特許 5937515 皮膚及び毛髪色制御因子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5937515

(24)【登録日】2016年5月20日

(45)【発行日】2016年6月22日

(54)【発明の名称】皮膚及び毛髪色制御因子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160609BHJP

   A61K 8/73 20060101ALI20160609BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20160609BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20160609BHJP

   A61Q 5/10 20060101ALI20160609BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20160609BHJP

   A61Q 19/04 20060101ALI20160609BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20160609BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   A61K8/73

   A61K45/00

   A61P17/00

   A61Q5/10

   A61Q19/02

   A61Q19/04

   C12Q1/68 Z

【請求項の数】14

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2012-541850(P2012-541850)

(86)(22)【出願日】2011年10月31日

(86)【国際出願番号】JP2011075064

(87)【国際公開番号】WO2012060323

(87)【国際公開日】20120510

【審査請求日】2014年5月29日

【審判番号】不服2015-8064(P2015-8064/J1)

【審判請求日】2015年4月30日

(31)【優先権主張番号】特願2010-245039(P2010-245039)

(32)【優先日】2010年11月1日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】村瀬 大樹

(72)【発明者】

【氏名】八谷 輝

【合議体】

【審判長】 中島 庸子

【審判官】 三原 健治

【審判官】 長井 啓子

(56)【参考文献】

【文献】 ＰＩＧＭＥＮＴ ＣＥＬＬ Ｒｅｓ．，２００２，Ｖｏｌ．１５，ｐ．４４０−４４６

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N 15/00-15/90

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記工程を含むケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤の評価及び／又は選択方法：
培養細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１の発現又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性の変化を測定する工程；
該測定の結果に基づいて、該被験物質のメラニン量調節作用を評価する工程；及び
該評価の結果に基づいて、該被験物質をケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤として選択する工程であって、該記遺伝子の発現又は該分子の発現若しくは活性が抑制された場合は、該試験物質をケラチノサイトにおけるメラニン量増加剤として選択し、該遺伝子の発現又は該分子の発現若しくは活性が増強された場合は、該試験物質をケラチノサイトにおけるメラニン量低下剤として選択する、工程。

【請求項2】

前記培養細胞が、皮膚細胞、毛包細胞、又はＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１を発現するように遺伝子工学的に改変された細胞である、請求項１記載の方法。

【請求項3】

下記工程を含む皮膚又は毛髪色制御剤の評価及び／又は選択方法：
培養細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１の発現又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性の変化を測定する工程；
該測定の結果に基づいて、該被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する工程；及び
該評価の結果に基づいて、該被験物質を皮膚又は毛髪色制御剤として選択する工程。

【請求項4】

前記遺伝子の発現又は前記分子の発現若しくは活性が抑制された場合に、前記試験物質が皮膚又は毛髪色を暗色化する作用があると評価され、皮膚又は毛髪の暗色化剤として選択される、請求項３記載の方法。

【請求項5】

前記遺伝子の発現又は前記分子の発現若しくは活性が増強された場合に、前記試験物質が皮膚又は毛髪色を明色化する作用があると評価され、皮膚又は毛髪の明色化剤として選択される、請求項３記載の方法。

【請求項6】

前記培養細胞が、皮膚細胞、毛包細胞、又はＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１を発現するように遺伝子工学的に改変された細胞である、請求項３〜５のいずれか１項記載の方法。

【請求項7】

メラニン量調節が所望されるケラチノサイトにおけるＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１の発現又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性をインビトロで調節する工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の調節方法。

【請求項8】

前記遺伝子の発現又は前記分子の発現若しくは活性が抑制され、ケラチノサイトにおけるメラニン量が増加する、請求項７記載の方法。

【請求項9】

前記遺伝子の発現又は前記分子の発現若しくは活性が増強され、ケラチノサイトにおけるメラニン量が減少する、請求項７記載の方法。

【請求項10】

非ヒト哺乳動物被験体のケラチノサイトにおけるＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１の発現又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性を調節する工程を含む、非ヒト哺乳動物被験体における皮膚又は毛髪色制御方法。

【請求項11】

皮膚ケラチノサイトにおける前記遺伝子の発現又は前記分子の発現若しくは活性が抑制され、皮膚色が暗色化される、請求項１０記載の方法。

【請求項12】

皮膚ケラチノサイトにおける前記遺伝子の発現又は前記分子の発現若しくは活性が増強され、皮膚色が明色化される、請求項１０記載の方法。

【請求項13】

毛包ケラチノサイトにおける前記遺伝子の発現又は前記分子の発現若しくは活性が抑制され、毛髪色が暗色化される、請求項１０記載の方法。

【請求項14】

毛包ケラチノサイトにおける前記遺伝子の発現又は前記分子の発現若しくは活性が増強され、毛髪色が明色化される、請求項１０記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ケラチノサイトにおけるメラニン量の調節、及び皮膚又は毛髪の色の制御に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚や毛髪の色を決定する因子として様々なものが報告されているが、その中でも、表皮に存在するメラニンの量や質が皮膚や毛髪の色に大きく寄与すると考えられている。すなわち、皮膚や毛髪の色の形成は色素細胞（メラノサイト）中のメラノソームと呼ばれる細胞小器官中でつくられたメラニンが、表皮や毛包のケラチノサイトへと転送されて表皮や毛髪全体へと広がることに大きく影響を受けるとされる。そのメラノサイトによるメラニンの産生量は、個体の皮膚や毛髪の色に関連する因子として古くから知られている。

