特許 5940212 ギンコライドの抽出分離方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5940212

(24)【登録日】2016年5月27日

(45)【発行日】2016年6月29日

(54)【発明の名称】ギンコライドの抽出分離方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 493/22 20060101AFI20160616BHJP

【ＦＩ】

   C07D493/22

【請求項の数】15

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2015-507330(P2015-507330)

(86)(22)【出願日】2012年5月17日

(65)【公表番号】特表2015-514785(P2015-514785A)

(43)【公表日】2015年5月21日

(86)【国際出願番号】CN2012075633

(87)【国際公開番号】WO2013159412

(87)【国際公開日】20131031

【審査請求日】2014年12月25日

(31)【優先権主張番号】201210121252.0

(32)【優先日】2012年4月23日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】514268590

【氏名又は名称】チェンデュ バイユ テクノロジー ファーマシー カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100109726

【弁理士】

【氏名又は名称】園田 吉隆

(74)【代理人】

【識別番号】100101199

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 義教

(72)【発明者】

【氏名】スン， イー

(72)【発明者】

【氏名】チュー， ヨンホン

(72)【発明者】

【氏名】トン， チョンピン

(72)【発明者】

【氏名】ワン， チエ

【審査官】 早川 裕之

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０３−０２４０８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−１２８７９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−０６４１９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５１９３８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５１４７６１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ ４９３／２２

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ギンコライドの抽出分離方法であって、
イチョウ葉を粉砕し、有機溶媒を加えて抽出を行い、濃縮された抽出液に抗酸化剤を加え、ｐＨ調節剤を用いてｐＨ値を４〜５に調節し、濃縮し、冷蔵し、
前記抽出に使う有機溶媒がエタノール、アセトンまたは酢酸エチルであり、濃度が５０〜８０％ｖ／ｖで、用量が５〜１２倍である、抽出ステップＡ、
冷蔵された後の濃縮液をまずノルマルヘキサンまたは石油エーテルで２〜３回抽出し、水相を脂溶性溶媒で４〜５回抽出し、さらに水飽和２−ブタノール−酢酸エチル混合溶媒または水飽和ｎ−ブタノール−酢酸エチル混合溶媒で４〜５回抽出し、有機相抽出液を併せて、減圧濃縮する、抽出ステップＢ、
抽出濃縮液をポリアミド樹脂カラムに通過させ、順に１〜５ＢＶの水、３〜５ＢＶの２０％〜４０％ｖ／ｖのエタノール、２〜３ＢＶの６０％〜９０％ｖ／ｖのエタノールで溶出し、溶出液の流速を２〜３ＢＶ／ｈに制御しながら、溶出を行い、溶出液を併せて、減圧濃縮し、乾燥する、カラムクロマトグラフィーステップＣ、
カラムクロマトグラフィーされた後の乾燥物を沸騰水に加え、撹拌して溶解させ、冷却し、上澄み液を等体積の酢酸エチル、蟻酸エステルまたはアセトンで４〜５回抽出し、抽出液を併せて、減圧濃縮し、蒸発乾燥させ、５〜８倍量の３０％〜５０％ｖ／ｖエタノールを加えて加熱撹拌して溶解させ、ろ過を行い、冷蔵し、結晶を析出させ、ろ過して、ろ液Ｉとして用意しておき、結晶を３０％〜５０％ｖ／ｖのエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶Ｉを得、
ろ液Ｉをアルコール含有量が１０％〜３０％ｖ／ｖになるまで濃縮し、冷蔵して、結晶を析出させ、ろ過を行い、ろ液ＩＩとして用意しておき、３０％〜５０％ｖ／ｖのエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶ＩＩを得、
ろ液ＩＩを濃縮し、０．１％〜０．５％の活性炭を加えて吸着させ、ろ過を行い、ろ液をアルコール含有量が１０％〜３０％ｖ／ｖになるまで濃縮し、冷蔵し、結晶を析出させ、ろ過して、ろ液ＩＩＩとして用意しておき、結晶を３０％〜５０％ｖ／ｖのエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶ＩＩＩを得、
ろ液ＩＩＩを濃縮し、活性炭−シリカゲルカラムクロマトグラフィーし、まず３０％〜５０％ｖ／ｖのエタノールで溶出し、さらに７０％〜９０％ｖ／ｖのエタノールで溶出し、溶出液を収集してアルコール含有量が１０％〜３０％ｖ／ｖになるまで濃縮し、冷蔵し、結晶を析出させ、ろ過を行い、ろ液ＩＶとして用意しておき、結晶を３０％ｖ／ｖエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶ＩＶを得、
ろ液ＩＶを濃縮し、冷蔵して、結晶を析出させ、ろ過を行い、結晶を３０％ｖ／ｖのエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶Ｖを得る、結晶析出ステップＤ、
結晶Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖを混合して均一化させ、粉砕を行って、ギンコライドを得る、結晶混合ステップＥ、を含むことを特徴とするギンコライドの抽出分離方法。

【請求項2】

ステップＡの前記抽出方法が還流抽出または煎じ抽出であることを特徴とする請求項１に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項3】

前記還流抽出はエタノール、アセトンまたは酢酸エチルを使用して抽出を行い、そのうち、異なる抽出溶媒の濃度及び抽出条件が以下の通りであり、
エタノール：濃度が５０％〜８０％ｖ／ｖ、抽出温度が７５〜８５℃、抽出回数が２〜３回、時間が１〜２時間／回であり、
アセトン：濃度が５０％〜８０％ｖ／ｖ、抽出温度が４５〜５５℃、抽出回数が２〜３回、時間が１〜２時間／回であり、
酢酸エチル：濃度が５０％〜８０％ｖ／ｖ、抽出温度が５５〜６５℃、抽出回数が２〜３回、時間が１〜２時間／回であることを特徴とする請求項２に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項4】

前記還流抽出はエタノール、アセトンまたは酢酸エチルを使用して抽出を行い、そのうち、異なる抽出溶媒の濃度及び抽出条件が以下の通りであり、
エタノール：濃度が６５％ｖ／ｖ、抽出温度が７５〜８５℃、抽出回数が３回、時間が１．５時間／回であり、
アセトン：濃度が５０％ｖ／ｖ、抽出温度が４５〜５５℃、抽出回数が３回、時間が１．５時間／回であり、
酢酸エチル：濃度が６０％ｖ／ｖ、抽出温度が５５〜６５℃、抽出回数が３回、時間が１．５時間／回であることを特徴とする請求項３に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項5】

前記煎じ抽出はエタノール、アセトンまたは酢酸エチルを使用して抽出を行い、そのうち、異なる抽出溶媒の濃度及び抽出条件が以下の通りであり、
エタノール：濃度が５０％〜８０％ｖ／ｖ、抽出温度が８０〜９０℃、抽出回数が２〜３回、時間が１〜２時間／回であり、
アセトン：濃度が５０％〜８０％ｖ／ｖ、抽出温度が５０〜６０℃、抽出回数が２〜３回、時間が１〜２時間／回であり、
酢酸エチル：濃度が５０％〜８０％ｖ／ｖ、抽出温度が６０〜６５℃、抽出回数が２〜３回、時間が１〜２時間／回であることを特徴とする請求項２に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項6】

前記煎じ抽出はエタノール、アセトンまたは酢酸エチルを使用して抽出を行い、そのうち、異なる抽出溶媒の濃度及び抽出条件が以下の通りであり、
エタノール：濃度が６５％ｖ／ｖ、抽出温度が８０〜９０℃、抽出回数が３回、時間が１．５時間／回であり、
アセトン：濃度が５０％ｖ／ｖ、抽出温度が５０〜６０℃、抽出回数が３回、時間が１．５時間／回であり、
酢酸エチル：濃度が６０％ｖ／ｖ、抽出温度が６０〜６５℃、抽出回数が３回、時間が１．５時間／回である、ことを特徴とする請求項５に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項7】

ステップＡの前記抗酸化剤が中性のアミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項8】

ステップＡの前記抗酸化剤がセリン、メチオニン、アスパラギンまたはトレオニンのうちの少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項9】

ステップＡの前記抗酸化剤がメチオニンであることを特徴とする請求項１に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項10】

ステップＡの前記ｐＨ調節剤が有機弱酸であることを特徴とする請求項１に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項11】

ステップＡの前記ｐＨ調節剤がクエン酸、リンゴ酸またはソルビン酸のうちの少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項12】

ステップＡの前記ｐＨ調節剤がクエン酸であることを特徴とする請求項１に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項13】

ステップＢの前記脂溶性溶媒が酢酸エチル、蟻酸エステル、アセトン、ブタノンのうちの少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項14】

カラムクロマトグラフィーステップＣの前記ポリアミド樹脂カラムにおけるポリアミド樹脂の粒度が３０〜６０メッシュである、ことを特徴とする請求項１に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【請求項15】

結晶析出ステップＤの前記活性炭−シリカゲルカラムにおける活性炭とシリカゲルとの体積比が１：１〜１：３であることを特徴とする請求項１に記載のギンコライドの抽出分離方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、植物の抽出分野、具体的には、ギンコライドの抽出分離方法に関する。

【背景技術】

【0002】

前世紀６０年代から、多くの国が現代分離技術を使用してイチョウ葉の化学成分に対する研究を行っており、薬理実験及び臨床検証によって、イチョウ葉の多くの面の生物活性がそれに含有されている特定の化学成分に関わっていることを発見した。ドイツＤｒ．Ｗｉｌｌａｒ Ｓｃｈｗａｂｅは初めてイチョウ葉の１種の簡単な抽出物を登録し、１９７２年に特許（Ｗ Ｓｃｈｗａｂｅ ＤＥ１７６７０８及びＤＥ２１１７４２９）を出願し、当該抽出物はＥＧｂ７６１と名付けられ、心脳血管疾患及び神経系疾患の治療に使用され、顕著な治療効果を有し、且つ毒性・副作用を有しない。ギンコライド系化合物（ｇｉｎｋｇｏｌｉｄｓ）は強い血小板活性化因子（ＰＡＦ）拮抗作用を有する。イチョウ製剤が治療薬としてリストされている国はドイツ、フランス及び中国が挙げられ、その他の国では保健食品または非処方薬として用いられており、米国で開発されたイチョウ保健食品は既にＦＤＡの承認を得た。

