特許 5945263 真核生物細胞を改変する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5945263

(24)【登録日】2016年6月3日

(45)【発行日】2016年7月5日

(54)【発明の名称】真核生物細胞を改変する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160621BHJP

   C12N 1/15 20060101ALN20160621BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20160621BHJP

   C12N 1/19 20060101ALN20160621BHJP

   A01K 67/027 20060101ALN20160621BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALN20160621BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   !C12N1/15

   !C12N5/10

   !C12N1/19

   !A01K67/027

   !C12Q1/68 A

【請求項の数】10

【外国語出願】

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2013-247817(P2013-247817)

(22)【出願日】2013年11月29日

(62)【分割の表示】特願2013-108631(P2013-108631)の分割

【原出願日】2001年10月31日

(65)【公開番号】特開2014-39567(P2014-39567A)

(43)【公開日】2014年3月6日

【審査請求日】2013年11月29日

(31)【優先権主張番号】60/244,665

(32)【優先日】2000年10月31日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】09/732,234

(32)【優先日】2000年12月7日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】アリス エヌ． エコノマイズ

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー ジェイ． マーフィー

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド エム． ヴァレンズエラ

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド フレンデウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ジョージ ディー． ヤンコポーロス

【審査官】 松岡 徹

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０８−５０４５６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第００／０４６２５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０５７８９２１５（ＵＳ，Ａ）

【文献】 ANGRAND P O，NUCLEIC ACIDS RESEARCH，１９９９年 ９月 １日，V27N17，PE16I-E16VI

【文献】 Nature Biotech.，１９９７年 ９月，Vol.15，p.859-865

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ａ０１Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

内因性非ヒト遺伝子座であって、該内因性非ヒト遺伝子座由来の内因性コード配列または遺伝子セグメントが、異なる種由来のオルソログコード配列で置換するように所望の位置で改変されており、置換された該内因性コード配列または遺伝子セグメントは、該内因性非ヒト遺伝子座に存在せず、該オルソログコード配列は、２０ｋｂよりも大きいゲノムＤＮＡフラグメント上にある、内因性非ヒト遺伝子座。

【請求項2】

前記非ヒト遺伝子座が哺乳動物遺伝子座である、請求項１に記載の内因性非ヒト遺伝子座。

【請求項3】

前記哺乳動物遺伝子座がげっ歯類遺伝子座である、請求項２に記載の内因性非ヒト遺伝子座。

【請求項4】

前記げっ歯類遺伝子座がマウス遺伝子座またはラット遺伝子座である、請求項３に記載の内因性非ヒト遺伝子座。

【請求項5】

前記オルソログコード配列がヒトである、請求項１に記載の内因性非ヒト遺伝子座。

【請求項6】

前記オルソログコード配列が少なくとも７０ｋｂである、請求項１に記載の内因性非ヒト遺伝子座。

【請求項7】

前記オルソログコード配列が少なくとも９５ｋｂである、請求項６に記載の内因性非ヒト遺伝子座。

【請求項8】

前記オルソログコード配列が少なくとも１２０ｋｂである、請求項７に記載の内因性非ヒト遺伝子座。

【請求項9】

げっ歯類遺伝子座である請求項１に記載の内因性非ヒト遺伝子座であって、前記オルソログコード配列がヒトである、内因性非ヒト遺伝子座。

【請求項10】

前記オルソログコード配列がヒトであり、かつ少なくとも７０ｋｂである、請求項９に記載の内因性非ヒト遺伝子座。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、米国特許出願番号第０９／７３２，２３４号（２０００年１２月７日出願）および米国仮特許出願番号第６０／２４４，６６５号（２０００年１０月３１日出願）に対する優先権を主張する。本出願全体で、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示内容は、その全体において、本明細書中でこの出願の参考として援用される。

【0002】

（発明の分野）
本発明の分野は、相同組換えを介して標的化し、任意の望ましい様式において、真核生物細胞における内因性遺伝子および染色体遺伝子座を改変するための、大きなＤＮＡベクターを設計し、利用するための方法である。真核生物細胞に対するこれらの大きなＤＮＡ標的ベクターは、ＬＴＶＥＣと命名され、クローン化ゲノムＤＮＡのフラグメントから誘導され、このＤＮＡのフラグメントは、真核生物細胞において相同的に標的化を行うために意図される他のアプローチによって典型的に使用されるフラグメントより大きい。本発明の分野は、さらに、真核生物細胞を検出する迅速で簡便な方法を提供し、この方法において、ＬＴＶＥＣは、正しく標的化され、そして所望の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変する。本発明の分野はまた、遺伝的改変を有する生物、生物自体を生成するためのこれらの細胞の使用およびその使用の方法を含む。

【背景技術】

【0003】

（導入部）
ＬＴＶＥＣの使用は、現行の方法を上回る実質的な利点を提供する。例えば、標的ベクターを生成するために従来使用されたＤＮＡフラグメントよりも大きなＤＮＡフラグメントから誘導されるため、ＬＴＶＥＣは、大きなゲノムＤＮＡフラグメントの利用可能なライブラリー（例えば、ＢＡＣライブラリーおよびＰＡＣライブラリー）から、現行の技術を用いて作製した標的ベクターよりも迅速かつ簡便に生成し得る。それに加えて、より大きな改変およびより大きなゲノム領域にわたる改変は、従来の技術を用いるよりも、簡便に生成し得る。

【0004】

さらに、本発明は、相同性を有する長い領域が「標的するのが困難な」遺伝子座の標的頻度を向上させるという利点を有し、また、もしあれば、これらの標的ベクターにおける同質遺伝子的なＤＮＡの利点を減少させる。

【0005】

従って、本発明は、所定の生物体の内因性遺伝子および染色体遺伝子座の全体を実質的に改変するための、迅速で、簡便な、合理化された方法を提供する。

【0006】

（発明の背景）
相同な外因性ＤＮＡと内因性染色体配列との間の相同組換えを用いる標的遺伝子は、欠失、挿入を作製し、変異を設計し、遺伝子変異を補正し、導入遺伝子を導入し、またはマウスにおける他の遺伝的改変を行うために、非常に価値ある方法であることがわかっている。現行の方法は、内因性ＤＮＡに対する相同性領域が、典型的に１０〜２０ｋｂ未満となる状態で、標準的な標的ベクターを用い、マウス胚幹（ＥＳ）細胞へと所望の遺伝的改変を導入し、その後、改変されたＥＳ細胞を、マウスの胚へと注入し、マウスの生殖細胞系列へと設計された遺伝子改変を伝える工程を包含する（Ｓｍｉｔｈｉｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３１７：２３０−２３４，１９８５；Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ，５１：５０３−５１２，１９８７；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：８９２７−８９３１，１９８９；Ｋｕｈｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：７０７−７１０，１９９１；Ｔｈｏｍａｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８４７−８５０，１９９０
；Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：７９９−８０３，１９８９；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８，１９８７；Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｃｅｌｌ，５：３１３−３２１，１９８９；ＤｅＣｈｉａｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３４５：７８−８０，１９９０；ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの出願人名の、米国特許第５，７８９，２１５号（１９９８年８月４日発行））。これらの現行の方法において、標準的な標的ベクターが、所望の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を正しく標的化され、改変された、まれなＥＳ細胞を検出することは、標的ベクター内に含まれる相同な標的配列以外の配列情報を必要とする。首尾よい標的化のためのアッセイは、標準的なサザンブロッティングまたは標的ベクター以外の配列および全体の相同性アームにわたる配列からの長鎖ＰＣＲを含み（Ｃｈｅｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：６８４−５，１９９４；ＦｏｏｒｄおよびＲｏｓｅ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ，３：Ｓ１４９−６１，１９９４；ＰｏｎｃｅおよびＭｉｃｏｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０：６２３，１９９２；米国特許第５，４３６，１４９号（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．に対して発行された））（定義を参照のこと）；従って、これらの方法を限定する大きさの考慮のため、相同性アームの大きさは、全体で１０〜２０ｋｂ未満に限定される（Ｊｏｙｎｅｒ，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２９３，１９９９）。

【0007】

従来の方法において使用されるものよりも大きな相同性アームを有する標的ベクターを使用するための能力は、非常に価値がある。例えば、このような標的ベクターを、大きなゲノム挿入物を含む入手可能なライブラリー（例えば、ＢＡＣライブラリーまたはＰＡＣライブラリー）から、現行の技術を用いて作製される標的ベクターよりも迅速かつ簡便に生成し、ここで、このようなゲノム挿入物は、使用の前に大規模に特徴づけし、切断する必要がある。それに加えて、より大きな改変およびより大きなゲノム領域にわたる改変は、従来技術を用いるよりも、より簡便に、より少ないステップで行える。さらに、相同性を有する長い領域の使用は、真核生物細胞における「標的するのが困難な」遺伝子座の標的頻度を増加させる。というのは、真核生物細胞における相同組換えの標的化は、標的ベクター内に含まれる全相同性に関連するように思われるからである（ＤｅｎｇおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１２：３３６５−７１，１９９２）。それに加えて、長い相同性アームを使用して得られる増加した標的化頻度は、これらの標的ベクターにおける同質遺伝子的なＤＮＡを使用して誘導され得る任意の潜在的な利点を減らし得る。

