特許 5938473 多価抗原結合Ｆｖ分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5938473

(24)【登録日】2016年5月20日

(45)【発行日】2016年6月22日

(54)【発明の名称】多価抗原結合Ｆｖ分子

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20160609BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160609BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160609BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20160609BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160609BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160609BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/46

   C12N15/00 A

   A61K39/395 N

   A61K31/7088

   A61K48/00

   A61P35/00

【請求項の数】9

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2014-520541(P2014-520541)

(86)(22)【出願日】2011年7月22日

(65)【公表番号】特表2014-527515(P2014-527515A)

(43)【公表日】2014年10月16日

(86)【国際出願番号】EP2011062673

(87)【国際公開番号】WO2013013700

(87)【国際公開日】20130131

【審査請求日】2014年3月18日

(73)【特許権者】

【識別番号】504099171

【氏名又は名称】アフィメート テラポイティクス アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100110973

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100120293

【弁理士】

【氏名又は名称】中谷 智子

(72)【発明者】

【氏名】リトル， メルヴィン

(72)【発明者】

【氏名】ル ガル， ファブリセ

【審査官】 竹内 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００５／０５６６０５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１０９９２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／１０６９０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, 318(2), pp.507-513

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖からなる二量体抗原結合分子であって、第一及び第二のポリペプチド鎖のそれぞれが、
− 第一の抗原Ａに特異的な軽鎖可変ドメインである第一ドメインＶ_ＬＡ；
− 第二の抗原Ｂに特異的な重鎖可変ドメインである第二ドメインＶ_ＨＢ；
− 第二の抗原Ｂに特異的な軽鎖可変ドメインである第三ドメインＶ_ＬＢ；及び
− 第一の抗原Ａに特異的な重鎖可変ドメインである第四ドメインＶ_ＨＡ
を含有し、ここで、
− 前記ドメインが、前記第一のポリペプチド鎖及び前記第二のポリペプチド鎖のそれぞれにおいて、前記ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけてＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡの順で配置され、かつ、
− 前記第一のポリペプチド鎖の前記第一ドメインＶ_ＬＡが、前記第二のポリペプチド鎖の前記第四ドメインＶ_ＨＡと会合して、前記第一の抗原Ａに対する抗原結合部位を形成し、
− 前記第一のポリペプチド鎖の前記第二ドメインＶ_ＨＢが、前記第二のポリペプチド鎖の前記第三ドメインＶ_ＬＢと会合して、前記第二の抗原Ｂに対する抗原結合部位を形成し、
− 前記第一のポリペプチド鎖の前記第三ドメインＶ_ＬＢが、前記第二のポリペプチド鎖の前記第二ドメインＶ_ＨＢと会合して、前記第二の抗原Ｂに対する抗原結合部位を形成し、
− 前記第一のポリペプチド鎖の前記第四ドメインＶ_ＨＡが、前記第二のポリペプチド鎖の前記第一ドメインＶ_ＬＡと会合して、第一の抗原Ａに対する抗原結合部位を形成している、抗原結合分子であって、
前記抗原結合分子がＣＤ３及びＣＤ１９に特異的である抗原結合分子。

【請求項2】

前記第一のポリペプチド鎖及び前記第二のポリペプチド鎖が、非共有結合によって会合している、請求項１に記載の抗原結合分子。

【請求項3】

前記抗原結合分子が四価である、請求項１又は請求項２に記載の抗原結合分子。

【請求項4】

前記ドメインが、ヒトドメイン又はヒト化ドメインである、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の抗原結合分子。

【請求項5】

前記抗原結合分子が少なくとも１つの追加の機能単位を含む、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の抗原結合分子。

【請求項6】

第一の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_ＬＡ）及び第一の重鎖可変ドメイン（Ｖ_ＨＡ）が、ＣＤ３に特異的である、請求項１に記載の抗原結合分子。

【請求項7】

請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の前記第一のポリペプチド鎖及び前記第二のポリペプチド鎖をコードする核酸分子。

【請求項8】

請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の抗原結合分子、又は請求項７に記載の核酸分子、及び薬学的に許容される担体を含む組成物。

【請求項9】

請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の抗原結合分子を含有する医療用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新しいタンデムＦｖダイアボディ及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

クアドローマ由来抗体の代替品として、様々な様式の多価の組換え抗体断片が設計されてきた。

【0003】

ＵＳ７，１２９，３３０、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）２９３：４１−５６、及びＫｉｐｒｉｙａｎｏｖ Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００９）５６２：１７７−１９３には、特定の様式の多価抗体断片の構築及び生産方法が記載されている。このような多価抗体断片は、その設計が、ダイアボディについて説明されているとおり（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８）２種類の異なるポリペプチドのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ可変ドメイン間の分子間対形成に基づいていることから「タンデムダイアボディ」（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））と呼ばれている。記載された抗体は、ＣＤ１９及びＣＤ３に対して二重特異性である。二価のｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）_２タンデムとは対照的に、タンデムダイアボディは、４つの抗原結合部位を有することから四価である。タンデムダイアボディを形成するポリペプチドのＮ末端からＣ末端にかけてＶ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡの順にドメインが配置されたポリペプチドが記載されている。可変ドメイン及びそれらの間のリンカーペプチドの順序は、各ドメインが別の同一分子中の相補的ドメインと会合することにより二量体化した四価タンデムダイアボディが形成されるように設計されている。タンデムダイアボディは、イムノグロブリンの定常ドメインを持たない。タンデムダイアボディは、高親和性、より高い結合活性、より低いクリアランス率などの利点を有し、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて好ましい効率性を示すことが報告された。

【0004】

例えば抗ＣＤ１６、抗ＥｐＣＡＭ、及び抗ＣＤ３０などの抗体特異性を含むいくつかの更なるタンデムダイアボディが公知である。しかし、いずれのケースにおいても、タンデムダイアボディのポリペプチド鎖に沿った４種の抗体ドメインの順は、常にＮ末端からＣ末端にかけてＶ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡである。ここで、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、抗原Ａ及びＢに対して特異性を有する抗体の、それぞれ、重鎖及び軽鎖可変ドメインを示す。

【0005】

このような二重特異性タンデムダイアボディは、腫瘍細胞（例えば、Ｂ−ＣＬＬ細胞）と、ヒト免疫系のエフェクター細胞（ＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ又は顆粒球）との間に架橋を形成することにより、腫瘍細胞の殺傷を可能とする。腫瘍細胞と細胞傷害性細胞とが強く結合することで、腫瘍細胞の破壊が誘導される。このようなタンデムダイアボディは、治療応用、例えば、腫瘍治療における治療コンセプトに適することが証明されているが、一方で、なお改善された抗原結合分子が必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

１つの態様において、本発明は、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含む二量体抗原結合分子であって、各々の前記第一のポリペプチド鎖及び前記第二のポリペプチド鎖は、（ａ）第一の抗原Ａに特異的な軽鎖可変ドメインである第一ドメインＶ_ＬＡ；（ｂ）第二の抗原Ｂに特異的な重鎖可変ドメインである第二ドメインＶ_ＨＢ；（ｃ）第二の抗原Ｂに特異的な軽鎖可変ドメインである第三ドメインＶ_ＬＢ；及び（ｄ）第一の抗原Ａに特異的な重鎖可変ドメインである第四ドメインＶ_ＨＡを含み、ここで、前記第一のポリペプチド鎖及び前記第二のポリペプチド鎖のそれぞれにおいて、該ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて前記ドメインがＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡの順で配置され、かつ、第一のポリペプチド鎖の第一ドメインＶ_ＬＡが、第二のポリペプチド鎖の第四ドメインＶ_ＨＡと会合して、第一の抗原Ａに対する抗原結合部位を形成し；かつ、第一のポリペプチド鎖の第二ドメインＶ_ＨＢが、第二のポリペプチド鎖の第三ドメインＶ_ＬＢと会合して、第二の抗原Ｂに対する抗原結合部位を形成し；かつ、第一のポリペプチド鎖の第三ドメインＶ_ＬＢが、第二のポリペプチド鎖の第二ドメインＶ_ＨＢと会合して、第二の抗原Ｂに対する抗原結合部位を形成し；かつ、第一のポリペプチド鎖の第四ドメインＶ_ＨＡが、第二のポリペプチド鎖の第一ドメインＶ_ＬＡと会合して、第一の抗原Ａに対する抗原結合部位を形成している、二量体抗原結合分子を提供するものである。

【0007】

ある態様において、本明細書に記載された抗原結合分子は、ホモ二量体であり、その第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖は、同じアミノ酸配列を有する。ある態様において、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖は、非共有結合によって会合している。ある態様において、抗原結合分子は四価である。ある態様において、抗原結合分子は二重特異性である。ある態様において、ドメインは、ヒトドメイン又はヒト化ドメインである。ある態様において、抗原結合分子は、少なくとも１つの追加の機能単位を含む。ある態様において、抗原結合分子は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄細胞又は食細胞に特異的である。ある態様において、抗原結合分子は二重特異性であり、更に、該抗原結合分子は、腫瘍細胞に特異的である。ある態様において、第一の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_ＬＡ）及び第一の重鎖可変ドメイン（Ｖ_ＨＡ）は、腫瘍細胞に特異的である。ある態様において、抗原結合分子は、アルブミン及びＣＤ３に対して二重特異性である。

【0008】

他の態様において、本発明は、（ａ）第一の抗原Ａに特異的な軽鎖可変ドメインである第一ドメインＶ_ＬＡ；（ｂ）第二の抗原Ｂに特異的な重鎖可変ドメインである第二ドメインＶ_ＨＢ；（ｃ）第二の抗原Ｂに特異的な軽鎖可変ドメインである第三ドメインＶ_ＬＢ；及び（ｄ）第一の抗原Ａに特異的な重鎖可変ドメインである第四ドメインＶ_ＨＡを含むポリペプチド鎖であって、ここで、前記ポリペプチド鎖において、該ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて前記ドメインがＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡの順で配置されているポリペプチド鎖を提供するものである。ある態様において、第一ドメインＶ_ＬＡ及び第四ドメインＶ_ＨＡは、第一の抗原Ａに対する抗原結合部位を形成するように会合しておらず、かつ、第二ドメインＶ_ＨＢ及び第三ドメインＶ_ＬＢは、第二の抗原Ｂに対する抗原結合部位を形成するように会合していない。ある態様において、第一ドメインＶ_ＬＡと第二ドメインＶ_ＨＢ、第二ドメインＶ_ＨＢと第三ドメインＶ_ＬＢ、及び、第三ドメインＶ_ＬＢと第四ドメインＶ_ＨＡは、約１２個以下のアミノ酸残基で隔てられている。ある態様において、前記ポリペプチド鎖は、第一ドメインＶ_ＬＡの上流及び／又は第四ドメインＶ_ＨＡの下流にアミノ酸残基を含む。ある態様において、前記ポリペプチド鎖は、追加の機能単位と結合している。特定の態様において、前記可変ドメインは、アルブミン及びＣＤ３に特異的である。

