ａ９Ｈ１２、１７Ｂ４または３１
Ｇ１１ ＬＡＧ−３モノクローナル抗体か、またはそれらの対応するアイソタイプ対照（それぞれＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１またはＩｇＭ）かを用いて、４℃で３０分間インキュベートでし、次に、２５％ウサギ血清を補給したＭＥＭで３７℃、１時間インキュベートした。細胞傷害活性比を上述のように、１０μｇ／ｍｌ Ａ９Ｈ１２（左側パネル）および０．１μｇ／ｍｌ Ａ９Ｈ１２（右側パネル）に対応する最大死について決定した。

【0015】

Ｅ）Ｔ細胞にＬＡＧ−３発現を誘導するためにＰＢＭＣをＳＥＢ（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、次に、Ａ９Ｈ１２もしくは３１Ｇ１１ ＬＡＧ−３モノクローナル抗体、またはそれらのアイソタイプ対照の存在下でのＣＤＣアッセイにおける標的細胞としてそれを使用した。蛍光色素と共役したＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５および１７Ｂ４で細胞を染色した後、７−ＡＡＤ陽性細胞の割合を図示したＴ細胞部分母集団について分析した。データは、各集団における（モノクローナル抗体がない場合の自発的な死を差し引いている）の死細胞の割合を示している。

【図8】Ａ９Ｈ１２ ＬＡＧ−３モノクローナル抗体により誘導された抗体依存性細胞性細胞傷害活性 Ａ）エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を、ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で１日間刺激した。標的細胞（ｈＬＡＧ−３トランスフェクトＣＨＯ細胞）をＣＦＳＥ（蛍光性生体染料）で標識し、室温で２０分、１μｇ／ｍｌのＡ９Ｈ１２、ｍＩｇＧ２ａ、１７Ｂ４またはｍＩｇＧ１とインキュベートした。その後、エフェクター細胞および標的細胞を図示したＥ：Ｔ比（Ｅ：Ｔ、エフェクタ：標的）で混合し、３７℃で１６時間インキュベートした。付着していない細胞も付着細胞も、Ｖｅｒｓｅｎｅ試薬を用いて収穫し、７−ＡＡＤで染色し、その直後にフローサイトメトリーにより分析してＣＦＳＥ陽性集団中の７−ＡＡＤ陽性細胞の割合を決定した。データは、死細胞の割合を表し、アイソタイプ対照の存在下での非特異的細胞は差し引いている。

【0016】

Ｂ）ＣＦＳＥ標識した野生型ＣＨＯ細胞またはＬＡＧ−３⁺標的細胞を、図示した濃度
のＡ９Ｈ１２またはｍＩｇＧ２ａとインキュベートし、ＩＬ−２刺激したＰＢＭＣを５０：１のＥ：Ｔ比で加え、３７℃で１６時間インキュベートした。細胞死を上記と同様に分析した。データは、Ａ９Ｈ１２またはそのアイソタイプ一致ＩｇＧ２ａ対照モノクローナル抗体の存在下でのＣＦＳＥ陽性細胞の死細胞の割合を示す。

【図9】関節炎の発生率（ＣＩＡを発症したマウスの割合） 雄ＤＢＡ／１マウス（ｎ＝２２）に、２５０μｇの結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含みウシＩＩ型コラーゲン（２００μｇ）を乳化させたＣＦＡを静脈注射した。

【図10】キメラＩＭＰ７３１治療用抗体の構築。

【図11】ＩＭＰ７３１の軽鎖（パネルＡ）および重鎖（パネルＢ）のための発現プラスミド。

【図12】ＣＨＯ細胞の安定なトランスフェクションのために使用した最終的なバイシス

【図13】ＬＡＧ−３⁺ＣＨＯおよび活性化ヒトＴ細胞に対するＩＭＰ７３１の結合。

【0017】

Ａ）陽イオンキレート剤を含むＶｅｒｓｅｎｅ緩衝液を使用して培養プラスチックからｈＬＡＧ−３をインフェクトしたＣＨＯを分離し、図示した濃度のＩＭＰ７３１抗体またはそのアイソタイプ対照ｈＩｇＧ１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）で４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、次にＦＩＴＣ結合Ｆ（ａｂ）’₂ヤギ抗ヒトＩｇＧ１二次抗体（５μｇ
／ｍｌ、ＳＢＡ社）と４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、フローサイトメトリーにより分析し、蛍光強度の測定値を抗体濃度の関数としてプロットした。

【0018】

Ｂ）Ｔ細胞でのＬＡＧ−３発現を誘導するために、健常ボランティアから得たＰＢＭＣをＳＥＢ（１μｇ／ｍｌ。Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）で２日間刺激した。ＰＢＭＣは上述のように染色した。データは、抗体濃度の関数としてプロットした、ＰＢＭＣ中のＬＡＧ−３⁺細胞の割合×ＬＡＧ−３⁺細胞の蛍光強度の平均として計算した加重割合を表す。

【図14】ＩＭＰ７３１ ＬＡＧ−３モノクローナル抗体により誘導された補体依存性細

【0019】

ｈＬＡＧ−３トランスフェクトＣＨＯ細胞を、１μｇ／ｍｌのＩＭＰ７３１抗体またはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照モノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を含む完全培地（１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補給したＭＥＭ）で４℃、３０分間インキュベートした。その後、細胞を、完全培地（補体を含まない）か、または２５％の新鮮な再懸濁したウサギ血清（Ｃｅｒｄａｌａｎｅ社）ＭＥＭ（補体を含む）で、３７℃、１時間インキュベートした。洗浄後、細胞を室温で１５分間７−ＡＡＤ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で染色し、その直後にフローサイトメトリーにより分析し、死細胞に対応する７−ＡＡＤ陽性細胞の割合を決定した。データは、図示した各条件における死細胞の割合を示している。

