【図1】評価された様々な市販の吸着媒体の各々、すなわち、活性化炭素（ＡＣ）；アガロース陽イオン交換樹脂、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔｆｌｏｗ（ＳＰＦＦ）；ポリマー性陽イオン交換樹脂、ＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓ；アガロース陰イオン交換樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＱＦＦ）；およびアガロースＨＩＣ樹脂、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ Ｆａｓｔｆｌｏｗ（ｐｈ ＦＦ）に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＩｇＧ収率を測定する実験の結果を示す棒グラフである。図１に示されるように、ＩｇＧ収率の最大で約５％の損失を示すＨＩＣ樹脂に関して以外は、スクリーニングされた全ての他の媒体が検出可能な収率の損失を示さなかった。

【図2】評価された様々な市販の吸着媒体の各々、すなわち、活性化炭素、Ｎｕｃｈａｒ（登録商標）ＲＧＣ、（ＡＣ）、ＳＰＦＦ、ＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓ、ＱＦＦおよびｐｈ ＦＦならびに未処理の清澄化された供給液に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＵＶ ２８０ｎｍ活性種の量を測定する実験の結果を示す棒グラフである。図２に示されるように、活性化炭素は、他の吸着媒体と比較して、着色された種の量を有意に減少させた。

【図3】に列挙された市販の吸着媒体の各々、ならびに未処理の清澄化された供給液に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の濃度を測定する実験の結果を示す棒グラフである。ＨＣＰ濃度はＣｙｇｎｕｓ ＣＨＯ−ＣＭ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキットを用いてｎｇ／ｍＬで測定された。図３に示されるように、活性化炭素を含む、スクリーニングされた全ての媒体が、ある程度までＨＣＰを除去した。しかしながら、陽イオン樹脂ＳＰＦＦおよびＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓが、最も効率的にＨＣＰを除去した。

【図4】に列挙された市販の吸着媒体の各々、ならびに未処理の清澄化された供給液に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＤＮＡ濃度を測定する実験の結果を示す棒グラフである。ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを用いて測定された。図４に示されるように、前記媒体の各々は、ある程度までＤＮＡを除去する。しかしながら、陰イオン交換媒体が最も効率的に、次いで活性化炭素がＤＮＡを除去する。

【図5】未処理の清澄化された供給液を含む、１００ＣＶまでロードされた供給液の１０ＣＶ毎のに列挙された評価された媒体の各々に関する、ポリクローナルＩｇＧおよびニシン精子ＤＮＡを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＩｇＧの濃度を測定する実験の結果を示すｘ−ｙ散布図である。カラム容量（ＣＶ）をｘ軸上に示し、ＩｇＧ濃度（ｍｇ／ｍＬ）をｙ軸に示す。ＡＣ、ＳＰＦＦ、ＰｒｏＲｅｓ（商標）−ＳおよびＱＦＦを含む、評価された全ての媒体が、未処理の清澄化された供給液の最大で１００ＣＶの負荷に対してＩｇＧの有意な損失を示さなかった。

【図6】未処理の清澄化された供給液を含む、１００ＣＶまでロードされた供給液の１０ＣＶ毎の評価された媒体の各々に関する、ポリクローナルＩｇＧおよびニシン精子ＤＮＡを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＵＶ活性種ピーク面積（ＵＶ活性種の量に対応する）を測定する実験の結果を示すｘ−ｙ分散図である。カラム容量（ＣＶ）をｘ軸上に示し、プロテインＡ分析カラムのフロースルー中のＵＶ活性種ピーク面積をｙ軸上に示す。評価された全ての材料のうち、ＡＣは１００ＣＶにわたって７０％を超えるＵＶ活性種を除去した；ＱＦＦは１００ＣＶにわたって約１０％のＵＶ活性種を除去した；ならびに２つの陽イオン交換樹脂、ＳＰＦＦおよびＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓは最少量のＵＶ活性種を除去した。