【0009】

他の態様において、本発明は、本明細書に記載されたポリペプチド鎖をコードする核酸分子を提供する。他の態様において、本発明は、本明細書に記載された抗原結合分子、ポリペプチド鎖又は核酸分子、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0010】

更に他の態様において、本発明は、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、アレルギー、癌を治療するための医薬品としての、及び／又は、免疫抑制薬としての抗原結合分子の医療的使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明に係る抗原分子をコードする構築物の遺伝子構成の模式図である。図中、Ｖ_ＬＡは、抗原Ａに特異的な軽鎖可変イムノグロブリンドメインを示し、Ｖ_ＨＢは、抗原Ｂに特異的な重鎖可変イムノグロブリンドメインを示し、Ｖ_ＬＢは、抗原Ｂに特異的な軽鎖可変イムノグロブリンドメインを示し、Ｖ_ＨＡは、抗原Ａに特異的な重鎖可変イムノグロブリンドメインを示し、Ｌ１は、Ｖ_ＬＡとＶ_ＨＢとを接続するペプチドリンカー又はペプチド結合であり、Ｌ２は、Ｖ_ＨＢとＶ_ＬＢとを接続するペプチドリンカー又はペプチド結合であり、Ｌ３は、Ｖ_ＬＢとＶ_ＨＡとを接続するペプチドリンカー又はペプチド結合である。

【図2】機能的ではないモノマーのポリペプチド鎖（Ａ）から、第一のポリペプチド鎖１及び第二のポリペプチド鎖２の可変ドメインが互いに分子間で対を形成することにより（Ｂ）、本発明に係るタンデムダイアボディの様式の機能的な抗原結合分子になることによる、本発明の二量体抗原結合分子形成の模式図である。図中「１」は、第一のポリペプチド鎖を示し、「２」は、第二のポリペプチド鎖を示し、Ｖ_ＬＡは、抗原Ａに特異的な軽鎖可変イムノグロブリンドメインを示し、Ｖ_ＨＢは、抗原Ｂに特異的な重鎖可変イムノグロブリンドメインを示し、Ｖ_ＬＢは、抗原Ｂに特異的な軽鎖可変イムノグロブリンドメインを示し、Ｖ_ＨＡは、抗原Ａに特異的な重鎖可変イムノグロブリンドメインを示し、Ｌ１は、Ｖ_ＬＡとＶ_ＨＢとを接続するペプチドリンカー又はペプチド結合であり、Ｌ２は、Ｖ_ＨＢとＶ_ＬＢとを接続するペプチドリンカー又はペプチド結合であり、Ｌ３は、Ｖ_ＬＢとＶ_ＨＡとを接続するペプチドリンカー又はペプチド結合である。

【図3】細胞傷害性アッセイにおけるＣＤ１９×ＣＤ３タンデムダイアボディの比較を示す。オプション０は、Ｖ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡのドメイン順を有する抗体Ａ１である。オプション２は、本発明のＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡのドメイン順を有する抗体Ｂである。１×１０^４個のカルセイン標識Ｒａｊｉ細胞を、５×１０^５個のＰＢＭＣと共に、図に示す濃度に段階的に増加させたＣＤ１９×ＣＤ３タンデムダイアボディの存在下で培養した。ＰＢＭＣは、２５Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−２の存在下で一晩培養し、その後アッセイでエフェクター細胞として用いた。培養４時間後、アポトーシス標的細胞から放出された細胞培養培地中の蛍光性カルセインを５２０ｎｍで測定し、特異的溶解率％（％ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ）を計算した。グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェアを用いて非線形回帰によりＥＣ_５０値を解析した。二重試験の平均値及び標準偏差をプロットした。

【図4】細胞傷害性アッセイによるＣＤ１９×ＣＤ３タンデムダイアボディの比較を示す。オプション０は、Ｖ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡのドメイン順を有する抗体Ａ２である。オプション２は、本発明のＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡのドメイン順を有する抗体Ｃである。１×１０^４個のカルセイン標識Ｒａｊｉ細胞を、５×１０^５個の新たに単離したＰＢＭＣと共に、図に示す濃度に段階的に増加させたＣＤ１９×ＣＤ３タンデムダイアボディの存在下で培養した。培養４時間後、アポトーシス標的細胞から放出された細胞培養培地中の蛍光性カルセインを５２０ｎｍで測定し、特異的溶解率％（％ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ）を計算した。グラフパッドソフトウェアを用いて非線形回帰によりＥＣ_５０値を解析した。二重試験の平均値及び標準偏差をプロットした。

【図5】ＨＳＡ存在下又は非存在下における実施例２のＨＳＡ×ＣＤ３ ＴａｎｄＡｂ抗体によるＴＣＲ調節を示す。ＣＤ３^＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を、段階的に濃度を増加させたＨＳＡ×ＣＤ３ ＴａｎｄＡｂのオプション０（Ｖ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡ；三角）抗体又はオプション２（本発明のＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡ；四角）抗体の存在下、５０ｍｇ／ｍＬのＨＳＡを添加（中黒の記号）又は非添加（白抜きの記号）で、２時間培養した。洗浄後、残存したＴＣＲ／ＣＤ３複合体を、ＰＣ５コンジュゲート抗ＴＣＲα／β抗体を用いてフローサイトメトリーで測定した。平均蛍光値を、非線形回帰による解析（実験ＣＡＢ−３０６）に用いた。

【図6】抗体ＢをコードするｐＣＤＮＡ５ＦＲＴのベクターマップを制限酵素切断部位と共に示す。ＶＨ及びＶＬは、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを示す。

【図7】抗体ＣをコードするｐＳＫＫ３のベクターマップを制限酵素切断部位と共に示す。ＶＨ及びＶＬは、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

１つの態様において、本発明は、１つのポリペプチド鎖中で互いに結合した４つのイムノグロブリンドメイン（２つの重鎖可変ドメイン及び２つの軽鎖可変ドメイン）を有し、かつ、該ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけてＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡの順に配置された、組換え二量体四価抗原結合分子を提供する。このような本発明の抗原結合分子は、例えば、増強された免疫応答又は増強された免疫抑制などの増強された生物活性を誘発する。

【0013】

一実施形態において、ＣＤ３及びＣＤ１９に特異的であり、かつ、Ｖ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡのドメイン順であるポリペプチド鎖を有するタンデムダイアボディの様式の二量体二重特異性抗原結合分子は、同一ドメインを有する類似タンデムダイアボディ分子であって、逆のドメイン順Ｖ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡである分子よりも、ｉｎ ｖｉｔｒｏで６０倍超の高い活性、すなわち細胞傷害性を有することが示される。

【0014】

他の実施形態において、アルブミン（ＨＳＡ）及びＣＤ１９に特異的であり、かつ、Ｖ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡのドメイン順であるポリペプチド鎖を有するタンデムダイアボディの様式の二量体二重特異性抗原結合分子は、同一ドメインを有する類似タンデムダイアボディ分子であって、逆のドメイン順Ｖ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡである分子よりも、ｉｎ ｖｉｔｒｏで有意により有効なＴ細胞受容体調節活性、すなわちより高い免疫抑制作用を有することが示される。

【0015】

従って、ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけてＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡのドメイン順を有するタンデムダイアボディは、免疫療法においてさらに高い能力を有する。増強された生物活性のさらなる利点は、このようなタンデムダイアボディの治療的有効投与量が少量となり得る点である。さらに、投与量がより少量となるため、投与された抗原結合分子によって引き起こされる副作用も低減され得る。理論にとらわれずに言えば、新しいドメイン順は、従来技術のタンデムダイアボディと比較して、二量体抗原結合分子の抗原Ａと抗原Ｂとの間の架橋形成の改変が可能とするものであり、さらに本発明のある態様においては、それにより、従来技術の二量体抗原結合分子よりも効率的に、二量体抗原結合分子が標的抗原、例えば受容体に結合することが可能となる。

【0016】

よって、二量体抗原結合分子を形成する各ポリペプチド鎖の４つの可変ドメインが、各ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけてＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡの順で配置される場合、タンデムダイアボディのような二量体抗原結合分子の生物活性を増強することができる。誘発される「生物活性」は抗原結合分子の特異性によって決まり、このような生物活性としては、細胞傷害性、貪食、抗原提示、サイトカイン放出又は免疫抑制、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が挙げられる。

【0017】

いくつかの実施形態において、本発明は、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含む二量体抗原結合分子であって、前記第一のポリペプチド鎖及び前記第二のポリペプチド鎖のそれぞれは、第一の抗原Ａに特異的な軽鎖可変ドメインである第一ドメインＶ_ＬＡ、第二の抗原Ｂに特異的な重鎖可変ドメインである第二ドメインＶ_ＨＢ、第二の抗原Ｂに特異的な軽鎖可変ドメインである第三ドメインＶ_ＬＢ、第一の抗原Ａに特異的な重鎖可変ドメインである第四ドメインＶ_ＨＡを含み、かつ、前記ドメインは、前記第一のポリペプチド鎖及び前記第二のポリペプチド鎖のそれぞれにおいて、前記ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけてＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡの順で配置されている二量体抗原結合分子を提供するものである。

【0018】

いくつかの実施形態において、第一、第二、第三、及び第四の可変ドメインは、同じポリペプチド鎖内での分子内対形成を阻害する向きに配置され、かつ、第一のポリペプチド鎖の第一ドメインＶ_ＬＡが、第二のポリペプチド鎖の第四ドメインＶ_ＨＡと会合して、第一の抗原Ａに対する抗原結合部位を形成し、第一のポリペプチド鎖の第二ドメインＶ_ＨＢが、第二のポリペプチド鎖の第三ドメインＶ_ＬＢと会合して、第二の抗原Ｂに対する抗原結合部位を形成し、第一のポリペプチド鎖の第三ドメインＶ_ＬＢが、第二のポリペプチド鎖の第二ドメインＶ_ＨＢと会合して、第二の抗原Ｂに対する抗原結合部位を形成し、第一のポリペプチド鎖の第四ドメインＶ_ＨＡが、第二のポリペプチド鎖の第一ドメインＶ_ＬＡと会合して、第一の抗原Ａに対する抗原結合部位を形成するように、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖とが会合、すなわち二量体化している。