【図15】ＩＭＰ７３１により誘導された抗体依存性細胞性細胞傷害活性。 Ａ）エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を、ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で１日間刺激した。標的細胞（ｈＬＡＧ−３トランスフェクトＣＨＯ細胞）をＣＦＳＥ（蛍光性生体染料）で標識し、室温で１０分、１μｇ／ｍｌ ＩＭＰ７３１またはｈＩｇＧ１とインキュベートした。その後、エフェクター細胞および標的細胞を図示したＥ：Ｔ比（Ｅ：Ｔ、エフェクタ：標的）で混合し、３７℃で１６時間インキュベートした。細胞を７−ＡＡＤで染色し、その直後にフローサイトメトリーにより分析してＣＦＳＥ陽性集団中の７−ＡＡＤ陽性細胞の割合を決定した。データは、死細胞の割合を表す。

【0020】

Ｂ）ＣＦＳＥ標識したＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ標的細胞を、図示した濃度のＩＭＰ７３１ま
たはｈＩｇＧ１とインキュベートし、ＩＬ−２刺激したＰＢＭＣを、５０：１のＥ：Ｔ比で加え、３７℃で１６時間インキュベートした。細胞をＣＦＳＥ陽性集団において上記と同様に分析した。細胞傷害活性比の割合は以下の式従って計算される。

【0021】

（サンプルの死 − 自発的な死） × １００
（最大の死 − 自発的な死）
サンプルの死は、各条件における７−ＡＡＤ陽性細胞の割合である。自発的な死は、抗体がない場合の７−ＡＡＤ陽性細胞の割合である。最大の死は、１μｇ ＩＭＰ７３１を用いた場合の７−ＡＡＤ陽性細胞の割合である。

【0022】

Ｃ） エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を、ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で１日間刺激した。標的細胞（ｈＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞またはｈ
ＬＡＧ−３^-ＣＨＯ細胞）をＣＦＳＥ（蛍光性生体染料）で標識し、室温で１０分、１μ
ｇ／ｍｌのＩＭＰ７３１またはｈＩｇＧ１とインキュベートした。その後、エフェクター細胞と標的細胞を図示したＥ：Ｔ比（Ｅ：Ｔ、エフェクタ：標的）で混合し、３７℃で１６時間インキュベートした。細胞を、７−ＡＡＤで染色し、その直後にフローサイトメトリーにより分析してＣＦＳＥ陽性集団中の７−ＡＡＤ陽性細胞の割合を決定した。データは、死細胞の割合を表す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明は、ＬＡＧ−３タンパク質に結合し、ＬＡＧ−３⁺活性化Ｔ細胞の欠乏を引き起
こす分子を提供する。かかる欠乏は、末梢血リンパ球数、組織または器官の変化により測定可能である。

【0024】

本発明は、好ましくは、ヒトＬＡＧ−３タンパク質（ｈＬＡＧ−３は以後ＬＡＧ−３とも称される）関する。好ましい実施形態では、ＬＡＧ−３タンパク質結合分子は、細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体か、またはＬＡＧ−３⁺活性化Ｔ細胞の欠乏を引
き起こすその断片であり、該抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＭ（またはマウスＩｇＧ２ａ）サブクラスのＦｃ断片と、ＬＡＧ−３に結合するＦＡｂ断片とを有し、該抗体は、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）のうちの少なくとも一方を示す。

【0025】

リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３、ＣＤ２２３）はＴ細胞活性化の初期段階に上方制御されている。本発明は、選択されたＬＡＧ−３モノクローナル抗体が低用量（＜０．１μｇ／ｍｌ）でＬＡＧ−３⁺活性化エフェクターＴ細胞の欠乏に有効であるという、
急性心臓の同種移植片拒絶および慢性関節リウマチ（インビボ動物試験）でのおよびインビトロ試験での、ＬＡＧ−３に対する細胞傷害活性抗体の作用の分析に基づいている。

【0026】

完全に血管形成された異所性同種心臓移植が、完全ＭＨＣ不適合障害のラットで行われた（ＬＥＷ．１ＷからＬＥＷ．ＩＡへ）。レシピエントは、ＬＡＧ−３のエキストラループ領域に対する抗体または対照抗体の２つの注射（０日目および３日目）を受けた。移植生存率、組織構造、ｍＲＮＡ転写物およびリンパ球の同種反応性を試験した。

【0027】

末梢リンパ器官ではなく拒絶反応する心臓の同種移植片にＬＡＧ−３ ｍＲＮＡ分子が蓄積することが最初に注目された。抗ＬＡＧ−３抗体の投与は、エフェクター単核細胞によるグラフト浸潤を阻害し、対照抗体で処理したレシピエントの同種移植片の生存率を６日から平均２７日に延長した。

【0028】

ＬＡＧ−３浸潤を発現している細胞が心臓同種移植片を拒絶し、誘発単独治療として細胞傷害活性抗体を用いたＬＡＧ−３のターゲッティングが、Ｔ細胞および単球によるグラ
フト浸潤を低減することにより急性拒絶を遅延させることが判明した。

【0029】

短期間のＣＤ４０Ｌ抗体治療がマウスと霊長類での長期移植片生存を達成し得ることを示す実験は、初めは同時刺激ブロックの効果として解釈された。しかしながら、モンク（Ｍｏｎｋ）ら（２）は、抗ＣＤ４０Ｌ治療の効能の多くが、同時刺激ブロックではなく活性化Ｔ細胞の破壊に由来することを示した。結果は、抗原を受けた潜在的侵攻性Ｔ細胞の選択的なパージングである。

【0030】

コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）は慢性関節リウマチ用のよく説明されている動物モデルである。コラーゲン誘発性関節炎は、異種ＩＩ型コラーゲンでの免疫によるラット、マウスおよび霊長類に誘発可能な自己免疫疾患である。生じる関節の病態は、滑膜増殖、軟骨浸食および最も重度な場合では骨吸収を伴う慢性関節リウマチに類似している（１２）。

