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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5943456
(24)【登録日】2016年6月3日
(45)【発行日】2016年7月5日
(54)【発明の名称】生物学的対象物の分化制御方法及びその装置
(51)【国際特許分類】
C12N 5/073 20100101AFI20160621BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20160621BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20160621BHJP
【ＦＩ】
C12N5/073
C12N5/071
C12M3/00 Z
【請求項の数】8
【全頁数】13
(21)【出願番号】特願2011-215851(P2011-215851)
(22)【出願日】2011年9月30日
(65)【公開番号】特開2013-74822(P2013-74822A)
(43)【公開日】2013年4月25日
【審査請求日】2014年9月19日
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】801000049
【氏名又は名称】一般財団法人生産技術研究奨励会
(74)【代理人】
【識別番号】100089635
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 守
(72)【発明者】
【氏名】藤井 輝夫
(72)【発明者】
【氏名】阿久津 英憲
(72)【発明者】
【氏名】酒井 康行
(72)【発明者】
【氏名】金田 祥平
(72)【発明者】
【氏名】木村 啓志
(72)【発明者】
【氏名】川田 治良
【審査官】
鈴木 崇之
(56)【参考文献】
【文献】
特開２０１１−１４７３８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１０−２７３６５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００７−５０４８１６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００５−１４８０４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００７−０５４０２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
米国特許出願公開第２０１１／００６４８２８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
集積型現場分析装置用送液システムの超小型化、URL: <http://www.microfluidics.iis.u-tokyo.ac.jp/r10020_j.html>，２０１０年，検索日：2015/04/21
【文献】
KAWADA J., et al. ，Microfluidic spatial control of stem cell differentiation，14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences，２０１０年１０月，P. 7-9
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ ５／０７３
Ｃ１２Ｎ ５／０７１
Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
マイクロ流体デバイス内部に上部チャンネルと下部チャンネルとの境界に微小孔を有する薄膜を挟み込み、前記上部チャンネルに導入した生物学的対象物であるＥＢ又は受精卵を前記微小孔に固定・保持することを特徴とする生物学的対象物の分化制御方法であって、前記上部チャンネルを上層流路、前記下部チャンネルを下層流路となし、前記下層流路の吸引送液により、前記上層流路に導入した前記ＥＢ又は受精卵を前記微小孔に固定・保持することを特徴とする生物学的対象物の分化制御方法。
【請求項2】
請求項１記載の生物学的対象物の分化制御方法において、前記微小孔で前記上層流路と前記下層流路とを隔てることによって部分的に連接されつつ独立なもう一つのＥＢを持つ特殊形状のＥＢを形成することを特徴とする生物学的対象物の分化制御方法。
