特許 5937114 標的を刺激すると考えられる分子の濃度プロファイルを制御するためのマイクロ流体システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5937114

(24)【登録日】2016年5月20日

(45)【発行日】2016年6月22日

(54)【発明の名称】標的を刺激すると考えられる分子の濃度プロファイルを制御するためのマイクロ流体システム

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20160609BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20160609BHJP

   G01N 35/08 20060101ALI20160609BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20160609BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/34 A

   G01N37/00 101

   G01N35/08 A

   C12M1/00 A

【請求項の数】16

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2013-557199(P2013-557199)

(86)(22)【出願日】2012年3月2日

(65)【公表番号】特表2014-508529(P2014-508529A)

(43)【公表日】2014年4月10日

(86)【国際出願番号】IB2012051001

(87)【国際公開番号】WO2012120424

(87)【国際公開日】20120913

【審査請求日】2015年2月4日

(31)【優先権主張番号】1100660

(32)【優先日】2011年3月4日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】512190608

【氏名又は名称】セントレ ナショナル デ ラ ルシェルシェ サイエンティフィック−シーエヌアールエス

(73)【特許権者】

【識別番号】512073725

【氏名又は名称】エコール ノルマル シュペリウール

(73)【特許権者】

【識別番号】504317743

【氏名又は名称】ユニベルシテ ピエール エ マリー キュリー（パリ シズエム）

(73)【特許権者】

【識別番号】503127873

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ボルドー セガラン

(73)【特許権者】

【識別番号】513266630

【氏名又は名称】フォンズ デ レスプシ−ジョージズ チャーパク

(74)【代理人】

【識別番号】100105924

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 賢樹

(72)【発明者】

【氏名】ダハン、マキシム

(72)【発明者】

【氏名】モレル、マシュー

(72)【発明者】

【氏名】ガラス、ジャン−クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】スチュダー、ヴィンセント

(72)【発明者】

【氏名】バートロ、デニス

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−１４７３８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０２４５１０２（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／００

Ｇ０１Ｎ １／００−４４

Ｇ０１Ｎ ３５／００−１０

Ｇ０１Ｎ ３７／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的を刺激すると考えられる分子の濃度プロファイルを制御するためのマイクロ流体システムであって、前記システムは、
少なくとも１つのマイクロ流体チャネル（４、４０）を備えるマイクロ流体装置（１、１００）を備え、前記少なくとも１つのマイクロ流体チャネル（４、４０）は少なくとも、
第１の流体（Ｆ_１）のための入口オリフィス（２１、２０１、４２０）を備える第１の枝路（４２、４２’）と、
前記標的を刺激すると考えられる分子を備える第２の流体（Ｆ_２）のための入口オリフィス（４３０）を備える第２の枝路（４３、４３’）と、
前記流体（Ｆ_１、Ｆ_２）のための出口オリフィス（２２、２０３、４５）を備える、前記流体のための共通の枝路（４４、４５’）とを有し、
前記システムはさらに、
前記マイクロ流体チャネル（４、４０）の前記入口オリフィスに接続され、前記流体（Ｆ_１、Ｆ_２）を前記チャネルに供給する少なくとも１つの手段と、
前記標的を受け取ることを目的とした基板（６）を有する少なくとも１つのチャンバ（８）または他のマイクロ流体チャネルと、
前記共通の枝路（４４、４５’）の接続器（４１、４１’）で配置され、前記チャンバ（８）または前記他のマイクロ流体チャネルをマイクロ流体チャネル（４、４０）から分ける少なくとも１つの微多孔膜（５）とを備え、
前記微多孔膜（５）は、前記基板（６）から離れて配置され、その結果、前記供給手段が前記流体（Ｆ_１、Ｆ_２）を前記マイクロ流体チャネル（４、４０）に供給すると、次いで、前記標的を刺激すると考えられる前記分子は、前記微多孔膜（５、５０）を通った後、前記チャンバ（８）もしくは前記他のマイクロ流体チャネルを通って拡散し、前記チャンバ（８）もしくは前記他のマイクロ流体チャネル内の前記濃度プロファイルを制御する、
ことを特徴とするマイクロ流体システム。

【請求項2】

前記マイクロ流体チャネル（４、４０）は、ガラスもしくはケイ素、非弾性光架橋ポリマー、金属、電気伝導体もしくは半導体である合金、セラミック、石英、サファイア、エラストマーから選択されたいずれかの材料製のカバー（２，２０）を備える、
請求項１に記載のマイクロ流体システム。

【請求項3】

前記流体のための前記少なくとも１つの入口オリフィス（２１、２０１、２０２）および前記少なくとも１つの出口オリフィス（２２、２０３）は、前記カバー（２、２０）内に形成される、請求項１または２に記載のシステム。

【請求項4】

前記マイクロ流体チャネル（４、４０）は、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂製の少なくとも１つの側壁（３、３０、３０’）を備える、請求項１から３のいずれか１項に記載のマイクロ流体システム。

【請求項5】

前記微多孔膜（５）は、前記マイクロ流体チャネル（４、４０）の前記側壁（３、３０、３０’）上を横方向に伸び、前記チャネルの底を閉じる、請求項１から４のいずれか１項に記載のマイクロ流体システム。

【請求項6】

前記マイクロ流体チャネル（４０）はいくつかの階層で編成され、各階層は、少なくとも１つの流体のための少なくとも１つの入口オリフィス（２０１、２０２）を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載のマイクロ流体システム。

【請求項7】

前記チャンバ（８）または前記他のマイクロ流体チャネルの前記基板（６）は、光透過性材料製である、請求項１から６のいずれか１項に記載のマイクロ流体システム。

【請求項8】

前記チャンバ（８）または前記他のマイクロ流体チャネルは、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂製の側壁（７ａ、７ｂ）を備える、請求項１から７のいずれか１項に記載のマイクロ流体システム。

【請求項9】

前記微多孔膜（５）は、前記チャンバ（８）もしくは前記他のマイクロ流体チャネルの前記側壁（７ａ、７ｂ）の間を横方向に伸び、前記チャンバもしくは前記他のマイクロ流体チャネルの上部を閉じる、請求項１から８のいずれか１項に記載のマイクロ流体システム。

【請求項10】

前記微多孔膜（５）は、ガラス、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、石英、ケイ素、シリカ、または炭化ケイ素から選択されるいずれかの材料製である、請求項１から９のいずれか１項に記載のマイクロ流体システム。

【請求項11】

前記微多孔膜（５）は、密度が１０^３から１０^１０孔／ｃｍ^２である孔を備える、請求項１から１０のいずれか１項に記載のマイクロ流体システム。

【請求項12】

前記孔は、水力直径が０．０５μｍから１２μｍである、請求項１から１１のいずれか１項に記載のマイクロ流体システム。

【請求項13】

光学的可視化手段（１８）を備える、請求項１から１２のいずれか１項に記載のマイクロ流体システム。

【請求項14】

前記光学的可視化手段（１８）は、光活性化局在性顕微鏡法の技術、または誘導放出制御顕微鏡法の技術を使用する、請求項１から１３のいずれか１項に記載のマイクロ流体システム。

【請求項15】

前記孔は、水力直径が０．０５μｍから３μｍである、請求項１２に記載のマイクロ流体システム。

【請求項16】

前記標的は、生細胞の集合によって形成されている、請求項１に記載のマイクロ流体システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイクロ流体技術の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

マイクロ流体技術は、大きさが、一般に、数１０から数１００マイクロンであるマイクロメートルの寸法を有するシステムを使用する。

【0003】

これらのシステムは、多数の分野、例えば、細胞診断試験、医薬品の開発、基礎生物学もしくは美容学で使用することができる。

【0004】

これらの分野では、生細胞のある種の分子に対する反応、特に、空間的ならびに時間的に制御された濃度プロファイルに対する反応を定量するためのマイクロ流体システムに対する要求が増加している。

