特許 5944191 メラノサイト分化誘導促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5944191

(24)【登録日】2016年6月3日

(45)【発行日】2016年7月5日

(54)【発明の名称】メラノサイト分化誘導促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/97 20060101AFI20160621BHJP

   A61Q 19/04 20060101ALI20160621BHJP

   A61Q 5/00 20060101ALI20160621BHJP

   A61K 36/03 20060101ALI20160621BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160621BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20160621BHJP

   A23L 33/105 20160101ALN20160621BHJP

   A23L 2/52 20060101ALN20160621BHJP

   A23L 2/38 20060101ALN20160621BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/97

   A61Q19/04

   A61Q5/00

   A61K36/03

   A61P43/00 105

   A61P17/00

   !A23L33/105

   !A23L2/00 F

   !A23L2/38 C

【請求項の数】3

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2012-63963(P2012-63963)

(22)【出願日】2012年3月21日

(65)【公開番号】特開2013-194001(P2013-194001A)

(43)【公開日】2013年9月30日

【審査請求日】2015年1月16日

(73)【特許権者】

【識別番号】592262543

【氏名又は名称】日本メナード化粧品株式会社

(72)【発明者】

【氏名】堀田 直和

(72)【発明者】

【氏名】坂井田 勉

(72)【発明者】

【氏名】井上 悠

(72)【発明者】

【氏名】長谷川 靖司

【審査官】 岩下 直人

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−１９１００８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１６７１２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−０８１７７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−０１０６９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biological and Pharmaceutical Bulletin，２０００年，Vol. 23，No. 8，Pages 962-967

【文献】 生薬学雑誌，２００６年，Vol.60，No.1，Pages 9-14

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ８／９７

Ａ６１Ｋ ３６／０３

Ａ６１Ｐ １７／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｑ ５／００

Ａ６１Ｑ １９／０４

Ａ２３Ｌ ２／３８

Ａ２３Ｌ ２／５２

Ａ２３Ｌ ３３／１０５

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ガゴメコンブ、オニコンブ及びホソメコンブから選択される１種又は２種以上の海藻の抽出物を含有することを特徴とする、メラノサイト分化誘導促進剤。

【請求項2】

ガゴメコンブ、オニコンブ及びホソメコンブから選択される１種又は２種以上の海藻の熱水又は塩酸抽出物を含有することを特徴とする、メラノサイト分化誘導促進剤。

【請求項3】

請求項１又は２記載のメラノサイト分化誘導促進剤を含有することを特徴とする、色素異常症又は白髪の予防若しくは改善用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願発明は、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導促進剤、並びに当該分化誘導促進剤を含有することを特徴とする、メラニン産生促進剤、白髪防止用組成物、皮膚黒化用組成物、及び頭髪若しくは皮膚用外用剤に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚や毛髪の色調は、皮膚や毛髪に含有するメラニンの量によって左右される。メラニンは、皮膚や毛髪に存在する色素細胞（メラノサイト）において、チロシンから生合成される。メラノサイトを活性化させることにより、メラニンが合成され、その結果、毛髪は黒色になり、皮膚は褐色になる。
一方、メラノサイトには様々な分化段階（神経堤細胞、色素幹細胞、メラノブラスト等）が存在しており、その分化の異常により様々な色素異常症や白髪化が引き起こされる。よって、このメラノサイトの分化自体を制御する因子の同定が根本的な色素異常症や白髪の解決のために重要である。しかしながら、従来においては、メラノサイト制御因子の探索には、主にメラノーマ細胞（メラノサイトの癌化により生じる）、最終分化後のメラノサイト及びマッシュルーム由来チロシナーゼ等を用いて行うスクリーニング系が用いられていた（特許文献１）。そのため、メラノサイトの分化を制御する因子の探索は従来においてほとんど行われていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２００５−１５４７２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