【0003】

従来の皮膚美白剤は主に、メラノサイトにおけるメラニン産生を標的として開発されてきた。例えば、非特許文献１では、メラニン前駆体であるチロシンからメラニンへの変換に関わる酵素であるチロシナーゼの酵素活性を阻害してメラニン産生を抑制する作用を有する皮膚美白剤として、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸等が報告されている。

【0004】

一方、皮膚色の違いによってケラチノサイトにおけるメラニンの存在様式や成熟状態に差異が認められることも報告されている（非特許文献２）。つまり、ケラチノサイト内でのメラニン動態が皮膚色決定に何らかの役割を担っている可能性が考えられる。これまでの報告では、ケラチノサイトにおけるメラニンの取り込み（貪食）に、レセプター分子ＰＡＲ−２が関与すること、及びその活性調節による皮膚色制御の可能性が示唆されている（非特許文献３）。また、メラニンがケラチノサイトに転送された後のそのケラチノサイト内での局在に、タンパク質分子ＤｙｎｅｉｎやＤｙｎａｃｔｉｎが関与することが示唆されている（非特許文献４及び５）。さらに最近では、糸状仮足（Ｆｉｌｏｐｏｄｉａ）と呼ばれる細胞構造の形成に関わるタンパク質分子ＭｙｏＸが、メラノサイトからケラチノサイト、及びケラチノサイトからケラチノサイトへの両メラニン転送に関与していることが示唆されている（非特許文献６）。しかしながら、メラノサイトで産生されたメラニン（メラノソーム）のケラチノサイトによる取り込み、輸送及び代謝の機序については、未だ充分明らかにされておらず、その皮膚色に対する役割も検証されていない。
また最近では、異なる民族に由来するケラチノサイトを用いた検討から、取り込まれたメラニンの代謝能に民族差があることも示唆されている（非特許文献７）。本論文は、蛍光物質で標識したメラニンを表皮細胞に取り込ませた後に、表皮細胞内の蛍光が消退していく結果をもってメラニンが白人由来の表皮細胞で分解されやすいことを報告している。しかしながら、分解に寄与するメカニズムや特定の因子については何ら言及されてはいない。

【0005】

ＣＬＩＰ−１７０、ＲＡＢ７Ｂ、Ｒｕｂｉｃｏｎ、ＲＡＢ１１Ａ及びＡＴＧ７は、小胞の輸送や局在、又は小胞の分解や自食に関与する分子として知られている（非特許文献８〜１６）。しかし、ケラチノサイト内におけるメラニン動態、例えば、メラニン取り込み、輸送、局在又は蓄積、排出又は分解等へのこれらの分子の関与はこれまでのところ明らかにされていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】美白戦略（南江堂）ＩＶ．，美白剤の薬理と臨床，ｐ９５−１１６

【非特許文献2】Ｔｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １４９：４９８−５０５

【非特許文献3】Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ ２１：１７２−１８３

【非特許文献4】Ｂｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２１：８１３−８２０

【非特許文献5】Ｂｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２７：１７３６−１７４４

【非特許文献6】Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ（２０１０）ＦＡＳＥＢ Ｊ ２４：３７５６−３７６９

【非特許文献7】Ｅｂａｎｋｓ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １３１：１２２６−１２３３

【非特許文献8】Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１２：１４３７−１４４７

【非特許文献9】Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３１８：７９２−７９９

【非特許文献10】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｂｌｏｏｄ １１０：９６２−９７１

【非特許文献11】Ｙａｏ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３：１７５１−１７５８

【非特許文献12】Ｐｒｏｇｉｄａ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２３：１４８０−１４９１

【非特許文献13】Ｍａｔｓｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：３８５−３９６

【非特許文献14】Ｂｒｙａｎｔ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：１０３５−１０４５

【非特許文献15】Ｉｓｈｉｄａ−Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２７ ：２１６６−２１７０

【非特許文献16】Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６９：４２５−４３４

【発明の概要】

【0007】

一態様において、本発明は、以下、
下記工程を含むケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤の評価及び／又は選択方法：
細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１の発現又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性の変化を測定する工程；
該測定の結果に基づいて、該被験物質のメラニン量調節作用を評価する工程；及び
該評価の結果に基づいて、該被験物質をケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤として選択する工程、
を提供する。
別の態様において、本発明は、以下、
下記工程を含む皮膚又は毛髪色制御剤の評価及び／又は選択方法：
細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１の発現又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性の変化を測定する工程；
該測定の結果に基づいて、該被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する工程；及び
該評価の結果に基づいて、該被験物質を皮膚又は毛髪色制御剤として選択する工程、
を提供する。

【0008】

さらに別の態様において、本発明は、メラニン量調節が所望されるケラチノサイトにおけるＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１の発現又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性を調節する工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の調節方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、皮膚又は毛髪色制御を所望する被験体のケラチノサイトにおけるＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１の発現又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性を調節する工程を含む、被験体における皮膚又は毛髪色制御方法を提供する。

【0009】

なお別の態様において、本発明は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を調節するための、ＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子の使用を提供する。
なお別の態様において、本発明は、皮膚又は毛髪色を制御するための、ＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子の使用を提供する。

【0010】

さらなる一態様において、本発明は、ＡＴＧ７遺伝子、ＲＡＢ１１Ａ遺伝子、ＣＬＩＰ−１７０遺伝子、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子及びＲＡＢ７Ｂ遺伝子からなる群から選択され、ケラチノサイトにおけるメラニン量調節に関わることを特徴とする、皮膚又は毛髪色制御遺伝子を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＣＬＩＰ−１７０、ＲＡＢ７Ｂ、又はＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現抑制後のケラチノサイトにおけるメラニン分布を示す顕微鏡画像。Ａ．左上：コントロール、右上：ＣＬＩＰ−１７０抑制、左下：ＲＡＢ７Ｂ抑制、右下：Ｒｕｂｉｃｏｎ抑制。Ｂ．Ａ中四角で囲まれた部分の拡大像。