【0003】

ギンコライドはテルペノイドに属し、テルペンラクトンと呼ばれ、セスキテルペンラクトン及びジテルペノイドから構成され、イチョウ葉の重要な活性成分の一種である。ビロバリド（ｂｉｌｏｂａｌｉｄｅ）はセスキテルペンラクトンに属し、１９６７年にＲ．Ｔ．Ｍａｊｏｒ及び１９６９年にＫ．Ｗｅｉｎｇｅｓに分離して得られ、現在イチョウ葉から発見された唯一のセスキテルペンラクトン化合物である。ギンコライドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｍ、Ｊ（ｇｉｎｋｇｏｌｉｄ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｍ、Ｊ）はジテルペノイド化合物であり、１９３２年にＳ．Ｆｕｒｕｋａｗａによって初めてイチョウ葉から分離され、１９６７年にやっとＫ．Ｎａｋａｎｉｓｈ、Ｍ．Ｍａｒｕｙａｍａ及びＫ．Ｏｋａｂｅらによってさらに分離及びその化学構造が確定された。構造から見ると、ビロバリド類分子骨格は１５つの炭素原子によって構成され、相互に縮合している４つの五員環を有し、そのうち１つは五員炭素環で、３つは五員ラクトン炭素環であり、五員環には１つの天然生成物にめったに見られないｔ−ブチルが連接される。ビロバリドは非常に強い生物活性を有し、神経の成長を促進する作用を有し、脳細胞ミトコンドリアが酸化ストレスによる機能変化を防止でき、高齢者の記憶機能を改善し、アルツハイマー型認知症の発生を防止することができ、及び脳、脊髄神経の脱髄疾患を防止する作用を有し、その神経への営養、神経への保護作用はギンコライドより強い。ギンコライドＢは抗炎症、抗ショック、心脳血管保護、急性膵炎治療等の作用を有する。ギンコライド類化合物の分子骨格は２０つの炭素原子によって構成され、６つの五員環を有し、そのうち、２つは五員炭素環で、３つは五員ラクトン環で、１つはテトラヒドロフラン環であり、２つの五員炭素環がスピロの形でつながっており、それ以外の環が縮合の形でつながっており、１つの剛性蘢状の特殊な立体化学構造を形成される。ギンコライド分子は共に天然生成物にめったに見られないｔ−ブチルを有する。ギンコライドはジテルペノイド類及びセスキテルペンラクトン類を含み、ジテルペノイドは主にギンコライドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｊ、Ｍ等を有し、セスキテルペンラクトンはビロバリドを有する。

【0004】

２０世紀７０年代初期にＰＡＦが発見されて以降、薬理学者はギンコライドに対する研究を行い、ギンコテルペンラクトンが強い血小板活性化因子拮抗剤であり、免疫システム、中枢神経システム、虚血性損傷に対して保護作用を有し、且つ抗ショック、抗アレルギー及び抗炎症作用を有することを明確化した。ギンコライドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｍ、Ｊの構造の相違点は含有されているヒドロキシル基の数及びヒドロキシル基の連接する位置が異なっていることにある。ギンコライドが共に強い血小板活性化因子拮抗剤で、イチョウ葉内の特殊な生理活性の重要成分である。

【0005】

ギンコライドは血小板活性化因子ＰＡＦ受容体に対して強大な特異性阻害作用を有し、そのうち、ギンコライドの抗ＰＡＦ活性が一番高い。ＰＡＦは血小板及び複数種の炎症組織の分泌により生成された１種の内因性リン脂質で、今まで発見された最も有効な血小板凝集惹起剤であり、多くの病気の発生、発展と深く関わっている。一方、ギンコライドは最も臨床応用性を持っている天然ＰＡＦ受容体拮抗剤と認められ、その拮抗作用活性が化学構造と深く関わっている。ラクトン構造におけるＲ３がヒドロキシル基またはヒドロキシル基の数が増加する時、ＰＡＦに対する拮抗活性が弱くなり、一方、Ｒ２がヒドロキシル基且つＲ３がＨである時、活性が顕著に増強され、そのうち、ギンコライドＢのＰＡＦに対して生じる拮抗作用が最も強い。

【0006】

ギンコライドの抽出及び純化する方法が比較的多く、主に溶媒抽出法、カラム抽出法、溶媒抽出-カラム抽出法、超臨界抽出法及びクロマトグラフまたはカラムクロマトグラフィー純化法等を有する。前記方法は全て、高い含有量のギンコライドを有効に分離できず、且つギンコライドの各組成の割合が確定できないため、臨床使用上の薬効がそれぞれ違っており、その含有量が高くないため、ある程度の安全リスクが存在し、完成した薬理毒性及び臨床試験データがないため、前記方法は全て試験段階となっており、薬品の生産過程には実施されておらず、中国ではギンコライド注射液に関する特許があるが、その組成は全て本発明と異なっており、ＩＣＨ加盟国の多数のオフィシャルウェブサイトを検索した結果、これまではその他のギンコライド注射剤製品はまだ市販されていない。現在、ギンコライド類成分の測定にはＨＰＬＣ−ＵＶ法、ＨＰＬＣ−ＭＳ及びＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ法が多く使用され、これらの方法はギンコライドの各成分の含有量に対してのみ測定できる、その製品における副作用物質に対する厳しい制御が欠乏しているため、薬品の品質特性を誠実に反映できず、１つの完備した薬品品質制御体系を形成できず、ギンコライドの発明特許は非常に多いが、制御方法が簡単すぎて、ギンコライドの組成の割合が一定化されていないため、漢方薬注射剤にすることができず、臨床の治療効果及び応用の安全性を保証できない。

【0007】

中国、ドイツ等の国ではギンコライドに関する特許及び発表が多くされているが、本発明の工程プロセス、品質制御技術及び臨床適応症はその他の発明特許とまったく異なる点を有し、特に異なる分離純化プロセスにより得たテルペンラクトンの成分がそれぞれ違っており、今まで４種の成分（ギンコライドＡ、Ｂ、Ｃ及びビロバリド）の割合が固定しているギンコライド有効部位組成物の抽出プロセスに関する発表はなく、ギンコライドにおける４種の成分のフィンガープリント制御技術及び残留可能な大きい分子、蛋白質に対する検査方法の発表もなかった。本発明により調製されたギンコライド注射液は既に国家食品薬品監督管理局の許可番号、国薬準字：Ｚ２０１１００３５を得ており、現在世界で初めてのイチョウ有効部位注射剤であり、製品の構造がはっきりと明確である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明が解決しようとする技術的課題は、ギンコライドの抽出分離方法を提供することであり、当該抽出分離方法では組成が固定しているギンコライドを得ることができる。当該方法のステップは以下の通りである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

ステップＡ、抽出：イチョウ葉を粉砕し、有機溶媒を加えて抽出を行い、濃縮された抽出液に抗酸化剤を加え、ｐＨ調節剤を用いてｐＨ値を４〜５に調節し、濃縮して冷蔵する。

【0010】

なお、抽出有機溶媒はエタノール、アセトンまたは酢酸エチルで、濃度が５０〜８０％ｖ／ｖで、用量が５〜１２倍の量で、最も好適な用量が６〜１０倍であり、

【0011】

抽出方法は還流抽出または煎じ抽出である。

【0012】

１） 還流抽出：
５０％〜８０％ｖ／ｖエタノール：抽出温度が７５〜８５℃で、抽出回数が２〜３回で、時間が１〜２時間／回であり、
５０％〜８０％ｖ／ｖアセトン：抽出温度が４５〜５５℃で、抽出回数が２〜３回で、時間が１〜２時間／回であり、
５０％〜８０％ｖ／ｖ酢酸エチル：抽出温度が５５〜６５℃で、抽出回数が２〜３回で、時間が１〜２時間／回であり、
真空度：−０．０２〜０．０８ＭＰａ
好ましい抽出条件が：３回抽出して、毎回１．５時間で、エタノールの適当な濃度が６５％ｖ／ｖで、アセトンの適当な濃度が５０％ｖ／ｖで、酢酸エチルの適当な濃度が６０％ｖ／ｖである。

【0013】

２） 煎じ抽出：
５０％〜８０％ｖ／ｖエタノール：抽出温度が８０〜９０℃で、抽出回数が２〜３回で、時間が１〜２時間／回であり、
５０％〜８０％ｖ／ｖアセトン：抽出温度が５０〜６０℃で、抽出回数が２〜３回で、時間が１〜２時間／回であり、
５０％〜８０％ｖ／ｖ酢酸エチル：抽出温度が６０〜６５℃で、抽出回数が２〜３回で、時間が１〜２時間／回であり、
好ましい抽出条件が：3回抽出して、毎回１．５時間で、エタノールの適当な濃度が６５％ｖ／ｖで、アセトンの適当な濃度が５０％ｖ／ｖで、酢酸エチルの適当な濃度が６０％ｖ／ｖである。

【0014】

抽出液が濃縮過程において熱を受けた後はギンコライドが分解されやすいため、保護剤及びｐＨ調節剤を添加することが必要である。保護剤を添加する目的はギンコライドが熱を受けて酸化分解されることを防止することにあり、使用可能な抗酸化剤は主にセリン、メチオニン、アスパラギン、トレオニンを含む中性アミノ酸のうちの少なくとも１種であり、メチオニンが好ましい。

【0015】

ｐＨ調節剤が主に有機弱酸であり、クエン酸、リンゴ酸、ソルビン酸のうちの少なくとも１種を含み、好ましくはクエン酸でｐＨ値を調節し、その弱酸性を利用して安定剤とし、ギンコライドのアルカリ性条件における開環を防止する。その原因はギンコライドの構造が５員環で、弱酸性下で安定であり、クエン酸が弱酸であることであるため、ギンコライドのアルカリ条件における開環を防止できる。

【0016】

ステップＡの冷蔵の目的は油水分離させることによって、水における脂溶性不純物を除去することにある。

【0017】

ステップＢ、抽出：濃縮液をまずノルマルヘキサンまたは石油エーテルで２〜３回抽出し（好ましくは等体積のノルマルヘキサンまたは石油エーテルで抽出する）、水相は脂溶性溶媒で４〜５回抽出し（好ましくは等体積の酢酸エチルで抽出する）、さらに水飽和２ーブタノール（ｎ−ブタノール）−酢酸エチル混合溶媒で４〜５回抽出し（好ましくは等体積の水飽和２−ブタノール−酢酸エチル混合溶媒で抽出する）、有機相抽出液を併せて、減圧濃縮する。

【0018】

なお、まずノルマルヘキサンまたは石油エーテルで抽出を行う目的は葉緑素、ギンコール酸等の不純物を除去することにある。

【0019】

さらに脂溶性溶媒でギンコライドを抽出し、使用可能な脂溶性溶媒は酢酸エチル、蟻酸エチル、アセトン、ブタノンのうちの少なくとも１種である。

【0020】

ギンコテルペンラクトンが酢酸エチルに溶けやすく、ギンゲチンは酢酸エチルにおいて溶解性が比較的低く、熱水及び含水アルコールにおいて溶解度が比較的大きいため、酢酸エチルを用いてギンコライドを抽出することができ、ギンゲチン類化合物と分離させ、分離し得たギンコライド粗生成物はさらに活性炭、シリカゲルまたは樹脂カラム吸着クロマトグラフィーによって不純物を除去することができ、その後含水アルコールにおいて結晶させれば純度の比較的高いギンコライドを得ることができる。