【0019】

用語「抗原結合分子」は、多価抗原結合特性を有し、好ましくは少なくとも４つの抗原結合部位を有するイムノグロブリン誘導体を意味する。各抗原結合部位は、同じ抗原（すなわちエピトープ）特異性である重鎖可変ドメインＶ_Ｈ及び軽鎖可変ドメインＶ_Ｌによって形成される。好ましくは、本発明に係る抗原結合分子は、イムノグロブリンの定常ドメイン又はイムノグロブリンの定常ドメインの断片を有さないが、以下で記載されるいくつかのケースでは、定常ドメイン又はその一部が、抗原結合分子に結合していてもよい。

【0020】

抗原結合分子は、「二量体」であり、この用語は、２つのポリペプチド単量体の複合体を意味する。これらの２つのポリペプチド単量体は、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖である。好ましくは、抗原結合分子は、「ホモ二量体」であり、この用語は、抗原結合分子が同一ポリペプチド単量体で構成されていることを意味する。本発明の好ましいホモ二量体抗原結合分子において、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖は、同じアミノ酸配列を有していてもよく、すなわち第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖は同一であり、従って、同じ単一のポリヌクレオチドによってコードされ、発現される。２種類の別々のポリヌクレオチドによってコードされているヘテロダイマーである、いわゆる二重特異性ダイアボディはこれとは異なる。先に記載した抗原結合分子においては、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖のそれぞれが、４つの可変ドメインを含み、４つの結合部位が形成され、かつ、抗原結合分子は四価である。このような四価のホモ二量体抗原結合分子は、本技術分野ではタンデムダイアボディとして一定程度認識されているものである。

【0021】

好ましくは、抗原結合分子において、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖は、非共有結合によって互いに会合しており、特には、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖との間に共有結合がないことを条件とする。しかし、所望により、２つのポリペプチド鎖は、少なくとも１つの共有結合による結合により、例えば異なるポリペプチド鎖のシステイン残基同士のジスルフィド架橋により、さらに安定化されていてもよい。

【0022】

用語「ポリペプチド鎖」は、アミド結合で結合したアミノ酸残基のポリマーを意味する。第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖は、好ましくは、分岐していない単鎖の融合タンパク質である。第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖のそれぞれにおいて、４つのドメインは、第二ドメインＶ_ＨＢが第一ドメインＶ_ＬＡのＣ末端側にあり、第三ドメインＶ_ＬＢが第二ドメインＶ_ＨＢのＣ末端側にあり、第四ドメインＶ_ＨＡが第三ドメインＶ_ＬＢのＣ末端側にあるように配置される。第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖は、第一ドメインＶ_ＬＡのＮ末端及び／又は第四ドメインＶ_ＨＡのＣ末端に隣接して追加のアミノ酸残基を有していてもよい。例えば、ポリペプチド鎖は、該ポリペプチドの精製に有用となり得るタグ配列を、好ましくはＣ末端に含有してもよい。タグ配列としては、Ｈｉｓ−タグを挙げることができ、例えば６個のＨｉｓ残基からなるＨｉｓ−タグが挙げられる。

【0023】

いくつかの実施形態において、第一、第二、第三、及び第四ドメインは、同じポリペプチド鎖のドメインが互いに会合しない、すなわち対を形成しないように共有結合によって接続している。これらのドメインは、第一ドメインＶ_ＬＡが、第一のリンカーＬ１により第二ドメインＶ_ＨＢと結合し、第二ドメインＶ_ＨＢが、第二のリンカーＬ２により第三ドメインＶ_ＬＢと結合し、第三ドメインＶ_ＬＢが、第三のリンカーＬ３により第四ドメインＶ_ＨＡと結合するように連結されていてもよく、ここで、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖のそれぞれにおいて、第一のリンカーＬ１及び第三のリンカーＬ３は、中央リンカーＬ２に対して末端に位置する。リンカーＬ１、リンカーＬ２、及びリンカーＬ３はそれぞれ、少なくとも１個のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーであってもよいし、又は２つの隣接するドメイン間にアミノ酸残基がまったく介在しないペプチド結合であってもよい。

【0024】

いくつかの実施形態において、それぞれのリンカーＬ１、Ｌ２、及びＬ３の長さは、第一のポリペプチド鎖のドメインが第二のポリペプチド鎖のドメインと会合して二量体抗原結合分子を形成することができるような長さである。リンカーの長さは、抗原結合分子の柔軟性に影響を与える。抗原結合分子の望ましい柔軟性は、標的抗原の密度、及び標的抗原、すなわちエピトープの接近しやすさによって決まる。リンカーが長いほど、より機動的な抗原結合部位を有するより柔軟な抗原結合分子となる。二量体抗原結合分子の形成に与えるリンカー長の影響は、例えばＴｏｄｏｒｏｖｓｋａら、２００１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：４７−６６；Ｐｅｒｉｓｉｃら、１９９４ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１２１７−１２２６；Ｌｅ Ｇａｌｌら、２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １７：３５７−３６６、及びＷＯ９４／１３８０４に記載されている。

【0025】

ある好ましい実施形態において、リンカーＬ１、Ｌ２、及び／又はＬ３は「短い」、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は約１２個のアミノ酸残基からなる。このような短いリンカーは、異なるポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイン間が結合して抗原結合部位を形成することにより、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖とが正しい二量体を形成するために好都合となる。特に、２つの隣接するドメインＶ_ＨＢ及びＶ_ＬＢにより、同じポリペプチド鎖内で単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗原結合単位が形成されることを防ぐため、中央リンカーＬ２は短いべきである。中央リンカーＬ２は、ポリペプチド鎖の柔軟性に影響を与える。中央リンカーＬ２が長く柔軟である（一般的に約１２個以上のアミノ酸残基からなる）場合、一つのポリペプチド鎖の頭部と尾部が会合するように折り畳まれて、当技術分野において単鎖ダイアボディとして知られる単鎖抗原結合分子を形成する可能性がある。中央リンカーＬ２が短く剛直な場合、ポリペプチド鎖は頭部と尾部が会合するように折り畳まれることができず、他のポリペプチド鎖と二量体化する。頭部と尾部が会合するように折り畳まれることを防ぐためのリンカーのアミノ酸残基の数は、ポリペプチド内に組みこまれる可変ドメインの種類に依存する。一般的に、リンカーを約１２個以下のアミノ酸残基と短くすることにより、同じポリペプチド鎖の隣接するドメインが互いに相互作用することは大体防ぐことができる。よって、中央リンカーＬ２ならびに末端のリンカーＬ１及びＬ３は、同じポリペプチド鎖の隣接するドメインが対形成することを防ぐために、好ましくは、約１２個以下のアミノ酸残基からなるべきである。本発明の好ましい実施形態において、リンカーＬ１、Ｌ２、及び／又はＬ３は、約３〜約１０個の連続したアミノ酸残基からなる。リンカーは、異なる数のアミノ酸残基からなっていてもよいが、末端のリンカーＬ１及びＬ３が、同じ数のアミノ酸残基を有するか、又は長さにおいて１個もしくは２個のアミノ酸残基より大きな違いがないことが好ましい。本発明のある態様において、リンカーＬ１、Ｌ２、及び／又はＬ３の少なくとも１つが、９個のアミノ酸残基からなる。本発明の特定の実施形態において、３つのリンカーＬ１、Ｌ２、及びＬ３の全てが、９個のアミノ酸残基からなる。ある実施形態において、リンカーＬ１、Ｌ２、及び／又はＬ３の少なくとも１つが、３〜１０個の間のアミノ酸残基からなる。

【0026】

追加のアミノ酸残基により、さらなる柔軟性がもたらされる。別の態様において、中央リンカーＬ２は、ポリペプチド鎖の頭部と尾部が会合するように折り畳まれることを防ぐために約１２個以下のアミノ酸残基を有していてもよく、かつ、末端のリンカーＬ１及び／又はＬ３の少なくとも１つは、さらなる柔軟性を与えるために約１２個より多いアミノ酸残基を有していてもよい。他の実施形態において、１２個よりも多いアミノ酸残基を有する中央リンカーＬ２を有する２つのポリペプチド鎖は、正しく互いに二量体化して、四価の二量体抗原結合分子になる（例えばＬｅ Ｇａｌｌら、２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １７：３５７−３６６を参照）。しかし、それより長いリンカー、例えば約１３個以上、特に約１５個以上のアミノ酸残基からなるリンカーが利用される場合、二量体抗原結合分子は、このような２つのポリペプチド鎖間の少なくとも１つの共有結合によりさらに安定化させることができる。

【0027】

リンカーのアミノ酸組成に関して、いくつかの実施形態では、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖の二量体化に干渉しないようなペプチドが選択される。例えばグリシン及びセリン残基を含むリンカーは、一般的には柔軟性及びプロテアーゼ耐性を付与する。リンカーのアミノ酸配列は、例えば、分子の抗原結合及び生産収率を改善するためにファージディスプレイ法によって最適化することができる。本発明の特定の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳＧＧＳを含んでもよい。

【0028】

第一ドメインＶ_ＬＡ、第二ドメインＶ_ＨＢ、第三ドメインＶ_ＬＢ、及び第四ドメインＶ_ＨＡは、イムノグロブリンの軽鎖及び重鎖可変ドメインである。可変ドメインは、抗原と接触する残基を含有する超可変ループ又は相補的結合領域（ＣＤＲ）と、正確な折り畳みとＣＤＲの提示に寄与するセグメントとを含む。各重鎖及び軽鎖可変ドメインのそれぞれが、対応する３つのＣＤＲを含むことが好ましい。これらのドメインは、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭ又はそれらのサブクラスなどのあらゆるイムノグロブリンクラスに由来することができる。イムノグロブリンは、動物、特に哺乳動物由来であってもよい。各ドメインは、完全なイムノグロブリンの重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、突然変異体、天然に存在する可変ドメインの断片もしくは誘導体、又は合成ドメイン、例えば遺伝子操作された組換えドメインであってもよい。誘導体とは、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも１つのアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されるように異なる可変ドメインである。合成ドメイン、例えば組換えドメインは、ハイブリドーマ由来の抗体、又はファージディスプレイイムノグロブリンライブラリーから、例えば周知の再現可能な方法によって得てもよい。例えばファージディスプレイ法は、ヒトイムノグロブリン配列由来のライブラリーをスクリーニングすることによって、抗原に対するヒト抗体の可変ドメインを得るのに用いることができる。最初に選択された抗体の親和性を、親和性の成熟、例えば鎖シャッフリング又はランダム突然変異誘発によってさらに高めることができる。当業者は、天然又は組換え抗体からドメインを得る方法について熟知している（実験マニュアルとして、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編；Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．ＩＩシリーズ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．）を参照）。一般的に、本発明の可変ドメイン源として本技術分野で公知のあらゆる抗体を用いることができる。