【0008】

非常に大きなゲノムフラグメント（例えば、ＢＡＣライブラリーにおいてクローン化されたもの）内に正確な改変を設計する問題は、細菌における相同組換えの使用を介して大部分は解決され（Ｚｈａｎｇら，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２０：１２３−８，１９９８；Ｙａｎｇら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５：８５９−６５，１９９７；Ａｎｇｒａｎｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２７：ｅ１６，１９９９；Ｍｕｙｒｅｒｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２７：１５５５−７，１９９９；Ｎａｒａｙａｎａｎら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，６：４４２−７，１９９９）、真核生物内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する相同性を有する大きな領域を含むベクターを構築することができた。しかし、一旦、作製されると、これらのベクターは、一般的に、相同組換えを介して、内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変するために有用ではない。というのは、相同性アームが、１０〜２０ｋｂより大きい場合、まれに正しい標的事象を検出することが困難であるからである（Ｊｏｙｎｅｒ，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２９３，１９９９）。結果的に、ＢＡＣゲノムフラグメントからの細菌相同組換えを使用して生成したベクターは、なおも、標的ベクターとして使用する前に広範囲に切断しなければならない（Ｈｉｌｌら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６４：１１１−３，２０００）。それゆえに、真核生物細胞における内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変するような、相同性を有する大きな領域を含む標的ベクターの使用を可能にする、
迅速かつ簡便な方法論がなお必要とされている。

【0009】

本発明に従って、本出願人は、相同組換えを介して、真核生物細胞における内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変するような、相同性を有する大きな領域を含む標的ベクターの使用を可能にする新規な方法を提供する。このような方法は、現行技術の上述のような制限を克服する。それに加えて、本発明の方法が、任意の真核生物（限定されないが、マウス、ラット、他のげっ歯類、またはヒトのような動物、ならびに大豆、トウモロコシおよび小麦のような植物を含む）の任意のゲノムＤＮＡを使用するために容易に適用されることを、当業者は容易に認識する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

（発明の要旨）
本発明に従って、本出願人は、改変した内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む真核生物細胞を作製し、スクリーニングするための、新規で、迅速で、合理化された、効率的な方法を開発した。この新規な方法は、初めて、以下を組み合わせる：
１．大きなクローン化ゲノムフラグメント内の所望の遺伝的改変を正確に設計するための細菌の相同組換えであって、これによって、真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製すること；
２．これらのＬＴＶＥＣを真核生物細胞に直接導入し、これらの細胞における目的の内因性染色体遺伝子座を改変すること；および
３．まれな真核生物細胞を決定するための分析であって、ここで、標的対立遺伝子は、所望のように改変され、標的配列以外の配列情報を必要としない親の対立遺伝子の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）のためのアッセイ（例えば、定量的ＰＣＲ）を含むこと。

【0011】

本発明の好ましい実施形態は、真核生物細胞における内因性遺伝子または染色体遺伝子座を遺伝的に改変するための方法であって、以下の工程を包含する：ａ）目的のＤＮＡ配列を含む大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る工程；ｂ）細菌相同組換えを用いて、（ａ）の大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変し、真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製する工程；ｃ）（ｂ）のＬＴＶＥＣを真核生物細胞へと導入して、細胞における内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変する工程；およびｄ）定量的アッセイを用いて、（ｃ）の真核生物細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出し、内因性遺伝子または染色体遺伝子座が遺伝的に改変されている真核生物細胞を同定する工程。

【0012】

本発明の別の実施形態は、内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または制御要素の欠失；コード配列、遺伝子セグメント、または制御要素の改変；新規なコード配列、遺伝子セグメント、または制御要素の挿入；条件的な対立遺伝子の作製；あるいは１つの種からのコード配列または遺伝子セグメントと、異なる種からの相同なコード配列またはオルソロガスなコード配列との交換、を含む方法である。

【0013】

本発明の代替の実施形態は、コード配列、遺伝子セグメント、または制御要素の改変が、置換、付加、または融合を含み、この融合は、エピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む、方法である。

【0014】

本発明のなお別の実施形態は、定量的アッセイが、定量的ＰＣＲ、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、または固定化されたプローブ（Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標））への定量的ハイブリダイゼーションまたはＭＭＰアッセイ（登録商標）を含み、ここで、定量的ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分子ビーコンまたは
Ｅｃｌｉｐｓｅ^ＴＭプローブ技術を使用する定量的ＰＣＲを含む、方法である。

【0015】

本発明の別の好ましい実施形態は、真核生物細胞が、哺乳動物の胚幹細胞であり、詳細には、この胚幹細胞がマウス、ラット、または他のげっ歯類の胚幹細胞である、方法である。

【0016】

本発明の別の好ましい実施形態は、内因性遺伝子または染色体遺伝子座が、哺乳動物の遺伝子または染色体遺伝子座、好ましくは、ヒトの遺伝子または染色体遺伝子座であるか、あるいはマウス、ラット、または他のげっ歯類の遺伝子または染色体遺伝子座である、方法である。

【0017】

さらなる好ましい実施形態は、ＬＴＶＥＣが、２０ｋｂよりも大きなＤＮＡフラグメントを収容することができ、特に、１００ｋｂよりも大きなＤＮＡフラグメントを収容することができる実施形態である。

【0018】

別の好ましい実施形態は、本発明の方法によって生成される遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座である。

【0019】

なお別の好ましい実施形態は、本発明の方法によって生成される遺伝的に改変された真核生物細胞である。

【0020】

本発明の好ましい実施形態は、本発明の方法によって生成される遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む非ヒト生物である。

【0021】

好ましいのはまた、本発明の方法によって生成される遺伝的に改変された真核生物細胞または胚幹細胞から生成される非ヒト生物である。

【0022】

好ましい実施形態は、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む非ヒト生物であり、これは、以下の工程を包含する方法によって生成される：ａ）目的のＤＮＡ配列を含む大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る工程；ｂ）細菌の相同組換えを用いて、（ａ）の大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変し、胚幹細胞に使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製する工程；ｃ）（ｂ）のＬＴＶＥＣを胚幹細胞へと導入して、細胞における内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変する工程；ｄ）定量的アッセイを用いて、（ｃ）の胚幹細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）の改変を検出し、内因性遺伝子または染色体遺伝子座が遺伝的に改変されている胚幹細胞を同定する工程；ｅ）（ｄ）の胚幹細胞を、胚盤胞へと導入する工程；ならびにｆ）（ｅ）の胚盤胞を、妊娠のための代理母へと導入する工程。

【0023】

本発明のさらなる好ましい実施形態は、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む非ヒト生物であり、これは、以下の工程を包含する方法によって生成される：ａ）目的のＤＮＡ配列を含む大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る工程；ｂ）細菌の相同組換えを用いて、（ａ）の大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変し、真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製する工程；ｃ）（ｂ）のＬＴＶＥＣを真核生物細胞に導入して、細胞における内因性遺伝子または染色体遺伝子座を遺伝的に改変する工程；ｄ）定量的アッセイを用いて、（ｃ）の真核生物細胞の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出し、内因性遺伝子または染色体遺伝子座が、遺伝的に改変されている真核生物細胞を同定する工程；ｅ）（ｄ）の真核生物細胞から核を取り除く工程；ｆ）（ｅ）の核を卵母細胞へと導入する工程；ならびに、ｇ）（ｆ）の卵母細胞を、妊娠のための代理母へと導入する工程。

【0024】

なお別の好ましい実施形態は、一般的に、改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む非ヒト生物であり、これらは、以下の工程を包含する方法によって生成される：ａ）目的のＤＮＡ配列を含む大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る工程；ｂ）細菌の相同組換えを使用して、（ａ）の大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変し、真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製する工程；ｃ）（ｂ）のＬＴＶＥＣを真核生物細胞に導入して、細胞における内因性遺伝子または染色体遺伝子座を遺伝的に改変する工程；ｄ）定量的アッセイを用いて、（ｃ）の真核生物細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出し、内因性遺伝子または染色体遺伝子座が遺伝的に改変されている真核生物細胞を同定する工程；ｅ）（ｄ）の真核生物細胞を別の真核生物細胞に融合する工程；ｆ）（ｅ）の融合された真核生物細胞を、妊娠のための代理母へと導入する工程。