上述のように、メラノサイトの分化自体を制御する因子の同定が根本的な色素異常症及び白髪化の解決のために重要である。
そこで、本願発明は、上述した実情に鑑み、幹細胞からメラノサイトへの分化促進活性を有する素材を見出し、これまでにない根本的な白髪防止改善用組成物、皮膚黒化用組成物、及び頭髪若しくは皮膚用外用剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導系を用いることにより、メラノサイトの発生、分化、増殖及びメラニン合成の全てを試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で再現できることを見出した。さらに本誘導系をスクリーニング系として用いることにより、コンブ属及びワカメ属から選択される１種又は２種以上の海藻の抽出物がメラノサイトの分化を促進する優れた効果を有することを見出し、本願発明を完成するに至った。
すなわち、本願発明は、以下を包含する。
（１）コンブ属及びワカメ属から選択される１種又は２種以上の海藻の抽出物を含有することを特徴とする、メラノサイト分化誘導促進剤。
（２）コンブ属の海藻が、ガゴメコンブ、オニコンブ、ホソメコンブ及びナガコンブであることを特徴とする、（１）のメラノサイト分化誘導促進剤。
（３）ワカメ属の海藻が、ワカメである（１）又は（２）のメラノサイト分化誘導促進剤。
（４）（１）〜（３）のいずれかのメラノサイト分化誘導促進剤を含有することを特徴とする、色素異常症又は白髪の予防若しくは改善用組成物。

【発明の効果】

【0006】

本願発明のメラノサイト分化誘導促進剤によれば、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導を顕著に促進することができ、色素異常症及び白髪において、根本的に治療・予防することができる。

【発明を実施するための形態】

【0007】

本願発明に用いるコンブ属（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）の海藻は、コンブ目コンブ科に属する海藻の一種で、ガゴメコンブ（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ ｓｃｕｌｐｅｒａ）、オニコンブ（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ ｄｉａｂｏｌｉｃａ）、ホソメコンブ（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ ｒｅｌｉｇｉｏｓａ）、ナガコンブ（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ）等が挙げられる。また、ワカメ属（Ｕｎｄａｒｉａ）の海藻は、コンブ目チガイソ科に属する海藻の一種で、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）等が挙げられる。

【0008】

抽出に使用する溶媒としては、例えば、水（熱水）、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）等が好ましい。これらの溶媒は単独で、又は２種以上を混合して用いても良い。また、これら溶媒に酸やアルカリを添加してｐＨ調整を行うこともできる。０．０１〜１Ｎ、特に０．１Ｎの塩酸で抽出することが最も好ましい。

【0009】

上述の溶媒を用いて、本願発明で用いる海藻を溶媒抽出する。溶媒抽出方法は、特に限定されないが、加熱による抽出が好ましい。例えば、本願発明で用いる海藻に水を加え、９５〜１００℃における熱水抽出を行うことで、抽出物を得ることができる。あるいは、本願発明で用いる海藻乾燥物に無機酸（例えば、塩酸）を加え、４℃程度で抽出を行うことで、本願発明で用いる海藻抽出物を得ることができる。

【0010】

このようにして得られた海藻抽出物を本願発明に係るメラノサイト分化誘導促進剤の有効成分とする。本願発明のメラノサイト分化誘導促進剤は、本願発明の海藻抽出物をそのまま使用しても良く、本願発明の海藻抽出物の効果を損なわない範囲内で、外用剤、注射剤、内用剤等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、キレート剤、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、分散剤、保存料、溶解補助剤、溶剤等の成分を配合することができる。

【0011】

本願発明のメラノサイト分化誘導促進剤は、化粧品、医薬部外品、医薬品のいずれにも用いることができ、その剤型としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤等の皮膚に適用されるものや、経口用には、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤等が挙げられる。また、注射液、座薬等が挙げられる。

【0012】

本願発明に用いる海藻抽出物の配合量は、本願発明のメラノサイト分化誘導促進剤全量に対し、固形物に換算して０．００００１重量％以上、好ましくは０．０００１〜１０重量％が良い。０．００００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を越えて配合した場合、効果の増強は認められにくく不経済である。また、添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。