【0005】

例えば、化学療法で使用される分子に対するガン細胞の反応の測定に関する問題が挙げられる。この反応を正確に定量するには、この反応を引き起こすであろう分子の使用を制御することが必要となる。この制御は、ガン細胞と相互作用する分子の量、ガン細胞がさらされる分子の濃度プロファイル、これらの分子の量ならびに／もしくはガン細胞で使用されるこれらの分子の濃度プロファイルの経時変化等に関連しうる。

【0006】

美容学の分野では、マイクロ流体システムは、生細胞および／または細胞組織におけるある種の分子の毒性を試験するために使用することが可能である。細胞に投与される、有毒である可能性がある分子の量を制御すること、およびこれらの分子を投与する方法は、毒性閾値を判断するために必要である。

【0007】

生細胞を刺激するために広く使用されるマイクロ流体システムの例は、特許文献１に提示されている。特に、このマイクロ流体システムは、プロファイルが長時間にわたって直線状および安定である分子の濃度勾配に生細胞を従わせることを可能にする。

【0008】

この種類のマイクロ流体システムの主な欠点は、せん断力を生成し、生細胞を摂動する流動を生細胞が受けることである。このせん断効果は、特に、神経細胞の成長円錐における走化性反応の研究を目的とする場合、問題となる。実際に、この流動は、最も良い場合では標的細胞の反応を変化させる、そうでなければ細胞の死もしくは剥離を引き起こすせん断応力を生成する。

【0009】

この方法で研究された生細胞の生理学的作用は、本明細書で開示するシステムで摂動される。

【0010】

したがって、生細胞を流動によって摂動させることなく、生細胞を分子の濃度勾配に従わせる解決策が提案されてきた。

【0011】

生細胞を刺激すると考えられる分子の濃度勾配を適用するためのマイクロ流体システムは、例えば、非特許文献１の論文に示される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】米国特許７３７４９０６

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｔａｅｓｕｎｇ Ｋｉｍ、Ｍｉｋｈａｉｌ Ｐｉｎｅｌｉｓ、および、Ｍｉｃｈｅｌ Ｍ． Ｍａｈａｒｂｉｚ著「Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｓｔｅｅｐ， ｓｈｅａｒ−ｆｒｅｅ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ（２００９年）、Ｖｏｌ．１１、６５−７３ページ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

このマイクロ流体システムは、マイクロ流体装置１０および装置に流体を供給する手段（図示せず）を備える。

【0015】

本明細書に開示するマイクロ流体システム１０を、図１に分解斜視図で示す。

【0016】

マイクロ流体システム１０は、ほぼ四角形の中央帯１２を備え、中央帯１２に対して十字の形に配置されたチャネル１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、および１３ｄに接続されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）基板１１を備える。さらに、ＰＤＭＳ基板１１の中央帯１２を覆うポリエステル微多孔膜１４も備える。最後に、ポリエステル膜１４と、ＰＤＭＳ基板１１と、チャネル１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄとを覆うＰＤＭＳカバー１５を備える（カバー１５は、図１に切断型で示す）。

【0017】

したがって、マイクロ流体システム１０はポリエステル膜１４によって２つの部分に分けられる。

【0018】

第１の部分は、流体が循環することを可能にするチャネルを形成し、前記チャネルは膜１４によって上部で閉じられ、したがって、膜の下側は、このチャネルの壁を形成して、流動を受ける。

【0019】

第２の部分は、チャネルとは反対側となる膜１４の上側によって形成され、培養した生細胞（ＬＣ）が配置される。

【0020】

流体を供給する手段は図示しない。しかしながら、第１の流体がマイクロ流体システム１０の基板１１に、導入口Ｅ１を介して導入されること、および第２の流体がマイクロ流体システム１０の基板１１に、導入口Ｅ１とは反対側の導入口Ｅ２を介して導入されることに留意されたい。これら流体の少なくとも一方は、ポリエステル膜１４を通過することによって、生細胞を刺激することを目的とした分子を備える。

【0021】

したがって、導入口Ｅ１、Ｅ２を介して導入される流体は、マイクロ流体システム１０の基板１１内で循環し、向かい合って接触し、この２つの流体の界面で混合域を作り出し、次いで、放出口Ｓを介してこの基板１１から放出される。

【0022】

長時間にわたって空間内で生細胞の培養を制御するために、マイクロ流体システム１０を用いて、流体の流量を調整して、ポリエステル膜１４における分子の所定の濃度プロファイルを確立することが可能である。

【0023】

より正確には、適切な流体を選択した後、２つの流体のそれぞれの流量を調整することで、２つの流体の間の界面でかなり特定された混合域を作り出すこと、すなわち、生細胞を刺激することを目的とした分子のかなり特定された濃度プロファイルを作り出すことが可能となる。規定されたプロファイルにより濃度勾配を生成したこの混合域は、概ね図１に示す軸Ａに沿って、基板１１の２つの放出口Ｓを通過して伸びる。

【0024】

しかしながら、このマイクロ流体システムにはいくつかの欠点がある。

【0025】

第１に、導入口Ｅ１、Ｅ２からの流体の各流量は、非常に正確に制御されて、ポリエステル膜１４の下側で安定する分子の濃度プロファイルを生成する必要がある。

【0026】

流量のこのような制御は、マイクロ流体システム１０の上流で、つまり、流体供給手段自体で実行され、勾配が基板１１におけるその部分に対して、２つの流体の間の界面で生成される。

【0027】

そのため、２つの流体の一方または他方の流量の摂動は、２つの流体の間の界面を変更し、その結果、膜１４の下側における分子の濃度プロファイルも変更する。したがって、濃度プロファイルの安定を実現することは困難である。

【0028】

さらに、生細胞が膜１４の上側に配置されるため、生細胞に適用された濃度プロファイルは、膜の下側で適用されたプロファイルにほぼ対応する。このことはすべて、膜１４の厚さが１０μｍと小さい場合、より当てはまる。

【0029】

第２に、生細胞で得られた濃度プロファイルの勾配は、マイクロ流体チャネルにおける流量、および導入口Ｅ１、Ｅ２からの２つの流体の間の界面の位置に左右される。したがって、プロファイルの勾配を制御することは非常に困難である。

【0030】

第３に、マイクロ流体システム１０は、ポリエステル膜１４を使用し、ポリエステル膜１４は、その下側がＰＤＭＳ基板１１の縁部に固定され、四角形であり、その上側がＰＤＭＳ製のカバー１５に固定される。これらの材料が選択されるのは、膜１４、基板１１、およびカバー１５を、本明細書で述べる処理によって共に固定することをとりわけ可能にするためである。膜１４およびチャネル１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄのカバー１５があることで、膜１４と基板１１との間の機械抵抗ならびに密封性を強化することが可能となり、膜１４と基板１１との間の固定が、基板１１の縁部でのみ実際に実行される。さらに、膜１４はＰＤＭＳのプレポリマーの堆積と共に固定され、機械圧力下で加熱することによって装置の不可逆的製造を可能にする。膜１４およびカバー１５がひとたび固定されると、カバー１５の横に開いた開口を介して、細胞を膜１４上に挿入することが可能となる。

【0031】

この構成およびこれら材料の選択を用いることで、このように、適切な機械抵抗および密封性を得ることが可能となる。

【0032】

チャネルと膜１４との間の密封性を確実にするために、マイクロ流体システムは、カバーを用いて閉じる必要がある。その場合、マイクロ流体システム１０内で細胞を培養する必要がある。これは、ニューロン、移植組織、もしくは組織の切片の１次培養等の複雑な細胞培養に対してあまり実用的ではない。

【0033】

さらに、ＰＤＭＳカバー１５を用いると、生細胞を刺激する反応を視覚化することができないか、もしくは視覚化することが困難になる。このことは、ＰＤＭＳ材料は弾性係数が低いことから、ＰＤＭＳカバーの操作を可能にするには、ある厚さを持たせる必要があるため、より重大である。厚さが大きいと、この材料の光学品質がさらに低下する。したがって、適切な光学手段を用いて、膜上に配置された生細胞の反応を観測することは非常に困難である。