【請求項3】
請求項１記載の生物学的対象物の分化制御方法において、前記上層流路と前記下層流路のそれぞれの入口ポートにはリザーバが設置され、前記上層流路と前記下層流路にはそれぞれ異なる組成の培養液を導入して連接したそれぞれのＥＢを異なる液性因子に暴露し、独立した分化制御を可能にすることを特徴とする生物学的対象物の分化制御方法。
【請求項4】
請求項１記載の生物学的対象物の分化制御方法において、前記下層流路に二つ以上の組成の培養液によって層流を形成することで、下層流路側のＥＢを異なる液性因子に暴露するようにしたことを特徴とする生物学的対象物の分化制御方法。
【請求項5】
請求項１記載の生物学的対象物の分化制御方法において、前記上層流路を開放空間とすることによって、前記生物学的対象物の増殖による大きさの変化に対応させることを特徴とする生物学的対象物の分化制御方法。
【請求項6】
マイクロ流体デバイス内部に形成される上部チャンネル及び下部チャンネルと、前記上部チャンネルと下部チャンネルとの境界に挟み込こまれる微小孔を有する薄膜とを備え、前記上部チャンネルに導入した生物学的対象物であるＥＢ又は受精卵を前記微小孔に固定・保持することを特徴とする生物学的対象物の分化制御装置であって、前記上部チャンネルが上層流路であり、前記下部チャンネルが下層流路であり、前記下層流路の吸引送液により、前記上層流路に導入した前記ＥＢ又は受精卵を前記微小孔に固定・保持することを特徴とする生物学的対象物の分化制御装置。
【請求項7】
請求項６記載の生物学的対象物の分化制御装置において、前記微小孔で前記上層流路と前記下層流路とを隔てられ、部分的に連接されつつ独立なもう一つのＥＢを持つ特殊形状のＥＢを形成することを特徴とする生物学的対象物の分化制御装置。
【請求項8】
請求項６記載の生物学的対象物の分化制御装置において、前記上層流路と前記下層流路のそれぞれの入口ポートには設置されるリザーバと、前記上層流路と前記下層流路のそれぞれに前記リザーバから導入される、それぞれ異なる組成の培養液とを備え、前記培養液を導入して連接したそれぞれのＥＢを異なる液性因子に暴露し、独立した分化制御を可能にすることを特徴とする生物学的対象物の分化制御装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物学的対象物の分化制御方法及びその装置に関するものである。特に、胚様体や受精卵に対する液性因子暴露の精密な制御による生物学的対象物の分化制御方法及びその装置に関するものである。
【背景技術】
【0002】
細胞や組織の挙動を理解する上で、それらをとりまく微小環境が大きな役割を果たすことが指摘されて久しいが、培養皿を用いる静的な実験方法では、細胞を取りまく微小環境を精密に設計・制御することが困難であった。これに対して、微小流体操作を応用して微小環境を制御する方法もあるが、三次元の生物学的対象物である胚様体に対して流れを用いる（下記特許文献１参照）と、流れそのものを乱してしまうために、液性因子暴露の精密な制御が困難であった。なお、ここで、胚様体とはＥＳ細胞（多能性幹細胞）・ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）の集合体である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特表２００４−５３５１７６号公報
【特許文献2】特開２０１１−１４７３８７号公報
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｇ．Ｋｅｌｌｅｒ，“Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｔｉａｔｉｏｎ：ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ”，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．，１９，１１２９（２００５）．
【非特許文献2】Ｅｌｅｃｔｒａ Ｃｏｕｃｏｕｖａｎｉｓ ａｎｄ Ｇａｉｌ Ｆｔ．Ｍａｒｔｉｎ，“Ｓｉｇｎａｌｓ ｆｏｒ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ：Ａ Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ Ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｅｍｂｒｙｏ”，Ｃｅｌｌ，８３，２７９（１９９５）