【図2】ＣＬＩＰ−１７０、ＲＡＢ７Ｂ、又はＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現抑制後のケラチノサイトにおけるメラニン量変化。

【図3】ＣＬＩＰ−１７０、ＲＡＢ７Ｂ、又はＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現抑制後のケラチノサイトにおけるメラニン（メラノソーム）量変化：ウェスタンブロッティング像。

【図4】メラニン添加後におけるＲＡＢ７Ｂの発現変化。

【図5】ＲＡＢ１１Ａ又はＡＴＧ７遺伝子の発現抑制後のケラチノサイトにおけるメラニン（メラノソーム）量変化：ウェスタンブロッティング像。Ａ；ＲＡＢ１１Ａ発現抑制。Ｂ；ＡＴＧ７発現抑制。

【図6】皮膚におけるＲＡＢ１１Ａ遺伝子発現と皮膚色との相関性。Ａ；ＲＡＢ１１Ａ遺伝子発現量の民族間比較。Ｂ；ＲＡＢ１１Ａ遺伝子発現量と皮膚色（Ｌ*値）との相関性。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明は、ケラチノサイトにおけるメラニンの局在、蓄積、排出又は分解に関与し、ケラチノサイトにおけるメラニン量調節、及び皮膚又は毛髪色制御に関わる因子に関する。また本発明は、当該因子を用いてケラチノサイトにおけるメラニン量を調節する方法、皮膚又は毛髪色を制御する方法、及び当該因子を用いてケラチノサイトにおけるメラニンの量調節剤、又は皮膚若しくは毛髪色制御剤を評価及び／又は選択する方法に関する。

【0013】

本発明者らは、皮膚又は毛髪色とケラチノサイト内遺伝子発現との関連性を明らかにするために、ケラチノサイト内のメラニン量調節に関わる遺伝子を探索し、また当該遺伝子発現のケラチノサイト内でのメラニン動態への影響について調べたところ、ケラチノサイトにおけるメラニン局在、蓄積、排出又は分解に関わるいくつかの遺伝子を見出し、またそれらの遺伝子の発現量と皮膚色との間に高い相関性があることを確認した。これらの結果から、本発明者らは、当該遺伝子又はその発現産物を利用すれば、ケラチノサイトのメラニン量や、皮膚又は毛髪色を制御可能であることを見出した。

【0014】

本発明によれば、ケラチノサイト内でのメラニンの局在、蓄積、排出分解に影響を及ぼすことにより皮膚又は毛髪色を制御することができる、皮膚又は毛髪色制御遺伝子が提供される。当該遺伝子やその発現産物の発現又は活性を調節することにより、ケラチノサイト内のメラニンの量や分布を調節して、皮膚又は毛髪色を制御することができる。また当該遺伝子又はその発現産物は、その発現又は活性を指標として、皮膚又は毛髪色を制御することができる素材を評価及び／又は選択することができるため、皮膚又は毛髪色制御剤、例えば、美白剤、タンニング剤、毛髪カラーリング又はブリーチング剤、白髪染め等の開発に有用である。

【0015】

本発明は、ＡＴＧ７遺伝子、ＲＡＢ１１Ａ遺伝子、ＣＬＩＰ−１７０遺伝子、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子及びＲＡＢ７Ｂ遺伝子からなる群から選択される皮膚又は毛髪色制御遺伝子を提供する。
上記に列挙した遺伝子は、下記表１のとおり、公知のデータベースに登録されているが、ケラチノサイト内でのメラニン動態、例えば、メラニンの取り込み、輸送、局在、蓄積、排出又は分解等における関与は従来知られていなかった。

【0016】

【表1】

【0017】

ＣＬＩＰ−１７０は、小胞を微小管に繋ぎ止めることで、細胞内輸送を直接的に制御している分子として従来知られていた。より具体的には、ＣＬＩＰ−１７０はＤｙｎｅｉｎやＤｙｎａｃｔｉｎといったモータータンパク質と微小管との相互作用を仲介していることが知られている（Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１２，１４３７−１４４７）。
ＲＡＢ７Ｂは、小胞の輸送に深く関与する低分子量Ｇタンパク質Ｒａｂ ＧＴＰａｓｅファミリーに属し、２００４年に初めて同定された分子である（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３１８，７９２−７９９）。主に単球やマクロファージ、樹状細胞など免疫系細胞で豊富に発現し、免疫制御に関与するＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）やＴＬＲ９（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９）のエンドサイトーシスに関与することが報告されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｂｌｏｏｄ １１０，９６２−９７１；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３，１７５１−１７５８）。また、Ｈｅｌａ細胞においては、ＲＡＢ７Ｂが小胞の分解酵素であるＣａｔｈｅｐｓｉｎ−Ｄの成熟を調節すること、ＲＡＢ７Ｂの発現抑制によって細胞内の分解器官リソソームへの正常な輸送が妨げられることも知られている（Ｐｒｏｇｉｄａ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２３，１４８０−１４９１）。
Ｒｕｂｉｃｏｎは、細胞内における自食作用（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する分子として最近報告された（Ｍａｔｓｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１，３８５−３９６）。
ＲＡＢ１１Ａは、ＲＡＢ７Ｂと同様に小胞の輸送に深く関与する低分子量Ｇタンパク質Ｒａｂ ＧＴＰａｓｅファミリーに属し、小胞のリサイクル、細胞極性の形成、エクソサイトーシスなど多彩な小胞輸送に関与していることが知られている（Ｂｒｙａｎｔ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１０３５−１０４５）。また、表皮顆粒層においてＲＡＢ１１Ａは層板顆粒（ラメラボディ）の細胞外分泌に関与することも報告されている（Ｉｓｈｉｄａ−Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２７ ，２１６６−２１７０）。
ＡＴＧ７は、オートファジーを制御する因子の１つである。オートファジーは自食作用とも呼ばれ、細胞内小器官などの大きなタンパク質構造体を膜で包み、タンパク質の分解器官であるリソソームと融合することで内容物を分解する機構である。ＡＴＧ７は、複数のオートファジー関連因子の中の１つであり、オートファゴソームの形成に関与することが知られている（Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ，２００５，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６９，４２５−４３４）。