【実施例】

【0013】

次に本願発明を詳細に説明するため、実施例として本願発明に用いる海藻抽出物の製造例、処方例及び実験例を挙げるが、本願発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量の部とは重量部を、％とは重量％を示す。

【0014】

製造例１ ガゴメコンブの熱水抽出物
ガゴメコンブの乾燥物２０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、ガゴメコンブの熱水抽出物を３．２ｇ得た。
製造例２ ガゴメコンブの塩酸抽出物
ガゴメコンブの乾燥物２０ｇに０．１Ｎ塩酸８００ｍＬを加え、４℃で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、ガゴメコンブの塩酸抽出物を２．４ｇ得た。
製造例３ ガゴメコンブの５０％エタノール抽出物
ガゴメコンブの乾燥物２０ｇに５０％エタノール４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固することで、ガゴメコンブの５０％エタノール抽出物を２．５ｇ得た。
製造例４ ガゴメコンブのエタノール抽出物
ガゴメコンブの乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固することで、ガゴメコンブのエタノール抽出物を４．３ｇ得た。
製造例５ ガゴメコンブの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
ガゴメコンブの乾燥物２０ｇに５０％１，３−ブチレングリコール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過することで、ガゴメコンブの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物を３７０ｇ得た。
製造例６ オニコンブの熱水抽出物
オニコンブの乾燥物２０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、オニコンブの熱水抽出物を３．５ｇ得た。
製造例７ オニコンブの塩酸抽出物
オニコンブの乾燥物２０ｇに０．１Ｎ塩酸８００ｍＬを加え、４℃で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、オニコンブの塩酸抽出物を２．５ｇ得た。
製造例８ オニコンブの５０％エタノール抽出物
オニコンブの乾燥物２０ｇに５０％エタノール４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固することで、オニコンブの５０％エタノール抽出物を３．２ｇ得た。
製造例９ オニコンブのエタノール抽出物
オニコンブの乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固することで、オニコンブのエタノール抽出物を５．５ｇ得た。
製造例１０ オニコンブの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
オニコンブの乾燥物２０ｇに５０％１，３−ブチレングリコール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過することで、オニコンブの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物を３７５ｇ得た。
製造例１１ ホソメコンブの熱水抽出物
ホソメコンブの乾燥物２０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、ホソメコンブの熱水抽出物を５．２ｇ得た。
製造例１２ ホソメコンブの塩酸抽出物
ホソメコンブの乾燥物２０ｇに０．１Ｎ塩酸８００ｍＬを加え、４℃で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、ホソメコンブの塩酸抽出物を３．５ｇ得た。
製造例１３ ホソメコンブの５０％エタノール抽出物
ホソメコンブの乾燥物２０ｇに５０％エタノール４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固することで、ホソメコンブの５０％エタノール抽出物を４．４ｇ得た。
製造例１４ ホソメコンブのエタノール抽出物
ホソメコンブの乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固することで、ホソメコンブのエタノール抽出物を５．２ｇ得た。
製造例１５ ホソメコンブの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
ホソメコンブの乾燥物２０ｇに５０％１，３−ブチレングリコール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過することで、ホソメコンブの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物を３７０ｇ得た。
製造例１６ ナガコンブの熱水抽出物
ナガコンブの乾燥物２０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、ナガコンブの熱水抽出物を２．２ｇ得た。
製造例１７ ナガコンブの塩酸抽出物
ナガコンブの乾燥物２０ｇに０．１Ｎ塩酸８００ｍＬを加え、４℃で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、ナガコンブの塩酸抽出物を１．８ｇ得た。
製造例１８ ナガコンブの５０％エタノール抽出物
ナガコンブの乾燥物２０ｇに５０％エタノール４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固することで、ナガコンブの５０％エタノール抽出物を２．４ｇ得た。
製造例１９ ナガコンブのエタノール抽出物
ナガコンブの乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固することで、ナガコンブのエタノール抽出物を３．６ｇ得た。
製造例２０ ナガコンブの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
ナガコンブの乾燥物２０ｇに５０％１，３−ブチレングリコール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過することで、ナガコンブの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物を３７０ｇ得た。
製造例２１ ワカメの熱水抽出物
ワカメの乾燥物２０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、ワカメの熱水抽出物を３．２ｇ得た。
製造例２２ ワカメの塩酸抽出物
ワカメの乾燥物２０ｇに０．１Ｎ塩酸８００ｍＬを加え、４℃で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、ワカメの塩酸抽出物を２．７ｇ得た。
製造例２３ ワカメの５０％エタノール抽出物
ワカメの乾燥物２０ｇに５０％エタノール４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固することで、ワカメの５０％エタノール抽出物を３．１ｇ得た。
製造例２４ ワカメのエタノール抽出物
ワカメの乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固することで、ワカメのエタノール抽出物を３．９ｇ得た。
製造例２５ ワカメの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
ワカメの乾燥物２０ｇに５０％１，３−ブチレングリコール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過することで、ワカメの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物を３８０ｇ得た。