【0034】

本発明の目的の１つは、これらの欠点の少なくとも１つを克服することである。

【課題を解決するための手段】

【0035】

これらの目的の少なくとも１つを達成するために、本発明は、例えば、生細胞の集合によって形成された標的を刺激すると考えられる分子の濃度プロファイルを制御するマイクロ流体システムを提案し、本システムは以下を備える。

【0036】

・少なくとも１つの流体に対して、少なくとも１つの入口オリフィスと少なくとも１つの出口オリフィスとを有する少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを備えるマイクロ流体装置
・標的を刺激すると考えられる分子を備える少なくとも１つの流体をマイクロ流体チャネルに供給するための少なくとも１つの手段
・標的を受け取ることを目的とした基板を有する少なくとも１つのチャンバまたは他のマイクロ流体チャネル
・マイクロ流体チャネルからチャンバまたは他のマイクロ流体チャネルを分ける少なくとも１つの微多孔膜
前記微多孔膜は、基板から離れて配置され、したがって、供給手段が、マイクロ流体チャネルに、微多孔膜と接する層状領域において流動する少なくとも１つの流体を供給する場合、標的を刺激すると考えられる分子は、微多孔膜を通過した後、チャンバもしくは前記他のマイクロ流体チャネルを通って拡散し、最後に、このチャンバ内もしくはこの他のマイクロ流体チャネル内で安定した濃度プロファイルを形成する。

【0037】

本システムは、以下のように、他の技術的特徴を単独で、もしくは組み合わせて想定することが可能である。

【0038】

・マイクロ流体チャネルは、ガラスもしくはケイ素、非弾性光架橋ポリマー、金属、電気伝導体もしくは半導体である合金、セラミック、石英、サファイア、エラストマーから選択された材料製のカバーを備える。
・流体に対する前記少なくとも１つの入口オリフィスおよび少なくとも１つの出口オリフィスは、カバー内に形成される。
・マイクロ流体チャネルは、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂製の少なくとも１つの壁を備える。
・微多孔膜は、マイクロ流体チャネルの側壁上を横方向に伸び、前記チャネルを底で閉じる。
・マイクロ流体チャネルはいくつかの階層で編成され、各階層は、少なくとも１つの流体のための少なくとも１つの入口オリフィスを有する。
・チャンバまたは前記他のマイクロ流体チャネルの基板は、光透過性材料製である。
・チャンバまたは前記他のマイクロ流体チャネルは、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂製の側壁を備える。
・微多孔膜は、チャンバもしくは前記他のマイクロ流体チャネルの側壁の間を横方向に伸び、前記チャンバもしくは前記他のマイクロ流体チャネルを上部で閉じる。
・微多孔膜は、ガラス、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、石英、ケイ素、シリカ、または炭化ケイ素から選択される材料製である。
・微多孔膜は、密度が１０^３から１０^１０孔／ｃｍ^２である孔を備える。
・孔は、水力直径が０．０５μｍから１２μｍ、好ましくは、０．０５μｍから３μｍである。
・光学的可視化手段を備える。
・光学手段は、光活性化局在性顕微鏡法の技術、または誘導放出制御顕微鏡法の技術を使用する。

【0039】

本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の図面を参照して、以下の詳細な記述で提示する。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】従来技術によるマイクロ流体システムの斜視図である。

【図2】本発明によるマイクロ流体装置の部分的な断面透視図である。

【図3】図３（ａ）〜図３（ｄ）は、図２に示すマイクロ流体装置の製造プロセスの工程、またはこのプロセスのある工程の最後で得られる中間構造体を、必要に応じて示した図である。

【図4】図４（ａ）〜図４（ｃ）は、本装置の基板および側壁によって形成された組立体の製造中に得られる中間構造体の図であり、前記組立体は、図２のマイクロ流体装置の一部を形成することを目的とする。

【図5】（ａ）は、本発明によるマイクロ流体装置のマイクロ流体チャネルの図であり、（ｂ）は、本発明による第１のチャネル内で流動する流体の図であり、（ｃ）は、本発明による装置のチャンバ内で得られる濃度プロファイルのグラフである。

【図6】図６（ａ）〜図６（ｃ）は、すべて本発明によるマイクロ流体装置の断面図であり、本装置のチャンバ内で生細胞を刺激することを目的とした分子の濃度プロファイルの、経時的に安定化する様々な工程を順に観測することが可能である。

【図7】（ａ）は、本発明によるマイクロ流体装置の他のマイクロ流体チャネルの図であり、（ｂ）は、第１のチャネル内で流動する流体の図であり、（ｃ）は、本発明による装置のチャンバ内で得られる濃度プロファイルのグラフである。

【図8】拡散により、様々な溶液に対し、生細胞を刺激することを目的とした分子の不変領域を確立するための経時変化を示す図である。

【図9】図２に模式的に示したマイクロ流体装置の場合よりも複雑な濃度プロファイルを生成することを可能にする、本発明によるマイクロ流体装置の一実施形態の断面図である。

【図10】空間的・周期的な濃度プロファイルを示すグラフであり、図９によるマイクロ流体装置のチャンバ内でほぼ頂点となる。

【図11】図１１（ａ）〜図１１（ｃ）は、図９に示すマイクロ流体装置の製造工程において得られるいくつかの中間構造体を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0041】

本発明は、例えば、生細胞の集合によって形成された標的を刺激すると考えられる分子の濃度プロファイルを制御するマイクロ流体システムに関し、システムは、マイクロ流体装置と、本標的を刺激すると考えられる分子を備える少なくとも１つの流体を本装置に供給する少なくとも１つの手段とを備える。

【0042】

マイクロ流体装置は図２を参照して説明し、本装置の製造工程は図３（ａ）から図３（ｄ）および図４（ａ）から図４（ｃ）を参照して説明する。次いで、非限定的な例として、図５（ａ）および図６（ａ）を参照して、本装置内で使用することが可能な特定の形態のマイクロ流体チャネルを説明する。

【0043】

図２は、本発明によるマイクロ流体装置１の部分的な断面透視図を示す。

【0044】

本マイクロ流体装置１は、有利には硬質であり、２つのオリフィス２１、２２を備えるカバー２と、有利には光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂製の側壁３とを備える。装置１の側壁３は、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂製の単一の層として生成される。

【0045】

マイクロ流体装置１はまた、その下部において、側壁３の基板に対し横方向に伸びる微多孔膜５によって覆われる開口４７を備える。側壁３、カバー２、および微多孔膜５は、マイクロ流体チャネル４と、前記オリフィス２１、２２から成る導入口ならびに放出口とを画定することが可能である。

【0046】

微多孔膜５は、マイクロ流体チャネル４内を流動しようとする流体が、この膜の他の側に移動することを防ぐが、この移動は、マイクロ流体チャネル４内の流体によって搬送される、標的を刺激すると考えられる分子の拡散を可能にする。

【0047】

本マイクロ流体装置１は、有利には硬質で透過である基板６と、有利には光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂製の側壁７ａ、７ｂとを備える。これらの側壁７ａ、７ｂ、基板６、および微多孔膜は、標的細胞に対する培養チャンバとなるチャンバ８を形成することを可能にする。チャンバ８を形成するために、４つの側壁が設けられるが、実際には、これらの壁は、単一の輪郭と見立てることができ、本製造工程では、有利には、これらの壁を一体形成する。

【0048】

チャンバ８の底は、例えば、生細胞から形成される標的を受け取ることを目的とした基板６の上側６１で形成される。したがって、生細胞を微多孔膜５上に配置することを目的としないが、微多孔膜５から離れて、チャンバ８の基板６上に配置される。したがって、マイクロ流体装置４とは別々に、生細胞は標準条件で培養することができる。