【0031】

特定の免疫プロトコルを使用して、初期の研究で、Ｈ−２ハプロタイプに関連するＣＩＡに対する反応性の階層を確立したところ、Ｈ−２^q（例えばＤＢＡ／１マウス）は最も
反応性の高い系統であり、Ｈ−２^b（例えばＣ５７ＢＬ／６マウス）が最も反応しない系
統であった。しかしながら、いくつかの研究によると、ＣＩＡに対する反応性は以前に考えられていた程にはＭＨＣクラスＩＩによっては制限されない可能性があり、免疫条件によるのと同じ程度である可能性があることが示された（１３）。異なる種由来の種々のＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）と、種々の濃度のヒト結核菌を含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）準備は、関節炎発達の重要なパラメータであった。イングリス（Ｉｎｇｌｉｓ）らは、ウシではなくニワトリのＣＩＩがＣ５７ＢＬ／６マウスで疾患を誘発できると共に、発生率が５０％から７５％であることを証明した。これは、ウシ、マウスおよびニワトリのＣＩＩのすべてが疾患を誘発し、発生率が８０％から１００％であるＤＢＡ／１マウスとは対照的である。関節炎の発現型は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスではＤＢＡ／１マウスより穏やかであり、膨潤が少なく臨床スコアが徐々に増大した（１４）。さらに、関節炎の発生率が雌マウスより雄マウスの方が幾分高いので、ＣＩＡ研究には雄マウスが好まれることが多い。

【0032】

マウスではＣＩＡは、ＣＦＡの存在下でＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）を皮内注射し、通常その２１日後にアジュバントなしのＣＩＩのブースト注射を行うことにより誘発される。しかしながら、免疫法のほとんどすべての態様で変動があることが報告されており、最も感受性の高いＤＢＡ／１マウスでも、ＣＩＡの発症時間、重症度、および発生率が変動し得る（１３，１５）。

【0033】

自動免疫疾患の治療のための治療用抗体は、慢性関節リウマチにおけるＴＮＦαモノクローナル抗体のように、既に説明されている。「ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子−３）」の定義は、最近活性化されたエフェクターＴ細胞のためのマーカーである。これらのエフェクターＬＡＧ−３⁺Ｔ細胞が欠乏すると、免疫抑制が標的化（つまり、コルチコイ
ドまたはサイクロスポリンと同様に、すべてのＴ細胞ではなく、活性化Ｔ細胞のみが抑制される。）されるだろう。この非常に特異的な免疫抑制は、古典的な免疫抑制物質や、ＴＮＦαをブロックする治療用抗体（例えばヒュミラ、レミケード）または可溶性受容体（例えばエンブレル）に比べると、より高い治療誘発につながるに違いない。したがって、ＬＡＧ−３は、自動反応性活性化エフェクターＴ細胞を除外するための治療用欠乏性モノクローナル抗体アプローチに利用可能な、有望なターゲットである。

【0034】

ＬＡＧ−３タンパク質に結合し、ＬＡＧ−３⁺活性化Ｔ細胞欠乏を引き起こす分子は、
本発明によれば、抗体（モノクローナルとポリクローナルのいずれでもよいが好ましくはモノクローナル）およびその断片、ペプチドおよび有機小分子を包含する。

【0035】

本発明の細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体またはその断片は、ＬＡＧ−３⁺活性化Ｔ細胞の３０％よりも多く、好ましくは５０％よりも多くの欠乏を引き起こす。
本発明の細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体またはその断片は、強いＣＤＣまたはＡＤＣＣ特性を与えるマウスＩｇＧ２ａまたはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を備えた抗体を含む。

【0036】

本発明の細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体またはその断片は、
（ｉ）０．１μｇ／ｍｌ未満のモノクローナル抗体濃度で最大ＣＤＣ活性の５０％を超える活性、または
（ｉｉ）０．１μｇ／ｍｌ未満のモノクローナル抗体濃度で最大ＡＤＣＣ活性の５０％を超える活性
のうちの少なくとも一方を示す。

【0037】

ＬＡＧ−３タンパク質結合分子、より詳細にはＬＡＧ−３⁺活性化Ｔ細胞および抗体の
欠乏を引き起こす細胞毒素抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により生産することができる。

【0038】

ＣＤ２２３ポリペプチドに対して作製される抗体は、ＣＤ２２３ポリペプチドを、動物へ、好ましくは非ヒトへ、投与、特には直接注射することにより得ることができる。このように、ＣＤ２２３ポリペプチドの断片のみをコードする配列も、未変性ＣＤ２２３ポリペプチド全体に結合する抗体を作製するために使用することができる。

【0039】

モノクローナル抗体の準備については、連続細胞株培養により作製された抗体を与える技術であればいかなるものを使用してもよい。実施例はハイブリドーマ法（９）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（１０）を包含する。

【0040】

一本鎖抗体の作製について説明した技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を容易に使用して、ＣＤ２２３ポリペプチドに対する一本鎖抗体を生産することができる。また、遺伝子組換えマウスを使用して、免疫原ＣＤ２２３ポリペプチドに対するヒト化抗体を発現させてもよい。

【0041】

Ａ９Ｈ１２と称される本発明の第１のモノクローナル抗体は、アクセス数ＣＮＣＭ １−３７５５の下でＣＮＣＭで置かれたハイブリドーマによって生産される。
３１Ｇ１１と称される本発明の第２のモノクローナル抗体は、アクセス番号ＣＮＣＭ１−３７５６の下ＣＮＣＭに２００７年４月２７日に寄託されたハイブリドーマによって生産される。

【0042】

本発明は、臓器移植拒絶を治療もしくは予防するかまたは自己免疫疾患を治療するための、医薬の製造のための細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体またはその断片の使用方法をもその対象とする。