【非特許文献3】Ｙａｌｉ Ｃｈｅｎ，Ｘｉａｏｆｅｎｇ Ｌｉ，Ｖｅｒａｒａｇａｖａｎ Ｐ Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ，Ｒｏｎｙ Ｓｅｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｌｏｎａｉ，“Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ） ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ＰＩ ３−ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ Ａｋｔ／ＰＫＢ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｉｔｉｏｎ”，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，３７５０（２０００）
【非特許文献4】Ｊｉｒｏ Ｋａｗａｄａ，Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｉｄｅｎｏｒｉ Ａｋｕｔｓｕ，Ｙａｓｕｙｕｋｉ Ｓａｋａｉ ａｎｄ Ｔｅｒｕｏ Ｆｕｊｉｉ，ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＣ ＳＰＡＴＩＡＬ ＣＯＮＴＲＯＬ ＯＦ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ”，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＭｉｃｒｏＴＡＳ ２０１０，７（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は無限に増殖可能であり、三胚様から様々な細胞へ分化させることができる（上記非特許文献１参照）。そして、胚様体（以下、ＥＢという）を発生させることが分化過程の初期段階となり得ることが示された（上記非特許文献１参照）。いくつかの論文では、ＥＢの分化過程が生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での胚の発生過程とある程度類似性を有することも示されている（上記非特許文献２，３参照）。したがって、特に、発生生物学分野において、ＥＢの時空間的分化制御ツールの開発は重要である。そこで、これまでに、本発明者らは二次元培養された多能性幹細胞の分化制御のためのマイクロ流体デバイスを提案している（上記特許文献２，上記非特許文献４参照）。
【0006】
しかし、上記したように、従来はＥＢなどの三次元の生物学的対象物に対して微小流だけでは部位特異的な液性因子暴露の精密な制御は困難であった。より具体的には、本発明では、マイクロ・ナノ統合アプローチによるＥＳ細胞・ｉＰＳ細胞の集合体又は受精卵を含む生物学的対象物の分化制御方法及びその装置を対象とする。
【0007】
本発明は、上記状況に鑑みて、液性因子暴露の精密な制御を実現することができる、生物学的対象物の分化制御方法及びその装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、上記目的を達成するために、〔１〕マイクロ流体デバイス内部に上部チャンネルと下部チャンネルとの境界に微小孔を有する薄膜を挟み込み、前記上部チャンネルに導入した生物学的対象物であるＥＢ又は受精卵を前記微小孔に固定・保持することを特徴とする生物学的対象物の分化制御方法であって、前記上部チャンネルを上層流路、前記下部チャンネルを下層流路となし、前記下層流路の吸引送液により、上層流路に導入した前記ＥＢ又は受精卵を前記微小孔に固定・保持することを特徴とする。
【0009】
〔２〕上記〔１〕記載の生物学的対象物の分化制御方法において、前記微小孔で前記上層流路と前記下層流路とを隔てることによって部分的に連接されつつ独立なもう一つのＥＢを持つ特殊形状のＥＢを形成することを特徴とする。
【0010】
〔３〕上記〔１〕記載の生物学的対象物の分化制御方法において、前記上層流路と前記下層流路のそれぞれの入口ポートにはリザーバが設置され、前記上層流路と前記下層流路にはそれぞれ異なる組成の培養液を導入して連接したそれぞれのＥＢを異なる液性因子に暴露し、独立した分化制御を可能にすることを特徴とする。