【0018】

後記実施例に例示するように、ケラチノサイトにおいてＡＴＧ７遺伝子、ＲＡＢ１１Ａ遺伝子、ＣＬＩＰ−１７０遺伝子、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子及びＲＡＢ７Ｂ遺伝子の発現をそれぞれ抑制した場合、該ケラチノサイトのメラニン量が増加する。また、ケラチノサイト内メラニン量の増加は上記遺伝子の発現産物の発現抑制を伴う。さらに、ケラチノサイトにおけるこれらの遺伝子の発現抑制により、該ケラチノサイトで通常認められる細胞核近傍へのメラニン局在が阻害され、メラニンが細胞質内に散在するようになる。また、メラニンの排出又は分解が抑制され、細胞内に蓄積するようになる。また後記実施例に示すように、上記遺伝子の発現量と皮膚色との間に高い相関性があることが確認された。すなわち、上記ＡＴＧ７遺伝子、ＲＡＢ１１Ａ遺伝子、ＣＬＩＰ−１７０遺伝子、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子及びＲＡＢ７Ｂ遺伝子及びその発現産物は、ケラチノサイト内でのメラニン局在、蓄積、排出又は分解に関与し、細胞のメラニン量調節や皮膚及び毛髪色の制御に寄与している。

【0019】

メラニンのケラチノサイト内での動態、例えば、メラノサイトから転送されるメラニンの取り込み、輸送、局在、蓄積、排出、分解等は、主にケラチノサイトにより構成される皮膚表皮層や、毛包の毛母細胞若しくはシャフトを構成する毛皮質細胞でのメラニンの量及び分布に深く関与し、ひいては、皮膚及び毛髪の色に影響を及ぼす。
したがって、上記ＡＴＧ７遺伝子、ＲＡＢ１１Ａ遺伝子、ＣＬＩＰ−１７０遺伝子、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子及びＲＡＢ７Ｂ遺伝子は、その発現を変化させることによって、ケラチノサイトにおけるメラニン蓄積、局在及び／又は分解を調節することができ、それによって皮膚表皮層や毛包の毛母細胞やさらにはシャフトを構成する毛皮質細胞におけるメラニン量及び分布を調節し、結果として皮膚及び毛髪の色を制御することができる皮膚又は毛髪色制御遺伝子である。

【0020】

本発明の皮膚又は毛髪色制御遺伝子の発現低下は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させ、細胞の色を暗色化させる。逆にこれらの遺伝子の発現増加により、ケラチノサイトのメラニン量は低下し、細胞の色は明色化する。
また、本発明の皮膚又は毛髪色制御遺伝子の発現低下は、ケラチノサイトにおける細胞核近傍へのメラニン局在を阻害してメラニンを細胞内に散在させ、又は、メラニンの排出や分解を抑制させ、細胞の色を暗色化させる。逆にこれらの遺伝子の発現増加により、ケラチノサイトの細胞核近傍へのメラニン局在化、排出又は分解が促進され、細胞の色は明色化する。
したがって、本発明の皮膚又は毛髪色制御遺伝子の発現又はこれらの遺伝子にコードされる分子（発現産物）の発現若しくは活性を増加させることにより、皮膚及び毛髪の色は明るくなる。逆に、本発明の皮膚又は毛髪色制御遺伝子の発現又はこれらの遺伝子にコードされる分子（発現産物）の発現若しくは活性を減少させることにより、皮膚及び毛髪の色は暗くなる。

【0021】

上記皮膚又は毛髪色制御遺伝子及び当該遺伝子にコードされる分子（発現産物）をまとめて、本明細書において、皮膚又は毛髪色制御因子と称する。当該皮膚又は毛髪色制御因子と皮膚又は毛髪色との関連性は本発明者らによって初めて見出された。

【0022】

上記本発明の皮膚又は毛髪色制御因子の発現又は活性を変化させることによって、ケラチノサイトにおけるメラニンの蓄積量、局在、排出若しくは分解等を変化させてそのメラニン量を調節し、皮膚又は毛髪の色を制御することができる。言い換えれば、本発明の皮膚又は毛髪色制御因子は、ケラチノサイトにおけるメラニン量調節のため、又は皮膚又は毛髪色制御のために使用することができる。あるいは、本発明の皮膚又は毛髪色制御因子は、ケラチノサイトにおけるメラニン量調節のため、又は皮膚若しくは毛髪色制御のための剤の製造において使用することができる。