【0043】

本発明は、臓器移植拒絶を治療もしくは予防するか、または自己免疫疾患を治療するための方法をさらに提供する。かかる方法は、哺乳動物対象に、治療上有効量の細胞傷害活性抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体またはその断片を投与することを含む。

【0044】

臓器移植拒絶は、同種宿主における臓器の移植のことを指す。臓器移植は、異常に多いＴ細胞集団または有害なＴ細胞活性を生じさせる状態に罹患している生物の治療に有効であり得る。異常に多いＴ細胞集団または有害なＴ細胞活性を生じさせる状態とは、宿主Ｔ細胞により媒介されるグラフト拒絶、グラフト対宿主疾患、および慢性関節、Ｉ型糖尿病
、筋肉硬化症等のＴ細胞媒介性自己免疫疾患および炎症性疾患が挙げられる。本発明の方法は、ＣＤ２２３を発現するＴ細胞を含むすべての生物に適用可能であり、これには任意の動物、特にはヒトよびマウスが含まれるが、それらに限定されない。

【0045】

自己免疫疾患は、対象自身の免疫系が対象の細胞に反して反応する疾患である。本発明による治療を受け得る自己免疫疾患には、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性血小板減少紫斑病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、急性リウマチ熱、本態性混合型クリオグロブリン血症、全身性紅斑性狼、インスリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、グレーヴス病、ハシモト甲状腺炎、重症筋無力症および多発性硬化症が含まれる。

【0046】

本発明の患者から得たサンプルからＬＡＧ−３⁺活性化Ｔ細胞を欠乏させる方法は、サ
ンプルを、上述の抗体を含む抗体組成物と反応させることからなる。
本発明の医薬組成物は、単一用量で３０〜３００ｍｇの上述の細胞傷害活性モノクローナル抗体と、哺乳動物への投与用の１または複数の医薬として許容される担体および／または希釈剤とを含む。本発明の医薬組成物は、固体か液体の形式で投与用に特に調剤されてもよい。

【0047】

実施例１；細胞傷害活性抗体により標的とされるＬＡＧ−３陽性細胞
材料および方法
動物と移植
ＭＨＣ領域全体がそれぞれ異なる、８−１２週例の雄Ｌｅｗｉｓ．１Ｗ（ＬＥＷ．１Ｗ（ハプロタイプＲＴ１^U））およびＬｅｗｉｓ．１Ａ（ＬＥＷ．１Ａ（ハプロタイプＲＴ
１^a））の同属ラット（Ｃｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｌｅｖａｇｅ Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｌｅ Ｇ
ｅｎｅｓｔ−Ｉｓｌｅ、フランス）。ＬＥＷ．１Ｗの異所的心臓移植を、以前に記述されている（１１）ように行った。移植生存率を腹壁を介した触診により評価した。

【0048】

抗ＬＡＧ−３抗体
ラットＬＡＧ−３タンパク質のエキストラループ領域に対応する合成ペプチド（ＮＣＢＩアクセッション番号 ＤＱ４３８９３７；ペプチドＤＱＰＡＳＩＰＡＬＤＬＬＱＧＭＰＳＴＲＲＨＰＰＨＲ）をオボアルブミンに結合し、２羽のウサギの免疫に使用した。免疫前血清と、４回目の免疫後６３日目に採取した免疫血清とを、免疫原およびペプチドに対するＥＬＩＳＡにより、およびＣｏｎ−Ａ活性化ラット脾臓細胞に対するフローサイトメトリーにより分析した。

【0049】

免疫前血清はいずれの分析でも陰性であった。プールした免疫血清は、ＥＬＩＳＡで１／６００００の力価（５０％シグナルに稀釈）およびＦＡＣＳで１／１０００の力価を示し、活性化Ｔ細胞に対する特異性を示した。

【0050】

補体依存性細胞傷害活性分析
補体媒介性の抗体依存性細胞傷害活性を、Ｌｅｗｉｓ １ＡラットＴ細胞に対するウサギ血清を使用して⁵¹Ｃｒ放出アッセイで試験した。合計２×１０⁶のＬｅｗｉｓ １Ａ
Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ）溶液中で、３０μＣｉの⁵¹Ｃｒで３７℃、９０分標識した。３回洗浄した後、Ｔ細胞を９６ Ｖ字底プレートに分配し、ウサギ補体および熱で不活性化させたウサギ血清の系列希釈とインキュベートした。３７℃で４時間後、シンチレーション計数器を使用して、⁵¹Ｃｒの放出を上澄みで測定した。細胞傷害活性比を以下の式に従って計算した：
（実験による放出 − 自発的放出） ×１００／（最大放出 − 自発的放出）。

【0051】

インビボの抗体誘発性細胞傷害活性
ＬＡＧ−３⁺細胞に対する抗ＬＡＧ−３抗体の細胞傷害活性を、インビボで評価した。
ＣｏｎＡ活性化（４８時間）ＬＥＷ．１Ｗ脾細胞をＣＦＳＥで標識し、抗ＬＡＧ−３抗体と共に、放射線照射した（４．５Ｇｙ、−３日）ＬＥＷ．１Ａレシピエントへ移した（１０⁸細胞）。１日目に、レシピエントを屠殺し、リンパ器官中および血液中のＣＦＳＥ陽
性細胞の存在をフローサイトメトリーにより評価した。

【0052】

免疫染色
移植片サンプルを、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ（ＯＣＴ化合物、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、アメリカ合衆国カリフォルニア）に埋設し、液体窒素で瞬間凍結し、５μｍ切片に切断し、アセトンで固定した。Ｄａｋｏビオチンブロックシステム（Ｄａｋｏ、Ｔｒａｐｐｅｓ、フランス）を使用して内因性ビオチン活性をブロックした。その後、切片を３段階の間接的免疫ペルオキシダーゼ顕色により標識した。各免疫ペルオキシダーゼ標識組織切片の細胞浸潤領域を、定量的形態測定分析により決定した。