【0025】

好ましい実施形態において、非ヒト生物は、マウス、ラット、または他のげっ歯類であり；胚盤胞は、マウス、ラット、または他のげっ歯の胚盤胞であり；卵母細胞は、マウス、ラット、または他のげっ歯の卵母細胞であり；そして代理は母、マウス、ラット、または他のげっ歯類である。

【0026】

別の好ましい実施形態は、胚幹細胞が、哺乳動物の胚幹細胞であり、好ましくは、マウス、ラット、または他のげっ歯類の胚幹細胞である。

【0027】

さらなる好ましい実施形態は、本発明の遺伝子的に改変された真核生物細胞の、非ヒト生物の産生のための使用、および特に、本発明の遺伝子的に改変された胚性幹細胞の、非ヒト生物の産生のための使用である。

【0028】

本発明の好ましい実施形態は、マウス胚性幹細胞において、目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を、遺伝子的に改変するための方法であり、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、２０ｋｂより大きな、クローニングされた大きなゲノムフラグメントを得る工程であって、ここで、この大きなクローニングされたＤＮＡフラグメントは、内因性遺伝子または染色体遺伝子座に相同性である、工程；ｂ）細菌相同組換えを使用して、（ａ）の大きなクローニングされたゲノムフラグメントを遺伝子的に改変して、マウス胚性幹細胞において使用するための大きな標的化ベクターを作製する工程であって、ここで、この遺伝子的な改変は、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失である、工程；ｃ）（ｂ）の大きな標的化ベクターをマウス胚性幹細胞に導入して、この細胞において内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変する工程；およびｄ）定量アッセイを使用して、（ｃ）のマウス胚性幹細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出し、内因性遺伝子または染色体遺伝子座が遺伝子的に改変されたマウス胚性幹細胞を同定する工程であって、ここで、この定量アッセイは、定量ＰＣＲである、工程。この方法によって産生された、遺伝子的に改変されたマウス胚性幹細胞；この方法によって産生された、遺伝子的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含むマウス；および遺伝子的に改変されたマウス胚性幹細胞から産生されたマウスもまた、好ましい。

【0029】

別の好ましい実施形態は、遺伝子的に改変された、目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含むマウスであり、このマウスは、以下の工程を包含する方法によって産生される：ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、２０ｋｂより大きな、クローニングされた大きなゲノムフラグメントを得る工程であって、ここで、この大きなクローニングされたＤＮＡフラグメントは、内因性遺伝子または染色体遺伝子座に相同性である、工程；ｂ）細菌相同組換えを使用して、（ａ）の大きなクローニングされたゲノムフラグメントを遺伝子的に改変して、マウス胚性幹細胞において使用するための大きな標的化ベクターを作製する工程であって、ここで、この遺伝子的な改変は、コード配列、遺伝子セグメント、または調節
エレメントの欠失である、工程；ｃ）（ｂ）の大きな標的化ベクターをマウス胚性幹細胞に導入して、この細胞において内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変する工程；およびｄ）定量アッセイを使用して、（ｃ）のマウス胚性幹細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出し、内因性遺伝子または染色体遺伝子座が遺伝子的に改変されたマウス胚性幹細胞を同定する工程であって、ここで、この定量アッセイは、定量ＰＣＲである、工程；ｅ）（ｄ）のマウス胚性幹細胞を、胚盤胞に導入する工程；ならびにｆ）（ｅ）の胚盤胞を、妊娠のための代理母に導入する工程。