【0021】

ステップＣ、カラムクロマトグラフィー：抽出液をポリアミド（３０〜６０メッシュ）樹脂カラムを経由させ、順に１〜５ＢＶ水、３〜５ＢＶ２０％〜４０％ｖ／ｖエタノール、２〜３ＢＶ６０％〜９０％ｖ／ｖエタノールで、溶出液の流速を２〜３ＢＶ／ｈに制御しながら、溶出を行い、溶出液を併せて、減圧濃縮し、乾燥する。

【0022】

ステップＤ、結晶析出：カラムクロマトグラフィーされた後の乾燥物を沸騰水に加え、撹拌して溶解させ、冷却し、上澄み液を等体積の酢酸エチル、蟻酸エチルまたはアセトンで４〜５回抽出し、抽出液を併せて、減圧濃縮し、蒸発乾燥させ、５〜８倍量の３０％〜５０％ｖ／ｖエタノールを加えて加熱撹拌して溶解させ、ろ過を行い、冷蔵し、結晶を析出させ、ろ過して、ろ液Ｉとして用意しておき、結晶を３０％〜５０％ｖ／ｖエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶Ｉを得る。

【0023】

ろ液Ｉをアルコール含有量が１０％〜３０％ｖ／ｖになるまで濃縮し、冷蔵して、結晶を析出させ、ろ過を行い、ろ液ＩＩとして用意しておき、結晶を３０％〜５０％ｖ／ｖエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶ＩＩを得る。

【0024】

ろ液ＩＩを濃縮し、０．１％〜０．５％（ｇ／Ｌ）の活性炭を加えて吸着させ、ろ過を行い、ろ液をアルコール含有量が１０％〜３０％ｖ／ｖになるまで濃縮し、冷蔵し、結晶を析出させ、ろ過して、ろ液ＩＩＩとして用意しておき、結晶を３０％〜５０％ｖ／ｖエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶ＩＩＩを得る。

【0025】

ろ液ＩＩＩを濃縮し、活性炭−シリカゲルカラム（体積比１：１〜１：３）を通過させ、まず３０％〜５０％ｖ／ｖエタノールで溶出し、さらに７０％〜９０％ｖ／ｖエタノールで溶出し、溶出液を収集してアルコール含有量が１０％〜３０％ｖ／ｖになるまで濃縮し、冷蔵し、結晶を析出させ、ろ過を行って結晶を得、ろ液ＩＶとして用意しておき、結晶を３０％ｖ／ｖエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶ＩＶを得る。

【0026】

ろ液ＩＶを濃縮し、冷蔵して、結晶を析出させ、ろ過を行い、結晶を３０％ｖ／ｖのエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶Ｖを得る。

【0027】

母液における残留ギンコライドに対するＨＰＬＣの検出結果に基づき、ろ液ＩＶに対して結晶化を行うか否かを考慮する。

【0028】

ステップＥ、結晶の混合：結晶Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖを混合して均一化させ、粉砕を行って、類白色の結晶組成物を得る。当該結晶組成物の有効部位（ビロバリド、ギンコライドＡ、ギンコライドＢ、ギンコライドＣの和）のＨＰＬＣ含有量は９５％より高い。

【0029】

本発明の抽出分離方法を使用して得たギンコライドのパラメータは以下の通りである。
ａ）性状：類白色または微黄色結晶粉末である。酢酸エチルに溶けやすく、メタノール、エタノールに溶け、水にはほとんど溶けない。
ｂ）水分：５．０％より低い。
ｃ）蛋白質：５９５ｎｍの吸光度が０．０５より小さい。
ｄ）タンニン、樹脂、シュウ酸塩、カリウムイオン：検出されていない。
ｅ）残留溶媒：エタノール及び酢酸エチルとも０．５％より低く、ノルマルヘキサンが０．０２９％より低く、カプロラクタムが０．００１５％より低い。
ｆ）総ギンコール酸：ＨＰＬＣ法で測定した総ギンコール酸の含有量が５ｐｐｍより低い。
ｇ）大分子及び重合体：ゲルクロマトグラフィーで測定した結果、残留大分子及び重合体は検出されていない。ＬＣ−ＭＳ法で測定した結果、分子量が１０００より大きい大分子物質及び重合体は検出されていない。
ｈ）重金属：１０ｐｐｍより低い。
ｉ）ヒ素塩：２ｐｐｍより低い。
ｋ）異常毒性：調製された０．２ｍｇ／ｍｌ溶液が静脈注射法投与に適する。
ｌ）フィンガープリント：ＨＰＬＣ法によって測定し、ビロバリド標準物、ギンコライドＡ標準物、ギンコライドＢ標準物、ギンコライドＣ標準物を参照物質とし、漢方薬クロマトフィンガープリントの類似度評価システムに基づき、４つの共通ピークの類似度は０．９５より大きい。
ｍ）含有量：ＨＰＬＣ法によって測定し、乾燥品に基づいて計算し、ビロバリド（Ｃ_１５Ｈ_１８Ｏ_８）２５．０〜５０．０％、ギンコライドＡ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_９）２０．０〜４５．０％、ギンコライドＢ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１０）１０．０〜３０．０％、ギンコライドＣ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１１）５．０〜１５．０％を含有し、且つビロバリド、ギンコライドＡ、ギンコライドＢ、ギンコライドＣの総含有量は９５％より大きい。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】図１は、溶出体積の溶出率に対する影響である。

【図2】図２は、エタノール流速の溶出率に対する影響である。

【図3】図３は、ギンコライドのＬＣ−ＭＳスペクトル（分子量４００〜１０００）である。

【図4】図４は、ギンコライドのＬＣ−ＭＳスペクトル（分子量４００〜３０００）である。

【図5】図５は、ギンコライドの標準フィンガープリントである。共通ピークにおけるピーク２：ギンコライドＣ、ピーク３：ビロバリド、ピーク４：ギンコライドＡ、ピーク５：ギンコライドＢ。

【発明を実施するための形態】

【0031】

以下は、本発明のギンコライド調製方法における重要条件をスクリーニングする試験である。

【0032】

一、抽出方法をスクリーニングする試験

【0033】

方法一、濃縮液をまず等体積のノルマルヘキサンで２〜３回抽出し、水相を８倍量のブタノン−アセトン（４：６）で温熱下において５回抽出し、抽出液を併せて、減圧濃縮する。

【0034】

方法二、濃縮液をまず等体積のノルマルヘキサンで２〜３回抽出し、水相をさらに等体積の酢酸エチルで４〜５回抽出し、等量の水飽和ブタノール−酢酸エチル（７：３）で４〜５回抽出し、抽出液を併せて、減圧濃縮し、乾燥する。

【0035】

以上の２種類の抽出分離純化方法のスクリーニング試験に、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ法で、２種の試験におけるギンコライドの総含有量をそれぞれ測定し、その試験結果を表１に示す。

【0036】

【0037】

方法二で得たラクトンの総含有量が比較的高く、酢酸エチル及び２−ブタノールが安全性の非常に高い溶剤であるため、方法二を選択して抽出分離純化のプロセスとする。

【0038】

二、クロマトグラフィー条件をスクリーニングする試験

【0039】

抽出液はまだ大量のギンゲチン類物質及びその他の不純物を含有しているため、純度の非常に高いギンコライドを得るために、フラボノイドをギンコライドから有効に分離しなければならず、現在、一般的に使用されている分離方法はポリアミド樹脂分離法、アルミナカラムクロマトグラフィー法及びシリカゲルカラムクロマトグラフィー法を含み、発明者は研究過程及び結果を以下の通り比較する。

【0040】

方法一、抽出液をポリアミド樹脂カラムを通過させ、まず２〜３倍量の３０％エタノールで溶出し、次は７０％エタノールで溶出し、溶出の速度が２ＢＶ／ｈであり、溶出液を濃縮し、蒸発して乾燥させる。

【0041】

方法二、抽出液を酸性アルミナカラムを通過させ、抽出液を等量の酸化アルミニウムと混合させ、加熱乾燥し、乾式方法でカラムクロマトグラフィーし、４〜６倍量の酢酸エチルで溶出し、溶出速度は２ＢＶ／ｈであり、溶出液を濃縮し、蒸発して乾燥させる。

【0042】

方法三、抽出液をシリカゲルカラムを通過させ、抽出液を等量のカラムクロマトグラフィーシリカゲルと混合させ、加熱乾燥し、乾式方法でカラムクロマトグラフィーし、まず４〜６倍量の石油エーテル−酢酸エチル（２：１）で溶出し、溶出速度は２ＢＶ／ｈであり、さらにノルマルヘキサン−酢酸エチル（５：１）で溶出し、溶出速度は２ＢＶ／ｈであり、溶出液を濃縮し、蒸発して乾燥させる。

【0043】

ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ法で３種の試験におけるギンコライドの総量に対してそれぞれ測定を行い、試験結果は表２に示す。

【0044】

【0045】

結果から分かるように、ポリアミド樹脂カラムを使用して得たギンコライドの含有量が比較的高く、分離効果が比較的良い。

【0046】

ポリアミド樹脂がフラボノイドに対して比較的良い吸着作用を有するため、ギンコライドからギンゲチンを有効に分離させ、カラムクロマトグラフィー溶出プロセスのパラメータに対して有効に考察することができる。

【0047】

１、 水洗体積の選択：蒸留水で樹脂カラムを洗浄することは非常によい不純物の除去作用を有し、５ＢＶの水で樹脂カラムを洗浄し、流速が１〜２ＢＶ／ｈであり、流出した色が濃い色から薄くなり、水洗液５ＢＶを収集し、流出液が澄明で、測定結果は、水体積が３ＢＶに達した時に、カラム内の水溶性不純物が既にほぼ無くなり、ギンコライドが検出されないため、３ＢＶの水洗体積を選択する。溶出体積が溶出率に対する影響は図１に示される。

【0048】

２、 エタノール溶出濃度の溶出効果に対する影響：抽出液をそれぞれ異なるポリアミドカラムにクロマトグラフィーさせ、３０分間吸着させ、まず３ＢＶ水で洗浄し、さらにそれぞれ１０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９０％のエタノールで溶出し、流速が１ＢＶ／ｈで、それぞれエタノール溶出液を収集し、各濃度の溶出液におけるギンコライドの量を測定し、エタノールの濃度の増加に伴って、溶出量及び溶出率が共に増大したが、４０％のエタノールになった後、溶出量の増大が徐々にゆっくりとなって、９０％のエタノールになった時には溶出量の差があまりなく、３０％のエタノールの溶出が既にほぼ最もよい溶出率になったため、３０％のエタノールを最適な溶出濃度とする。