【図7】未処理の清澄化された供給液を含む、１００ＣＶまでロードされた供給液の１０ＣＶ毎の評価およびに列挙された媒体の各々に関する、ポリクローナルＩｇＧおよびニシン精子ＤＮＡを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度を測定する実験の結果を示すｘ−ｙ分散図である。カラム容量（ＣＶ）をｘ軸上に示し、ＨＣＰ濃度（ｎｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。ＳＰＦＦおよびＰｒｏＲｅｓ Ｓは１００ＣＶにわたって多くのＨＣＰを除去した。ＱＦＦはいくらかのＨＣＰを除去したが、迅速に漏出した。高濃度のＤＮＡを有したこの特定の供給液について、活性化炭素は最少量のＨＣＰを除去した。

【図8】未処理の清澄化された供給液を含む、１００ＣＶまでロードされた供給液の１０ＣＶ毎の評価およびに列挙された媒体の各々に関する、ポリクローナルＩｇＧおよびニシン精子ＤＮＡを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＤＮＡ濃度を測定する実験の結果を示すｘ−ｙ分散図である。カラム容量（ＣＶ）をｘ軸上に示し、ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。ＡＣ、ＳＰＦＦ、ＰｒｏＲｅｓ（商標）−ＳおよびＱＦＦを含む、評価された媒体の各々は、１００ＣＶにわたってＤＮＡを除去したが、しかしながら、異なる程度であった。

【図9】不純物除去に用いることができる操作の様々な様式例の概略図である。左側の流れ図は、未処理の清澄化された供給液が、ＡＣを含有するカラム、次いで、ＳＰＦＦ、ＰｒｏＲｅｓ（商標）−ＳまたはＱＦＦ媒体を含有するカラム上にロードされる代表的な実験を示す。中央の流れ図は、未処理の清澄化された供給液が、ＡＣを含有するカラム、次いで、ＳＰＦＦまたはＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓおよび次いでＱＦＦを含有するカラム上にロードされる代表的な実験を示す。右側の流れ図は、未処理の清澄化された供給液が、ＡＣとＳＰＦＦとの１：１（ｖ／ｖ）混合物；またはＡＣとＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓとの１：１（ｖ／ｖ）混合物；またはＡＣとＰｒｏＲｅｓ（商標）−ＳとＱＦＦとの１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合物を含有するカラム上にロードされる代表的な実験を示す。

【図10】未処理の清澄化された供給液を含む、図９に示された材料の組合せの各々に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＵＶ活性種ピーク面積（ＵＶ活性種の量に対応する）を示す棒グラフである。活性化炭素および活性化炭素を含む混合物は、ＵＶ活性種を有意に減少させた。活性化炭素および陰イオン交換樹脂が両方ともプロセスにおいて用いられた場合、連続的にまたは混合物として用いた場合、より多くのＵＶ活性種が除去されたが、これは異なる材料の相乗効果を示している。

【図11】未処理の清澄化された供給液を含む、図９に示された材料の組合せの各々に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度を示す棒グラフである。全ての材料がＨＣＰをある程度まで除去したが、活性化炭素が、ＳＰＦＦもしくはＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓなどの陽イオン樹脂と一緒にまたはＱＦＦなどの陰イオン樹脂と一緒にプロセスにおいて用いられた場合、樹脂と共に連続的にまたは樹脂との混合物として用いられた場合、ＨＣＰを最も効率的に除去したが、これは異なる材料の相乗効果を示唆している。

【図12】未処理の清澄化された供給液を含む、図９に示された材料の組合せの各々に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＤＮＡ濃度を示す棒グラフである。全ての材料がＤＮＡをある程度まで除去したが、活性化炭素がＱＦＦと共に連続的に用いられたまたはＱＦＦとの混合物として用いられた場合、それは評価された他の材料および組合せと比較して、ＤＮＡ除去において最も有効であった。