【0029】

本発明の所定の態様において、第一ドメインＶ_ＬＡ、第二ドメインＶ_ＨＢ、第三ドメインＶ_ＬＢ、及び第四ドメインＶ_ＨＡの少なくとも１つ、好ましくは全てが、完全ヒト、ヒト化又はキメラドメインである。ヒト化可変ドメインは、実質的にヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワーク領域と、非ヒトイムノグロブリンのＣＤＲとを含む。ヒト化抗体は、例えばＣＤＲグラフティングなどの十分に確立された方法によって生産することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編；Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．ＩＩシリーズ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．）を参照）。従って、当業者であれば、ヒト免疫系における免疫原性を低減させ、かつ、抗原結合分子の効率を改善するために、当技術分野で公知の標準的な分子生物学的な手法を用いて、非ヒト起源、例えばマウスからヒト化又は完全ヒト型の抗原結合分子及び可変ドメインを容易に作製することができる。本発明の好ましい実施形態において、全てのドメイン（例えば、Ｖ_ＬＡ、Ｖ_ＨＢ、Ｖ_ＬＢ、及びＶ_ＨＡ）は、ヒト化されているか、又は完全ヒト型であり；最も好ましくは、本発明に係る二量体抗原結合分子は、ヒト化されているか、又は完全ヒト型である。用語「完全ヒト型」は、本明細書で用いられる場合、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖における可変ドメイン及び可変ドメインを連結しているペプチドのアミノ酸配列がヒト由来であるか、又はヒトで見出すことができることを意味する。本発明のある実施形態において、可変ドメインはヒト型又はヒト化であるが、可変ドメインを連結しているペプチドはヒト型又はヒト化ではなくてもよい。

【0030】

一実施形態において、第一ドメインＶ_ＬＡ、第二ドメインＶ_ＨＢ、第三ドメインＶ_ＬＢ、及び第四ドメインＶ_ＨＡは、同じ抗原に特異的であり、これらのドメインによって形成された抗原結合部位は、同じエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープのいずれかに結合する。この場合、「抗原Ａ」及び「抗原Ｂ」という表現は、同じ抗原を意味する。このような抗原結合分子は、単一特異性である。

【0031】

他の実施形態において、第一ドメインＶ_ＬＡ、第二ドメインＶ_ＨＢ、第三ドメインＶ_ＬＢ、及び第四ドメインＶ_ＨＡは、異なる抗原に特異的であり、Ｖ_ＬＡ及びＶ_ＨＡが、抗原Ａのための第一の特異性を有する抗原結合部位を形成し、Ｖ_ＨＢ及びＶ_ＬＢが、抗原Ｂのための第二の特異性を有する抗原結合部位を形成する。異なる抗原は、異なる種類の細胞に関係していてよいし、又は同じ種類の細胞の異なる抗原を示していてもよい。このような本発明の抗原結合分子は、二重特異性である。

【0032】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗原結合部位は、細菌物質、ウイルスタンパク質、自己免疫マーカー、又は、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄細胞、貪食細胞、若しくは腫瘍細胞の細胞表面タンパク質などの特定の細胞上に存在する抗原に特異的であってもよい。

【0033】

本発明の１つの態様において、二量体抗原結合分子は、エフェクター細胞に対する第一の特異性と、該エフェクター細胞とは異なる標的細胞に対する第二の特異性とを備える二重特異性である。このような抗原結合分子は、２つの細胞を架橋することができ、エフェクター細胞を特定の標的に向かわせるのに用いることができる。本発明の他の態様において、二量体抗原結合分子は、標的細胞と、次の群より選択される分子とに対して二重特異性であってもよい：薬物、毒素、放射性ヌクレオチド、酵素、アルブミン、及びリポタンパク質、例えばサイトカイン又はケモカインなどの天然に存在するリガンド。標的分子がアルブミンである場合、アルブミン又は血清アルブミンは、ヒト、ウシ、ウサギ、イヌ、及びマウスからなる起源群より選択することができる。

【0034】

「エフェクター細胞」は、典型的には、細胞傷害、貪食、抗原提示、サイトカイン放出を刺激又は誘発することができる免疫系の細胞を意味する。このようなエフェクター細胞としては、これらに限定されるものではないが、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞、赤血球、及び抗原提示細胞が挙げられる。エフェクター細胞に対して適切な特異性を有するものの例としては、これらに限定されるものではないが、Ｔ細胞の場合、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ２８、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の他の構成要素；ＮＫ細胞の場合、ＣＤ１６、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、ＣＤ３３６（ＮＫｐ４４）、ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＮＫｐ８０、ＮＫＧ２Ｃ、及びＮＫＧ２Ｄ；顆粒球の場合、ＣＤ１８、ＣＤ６４、及びＣＤ８９；単球及びマクロファージの場合、ＣＤ１８、ＣＤ６４、ＣＤ８９、及びマンノース受容体；樹状細胞の場合、ＣＤ６４、及びマンノース受容体；赤血球の場合、ＣＤ３５が挙げられる。本発明のある態様において、このようなエフェクター細胞への特異性、すなわちエフェクター細胞の細胞表面分子への特異性は、二重特異性抗体がこのような細胞表面分子に結合した際に、それにより細胞溶解又はアポトーシスを誘導して、細胞死をもたらすのに適している。

【0035】

「標的細胞」は、典型的には、それぞれの生物学的応答、例えば免疫応答を誘導し又は誘発するように、エフェクター細胞がそれに対して方向付けられるべき部位を意味する。標的細胞の例は、腫瘍細胞、例えばウイルス性もしくは細菌性病原体等の感染因子、例えばデング熱ウイルス、単純ヘルペス、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、又はＩＬ−２、自己免疫マーカーもしくは自己免疫抗原などの自己免疫標的を保有する細胞であり得る。

【0036】

本発明の好ましい実施形態において、二量体抗原結合分子は、腫瘍細胞と、エフェクター細胞、特にはＴ細胞又はＮＫ細胞とに対して二重特異性である。腫瘍細胞に適した特異性は、腫瘍抗原、及びそれぞれの腫瘍細胞上の細胞表面抗原、例えば特異的な腫瘍マーカーであり得る。このような二重特異性二量体抗原結合分子は、腫瘍細胞と免疫エフェクター細胞との両方に結合することにより、Ｔ細胞又はＮＫ細胞により誘導される細胞傷害性応答を誘発する。用語「腫瘍抗原」は、本明細書で用いられる場合、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を含む。「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）は、本明細書で用いられる場合、腫瘍細胞上及び胎児期中の正常細胞上に存在し（癌胎児性抗原）、かつ、生後には選択された臓器において腫瘍細胞よりもかなり低い濃度で存在するタンパク質を意味する。ＴＡＡは、腫瘍細胞近傍の間質中に存在することもあるが、体内の他の間質中よりも低い量で発現される。対照的に、用語「腫瘍特異的抗原」（ＴＳＡ）は、腫瘍細胞によって発現されるタンパク質を意味する。用語「細胞表面抗原」は、細胞表面上の抗体によって認識され得るあらゆる抗原又はそれらの断片を意味する。

【0037】

腫瘍細胞に特異的なものの例としては、これらに限定されるものではないが、本技術分野において記載されているような、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ラミニン受容体前駆体タンパク質、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＬＡＰ、トムゼン−フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＣＤ５、ＩＬ４−Ｒアルファ、ＩＬ１３−Ｒ、ＦｃεＲＩ、及びＩｇＥが挙げられる。

【0038】

一実施形態において、エフェクター細胞に特異的なものは、ＣＤ３又はＣＤ１６であってもよく、腫瘍細胞に特異的なものは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ラミニン受容体前駆体、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、ＰＬＡＰ、トムゼン−フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＣＤ５、ＩＬ４−Ｒアルファ、ＩＬ１３−Ｒ、ＦｃεＲＩ、及びＩｇＥより選択してもよい。特に、抗原結合分子の例としては、ＣＤ３及びＣＤ１９、又はＣＤ１６及びＣＤ３０に対して二重特異性であるものがある。

【0039】

本発明のある態様において、第一ドメインＶ_ＬＡ及び第四ドメインＶ_ＨＡは、腫瘍細胞に対して特異性を有し、その他の２つのドメイン、すなわち第二ドメインＶ_ＨＢ及び第三ドメインＶ_ＬＢは、エフェクター細胞、特にＴ細胞又はＮＫ細胞に対して特異性を有する。一態様において、第一ドメインＶ_ＬＡ及び第四ドメインＶ_ＨＡは、腫瘍細胞に対して特異性を有し、その他の２つのドメイン、すなわち第二ドメインＶ_ＨＢ及び第三ドメインＶ_ＬＢは、ＣＤ３又はＣＤ１６に対して特異性を有する。それらの所定の実施形態において、第一ドメインＶ_ＬＡ及び第四ドメインＶ_ＨＡは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ラミニン受容体前駆体、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、ＰＬＡＰ、トムゼン−フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＣＤ５、ＩＬ４−Ｒアルファ、ＩＬ１３−Ｒ、ＦｃεＲＩに対して特異性を有し、その他の２つのドメイン、すなわち第二ドメインＶ_ＨＢ及び第三ドメインＶ_ＬＢは、ＣＤ３に対して特異性を有する。

【0040】

本発明の他の態様において、第一ドメインＶ_ＬＡ及び第四ドメインＶ_ＨＡは、エフェクター細胞、特にＴ細胞又はＮＫ細胞に対して特異性を有し、その他の２つのドメイン、すなわち第二ドメインＶ_ＨＢ及び第三ドメインＶ_ＬＢは、腫瘍細胞に対して特異性を有する。一態様において、第一ドメインＶ_ＬＡ及び第四ドメインＶ_ＨＡは、ＣＤ３又はＣＤ１６に対して特異性を有し、その他の２つのドメイン、すなわち第二ドメインＶ_ＨＢ及び第三ドメインＶ_ＬＢは、腫瘍細胞に対して特異性を有する。特定の好ましい態様において、第一ドメインＶ_ＬＡ及び第四ドメインＶ_ＨＡは、ＣＤ３に対して特異性を有し、その他の２つのドメイン、すなわち第二ドメインＶ_ＨＢ及び第三ドメインＶ_ＬＢは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ラミニン受容体前駆体、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、ＰＬＡＰ、トムゼン−フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＣＤ５、ＩＬ４−Ｒアルファ、ＩＬ１３−Ｒ、ＦｃεＲＩ、及びＩｇＥからなる群より選択される腫瘍細胞に対する特異性を有する。