【0023】

上記本発明によるメラニン量調節、又は皮膚若しくは毛髪色制御においては、被験体のケラチノサイトにおいて、当該遺伝子のうちの少なくとも１の発現、あるいは当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性を、当該分野で通常使用される任意の手段で変化させればよい。
当該遺伝子の発現、又は当該分子の発現若しくは活性を変化させる手段は特に限定されない。例えば、遺伝子発現を変化させる手段としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ等による遺伝子ノックダウン、特異的プロモーターによる標的遺伝子の転写活性化、ベクターを用いた外部からの遺伝子の挿入、その他遺伝子の発現を変化させる作用を有する任意の物質の添加等が挙げられる。このうち、当該遺伝子の発現を変化させる作用を有する任意の物質の添加等がより好ましい。

【0024】

上記遺伝子にコードされる分子としては、上記遺伝子にコードされるｍＲＮＡ及びポリペプチドが挙げられる。ここで、「分子の発現若しくは活性の変化」とは、分子全体での発現若しくは活性を変化させる任意の状態、例えば、分子の発現量の変化、分子の分解速度の変化、分子の活性化率の変化、分子の不活性化率の変化等を含み得るが、好ましくは分子の発現量の変化を意味する。
分子の発現若しくは活性を変化させる手段としては、上述の遺伝子発現を変化させる手段、タンパク質発現を変化させる手段、分子の酵素活性等を変化させる手段、分子とその標的因子との相互作用を変化させる手段、分子が作用を及ぼすシグナル経路を変化させる手段などが挙げられる。このうち、遺伝子発現を変化させる手段、タンパク質発現を変化させる手段などがより好ましい。

【0025】

上記被験体としては、天然の又は遺伝子工学的に改変された、上記遺伝子のうちの少なくとも１を発現する能力を有し、メラニン量調節が所望されるケラチノサイト、ならびにそれを含む培養物、組織、器官及び動物が挙げられる。
上記ケラチノサイトとしては、皮膚や毛包に存在するケラチノサイトが好ましく、表皮ケラチノサイト、毛母細胞及び毛皮質細胞がより好ましい。上記ケラチノサイトを含む培養物、組織、器官としては、培養ケラチノサイト、ならびに表皮組織、毛包組織、皮膚及びそれらの培養物が好ましい。上記動物としては、ヒト又は非ヒト哺乳動物が好ましい。

【0026】

一態様において、上記本発明によるメラニン量調節、又は皮膚若しくは毛髪色制御は、上記ケラチノサイト、又はそれを含む培養物、組織若しくは器官を被験体として、インビトロで行われ得る。好ましくは、被験体は、培養ケラチノサイト、培養皮膚組織、培養表皮、又は培養毛包である。
別の一態様において、上記本発明によるメラニン量調節、又は皮膚若しくは毛髪色制御においては、メラニン蓄積量、局在、排出若しくは分解の調節、又は皮膚若しくは毛髪色の制御を所望する動物が被験体であり得る。好ましくは、当該調節又は制御は、美容目的、例えば、皮膚の美白若しくはタンニング、毛髪のカラーリング（ライトニング若しくは暗色化）又はブリーチング、ブリーチング後の色戻し、白髪染め等の目的により、非治療的に行われ得る。本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。

【0027】

本発明の例示的態様は、メラニン量増加が所望されるケラチノサイトにおけるＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１の発現又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の増加方法である。
別の実施形態は、メラニン量低減が所望されるケラチノサイトにおける当該遺伝子の発現又は当該分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の低減方法である。

【0028】

本発明の別の例示的態様は、皮膚色褐色化又は暗色化を所望する被験体の皮膚ケラチノサイトにおけるＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１の発現又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させ、あるいは当該ケラチノサイト内のメラニンを散在させる工程を含む、被験体の皮膚色を褐色化又は暗色化する方法である。この方法によれば、例えば、皮膚タンニングが可能になる。
別の実施形態は、皮膚色明色化を所望する被験体の皮膚ケラチノサイトにおける当該遺伝子の発現又は当該分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させ、あるいは当該ケラチノサイト内のメラニン局在を限局化させる工程を含む、被験体の皮膚色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、皮膚美白が可能になる。

【0029】

本発明のさらに別の例示的態様は、毛髪色褐色化又は暗色化を所望する被験体の毛包ケラチノサイトにおけるＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１の発現又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させ、あるいは当該ケラチノサイト内のメラニンを散在させる工程を含む、被験体の毛髪色を褐色化又は暗色化する方法である。この方法によれば、例えば、ブリーチ後の髪の色戻し又は白髪染めが可能になる。
別の実施形態は、毛髪色明色化を所望する被験体の毛包ケラチノサイトにおける当該遺伝子の発現又は当該分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させ、あるいは当該ケラチノサイト内のメラニン局在を限局化させる工程を含む、被験体の毛髪色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、髪のライトニング又はブリーチングが可能になる。

【0030】

上記本発明の皮膚又は毛髪色制御因子、すなわちＡＴＧ７遺伝子、ＲＡＢ１１Ａ遺伝子、ＣＬＩＰ−１７０遺伝子、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子及びＲＡＢ７Ｂ遺伝子、又はそれらの発現産物の発現又は活性を変化させる物質は、ケラチノサイトにおけるメラニンの蓄積量、局在、排出若しくは分解等を変化させることによってそのメラニン量を調節し、皮膚又は毛髪の色を制御することができる物質である。したがって、本発明はまた、本発明の皮膚又は毛髪色制御因子を用いる、ケラチノサイトのメラニン量調節剤、又は皮膚若しくは毛髪色制御剤の評価及び／又は選択方法を提供する。