【図13】評価された材料の各々、すなわち、ＡＣ；ＳＰＦＦ；ＱＦＦ；ｐｈ ＦＦ、ならびに２つの材料の組合せ、ＡＣ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦの１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合物およびＰｈＦＦ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦの１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合物に関する、プロテインＡカラム溶出プールのフロースルー溶出液中のＩｇＧ収率を測定する実験の結果を示す棒グラフである。評価された異なる材料のフロースルー溶出液のための供給液は、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液からＰｒｏｓｅｐ Ｕｌｔｒａ ＰｌｕｓプロテインＡ樹脂を用いて作製されたプロテインＡカラム溶出プールであった。スクリーニングされた全ての材料は８０％を超える収率を示した。

【図14】評価された材料の各々、すなわち、ＡＣ；ＳＰＦＦ；ＱＦＦ；ｐｈ ＦＦ、ならびに２つの材料の組合せ、ＡＣ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦの１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合物およびＰｈＦＦ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦの１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合物に関する、プロテインＡカラム溶出プールのフロースルー溶出液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度を測定する実験の結果を示す棒グラフである。評価された異なる材料のフロースルー溶出液のための供給液は、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液からＰｒｏｓｅｐ Ｕｌｔｒａ ＰｌｕｓプロテインＡ樹脂を用いて作製されたプロテインＡカラム溶出プールであった。全ての材料または材料混合物がプロテインＡ溶出プールから特定量のＨＣＰを除去したが、単独で用いた場合、活性化炭素および陽イオン交換樹脂がより有効であった。混合物として用いた場合、ＡＣ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦおよびＰｈＦＦ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦは、単一成分のみよりも多くのＨＣＰを除去した。ＱＦＦおよびＰｈＦＦは、単独で用いた場合、最少量のＨＣＰを除去した。

【図15】評価された材料の各々、すなわち、ＡＣ；ＳＰＦＦ；ＱＦＦ；ｐｈ ＦＦ、ならびに２つの材料の組合せ、ＡＣ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦの１：１：１混合物およびＰｈＦＦ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦの１：１：１混合物に関する、プロテインＡカラム溶出プールのフロースルー溶出液中のＤＮＡ濃度を測定する実験の結果を示す棒グラフである。評価された異なる材料のフロースルー溶出液のための供給液は、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液からＰｒｏｓｅｐ Ｕｌｔｒａ ＰｌｕｓプロテインＡ樹脂を用いて作製されたプロテインＡカラム溶出プールであった。全ての材料または材料混合物がプロテインＡ溶出プールから特定量のＤＮＡを除去したが、樹脂混合物ＡＣ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦおよびＰｈＦＦ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦは任意の単一成分を超えるわずかな利点を示す。

【図16】モノクローナル抗体溶液の個々の画分についての生成物（すなわち、モノクローナル抗体）の濃度（ｐｐｍ）と比較したＨＣＰの濃度を測定する実験の結果を示すグラフであり、ここで、溶液はプロテインＡクロマトグラフィーを用いて清澄化された細胞培養液（プロテインＡ溶出液と呼ぶ）から捕捉され、その後、３回の個別のフロースルー精製トレインにかけられた。１番目のトレインは、５つの層から構成された０．２ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）陰イオン交換膜デバイスを用いた；２番目のトレインは、ＨＤ １ｍＬのＮｕｃｈａｒ活性化炭素が充填されたカラムを用いた；および３番目のトレインは、１ｍＬの活性化炭素カラム、次いで、０．２ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）陰イオン交換膜を用いた。溶出液の１０個の１０ｍＬ画分がそれぞれの精製トレインから収集され、選択された画分が宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析された。グラフのＸ軸は、活性化炭素カラムからの溶出液のカラム容量（ＣＶ）中の１０ｍＬ画分に関する収集の終点を示す。グラフのＹ軸は、活性化炭素溶出液の個々の画分についての生成物（すなわち、モノクローナル抗体）の濃度（ｐｐｍ）と比較したＨＣＰの濃度を示す。このグラフは、活性化炭素のみ、および陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素によるアフィニティ捕捉された溶出液のフロースルー処理が、モノクローナル抗体溶液からの不純物の除去にとって予想外に有効であったことを示している。