【0041】

ＣＤ３抗原は、Ｔ細胞上でＴ細胞受容体複合体と会合する。エフェクター細胞に対する特異性がＣＤ３による場合、本発明に係る二量体抗原結合分子がＣＤ３に結合すると、標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害活性を誘発することができる。すなわち、二量体抗原結合分子がＣＤ３と標的細胞、例えば腫瘍細胞とに二重特異的に結合することにより、標的細胞の細胞溶解を誘導することができる。ＣＤ３及びその産生物に対して特異性を有する二量体抗原結合分子は本技術分野で公知である（例えば、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２９３：４１−５６、Ｌｅ Ｇａｌｌら、２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、１７／４：３５７−３６６に記載）。

【0042】

単一特異性抗ＣＤ３抗原結合分子は、Ｔ細胞受容体に結合してそれらを調節することにより免疫抑制特性を有することで知られている（例えば、ＷＯ２００４／０２４７７１に記載）。一実施形態において、本発明の抗原結合分子は、移植等における、免疫抑制剤として使用するために、ＣＤ３及びアルブミンに対して二重特異性である。

【0043】

ＣＤ１６（ＦｃγＩＩＩＡ）抗原は、ＮＫ細胞表面に発現する受容体である。ＮＫ細胞は、固有の細胞溶解活性を有しており、本発明に係る二量体抗原結合分子がＣＤ１６と二重特異的に結合することにより、ＮＫ細胞の標的細胞に対する細胞傷害活性を誘発することができる。ＣＤ１６に対して特異性を有する二重特異性抗原結合分子の例は、例えば、Ａｒｎｄｔら、１９９９、Ｂｌｏｏｄ、９４：２５６２−２５６８に記載されている。本発明の特定の実施形態において、重鎖又は軽鎖可変ドメインの少なくとも一つは、ＷＯ２００６／１２５６６８に記載された抗ＣＤ１６抗体、特には、ＣＤ１６Ａアイソフォームを認識するがＣＤ１６Ｂアイソフォームは認識しない抗体に由来する。

【0044】

ＣＤ１９抗原は、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）から非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に至るまで事実上全てのＢ細胞系列の悪性腫瘍で発現していることから、腫瘍特異性がＣＤ１９抗原に対するものである本発明の二量体抗原結合分子は、Ｂ細胞性悪性腫瘍の免疫療法に用いることができる。特に非ホジキンリンパ腫の治療には、ＣＤ１９又はＣＤ２０に対して特異性を有する二量体抗原結合分子を用いることができる。ＣＤ１９及びその産生物に対して特異性を有する二量体抗原結合分子は、本技術分野で公知である（例えば、Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓら、２０００、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：４３３６−４３４１に記載）。

【0045】

腫瘍特異性がラミニン受容体又はラミニン受容体前駆体に対するものである本発明の二量体抗原結合分子は、例えば、これらに限定されるものではないが、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、肺癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、特には、これらの転移癌又は微小残存癌の状態、の治療に用いることができる。ラミニン受容体前駆体に対して特異性を有する抗原結合分子は、例えば、Ｚｕｂｅｒら、２００８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３７８：５３０−５３９に記載されている。

【0046】

腫瘍特異性がＥＧＦＲ１に対するものである本発明の二量体抗原結合分子は、特に、ＥＧＦＲ１発現が上方制御されているか又は変化している癌、例えば、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、前立腺癌、腎臓癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、及び神経膠腫の治療に用いることができる。

【0047】

腫瘍特異性がＴＦ抗原に対するものである本発明の二量体抗原結合分子は、特に、乳癌、結腸癌、及び／又は肝転移の治療に用いることができる。

【0048】

腫瘍特異性がＣＤ３０に対するものである二量体抗原結合分子は、特に、ホジキン病の治療に用いることができる。ＣＤ３０に対して特異性を有する抗原結合分子は、例えばＡｒｎｄｔら、１９９９、Ｂｌｏｏｄ、９４：２５６２−２５６８に記載されている。

【0049】

腫瘍特異性がＩＬ４受容体のアルファ鎖（ＩＬ４Ｒアルファ）に対するものである二量体抗原結合分子は、特に、固形腫瘍、特には、乳房、卵巣、腎臓系、頭頸部の癌腫、悪性黒色腫、及びＡＩＤＳ関連のカポジ肉腫の治療に用いることができる。少なくとも１つの追加の特異性がＥＧＦＲ３／ＨＥＲ３及び／又はＥＧＦＲ２／ｎｅｕに対するものである二量体抗原結合分子は、特に、乳癌の治療に用いることができる。腫瘍特異性がＩＧＦＲに対するものである二量体抗原結合分子は、特に、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌又は乳癌の治療に用いることができる。

【0050】

腫瘍特異性がＣＤ５に対するものである二量体抗原結合分子は、特に、慢性リンパ性白血病の治療に用いることができる。

【0051】

腫瘍特異性がＭＵＣ−Ｉに対するものである二量体抗原結合分子は、特に、胃癌及び卵巣癌の治療に用いることができる。

【0052】

腫瘍特異性がＥｐＣＡＭに対するものである二量体抗原結合分子は、特に、結腸、腎臓、及び乳房の癌腫の治療に用いることができる。

【0053】

腫瘍特異性がＰＬＡＰに対するものである二量体抗原結合分子は、卵巣又は精巣癌の治療に用いることができる。

【0054】

腫瘍特異性がＯＦＡ−ｉＬＲに対するものである二量体抗原結合分子は、転移性腫瘍の治療に用いることができる。

【0055】

本発明のある態様において、本明細書に記載された抗原結合分子は、二量体で、かつ、ＣＤ３及びＣＤ１９に対して二重特異性を有するか、あるいは、該抗原結合分子は、二量体で、かつ、ＣＤ１６及びＣＤ１９に対して二重特異性を有する。それぞれの前記特定の実施形態において、第一ドメインＶ_ＬＡ及び第四ドメインＶ_ＨＡは、ＣＤ３及びＣＤ１６に特異的であり、第二ドメインＶ_ＨＢ及び第三ドメインＶ_ＬＢはＣＤ１９に特異的である。これらの場合、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖の各々は、ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけてＶ_Ｌ^ＣＤ３−Ｖ_Ｈ^ＣＤ１９−Ｖ_Ｌ^ＣＤ１９−Ｖ_Ｈ^ＣＤ３か、又は、Ｖ_Ｌ^ＣＤ１６−Ｖ_Ｈ^ＣＤ１９−Ｖ_Ｌ^ＣＤ１９−Ｖ_Ｈ^ＣＤ１６のドメイン順を有する。好ましい実施形態において、第一ドメイン、第二ドメイン、第三ドメイン、及び第四ドメインは、ヒト化されているか、又は完全ヒトドメインである。最も好ましい実施形態において、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖は、上記で定義されたように、ヒト化されているか、又は完全ヒトポリペプチド鎖である。本発明の他の態様において、二量体抗原結合分子は、例えば、ＥｐＣＡＭとＣＤ３；ＨＳＡなどのアルブミンとＣＤ３；又は、ＥＧＦＲとＣＤ３に対して二重特異性であってもよい。

【0056】

本発明の更なる態様において、本明細書に記載された抗原結合分子は、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及びアルブミンとは異なる他の抗原に特異的である。このような抗原結合分子は、血清アルブミンに結合することにより、血清中及びｉｎ ｖｉｖｏでの血清中半減期が長くなる。従って、このような抗原結合分子は、医療的使用又は診断的使用、及び医薬組成物として有利であり、ここで、該抗原結合分子のポリペプチドは、治療用又は診断用抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメイン、ならびに、アルブミンに特異的な軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む。公知の及び／又は市販の治療用、診断用又は抗アルブミン抗体を、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの起源として用いることができる。さらに、アルブミン、例えばＨＳＡに特異的な抗体又はＦｖ断片を起こして作製する方法は本技術分野で公知である。このような抗原結合分子において、ポリペプチド鎖のドメインは、Ｖ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡの順で配置され、ここで、抗原Ａ又は抗原Ｂはアルブミンである。好ましい実施形態において、アルブミンは、抗原Ａである。本発明のある態様において、もう一方の抗原は、ＣＤ３である。特定の実施形態において、抗原Ａはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）であり、ＨＳＡ×ＣＤ３抗原結合分子のポリペプチドは、実施例２で示されるようにＶ_Ｌ^ＨＳＡ−Ｖ_Ｈ^ＣＤ３−Ｖ_Ｌ^ＣＤ３−Ｖ_Ｈ^ＨＳＡのドメイン順を有する。このような抗原結合分子の作製は、例えば、実施例１においてＣＤ３×ＣＤ１９について記載した方法と同様に、例えば、抗ＨＳＡ抗体及び抗ＣＤ３抗体又はその抗体断片の可変ドメインを作製し、図７に示される発現プラスミドの抗ＣＤ３ドメイン及び抗ＣＤ１９ドメインと置き換えることでそれぞれの順に挿入してもよいし、又は他のあらゆる適切な発現プラスミドもしくは発現構築物にそれぞれの順に挿入してもよい。

【0057】

本発明は、更なる態様において、独立して生物学的機能を発揮し、特に生化学的な事象を引き起こす、追加の機能単位、例えば機能性ドメイン又は機能性物質と結合した、上述の実施形態のいずれか一つの二量体抗原結合分子を提供する。追加の機能単位は、二量体抗原結合分子の２つの個々のポリペプチド鎖の少なくとも一方と複合体を形成していてもよいし、又はそれと共有結合していてもよい。一態様において、追加の機能単位は、個々のポリペプチド鎖の一方のみに共有結合していてもよいし、他の態様において、追加の機能単位は、二量体抗原結合分子の両方のポリペプチド鎖に共有結合することにより、２つのポリペプチド鎖を連結させていてもよい。さらなる態様において、２つのポリペプチド鎖はそれぞれ個々に追加の機能単位と共有結合している。追加の機能単位が２つのポリペプチド鎖の少なくとも一方に共有結合している場合、追加の機能単位は、ペプチド結合又はペプチドリンカーによって２つのポリペプチド鎖の少なくとも一方と融合していてもよい。あるいは、追加の機能単位は、例えば、少なくとも１つのポリペプチド鎖のシステイン残基と追加の機能単位システイン残基との間のジスルフィド架橋等のジスルフィド架橋、及び、エステル結合等の化学的融合、又は化学的架橋形成によって結合していてもよい。本発明のある態様において、追加の機能単位は、例えばジスルフィド結合などの切断可能なリンカーによって抗原結合分子に結合していてもよい。

【0058】

追加の機能単位は、第一のポリペプチド鎖及び／又は第二のポリペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端に結合していてもよい。１つの追加の機能単位が、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖の両方に結合している場合、追加の機能単位は、一方のポリペプチド鎖のＮ末端と他方のポリペプチド鎖のＣ末端とに結合していてもよい。