【0049】

３、 エタノール脱着流速の溶出効果に対する影響：抽出液をそれぞれ異なるポリアミドカラムにクロマトグラフィーさせ、３０分間吸着させ、まず３ＢＶ水で洗浄し、さらに４０％エタノールで溶出し、流速が１ＢＶ／ｈである。より好適なエタノール脱着流速を選ぶため、それぞれ１、２、３、４、５ＢＶ／ｈの流速でカラムクロマトグラフィーし、溶出して３ＢＶ溶出液を収集し、ギンコライドの量を測定する。溶出流速が脱着率と非常に大きな関連性を有し、流速の向上に伴って、脱着率が増加するが、３ＢＶ／ｈに達する時に逆に降下し、これは速度の増加によってエタノール溶出液が吸着されていたギンコライドとうまく交換できなくなり、従って、よい溶出の効果を奏することができなくなる。好適な流速は２〜３ＢＶ／ｈである。エタノール流速の溶出率に対する影響は図２に示す。

【0050】

三、結晶化条件をスクリーニングする試験

【0051】

カラムクロマトグラフィーして、抽出した後に抽出物におけるギンコライドの含有量が増加し、フラボノイド類の物質も有効に分離されたが、ギンコライドの含有量がまだ注射剤の要求に達することができず、更なる結晶化・純化が必要である。ギンコライドはエタノール、酢酸エチル等の溶媒において溶けやすいが、水、ノルマルヘキサン等の溶媒において溶けないため、極性の適する混合溶媒を結晶化溶媒として選択するしかない。

【0052】

（１）３０％ｖ／ｖエタノール溶媒：結晶化予定の抽出物１０ｇを取り、それぞれ４、６、８、１０倍量の３０％エタノールを加え、加熱溶解し、低温（０〜６℃）で静置し、ろ過を行い、減圧乾燥し、それぞれ結晶の重量を測定し、試験結果は表３に示す。

【0053】

【0054】

結晶化させる時に５〜８倍量の３０％エタノールを添加することは比較的好適で、析出された結晶が比較的多い。

【0055】

（２）ノルマルヘキサン−酢酸エチル（８：１）溶媒：結晶化予定の抽出物１０ｇを取り、それぞれ４、６、８、１０倍量のノルマルヘキサン−酢酸エチル（８：１）混合溶媒を加え、加熱溶解し、低温（０〜６℃）で静置し、ろ過を行い、減圧乾燥し、それぞれ結晶の重量を測定し、試験結果は表４に示す。

【0056】

【0057】

ノルマルヘキサン−酢酸エチル混合溶媒の析出した結晶の量は３０％エタノール溶媒の析出した結晶の量より少ない。

【0058】

（３）１０％ｖ／ｖ酢酸エチル溶媒：結晶化予定の抽出物１０ｇを取り、それぞれ４、６、８、１０倍量の１０％ｖ／ｖ酢酸エチルを加え、加熱溶解し、低温（０〜６℃）で静置し、ろ過を行い、減圧乾燥し、それぞれ結晶の重量を測定し、試験結果は表５に示す。

【0059】

【0060】

１０％ｖ／ｖ酢酸エチル溶媒の析出した結晶の量は３０％エタノール溶媒の析出した結晶の量より少ない。

【0061】

実験結果に基づき、結晶化溶媒は５〜８倍量の３０％エタノールを選択するのが比較的好適である。

【0062】

以下、本発明の方法でギンコライドを調製する実例である。

【実施例1】

【0063】

イチョウ葉の粗粉末５０ｋｇに、６５％エタノールを加えて加熱還流し、１．５時間／回で、３回（１０、８、６倍量）抽出し、抽出液を併せて、ろ過を行い、減圧濃縮し、０．０５％メチオニンを加えて撹拌溶解し、クエン酸溶液でｐＨ値を４〜５まで調節し、濃縮し続けて、低温放置し、ろ過する。まず等量のノルマルヘキサンで抽出し、さらに等量の酢酸エチルで抽出し、最後に水飽和２−ブタノール−酢酸エチル混合溶媒で抽出し、ポリアミド（３０〜６０メッシュ）樹脂カラムを通過し、まず水で溶出し、続いて３０％エタノールで溶出し、さらに７０％エタノールで溶出し、溶出液を併せて、減圧濃縮する。２〜３倍量の沸騰水に加え、撹拌溶解し、静置し、放冷し、酢酸エチルで抽出し、減圧濃縮し、エタノールを加えて加熱して撹拌溶解し、ろ過し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶Ｉ（主にはビロバリド及びギンコライドＢである）を得る。ろ液を濃縮し続けて、エタノールを３０％になるまで加えて、静置し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩ（主にはギンコライドＡ、Ｂ、Ｃである）を得る。ろ液に薬用炭を加え、撹拌して吸着させ、ろ過し、濃縮し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩＩ（主にはギンコライドＡ及びＢである）を得る。ろ液を濃縮し、薬用炭−シリカゲル（１：１）カラムを通過させ、まず２倍量の３０％エタノールで溶出し、さらに４倍量の７０％エタノールで溶出し、溶出液を収集し、濃縮し、エタノールを３０％まで加えて、放冷し、静置し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＶを得る。ろ液を濃縮し、エタノールを３０％になるまで加えて、放冷し、静置し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶Ｖを得る。結晶を混合して均一化させ、ギンコライド９１．６ｇを得、ＨＰＬＣ含有量が９７．２％であり、そのうち、ビロバリド（Ｃ_１５Ｈ_１８Ｏ_８）が４２．５％、ギンコライドＡ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_９）が２５．４％、ギンコライドＢ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１０）が１８．７％、ギンコライドＣ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１１）が１０．６％である。

【実施例2】

【0064】

イチョウ葉の粗粉末２００ｋｇに、６倍量の８０％エタノールを加えて加熱還流し、１．５時間／回で、３回抽出し、抽出液を併せて、ろ過を行い、ろ液を減圧しエタノールの匂いがなくなるまでエタノールを回収し、０．０５％メチオニンを加えて撹拌溶解し、クエン酸溶液でｐＨ値を４〜５まで調節し、濃縮し続けて、低温放置し、ろ過する。まずノルマルヘキサンで抽出し、さらに酢酸エチルで抽出し、最後に水飽和２−ブタノール−酢酸エチル混合溶媒で抽出し、ポリアミド（３０〜６０メッシュ）樹脂カラムを通過し、まず３０％エタノールで溶出し、さらに７０％エタノールで溶出し、溶出液を併せて、減圧濃縮する。沸騰水に加え、撹拌溶解し、静置放冷し、酢酸エチルで抽出し、減圧濃縮し、エタノールを加えて加熱して撹拌溶解し、ろ過し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶Ｉ（主にはビロバリド及びギンコライドＢである）を得る。ろ液を濃縮し続けて、エタノールを加え、静置して結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩ（主にはギンコライドＡ、Ｂ、Ｃである）を得る。ろ液に薬用炭を加え、撹拌して吸着させ、ろ過し、濃縮し、エタノールを加え、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩＩ（主にはギンコライドＡ及びＢである）を得る。ろ液を濃縮し、薬用炭−シリカゲル（１：１）カラムを通過し、まず２倍量の３０％エタノールで溶出し、さらに４倍量の７０％エタノールで溶出し、溶出液を収集し、濃縮し、エタノールを３０％になるまで加えて、放冷し、静置し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＶを得る。ろ液を濃縮し、エタノールを３０％になるまで加えて、放冷し、静置し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶Ｖを得る。結晶を混合して均一化させ、ギンコライド３６２．８ｇを得、ＨＰＬＣ含有量が９６．８％であり、そのうち、ビロバリド（Ｃ_１５Ｈ_１８Ｏ_８）が３１．２％、ギンコライドＡ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_９）が２８．８％、ギンコライドＢ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１０）が２８．２％、ギンコライドＣ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１１）が８．６％である。

【実施例3】

【0065】

イチョウ葉の粗粉末２００ｋｇに、８倍量の７５％エタノールを加えて加熱還流し、１．５時間／回で、３回抽出し、抽出液を併せて、ろ過を行い、ろ液を減圧しエタノールの匂いがなくなるまでエタノールを回収し、０．０５％メチオニンを加えて撹拌溶解し、クエン酸溶液でｐＨ値を４〜５まで調節し、濃縮し続けて、低温放置し、ろ過する。まずノルマルヘキサンで抽出し、さらに酢酸エチルで抽出し、最後に水飽和２−ブタノール−酢酸エチル混合溶媒で抽出し、ポリアミド（３０〜６０メッシュ）樹脂カラムを通過させ、まず３０％エタノールで溶出し、続いて７５％エタノールで溶出し、溶出液を併せて、減圧濃縮する。沸騰水に加え、撹拌溶解し、静置放冷し、酢酸エチルで抽出し、減圧濃縮し、エタノールを加えて加熱して撹拌溶解し、ろ過し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶Ｉ（主にはビロバリド及びギンコライドＢである）を得る。ろ液を濃縮し続けて、エタノールを加え、静置して結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩ（主にはギンコライドＡ、Ｂ、Ｃである）を得る。ろ液に薬用炭を加え、撹拌して吸着させ、ろ過し、濃縮し、エタノールを加え、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩＩ（主にはギンコライドＡ及びＢである）を得る。ろ液を濃縮し、薬用炭−シリカゲル（１：１）カラムを通過させ、６０％エタノールで溶出し、溶出液を収集し、濃縮し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＶを得、結晶を混合して均一化させ、ギンコライド３７５．５ｇを得、ＨＰＬＣ含有量が９７．１％であり、そのうち、ビロバリド（Ｃ_１５Ｈ_１８Ｏ_８）が３５．８％、ギンコライドＡ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_９）が２８．５％、ギンコライドＢ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１０）が２６．２％、ギンコライドＣ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１１）が６．６％である。