【0049】

結果として、微多孔膜５は、装置を２つの別々のマイクロ流体チャネル４、８に分ける。マイクロ流体チャネル４は、標的を刺激すると考えられる分子を備える流体が循環することを可能にする。これは、後の記述でより詳細に説明するように、微多孔膜５を通ってチャンバ８に分散することにより実行され、次いで、その底に、例えば、刺激標的の生細胞（ＬＣ）を備えるチャンバ８（培養チャンバ）を通って拡散することによって実行される。

【0050】

有利には、基板６は光透過性材料、例えば、ガラス製である。これは、例えば、チャンバ８の底に配置された生細胞の刺激に対する反応を視覚化するために、装置の外部の光学的可視化手段を調整することが可能であるため興味深い。

【0051】

カバー２は、ガラスもしくはケイ素、非弾性光架橋ポリマー、金属、電気伝導体もしくは半導体である合金、セラミック、石英、サファイア、エラストマーから選択された材料から製造することが可能である。

【0052】

微多孔膜５の孔の大きさは、第１のマイクロ流体チャネル４とチャンバ８との間でいかなる流体の通過も防ぐよう選択される。孔が円筒状である場合、この大きさは孔の直径に相当する。より一般的には、孔の大きさは、孔の水力直径と見立てることが可能である。

【0053】

実際には、微多孔膜５を流体の通過に対して完全に不透過性にすることはできない。したがって、微多孔膜５を通る流体の流液速度が限界値未満である場合、チャンバ８の底に配置された細胞はいかなる流動も受けないと考えられる。

【0054】

例えば、限界速度は１μｍ／ｓ程度であると考えられる。この場合、細胞にかかるせん断応力は、チャンバ８の高さｈ’が、例えば、２０μｍの小ささである場合でさえも、無視できる。

【0055】

さらに、マイクロ流体チャネル４における速度は、一般に、１００μｍ／ｓから１０００μｍ／ｓとなる。

【0056】

したがって、限界値１μｍ／ｓを得るために、微多孔膜５の流体力学的抵抗Ｒ_ｈ，膜は、チャネル４における流体の速度に応じて、マイクロ流体チャネル４の流体力学的抵抗Ｒ_{ｈ，チャネル}より１００から１０００倍大きくする必要がある。

【0057】

特に、マイクロ流体チャネル４における流体の流速が１０００μｍ／ｓである場合、膜５を通る流体の速度が考慮した限界値１μｍ／ｓ未満となることを確実にするために、以下の不等式に従うことが必要である。
１０００×Ｒ_{ｈ，チャネル}＜Ｒ_ｈ，膜 （Ｒ１）
さらに、高さｈ、幅ｗ、ならびに長さＬの長方形のマイクロ流体チャネル４、および厚さがｅであり、半径ｒ_孔と同一で円筒状であり、表面孔密度ρを有する孔を備えた微多孔膜５を考慮した場合、関係（Ｒ１）は、以下の形式で書き表される。
１０００×μ．Ｌ／（ｗ．ｈ^３）＜μ．ｅ／（ｒ_孔^４．ρ．Ｌｗ） （Ｒ２）
および
θ＝ｒ_孔^４．ρ／ｅ＜１０^−３×ｈ^３／Ｌ^２ （Ｒ３）

【0058】

高さｈ＝１００μｍ、幅ｗ＝１０００μｍ、および長さＬ＝１０００μｍのマイクロ流体チャネル４に対し、関係（Ｒ３）を満たすにはθは１０^−９ｍ未満である必要がある。さらに、半径１μｍで、膜厚１０μｍの円筒状の孔を考慮した場合、表面孔密度ρは、１０^６孔／ｃｍ^２未満である必要がある。

【0059】

当然、関係（Ｒ３）は、一方で微多孔膜５を通る流体の限定速度、他方でマイクロ流体チャネル４内の流体の流速について考慮した値に応じて一般化することができる。

【0060】

微多孔膜５は、水力直径が０．０５μｍから１２μｍである孔を有することが可能である。特に、孔が円筒状である場合、孔の水力直径は、その直径に対応する。

【0061】

有利には、しかしながら、この水力直径は、０．０５μｍから３μｍとなるであろう。実際に、水力直径が３μｍ未満である孔を有する膜を使用すると、発生する可能性の高いほとんどの使用条件に対して、チャンバ８における一切の流通を防ぐことになる点に留意されたい。

【0062】

現在では、膜の製造者は、孔の水力直径が概ね０．２μｍ超である膜を提供する。したがって、本発明において、有利には、孔は０．２μｍから３μｍの水力直径を有することが可能である。しかしながら、理論上、孔の水力直径に対して下限はなく、そのため、水力直径が０．０５μｍに達する孔を使用することも想定される。

【0063】

しかしながら、孔を大きくすると、マイクロ流体装置を使用して、（例えば、マイクロ流体チャネル４内の流量を選択する際に）微多孔膜５を流体が通らなくすることがより難しくなる。

【0064】

孔の密度については、１０^３から１０^１０孔／ｃｍ^２とすることが可能である。孔の高さは、５０ｎｍから１００μｍとすることが可能である。

【0065】

さらに、微多孔膜５は、ガラス、石英、ケイ素、シリカもしくは炭化ケイ素、またはマイクロ流体装置の他の部分のために使用されるであろうポリマーと同じ性質のポリマー等の様々な材料で製造することが可能である。したがって、ポリカーボネート、ポリエステル、またはポリエチレンテレフタレートを使用することが可能である。

【0066】

第１の例によれば、ポリカーボネート微多孔膜５は、孔の水力直径が０．２μｍから１μｍである際、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ社によるＣｙｃｌｏｐｏｒｅ型（Ｗｈａｔｍａｎ Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ（商標））を想定することが可能である。第２の例によれば、ポリエステル微多孔膜５は、孔の水力直径が０．４μｍから３μｍである際、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ社によるＴｒａｎｓｗｅｌｌ型（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標））を想定することが可能である。第３の例によれば、ポリエチレンテレフタレート微多孔膜５は、孔の水力直径が０．４μｍから８μｍである際、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社による「Ｔｒａｃｋ−Ｅｔｃｈｅｄ」型を想定することが可能である。

【0067】

これらの微多孔膜には、図３（ａ）から図３（ｄ）を参照して以下に記載するマイクロ流体装置１の製造工程と適合可能な利点がある。これらはまた、特に様々な分子を通過させるために生体適合可能および官能化可能である利点がある。「官能化可能」とは、微多孔膜５が化学的に変性し、特定の機能（特定の種や化学反応等の保持）を満たすことが可能であるという意味である。

【0068】

通常は、本装置は以下の寸法を有することができる。マイクロ流体チャネルの高さｈは、１μｍから１０００μｍ、有利には、１０μｍから２００μｍとすることができる。その幅（図示せず）は、１０μｍから２ｍｍとすることができる。チャンバ８の高さｈ’は、１０μｍから１０００μｍ、有利には、５０μｍから２００μｍとすることができる。さらに、導入口Ｅと放出口Ｓとの間の距離は、数センチメートルとする。

【0069】

本発明によるマイクロ流体装置１の製造工程の一例は、少なくとも以下の工程を備える処理である。
（ａ）エラストマー材料製のスタンプ１’を使用して、微多孔膜５を備える基板２’上に配置された光硬化性液体および／または熱硬化性液体をプリントする。
（ｂ）液体Ｌに光照射および／または加熱を行い、微多孔膜５によって底部が閉じられている第１の側壁３を形成する。
（ｃ）第１の側壁３上、すなわち基板２’の反対側に、少なくとも２つのオリフィス２１、２２を備えるカバー２を固定し、液体が循環することを可能とするマイクロ流体チャネル４を形成する。
（ｄ）基板２’を除去することによって接触可能となる第１の側壁３の一部を固定する基板２’を除去した後、組立体は少なくとも基板６と、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂製の前記少なくとも２つの第２の側壁７ａ、７ｂとを備え、チャンバ８を形成する。
この処理は、国際公開第２００８／００９８０３号明細書に開示された処理に基づく。