【0030】

マウスの産生のための、上記遺伝子的に改変されたマウス胚性幹細胞の使用もまた、好ましい。

【0031】

約１〜５μｇの大きな標的化ベクターＤＮＡが、約１×１０^７の真核生物細胞に導入される方法もまた、好ましい。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１） 真核生物細胞中の目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を遺伝的に改変するための方法であって、以下：
ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る、工程；
ｂ）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、該真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を産生するために、細菌相同性組換えを使用する、工程；
ｃ）（ｂ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程；および
ｄ）（ｃ）の該真核生物細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変された真核生物細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する、工程、
を包含する、方法。
（項目２） 項目１に記載の方法であって、ＤＮＡ配列を含む、上記大きなクローン化遺伝子フラグメントが、目的の上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対して相同性である、方法。
（項目３） 項目１に記載の方法であって、上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失；コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更；新しいコード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入；条件付き対立遺伝子の作製；あるいは１つの種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、同一種または異なる種由来の相同性コード配列または定向進化配列との置換を含む、方法。
（項目４） 項目３に記載の方法であって、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの上記変更が、置換、付加、または融合を含む、方法。
（項目５） 項目４に記載の方法であって、上記融合が、エピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む、方法。
（項目６） 項目１に記載の方法であって、上記定量的アッセイが、定量的ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、競合的ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化したプローブもしくはＩｎｖａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）に対する定量的ハイブリダイゼーション、またはＭＭＰアッセイ（登録商標）を含む、方法。
（項目７） 上記定量的ＰＣＲが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｅａｃｏｎ、またはＥｃｌｉｐｓｅ^ＴＭプローブ技術を含む、項目６に記載の方法。
（項目８） 上記真核生物細胞が、哺乳動物の胚幹細胞である、項目１に記載の方法。
（項目９） 上記胚幹細胞が、マウス、ラット、または他のげっ歯類の胚幹細胞である、項目８に記載の方法。
（項目１０） 上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座が、哺乳動物の遺伝子または
染色体遺伝子座である、項目１に記載の方法。
（項目１１） 上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座が、ヒトの遺伝子または染色体遺伝子座である、項目１０に記載の方法。
（項目１２） 上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座が、マウス、ラット、または他のげっ歯類の遺伝子または染色体遺伝子座である、項目１０に記載の方法。
（項目１３） 上記ＬＴＶＥＣが、２０ｋｂより大きなＤＮＡフラグメントに適応し得る、項目１に記載の方法。
（項目１４） 上記ＬＴＶＥＣが、１００ｋｂより大きなＤＮＡフラグメントに適応し得る、項目１３に記載の方法。
（項目１５） マウス胚幹細胞中の目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を遺伝的に改変する方法であって、以下：
ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、２０ｋｂより大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る工程であって、ここで、該大きなクローン化ＤＮＡフラグメントが、該内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対して相同性である、工程；
ｂ）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、該マウス胚幹細胞において使用するための大きな標的ベクターを産生するために、細菌相同性組換えを使用する工程であって、ここで、該遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失である、工程；
ｃ）（ｂ）の該大きな標的ベクターを該マウス胚幹細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の該マウス胚幹細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する工程であって、該定量的アッセイが、定量的ＰＣＲである、工程、
を包含する、方法。
（項目１６） 項目１または１５のいずれか１項に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座。
（項目１７） 項目１６に記載の遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座であって、上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失；コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更；新しいコード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入；条件付き対立遺伝子の作製；あるいは１つの種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、同一種または異なる種由来の相同性コード配列または定向進化配列との置換を含む、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座。
（項目１８） コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの上記変更が、置換、付加、または融合を含む、項目１７に記載の遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座。
（項目１９） 上記融合が、エピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む、項目１８に記載の遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座。
（項目２０） 項目１に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された真核生物。
（項目２１） 項目１５に記載された方法によって産生された、遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞。
（項目２２） 項目２０に記載の遺伝的に改変された真核生物細胞であって、上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失；コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更；新しいコード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入；条件付き対立遺伝子の作製；あるいは１つの種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、同一種または異なる種由来の相同性コード配列または定向進化配列との置換を含む、遺伝的に改変された真核生物細胞。
（項目２３） コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの上記変更が、置換、付加、または融合を含む、項目２２に記載の遺伝的に改変された真核生物細胞細胞。
（項目２４） 上記融合が、エピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む、項目２３に記載の遺伝的に改変された真核生物細胞。
（項目２５） 項目１に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、非ヒト生物。
（項目２６） 項目１５に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、マウス。
（項目２７） 項目２０、２２、２３、または２４のいずれか１項に記載の遺伝的に改変された真核生物細胞から産生された、非ヒト生物。
（項目２８） 項目２１に記載の遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞から産生された、マウス。
（項目２９） 項目１に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された胚幹細胞。
（項目３０） 項目２９に記載の遺伝的に改変された胚幹細胞であって、上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失；コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更；新しいコード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入；条件付き対立遺伝子の作製；あるいは１つの種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、異なる種由来の相同性コード配列または定向進化配列との置換を含む、遺伝的に改変された胚幹細胞。
（項目３１） コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの上記変更が、置換、付加、または融合を含む、項目３０に記載の遺伝的に改変された胚幹細胞。
（項目３２） 上記融合が、エピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む、項目３１に記載の遺伝的に改変された胚幹細胞。
（項目３３） 遺伝的に改変された、目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下の工程：
ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る、工程；
ｂ）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、胚幹細胞において使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を産生するために、細菌相同性組換えを使用する、工程；
ｃ）（ｂ）の該ＬＴＶＥＣを該胚幹細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程；
ｄ）（ｃ）の該胚幹細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変された胚幹細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する、工程；
ｅ）（ｄ）の該胚幹細胞を胚盤胞に導入する、工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の該胚盤胞を、妊娠のために代理母に導入する、工程、
を包含する、方法によって産生される、非ヒト生物。
（項目３４） 遺伝的に改変された、目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、マウスであって、該マウスは、以下の工程：
ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、２０ｋｂより大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る工程であって、ここで、該大きなクローン化ＤＮＡフラグメントが、該内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対して相同性である、工程；
ｂ）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、該マウス胚幹細胞において使用するための大きな標的ベクターを産生するために、細菌相同性組換えを使用する工程であって、ここで、該遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失である、工程；
ｃ）（ｂ）の該大きな標的ベクターを該マウス胚幹細胞に導入して、該細胞中の該内因
性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程；
ｄ）（ｃ）の該マウス胚幹細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する工程であって、該定量的アッセイが、定量的ＰＣＲである、工程；
ｅ）（ｄ）の該マウス胚幹細胞を胚盤胞に導入する、工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の該胚盤胞を、妊娠のために代理母に導入する、工程、
を包含する、方法によって産生される、マウス。
（項目３５） 遺伝的に改変された、内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下の工程：
ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る、工程；
ｂ）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を産生するために、細菌相同性組換えを使用する、工程；
ｃ）（ｂ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程；
ｄ）（ｃ）の該真核生物細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変された真核生物細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する、工程；
ｅ）（ｄ）の該真核生物細胞から核を取り除く、工程；
ｆ）（ｅ）の該核を卵母細胞に導入する、工程；ならびに
ｇ）（ｆ）の該卵母細胞を、妊娠のために代理母に導入する、工程
を包含する、方法によって産生される、非ヒト生物。
（項目３６） 遺伝的に改変された、内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下の工程：
ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る、工程；
ｂ）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を産生するために、細菌相同性組換えを使用する、工程；
ｃ）（ｂ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程；
ｄ）（ｃ）の該真核生物細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変された真核生物細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する、工程；
ｅ）（ｄ）の該真核生物細胞を別の真核生物細胞と融合する、工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の融合した該真核生物細胞を妊娠のために代理母に導入する、工程、
を包含する、方法によって産生される、非ヒト生物。
（項目３７） ＤＮＡ配列を含む、上記大きなクローン化ゲノムフラグメントが、目的の上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対して相同性である、項目３３、３５、または３６のいずれか１項に記載の非ヒト生物。
（項目３８） 上記非ヒト生物が、マウス、ラット、または他のゲッ歯類である、項目２５、３３、３５、または３６のいずれか１項に記載の非ヒト生物。
（項目３９） 上記胚盤胞が、マウス、ラット、または他のゲッ歯類の胚盤胞である、項目３３に記載の非ヒト生物。
（項目４０） 上記卵母細胞が、マウス、ラット、または他のゲッ歯類の卵母細胞である、項目３５に記載の非ヒト生物。
（項目４１） 上記代理母が、マウス、ラット、または他のゲッ歯類である、項目３３、３５、または３６のいずれか１項に記載の非ヒト生物。
（項目４２） 上記胚幹細胞が、哺乳動物の胚幹細胞である、項目３３に記載の非ヒト生物。
（項目４３） 上記哺乳動物の胚幹細胞が、マウス、ラット、または他のゲッ歯類の胚幹細胞である、項目４２に記載の非ヒト生物。
（項目４４） 項目３３、３５、または３６のいずれか１項に記載の非ヒト生物であって、上記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失；コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更；新しいコード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入；条件付き対立遺伝子の作製；あるいは１つの種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、同一種または異なる種由来の相同性コード配列または定向進化配列との置換を含む、非ヒト生物。
（項目４５） コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの上記変更が、置換、付加、または融合を含む、項目４４に記載の非ヒト生物。
（項目４６） 上記融合が、エピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む、項目４５に記載の非ヒト生物。
（項目４７） 項目３３、３５、または３６のいずれか１項に記載の非ヒト生物であって、上記定量的アッセイが、定量的ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、競合的ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化したプローブもしくはＩｎｖａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）に対する定量的ハイブリダイゼーション、またはＭＭＰアッセイ（登録商標）を含む、非ヒト生物。
（項目４８） 上記定量的ＰＣＲが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、またはＥｃｌｉｐｓｅ^ＴＭプローブ技術を含む、項目４７に記載の非ヒト生物。
（項目４９） 非ヒト生物の産生のための、項目２０に記載の遺伝的に改変された真核生物細胞の使用。
（項目５０） 上記マウスの産生のための、項目２１に記載の遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞の使用。
（項目５１） 非ヒト生物の産生のための、項目２９に記載の遺伝的に改変された胚幹細胞の使用。
（項目５２） （ｃ）の上記大きな標的ベクターの約１〜５μｇが、約１×１０^７細胞に導入される、項目１または１５に記載の方法。
（項目５３） （ｃ）の上記大きな標的ベクターの約１〜５μｇが、約１×１０^７細胞に導入される、項目３４に記載のマウス。
（項目５４） （ｃ）の上記大きな標的ベクターの約１〜５μｇが、約１×１０^７細胞に導入される、項目３３、３５、または３６に記載の非ヒト生物。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】図１は、細菌相同組換えを使用する、代表的なＬＴＶＥＣの産生の概略図である。（ｈｂ１＝相同ボックス１；ｈｂ２＝相同ボックス２；ＲＥ＝制限酵素部位）。

【図2】図２は、マウスＯＣＲ１０に対するドナーフラグメントおよびＬＴＶＥＣの概略図である。（ｈｂ１＝相同ボックス１；ｌａｃＺ＝β−ガラクトシダーゼＯＲＦ；ＳＶ４０ポリＡ＝ポリアデニル化部位およびシグナルを含む、シミアンウイルス４０由来のＤＮＡフラグメント；ＰＧＫｐ＝マウスホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター；ＥＭ７＝細菌プロモーター；ｎｅｏ＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ；ＰＧＫポリＡ＝ＰＧＫ遺伝子由来であり、そしてポリアデニル化部位およびシグナルを含む、３’非翻訳領域；ｈｂ２＝相同ボックス２）。

【図3A】図３Ａ〜３Ｄは、ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣを使用して標的化されたＥＳ細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために、定量ＰＣＲアッセイにおいて使用される、マウスＯＣＲ１０ ｃＤＮＡ、相同ボックス１（ｈｂ１）、相同ボックス２（ｈｂ２）、ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびプライマーの配列である。ｈｂ１：塩基対１〜２１１ｈｂ２：塩基対１５８６〜１８０１ｍＯＣＲ１０エキソン３由来のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび対応するＰＣＲプライマーセット：ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：ヌクレオチド４１３〜４３９（上の鎖）プライマーｅｘ３−５’：ヌクレオチド３９０〜４１０（上の鎖）プライマーｅｘ３−３’：ヌクレオチド４４５〜４６１（下の鎖）ｍＯＣＲ１０エキソン４由来のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび対応するＰＣＲプライマーセット：ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：ヌクレオチド６０８〜６３９（上の鎖）プライマーｅｘ４−５’：ヌクレオチド５８６〜６０５（上の鎖）プライマーｅｘ４−３’：ヌクレオチド６４２〜６６２（下の鎖）

【図3B】図３Ａ〜３Ｄは、ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣを使用して標的化されたＥＳ細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために、定量ＰＣＲアッセイにおいて使用される、マウスＯＣＲ１０ ｃＤＮＡ、相同ボックス１（ｈｂ１）、相同ボックス２（ｈｂ２）、ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびプライマーの配列である。

【図3C】図３Ａ〜３Ｄは、ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣを使用して標的化されたＥＳ細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために、定量ＰＣＲアッセイにおいて使用される、マウスＯＣＲ１０ ｃＤＮＡ、相同ボックス１（ｈｂ１）、相同ボックス２（ｈｂ２）、ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびプライマーの配列である。

【図3D】図３Ａ〜３Ｄは、ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣを使用して標的化されたＥＳ細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために、定量ＰＣＲアッセイにおいて使用される、マウスＯＣＲ１０ ｃＤＮＡ、相同ボックス１（ｈｂ１）、相同ボックス２（ｈｂ２）、ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびプライマーの配列である。

【発明を実施するための形態】

【0033】

（定義）
「標的化ベクター」とは、所望の遺伝子的改変に隣接する内因性染色体核酸配列に「相同な」配列を含む、ＤＮＡ構築物である。この隣接相同配列は、「相同性アーム」と称され、この相同アームと対応する内因性配列との間に存在する相同性を利用して、標的化ベクターを、ゲノム内の特定の染色体遺伝子座に指向し、そして所望の遺伝子改変を、「相同組換え」と称されるプロセスによって導入する。