【0053】

各スライド上の陽性染色細胞を、顕微鏡のアイピース中に１２１に分けられた正方形グリッドの点算法分析（１４）を使用した形態測定分析により計数した。簡単に説明すると、特定の抗原特異性（領域浸潤）を有する細胞が占める各移植切片の領域の割合を、以下のように計算した：
［グリッドの目の下にある陽性細胞の数／（グリッドの目の合計数＝１２１）×１００］。

【0054】

移植切片を４００倍で調べた。この技術の精度は、数えた点の数に比例する。したがって、＜１０％の標準誤差を維持するために、各標識切片当たり１５個のフィールドを数えた。結果は、（ＯＸ１、ＯＸ３０標識で決定される）白血球により浸潤された組織切片の免責の割合として現され、該浸潤の発現型組成と、その部分母集団とは、白血球総数の割合に関し、白血球の割合として表される。

【0055】

移植浸潤細胞抽出染色
破断した心臓を、３７℃で１０分、コラゲナーゼＤ（２ｍｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化した。その後、細胞をステンレス鋼メッシュに通過させて抽出により収集した。得られた懸濁液をフィコール分離により清澄化した。

【0056】

定量的ＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイム定量的ＰＣＲを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ所在）を用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｅｎＡｍｐ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで行った。本研究には以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
ラットＬＡＧ−３：
上流プライマー ５’−ＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＧＧＣＡＧ−３’
下流プライマー ５’−ＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＡＧＡＧＣＴＧＣＣＴ−３’
ラットＩＮＦ−ｇ：
上流プライマー ５’−ＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡ−３’
下流プライマー ５’−ＧＡＴＴＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧ−３’
ラットＨＰＲＴ：
上流プライマー ５’−ＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣ−３’
下流プライマー ５’−ＴＴＣＧＣＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＡＣＡＴＧＡ−３’。

【0057】

１００ｎｇの全ＲＮＡの逆転写に対応する一定量のｃＤＮＡを、２５μｌのＰＣＲ混合
物（３００ｎＭの各プライマー；２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ；４００μＭ ｄＵＴＰ；３ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．２５Ｕ ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ
；０．６２５ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ）に入れて増幅した。混合物は４０サイクル増幅させた。リアルタイムＰＣＲのデータを、ΔＲ_n蛍光シグナル
対サイクル数としてプロットした。ΔＲ_n値は、以下の式を使用してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００配列検出ソフトウェアにより計算した：ΔＲ_n＝（Ｒ_n ⁺）−（Ｒ_n⁻）、式中、Ｒ_n ⁺は所定時間の生成物の蛍光シグナルであり、Ｒ_n⁻はサイクル
３−１３の間の平均蛍光シグナルで、ベースラインと呼ばれる。Ｃ_t値はΔＲ_nが閾値を超えたときのサイクル数として定義される。閾値は、陽性反応の増幅曲線の指数関数部分と交差するようバックグラウンド蛍光を超えるよう設定される。Ｃ_tはＰＣＲ内のテンプレ
ートのｌｏｇ量に反比例する。

【0058】

統計分析
統計学的有意差を、２群比較のためのａａ Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙアッセイを使用して評価した。移植片の生存率はｌｏｇ ｒａｎｋアッセイを用いたＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析により評価した。

【0059】

結果
拒絶された同種移植片およびリンパ器官でのＬＡＧ−３ ｍＲＮＡの発現
ＬＡＧ−３は、炎症を起こしたリンパ器官および組織中の活性化Ｔ細胞により発現される（７）。ＬＡＧ−３が拒絶された同種移植片でも発現されているかどうかを確認するために、ＬＥＷ．１ＷからＬＥＷ ＩＷ．１Ａラットレシピエントへの心臓移植片を５日目（６日目に拒絶が生じている）に分析した。ＬＡＧ−３の伝令ＲＮＡを分析し、寛容誘導剤（抗ＣＤ２８抗体＋ＣＳＡ、文献（１６）に記載）を受けた同種移植片（アログラフト）および同系移植片（アイソグラフト）と比較した。拒絶された同種移植片は、寛容移植片および同系移植片と比較してそれぞれ７倍および２５倍のＬＡＧ−３ ｍＲＮＡ蓄積を示した（図１Ａ）。このような蓄積は、拒絶レシピエントのリンパ節（図１Ｂ）または脾臓（図１Ｃ）では検知されなかった。

【0060】

抗ＬＡＧ−３抗体の作用機序
抗ＬＡＧ−３抗体を、クラスＩＩとのＬＡＧ−３の相互作用に関連する（ＰＮＡＳ Ｈｕａｒｄ １９９７を参照）ＬＡＧ−３ Ｉｇ様 Ｎ末端領域のエキストラループ由来の合成ペプチドで免疫することにより、ウサギで生産した。免疫後血清は、ＩｇＧ分画と同様に、ラット脾臓細胞の１％未満を染色し、４０％のラット脾臓細胞をＣｏｎＡ、ＰＭＡ＋イオノマイシン、またはＰＨＡで４８時間活性化させた。免疫前血清は陰性であった（データは図示しない）。ＬＡＧ−３⁺細胞に対する抗ＬＡＧ−３抗体の作用を特徴付ける
ために、補体およびＡＤＣＣ依存性細胞傷害活性をインビトロで分析した。１５％のＣｏｎＡ活性化脾臓細胞が補体依存性細胞傷害活性分析で溶解された（図２）。ＣｏｎＡ活性化標的細胞の４０％しかＬＡＧ−３を発現していないことを考えると、この分析により、調製物中のＬＡＧ−３⁺脾臓細胞の約３７％が補体活性化の結果、インビトロで溶解され
たことが明らかとなった。