【実施例4】

【0066】

イチョウ葉の粗粉末２００ｋｇに、１０倍量の７５％エタノールを加えて加熱還流し、１．５時間／回で、３回抽出し、抽出液を併せて、ろ過を行い、ろ液を減圧しエタノールの匂いがなくなるまでエタノールを回収し、０．０５％メチオニンを加えて撹拌溶解し、クエン酸溶液でｐＨ値を４〜５まで調節し、濃縮し続けて、低温放置し、ろ過する。まずノルマルヘキサンで抽出し、さらに酢酸エチルで抽出し、最後に水飽和２−ブタノール−酢酸エチル混合溶媒で抽出し、ポリアミド（３０〜６０メッシュ）樹脂カラムを通過させ、まず２５％エタノールで溶出し、続いて６５％エタノールで溶出し、溶出液を併せて、減圧濃縮する。沸騰水に加え、撹拌溶解し、静置放冷し、酢酸エチルで抽出し、減圧濃縮し、５０％エタノールを加えて加熱して撹拌溶解し、ろ過し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶Ｉ（主にはビロバリド及びギンコライドＢである）を得る。ろ液を濃縮し続けて、エタノールを加え、静置して結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩ（主にはギンコライドＡ、Ｂ、Ｃである）を得る。ろ液に薬用炭を加え、撹拌して吸着させ、ろ過し、濃縮し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩＩ（主にはギンコライドＡ及びＢである）を得る。ろ液を濃縮し、薬用炭−シリカゲル（１：１）カラムを通過させ、６０％エタノールで溶出し、溶出液を収集し、濃縮し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＶを得、ろ液を濃縮し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶Ｖを得る。結晶を混合して均一化させ、ギンコライド３６２．２ｇを得、ＨＰＬＣ含有量が９６．５％であり、そのうち、ビロバリド（Ｃ_１５Ｈ_１８Ｏ_８）が３５．５％、ギンコライドＡ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_９）が２６．０％、ギンコライドＢ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１０）が２６．２％、ギンコライドＣ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１１）が８．８％である。

【実施例5】

【0067】

イチョウ葉の粗粉末２００ｋｇに、８倍量の６０％エタノールを加えて加熱還流し、１．５時間／回で、３回抽出し、抽出液を併せて、ろ過を行い、ろ液を減圧し酢酸エチルを回収し、０．０５％メチオニンを加えて撹拌溶解し、クエン酸溶液でｐＨ値を４〜５まで調節し、濃縮し続いて、低温放置し、ろ過する。まず石油エーテルで抽出し、水相はさらに酢酸エチルで抽出し、最後に水飽和２−ブタノール−酢酸エチル混合溶媒で抽出し、ポリアミド（３０〜６０メッシュ）樹脂カラムを通過させ、まず３０％エタノールで溶出し、続いて７５％エタノールで溶出し、溶出液を併せて、減圧濃縮する。沸騰水に加え、撹拌溶解し、静置放冷し、アセトンで抽出し、乾燥まで減圧濃縮し、５０％エタノールを加えて加熱して撹拌溶解し、ろ過し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶Ｉ（主にはビロバリド及びギンコライドＢである）を得る。ろ液を濃縮し続けて、エタノールを加え、静置して結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩ（主にはギンコライドＡ、Ｂ、Ｃである）を得る。ろ液に薬用炭を加え、撹拌して吸着させ、ろ過し、濃縮し、エタノールを加え、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩＩ（主にはギンコライドＡ及びＢである）を得る。ろ液を濃縮し、薬用炭−シリカゲル（１：１）カラムを通過させ、６０％エタノールで溶出し、溶出液を収集し、濃縮し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＶを得る。結晶を混合して均一化させ、ギンコライド３５０．６ｇを得、ＨＰＬＣ含有量が９７．４％であり、そのうち、ビロバリド（Ｃ_１５Ｈ_１８Ｏ_８）が４０．０％、ギンコライドＡ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_９）が２２．５％、ギンコライドＢ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１０）が２７．２％、ギンコライドＣ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１１）が１０．３％である。

【実施例6】

【0068】

イチョウ葉の粗粉末２００ｋｇに、８倍量の５０％アセトンを加えて加熱還流し、１．５時間／回で、３回抽出し、抽出液を併せて、ろ過を行い、ろ液を減圧しアセトンを回収し、０．０５％メチオニンを加えて撹拌溶解し、クエン酸溶液でｐＨ値を４〜５まで調節し、濃縮し続いて、低温放置し、ろ過する。まず石油エーテルで抽出し、水相をさらに酢酸エチルで抽出し、最後に水飽和２−ブタノール−酢酸エチル混合溶媒で抽出し、ポリアミド（３０〜６０メッシュ）樹脂カラムを通過させ、まず３０％エタノールで溶出し、続いて７０％エタノールで溶出し、溶出液を併せて、減圧濃縮する。沸騰水に加え、撹拌溶解し、静置放冷し、酢酸エチルで抽出し、乾くまで減圧濃縮し、３０％エタノールを加えて加熱して撹拌溶解し、ろ過し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶Ｉ（主にはビロバリド及びギンコライドＢである）を得る。ろ液を濃縮し続けて、エタノールを加え、静置して結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩ（主にはギンコライドＡ、Ｂ、Ｃである）を得る。ろ液に薬用炭を加え、撹拌して吸着させ、ろ過し、濃縮し、エタノールを加え、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩＩ（主にはギンコライドＡ及びＢである）を得、ろ液を濃縮し、薬用炭−シリカゲル（１：１）カラムを通過させ、６０％エタノールで溶出し、溶出液を収集し、濃縮し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＶを得る。ろ液を濃縮し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶Ｖを得る。結晶を混合して均一化させ、ギンコライド３４３．５ｇを得、ＨＰＬＣ含有量が９６．２％であり、そのうち、ビロバリド（Ｃ_１５Ｈ_１８Ｏ_８）が３８．２％、ギンコライドＡ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_９）が２８．３％、ギンコライドＢ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１０）が２４．２％、ギンコライドＣ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１１）が９．３％である。

【実施例7】

【0069】

イチョウ葉の粗粉末２００ｋｇに、８倍量の７０％エタノールを加えて沸騰し初めまで加熱し、１．５時間／回で、３回抽出し、抽出液を併せて、ろ過を行い、ろ液を減圧しエタノールを回収し、０．０５％メチオニンを加えて撹拌溶解し、クエン酸溶液でｐＨ値を４〜５まで調節し、濃縮し続いて、低温放置し、ろ過する。まず石油エーテルで抽出し、水相をさらに酢酸エチルで抽出し、最後に水飽和２−ブタノール−酢酸エチル混合溶媒で抽出し、ポリアミド（３０〜６０メッシュ）樹脂カラムを通過させ、まず３０％エタノールで溶出し、続いて７０％エタノールで溶出し、溶出液を併せて、減圧濃縮する。沸騰水に加え、撹拌溶解し、静置放冷し、酢酸エチルで抽出し、乾燥まで減圧濃縮し、３０％エタノールを加えて加熱して撹拌溶解し、ろ過し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶Ｉ（主にはビロバリド及びギンコライドＢである）を得る。ろ液を続けて濃縮し、エタノールを加え、静置して結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩ（主にはギンコライドＡ、Ｂである）を得る。ろ液に薬用炭を加え、撹拌して吸着させ、ろ過し、濃縮し、エタノールを加え、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＩＩ（主にはギンコライドＡ及びＣである）を得る。ろ液を濃縮し、薬用炭−シリカゲル（１：１）カラムを通過させ、６０％エタノールで溶出し、溶出液を収集し、濃縮し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶ＩＶを得る。ろ液を濃縮し、放冷し、結晶を析出させ、ろ過を行い、乾燥して、結晶Ｖを得る。結晶を混合して均一化させ、ギンコライド３６２．６ｇを得、ＨＰＬＣ含有量が９７．４％であり、そのうち、ビロバリド（Ｃ_１５Ｈ_１８Ｏ_８）が３６．５％、ギンコライドＡ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_９）が２５．３％、ギンコライドＢ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１０）が２８．２％、ギンコライドＣ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１１）が７．４％である。

【0070】

前記のように、本発明に用いる抽出分離純化方法を採用することにより純度の比較的高く、組成が相対的安定するギンコライドを得ることができ、そのうち、ビロバリド（Ｃ_１５Ｈ_１８Ｏ_８）２５．０〜５０．０％、ギンコライドＡ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_９）２０．０〜４５．０％、ギンコライドＢ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１０）１０．０〜３０．０％、ギンコライドＣ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１１）５．０〜１５．０％を含有し、且つビロバリド、ギンコライドＡ、ギンコライドＢ、ギンコライドＣの総量が９５％より大きい。

【0071】

本発明のギンコライドの各項目の測定方法及び測定結果は以下の通りである。

【0072】

ａ）性状：類白色または微黄色結晶性粉末。
酢酸エチルに溶けやすく、メタノール、エタノールに溶け、水にほとんど溶けない。
ｂ）水分：６０℃で減圧し乾燥減量が５．０％より小さい。
ｃ）蛋白質：５９５ｎｍでの吸光度が０．０５より小さい。
本発明のギンコライド約２４ｍｇを取り、エタノール２ｍｌを加えて溶解した後、水を加えて５０ｍｌまで希釈し、試料溶液とする。ブラッドフォード法(Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）に基づいて測定し、対応する試薬をブランクとし、５９５ｎｍでの吸光度が０．０５より小さい。

【0073】

ｄ）タンニン、樹脂、シュウ酸塩、カリウムイオン
採用可能な測定方法は、
タンニン：蛋白質測定項目用の試料溶液１ｍｌを取り、希酢酸１滴を加え、さらにゼラチン塩化ナトリウム試液５滴を加え、振り混ぜて、１０分間放置し、混濁または沈殿物は認められない。

【0074】

樹脂：蛋白質測定項目用の試料溶液５ｍｌを取り、塩酸１滴を加え、３０分間放置し、樹脂状物質の析出は認められない。

【0075】

シュウ酸塩：蛋白質測定項目用の試料溶液２ｍｌを取り、希酢酸でｐＨ値を１〜２まで調節し、ろ過を行い、ろ液をアンモニア水でｐＨ値５〜６まで調節し、３％塩化カルシウム溶液３滴を加え、１０分間放置し、混濁または沈殿物は認められない。

【0076】

カリウムイオン：蛋白質測定項目用の試料溶液２ｍｌを取り、１０ｍｌネスラー比色管に入れ、アルカリ性ホルムアルデヒド溶液０．６ｍｌ、３％ＥＤＴＡ溶液２滴、３％テトラフェニルホウ酸ナトリウム溶液０．５ｍｌを加え、水を加えて１０ｍｌまで希釈し、また、標準塩化カリウム溶液０．８ｍｌを別に取り、同様な方法で試験し、試料溶液の濁度が標準溶液より高くない。

【0077】

結果：タンニン、樹脂、シュウ酸塩、カリウムイオンが検出されていない。

【0078】

ｅ）残留溶媒
（１）エタノール、酢酸エチル及びノルマルヘキサン：エタノール及び酢酸エチルの含有量が共に０．５％より低く、ノルマルヘキサンの含有量が０．０２９％より低い。
（２）樹脂残留量：カプロラクタムの含有量が０．００１５％より低い。

【0079】

ｆ）総ギンコール酸：ギンコール酸の含有量が５ｐｐｍより低い。

【0080】

ｇ）大分子及び重合体：ゲルスペクトル法で測定した結果、残留大分子及び重合体は検出されていない。ＬＣ−ＭＳ法で測定した結果、分子量が１０００より高い大分子及び重合体は検出されていない。
測定方法：
（１）ゲルクロマトグラフィーカラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ２０００、３００×７．８ｍｍ、５μｍ、移動相：０．７１％（うち、０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する）硫酸ナトリウム溶液、カラム温度：３５℃、検出器温度：３５℃、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ。結果：残留大分子及び重合体が検出されていない。