【0034】

「相同」とは、同一であるか、または互いにハイブリダイズし得るかもしくは分子間交換を起こすために十分に類似しているかのいずれかである、２つ以上の核酸配列を意味する。

【0035】

「遺伝子標的化」とは、標的化ベクターを使用する相同組換えを介する、内因性配列への挿入、内因性配列の欠失、または置換による、内因性染色体遺伝子座の改変である。

【0036】

「遺伝子ノックアウト」とは、染色体遺伝子座にコードされる遺伝情報の破壊から生じる、遺伝子改変である。

【0037】

「遺伝子ノックイン」とは、染色体遺伝子座においてコードされる遺伝情報の、異なるＤＮＡ配列での置換から生じる、遺伝子改変である。

【0038】

「ノックアウト生物」とは、かなりの割合の生物の細胞が遺伝子ノックアウトを保有する、生物である。

【0039】

「ノックイン生物」とは、かなりの割合の生物の細胞が遺伝子ノックインを保有する、生物である。

【0040】

「マーカー」または「選択マーカー」とは、集団における大部分の処理された細胞から
マーカーを発現する稀なトランスフェクトされた細胞の単離を可能にする、選択マーカーである。このようなマーカーの遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、またはＧＦＰのような蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0041】

「ＥＳ細胞」とは、胚性幹細胞である。この細胞は、通常、胚盤胞段階の胚の内細胞塊由来である。

【0042】

「ＥＳ細胞クローン」とは、ＤＮＡの導入および引き続く選択に続いて、ＥＳ細胞集団の単一の細胞に由来する、細胞の部分集団である。

【0043】

「隣接ＤＮＡ」とは、特定の参照点と共線であり、そしてこの参照点に隣接する、ＤＮＡのセグメントである。

【0044】

「ＬＴＶＥＣ」とは、真核生物細胞において相同標的化を実施することが意図される他のアプローチによって代表的に使用されるものより大きな、クローニングされたゲノムＤＮＡのフラグメント由来の、真核生物細胞に対する大きな標的化ベクターである。

【0045】

「非ヒト生物」とは、通常は公共によってヒトとして認容されない生物である。

【0046】

「対立遺伝子の改変」（ＭＯＡ）とは、遺伝子における１つの対立遺伝子、またはゲノムにおける染色体遺伝子座（単数または複数）の正確なＤＮＡ配列の改変をいう。この対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）としては、１ヌクレオチド程度に小さな欠失、置換、または挿入、あるいは目的の遺伝子または染色体遺伝子座にまたがる何キロ塩基もの欠失、ならびにこれらの両極端の間の全ての任意の可能な改変が挙げられるが、これらに限定されない。

【0047】

「定向進化」配列とは、別の種におけるその配列の機能的等価物である１つの種由来の配列をいう。

【0048】

以下に提示される説明および実施例は、本発明を例示するために提供される。当業者は、これらの実施例が、本発明の例示のみによって提供されるのであり、限定の目的で含まれるのではないことを認識する。

【0049】

（発明の詳細な説明）
本出願人らは、改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む真核生物細胞を作製およびスクリーニングするための、新規な、迅速な、能率的な、そして効率的な方法を開発した。これらの細胞において、改変は、遺伝子のノックアウト、ノックイン、点変異、または大きなゲノムの挿入もしくは欠失あるいは他の改変であり得る。非限定的な例として、これらの細胞は、変更され、欠失され、そして／または挿入された遺伝子の機能を決定する目的で、ノックアウト生物またはノックイン生物、および特に、ノックアウトマウスまたはノックインマウスを、作製するために有用な胚性幹細胞であり得る。

【0050】

本明細書中に記載される新規方法は、初めて、以下を組み合わせる：
１．所望の遺伝子改変を、大きなクローニングされたゲノムＤＮＡフラグメントにおいて正確に操作し、これによって、真核生物細胞において使用するための大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製するための、細菌相同組換え；
２．これらのＬＴＶＥＣを真核生物細胞に直接導入して、これらの細胞において目的の対応する内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変すること；ならびに
３．標的された対立遺伝子が所望のように改変された、希少な真核生物細胞を決定する
ための分析であって、親対立遺伝子の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）のための定量アッセイを包含する、分析。

【0051】

真核生物細胞における首尾よい相同組換えを検出するための以前の方法は、ＬＴＶＥＣに存在する長い相同性アームに起因して、本出願人らの発明のＬＴＶＥＣと組み合わせて利用され得ないことが、強調されるべきである。ＬＴＶＥＣを利用して、相同組換えを介して真核生物細胞における内因性遺伝子または染色体遺伝子座を故意に改変することは、標的された対立遺伝子が所望のように改変された希少な真核生物細胞を決定するためのアッセイの新規な適用によって、可能となり、このようなアッセイは、例えば、対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）に対する定量ＰＣＲまたは他の適切な定量アッセイを使用することによる、親対立遺伝子のＭＯＡのための定量アッセイを包含する。

【0052】

既存の方法において使用されるものより大きな相同性アームを有する標的化ベクターを利用し得ることは、以下の理由により、特に価値がある：
１．先行技術を使用して作製される標的化ベクターより迅速に、かつ好都合に、標的化ベクターが、大きなゲノム挿入物を含む利用可能なライブラリー（例えば、ＢＡＣライブラリーまたはＰＡＣライブラリー）から生成され、ここで、このゲノム挿入物は、使用の前に広範囲にわたって特徴付けられ、そして「トリミング」されなければならない（以下に詳細に説明される）。さらに、目的の遺伝子座についての最小の配列情報が知られる必要がある。すなわち、相同性ボックスを作製するため（以下に詳細に記載される）、およびＭＯＡについての定量アッセイにおいて使用され得るプローブを作製するため（以下に詳細に記載される）に必要とされる、約８０〜１００ヌクレオチドを知ることのみが、必要である。

【0053】

２．より大きな改変、およびより大きなゲノム領域にまたがる改変が、以前の技術を使用するより好都合に、そしてより少ない工程で生成される。例えば、本発明の方法は、従来のプラスミドに基づく標的化ベクターによっては、その大きさの制限に起因して適応され得ない、大きな遺伝子座の正確な改変を可能にする。本発明の方法はまた、１つの工程で複数の点においての、任意の所与の遺伝子座の改変（例えば、マルチエキソン遺伝子の異なるエキソンにおける、特定の変異の導入）を可能にして、複数の標的化ベクターを操作することの必要性、ならびにＥＳ細胞における相同組換えのための何回もの標的化およびスクリーニングを実施する必要性を、軽減する。

【0054】

３．長い相同性の領域（長い相同性アーム）の使用により、真核生物細胞における「標的化しにくい」遺伝子座の標的化頻度が上昇し、このことは、真核生物細胞における相同組換えの標的化が標的化ベクターに含まれる全相同性に関連するようであるという、以前の知見と一致する。

【0055】

４．長い相同性アームを使用して得られる、上昇した標的化頻度は、これらの標的化ベクターにおいて同系のＤＮＡを使用することによる利点（存在する場合）を明らかに減少させる。

【0056】

５．相同組換えに関して真核生物細胞をスクリーニングするための定量ＭＯＡアッセイの適用は、標的化ベクターとしてのＬＴＶＥＣの使用（上で概説した利点）を可能にするのみでなく、正しく改変された真核生物細胞の同定のための時間を、代表的な数日間から数時間へと減少させる。さらに、定量ＭＯＡの適用は、改変されている内因性遺伝子または染色体遺伝子座の外側に位置するプローブの使用を必要とせず、従って、改変された遺伝子または遺伝子座に隣接する配列を知る必要性を除く。このことは、過去においてスクリーニングが実施された様式における顕著な改善であり、そしてこの様式を、真核生物細胞における相同組換えをスクリーニングするための、さらに労力非集約的な、そしてさら
に費用効果的なアプローチにする。

【0057】

（方法）
本明細書中に記載される、ＤＮＡベクターを構築するために使用される技術の多くは、当業者に周知の標準的な分子生物学技術である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、第１、２、および３巻、１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）。全てのＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーおよびＴａｑ Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、標準的な技術によってなされる。

【0058】

工程１．目的の遺伝子または染色体遺伝子座を含む、大きなゲノムＤＮＡクローンを得る。

【0059】

目的の遺伝子または遺伝子座は、特定の基準（例えば、詳細な構造データまたは機能的データ）に基づいて選択され得るか、またはこのような詳細な情報の非存在下で選択され得る。なぜなら、潜在的な遺伝子または遺伝子フラグメントは、種々のゲノム配列決定計画の努力によって予測されるからである。