【0061】

インビボで、抗ＬＡＧ−３抗体の欠乏活性を、放射線照射されたラットレシピエントに適合移植されたＣＦＳＥ標識活性化Ｔ細胞の運命の測定により評価した。治療用量の抗ＬＡＧ−３免疫血清を注射した１日後には、免疫前血漿の同様な注射と比べて、ＣＦＳＥ⁺
／ＣＤ４⁺およびＣＦＳＥ⁺／ＣＤ８⁺細胞の半分量しか脾臓から回収することができなか
った（図３）。

【0062】

抗ＬＡＧ−３抗体は心臓同種移植の拒絶反応を遅延させる
予備的薬物動態学的観察から、発明者らは０日目と３日目に６００μｌの抗ＬＡＧ−３
ウサギ血清を２回静脈注射したところ、少なくとも２週間、レシピエントの血清中で抗ＬＡＧ−３の結合活性が維持された。この処理は、心臓の同種移植の拒絶反応を、未処理レシピエントおよび対照処理レシピエントの６日から、平均２７日へと遅延させた。しかしながら、レシピエントはすべて、最終的には１０週以内に移植片を拒絶した（図４）。５日目に、対照処理レシピエントの移植片は活性化Ｔ細胞により重度に浸潤されていたが、この浸潤は抗ＬＡＧ−３処理レシピエントではそれほど重要ではなかった。しかしながら、ＣＤ２５⁺細胞およびＮＫ細胞による浸潤はこの処理によっては変化しなかった。発明
者らの抗ＬＡＧ−３抗体は免疫組織化学ではＬＡＧ−３を認識しないため、移植浸潤細胞（ＧＩＣ）によるＬＡＧ−３発現を、摘出後にフローサイトメトリーにより分析した。対照拒絶移植片から平均８．５ １０⁶±０．７６個のＧＩＣを回収できた。抗ＬＡＧ−３
処理レシピエントの心臓同種移植からは、３．１６±０．４４ １０⁶ ＧＩＣしか回収
できなかった（ｎ＝３、ｐ＜０．００５）。ＧＩＣは、対照では４１．１７±１％のＬＡＧ−３⁺細胞（すなわち３．５ １０⁶細胞）を含むのに対し、処理動物では２２．２±０．９％のＬＡＧ−３⁺細胞（つまり０．７ １０⁶細胞、ｎ＝３、ｐ＜０．０００５、図５）しか含んでいなかった。ｍＲＮＡ転写物の分析により、発明者らは処理移植片では４倍より少ないＩＮＦγ ｍＲＮＡ分子を測定したため、単核細胞により心臓移植片の浸潤が減少されるという上記知見が補強された。

【0063】

抗ＬＡＧ−３抗体は進行中の急性心臓同種移植片の遅延拒絶を阻害する
進行中の急性同種移植拒絶の治療剤として機能するか否かを調べるために、発明者らはＬＥＷ．１Ｗの心臓を、治療せずに３日または４日間維持しておいたＬＥＷ．１Ａ同種レシピエントに移植した。その時、レシピエントは、６００ｍｌの対照または抗ＬＡＧ−３ウサギ血清の注射を受けた。対照処理レシピエントは５日目に同種移植片を拒絶したが、抗ＬＡＧ−３抗体処理レシピエントは１１日目になって拒絶した（表１）。

【0064】

【表1】

【0065】

実施例２；新しい高親和性ｈＬＡＧ−３モノクローナル抗体の作製
材料および方法
マウスを、ｈＬＡＧ−３トランスフェクトＣＨＯ細胞（１０⁷個の細胞、復腔内注射）
で３回免疫し、１０μｇ ＩＭＰ３２１（臨床グレードのｈＬＡＧ−３Ｉｇ組換えタンパ
ク質）でブースト静脈注射した。ブーストの３日後、脾臓細胞をＸ６３．ＡＧ８６５３融合パートナーと融合し、ハイブリドーマ細胞を産出した。ハイブリドーマからの上澄みを、ｈＬＡＧ−３トランスフェクトＣＨＯ対野生型ＣＨＯ細胞に対するその特異的結合についてスクリーニングした（ＦＡＣＳ分析）。

【0066】

１つのマウスＩｇＧ２ａ抗体（５８０．１Ｅ９Ｈ３Ａ９Ｈ１２、Ａ９Ｈ１２と称される）を選択し、サブクローニングして安定した細胞株を産出し、さらにはマウスＩｇＧ２ａ
Ｆｃ領域が異種細胞（つまりＣＨＯ細胞またはヒトＰＢＭＣ）でもＣＤＣ（補体依存性細胞傷害活性）およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害活性）という活性を伝達するのにマウスでは最も効率的であることが公知であることに鑑みてＣＤＣおよびＡＤＣＣを介してＬＡＧ−３⁺細胞を欠乏させるその能力を特徴付けた。

【0067】

結果
最初に、Ａ９Ｈ１２の用量依存的結合を、ｈＬＡＧ−３トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する、およびＬＡＧ−３⁺インビトロ １７Ｂ４活性化ヒトＴ細胞に対する参照ＬＡＧ
−３特異的１７Ｂ４モノクローナル抗体と比較した（図６）。Ａ９Ｈ１２は、いずれの細胞型に対する参照１７Ｂ４モノクローナル抗体よりも大きな結合を示した。例えば、活性化ヒトＴ細胞へのＡ９Ｈ１２の有意な結合が、０．０１μｇ／ｍｌという低い濃度で観察された。