【0031】

本発明による、ケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤の評価及び／又は選択方法は、細胞に被験物質を投与する工程；当該細胞における上記本発明の皮膚又は毛髪色制御遺伝子のうちの少なくとも１の発現、又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性の変化を測定する工程；当該測定の結果に基づいて、当該被験物質のメラニン量調節作用を評価する工程；及び、当該評価の結果に基づいて、当該被験物質をケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤として選択する工程、を含む。

【0032】

被験物質を投与する細胞は、上記本発明の皮膚又は毛髪色制御遺伝子のうちの少なくとも１を発現する能力を有する限り、天然の細胞でも又は遺伝子工学的に改変された細胞でもよく、特に限定されない。細胞は、培養細胞、又は動物の組織若しくは器官培養物に由来する細胞が好ましく、培養ヒト細胞がより好ましい。また好ましくは、細胞は皮膚細胞であり、より好ましくは表皮細胞又は毛包細胞であり、さらに好ましくはヒト由来培養表皮細胞（例えば、ヒト正常表皮細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）、又はヒト組織培養毛包細胞である。

【0033】

被験物質の種類は特に限定されず、天然物でも合成物でもよく、また単一物質であっても組成物若しくは混合物であってもよい。投与の形態は、被験物質に依存して、任意の形態であり得る。

【0034】

皮膚又は毛髪色制御遺伝子の発現又は当該遺伝子にコードされる分子の発現若しくは活性は、当該分野で通常使用される任意の解析方法によって測定することができる。遺伝子発現解析方法としては、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるリポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ、等が挙げられる。
遺伝子にコードされる分子の発現若しくは活性の解析方法としては、ウェスタンブロッティング法、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ、バインディングアッセイ等が挙げられる。

【0035】

測定した当該遺伝子発現又は当該分子の発現又は活性に基づいて、被験物質の投与による当該遺伝子発現又は当該分子の発現若しくは活性の変化を評価することができる。例えば、被験物質の投与前後に本発明の皮膚又は毛髪色制御遺伝子の発現又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を測定し、必要に応じて測定値を定量化した後、投与前後の結果を比較することができる。また例えば、被験物質の投与群と、非投与群若しくは対照物質投与群から本発明の皮膚又は毛髪色制御遺伝子の発現又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を測定し、必要に応じて測定値を定量化した後、結果を投与群と非投与群、又は投与群と対照物質投与群との間で比較することができる。また例えば、異なる濃度の被験物質を投与して本発明の皮膚又は毛髪色制御遺伝子の発現又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を測定し、被験物質の濃度による測定結果の差を調べることができる。
当該遺伝子の発現又は当該分子の発現若しくは活性に影響を及ぼす被験物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量の調節作用を有する物質として評価することができる。

【0036】

例えば、本発明の皮膚又は毛髪色制御遺伝子の発現又は当該遺伝子にコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量増加剤として選択される。当該剤は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させて皮膚又は毛髪色を褐色化又は暗色化する、皮膚又は毛髪色の褐色化又は暗色化剤（例えば、皮膚タンニング剤、毛髪暗色化剤、ブリーチ後の髪の色戻し剤、白髪染め剤等）として使用することができる。一方、当該遺伝子の発現又は当該分子の発現若しくは活性を増強する物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量低下剤として選択される。当該剤は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させて皮膚又は毛髪色を明色化する、皮膚又は毛髪色の明色化剤（例えば、皮膚美白剤、髪のライトニング又はブリーチング剤等）として使用することができる。

【0037】

本発明はまた、皮膚又は毛髪色制御剤の評価及び／又は選択方法を提供する。当該方法は、細胞に被験物質を投与する工程；当該細胞における上記本発明の皮膚又は毛髪色制御遺伝子のうちの少なくとも１の発現、又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１の発現若しくは活性の変化を測定する工程；当該測定の結果に基づいて、当該被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する工程；及び、当該評価の結果に基づいて、当該被験物質を皮膚又は毛髪色制御剤として選択する工程、を含む。
当該方法で使用される細胞、被験物質、遺伝子又は分子の発現又は活性の測定方法、及び該測定結果の評価方法は、上述と同様である。
当該遺伝子の発現又は当該分子の発現若しくは活性に影響を及ぼす被験物質は、皮膚又は毛髪色制御作用を有する物質として評価することができ、皮膚又は毛髪色の制御に使用できる皮膚又は毛髪色制御剤として選択される。

【0038】

例えば、本発明の皮膚又は毛髪色制御遺伝子の発現又は当該遺伝子にコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させて皮膚又は毛髪色を褐色化又は暗色化する、皮膚又は毛髪色の褐色化又は暗色化剤（例えば、皮膚タンニング剤、毛髪暗色化剤、ブリーチ後の髪の色戻し剤、白髪染め剤等）として選択される。一方、当該遺伝子の発現又は当該分子の発現若しくは活性を増強する物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させて皮膚又は毛髪色を明色化する、皮膚又は毛髪色の明色化剤（例えば、皮膚美白剤、髪のライトニング又はブリーチング剤等）として選択される。