【0015】

比較製造例としてオキナワモズクを用いた。オキナワモズクは、ナガマツモ目ナガマツモ科オキナワモズク属に属する海藻であり、コンブ属やワカメ属ではない。
比較製造例１ オキナワモズクの熱水抽出物
オキナワモズクの乾燥物２０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、オキナワモズクの熱水抽出物を５．５ｇ得た。
比較製造例２ オキナワモズクの塩酸抽出物
オキナワモズクの乾燥物２０ｇに０．１Ｎ塩酸８００ｍＬを加え、４℃で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮及び凍結乾燥することで、オキナワモズクの塩酸抽出物を３．７ｇ得た。
比較製造例３ オキナワモズクの５０％エタノール抽出物
オキナワモズクの乾燥物２０ｇに５０％エタノール４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固することで、オキナワモズクの５０％エタノール抽出物を３．３ｇ得た。
比較製造例４ オキナワモズクのエタノール抽出物
オキナワモズクの乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固することで、オキナワモズクのエタノール抽出物を５．０ｇ得た。
比較製造例５ オキナワモズクの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
オキナワモズクの乾燥物２０ｇに５０％１，３−ブチレングリコール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出を行った。抽出後、抽出液を濾過することで、オキナワモズクの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物を３７５ｇ得た。

【0016】

処方例１ 化粧水
成分 配合量（部）
１．ガゴメコンブの熱水抽出物（製造例１） ０．１
２．１，３−ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

【0017】

処方例２ クリーム
成分 配合量（部）
１．ガゴメコンブの塩酸抽出物（製造例２） ０．０５
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール ８．５
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

【0018】

処方例３ 錠剤
成分 配合量（部）
１．オニコンブの熱水抽出物（製造例６） ５．０
２．乾燥コーンスターチ ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０．０
４．微結晶セルロース ４０．０
５．ポリビニルピロリドン ７．０
６．タルク ３．０
［製造方法］成分１〜４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

【0019】

処方例４ 飲料
成分 配合量（部）
１．オニコンブの塩酸抽出物（製造例７） ０．０５
２．ステビア ０．０５
３．リンゴ酸 ５．０
４．香料 ０．１
５．精製水にて全量を１００とする。
［製造方法］成分２及び３を成分５の一部に溶解する。次いで、成分１、４及び５を加えて混合する。

【0020】

処方例５ ヘアトニック
成分 配合量（部）
１．ガゴメコンブのエタノール抽出物（製造例４） ５．０
２．エタノール ６０．０
３．グリセリン ２．０
４．トウガラシチンキ ０．１
５．酢酸ｄｌ−α−トコフェロール ０．１
６．ｌ−メントール ０．０５
７．精製水にて全量を１００とする。
［製造方法］成分１及び成分４〜６を成分２に溶解し、成分３、７を加え、十分撹拌混合し、製品とする。