【図17】モノクローナル抗体溶液の個々の画分についての生成物（すなわち、モノクローナル抗体）の濃度（ｐｐｍ）と比較したＨＣＰの濃度を測定する実験の結果を示すグラフであり、ここで、溶液は陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーを用いて清澄化された細胞培養液（ＣＥＸ溶出液と呼ぶ）から捕捉され、その後、ＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素の１ｍＬ充填されたカラムを用いる精製にかけられた。溶出液の７個の１０ｍＬ画分が収集され、これらが宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析された。グラフのＸ軸は、活性化炭素カラムからの溶出液の溶出した容量（ｍＬ）中の１０ｍＬ画分に関する収集の終点を示す。グラフのＹ軸は、個々の画分についての生成物（すなわち、モノクローナル抗体）の濃度（ｐｐｍ）と比較したＨＣＰの濃度を示す。このグラフは、活性化炭素を用いて、様々な異なるタンパク質溶液から不純物を除去することができることを示している。

【図18】モノクローナル抗体溶液の個々の画分についての生成物（すなわち、モノクローナル抗体、ＭＡｂ ＩＩ）の濃度（ｐｐｍ）と比較したＨＣＰの濃度を測定する実験の結果を示すグラフであり、ここで、溶液はプロテインＡカラムを備えた３つのカラムの連続多クロマトグラフィークロマトグラフィー（ＣＭＣ）系を用いて清澄化された細胞培養液から捕捉された後、カラム中に充填されたＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素、次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーデバイス（例えば、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））を用いて精製される。このグラフのＸ軸は、陰イオン交換デバイスの単位容量あたりにロードされる抗体の重量（ｋｇ／Ｌ）で測定された、画分収集の終点を示す。このグラフのＹ軸は、個々の画分についての生成物（すなわち、モノクローナル抗体）の濃度（ｐｐｍ）と比較したＨＣＰの濃度を示す。このグラフは、活性化炭素およびＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）の両方が、単独で用いた場合にＨＣＰの有意な部分を除去したが、組合せて用いた場合、それらは出発溶液の純度を１，３７０ｐｐｍのＨＣＰから１０ｐｐｍ以下まで増加させることを示している。

【図19】本明細書に記載されたような、接続されたフロースルー精製プロセスステップの概略図である。活性化炭素含有デバイスは、陰イオン交換デバイスに直接接続される。陰イオン交換デバイスからの流出液はスタティックミキサーを通過し、そこで水性酸がｐＨを低下させるために添加され、次いで、陽イオン交換フロースルーデバイスおよびウイルスフィルターを通過する。

【図20】陰イオン交換クロマトグラフィーデバイス（すなわち、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））後のＨＣＰ漏出を測定する実験の結果を示すグラフである。Ｙ軸はＨＣＰ濃度（ｐｐｍ）を示し、Ｘ軸はＡＥＸ負荷（ｋｇ／Ｌ）を示す。

【図21】フロースルー精製プロセスステップにおけるウイルス濾過デバイスの負荷の関数としてＭＡｂ凝集物の除去を測定する実験の結果を示すグラフである。Ｘ軸はウイルス濾過負荷（ｋｇ／ｍ^２）を示し、Ｙ軸はウイルス濾過後の試料中のＭＡｂ凝集物のパーセンテージを示す。

【図22】深層濾過、活性化炭素およびウイルス濾過後の圧力プロファイルを測定する実験の結果を示すグラフである。Ｙ軸は圧力（ｐｓｉ）を示し、Ｘ軸は時間（ｈ）を示す。