【0059】

ポリペプチド鎖と、追加のポリペプチド又は追加の作用物質などの追加の機能単位との化学的架橋形成のためのホモ二官能性及びヘテロ二官能性試薬が本技術分野で周知である。例としては、これらに限定されるものではないが、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏ−ＰＤＭ）、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、又は４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）が挙げられる。イムノグロブリン鎖を含むポリペプチド鎖と追加のポリペプチド又は化学物質との架橋を形成する方法は、例えば、Ｇｒａｚｉａｎｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００４、２８３巻、７１−８５、及び、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ １９９６に記載されている。

【0060】

一態様において、追加の機能単位は、少なくとも１つの追加の可変イムノグロブリンドメインであってもよい。追加の可変イムノグロブリンドメインは、二量体抗原結合分子の結合部位が特異性を有する第一の抗原Ａ又は第二の抗原Ｂに特異的であってもよく、あるいは、抗原Ａ及び抗原Ｂとは異なる第三の抗原Ｃに特異的であってもよい。ある態様において、追加の軽鎖可変ドメインＶ_Ｌ及び追加の重鎖可変ドメインＶ_Ｈは、２つのポリペプチド鎖の各々に、一方の追加ドメイン、特にはＶ_Ｈ、がＮ末端に融合し、他方の追加ドメイン、特にはＶ_Ｌ、がＣ末端に融合するように結合して、その結果、６つの抗原結合部位を有するポリペプチドであって、同一の他のポリペプチドと会合して６つの可変ドメインを有する二量体抗原結合分子を生じてもよい。他の態様において、１つの追加の可変イムノグロブリンドメインは、抗原結合分子のポリペプチド鎖の一方に融合し、それが追加の第三のポリペプチドの同じ特異性を有する相補的な可変イムノグロブリンドメインと非共有結合によって会合することにより、二量体抗原結合分子と追加の第三のポリペプチドとの間に追加の抗原結合部位が形成されてもよい。他の態様において、ｓｃＦｖ又はダイアボディを含む追加の抗原結合単位は、追加の機能単位として二量体抗原結合分子に結合されていてもよい。

【0061】

ある態様において、追加の機能単位は、少なくとも１つの追加の本明細書に記載された二量体抗原結合分子であってもよい。従って、本発明に係る２つ以上の二量体抗原結合分子を互いに結合させることにより、抗原結合分子の価数及び結合活性を高めることもできる。

【0062】

他の態様において、追加の機能単位は、Ｆｃドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン又はそれらの断片などを含むエフェクタードメインであってもよい。このような単位は、Ｆｃ受容体と結合することにより、抗原結合分子にエフェクター特性を付与することができる。このような機能単位はさらに、抗原結合分子の血清中半減期を長くするために用いることができる。

【0063】

他の態様において、追加の機能単位は、酵素であってもよい。酵素がプロドラッグを活性な薬物に変換することができる場合、抗原結合分子は、抗体依存性酵素によるプロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）に用いることができる。この場合、抗原結合分子は、酵素を対象の組織に向かわせ、抗原結合分子は組織に結合すると、その部位でプロドラッグを活性化する。さらに、癌治療のための酵素を標的化するための二重特異性抗原分子、例えば、これらに限定されるものではないが、ＣＤ３０とマイトマイシンホスフェートからマイトマイシンアルコールへの変換を触媒するアルカリホスファターゼとに対して特異性を有する二重特異性抗原分子、又は胎盤性アルカリホスファターゼとセファロスポリンベースの抗癌プロドラッグを活性化するβ−ラクタマーゼとに対して特異性を有する二重特異性抗原分子の使用が本技術分野で公知である。また、線維素と組織プラスミノゲン活性化因子とに対して特異性を有する線維素溶解のための二重特異性抗原結合分子、及び、酵素ベースのイムノアッセイのための酵素結合抗原結合分子の使用も適している。

【0064】

他の態様において、機能単位は、薬物、毒素、放射性同位体、リンホカイン、ケモカイン又は標識分子であってもよい。このような抗原結合分子は、機能単位を所望の作用部位に送達する。例えば、腫瘍抗原に特異的な抗原結合分子に結合している化学療法薬は、腫瘍細胞に送達され、毒素は病原体又は腫瘍細胞に送達され得る。毒素と結合した抗原結合分子は、ＮＫ細胞又はマクロファージを標的として用いることができ、好ましくはＣＤ１６に特異的である。毒素の例としては、これらに限定されるものではないが、リボシルトランスフェラーゼ、セリンプロテアーゼ、グアニルシクラーゼ活性化因子、カルモジュリン依存性アデニルシクラーゼ、リボヌクレアーゼ、ＤＮＡアルキル化剤又は有糸分裂阻害剤、例えば、ドキソルビシンが挙げられる。標識分子は、例えば、蛍光分子、発光分子もしくは放射標識分子、金属キレート又は酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼなど）であってもよく、これらの酵素が本発明の抗原結合分子に結合している場合、後に基質に晒されると、該基質と反応して検出可能な化合物部分が生産され、ｉｎ ｖｉｖｏでのイメージング又はイムノアッセイに用いることができる。イムノアッセイに用いる場合、二量体抗原結合分子は、不溶性担体、例えばガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、天然及び改質セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびに磁気ビーズに固定化されていてもよい。

【0065】

本発明の抗原結合分子の体内の血清半減期を長くするため、抗原結合分子は、所望により、アルブミンに融合させるか、又はペグ化、シアル化もしくはグリコシル化されていてもよい（例えばＳｔｏｒｋら、２００８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８３：７８０４−７８１２を参照）。上述の通り、本発明の抗原結合分子に追加のアルブミンを融合させる代わりに、抗原結合分子がアルブミンと他の抗原に特異的であってもよい。

【0066】

上述の実施形態のいずれか１つに係る二量体抗原結合分子は、互いに会合して二量体抗原結合分子を形成する個々のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。よって、本発明のさらなる実施形態は、本明細書において上述したような二量体抗原結合分子のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡである。

【0067】

前記ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法、例えば、ペプチドリンカーで隔てられているか、又はペプチド結合で直接結合された第一ドメインＶ_ＬＡ、第二ドメインＶ_ＨＢ、第三ドメインＶ_ＬＢ、及び第四ドメインＶ_ＨＡをコードする遺伝子を、適切なプロモーターと機能的に結合し、任意で適切な転写ターミネーターと機能的に結合するように単一の遺伝的構築物に組み込み、それを細菌又は他の適当な発現系で発現させることによって構築してもよい。利用するベクター系及び宿主に応じて、適切な転写及び翻訳要素、例えば構成的及び誘導性プロモーターを何個でも用いることができる。プロモーターは、それぞれの宿主細胞でポリヌクレオチドを発現させるように選択される。

【0068】

上記ポリヌクレオチドは、選択された宿主における特定の発現に適合するように変更されたコドンバイアスでコドンが最適化されていてもよい。

【0069】

上記ポリヌクレオチドは、ベクターに、好ましくは発現ベクターに挿入されていてもよく、このようなベクターは、本発明のさらなる態様の１つである。これらの組換えベクターは当業者周知の方法に従って構築することができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．を参照されたい。

【0070】

本発明のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、それらを発現させるために、様々な発現ベクター／宿主系を利用することができる。このようなものとしては、これらに限定されるものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌、酵母発現ベクターで形質転換した酵母等の微生物；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で、もしくは細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；又は、例えばウイルスベースの発現系を利用できる動物細胞系が挙げられる。

【0071】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現に特に好ましい発現ベクターは、ｐＳＫＫであり（ＬｅＧａｌｌら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００４）２８５（１）：１１１−２７）、又は、哺乳動物細胞での発現に特に好ましい発現ベクターはｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。

【0072】

従って、本明細書に記載された二量体抗原結合分子は、上述のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド又はベクターを宿主細胞に導入して、該宿主細胞を該ポリペプチド鎖が発現されるような条件下で培養することによって生産してもよい。発現されたポリペプチド鎖から得られた二量体抗原結合分子は単離してもよく、任意でさらに精製してもよい。宿主細胞の増殖及び維持、並びにこれらの宿主細胞からの本発明の二量体抗原結合分子の発現、単離、及び精製のための条件は、本技術分野において詳細に述べられている。

【0073】

本発明は、さらなる態様において、本明細書に記載した二量体抗原結合分子又はポリヌクレオチドと、少なくとも１つのさらなる構成要素とを含む組成物を提供する。疾患又は障害の予防又は治療に使用するために、二量体抗原結合分子を含有し、又は抗原結合分子を形成するポリペプチド鎖をコードするポリ核酸分子を含有する組成物は、適切な薬学的に許容される担体と組み合わされることが好ましい。用語「薬学的に許容される担体」は、成分の生物活性の有効性に干渉せず、投与される患者に毒性を示さないあらゆる担体を包含する。適切な製剤用担体の例は本技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などを含む。このような担体は、従来の方法で配合することができ、さらに適切な用量で被験者に投与することができる。好ましくは、本組成物は滅菌されている。該組成物はまた、保存剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを含有してもよい。様々な抗菌剤及び抗真菌剤を包含させることにより、微生物の活動を確実に阻害することができる。適切な組成物は様々な方法で投与することができ、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所又は皮内投与によって投与することができる。投与経路は当然ながら治療法の種類、及び医薬組成物に含有される化合物の種類によって決まる。投薬レジメンは、担当医師、及び他の臨床的な要因によって決定され得る。医療分野において周知の通り、それぞれの患者に対する投与量は、患者の体重、体表面積、年齢、性別、投与される具体的な化合物、投与の時間及び経路、治療法の種類、全身の健康状態、ならびに同時投与される他の薬物などの多くの要因によって決まる。

【0074】

本発明はさらに、上述の二量体抗原結合分子の有効量を対象、例えば患者、に投与することによる、移植における、あるいは、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、アレルギー、又は癌（例えば、非ホジキンリンパ腫；慢性リンパ性白血病；ホジキンリンパ腫；乳癌、卵巣癌、結腸癌、腎臓癌若しくは胆管癌で発生する固形腫瘍等の固形腫瘍；微小残存病変；肺、骨、肝臓若しくは脳に転移した転移腫瘍等の転移腫瘍）の治療における免疫抑制治療のための医学的使用又は方法を提供する。抗原結合分子は、予防又は治療を目的として、単独で、又は既存の療法と組み合わせて用いることができる。