【0011】
〔４〕上記〔１〕記載の生物学的対象物の分化制御方法において、前記下層流路に二つ以上の組成の培養液によって層流を形成することで、下層流路側のＥＢを異なる液性因子に暴露するようにしたことを特徴とする。
【0012】
〔５〕上記〔１〕記載の生物学的対象物の分化制御方法において、前記上層流路を開放空間とすることによって、前記生物学的対象物の増殖による大きさの変化に対応させることを特徴とする。
【0013】
〔６〕マイクロ流体デバイス内部に形成される上部チャンネル及び下部チャンネルと、前記上部チャンネルと下部チャンネルとの境界に挟み込こまれる微小孔を有する薄膜とを備え、前記上部チャンネルに導入した生物学的対象物であるＥＢ又は受精卵を前記微小孔に固定・保持することを特徴とする生物学的対象物の分化制御装置であって、前記上部チャンネルが上層流路であり、前記下部チャンネルが下層流路であり、前記下層流路の吸引送液により、前記上層流路に導入した前記ＥＢ又は受精卵を前記微小孔に固定・保持することを特徴とする。
【0014】
〔７〕上記〔６〕記載の生物学的対象物の分化制御装置において、前記微小孔で前記上層流路と前記下層流路とを隔てられ、部分的に連接されつつ独立なもう一つのＥＢを持つ特殊形状のＥＢを形成することを特徴とする。
【0015】
〔８〕上記〔６〕記載の生物学的対象物の分化制御装置において、前記上層流路と前記下層流路のそれぞれの入口ポートには設置されるリザーバと、前記上層流路と前記下層流路のそれぞれに前記リザーバから導入される、それぞれ異なる組成の培養液とを備え、前記培養液を導入して連接したそれぞれのＥＢを異なる液性因子に暴露し、独立した分化制御を可能にすることを特徴とする。
【発明の効果】
【0016】
本発明によれば、薄膜の微小孔の吸引現象によって、生物学的対象物を固定・保持することができ、培養状態をタイムラプス（Ｔｉｍｅ−Ｌａｐｓｅ）装置などで観察することができる。また、薄膜の微小孔で上下層の流路を隔てることによって、部分的に連接されつつ独立なもう一つの生物学的対象物としてのＥＢを持つ特殊形状のＥＢを形成することができる。このとき、上下層に組成の異なる培養液を導入すると、連接したそれぞれの生物学的対象物を異なる液性因子に暴露することができるため、独立した分化制御が可能である。特に、連接部位（括れ部分）では連接したＥＢ間の相互作用を観察することができる。孔径や孔数を任意に変更することも容易であり、取り扱うＥＢの集合体又は受精卵のサイズ変更やアレイ化も可能である。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】本発明の第１実施例を示す生物学的対象物としてのＥＢの分化制御装置の模式図である。
【図2】タイムラプス（Ｔｉｍｅ−Ｌａｐｓｅ）装置を示す図面代用写真である。
【図3】微小孔に固定されたＥＢを示す図である。
【図4】薄膜に形成された微小孔に固定されたＥＢを示す側面図である。
【図5】デバイス内培養１日目及び３日目のＥＢの状態を示す図である。
【図6】培養４日目のデバイスから取り出したＥＢの状態を示す図である。
【図8】培養７日目（培養皿に移してから３日目）のＥＢの分化状態を示す図である。
【図9】培養８日目（培養皿に移してから４日目）のＥＢの分化状態を示す図である。
【図10】培養８日目での蛍光観察を示す図である。
【図11】薄膜の微小孔変更後（直径１００μｍ）の未分化状態のＥＢの固定を示す図である。
【図12】デバイス内のＥＢ培養の様子を示す図である。
【図13】ａｒｔ−ＥＢ培養結果を示す図である。
【図15】本発明の第２実施例を示す生物学的対象物としてのＥＢの形成装置の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明の生物学的対象物の分化制御方法は、マイクロ流体デバイス内部に上部チャンネルと下部チャンネルとの境界に微小孔を有する薄膜を挟み込み、前記上部チャンネルに導入した生物学的対象物であるＥＢ又は受精卵を前記微小孔に固定・保持する生物学的対象物の分化制御方法であって、前記上部チャンネルを上層流路、前記下部チャンネルを下層流路となし、前記下層流路の吸引送液により、上層流路に導入した前記ＥＢ又は受精卵を前記微小孔に固定・保持する。
【実施例】
【0019】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【0020】