【0068】

ＣＤＣ試験については、この分析で使用した標的細胞はＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞であり
、これを野生型ＣＨＯ細胞と比較した（図７Ａ）。いずれのタイプの細胞も、Ａ９Ｈ１２、そのマウスアイソタイプ一致ＩｇＧ２ａ陰性対照モノクローナル抗体、３１Ｇ１１、そのマウスアイソタイプ一致ＩｇＭ陰性対照、または参照１７Ｂ４（ＩｇＧ１）モノクローナル抗体と、活性補体を含むウサギ血清と、３７℃、１時間インキュベートした。次に、細胞生存率を、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）（死後に急速に現われる現象である膜質の完全性を失った細胞を標識する蛍光染料）を使用して評価した。７−ＡＡＤ陽性のＣＨＯ細胞（つまり死んでいる標的細胞）の割合を、フローサイトメトリー分析により決定した。Ａ９Ｈ１２は、このＣＤＣ分析で強力かつ特異的な細胞傷害活性を示し、補体の存在下ではＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞のみを殺した（図７Ｂ）。低濃度の抗体でＣ
ＤＣを活性化する抗体の効力を決定するために、抗ＬＡＧ−３抗体の力価を測定した。Ａ９Ｈ１２は０．０１μｇ／ｍｌという低い濃度で効率的にＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞の死を
誘発した（図７Ｃ）。ＩｇＧ１ １７Ｂ４抗体もこの分析で試験したが、効果がなく（図７Ｄ、左側のパネル）、すべてのＬＡＧ−３モノクローナル抗体がこのバイオアッセイで細胞傷害活性を引き起こすとは限らない可能性を示した。Ａ９Ｈ１２に関して観察されるように、２番目の３１Ｇ１１ ＬＡＧ−３特異的モノクローナル抗体も、ＬＡＧ−３⁺Ｃ
ＨＯ細胞の死を誘発した（図７Ｄ、右側のパネル）。

【0069】

ＣＤＣバイオアッセイを、スーパー抗原ＳＥＢで刺激したＰＢＭＣでも行なった。Ａ９Ｈ１２および３１Ｇ１１の細胞傷害活性を、活性化した（すなわちＣＤ２５⁺／ＬＡＧ−
３⁺細胞）および活性化しない（すなわちＣＤ２５^-／ＬＡＧ−３^-細胞）ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８⁺細胞傷害活性Ｔ細胞の両方について分析した。活性化ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞のみが、Ａ９Ｈ１２および３１Ｇ１１により特異的に死滅されたが（図７
Ｅ）、これは活性化ヒトＴ細胞が補体存在下でのＡ９Ｈ１２または３１Ｇ１１特異的死滅を受けることを示している。

【0070】

ＡＤＣＣ試験については、ＰＭＢＣをエフェクター細胞として機能するようＩＬ−２で１日間刺激し、ＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞を標的細胞として機能するよう生体染料ＣＦＳＥ
で標識した。Ａ９Ｈ１２の存在下で、ＰＢＭＣはＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞の有意な割合を
死滅させることができ、この作用はエフェクター細胞数と共に増大した（図８Ａ）。１７
Ｂ４が存在すると、Ｅ：Ｔ比が高くても低い割合の標的細胞しか死滅しなかったが（図８Ａ）、これはすべてのＬＡＧ−３モノクローナル抗体がこのバイオアッセイで細胞傷害活性を引き起こすとは限らない可能性を示している。低濃度の抗体でＡＤＣＣを誘導する抗体の効力を決定するために、Ａ９Ｈ１２ ＬＡＧ−３モノクローナル抗体の力価を測定した。Ａ９Ｈ１２は、０．０１μｇ／ｍｌという低い濃度で効率的にＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細
胞死を誘発した（図８Ｂ）。

【0071】

実施例３；コラーゲン誘発性関節炎マウスモデルにおける欠乏性ＬＡＧ−３抗体の試験
材料および方法
動物と材料
８−１０週齢の雄ＤＢＡ／１（Ｈ−２^q）マウスをＪａｎｖｉｅｒ研究所から得た。動
物実験は当局のガイドラインに従って行なった。ウシＣＩＩ（関節軟骨）をＢｉｏＣｏｌから購入した。不完全フロイントアジュバントはシグマから提供されたものである。加熱殺菌した結核菌Ｈ３７ＲａをＤｉｆｃｏ研究所から購入した。

【0072】

コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）の誘発
２つの刊行物（１３，１５）に以前に記載されている通りに、ＣＩＡの誘発および評価を行なった。完全フロイントアジュバントを、１３．３ｍｌ ＩＦＡに１００ｍｇの加熱殺菌結核菌（最終濃度７．５ｍｇ／ｍｌ）を混合することにより調製した。ウシＣＩＩを、１０ｍＭ酢酸中に３ｍｇ／ｍｌとなるように４℃で一晩溶解させた。２体積のＣＩＩを１体積のＣＦＡと混合することにより、エマルジョンを形成した。ＣＩＩ溶液と、ＣＦＡのエマルジョンは、常に新しく調製した。雄ＤＢＡ／１マウスに、２００μｇのＣＩＩと２５０μｇの結核菌を含む合計１００μｌのエマルジョンを、尾の基部に１日目（Ｄ１）に皮内注射した。係る注射を２１日目（Ｄ２１）に繰り返した。対照として、３匹のマウスにＣＩＩを含まないＣＦＡのエマルジョンを注射した。

【0073】

関節炎マウスの臨床評価
２２日目から、一週間に３回、関節炎の徴候についてマウスを試験した。疾患の重度を各肢について以下のスコアシステムで決定した：
スコア０＝正常、
スコア１＝足蹠または関節の腫れ、
スコア２＝足蹠の腫れと、１または２箇所の関節の腫れ
スコア３＝足蹠の腫れと、３または４箇所の関節の腫れ
スコア４＝足蹠の腫れと、すべての関節の腫れ。

【0074】

各足を類別し、一つのマウス当たりの考えられる最大スコアが１６になるように、４つのスコアを合計した。発生率を、関節炎スコアが１以上であるマウスの割合として表した。

【0075】

結果
ＣＩＡが、２５０μｇの結核菌を含むＣＦＡで乳化されたウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）の皮内注射により引き起こされた。１回の注射後、２２匹のマウスのうち４匹のマウスが２１日目に関節炎になった。２回目の注射の２週間後、３５日目には、８０−９０％のマウスが関節炎の臨床症状を呈した（図９）。マウスは、１から１６までの全範囲の応答を包含する臨床スコアを示し、いくつかの肢では足蹠、足首／手首の関節ならびに指が重度に腫れていた（表２）対照動物（ＣＩＩを含まないＣＦＡを注射）はいずれも関節炎の症状を呈しなかった（データは示さない）。