【0060】

重要なことには、本発明の方法を適用してＬＴＶＥＣを生成するために、目的の遺伝子の完全な配列および遺伝子構造を知ることは、必ずしも必要ではないことが注目されるべきである。実際に、必要とされる唯一の配列情報は、目的のゲノムクローンを得るように、そしてＬＴＶＥＣを作製する際に使用される相同性ボックスを作製するように（以下に詳細に記載される）、そして定量ＭＯＡアッセイにおいて使用するためのプローブを作製するように、約８０〜１００ヌクレオチドである。

【0061】

一旦、目的の遺伝子または遺伝子座が選択されると、この遺伝子または遺伝子座を含む大きなゲノムクローンが得られる。このクローンは、標準ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技術による適切なＤＮＡライブラリー（例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣまたはコスミド）のスクリーニングが挙げられるがこれらに限定されない、いくつかの方法のうちの任意の１つにおいて、あるいは当業者に公知である、他の任意の方法によって、得られ得る。

【0062】

（工程２．改変カセットへのホモロジーボックス１および２の付加ならびにＬＴＶＥＣの産生。）
ホモロジー（相同性）ボックスは、大きなクローン化ゲノムフラグメント（図１）からＬＴＶＥＣを産生するのに用いられる細菌相同組換えの部位をマークする。ホモロジーボックスはＤＮＡの短いセグメント（一般に二重鎖で、長さが少なくとも４０ヌクレオチド）であり、大きなクローン化ゲノムフラグメント内の、「改変される領域」に隣接する領域と相同である。このホモロジーボックスが改変カセットに付加され、その結果、細菌内での相同組換えに続いて、この改変カセットが、改変される領域を置き換える（図１）。細菌相同組換えを用いて標的化ベクターを作製する技術は、種々の系（Ｙａｎｇら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５：８５９−６５，１９９７；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２７：１５５５−７，１９９９；Ａｎｇｒａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２７：ｅ１６，１９９９；Ｎａｒａｙａｎａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，６：４４２−７，１９９９；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７：５９７８−８３，２０００）において行われ得る。現在用い
られる好ましい技術の一例は、ＥＴクローニング（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２０：１２３−８，１９９８；Ｎａｒａｙａｎａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，６：４４２−７，１９９９）およびこの技術の変法（Ｙｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７：５９７８−８３，２０００）である。ＥＴとは、相同組換え反応を行うｒｅｃＥタンパク質（ＨａｌｌおよびＫｏｌｏｄｎｅｒ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９１：３２０５−９，１９９４）およびｒｅｃＴタンパク質（Ｋｕｓａｎｏら、Ｇｅｎｅ，１３８：１７−２５，１９９４）をいう。ｒｅｃＥは直鎖状の二重鎖ＤＮＡ（本質的に、以下で記述される、ドナーＤＮＡフラグメント）のうち１本の鎖を５’→３’で切り取るエキソヌクレアーゼであり、従って、３’一本鎖オーバーハングを直鎖状の二重鎖フラグメントに残す。この一本鎖オーバーハングは、ｒｅｃＴタンパク質によってコーティングされ、このｒｅｃＴタンパク質は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）結合活性を有する（ＫｏｖａｌｌおよびＭａｔｔｈｅｗｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：１８２４−７，１９９７）。ＥＴクローニングは、ｒｅｃＥおよびｒｅｃＴのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子産物を過渡的に発現するＥ．ｃｏｌｉ（ＨａｌｌおよびＫｏｌｏｄｎｅｒ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９１：３２０５−９，１９９４；Ｃｌａｒｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ，４９：４５３−６２，１９８４；ＮｏｉｒｏｔおよびＫｏｌｏｄｎｅｒ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７３：１２２７４−８０，１９９８；Ｔｈｒｅｓｈｅｒら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２５４：３６４−７１，１９９５；Ｋｏｌｏｄｎｅｒら、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１１：２３−３０，１９９４；Ｈａｌｌら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７５：２７７−８７，１９９３）およびバクテリオファージラムダ（λ）タンパク質λｇａｍ（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７３：５８０８−２１，１９９１；Ｐｏｔｅｅｔｅら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７０：２０１２−２１，１９８８）を用いて行われる。このλｇａｍタンパク質は、ｒｅｃＢＣエキソヌクレアーゼ系（ＭｙｅｒｓおよびＳｔａｈｌ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，２８：４９−７０，１９９４）による分解からの、ドナーＤＮＡフラグメントの保護に必要であり、そしてｒｅｃＢＣ^＋宿主（例えば、頻繁に用いられるＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０ｂ）における効率的なＥＴクローニングに必要である。

【0063】

細菌相同組換えを用いて改変および置換されるこの領域の範囲は、長さ零ヌクレオチド（本来の遺伝子座への挿入を作製する）から数十キロベース（本来の遺伝子座の欠失および／または置換を作製する）におよび得る。改変カセットに依存して、この改変は以下の結果を生じる：
（ａ）コード配列、遺伝子セグメントまたは調節エレメントの欠失；
（ｂ）置換、付加、および融合（例えば、エピトープタグまたは二機能性タンパク質（例えば、ＧＦＰを有するタンパク質）の作製）を含む、コード配列、遺伝子セグメントまたは調節エレメントの変化；
（ｃ）新しいコード領域、遺伝子セグメントまたは調節エレメント（例えば、選択可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子に対するもの）の挿入あるいは内因性転写制御下への新しい遺伝子の配置；
（ｄ）条件的対立遺伝子の作製（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ（ＡｂｒｅｍｓｋｉおよびＨｏｅｓｓ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５９：１５０９−１４，１９８４）によって切除される領域に隣接するｌｏｘＰ部位、または、Ｆｌｐリコンビナーゼ（Ａｎｄｒｅｗｓら、Ｃｅｌｌ，４０：７９５−８０３，１９８５；Ｍｅｙｅｒ−Ｌｅｏｎら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ，４９：７９７−８０４，１９８４；Ｃｏｘ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８０：４２２３−７，１９８３）によって切除される領域に隣接するＦＲＴ部位の導入による）；あるいは
（ｅ）ある種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、異なる種由来のオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）コード配列による置換（例えば、特定の遺伝子座が「ヒト化
」されたマウスを操作するための、マウスの遺伝子座の、オルソログヒト遺伝子座による置換）。

【0064】

これらの改変のうちいずれかまたは全てが、ＬＴＶＥＣに導入され得る。内因性コード配列が全体的に消去され、かつレポーター遺伝子および選択可能なマーカーの両方に同時に置き換えられた、特定の、非限定的な例は、従来の技術と比較した場合の本方法の利点として、以下の実施例１において与えられる。
（工程３（任意）．各ＬＴＶＥＣが正しく操作されたことを検証する。）
以下により、各ＬＴＶＥＣが正しく操作されたことを検証する：
ａ．目的の遺伝子または染色体座へのドナーフラグメントの導入によって作製された新規の接合を検証するための、診断的ＰＣＲ。従って、得られるＰＣＲフラグメントは、目的の遺伝子または染色体座へのドナーフラグメントの導入によって作製された新規の接合部をさらに検証するために配列決定され得る。

【0065】

ｂ．所望の改変のみが、細菌相同組換えプロセスの間にＬＴＶＥＣに導入されていることを確認する、診断的制限酵素消化。

【0066】

ｃ．目的の遺伝子または染色体座へのドナーフラグメントの導入によって作製された新規の接合部を検証するための、ＬＴＶＥＣ、特に改変部位にわたる領域の直接的配列決定。

【0067】

（工程４．真核生物細胞への導入のための、ＬＴＶＥＣ ＤＮＡの精製、調製および直鎖化）
（ａ．ＬＴＶＥＣ ＤＮＡの調製：）
選択されたＬＴＶＥＣのミニプレップＤＮＡの調製（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，第１巻，２巻，および３巻，１９８９；ＴｉｌｌｅｔｔおよびＮｅｉｌａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４：５６８−７０，５７２，１９９８；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ／ｈａｎｄｂｏｏｋｓ／ｐｌｋｍｉｎｉ／ｐｌｍ＿３９９．ｐｄｆ）および、エレクトロポレーションを用いる、ミニプレップＬＴＶＥＣ ＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉへの再形質転換（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，第１巻，２巻，および３巻，１９８９）。この工程は、細菌相同組換えの工程に利用される遺伝子組換えタンパク質をコードするプラスミドを除去するために必要である（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２０：１２３−８，１９９８；Ｎａｒａｙａｎａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，６：４４２−７，１９９９）。このプラスミドの除去は、（ａ）このプラスミドが高コピー数プラスミドであり、大規模ＬＴＶＥＣプレップにおいて得られる収率を減少させ得るので；（ｂ）遺伝子組換えタンパク質の発現を誘導する可能性を排除するために；そして（ｃ）このプラスミドがこのＬＴＶＥＣの物理的マッピングを不明瞭化し得るので、有用である。真核生物細胞へのこのＬＴＶＥＣの導入の前に、標準的方法論（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ／ｈａｎｄｂｏｏｋｓ／ｐｌｋ／ｐｌｋｌｏｗ．ｐｄｆ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，第１巻，２巻，および３巻，１９８９；ＴｉｌｌｅｔｔおよびＮｅｉｌａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４：５６８−７０，５７２，１９９８）によって、より大量のＬＴＶＥＣ ＤＮＡが調製される。しかし、この工程は、遺伝子組換えプロファージを利用する細菌相同組換えの方法が用いられる場合（すなわち、遺伝子組換えタンパク質をコードする遺伝子が、細菌染色体へと組み込まれる細菌相同組換えの方法（Ｙｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
，９７：５９７８−８３，２０００）が用いられる場合）、回避され得る。