図１は本発明の第１実施例を示す生物学的対象物としてのＥＢのａｒｔ−ＥＢ分化制御装置の模式図であり、図１（ａ）はその全体斜視図、図１（ｂ）はその部分拡大斜視図である。
【0021】
これらの図において、１は生物学的対象物としてのＥＢのａｒｔ−ＥＢの分化制御装置、２は上部チャンネル、３は下部チャンネル、４は上部チャンネル２と下部チャンネル３とを仕切る薄膜、５は薄膜４に形成される微小孔、６は上部チャンネル２のリザーバ、７はリザーバ６から導入されるＥＢ、８はリザーバ６から上部チャンネル２に供給される第１の培地、９は下部チャンネル３のリザーバ、１０はリザーバ９から下部チャンネル３に供給される印加される陰圧の第２の培地である。
【0022】
また、微小孔の大きさは、例えば、数μｍから数ｍｍ（具体的には１μｍから１ｍｍ）の範囲で制御可能であり、また、薄膜の厚みは特に限定されないが、例えば、５μｍ〜１００μｍが望ましい。
【0023】
なお、薄膜４の材料としては、樹脂であればよく、例えば、製作し易いポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）やこのＰＤＭＳ以外にもポリスチレン、ポリカーボネート、又はポリエチレンテレフタレートなどでもよい。
【0024】
また、微小孔５の孔径はＥＢ７の径よりも小さければよいものとする。また、微小孔５の形状は円形に限定されるものではないが、上部チャンネル２と下部チャンネル３とが仕切られるようにする必要がある。
【0025】
上部チャンネル２および下部チャンネル３にはそれぞれリザーバ６，９が設置されており、各チャンネル２，３に供給する培地８，１０が貯蔵されている。下部チャンネル３には下部チャンネル３の出口側から陰圧が印加されるように構成しているので、微小孔５には上部チャンネル２から下部チャンネル３方向への流れが生じ、この微小孔５への吸引現象が生じる。リザーバ６から上部チャンネル２へ導入されるＥＢ７をこの吸引現象により微小孔５に固定・保持することができる。このように固定・保持されたＥＢ７を培養し、図２に示すようなタイムラプス（Ｔｉｍｅ−Ｌａｐｓｅ）装置にセットアップ〔図２（ａ）〕し、培養状態を撮影することで〔図２（ｂ）〕、培養の様子を観察することができる。さらに、このように固定・保持されたＥＢ７に液性因子暴露を行うこともできる。
【0026】
このように、本発明によれば、培地中で浮遊状態となる三次元構造物であるＥＢ又は受精卵を流体操作のみで固定・保持することができ、観察および液性因子暴露による分化誘導を行うことができる。
【0027】
ところで、実際の培養においては、体内と類似したＨｅｔｅｒｏｇｅｎｕｓｅ環境下で培養を行う必要がある。つまり、ＥＢ又は受精卵の培養を行う装置では、そのようなＨｅｔｅｒｏｇｅｎｕｓｅ環境を実現する必要がある。
【0028】
図１（ｂ）に示したように、本発明の装置では、ＥＢ７は微小孔５に固定・保持されている。例えば、ここで導入されるＥＢ７の直径が約５００μｍであり、微小孔５の直径が２００μｍとすると、ＥＢ７の薄膜４により上側部分が第１の培地８に暴露され、ＥＢ７の薄膜４により下側部分が第２の培地１０に暴露されることになる。そこで、第１の培地８と第２の培地１０を異なる培地とすることで、１つのＥＢ７に対し、異なる液性因子暴露を行うことができる。
【0029】
図３は微小孔に固定されたＥＢを示す図であり、図３（ａ）は分化制御装置内のＥＢに焦点を当てた画像、図３（ｂ）は微小孔に焦点を当てた画像である。
【0030】
これらの図において、５は薄膜４に形成された微小孔、７は上部チャンネル２に導入されたＥＢである。図３（ｂ）に見られるように、微小孔５の輪郭が確認でき、ＥＢ７が微小孔５に固定されていることが分かる。この状態で、上部チャンネル２に第１の培地８として心筋分化培地であるＦＢＳ（細胞培養液成分）２０％培養液、下部チャンネル３に第２の培地１０として神経分化培地であるＲＨＢＡ培養液の送液を開始する。
【0031】
図４は薄膜に形成された微小孔に固定されたＥＢを示す側面図である。
【0032】
図５は培養１日目及び３日目のＥＢの分化状態を示す図であり、図５（ａ）はその１日目の微小孔５に固定されたＥＢに焦点を当てた画像、図５（ｂ）はそのＥＢが固定された微小孔５に焦点を当てた画像、図５（ｃ）はその３日目の微小孔５に固定されたＥＢに焦点を当てた画像、図５（ｄ）はそのＥＢが固定された微小孔５に焦点を当てた画像を示す図である。
【0033】
これらの図から明らかなように、時間の経過とともに、微小孔５の手前側に派生したＥＢが下部チャンネル３で徐々に大きくなっている。つまり、図５（ｂ）及び図５（ｄ）の画像では、黒いものが徐々に大きくなっていることがわかる。