【実施例】

【0039】

以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。

【0040】

実施例１
皮膚又は毛髪色制御遺伝子発現がケラチノサイトのメラニン量に与える影響
１．メラニンの単離
メラノーマ細胞株ＭＮＴ−１細胞は、１０％ＡＩＭ−Ｖ培地と１０％ＦＢＳ（仔牛胎児血清）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（いずれもＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用して３７℃、５％ＣＯ_２下にて培養した。ＭＮＴ−１細胞からメラノソーム画分を単離調製するため、Ｔ−１７５フラスコに培養したＭＮＴ−１細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡで回収し、ＰＢＳにて洗浄した。続いて、３ｍＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、０．０１％ＳＤＳ）を加えて緩やかに混合し、４℃にて１時間振盪攪拌した。この細胞抽出液を１．５ｍＬチューブに分注し、１，０００ｇの速度で１０分間（４℃）遠心し、上清を回収した。本遠心操作を計２回繰り返し、得られた上清を２０，０００ｇで１０分間（４℃）遠心した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、同条件での遠心操作をさらに操り返し、得られたペレットをメラノソーム画分（Ｍｅｌａｎｉｎ）とした。

【0041】

２．ｓｉＲＮＡ導入
正常ヒト新生児表皮由来表皮細胞（ＮＨＥＫ）は、増殖用培地として表皮細胞用増殖培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ（登録商標））及び培地用添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２）（いずれもクラボウ社より購入）を使用して３７℃、５％ＣＯ_２下にて培養した。続いて、細胞を０．７５×１０^５細胞／ｍＬ／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレートに播種した。試験用培地Ｅｐｉｌｉｆｅ（登録商標）（培地用添加剤として０．５μｇ／ｍＬ ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ及び５０ｎｇ／ｍＬ ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂを添加）１００μＬに、４μＬのトランスフェクション試薬ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を添加し、よく攪拌した。
ＣＬＩＰ−１７０遺伝子、ＲＡＢ７Ｂ遺伝子、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子、又はコントロール（標的遺伝子が存在しない非特異的な配列）のｓｉＲＮＡをＡｍｂｉｏｎ ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入し、上記トランスフェクション試薬の最終濃度が１０ｎＭとなるように各々のｓｉＲＮＡを加えて攪拌後、１０分間室温にて静置し、ｓｉＲＮＡ−トランスフェクション試薬コンプレックスを調製した。その試薬コンプレックスを各ウェルに添加した後プレートを静かに振盪させて均一にした。翌日に培地交換を行った。ｓｉＲＮＡ導入により標的遺伝子及び／又は当該分子の発現が特異的に抑制されたことを確認した（データ示さず）。
ｓｉＲＮＡ導入から２日後にＭＮＴ−１細胞から単離したメラニンを添加して、さらに２４時間後に細胞内のメラニン量を観察するとともに、メラニン定量及びウェスタンブロッティング法によるメラノソームタンパク質（Ｐｍｅｌ１７）の発現定量を行った。

【0042】

３．細胞内メラニンの定量
メラニン添加から２４時間後に細胞培養プレートをＰＢＳで３回洗浄し、各ウェルに２Ｍ ＮａＯＨを１２０μＬ加えてから１００℃で溶解させた。プレートを遠心し、得られた上清についての吸光度（４０５ｎｍ）を測定し、メラニン量を算出した。メラニン量は、定法により求めた各ウェル中のタンパク質量により補正して評価に供した。

【0043】

４．メラノソームタンパク質の発現解析
メラニン添加から２４時間後に細胞培養プレート（１２ウェル）をＰＢＳで洗浄した後、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を０．１ｍｌ加えて細胞を回収し、超音波処理により細胞を破砕した。その後、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、その上清についてタンパク定量を行った後、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲル）に供した。一次抗体はａｎｔｉ−Ｐｍｅｌ１７ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＨＭＧ４５、１：５００、ＤＡＫＯ社製）を用いた。二次抗体はａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ＡＢ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を５０００倍に希釈して用いた。その後、ＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて発色させ、ＬＡＳ４０００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて可視化した。内部標準としてのβ−ａｃｔｉｎの発現を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製のｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ β−ａｃｔｉｎを用いて評価した。

【0044】

結果を図１〜３に示す。ＣＬＩＰ−１７０、ＲＡＢ７Ｂ又はＲｕｂｉｃｏｎの発現抑制により、メラニンの細胞内蓄積の亢進とともに、そのメラニン局在の変化が観察された（図１）。コントロールで認められるメラニンの核近傍への局在が阻害され、細胞質内に散在する傾向が観察された（図１Ｂ）。また、メラニン定量（図２）及びメラノソームの構成タンパク質であるＰｍｅｌ−１７タンパク質の発現解析（図３）の結果から、ＣＬＩＰ−１７０、ＲＡＢ７Ｂ又はＲｕｂｉｃｏｎの発現抑制により、ケラチノサイト内のメラニン量がコントロールと比較して有意に増加することが示された。

【0045】

実施例２
メラニン添加に伴う皮膚又は毛髪色制御因子の発現変化
ケラチノサイトに取り込まれたメラニン（メラノソーム）による本発明の皮膚色制御遺伝子の発現変化を調べた。メラニン添加から２４時間後におけるＲＡＢ７Ｂのタンパク質及びｍＲＮＡの発現を一例として示す。
タンパク質発現は以下のように評価した。メラニン添加から２４時間後に培養プレートをＰＢＳで洗浄した後、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を０．１ｍｌ用いて細胞を回収し、超音波処理により細胞を破砕した。その後、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、その上清のタンパク定量を行った後、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲル）に供した。一次抗体はａｎｔｉ−ＲＡＢ７Ｂ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：１０００、Ａｖｎｏｖａ社製）を用いた。二次抗体はａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ＡＢ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を５０００倍に希釈して用いた。その後、ＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて発色させ、ＬＡＳ４０００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて可視化した。内部標準としては、β−ａｃｔｉｎの発現を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製のｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ β−ａｃｔｉｎを用いて評価した。