【0081】

（２）ＨＰＬＣ−ＭＳ連用法の移動相：メタノール−水（９０：１０）、カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＸ−Ｃ_１８（２．１×５０ｍｍ）、カラム温度：２５℃、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ。結果：分子量が１０００より高い大分子及び重合体が検出されていない。

【0082】

ｈ）重金属：１０ｐｐｍより低い。
ｉ）ヒ素塩：２ｐｐｍより低い。

【0083】

ｋ）異常毒性：調製された０．２ｍｇ／ｍｌ溶液が静脈注射法の投与に適する。
試料溶液の調製：本発明のギンコライド約２５ｍｇを取り、エタノール２ｍｌで溶解した後塩化ナトリウム注射液を加えて０．２ｍｇ／ｍｌ溶液を調製する。
検査法：体重１７〜２０ｇのマウス５匹を取り、マウスの尾静脈に試料溶液０．５ｍｌを注入し、４８時間以内に死亡が認められない。

【0084】

ｌ）フィンガープリント：ＨＰＬＣ法で測定し、６０分間のフィンガープリントを記録する。漢方薬クロマトフィンガープリントの類似度評価システムに基づき、４つの共通ピークの類似度が０．９５より大きい。

【0085】

ｍ）含有量：ＨＰＬＣ法で測定し、乾燥品に基づいて計算し、ビロバリド（Ｃ_１５Ｈ_１８Ｏ_８）２５．０〜５０．０％、ギンコライドＡ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_９）２０．０〜４５．０％、ギンコライドＢ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１０）１０．０〜３０．０％、ギンコライドＣ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１１）５．０〜１５．０％を含有し、且つビロバリド、ギンコライドＡ、ギンコライドＢ、ギンコライドＣの総量が９５％より大きい。

【0086】

ｌ）フィンガープリント及びｍ）含有量測定に採用された測定方法が同様で、条件が以下の通りで、オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填剤とし、メタノール−テトラヒドロフラン−水（２５：１０：６５）を移動相とし、蒸発型光散乱検出器を使用し、ドリフトチューブ温度が１０５℃、キャリアガスの流速が：３．００Ｌ／ｍｉｎ、カラム温度が４０℃で、理論段数がビロバリドビップに基づいて計算すると２５００より低くないはずである。ビロバリドピークとギンコライドＣピークとの分離度が１．５より大きいはずである。

【0087】

ｎ）発熱因子検査：体温の上昇が０．６℃より低い。
試料溶液の調製：本発明のギンコライド２０ｍｇを精密に量り、２ｍｌエタノールを加えて溶解させ、さらに１００ｍｌの０．９％塩化ナトリウム注射液に加える。
検査方法：家兎３匹を取り、その正常体温を測定した後１５分以内に、家兎体重に基づいて１ｋｇ当たりに５ｍｌ、試料溶液を耳静脈から注射し、３０分毎に体温を１回測定し、合計６回測定し、体温の上昇は全て０．６℃より低く、且つ３匹の家兎の体温の上昇が合計１．３℃より低いはずである。

【0088】

発明者は、本発明の技術的効果を証明するために、前記発明内容に対して大分子及び重合体の測定研究及び説明を行った。以下の試験は本発明をさらに説明及び解釈するために用いられるが、本発明を制限するものではない。

【0089】

（１）試験機器及び試薬
Ａｇｉｌｅｎｔ １２００型高速液体クロマトグラフ、紫外検出器、示差屈折率検出器。
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ２０００ゲルクロマトグラフカラム。
デキストラン標準物質Ｄ２０００（ブルーデキストラン２０００）、中検所、ロット番号１４０６４６−２０００−０１
グルコース標準物質（Ｄ０）、含有量：９９．５％、ロット番号０８６Ｋ０１６６、ＳＩＧＭＡ。
超純水はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｑ超純水システムによって製造される。
その他の試薬は分析級試薬である。

【0090】

（２）移動相の選択
０．７１％（うち、０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する）硫酸ナトリウム溶液を移動相とする。

【0091】

（３）検出器の選択
汎用型検出器の示差屈折率検出器を選び、当該検出器は屈折係数の差異が存在する物質に対して全て良好な応答を有する。

【0092】

（４）決定されるクロマトグラフィーの条件
クロマトグラフカラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ２０００、３００×７．８ｍｍ、５μｍ
移動相：０．７１％（うち、０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する）硫酸ナトリウム溶液
カラム温度：３５℃、検出器温度：３５℃、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ

【0093】

【0094】

（６）方法論研究
１．デキストラン及びグルコースの標準物質にそれぞれ移動相を加えて１０ｍｇ／ｍｌの溶液を調整し、それぞれ標準物質の溶液２０μｌを精密に取り、クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、結果、デキストランは保持時間９．８１６’にてピークが現れ、グルコースは保持時間１８．７１２’にてピークが現れることから、ゲルクロマトグラフィー法を採用すると、分子量の大きい物質が先にピークが現れ、分子量の小さい物質が後にピークが現れることを示す。

【0095】

２．本発明のギンコライド約１０ｍｇを取り、エタノール２ｍｌを加え、デキストラン標準物質溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加え、混合して均一化させ、１０μｌを精密に取り、クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、結果、保持時間９．６９８’にデキストランが検出され、ギンコライド注射液の成分のピークが全て１８分以後に現れることから、分子量１８０〜４５０のピーク現れ時間が約１８分間で、分子量５０００〜２００００００のピーク現れ時間が約９分間で、ゲルクロマトグラフィー法を用いることによって大分子物質の検出は可能であることを示す。

【0096】

本品には大分子及び重合体を含有しないことを検証するため、さらにＬＣ−ＭＳ試験を行った。

【0097】

クロマトグラフィー条件：メタノール−水（９０：１０）を移動相とし、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＸ−Ｃ_１８（２．１×５０ｍｍ）クロマトグラフカラム、カラム温度が２５℃、流速が０．３ｍｌ／ｍｉｎである。

【0098】

試料溶液の調製：本発明のギンコライド１０ｍｇを精密に量って、１０ｍｌメスフラスコに入れ、適量の１％酢酸を加えて溶解させ、移動相を加えてメモリまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液とする。

【0099】

ＬＣ−ＭＳ連用テスト：所定の試験方法に基づき、それぞれ試料溶液１０μｌを取り、４００〜１０００及び４００〜３０００分子量範囲内にそれぞれ測定し、クロマトグラムを記録する。試験結果は表６に示す。

【0100】

【0101】

ＬＣ−ＭＳ連用で分子量の測定結果から、ギンコライドＡ（分子量４０８．５）、ギンコライドＢ（分子量４２４．４）、ギンコライドＣ（分子量４４０．４）がそれぞれ検出され、本発明のギンコライドの有効成分と完全に一致し、測定された分子量範囲が４００〜３０００の間であるため、ビロバリドに対しては測定せず、本発明のギンコライドには分子量が７００以上である物質が検出されず、その他の異なる分子量の物質はその他の不純物が存在する可能性があり、ＬＣ−ＭＳのギンコライドにおける異なる成分に対する分子量測定結果から、本品には大分子または重合体を含有しないことを表明した。ギンコライドＬＣ−ＭＳスペクトルは図３〜４に示す。

【実施例8】

【0102】

ギンコライド品質制御−総ギンコール酸検査
クロマトグラフィー条件及びシステム適用性試験：オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填剤とし、メタノール−１％氷酢酸（９０：１０）を移動相とし、流速が１．０ｍｌ／ｍｉｎで、検出波長が３１０ｎｍである。理論段数がギンコール酸に基づいて計算すると４０００より低くないはずである。

【0103】

標準物質溶液の調製：ギンコール酸標準物質適量を取り、精密に量り、メタノールを加えて１ｍｌ当たりに５μｇを含有する溶液を調整して標準物質溶液にし、また、総ギンコール酸標準物質適量を別に取り、精密に量り、メタノールを加えて１ｍｌ当たりに１００μｇを含有する溶液を調整して位置決め用標準溶液にする。

【0104】

試料溶液の調製：本発明のギンコライド５ｇを取り、精密に量り、フラスコに入れ、ノルマルヘキサン５０ｍｌを加え、加熱して２時間還流させ、取り出し、放冷し、ろ過を行い、残渣を少量のノルマルヘキサンでさらに洗浄し、ろ液と洗浄液とを併せて、水浴上に置いて蒸発乾燥させ、残渣はメタノール溶液を加えて溶解し且つ２ｍｌまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液とする。

【0105】

測定方法：試料溶液、標準物質溶液及び位置決め用標準溶液それぞれ２０μｌを精密に取り、液体クロマトグラフに注入し、試料溶液における、総ギンコール酸標準物質と対応するクロマトグラムピークのピーク合計面積を計算し、ギンコール酸標準物質外部標準法で総ギンコール酸含有量を計算し、総ギンコール酸が５ｐｐｍより小さい。

【0106】

発明者は本発明の技術的効果を証明するために、前記発明内容に対して研究及び説明を行った。以下の試験は本発明をさらに説明及び解釈することに用いられるが、本発明を制限しない。

【0107】

ａ、方法一
試料溶液の調製：本発明のギンコライド５ｇを取り、精密に量り、フラスコに入れ、石油エーテル（６０〜９０℃）５０ｍｌを精密に加え、２時間還流し、取り出し、放冷し、ろ過を行い、残渣を少量の石油エーテルでさらに１回洗浄し、ろ液と洗浄液を併せ、水浴上に置いて蒸発乾燥し、残渣はメタノールを加えて溶解し且つ２ｍｌまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液（１）とする。

【0108】

ブランクサンプル溶液の調製：石油エーテル（６０〜９０℃）５０ｍｌを取り、コニカルフラスコに入れ、２時間還流し、水浴上に置いて蒸発乾燥し、残渣はメタノールを加えて溶解し且つ２ｍｌまで希釈し、振り混ぜて、ブランク溶液（１）とする。

【0109】

ｂ、方法二（石油エーテルの代わりにノルマルヘキサンを使用する）
試料溶液の調製：本発明のギンコライド５ｇを取り、精密に量り、フラスコに入れ、ノルマルヘキサン５０ｍｌを精密に加え、２時間還流し、取り出し、放冷し、ろ過を行い、残渣を少量のノルマルヘキサンでさらに１回洗浄し、ろ液と洗浄液を併せ、水浴上に置いて蒸発乾燥し、残渣はメタノールを加えて溶解し且つ２ｍｌまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液（２）とする。