【0034】
図６は培養４日目のＥＢの状態を示す図であり、デバイス内から取り出して培養皿に移したものを示す。この図より分かるように、上部チャンネル２側に心筋分化培地を暴露させた心筋分化培地暴露部位１１と下部チャンネル３側で神経分化培地を暴露させた神経分化培地暴露部位１２と薄膜に形成された微小孔に対応したそれらの境界部位（括れ部）１３を示しており、雪だるま状のＥＢ１４が形成されている。
【0035】
図７は上記した図１〜図６までをまとめたフローを示す図であり、第１日目の培養〔図７（ａ）参照〕から第４日目の培養〔図７（ｂ）参照〕を経て、図７（ｃ）に示すように、培養皿１５にＥＢをピックアップするようにしており、上記したようにＥＢが培養され、図７（ｄ）に示すように、雪だるま状のＥＢが形成されている。
【0036】
図８は培養７日目（培養皿に移してから３日目）のＥＢ分化状態を示す図であり、図８（ａ）はＥＢの全体を示す図、図８（ｂ）は心筋分化培地暴露部位の様子を示す図、図８（ｃ）は神経分化培地暴露部位の様子を示す図である。ここで、神経分化培地暴露部位１２では神経様細胞２２を確認し、心筋分化培地暴露部位１１での非神経様細胞２１とは細胞の形態が明らかに異なる。
【0037】
図９は培養８日目（培養皿に移してから４日目）のＥＢの分化状態を示す図であり、神経分化培地暴露部位１２では神経様細胞２２ａ，２２ｂ，２２ｃを確認し、心筋分化培地暴露部位１１の非神経様細胞２１ａ，２１ｂ，２１ｃとは細胞の形態が明らかに異なる。
【0038】
図１０は培養８日目での蛍光観察を示す図であり、心筋分化培地暴露部位１１のＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（タカラバイオ株式会社製）による蛍光観察〔図１０（ａ）〕、Ｔ α−１ チューブリンによる蛍光観察〔図１０（ｂ）〕、神経分化培地暴露部位１２のＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒによる蛍光観察〔図１０（ｃ）〕、Ｔ α−１ チューブリンによる蛍光観察〔図１０（ｄ）〕を示す図である。 より具体的には、本発明でマウス胚性幹細胞（Ｔ α−１ チューブリン−ＧＦＰ マウスＥＳ細胞株。なお、Ｔ α−１ チューブリンは初期神経分化マーカーの１つ）より作製したＥＢを本装置中で培養した。まず、ウェルプレートでＥＢを作製し、ウェルプレートで２４時間培養したものを本デバイスに導入する。次に、上部チャンネルについてはＦＢＳ２０％培地を、下部チャンネルについては神経分化（ＮＤ）培地（ステムセル社製）を、リザーバにそれぞれ充填した。４日目にＥＢをデバイス内から回収し、ＦＢＳ培地で満たされたコラーゲンコートされた培養皿に移した。
【0039】
上記で示したように，本発明で形成されたＥＢは、ＥＢの膜上側部分が大きくなっており、同時に薄膜下側にも別の球状構造が形成されている。薄膜上側と薄膜下側の２つの球状構造は互いに結合しており、連接型胚様体（ａｒｔｉｃｕｌａｔｅｄ ＥＢ；ａｒｔ−ＥＢ）と呼ぶような雪だるま形状を形成している。本発明の形成装置では、ａｒｔ−ＥＢの２つの球状部を異なる培地にそれぞれ暴露することができ、ａｒｔ−ＥＢを培養皿に移すと、連接形状がはっきりと観察される。ａｒｔ−ＥＢを接着してさらに培養皿で培養したところ、ＮＤ培地に暴露された、ａｒｔ−ＥＢの下側の球状構造に対応する部分の細胞に神経様形状が見られる。さらに、下側の球状部分では、Ｔ α−１ チューブリンの発現と関連するＧＦＰの蛍光強度が、ａｒｔ−ＥＢの上側の球状構造に対応する部分よりもかなり高かった。これらの結果から、ａｒｔ−ＥＢの下側の球状部分で神経分化が誘導されたことがわかる。さらに、上側の球状部分は神経細胞とは明らかに異なる形態を示した。
【0040】
このように、本発明によれば、部分的に連接される２つの球状部分を備えるＥＢを形成することができ、さらに、各球状部分に対して独立した分化制御を行うことに成功した。
【0041】
次に、薄膜の微小孔変更後のＥＢの固定について説明する。
【0042】
図１１は薄膜の微小孔へ変更後（直径１００μｍ）のＥＢの固定を示す図であり、図１１（ａ）はＥＢ３３に焦点をあてた図、図１１（ｂ）は微小孔３２に焦点をあてた図である。なお、３１は薄膜である。図１１の右側の蛍光画像は、胚様体が未分化である状態を示す。
【0043】