【0046】

ｍＲＮＡの発現は以下のように評価した。培養細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて定法に従いｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡのうち１μｇを用いて、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のＰｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにて、定法に従って行った。続いて、合成したｃＤＮＡ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法による遺伝子発現解析を行った。各遺伝子に特異的なプローブ及びプライマーは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｐ／Ｎ４３３１１８２）より入手した。各々の発現量は、内部標準遺伝子ＲＰＬＰ０の発現量により補正して評価した。反応条件は定法に従って設定し、アプライドバイオシステムズ社製のシークエンスディテクター（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。

【0047】

結果を図４に示す。ＲＡＢ７Ｂの発現はメラニン添加に伴い、タンパク質及びｍＲＮＡレベルで顕著に増加することが確認された（図４）。

【0048】

実施例３
ＲＡＢ１１Ａ又はＡＴＧ７遺伝子発現がケラチノサイトのメラニン量に与える影響
１．ｓｉＲＮＡ導入
正常ヒト新生児表皮由来表皮細胞（ＮＨＥＫ）は、増殖用培地として表皮細胞用増殖培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ（登録商標））及び培地用添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２）（いずれもクラボウ社より購入）を使用して３７℃、５％ＣＯ_２下にて培養した。続いて、細胞を０．７５×１０^５細胞／ｍＬ／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレートに播種した。試験用培地Ｅｐｉｌｉｆｅ（登録商標）（培地用添加剤として０．５μｇ／ｍＬ ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ及び５０ｎｇ／ｍＬ ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂを添加）１００μＬに、４μＬのトランスフェクション試薬ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を添加し、よく攪拌した。
ＲＡＢ１１Ａ遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、又はコントロール（標的遺伝子が存在しない非特異的な配列）のｓｉＲＮＡをＡｍｂｉｏｎ ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ （Ａｍｂｉｏｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入し、上記トランスフェクション試薬の最終濃度が１０ｎＭとなるように各々のｓｉＲＮＡを加えて攪拌後、１０分間室温にて静置し、ｓｉＲＮＡ−トランスフェクション試薬コンプレックスを調製した。その試薬コンプレックスを各ウェルに添加した後プレートを静かに振盪させて均一にした。翌日に培地交換を行った。ｓｉＲＮＡ導入により標的遺伝子及び／又は当該分子の発現が特異的に抑制されたことを確認した。
ｓｉＲＮＡ導入から２日後に、実施例１記載の方法に従ってＭＮＴ−１細胞から単離したメラニンを添加して、さらに２４時間後にウェスタンブロッティング法による細胞内のＲＡＢ１１Ａ及びＡＴＧ７遺伝子の発現産物、ならびにメラノソームタンパク質（Ｐｍｅｌ１７）の発現定量を行った。ＲＡＢ１１ＡとＡＴＧ７の発現解析については、一次抗体としてａｎｔｉ−ＲＡＢ１１ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）又はａｎｔｉ−ＡＴＧ７ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：２０００、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社製）をそれぞれ用いて、これらの発現抑制を確認した。内部標準としてのβ−ａｃｔｉｎの発現を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製のｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ β−ａｃｔｉｎを用いて評価した。

【0049】

結果を図５に示す。メラノソームの構成タンパク質であるＰｍｅｌ−１７タンパク質の発現解析の結果から、ＲＡＢ１１Ａ（図５Ａ）又はＡＴＧ７（図５Ｂ）の発現抑制に伴って、ケラチノサイト内のメラニン量がコントロールと比較して顕著に増加することが示された。

【0050】

実施例４
皮膚又は毛髪色制御遺伝子発現と皮膚色との相関
ＲＡＢ１１Ａ遺伝子発現と皮膚色との相関を調べた。皮膚組織は、米国テキサス州ダラス近郊のコントラクトラボラトリー（ＲＣＴＳ）に依頼し、現地皮膚科医によってＣａｕｃａｓｉａｎ、Ａｓｉａｎ、Ｈｉｓｐａｎｉｃ及びＡｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ（各ｎ＝３）の上腕内側部から、皮膚の測色後にパンチバイオプシーによって採取された。本試験は全てＩＲＢ（ＩｎｔｅｇＲｅｖｉｅｗ）により承認済みであり、適切なインフォームドコンセントを得た上で実施されている。皮膚組織からＲＮＡを抽出後、ＤＮＡマイクロアレイ法としてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ ｐｌｕｓ ２．０ ａｒｒａｙ）を用いて遺伝子発現を網羅的に解析するとともに、肌色強度（明度Ｌ＊値）との相関性を調べた。結果を図６に示す。

【0051】

肌色の明るさの指標であるＬ＊値は、Ｃａｕｃａｓｉａｎ、Ａｓｉａｎ、Ｈｉｓｐａｎｉｃ、そしてＡｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎの順に高く、民族差異が確認された（データ示さず）。また、ＤＮＡマイクロアレイ解析の結果から、ＲＡＢ１１Ａ遺伝子の発現データを抽出したところ、Ｃａｕｃａｓｉａｎと比べてＡｓｉａｎ、ＨｉｓｐａｎｉｃそしてＡｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎの順に低く発現していることが明らかになった（図６Ａ）。さらに、ＲＡＢ１１Ａ遺伝子の発現量とＬ＊値の間に高い相関性が確認され（図６Ｂ）、皮膚色の程度が明るいほど遺伝子の発現量が高いことが示された。

【図2】

【図6】

【図1】

【図3】

【図4】

【図5】