【0110】

ブランクサンプル溶液の調製：ノルマルヘキサン５０ｍｌを取り、フラスコに入れ、２時間還流し、水浴上に置いて蒸発乾燥し、残渣はメタノールを加えて溶解し且つ２ｍｌまで希釈し、振り混ぜて、ブランク溶液（２）とする。

【0111】

測定方法：試料溶液及びブランク溶液それぞれ２０μｌを精密に取り、液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録する。試験結果は表７に示す。

【0112】

【0113】

試験結果から、方法一（石油エーテル）を使用したサンプルの調製では、ブランク溶液にはクロマトグラフピークが検出され、そのピークの面積が試料溶液に検出されたクロマトグラフピークの面積とほぼ一致しているため、ブランク試験には干渉が存在することを示し、一方、方法二（ノルマルヘキサン）のサンプルの調製では、ブランク溶液及び試料溶液と共にクロマトグラフピークが検出されなかったため、発明者は方法二を使用して添加回収試験を行うことによって、方法二の実行可能性を証明する。

【0114】

ｃ、総ギンコール酸の添加回収試験
試料溶液の調製：本発明のギンコライド５ｇを取り、精密に量り、フラスコに入れ、濃度が１．０３２ｍｇ／ｍｌである総ギンコール酸標準物質溶液０．２ｍｌを精密に加え、さらにノルマルヘキサン５０ｍｌを精密に加え、２時間還流し、放冷し、ろ過を行い、残渣を少量のノルマルヘキサンでさらに洗浄し、ろ液と洗浄液を併せ、水浴に置いて蒸発乾燥し、残渣はメタノールを加えて溶解し且つ２ｍｌまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液とする。

【0115】

標準物質溶液の調製：濃度が１．０３２ｍｇ／ｍｌである総ギンコール酸標準物質溶液０．２ｍｌを精密に量り、２ｍｌメスフラスコに入れ、メタノールを加えてメモリまで希釈し、振り混ぜて、標準物質溶液とする。

【0116】

測定方法：試料溶液及び標準物質溶液それぞれ２０μｌを精密に取り、液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録する。

【0117】

結果、試料溶液は総ギンコール酸標準物質のクロマトグラフと対応する位置に総ギンコール酸のクロマトグラフピークが検出され、ピーク面積から見て、試料溶液と標準物質溶液とのピーク面積が一致しているため、回収率が比較的よいことを示す。試験結果は表８に示す。

【0118】

【0119】

ｄ、再現性試験
標準物質溶液の調製：ギンコール酸標準物質適量を取り、精密に量り、メタノールを加えて１ｍｌ当たりに５μｇを含有する溶液を調整して標準物質溶液とする。また、総ギンコール酸標準物質適量を別に取り、精密に量り、メタノールを加えて１ｍｌ当たりに１００μｇを含有する溶液を調整して位置決め用標準溶液とする。

【0120】

試料溶液の調製：本発明のギンコライド５ｇを取り、精密に量り、トータル６部を量り、それぞれフラスコに入れ、ノルマルヘキサン５０ｍｌを加え、２時間還流させ、放冷し、ろ過を行い、残渣を少量のノルマルヘキサンで洗浄し、ろ液と洗浄液とを併せて、水浴上に置いて蒸発乾燥させ、残渣はメタノール溶液を加えて溶解し且つ２ｍｌまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液とする。

【0121】

測定方法：試料溶液、標準物質溶液及び位置決め用標準溶液それぞれ２０μｌを精密に取り、液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録する。試験結果は表９に示す。

【0122】

【0123】

試験結果は、本発明のギンコライドにはギンコール酸が含有されていないことを示した。

【0124】

ｅ、回収率試験
試料溶液の調製：本発明のギンコライド５ｇを取り、精密に量り、合計３回分を量り、それぞれフラスコに入れ、濃度が３．０４μｇ／ｍｌであるギンコール酸標準物質溶液１．６ｍｌ、２．０ｍｌ、２．４ｍｌをそれぞれ加え、さらにノルマルヘキサン５０ｍｌをそれぞれ加え、２時間還流させ、放冷し、ろ過を行い、残渣を少量のノルマルヘキサンで洗浄し、ろ液と洗浄液を併せて、水浴上に置いて蒸発乾燥させ、残渣はメタノール溶液を加えて溶解し且つ２ｍｌまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液とする。

【0125】

標準物質溶液の調製：再現性試験項目と同じである。
測定方法：試料溶液、標準物質溶液それぞれ２０μｌを精密に取り、液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録する。各濃度は３回測定し、合計９回である。回収率、ＲＳＤ値を計算する。試験結果は表１０に示す。

【0126】

【0127】

試験結果は、回収率が比較的良いことを示した。

【実施例9】

【0128】

ギンコライド品質制御−フィンガープリント検査
クロマトグラフィー条件及びシステム適用性試験：オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填剤とし、メタノール−テトラヒドロフラン−水（２５：１０：６５）を移動相とし、蒸発型光散乱検出器を使用し、ドリフトチューブ温度が１０５℃、キャリアガス流速が３．００Ｌ／ｍｉｎで、カラム温度が４０℃で、理論段数はビロバリドピークに基づいて計算すると２５００より低くないはずである。ビロバリドピークとギンコライドＣピークとの分離度は１．５より大きいはずである。

【0129】

参照物質溶液の調製：ビロバリド標準物質、ギンコライドＡ標準物質、ギンコライドＢ標準物質、ギンコライドＣ標準物質をそれぞれ適量に精密に量り、メタノールを加えて１ｍｌ当たりにそれぞれ０．１５ｍｇ、０．１２ｍｇ、０．１ｍｇ、０．１ｍｇを含有する混合溶液を調整し、振り混ぜて、参照物質溶液とする。

【0130】

試料溶液の調製：本発明のギンコライド６ｍｇを取り、精密に量り、１０ｍｌメスフラスコに入れ、メタノール１ｍｌを加えて溶解させ、移動相を加えてメモリまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液とする。

【0131】

測定方法：参照物質溶液及び試料溶液それぞれ２０μｌを精密に取り、液体クロマトグラフに注入し、６０分間のクロマトグラムを記録する。

【0132】

漢方薬クロマトフィンガープリント類似度評価システムに基づき、試料のフィンガープリントと標準フィンガープリントとの類似度が０．９５より大きい。

【0133】

発明者は、本発明の技術的効果を証明するために、前記発明内容に対して研究及び説明を行った。以下の試験は本発明をさらに説明及び解釈するために用いられるが、本発明を制限するものではない。

【0134】

ギンコライドのフィンガープリントにおいて、ピーク２はギンコライドＣ、ピーク３はビロバリド、ピーク４はギンコライドＡ、ピーク５はギンコライドＢであり、本製品における有効部位４つの特徴ピークは全てフィンガープリントにおけるピークとそれぞれ対応できる。ギンコライド標準フィンガープリントは図５に示す。

【0135】

まず国家薬典委員会２００４年フィンガープリント指定ソフトウエアである漢方薬クロマトフィンガープリント類似度評価システムＡ版を使用して、１０ロットのギンコライドに対してそれぞれ標準フィンガープリントを生成し、異なるロットの試料のフィンガープリントと標準フィンガープリントに対して、類似度ソフトウエアを使用して類似度を計算する。試験結果は表１１に示す。

【0136】

【0137】

１０ロットのギンコライドのフィンガープリントの類似度が全て０．９５より大きい。

【実施例10】

【0138】

ギンコライド品質制御−残留溶媒測定
（１）エタノール、酢酸エチル及びノルマルヘキサン
試料溶液の調製：本発明のギンコライド約０．１ｇを取り、精密に量り、ヘッドスペースボトルに入れ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５ｍｌを精密に加えて溶解させ、密封し、試料溶液とする。

【0139】

標準物質溶液の調製：エタノール、酢酸エチル及びノルマルヘキサンを適量に取り、精密に量り、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを使用して定量希釈を行い１ｍｌ当たりにそれぞれ約３０μｇを含有する溶液を調整し、精密に５ｍｌを量り、ヘッドスペースボトルに入れ、密封し、標準物質溶液とする。

【0140】

測定方法：６％シアノプロピルフェニル−９４％ジメチルポリシロキサン（または極性の類似するもの）を固定液とし、開始温度５０℃で、３分間保持し、４０℃／ｍｉｎの速度で温度を１６０℃まで上げ、３分間保持し、サンプル注入口の温度が２００℃、検出器温度が２５０℃、ヘッドスペースボトルの平衡温度が８０℃、平衡時間が３０分である。標準物質溶液を取ってヘッドスペースボトルに注入し、各成分ピークの間の分離度が要件を満たすべきで、さらに試料溶液及び標準物質溶液を取ってそれぞれヘッドスペースボトルに注入し、クロマトグラムを記録し、外部標準法に基づいてピーク面積を計算する。

【0141】

エタノール及び酢酸エチルの含有量が共に０．５％より低く、ノルマルヘキサンの含有量が０．０２９％より低い。

【0142】

（２）樹脂残留量
標準物質溶液の調製：適量のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを取り、精密に量り、水で１ｍｌ当たりに約０．１ｍｇを含有する溶液を調整し、振り混ぜて、内部標準液とし、カプロラクタムを適量に量り、内部標準液を加えて１ｍｌ当たりに約３７．５μｇのカプロラクタムを含有する溶液を調整し、標準物質溶液とする。

【0143】

試料溶液の調製：本発明のギンコライド約２．５ｇを取り、精密に量り、コニカルフラスコに入れ、ノルマルヘキサン２５ｍｌを加え、２時間還流し、取り出し、放冷し、ろ過を行い、少量のノルマルヘキサンで洗浄し、ろ液と洗浄液を併せ、６０℃の水浴で蒸発乾燥し、残渣は内部標準液１ｍｌを加えて溶解させ、試料溶液とする。

【0144】

測定方法：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−２０Ｍ）（または極性の類似するもの）を固定液とし、開始温度１００℃、２分間保持し、４０℃／ｍｉｎの速度で温度を１６０℃まで上げ、３分間保持し、さらに４０℃／ｍｉｎの速度で温度を２２０℃まで上げ、７分間保持し、サンプル注入口の温度が２４０℃で、検出器温度が２６０℃である。標準物質溶液及び試料溶液をそれぞれ１μｌ精密的に取り、ガスクロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録する。内部標準法に基づいてピーク面積を計算し、試料溶液におけるカプロラクタムのピーク面積と内部標準ピーク面積との比が、標準物質溶液におけるカプロラクタムのピーク面積と内部標準ピーク面積との比より小さい。
カプロラクタムは検出されていない。

【実施例11】

【0145】

ギンコライド品質制御−含有量測定
クロマトグラフィー条件及びシステム適用性試験：オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填剤とし、メタノール−テトラヒドロフラン−水（２５：１０：６５）を移動相とし、蒸発型光散乱検出器を使用し、ドリフトチューブ温度が１０５℃で、キャリアガス流速が３．００Ｌ／ｍｉｎで、カラム温度が４０℃で、理論段数はビロバリドピークに基づいて計算すると２５００より低くないはずである。ビロバリドピークとギンコライドＣピークとの分離度は１．５より大きいはずである。