【0070】

工程（ａ）の間に実行される処理を図３（ａ）に示す。

【0071】

工程（ａ）で使用されるスタンプ１’は、ＰＤＭＳ等のエラストマー材料で製造することが可能である。スタンプ１’は、ここで生成しようとするマイクロ流体装置１の輪郭に相補的である鋳型として使用される輪郭を有する。したがって、スタンプ１’は、ここで得ようとするマイクロ流体装置１のチャネル４に対応する突起１’ａを有する。スタンプ１’はまた、マイクロ流体装置１の前記第１の側壁３の形成を目的とした領域である、突起１’ａを取り囲む中空帯１’ｂを有する。基板２’はまた、ＰＤＭＳで製造することができ、平坦な輪郭を有する。

【0072】

微多孔膜５は、基板２’上にあらかじめ配置され、次いで、スタンプ１’が基板２’に対して押しつけられる。このように、スタンプ１’は突起１’ａを介して、基板２’に対して膜５を押し込む。

【0073】

次に、液状形態の光架橋性樹脂および／または光重合型樹脂ＬＲは、スタンプ１’と基板２’との間にある容積を、適切な量で、とりわけスタンプ１’の中空帯１’ｂにおいて充填する。この充填により微多孔膜５の位置は変化せず、微多孔膜５はスタンプ１’と基板２’との間に押し込まれる。

【0074】

光架橋性樹脂ならびに／もしくは光重合型樹脂は、モノマーならびに／もしくはプレポリマーに基づく溶液もしくは分散系である。接着剤、凝固剤、もしくは表面被覆として通常使用する光架橋性樹脂および／または光重合型樹脂を、本発明の処理において使用する。

【0075】

有利には、光学分野で通常使用する接着剤、粘着剤、または表面被覆が選ばれる。それらの樹脂は、照射、および光架橋ならびに／もしくは光重合されると、固体になる。このように形成された固体は透明であり、気泡、または他のあらゆる異常がないことが好ましい。

【0076】

一般に、そのような樹脂は、エポキシ、エポキシシラン、アクリラート、メタクリレート、アクリル酸、またはメタクリル酸系のモノマー／コモノマー／プレポリマーに基づくが、チオレン、ポリウレタン、およびウレタン−アクリラート樹脂を挙げることもできる。樹脂は、ポリアクリルアミドゲル等の光架橋性水性ゲルと置き換えることができ、常温で液体となるよう選択される。樹脂はまた、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）と置き換えることができる。

【0077】

本発明において使用可能な光架橋性樹脂として、Ｎｏｒｌａｎｄ Ｏｐｔｉｃｓ社によりＮＯＡ（登録商標） Ｎｏｒｌａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅの名称で市販されている商品、例えば、ＮＯＡ８１およびＮＯＡ６０や、Ｄｙｍａｘ社による一連の「Ｄｙｍａｘ Ａｄｈｅｓｉｖｅおよび光硬化系」として市販されている商品や、Ｂｏｈｌｅ社による「ＵＶ接着剤」商品群として市販されている商品や、Ｓａｒｔｏｍｅｒ社によりＳＲ４９２およびＳＲ４９９の製品コードで市販されている商品を用いることもできる。

【0078】

これらの樹脂の重合および／または架橋結合は、あらゆる適切な手段、例えば、ＵＶ、可視光、もしくはＩＲ放射を用いた照射を使用する光活性化により実行される。

【0079】

樹脂は、重合および／または架橋結合すると、硬質かつ非柔軟性となる樹脂から選択されることが好ましく、これは、流体がマイクロ流体装置１において加圧下で循環した場合、エラストマー樹脂は変形する傾向があるためである。しかしながら、生細胞の弾性の研究等の特定の用途においては、光架橋性エラストマー樹脂の使用は除外されない。

【0080】

スタンプ１’と基板２’との間の容量を液体樹脂ＬＲで満たすと、圧力Ｐがスタンプ１’にかかり、可能な限りの余分な樹脂を排除する。図２において、突出部、とりわけエラストマースタンプ１’の突起１’ａは、基板２’と接する。液体樹脂は、スタンプ１’の中空帯の形状であると仮定する。

【0081】

工程（ｂ）の最後で得られる構造体を図３（ｂ）に示す。

【0082】

工程（ｂ）の間、樹脂の照射は、装置の基板に垂直な軸方向に、スタンプ１’を通じて実行される。照射は正確に配分される必要があり、したがって、必要ならば、活性重合および／または架橋結合部位が、前記第１の樹脂側壁３の表面上に残される。次いで、スタンプ１’が、装置から除去される。図３（ｂ）は、光重合樹脂および／または光架橋性樹脂製の第１の側壁３を示し、スタンプ１’の中空帯の輪郭と相補的な輪郭を有する。

【0083】

スタンプ１’の輪郭を、例えば、光重合樹脂および／または光架橋性樹脂が他のパターンの輪郭になるようなものと想定することが可能であることが理解されよう。これは、とりわけ、本発明によるマイクロ流体装置１００に対する場合であり、図９を参照してさらに説明する。

【0084】

液状の樹脂の状態のエラストマースタンプ１’を用いてプリントすることで、非常に良好な解像度を有する非常に小型の構造体を得ることが可能となる。

【0085】

次いで、工程（ｃ）の間、少なくとも２つのオリフィス２１、２２を有するカバー２は、装置上で、以前にスタンプ１’と接していた前記第１の側壁３の側に固定される。次いで、基板２’は除去することができる。

【0086】

工程（ｃ）の最後で得られる構造体を図３（ｃ）に示す。

【0087】

基板２’の除去は、微多孔膜を光重合樹脂および／または光架橋性樹脂から剥がすことなく、および、抜き取ったり部分的に引き離したりすることなく実行される。

【0088】

カバー２は、ガラス、ケイ素、固体ポリマー膜、金属、導体もしくは半導体である合金、セラミック、石英、サファイア、エラストマーから製造することが可能である。

【0089】

ガラススライド、ポリマー膜、またはケイ素スライドが選択されることが好ましい。カバー２を形成するために使用される材料は、マイクロ流体装置１の所期の用途に応じて選択される。

【0090】

したがって、カバー２を光透過性材料、例えばガラス等で製造することは、観測、すなわち光学検出（透過性）を容易にするためにより適切である。ガラスの他の利点は、熱伝導性が非常に良好であり、装置を均一に加熱できる点である。

【0091】

マイクロ流体チャネル４の下部での微多孔膜５の構成により、その使用が、生細胞を培養するための標準手順と適合することに留意されたい。実際に、その場合、基板６は生細胞を培養するガラススライドであり、そのため、以下の記述で説明するように、前記スライドは、工程（ｃ）の最後で得られた構造体上に固定されてチャンバ８（培養チャンバ）を形成すると想定することが可能である。

【0092】

基板６と２つの第２の側壁７ａ、７ｂとを備える組立体は、以下の処理工程に基づいて生成することが可能である。
（ｅ_１）エラストマー材料製で、光硬化性および／または熱硬化性液体樹脂ＬＲを受け取ることを目的とした基板側３’ａおよび空隙３’ｂを有する開放鋳型３’を使用する。
（ｅ_２）鋳型３’の基板側３’ａ上に基板６を配設する。
（ｅ_３）基板６上にマスク４’を配設し、次いで、光照射または加熱して、前記第２の側壁７ａ、７ｂを形成する。

【0093】

工程（ｅ_１）から（ｅ_３）の最後で得られた構造体を図４（ａ）に示すが、ここで、工程（ｅ_３）は、光照射した液体樹脂からなる場合である。

【0094】

スタンプ１’および基板２’のように、鋳型３’はＰＤＭＳ等のエラストマーから製造することが可能である。

【0095】

壁７ａ、７ｂを形成するために使用する光硬化性および／または熱硬化性液体樹脂は、工程（ａ）で使用した液体樹脂のために前に説明したものから選択することが可能である。工程（ａ）および（ｅ_１）から（ｅ_３）のために使用する液体樹脂は、同じであることが好ましい。変形として、上記したもののような光架橋性水性ゲル、もしくはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を使用することが可能である。