【0068】

（ｂ．ＬＴＶＥＣ ＤＮＡの直鎖化：）
真核生物細胞への導入のためのＬＴＶＥＣを調製するために、このＬＴＶＥＣは、長いホモロジーアーム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍ）に隣接する改変された内因性遺伝子または染色体座ＤＮＡを残す様式で、好ましくは直鎖化される。これは、希にのみ消化する、任意の適切な制限酵素を用いて、好ましくはベクター骨格において、このＬＴＶＥＣを直鎖化することによって達成され得る。適切な制限酵素の例としては、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｒｆＩ、ＳｗａＩ、ＦｓｅＩなどが挙げられる。制限酵素の選択は、実験的に（すなわち、いくつかの異なる候補の希なカッター（ｒａｒｅ ｃｕｔｔｅｒ）を試験することによって）決定され得るか、または、このＬＴＶＥＣの配列が公知である場合、この配列を分析し、そしてこの分析に基づいて適切な制限酵素の選択することによって決定され得る。このＬＴＶＥＣが希な部位（例えば、ＣｏｓＮ部位）を含むベクター骨格を有する状況において、このＬＴＶＥＣは、このような部位を認識する酵素（例えば、λターミナーゼ（Ｓｈｉｚｕｙａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９：８７９４−７，１９９２；ＢｅｃｋｅｒおよびＧｏｌｄ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，７５：４１９９−２０３，１９７８；Ｒａｃｋｗｉｔｚら、Ｇｅｎｅ，４０：２５９−６６，１９８５））によって切断され得る。

【0069】

（工程５．真核生物細胞へのＬＴＶＥＣの導入、および、このＬＴＶＥＣの首尾よい導入が生じた細胞の選択）
ＬＴＶＥＣ ＤＮＡは、標準的方法論（例えば、リン酸カルシウム、脂質によって媒介されるトランスフェクトまたはエレクトロポレーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，第１巻，２巻，および３巻，１９８９））を用いて、真核生物細胞に導入され得る。このＬＴＶＥＣが首尾よく導入された細胞は、このＬＴＶＥＣへ操作された選択可能なマーカー遺伝子に依存して、選択薬剤に対する曝露によって選択され得る。非限定的な例として、この選択可能なマーカーがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ネオ）遺伝子（Ｂｅｃｋら、Ｇｅｎｅ，１９：３２７−３６，１９８２）である場合、このＬＴＶＥＣを取り込んだ細胞は、Ｇ４１８含有培地において選択され得る；このＬＴＶＥＣを有さない細胞は死滅するが、このＬＴＶＥＣを取り込んだ細胞は生存する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ，３０：１４７−５６，１９８４）。他の適切な選択可能なマーカーとしては、真核生物細胞において活性を有する任意の薬物（Ｊｏｙｎｅｒ，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２９３，１９９９）（例えば、ハイグロマイシンＢ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ，３０：１４７−５６，１９８４；Ｂｅｒｎａｒｄら、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，１５８：２３７−４３，１９８５；ＧｉｏｒｄａｎｏおよびＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ、Ｇｅｎｅ，８８：２８５−８，１９９０）、ブラスチシジンＳ（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ）（Ｉｚｕｍｉら、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，１９７：２２９−３３，１９９１））、および、当業者に公知の他の薬物が挙げられる。

【0070】

（工程６．対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）に対する定量的アッセイを用いて、真核生物細胞における相同組換え事象をスクリーニングする）
このＬＴＶＥＣを目的の遺伝子座に標的化することによって首尾よく改変された真核生物細胞は、目的の遺伝子座内における対立遺伝子の改変を検出し得、そしてホモロジーアームにわたるアッセイに依存しない、種々のアプローチを用いて同定され得る。このようなアプローチとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（ａ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）を用いる定量的ＰＣＲ（ＬｉｅおよびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９：４３−８，１９９８）；
（ｂ）分子ビーコンを用いる定量的ＭＯＡアッセイ（Ｔａｎら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
６：１１０７−１１，２０００）
（ｃ）蛍光インサイチュハイブリダイゼーションＦＩＳＨ（Ｌａａｎら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，９６：２７５−８０，１９９５）または比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（Ｆｏｒｏｚａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，１３：４０５−９，１９９７；ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＧｒａｙ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｕｐｐｌ，１３９−４３，１９９３；ＨｏｕｌｄｓｗｏｒｔｈおよびＣｈａｇａｎｔｉ、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１４５：１２５３−６０，１９９４）；
（ｄ）等温ＤＮＡ増幅（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，１９：２２５−３２，１９９８；ＭｉｔｒａおよびＣｈｕｒｃｈ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２７：ｅ３４，１９９９）；
（ｅ）固定プローブへの定量的ハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３，１９７５；Ｋａｆａｔｏｓ ＦＣ；Ｊｏｎｅｓ ＣＷ；Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ Ａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ７（６）：１５４１−５２，１９７９）；
（ｆ）Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；
（ｇ）Ｅｃｌｉｐｓｅ^ＴＭおよび分子ビーコンプローブ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；ならびに
（ｈ）ＭＭＰアッセイ（Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）
本出願人らは、本明細書中において、ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲを用いて、首尾よく標的化された真核生物細胞についてスクリーニングをする例を提供する。この非限定的な例において、ＴａｑＭａｎ（登録商標）は、二倍体ゲノムにおいて、２つの内因性対立遺伝子のうちの１つの一部が、別の配列によって置き換えられた相同組換えを起こしている、真核生物細胞を同定するために用いられる。ホモロジーアーム全体にわたる制限フラグメントの長さの差異が、２つの対立遺伝子のうちの１つの改変を示す従来の方法とは対照的に、この定量的ＴａｑＭａｎ（登録商標）法は、未改変の対立遺伝子のコピー数の減少（半分まで）の測定によって、１つの対立遺伝子の改変を検出する。特に、このプローブは、未改変の対立遺伝子を検出し、そして改変された対立遺伝子を検出しない。従って、本方法は改変の厳密な性質から独立しており、そして本実施例に記述される配列置換に限定されない。ＴａｑＭａｎは、ゲノムＤＮＡサンプル中のＤＮＡテンプレートのコピー数を、特に参照遺伝子（ＬｉｅおよびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９：４３−８，１９９８）に対する比較によって、数量化するために用いられる。この参照遺伝子は、同一のゲノムＤＮＡにおいて、標的遺伝子または遺伝子座として定量化される。従って、（各々がそれぞれのプローブを用いる）２つのＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅が行われる。一方のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは参照遺伝子の「Ｃｔ」（許容限界サイクル）を決定するが、他方のプローブは、首尾よい標的化によって置き換えられる標的化遺伝子または遺伝子座の領域のＣｔを決定する。このＣｔは、各ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに対する開始ＤＮＡの量を反映する量である（すなわち、配列の量がより少なくなれば、許容限界サイクルに達するまでに、より多くのＰＣＲのサイクルを必要とする）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応に対する、テンプレート配列のコピー数の半分までの減少は、約１Ｃｔ単位の増加を生じる。標的遺伝子または標的遺伝子座の１つの対立遺伝子が相同組換えによって置き換えられた細胞における、ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応は、非標的化細胞由来のＤＮＡと比較した場合、参照遺伝子に対するＣｔの増加を伴わない標的ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応について、１Ｃｔの増加を生じる。このことにより、ＬＴＶＥＣを用いる真核生物細胞における目的の遺伝子の１つの対立遺伝子の改変の検出が可能となる。