【0076】

【表2】

【0077】

発明者らの結果は、ＣＩＡプロトコルを使用すると、関節炎の症状を呈するマウスを高い割合（８０−９０％）で得ることが可能であることを示している。この実験プロトコルは、自動免疫疾患における欠乏作用を有する欠乏性ＬＡＧ−３抗体（マウスＬＡＧ−３に特異的）の治療効果を評価するためのモデルを提供する。

【0078】

２００μｇの欠乏性ＬＡＧ−３モノクローナル抗体（Ａ９Ｈ１２または３１Ｇ１１）を１５日目および２５日目に腹腔内または静脈注射する。関節炎発生率の有意な減少および平均臨床スコアの有意な低下のいずれにも関与する。

【0079】

実施例４：ＩＭＰ７３１により引き起こされる補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）
材料および方法
欠乏特性を有する新規なマウスモノクローナル抗体Ａ９Ｈ１２は、ヒヒおよびマカクザルのＬＡＧ−３⁺細胞をも高い親和力で認識することが示されており、発明者らのリード
治療用モノクローナル抗体として選択した（Ｉｍｍｕ．Ｔｕ．ｎｅ ＩＭＰ７３１）。

【0080】

Ａ９Ｈ１２を、標準遺伝工学技術およびＰＣＲプロトコルを使用して、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域とキメラ化し、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害活性）およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害活性）特性を与えた。

【0081】

Ａ９Ｈ１２ハイブリドーマ細胞ｍＲＮＡに由来するＡ９Ｈ１２ ＶＨ配列およびＶＬ ｃＤＮＡ配列を、ヒトＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧ１領域およびＣκ鎖の上流でそれぞれ融合した。

【0082】

２つの軽いおよび重いＩＭＰ７３１キメラ鎖を、別々の発現プラスミドに入れて独立してＰＧＫ（または別の構築物ではＳＲａｌｐｈａ、図示せず）の制御下でクローニングした（それぞれ図１１のパネルＡおよびＢ）。これらの２つのプラスミドを共にＣＨＯ細胞へ同時トランスフェクト（一過性トランスフェクション）し、２日目または３日目に培養液上澄みからプロテインＡカラムアフィニティ捕捉および溶出（ｐＨ３）を使用してＩＭ
Ｐ７３１を精製した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和後、精製したＩＭＰ７３１抗体を、そのＬＡＧ−３⁺標的細胞を死滅させる能力について、ＣＤＣおよびＡＤＣＣ実験で試験した。

【0083】

次に、２つのＩＭＰ７３１の軽鎖および重鎖を、同じ組み込み部位（図１２）の２つのＩＭＰ７３１鎖が統合発現されるよう頭から尾への状態でＰＧＫ（またはＳＲａｌｐｈａ、図示せず）プロモータを用いて共にクローニングした。このバイシストロンＩＭＰ７３１発現プラスミドを使用したのは、無血清培地中で増大する濃度のヒグロマイシンを使用して、安定したトランスフェクションと高い生産性（例えば１日当たり、１００万個のＣＨＯ−Ｓ細胞当たり、２０ピコグラムのＩＭＰ７３１タンパク質）のＣＨＯ−Ｓ細胞を得るためである。

【0084】

結果
最初に、ＩＭＰ７３１の用量依存的結合を、ｈＬＡＧ−３トランスフェクトＣＨＯ細胞（図１３Ａ）に対して、およびＬＡＧ−３⁺インビトロ活性化ヒトＴ細胞（図１３Ｂ）に
対して評価した。ＩＭＰ７３１は、活性化Ｔ細胞の対して０．０１μｇ／ｍｌという低濃度でいずれの細胞のタイプに対しても有意な結合を示した。

【0085】

補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）試験については、この分析で使用した標的細胞はＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞であった（図１４）。細胞を、ＩＭＰ７３１またはそのヒトアイソ
タイプ一致ＩｇＧ１陰性対照のいずれかとインキュベートし、次に、活性補体を含むウサギ血清と３７℃、１時間インキュベートした。次に、細胞生存率を、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を使用して評価した。７−ＡＡＤは、死後に急速に現われる現象である膜質の完全性を失った細胞を標識する蛍光染料である。７−ＡＡＤ陽性のＣＨＯ細胞（つまり死んでいる標的細胞）の割合を、フローサイトメトリー分析により決定した。ＩＭＰ７３１は、このＣＤＣ分析で強力かつ特異的な細胞傷害活性を示し、補体の存在下ではＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞のみを殺した（図１４）。

【0086】

抗体依存性細胞性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）試験については、ＰＭＢＣをエフェクター細胞として機能するようＩＬ−２で１日間刺激し、ＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞を標的細胞と
して機能するよう生体染料ＣＦＳＥで標識した。ＩＭＰ７３１の存在下で、ＰＢＭＣはＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞の有意な割合を死滅させることができた（図１５Ａ）。低濃度の抗
体でＡＤＣＣを誘導する抗体の効力を決定するために、ＩＭＰ７３１ ＬＡＧ−３モノクローナル抗体の力価を測定した。ＩＭＰ７３１は、０．０１μｇ／ｍｌという低い濃度で効率的にＬＡＧ−３⁺ＣＨＯ細胞の死を誘発した（図１５Ｂ）。この分析ではＩＭＰ７３
１の添加によりＬＡＧ−３⁺細胞は死滅したがＬＡＧ−３^-細胞は死滅しなかった（図１５Ｃ）。

【0087】

ＩＭＰ３７１の結合活性および機能的活性は、ハイブリドーマ細胞により生産された親であるＡ９Ｈ１２マウスモノクローナル抗体に類似しているようであった。
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図10】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]