【0096】

基板６は、カバーのために使用する材料から選択することが可能である。有利には、光透過性材料を使用して、専用の装置による光学的可視化を容易にすることが可能である。この光透過性材料は、特に、ガラスとすることができ、したがって、基板６は、生細胞（ＬＣ）を培養するために通常使用するようにガラスカバーを形成することが可能である。さらに、ガラスを使用することで、この基板に対してすでに利用可能な化学的および生物学的表面処理を利用することが可能になる。

【0097】

マスク４’は、マイクロ流体装置の前記第２の側壁７ａ、７ｂを形成するために、液体樹脂の的確な領域への光照射を可能にするオリフィス４’ａ、４’ｂを有することができる。

【0098】

工程（ｅ_３）が完了すると、残る作業は、工程（ｅ_４）でマスク４’と鋳型３’とを除去して、前記第２の側壁７ａ、７ｂおよび基板６によって形成される組立体だけにすることのみである。この組立体を図４（ｂ）に示す。

【0099】

一般に、工程（ｅ_５）が次に実行され、工程（ｅ_５）は、例えば、体積の比率が９０／１０のエタノール／アセトン混合物で前記組立体を洗浄する作業で構成される。このように洗浄することで、基板６上に残る可能性の高い、光照射されなかった、または加熱されなかったすべての樹脂を除去することが可能となる。

【0100】

次いで、工程（ｃ）の最後で得られた構造体を有する組立体を配設する前であって、工程（ｄ）を開始する前に、生細胞（ＬＣ）を培養する。

【0101】

この作業のために、組立体を生体適合することが必要である。

【0102】

この目的のために、組立体を、例えばＵＶで強力に光照射し、その後、水等の中性溶液で数時間かけて強く洗浄してもよい。

【0103】

最後に、次いで、図４（ｃ）に示すように、基板６の上側６１で生細胞の培養を行うことができる。この培養は、標準条件で実行される。特に、前記培養は、従来のガラススライドの形である基板６上で行うことができる。

【0104】

この培養が完了すると、工程（ｄ）を実行することが可能となる。

【0105】

工程（ｄ）で実行される処理を、図３（ｄ）に示す。

【0106】

工程（ｄ）が実行されると、マイクロ流体装置１は、使用可能な状態になる。マイクロ流体装置１は、特に、チャンバ８（培養チャンバ）内の微多孔膜５の反対側となる基板６の上側６１に生細胞を備える。

【0107】

このマイクロ流体装置１を使用するために、本発明によるマイクロ流体システムにも属する流体供給手段（図示せず）と組み合わせる。この供給手段は、マイクロ流体チャネルに、生細胞を刺激すると考えられる分子を備える少なくとも１つの流体を供給することを可能にする。

【0108】

この供給手段を、例えば、１組の流体タンクで形成し、毛細管でマイクロ流体チャネル４に接続することが可能である。この手段を用いると、次いで、様々な貯水器から受け取った様々な流体の希釈および／または混合を、流体がマイクロ流体チャネルに入る前に行うことができる。

【0109】

さらに、マイクロ流体チャネル４は、特定の形状を有することができる。

【0110】

使用されることが多いマイクロ流体チャネル４の例を、図５（ａ）に透視図で模式的に示す。

【0111】

この例は、１つで２つの異なる流体Ｆ_１、Ｆ_２に対応するマイクロ流体チャネル４である。流体Ｆ_１、Ｆ_２は、標的細胞に対する刺激分子が、２つの流体のうち一方に低濃度で存在することのみ異なる。流体は、２つの枝路４２、４３に伝達され、枝路４２、４３は、マイクロ流体装置１の微多孔膜５が上に配置することを目的とした接続器４１を有する共通の枝路４４に結合する。

【0112】

この特定の場合において、供給手段は、流体Ｆ_１、Ｆ_２それぞれに対する２つの流体源をもたらすことが理解されよう。

【0113】

これらの流体Ｆ_１、Ｆ_２は、導入口４２０、４３０を介してマイクロ流体チャネル４に導入される。さらに、共通の枝路４４の端は、２つの流体Ｆ_１、Ｆ_２に対する共通の放出口４５を有する。マイクロ流体チャネル４の一般的な形状は、Ｙ形である。

【0114】

導入口４２０、４３０は、図２における入口オリフィス２１に相当し、放出口４５は、図２における出口オリフィス２２に相当することに留意されたい。図２において、マイクロ流体チャネル４は、単一のオリフィス２１によって導入され、単一のオリフィス２２によって放出される単一の流体のみが循環するよう設計されている。

【0115】

図５（ｂ）は、マイクロ流体チャネル４の異なる枝路における流体Ｆ_１、Ｆ_２の流動を示す模式図である。特に、共通の枝路４４において、流体Ｆ_１、Ｆ_２は、層状領域内を互いに並んで流動することに留意されたい。流動が層状である場合、流体は流体力学的に混ざらない。

【0116】

既知であるように、この共通の枝路５０４における流動のレイノルズ数が、流体力学ハンドブックから容易に決定することができる限界レイノルズ数未満である場合、流動は層状であると考えられる。

【0117】

レイノルズ数は、関係式Ｒｅ＝（Ｖ．Ｄ_ｈ）／νにより定義される無次元数であり、ここで、Ｖは共通の枝路４４における流体の速度、Ｄ_ｈは共通の枝路４４の水力直径、νは流体の動粘性率である。水力直径は共通の枝路４４の形状によって決まる。

【0118】

マイクロ流体チャネルの形状を考慮して、臨界レイノルズ数は２３００程度とする。

【0119】

流動の性質を考えて、「並行流」型の供給手段について説明する。

【0120】

実際には、マイクロ流体チャネル４０の寸法がマイクロメートルである場合、流動は、本発明により想定される用途のために使用される流体および流体の流速に対し層状である。

【0121】

これらの流体Ｆ_１、Ｆ_２は、マイクロ流体装置１のマイクロ流体チャネル４内を流動することを目的とし、どちらも微多孔膜５と接するが、チャンバ８（培養チャンバ）内には流動しない。

【0122】

次に、マイクロ流体チャネル４と、チャンバ８の基板６上に配置された前記細胞との間で生細胞を刺激すると考えられる（２つの流体Ｆ_１、またはＦ_２の少なくとも一方に含有されている）分子の伝達は、微多孔膜５を通じてチャンバ８内に拡散することによって生じる。

【0123】

より正確には、これらの分子の伝達は、第１に、微多孔膜５を通って拡散し、次いで、チャンバ８を通って拡散することによって生じ、最後に、チャンバ８の基板６の上側６１、つまり、生細胞が配置された側６１に達する。

【0124】

しかしながら、濃度プロファイルがチャンバ内で安定するためにはある程度の時間がかかる。特に、チャンバ８の基板６では、安定化時間Ｔ_ｓｔａｂは約ｈ’^２／Ｄであり、ｈ’はチャンバ８の高さであり、Ｄはチャンバ８内で標的細胞を刺激することを目的とした分子の拡散係数である。過度な安定化時間を避けるために、チャンバの高さは、概ね、５００μｍに限定されるであろうことに留意されたい。

【0125】

図６（ａ）から図６（ｃ）は、「並行流」型の流体供給を考慮する場合の拡散現象におけるいくつかの工程を示す。白の場合、流体Ｆ_２は、チャンバ８の基板６１上に配置されることを目的とした生細胞に対する刺激分子を備える。黒の場合、流体Ｆ_１は中性である。図６（ａ）において、流体供給は微多孔膜５に到達し、分子がチャンバ８内で拡散し始める。図６（ｂ）は、濃度プロファイルが安定局面にある遷移過程である。図６（ｃ）において、濃度プロファイルが安定した。

【0126】

拡散は、チャンバ８内の拡散が他の方向に生じる場合でも、主に、チャンバ８（培養チャンバ）の高さ全体に生じ、すなわち、マイクロ流体チャネル４内の流体Ｆ_１、Ｆ_２の流動方向におよそ垂直である方向に生じることが理解されよう。