【0021】

実験例１ 本願発明に用いる海藻抽出物の幹細胞からメラノサイトへの分化誘導促進によるメラニン合成促進効果の評価
本実験例では、これまでに山根らが報告しているマウス胚性幹細胞（ＥＳ ｃｅｌｌ：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を用いた幹細胞からメラノサイトへの分化誘導系（Ｙａｍａｎｅ Ｔ．， Ｈａｙａｓｈｉ Ｓ．， Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ Ｍ．， Ｙａｍａｚａｋｉ Ｈ．， Ｋｕｎｉｓａｄａ Ｔ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， １９９９， Ｖｏｌ． ２１６， Ｉｓｓｕｅ ４−５， ｐｐ． ４５０−４５８）を用いて、本願発明に用いる海藻抽出物のメラノサイトへの分化誘導促進効果とそれに伴うメラニン合成の促進効果について評価した。なお、本実験において、これまでメラニン合成促進効果が確認されているエンドセリン−１についても同様な実験系を用いて評価した。以下に詳細を説明する。

【0022】

６ｃｍプラスチックディッシュにマイトマイシンＣ処理を施したＭＥＦ細胞（Ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を培養し、その上にマウスＥＳ細胞を１０×１０^４〜２０×１０^４個播種し、３７℃において５％ＣＯ_２インキュベーターにて前培養した。使用した培地は、ＤＭＥＭにＥＳ細胞用添加因子（Ｌ−グルタミン液、２−メルカプトエタノール液、ヌクレオシド液、非必須アミノ酸液及びＥＳＧＲＯ、いずれもｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を推奨濃度で添加した後、ＦＢＳを１５％添加したものを用いた。
次いで、ＳＴ２細胞を２４ｗｅｌｌプレート上でコンフルエントになるまで培養し、そこにＭＥＦ細胞から分離した上述の培養ＥＳ細胞を２５０〜５００個播種した。当該培養物を、分化誘導培地（α−ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清、１００ｎＭ デキサメタゾン、２０ｐＭ 塩基性線維芽細胞増殖因子、１０ｐＭ コレラトキシン及び１００ｎｇ／ｍＬ エンドセリン−３を添加したもの）で培養し、ＥＳ細胞をメラノサイトへ分化誘導した。分化誘導後２４日間で、メラノサイトが出現し、メラニン合成を行う様子が観察された。
本誘導系において、上述の分化誘導培地に各濃度（１２．５、２５、５０μｇ／ｍＬ）で本願発明に用いる海藻抽出物を継続して添加し、２４日間の分化誘導を行った。また、エンドセリン−１についても同様に実験を行った。その後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８を用いて相対細胞数を定量し、さらに、細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、２Ｎ ＮａＯＨを用いて６０℃で２時間溶解した。溶解物について４７５ｎｍの吸光度を測定し、メラニン合成量を定量した。その結果、本願発明に用いる海藻抽出物を添加することにより、メラノサイトへの分化が促進され、かつ細胞数当たりのメラニン合成量が濃度依存的に有意に増加した。

【0023】

これらの試験結果を表１に示した。本願発明に用いる海藻抽出物に、陽性対照であるエンドセリン−１と同等以上の顕著なメラノサイト分化誘導促進効果が認められた。なお、オキナワモズクの抽出物には効果がなく、特定の海藻抽出物のみに効果があることが分かった。以上より、本願発明に用いる海藻抽出物が極めて優れた幹細胞からのメラノサイト分化誘導促進効果及びメラニン合成促進効果を有することが明らかとなり、本願発明に用いる海藻抽出物のメラノサイト分化誘導促進剤及びメラニン合成促進剤としての効果が認められた。

【表1】

表中の値は、分化誘導２４日目のメラニン合成量／相対細胞数（％）（コントロール比）である。

【産業上の利用可能性】

【0024】

本願発明のメラノサイト分化誘導促進剤によれば、色素異常症及び白髪を治療、予防及び改善することができる。例えば、本願発明において見出された海藻抽出物を用いることにより、根本からの色素異常症及び白髪の解決に繋がる。本願発明で見出された海藻抽出物を経口投与、皮膚への直接注入、塗布、貼付等により導入することで、組織に存在する未分化細胞のメラノサイトへの分化を促進することができる。