【0146】

標準物質溶液の調製：ビロバリド標準物質、ギンコライドＡ標準物質、ギンコライドＢ標準物質、ギンコライドＣ標準物質をそれぞれ適量に精密に量り、メタノールを加えて１ｍｌ当たりにそれぞれ０．１５ｍｇ、０．１２ｍｇ、０．１ｍｇ、０．１ｍｇを含有する混合溶液を調整し、振り混ぜて、標準物質溶液とする。

【0147】

試料溶液の調製：本発明のギンコライド６ｍｇを取り、精密に量り、１０ｍｌメスフラスコに入れ、メタノール１ｍｌを加えて溶解させ、移動相を加えてメモリまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液とする。

【0148】

測定方法：標準物質溶液１０μｌ、２０μｌ及び試料溶液１０〜２０μｌをそれぞれ精密に取り、高速液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、外部標準二点法対数方程式を使用してビロバリド、ギンコライドＡ、ギンコライドＢ及びギンコライドＣの含有量をそれぞれ計算する。

【0149】

乾燥品に基づいて計算すると、ビロバリド（Ｃ_１５Ｈ_１８Ｏ_８）４２．５％、ギンコライドＡ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_９）２５．４％、ギンコライドＢ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１０）１８．７％、ギンコライドＣ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１１）１０．６％を含有し、且つビロバリド、ギンコライドＡ、ギンコライドＢ、ギンコライドＣの総量が９７．２％である。

【実施例12】

【0150】

ギンコライド品質制御−異常毒性検査
試料溶液の調製：本発明のギンコライドを取り、塩化ナトリウム注射液を加えて１ｍｌ当たりに０．２ｍｇを含有する溶液を調整する。

【0151】

検査方法：体重１７〜２０ｇのマウス５匹を取り、マウスの尾静脈にそれぞれ試料溶液０．５ｍｌを注入し、４８時間内に死亡が認められない。

【実施例13】

【0152】

ギンコライド品質制御−発熱因子検査
試料溶液の調製：本発明のギンコライド１０ｍｇを取り、０．９％塩化ナトリウム注射液５０ｍｌに加え、振り混ぜる。

【0153】

検査方法：家兎３匹を取り、その正常体温を測定した後１５分以内に、家兎の体重に基づいて、１ｋｇ当たりに５ｍｌ試料溶液を耳静脈から徐々に注入し、３０分毎に体温を１回測定し、合計６回で測定し、体温の上昇は全て０．６℃より低く、且つ３匹の家兎の体温上昇が合計１．３℃より低い。

【実施例14】

【0154】

ギンコライド注射液品質制御−関連物質検査
注射液処方：
ギンコライド：テルペンラクトンに基づいて計算すると １〜１０ｍｇ／ｍｌ
グリセリン ０．２〜０．５ｍｌ／ｍｌ
エタノール ０．４〜０．７ｍｌ／ｍｌ
注射用水 ０〜０．５ｍｌ／ｍｌ。

【0155】

調製方法は、
ａ）調製：エタノールとグリセリンを混合し、ギンコライドを加えて、溶解させ、エタノールまたは注射用水を全量まで補充追加し、５〜１０％のクエン酸溶液または１〜１０％の塩酸溶液でｐＨ値を３．２〜３．８まで調節する。
ｂ）ろ過除菌する。
ｃ）充填密封する。

【0156】

ｄ）滅菌する。
（１）蛋白質：ギンコライド注射液２ｍｌを取り、水を加えて５０ｍｌを調整し、試料溶液とする。クマシーブリリアントブルーＧ−２５０約５０ｍｇを量り、２５ｍｌエタノールに溶解させ、さらに８５％（ｗ／ｖ）リン酸５０ｍｌを加え、水を加えて５００ｍｌに希釈し、振り混ぜて、ろ過し、ろ液５ｍｌを精密に量ってテストチューブに入れ、さらに１ｍｌ試料溶液を加え、振り混ぜて、３分間放置する。同様な方法でブランクを調製し、波長５９５ｎｍの吸光度を測定し、試料溶液の吸光度が０．０５より小さい。

【0157】

（２）タンニン：蛋白質検査項目用の試料溶液１ｍｌを取って希酢酸１滴を加え、さらにゼラチン塩化ナトリウム溶液５滴を加え、振り混ぜて、１０分間放置し、混濁または沈殿物が認められない。

【0158】

（３）樹脂：蛋白質検査項目用の試料溶液５ｍｌを取って、塩酸１滴を加え、３０分間放置し、樹脂状物質の析出が認められない。

【0159】

（４）シュウ酸塩：蛋白質検査項目用の試料溶液２ｍｌを取って、希塩酸でｐＨ値を１〜２に調節し、ろ過を行い、ろ液はアンモニア水でｐＨ値を５〜６に調節し、３％塩化カルシウム溶液３滴を加え、１０分間放置し、混濁または沈殿物が認められない。

【0160】

（５）カリウムイオン：蛋白質検査項目用の試料溶液２ｍｌを取って、１０ｍｌネスラー比色管に入れ、アルカリ性ホルムアルデヒド溶液０．６ｍｌ、３％ＥＤＴＡ溶液２滴、３％テトラフェニルホウ酸ナトリウム溶液０．５ｍｌを加え、水を加えて１０ｍｌまで希釈し、また、標準塩化カリウム溶液０．８ｍｌを取り、同様な方法で試験し、濁度が標準溶液より低い。

【実施例15】

【0161】

ギンコライド注射液品質制御−溶血及び凝集検査
試料溶液の調製：ギンコライド注射液（実施例１４に基づいて調製する）６ｍｌを取り、０．９％塩化ナトリウム注射液１００ｍｌに加えて振り混ぜる。

【0162】

検査方法：清潔なガラステストチューブ５本を取り、番号を付け、１、２番チューブは試料用チューブで、３番チューブは陰性対照用チューブで、４番チューブは陽性対照用チューブで、５番チューブは試料対照用チューブである。表１２に示す順に２％赤血球懸濁液、０．９％塩化ナトリウム溶液、蒸留水を逐次に加え、混合して均一化させた後３７℃±０．５℃の恒温器に入れて恒温させる。

【0163】

【0164】

テストチューブ内の溶液が澄み切った赤色を呈し、底には細胞が残留していないまたは少量の赤血球が残留していれば、溶血が発生しているとする。もし赤血球が全部沈み、上澄み液が無色澄明で、または上澄み液が色あり澄明であるが、１、２番チューブ及び５番チューブの肉眼観察結果が顕著な差異が無ければ、溶血が発生していないことを示す。３時間後に観察する結果、溶血及び凝集反応は認められない。

【実施例16】

【0165】

ギンコライド注射液品質制御−フィンガープリント検査
クロマトグラフィー条件及びシステム適用性試験：オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填剤とし、メタノール−テトラヒドロフラン−水（２５：１０：６５）を移動相とし、蒸発型光散乱検出器を使用し、ドリフトチューブ温度が１０５℃で、キャリアガス流速が３．００Ｌ／ｍｉｎで、カラム温度が４０℃で、理論段数はビロバリドピークに基づいて計算すると２５００より低くないはずである。ビロバリドピークとギンコライドＣピークとの分離度は１．５より大きいはずである。

【0166】

参照物質溶液の調製：ビロバリド標準物質、ギンコライドＡ標準物質、ギンコライドＢ標準物質、ギンコライドＣ標準物質をそれぞれ適量に精密に量り、メタノールを加えて１ｍｌ当たりにそれぞれ０．１５ｍｇ、０．１２ｍｇ、０．１ｍｇ、０．１ｍｇを含有する混合溶液を調整し、振り混ぜて、参照物質溶液とする。

【0167】

試料溶液の調製：「含有量測定」項目における試料溶液を取る。

【0168】

測定方法：参照物質溶液及び試料溶液それぞれ２０μｌを精密に量り、液体クロマトグラフに注入し、６０分間のクロマトグラムを記録する。

【0169】

漢方薬クロマトフィンガープリント類似度評価システムに基づき、試料フィンガープリントと標準フィンガープリントとの類似度が０．９５より大きい。

【実施例17】

【0170】

ギンコライド注射液品質制御−含有量測定
クロマトグラフィー条件及びシステム適用性試験：オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填剤とし、メタノール−テトラヒドロフラン−水（２５：１０：６５）を移動相とし、蒸発型光散乱検出器を使用し、ドリフトチューブ温度が１０５℃で、キャリアガス流速が３．００Ｌ／ｍｉｎで、カラム温度が４０℃で、理論段数はビロバリドピークに基づいて計算すると２５００より低くないはずである。ビロバリドピークとギンコライドＣピークとの分離度は１．５より大きいはずである。

【0171】

標準物質溶液の調製：ビロバリド標準物質、ギンコライドＡ標準物質、ギンコライドＢ標準物質、ギンコライドＣ標準物質をそれぞれ適量に精密に量り、メタノールを加えて１ｍｌ当たりにそれぞれ０．１５ｍｇ、０．１２ｍｇ、０．１ｍｇ、０．１ｍｇを含有する混合溶液を調整し、振り混ぜて、標準物質溶液とする。

【0172】

試料溶液の調製：ギンコライド注射液（実施例１４に基づき調製する）１ｍｌを精密に量り、リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）１４ｍｌを加え、振り混ぜて、Ｅｘｔｒｅｌｕｔ−２０カラムを通過させ、１５分間吸着させ、酢酸エチル１００ｍｌを使用して溶出し、溶出液を収集し、水浴上で蒸発乾燥し、残渣は移動相で溶解させ且つ１０ｍｌのメスフラスコに移入し、移動相を加えてメモリまで希釈し、振り混ぜて、０．４５μｍ微多孔膜を使用してろ過し、試料溶液とする。

【0173】

測定方法：標準物質溶液をそれぞれ１０μｌ、２０μｌ、及び試料溶液１５μｌを精密に取り、高速液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、外部標準二点法対数方程式を使用してビロバリド、ギンコライドＡ、ギンコライドＢ及びギンコライドＣの含有量をそれぞれ計算する。

【0174】

ギンコライド注射液は１ｍｌ当たりにギンコテルペンラクトン５．１５ｍｇを含有する。

【0175】

ギンコライド注射液は、１ｍｌ当たりにギンコテルペンラクトンの含有量が、ビロバリド（Ｃ_１５Ｈ_１８Ｏ_８）、ギンコライドＡ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_９）、ギンコライドＢ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１０）及びギンコライドＣ（Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_１１）の総量に基づいて計算すると１〜１０ｍｇで、好ましくは４．２５〜５．７５ｍｇである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】