【0127】

図５（ｃ）は、マイクロ流体装置１を配置した接続器４１で生じることを示す断面図である。

【0128】

これに対し、第１の流体Ｆ_１として中性溶液を、第２の流体Ｆ_２として蛍光溶液を用いて実験を行った。蛍光溶液Ｆ_２は、生細胞を刺激するために通常使用される分子と同様の拡散係数を有する分子を備える。この場合、使用する蛍光溶液はフルオレセインイソチオシアネートとすることができ、「緑色蛍光タンパク質」として、ＧＦＰｕｖと呼ばれる蛍光タンパク質を備えることができ、またはデキストラン−７０ＭＷ−ローダミン蛍光分子と関連したタンパク質を備えることができる。これは、ロードアミン−Ｂの蛍光分子に結合したタンパク質デキストラン−７０である。

【0129】

微多孔膜５の上、つまり、マイクロ流体装置１のマイクロ流体チャネル４において、図５（ｃ）に示す蛍光溶液の濃度プロファイルは、（図６（ｃ）にさらに示すような）クレネレーションである。実際に、この蛍光溶液は、マイクロ流体チャネル４の一部のみを占め、前記チャネル４の他の部分は、中性溶液によって占められる。

【0130】

刺激しようとしている生細胞が配置される可能性の高い基板６の上側６１で得られる濃度プロファイルを決定するために、次いで、マイクロ流体装置１を、本発明によるマイクロ流体システムに属する光学手段１８を用いて観測した。

【0131】

基板６の上側６１で得られた濃度プロファイルは、「ｅｒｆ」型の関数の代表曲線の形を有する。この形は、中性溶液および蛍光溶液が微多孔膜５を通り、次いで、チャンバ８を通って拡散することによって得られる。

【0132】

したがって、「並行流」型の流体供給手段５０を用いる場合、チャンバ８の基板で、つまり、刺激しようとしている生細胞についてのかなり特定された濃度プロファイルを得ることが可能となる。

【0133】

他の形式のマイクロ流体チャネル４’を図７（ａ）から図７（ｃ）に示す。

【0134】

流体Ｆ_１、Ｆ_２は、２つの枝路４２’、４３’に伝達され、枝路４２’、４３’は、１つとなり、３つのチュービングコイル（図示せず）に繋がる３つの放出口を有する同じチャネル４４’に繋がる。第１の流体Ｆ_１は、第１の放出口を介して放出され、第１のチュービングコイルに誘導され、第２の流体Ｆ_２は、第２の放出口を介して放出され、第２のチュービングコイルに誘導され、２つの流体Ｆ_１およびＦ_２の混合液は、最後に、チャネル４４’の中央放出口を介して放出され、中央チュービングコイルに誘導される。蛇行チューブの放出口では、流体は、本発明によるマイクロ流体装置１の微多孔膜５を有する接続器４１’を有する共通の枝路４５’に結合される。

【0135】

共通の枝路４５’の端４６’は、流体Ｆ_１、Ｆ_２に対する放出口を有する。

【0136】

図７（ｂ）は、マイクロ流体チャネル４’の異なる枝路における流体Ｆ_１、Ｆ_２の流動を示す模式図である。異なる流体が、層状領域内のマイクロ流体チャネル４を流動する。

【0137】

次いで、「３流路」型の流体供給手段について説明する。

【0138】

図７（ｃ）は、接続器４１’での流体の挙動を示す断面図である。この目的のために使用する実験装置は、「並行流」型のマイクロ流体チャネル４に対して上記したものと同様である。

【0139】

図７（ｃ）は、マイクロ流体チャネル４’における濃度プロファイルが階段型であることを明白に示す。図７（ｃ）は、（光学的に透明な）基板６の上側６１で得られた濃度プロファイルは、線形の中央帯を有し、ある種の標的細胞を刺激するために使用することが可能であることも示す。

【0140】

したがって、「３流路」型のマイクロ流体チャネル４’を用いた場合、刺激しようとしている生細胞上のカバーの中心で線形の濃度プロファイルを適用することが可能である。

【0141】

本発明によるマイクロ流体システムは、上記した「並行流」型または「３流路」型に従ってのみ設計した第１のマイクロ流体チャネル４、４’を使用するものに限定されない。したがって、他の種類の第１のマイクロ流体チャネルを、生細胞に適用することを所望する濃度プロファイルに応じて想定することが可能である。

【0142】

したがって、本発明によるマイクロ流体システムは、生細胞等の標的を刺激すると考えられる分子の濃度プロファイルをより簡単に制御することを可能にする。

【0143】

そのため、流体Ｆ_１、Ｆ_２のいずれの流量が変化しても、生細胞に適用される分子の濃度プロファイルに実質的な変化を引き起こさない。

【0144】

理由の１つとして、生細胞が微多孔膜５上に配置されず、チャンバ８の基板６上に配置されるということがある。実際に、生細胞が膜５の反対側に配置された場合、チャンバ８を通って拡散するための時間が、マイクロ流体チャネル４における流体の流動が摂動する可能性を少なくする。

【0145】

図５（ｃ）および図７（ｃ）は、例として、生細胞に適用する可能性の高い異なる濃度プロファイルを示す。

【0146】

本発明によるマイクロ流体システムの設計もまた、挙動を動的に表示し、多数の試験を迅速に実行することを可能にする。

【0147】

このことは、以下に記載する試験によって実証され、動的状態において実行される。

【0148】

これらの試験のために、微多孔膜５は、４００ｎｍの孔を有するＷｈａｔｍａｎ Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ型の膜とする。培養チャンバは、高さｈ’＝２００μｍ、幅１ｍｍとする。
第１の流体Ｆ_１（中性溶液）は、マイクロ流体チャネル４内を循環し、その後、第２の流体Ｆ_２が、これと同じチャネル４内を循環し、この場合、流体Ｆ_２は、生細胞を刺激するために通常使用される分子に相当する拡散係数を有する分子を備える蛍光溶液によって形成される。

【0149】

３つの蛍光溶液（フルオレセイン、ＧＦＰ、およびＤｅｘｔｒａｎ７０ＭＷ）に対して得られた結果を、図８に示す。

【0150】

図８は、時間の関数として、基板６の背後に配置した共焦点顕微鏡等の光学手段を用いて測定した蛍光溶液の正規化強度の変化を示す。顕微鏡を用いる測定は基板６で行い、基板６は、この場合、ガラススライドである。

【0151】

図８に示す３つの曲線（ｔ＝０秒）のそれぞれの起点は、第２の流体Ｆ_２の循環の開始に対応する。

【0152】

このガラススライドでの濃度プロファイルを確立するための時間は、蛍光溶液の性質に応じて、数十秒から数分の間であることが理解できる。論理的に、この溶液が含有する分子が多くなれば、確立するための時間が長くなる。

【0153】

通常は、確立するための時間は比較的短く、チャンバ８（培養チャンバ）の高さｈ’と同じくらいの距離にわたって拡散するための時間に相当し、安定した濃度プロファイルを用いて実験を迅速に行うことを可能にすることが理解される。

【0154】

マイクロ流体システムでは独立して生細胞を培養することが可能であるため、通常は１時間から２時間の時間で試験を迅速に実行することができる。その後、他の培養物を用いて、他の試験に移ることが可能である。

【0155】

これは、図１に示すマイクロ流体システムでは想定されない。実際に、この場合、培養はマイクロ流体システム内で行われ、そのため、試験を実行するために数日が必要となる。

【0156】

一般に、マイクロ流体システムは、基板６を通じて培養チャンバ８を視覚化するための光学装置を備えることになる。そのような光学装置を備える場合、基板は光透過性材料で作ると有利である。したがって、この基板６上に配置された生細胞のある種の分子による刺激に対する反応を追うことがより容易となる。

【0157】

図９は、本発明によるマイクロ流体装置の一実施形態を、部分断面図で示す。実際に、図９は、マイクロ流体装置、（例えば、生細胞の培養物を受け取る可能性のある）基板を備える組立体、およびマイクロ流体装置１００を使用可能にするために必要となる微多孔膜５の下でチャンバを形成する可能性の高い側壁の上部のみを示す。