本実施例では、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ ｉＰＳ（人工多能幹細胞、なおＮａｎｏｇは未分化を示すマーカー遺伝子）を使用し、上部チャンネルは未分化維持培地〔ＬＩＦ（＋）ＫＳＲ１５％〕、下部チャンネルは分化培地（ＬＩＦ（−）ＦＢＳ１５％〕である。
【0044】
このように微小孔径を変更しても同様に雪だるま形状のＥＢを形成することができる。
【0045】
図１２はデバイス内のＥＢの様子を示す図である。図１２（ａ）は培養開始時のＥＢの様子を示し、微小孔に焦点を当てたもの（明視野と蛍光画像）で蛍光画像から蛍光が確認できるため、未分化状態が保たれていることを示す。図１２（ｂ）は培養後（培養３日目）のＥＢの様子を示し、下層流路側に焦点を当てたもの（明視野と蛍光画像）を示す図である。上層流路内のＥＢから蛍光が観察され、上層流路内の培養液によって未分化状態が維持されていることを示す。
【0046】
図１３はａｒｔ−ＥＢ形成時の分化の様子を示す図であり、図１３（ａ）はａｒｔ−ＥＢをデバイスから取り出し、上層部に形成されたＥＢの図、図１３（ｂ）はｃｏｎｔｒｏｌ実験として、９６ウェルプレートの中で、ＬＩＦ（＋）培養液に暴露したＥＢであり、図１３（ｃ）はＬＩＦ（−）培養液に暴露したＥＢの明視野と蛍光画像、蛍光で光っている部位は未分化状態を示している。一方、蛍光が見られない部位は分化した状態を示している。
【0047】
図１４は図１３の培養後のＥＢの分割を活かした系統分化を示す図である。実験方法としては、ａｒｔ−ＥＢを形成した後、上下層流路に形成された両方のＥＢを再びデバイスに入れ、培養し、再びａｒｔ−ＥＢを培養する。この実験を繰り返して、デバイス内で時間的に異なる培養液にさらしたａｒｔ−ＥＢを形成させることで、生体内での胚発生に準じた分化制御を系統的に行うことができる。
【0048】
図１５は本発明の第２実施例を示す生物学的対象物としてのＥＢの分化制御装置の模式図である。
【0049】
この実施例では、上部チャンネルが開放空間であり、前記生物学的対象物の増殖による大きさの変化に対応させるように構成した例であり、上記した上部チャンネルとして、流路に代えて、開放空間を用いることもできる。また、開放空間にすることによって、微小孔５へのアクセスがしやすくなることで、ＥＢの配置や培養後の回収が可能になる。
【0050】
図１５において、４１は生物学的対象物としてのＥＢ又は受精卵の分化制御装置、４２は上部チャンネルとしての上部空間が開放される桶、４３は下部チャンネル、４４は桶４２と下部チャンネル４３とを仕切る薄膜、４５は薄膜４４に形成される微小孔、４６はウェルプレートであり、桶４２内に導入される第１の培地４８とともに封入されるＥＢ４７がセットされている。４９は下部チャンネル４３のリザーバ、５０は下部チャンネル４３に供給される印加される陰圧の第２の培地である。
【0051】
このように、第１実施例における上部チャンネル２に代えて、上部空間を設定しておき、上記したように、ＥＳ又は受精卵の培養と分化制御を促すことができる。
【0052】
上記実施例では主に、ＥＢについて説明したが、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞又は受精卵を含む三次元生物学的対象物についても適用できる。
【0053】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【0054】
本発明の生物学的対象物の形成方法は、液性因子暴露の精密な制御を実現することができる、生物学的対象物の形成方法として利用可能である。
【符号の説明】
【0055】
１，４１ 生物学的対象物としてのＥＢのａｒｔ−ＥＢの分化制御装置２ 上部チャンネル
３，４３ 下部チャンネル
４，３１，４４ 上部チャンネルと下部チャンネルとを仕切る薄膜
５，３２，４５ 薄膜に形成される微小孔
６ 上部チャンネルのリザーバ
７ リザーバから導入されるＥＢ
８ 上部チャンネルに供給される第１の培地
９，４９ 下部チャンネルのリザーバ
１０，５０ 下部チャンネルに供給される第２の培地
１１ 心筋分化培地暴露部位
１２ 神経分化培地暴露部位
１３ 境界部位（括れ部）
１４ 雪だるま状のＥＢ
１５ 培養皿
２１，２１ａ，２１ｂ，２１ｃ 非神経様細胞
２２，２２ａ，２２ｂ，２２ｃ 神経様細胞
３３ ＥＢ
４２ 上部チャンネルとしての上部空間が開放される桶
４６ ウェルプレート
４７ 桶内に導入されるＥＢ
４８ 桶内に導入される第１の培地