【0075】

本発明の抗原結合分子を用いて治療することができる癌としては、これらに限定されるものではないが、原発性及び転移性の副腎皮質癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、中枢神経系の腫瘍、末梢中枢神経系の癌、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、小児非ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍ファミリー（例えばユーイング肉腫）、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ヘアリーセル白血病、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭及び下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、小児白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、肝臓癌、肺癌、肺カルチノイド腫瘍、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔及び口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（成人の軟部組織癌）、黒色腫皮膚癌、非黒色腫皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌（例えば子宮肉腫）、膣癌、外陰癌、ならびにワルデンストレームマクログロブリン血症が挙げられる。

【0076】

「有効用量」は、疾患の経過及び重症度に影響を与えてこのような病状を軽減又は緩和するのに十分な活性成分の量を意味する。これらの疾患又は障害を治療及び／又は予防するのに用いられる「有効用量」は、当業者に公知の方法を用いて決定することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｇｏｄｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎ編．Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１−４６（１９７５）参照）。

【0077】

本発明の他の態様において、上述の二量体抗原結合分子は、免疫抑制薬、あるいは自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、アレルギー又は癌（例えば、非ホジキンリンパ腫；慢性リンパ性白血病；ホジキンリンパ腫；乳癌、卵巣癌、結腸癌、腎臓癌若しくは胆管癌で発生する固形腫瘍等の固形腫瘍；微小残存病変；肺、骨、肝臓若しくは脳に転移する転移腫瘍等の転移腫瘍）を治療するための医薬品の製造に用いられる。特定の多重特異性結合分子が、特定の疾患の治療において特に有用であると上述されている場合、これらの結合分子はその特定の疾患のための医薬品の製造に用いることができる。

【0078】

例えば、癌などの疾患の予防及び／又は治療における、医薬組成物、すなわち医薬品の調製方法及び抗原結合分子の臨床用途は、当業者に公知である。

【0079】

本発明の特定の態様において、二量体抗原結合分子は二重特異性であり、細胞傷害性エフェクター細胞を腫瘍細胞に対して再標的化するのに用いることができるため、癌治療に用いられる。このような治療概念は本技術分野で周知である。例えば、臨床研究により、抗ＣＤ３×抗腫瘍二重特異性抗体で処置した患者（例えば、Ｃａｎｅｖａｒｉ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、８７：１４６３−１４６９、１９９６）、又は抗ＣＤ１６×抗腫瘍二重特異性抗体で処置した患者（例えばＨａｒｔｍａｎｎら；Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１；７（７）：１８７３−８１）において腫瘍の縮小が示されている。また、例えば、Ｖ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡのドメイン順を有する二量体かつ四価のＣＤ３×ＣＤ１９抗原結合分子（Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓら；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００、６０：４３３６−４３４１）等や、又はＢｉＴＥ（登録商標）様式の単量体単鎖Ｆｖ抗体分子（異なる特異性を有する２つの単鎖抗体が共に結合したもの；Ｍｉｃｒｏｍｅｔ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｂａｒｇｏｕ Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８、３２１（５８９１）：９７４−９７７；Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ及びＲｅｉｎｈａｒｄｔ Ｃ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９、６９（１２）：４９４１−４９４４）を用いた近年の臨床研究において、可変ドメイン（Ｆｖ）のみを含む様々な組換え二重特異性抗体分子に関して概念が実証されている。本明細書に記載された二量体抗原結合分子は、同じ組合せの抗体特異性により治療（例えば細胞傷害性）メカニズムに方向付けることができるため、医薬品として使用することができ、かつ、本技術分野の二重特異性抗体と同様に治療に適用することができる。さらに、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３などのＣＤ３に対して単一の特異性がある免疫抑制抗体は、移植による拒絶反応、並びに腎臓移植（同種移植片）、肝臓及び心臓移植の急性拒絶反応を治療することが知られている。従って、アルブミン及びＣＤ３に対して二重特異性である抗原結合分子は、公知の単一特異性抗ＣＤ３抗体と同じ治療方法において用いることができる。さらに、本明細書で記載されたアルブミンと他の抗原、すなわち治療又は診断標的とに特異的な抗原結合分子は、アルブミン以外のそれぞれの抗原特異性の臨床用途に用いることができる。

【0080】

抗原結合分子及びその組成物は、経口、静脈内、腹腔内、又は他の薬学的に許容される投薬形態であってもよい。いくつかの実施形態において、本組成物は経口投与され、投薬形態は、錠剤、カプセル、カプレット、又は他の経口で利用可能な形態である。いくつかの実施形態において、本組成物は、非経口、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮下用であり、抗原結合分子を含有する溶液によって投与される。

【0081】

当業者であれば、本技術分野で公知の確立された技術及び標準的な方法を利用することにより、過度な作業を行うことなく本明細書において記載される抗原結合分子を構築して入手することが容易にできる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．；Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（２００２）；又はＡｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編；Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．ＩＩシリーズ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．）を参照されたい。加えて、当業者であれば、上述の各ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけてＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡのドメイン順を有する２つのポリペプチド鎖を含む二量体抗原結合分子が得られるように、本技術分野で公知の標準的な方法を利用して、かつ、ＵＳ７，１２９，３３０、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）２９３、４１−５６、又はＬｅ Ｇａｌｌら、２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １７：３５７−３６６に記載された方法を改変することにより本明細書に記載された抗原結合分子を作製することができる。

【0082】

さらに以下の実施例によって本発明を説明するが、それにより本発明の範囲が限定されるものではない。

【実施例1】

【0083】

Ｖ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡ以外のドメイン配置を用いて機能的な二量体タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））を構築するため、ヒト化抗ＣＤ１９単鎖抗体及びヒト化抗ＣＤ３単鎖抗体の２つのドメインをそれぞれ使用して、数種の二量体タンデムダイアボディを本発明のドメイン配置Ｖ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡと共に構築した。この結果は、ヒト化抗ＣＤ１９及びヒト化抗ＣＤ３抗体の両方について行われた親和性成熟の様々な段階の生成物を代表する各抗原結合分子の２種類の変異体を用いることによって確認した。

【0084】

それぞれＣＤ１９及びＣＤ３に対する抗体であるマウスモノクローナル抗体ＨＤ３７及びＵＣＨＴを、比較的高い親和性を有するヒト化抗体を得るための出発材料とした。それぞれのケースにおいて、まずＶ_ＨドメインをｓｃＦｖファージミドベクター中のヒトＶ_Ｌライブラリーと組み合わせて、ファージディスプレイにより適切なヒトＶ_Ｌ鎖を選択した。次のステップで、選択されたヒトＶ_Ｌ鎖を、ＣＤＲ３領域が不変のまま維持されたＶＨドメインライブラリーと組み合わせた。この手順により、それぞれＶＨＣＤＲ３領域に短いマウス配列のみを有する、ヒト化抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３が得られた。これらのクローンは、その後、抗原結合に関与すると考えられる残基に点突然変異を導入することにより親和性を成熟させた。次に、ファージディスプレイによって最良の結合を示す突然変異体を選択した。ＴａｎｄＡｂを構築するために選択されたクローンは、ＣＤ１９と結合したＭ１３及びＭ３９、ならびにＣＤ３と結合したＣ４及びＬｃＨＣ２１であった。

【0085】

以下の抗体を作製した：
抗体Ａ１：ＣＤ１９^Ｍ３９×ＣＤ３^Ｃ４（オプション０）Ｖ_Ｈ^{ＣＤ３Ｃ４}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ１９Ｍ３９}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ１９Ｍ３９}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ３Ｃ４}
抗体Ｂ：ＣＤ１９^Ｍ３９×ＣＤ３^Ｃ４（オプション２）Ｖ_Ｌ^{ＣＤ３Ｃ４}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ１９Ｍ３９}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ１９Ｍ３９}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ３Ｃ４}
抗体Ａ２：ＣＤ１９^Ｍ１３×ＣＤ３^{ＬＣＨＣ２１}（オプション０）Ｖ_Ｈ^{ＣＤ３ＬＣＨＣ２１}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ１９Ｍ１３}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ１９Ｍ１３}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ３ＬＣＨＣ２１}
抗体Ｃ：ＣＤ１９^Ｍ１３×ＣＤ３^{ＬＣＨＣ２１}（オプション２）Ｖ_Ｌ^{ＣＤ３ＬＣＨＣ２１}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ１９Ｍ１３}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ１９Ｍ１３}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ３ＬＣＨＣ２１}。

【0086】

抗体Ｂのハイブリッド単量体Ｖ_Ｌ^{ＣＤ３Ｃ４}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ１９Ｍ３９}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ１９Ｍ３９}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ３Ｃ４}と、抗体Ｃのハイブリッド単量体Ｖ_Ｌ^{ＣＤ３ＬＣＨＣ２１}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ１９Ｍ１３}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ１９Ｍ１３}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ３ＬＣＨＣ２１}とをコードするプラスミドは、ＤＮＡ操作及び加工を行う業者が作製した。Ｖ_Ｌ^{ＣＤ３Ｃ４}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ１９Ｍ３９}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ１９Ｍ３９}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ３Ｃ４}単量体の配列主鎖は、２種のｓｃＦｖ抗体、すなわちｓｃＦｖＣＤ１９^Ｍ３９及びｓｃＦｖＣＤ３^Ｃ４のそれぞれのＤＮＡ配列を含む。Ｖ_Ｌ^{ＣＤ３ＬＣＨＣ２１}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ１９Ｍ１３}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ１９Ｍ１３}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ３ＬＣＨＣ２１}単量体配列は、単鎖Ｆｖ ＣＤ１９^Ｍ１３及び単鎖Ｆｖ ＣＤ３^{ＬＣＨＣ２１}の可変ドメインを組み合わせた。４種全てのｓｃＦｖは、抗原ＣＤ１９及びＣＤ３に対する単鎖抗体のファージディスプレイによる選択で得た。両ケースにおいて、配列情報を用いて上記のハイブリッド単量体を構築した。９アミノ酸（Ｇ_２Ｓ）_３リンカーを用いて、ドメインを互いに結合させた。Ｖ_Ｌ^{ＣＤ３Ｃ４}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ１９Ｍ３９}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ１９Ｍ３９}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ３Ｃ４}をコードする合成遺伝子を、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ５ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。また、Ｖ_Ｌ^{ＣＤ３ＬＣＨＣ２１}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ１９Ｍ１３}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ１９Ｍ１３}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ３ＬＣＨＣ２１}の遺伝子も発現ベクターにクローニングし、ＮｃｏＩ切断部位を導入したフォワードプライマーとＮｏｔＩ切断部位を導入したリバースプライマーとを用いたＰＣＲで増幅した。アガロースゲルによる解析及び単離の後、続いてＰＣＲ産物をＮｃｏＩとＮｏｔＩとで二重に消化し、ＮｃｏＩとＮｏｔＩとで直線化したｐＳＫＫ３ベクターにクローニングした。ＤＮＡ配列解析で正確なクローニングを確認した。