【0158】

マイクロ流体装置１００は、図２を参照して説明したマイクロ流体装置１と同様の特徴を有し、この場合、「並行流」型または「３流路」型のマイクロ流体チャネル４０と共に使用することができる。

【0159】

マイクロ流体チャネル４０は、上記したような流体供給手段から供給を受けることができる。

【0160】

ただし、マイクロ流体チャネルの構造は変更される。実際に、この実施形態において、マイクロ流体チャネル４０は、いくつかの階層、この場合は、図９に示す例における２つの階層４０_１、４０_２で構成される。各階層は、カバー２０内に形成されたオリフィス２０１、２０２に対応する流体導入口と、共通の流体放出口２０３とを備える。

【0161】

いくつかの階層を有するマイクロ流体チャネルを備えるマイクロ流体装置を使用することの利点は、生細胞を刺激すると考えられる分子のより複雑な濃度プロファイルの適用が可能になることである。例えば、チャンバ８における凹状、凸状、または周期的な濃度プロファイルを使用し、それでもなお、流体の導入口と放出口を限られた数に保持することを想定することが可能である。

【0162】

さらに、図１０は、空間的・周期的な濃度プロファイルを得ることを可能にする、２つの階層を有するチャネル４を備えるマイクロ流体装置を用いて得られたシミュレーションの結果を示す。チャンバ８の幅を横座表で示し、刺激分子の正規化濃度を縦座標で示す。異なる実線曲線は、シミュレーションした濃度プロファイルが安定するまでの経時変化を示す。点線曲線は、フルオレセインの流動により得られた実験データに対応する。

【0163】

特に、周期的に適用する所与の濃度プロファイルを実現するために、流体Ｆ_１、Ｆ_２を、マイクロ流体チャネルの第１の階層４０_１内に（オリフィス２０２を介して）「並行流」型の供給手段で導入し、次いで、規則的な間隔で、例えば、「並行流」型の他の供給手段を用いて、他の流体Ｆ’_１、Ｆ’_２を第２の階層４０_２に、オリフィス２０１を介して導入することが想定可能である。

【0164】

これはとりわけ、微多孔膜５上にあらゆる形状のマイクロ流体チャネルを構築することを可能にする製造プロセスを使用したために可能となる。

【0165】

第１のチャネル４０が、適用したい濃度プロファイルの複雑さに応じて、３つ以上の階層を有することが可能であることが理解されよう。

【0166】

図８に示す構造体の製造は、上記した処理の適用に基づく。

【0167】

したがって、工程（ａ）および（ｂ）は、図１１（ａ）に示す構造体２００を生成するために実行される。これらの工程で使用する基板は、参照番号２０’で示し、側壁３０’’は底部が微多孔膜５により閉じられる。

【0168】

次いで、図１１（ｂ）に示す構造体２００’を、上記した工程（ａ）から（ｃ）と同様の工程を使用して生成する。構造体２００’は、３つのオリフィス２０１、２０２（流体導入口用）および２０２（流体の共通の放出口用）を備えるカバー２に固定された４つの第１の側壁３０、３０’’’を備える。この場合、側壁３０の基板に微多孔膜は設けないが、これは、マイクロ流体チャネル４０の階層４０_１が、これと同じマイクロ流体チャネル４０の第２の階層４０_２と流体連結する必要があるためである。

【0169】

次いで、構造体２００および２００’は、図１１（ｃ）に示すように、互いに固定される。このような固定は、光照射または加熱により実行することができ、その結果、側壁３０”および３０’’’は、互いに固定されて側壁３０’を形成する。したがって、この工程は、マイクロ流体チャネル４０の第２の階層４０_２を形成することを可能にする。

【0170】

最後に、微多孔膜の下でチャンバを形成するために、工程（ｄ）と同様の工程を、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂の２つの第２の側壁を備える組立体に対して実行する。図４（ａ）から図４（ｃ）を参照して上記した工程（ｅ_１）から（ｅ_３）を繰り返す処理を、この目的のために実行する。

【0171】

上記した装置１、１００は、チャンバ８（当然、マイクロ流体チャネル４、４０に固定された場合、閉じる）を備え、チャンバ８の中に生細胞が配置されることに留意されたい。このチャンバ８は、培養ゲルを備えることができるが、そうしない方が都合がよい。さらに、このチャンバは、マイクロ流体チャネルによって置き換えることができ、したがって、有利には、横方向に配置された開口を備える。後者の場合、マイクロ流体装置は流体を循環させるマイクロ流体チャネル４、４０と、生細胞が配置された他のマイクロ流体チャネル４とを備えることになる。

【0172】

したがって、本発明によるマイクロ流体システムにより、複数の可能性がもたらされる。

【0173】

特に、生細胞を刺激することを目的とした分子の濃度勾配を適用することが可能であり、この濃度勾配は、これらの生細胞で所望の形状（上記の例は、「ｅｒｆ」関数の形における勾配、または装置１、１００のチャンバ８の中央部分における線形形状の勾配を示す）を有する。濃度プロファイルがチャンバ８内で確立され、生細胞が微多孔膜５から離れて、より正確には、チャンバ８内の膜５と反対側に配置された装置の基板上に配置される（このチャンバをマイクロ流体チャネルと置き換えることが可能である）。

【0174】

そのため、このプロファイルは流体供給手段で適用されない。その場合、流体供給手段はシンプルであり、生細胞で適用した濃度プロファイルが顕著に変動することなく、流量がわずかに変化することが可能である流体のみを供給する。したがって、生細胞での濃度プロファイルの制御がより容易であり、マイクロ流体システムの外部で起こり得る摂動の影響を受けにくい。

【0175】

このように、主に、チャンバの高さと刺激分子の拡散係数とによって決まる安定化のための時間の後、チャンバ８において、特に、このチャンバの基板６１で、安定した濃度プロファイルを得ることが可能である。

【0176】

本発明によるマイクロ流体装置の製造プロセスはまた、光透過性材料製の基板、例えば、標準手順により細胞を培養することが可能なガラススライドを使用することが可能である。したがって、生細胞の挙動（成長等）は、ガラススライドの背後に配置した光学的可視化手段を用いて容易に観測することができる。

【0177】

光学観測は、光透過性材料製の基板を非常に薄くすることが可能であるため、高い空間解像度で実行することができる。例えば、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）または誘導放出制御顕微鏡法（ＳＴＥＤ）等の技術を用いて得られた高解像度、もしくは超解像度蛍光顕微鏡法さえもが、厚さ１５０μｍのガラススライドで形成された基板を使用して、実行することができる。

【0178】

同時にこの視覚化手段は、生細胞に適用した刺激分子の濃度プロファイルを知ることを可能にする。したがって、生細胞について観測された挙動と、生細胞に適用する濃度プロファイルとの間の相関関係を、実験的に実行することがより容易となる。

【0179】

最後に、多数の試験を迅速に実行することができる。

【0180】

本発明は、特に生物学の分野で、生細胞の培養、観測、および研究のために使用することができる。特に、例えば、ニューラルネットワークを作り出すために、ある種の分子に対する神経細胞の走化性反応を判断することができる。特に、化学療法のために使用される分子に対するガン細胞の反応を測定することも可能である。マイクロ流体システムはまた、バイオチップを作成するために使用することもできる。

【0181】

本発明と関連した利点は、他の分野の用途に対して、例えば、美容学におけるある種の分子の毒性閾値を判断するために適用することが可能である。

【図1】

【図2】

【図3(a)】

【図3(b)】

【図3(c)】

【図3(d)】

【図4(a)】

【図4(b)】

【図4(c)】

【図5(a)】

【図5(b)】

【図5(c)】

【図7(a)】

【図7(b)】

【図7(c)】

【図9】

【図11(a)】

【図11(b)】

【図11(c)】

【図6】

【図8】

【図10】