【0087】

図６に抗体ＢをコードするｐＣＤＮＡ５ＦＲＴのベクターマップを示す。図７に抗体ＣをコードするｐＳＫＫ３のベクターマップを示す。

【0088】

高レベルの生産のために、遺伝子Ｖ_Ｌ^{ＣＤ３Ｃ４}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ１９Ｍ３９}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ１９Ｍ３９}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ３Ｃ４}を含有するベクターを（ＣａＰＯ_４を用いて）接着性ＨＥＫ２９３細胞に一過性に導入した。タンパク質の発酵は、本技術分野で周知の増殖条件下で行われた。

【0089】

組換えタンパク質は、シグナルペプチドを有するＨｉｓ−タグ融合タンパク質として発現させた。タンパク質を、既述の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９３、４１−５６）によって細胞培養上清から単離した。続いて、精製した物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色と、リン酸ナトリウム緩衝液（３０ｍＭのＮａＰＯ_４、０．７５Ｍアルギニン／ＨＣｌ、ｐＨ６．０）中の較正済みのスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ＨＲ１０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によるサイズ排除クロマトグラフィーにより、組換えタンパク質（抗体Ｂ）が純粋であり正確にアセンブルされたことがわかった。

【0090】

高レベルの発現のために、ヒト化Ｖ_Ｌ^{ＣＤ３ＬＣＨＣ２１}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ１９Ｍ１３}−Ｖ_Ｌ^{ＣＤ１９Ｍ１３}−Ｖ_Ｈ^{ＣＤ３ＬＣＨＣ２１}単量体とそれに続く６×Ｈｉｓ−タグをコードする遺伝子を、ｈｏｋ／ｓｏｋ遺伝子細胞自殺システムとＳｋｐ／ＯｍｐＨペリプラズム因子をコードするｓｋｐ遺伝子とを含有するｐＳＫＫ３プラスミドにクローニングした（ＬｅＧａｌｌら、２００４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８５、１１１−１２７）。このプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株（ＡＴＣＣ ３１６０８（商標））にトランスフェクションした。

【0091】

形質転換細菌を、基本的には記述の通り（Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６５、８８８−８９５）振盪フラスコ中で増殖させ誘導した。既述の方法（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９３、４１−５６）に従い、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって可溶性ペリプラズム分画と細菌培地の上清との両方から組換えタンパク質を単離した。

【0092】

続いて、精製した材料を、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥと、リン酸ナトリウム緩衝液（３０ｍＭのＮａＰＯ_４、０．７５Ｍアルギニン／ＨＣｌ、ｐＨ６．０）中の較正済みのスーパーデックス２００ＨＲ１０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でのサイズ排除クロマトグラフィーとで解析した。生成物は、純粋であり正確にアセンブルされたようであった。

【0093】

比較用の抗体Ａ１及びＡ２を、それぞれ抗体Ｂ及びＣと同様に作製したが、この場合、抗体Ａ１及びＡ２それぞれのドメイン順は、抗体Ｂ及びＣそれぞれのドメイン順とは逆となるようにした。

【0094】

細胞傷害性アッセイを、基本的にはＴ．Ｄｒｅｉｅｒら（２００２、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １００、６９０−６９７）で記載された方法で行った。健康な志願者の末梢血液からエフェクター細胞として用いるＰＭＢＣを密度勾配遠心分離によって単離した。いくつかのケースでは、ＰＢＭＣを、２５Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−２の存在下で一晩培養した後、それらを細胞傷害性アッセイにおいてエフェクター細胞として用いた。それぞれのケースにおいて、単離されたＰＢＭＣの純度及び抗原発現をフローサイトメトリーによって確認した（データ非図示）。

【0095】

ＣＤ１９^＋ＪＯＫ−１又はＲａｊｉ標的細胞を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウム、及び１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ１６４０培地（本明細書では、ＲＰＭＩ培地と呼ぶ；全ての構成成分はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養した。細胞傷害性アッセイのために、細胞を、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地中で、３７℃で３０分、１０μＭカルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。穏やかに洗浄した後、標識した細胞を１×１０^５個／ｍＬの密度となるようにＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。次に１×１０^４個の標的細胞を５×１０^５個のＰＢＭＣと一緒に、丸底９６ウェルマイクロプレートの個々のウェルに、１ウェルあたりの全体積が２００μＬとなるように、示された抗体と共に播種した。２００ｇで２分間遠心分離した後、アッセイを、５％ＣＯ_２、加湿雰囲気中、３７℃で４時間培養した。培養終了の１５分前に、２０μＬのＲＰＭＩ培地中の１０％トリトンＸ−１００を標的細胞のみを含むウェルに添加した。その他の全てのウェルには２０μＬのＲＰＭＩ培地を添加した。５００ｇで５分間、追加の遠心分離を行った後に各ウェルから１００μＬの細胞培養上清を回収し、放出されたカルセインの５２０ｎｍにおける蛍光を、蛍光プレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。測定されたカウントに基づき、以下の式に従って特異的な細胞溶解を計算した：［蛍光（サンプル）−蛍光（自然発生）］／［蛍光（最大）−蛍光（自然発生）］×１００％。蛍光（自然発生）は、エフェクター細胞及び抗体の非存在下における標的細胞からの蛍光カウントを示し、蛍光（最大）は、トリトンＸ−１００添加により誘導された全細胞溶解を示す。プリズム（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてＳ字状の用量応答曲線及びＥＣ_５０値を計算した。

【0096】

結果：
図３に、Ｎ末端から開始するそれぞれ以下のドメイン順、Ｖ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡ（抗体Ａ）及びＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡ（抗体Ｂ）を有するタンデムダイアボディについての、抗ＣＤ１９変異体Ｍ３９及び抗ＣＤ３変異体Ｃ４を用いた細胞傷害性アッセイの結果を示す。

【0097】

驚くべきことに、これら２種のタンデムダイアボディの細胞傷害性活性に極めて大きい差がみられた。所与の条件下でＥＣ_５０値を比較することにより決定されたように、「抗体Ｂ」と名付けられた本発明に係るドメイン配置を有するタンデムダイアボディの活性は、「抗体Ａ」と名付けられたタンデムダイアボディよりも６０倍超高かった。

【0098】

抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３抗体の２種類の追加の変異体を用いることによって、本発明で示されたドメイン配置（抗体Ｃ）が、より優れた細胞傷害性を有することが確認された（図４参照）。

【0099】

オプション２で示された本発明に係るドメイン順を有するタンデムダイアボディのＥＣ_５０値は極めて低い（０．１ｐＭ）。その活性は、所与の条件下でＥＣ５０値を比較すると、オプション０で示されたＴａｎｄＡｂよりも２７倍高い。

【実施例2】

【0100】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）×ＣＤ３ ＴａｎｄＡｂ抗体によるＴ細胞受容体の調節
異なるドメイン順を有するＨＳＡ×ＣＤ３ ＴａｎｄＡｂ抗体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＴ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３調節の誘導における差を決定するため、ＣＤ３^＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を、段階的に濃度を増加させた二重特異性ＨＳＡ×ＣＤ３ ＴａｎｄＡｂ抗体の存在下で培養し、その後、残存したＴＣＲについて解析した。調節のアッセイは、ＨＳＡ存在下又は非存在下で行われ、ＨＳＡのＴａｎｄＡｂ活性への影響を測定した。

【0101】

簡単には、１×１０^６個のＪｕｒｋａｔ細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウム、及び１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン（全ての構成成分はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）添加ＲＰＭＩ１６４０培地中、丸底９６ウェルマイクロプレートの個々のウェルに播種した。別のマイクロプレートに、５０ｍｇ／ｍＬのＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加したこと以外は上述のとおりにしてＲＰＭＩ培地中、Ｊｕｒｋａｔ細胞を播種した。指定された抗体を添加した後、細胞を、５％ＣＯ_２存在下、加湿したインキュベーター中、３７℃で、１ウェルあたりの全体積を２００μＬとして培養した。対照として、細胞を抗体の非存在下で培養した。２％の熱不活化ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び０．１％アジ化ナトリウム（Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）添加氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＦＡＣＳ緩衝液と称する）で洗浄した後、細胞を、全体積を１００μＬとしてＦＡＣＳ緩衝液中の１０μＬのＰＣ５コンジュゲート抗ＴＣＲα／β抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）により、暗所、氷上で４５分間染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＦＣ５００ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて１０^４個の細胞の６７５ｎｍにおける蛍光を測定した。ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて平均蛍光値を決定し、これをグラフパッドプリズムバージョン３．０３（Ｗｉｎｄｏｗｓ用）、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡを用いた非線形回帰による解析／４パラメーターのロジスティックフィットに用いた。

【0102】

ＴＣＲ調節実験ＣＡＢ−３０６で得られた結果を図５に示し、また、表１に要約した。Ｖ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡ（＝オプション０）及びＶ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡ（＝オプション２）のドメイン順を有するＨＳＡ×ＣＤ３ ＴａｎｄＡｂはいずれも、同等のＴＣＲ調節能を有することを示し、これはＨＳＡが抗原Ｂの場合における調節能を示していた。しかし、生理学的な濃度のＨＳＡの存在下では、オプション０（Ｖ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡ）のＴａｎｄＡｂの調節能は顕著に減少するが、オプション２（Ｖ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡ）の向きのＴａｎｄＡｂのＥＣ_５０値は２．６倍増加するだけである。

【0103】

これらのデータから明らかに、オプション２のドメイン方向（Ｖ_ＬＡ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＡ）を有するＨＳＡ×ＣＤ３ ＴａｎｄＡｂが、オプション０（Ｖ_ＨＡ−Ｖ_ＬＢ−Ｖ_ＨＢ−Ｖ_ＬＡ）のＨＳＡ×ＣＤ３ ＴａｎｄＡｂと比較して優れた特性を有することが示された。

【表1】

【0104】

表１：ＴＣＲ調節実験の結果の要約：ＨＳＡ存在下又は非存在下における２種のＨＳＡ×ＣＤ３ ＴａｎｄＡｂ抗体を用いたＴＣＲ調節実験から得られたＥＣ_５０値（図５；実験ＣＡＢ−３０６）を、非線形回帰／４パラメーターのロジスティックフィットによって決定した。

【0105】

本明細書において本発明の好ましい実施形態を示して記載したが、当業者はこのような実施形態は単なる例として提供されるものであることを当然に理解するものである。当業者であれば、本発明から逸脱することなく多数のバリエーション、変更、及び置換が可能である。本発明の実施において、本明細書において記載した本発明の実施形態の様々な代替物を使用することが可能であることが理解されるはずである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義することを意図するものであり、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物が該請求項に包含されるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】