【0071】

上記のように、対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）のスクリーニングは、１つの対立遺伝子の改変を検出して相同組換えを起こした細胞を同定する、任意の方法の用途である。これらの標的化対立遺伝子は互いに同一（相同）である必要はなく、そして実際に、マウスの異
なる２つの系統の交配に起因する子孫の場合と同様に、多型を含み得る。さらに、ＭＯＡスクリーニングによっても網羅される、ある特殊な状況は、通常は細胞において単一のコピーとして存在する遺伝子（例えば、性染色体、および、特にＹ染色体に位置するいくつか）の標的化である。この場合、単一の標的化対立遺伝子の改変を検出する方法（例えば、定量的ＰＣＲ、サザンブロットなど）を、標的化事象を検出するために用い得る。本発明の方法は、対立遺伝子が多型である場合でさえ、または対立遺伝子が標的化細胞内の単一コピー中に存在する場合でさえ、改変された真核生物細胞を作製するために用いられ得ることが明らかである。

【0072】

（工程８．遺伝的に改変された真核生物細胞の使用）
（ａ）工程１〜７で記述された方法によって作製された、遺伝的に改変された真核生物細胞は、この細胞の表現型を変化させることが望ましいインビトロまたはインビボでの任意のアッセイにおいて用いられ得る。

【0073】

（ｂ）工程１〜７で記述された方法によって作製された、遺伝的に改変された真核生物細胞はまた、遺伝的な改変を有する生物体を作製するために用いられる。この遺伝的に改変された生物体は、以下に挙げられるが、これらに限定されない、いくつかの異なる技術によって作製され得る：
１．改変された胚幹（ＥＳ）細胞（例えば、頻繁に用いられるラットおよびマウスのＥＳ細胞）。ＥＳ細胞は、標準的な胚盤胞注入技術または凝集技術（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２５４，１９８７；Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ，３６５：８７−９，１９９３；Ｊｏｙｎｅｒ，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２９３，１９９９）、四倍体胚盤胞注入（Ｗａｎｇら、Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ，６２：１３７−４５，１９９７）、あるいは核移入およびクローニング（Ｗａｋａｙａｍａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９６：１４９８４−９，１９９９）によって、遺伝的に改変されたラットまたはマウスを作製するために用いられ得る。他の生物体（例えば、ウサギ（Ｗａｎｇら、Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ，６２：１３７−４５，１９９７；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，４５：４３９−４３，１９９６）またはニワトリ（Ｐａｉｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２２：２３３９−４８，１９９６）または他の種）に由来するＥＳ細胞もまた、本発明の方法を用いる遺伝的な改変に受け入れられるべきである。

【0074】

２．改変されたプロトプラストは、遺伝的に改変された植物を作製するために用いられ得る（例えば、米国特許第５，３５０，６８９号「プロトプラストまたはプロトプラスト由来細胞から再生されるトウモロコシ植物およびトランスジェニックトウモロコシ植物」、米国特許第５，５０８，１８９号「培養された孔片細胞プロトプラストからの植物の再生」、およびこれらの参考文献を参照のこと）。

【0075】

３．改変された対立遺伝子を有するクローン化生物体を作製するための、改変された真核生物細胞から卵母細胞への核移入（Ｗａｋａｙａｍａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９６：１４９８４−９，１９９９；Ｂａｇｕｉｓｉら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：４５６−６１，１９９９；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ，１０：６３９−４３，１９９８；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０−３，１９９７；Ｗａｋａｙａｍａら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２４：１０８−９，２０００；Ｗａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，３９４：３６９−７４，１９９８；Ｒｉｄｅｏｕｔら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２４：１０９−１０，２０００；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６，１９９６）。

【0076】

４．操作された染色体の移動を含む、改変された対立遺伝子を別の細胞に移入させるための細胞融合、および改変された対立遺伝子または操作された染色体を有する生物体を産
生するためのこのような細胞の使用（Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８：１０８６−１０９０，２０００）。

【0077】

５．本方法はまた、用いられているか、または、まだ発見されていない、他の任意のアプローチに受け入れられる。

【0078】

本発明の方法の個々の工程を実行する際に使用される多くの技術は、当業者によく知られているが、本出願人は、本発明の方法の新規性が、真核生物細胞にＬＴＶＥＣを直接導入して、染色体遺伝子座を改変する、以前に記載されたことのない方法と、適切に改変された真核生物細胞を同定するための定量的ＭＯＡアッセイの使用とに組み合わされた、工程および技術の独自の組み合わせにあることを主張する。この新規組み合わせは、内因性の遺伝子または染色体遺伝子座の改変を有する生物を作製するための、先行技術を上回る有意な改善を示す。

【実施例】

【0079】

（実施例）
（実施例１：ＯＣＲ１０遺伝子の欠失を有するマウスＥＳ細胞の操作）
（ａ．ｍＯＣＲ１０遺伝子を含む大きいゲノムＤＮＡクローンの選択）
マウスＯＣＲ１０（ｍＯＣＲ１０）遺伝子のコード配列を含む大きいゲノムＤＮＡフラグメントを保持する細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを、ＰＣＲを使用して、整列されたマウスゲノムＤＮＡのＢＡＣライブラリー（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）をスクリーニングすることによって獲得した。このライブラリーをスクリーニングするために使用したプライマーは、ｍＯＣＲ１０遺伝子のｃＤＮＡ配列に由来した。

【0080】

使用した２つのプライマー対は、以下であった：
（ａ）ＯＣＲ１０．ＲＡＡ（５’−ＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＧＣＡＧ−３’）およびＯＣＲ１０．ＰＶＩｒｃ（５’−ＣＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧ−３’）、これらは、１０２ｂｐのＤＮＡを増幅する；ならびに
（ｂ）ＯＣＲ１０．ＴＤＹ（５’−ＧＡＣＣＴＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＣＴＡＣ−３’）およびＯＣＲ１０．ＱＥＴｒｃ（５’−ＡＣＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＴＣＴＣＴＴＧ−３’）、これらは、１５００ｂｐのＤＮＡを増幅する。

【0081】

このｍＯＣＲ１０ ＢＡＣは、完全なｍＯＣＲ１０コード配列を含む、約１８０ｋｂのゲノムＤＮＡを含んだ。このＢＡＣクローンを使用して、ＬＴＶＥＣを作製し、続いて、これを使用して、開始コドンがＯＣＲ１０の開始コドンで正確に置換されたレポーター遺伝子を導入し、同時にこのレポーター遺伝子の後ろに、Ｅ．ｃｏｌｉおよび哺乳動物細胞の両方において選択するのに有用な選択マーカー遺伝子を挿入しながら、ｍＯＣＲ１０のコード領域の一部を欠失した（図２）。レポーター遺伝子（この非限定的な例において、ＬａｃＺ。この配列は、当業者に容易に入手可能である）は、Ｅ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ酵素をコードする。ＬａｃＺ（その開始コドンは、ｍＯＣＲ１０の開始コドンと同じ位置である）の挿入部分に起因して、ＬａｃＺでの類似の置換が先行技術を使用して実行された他の例において観察されたように（「Ｇｅｎｅ ｔｒａｐ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ」、Ｗ ＷｕｒｓｔおよびＡ．Ｇｏｓｓｌｅｒ、Ｊｏｙｎｅｒ、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、２９３、１９９９を参照のこと）、ｌａｃＺの発現は、ｍＯＣＲ１０の発現を模倣するはずである。ＬａｃＺ遺伝子は、発現パターンをインサイチュで明らかにし得る、単純かつ標準的な酵素アッセイが実行されるのを可能にし、従って、置換された遺伝子または染色体遺伝子座の正常な発現パターンを反映する代理アッセイを提供する。

【0082】

（ｂ．ドナーフラグメントの構築およびＬＴＶＥＣの作製）
ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣの構築において使用される改変カセットは、ｌａｃＺ−ＳＶ４０ポリＡ−ＰＧＫｐ−ＥＭ７−ｎｅｏ−ＰＧＫポリＡカセットであり、ここでｌａｃＺは、上記のようなマーカー遺伝子であり、ＳＶ４０ポリＡは、シミアンウイルス４０由来のフラグメントであり（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｐｒｏｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９：１５７−６４、１９７６；Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２５３：１６１３−８、１９７８；Ｄｈａｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、７１：３７１−５、１９７４；Ｒｅｄｄｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００：４９４−５０２、１９７８）、そしてポリアデニル化部位およびシグナルを含み（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｐｒｏｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９：１５７−６４、１９７６；Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２５３：１６１３−８、１９７８；Ｄｈａｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、７１：３７１−５、１９７４；Ｒｅｄｄｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００：４９４−５０２、１９７８）、ＰＧＫｐは、マウスホスホグリセレリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターであり（Ａｄｒａら、Ｇｅｎｅ、６０：６５−７４、１９８７）（これは、哺乳動物細胞における薬物耐性遺伝子の発現を駆動するために広く使用されてきた）、ＥＭ７は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子の発現を駆動することによって、細菌中の、完成したＬＴＶＥＣ構築物のポジティブ選択を可能にする利点を有する、強力な細菌プロモーターであり、ｎｅｏは、原核生物細胞におけるカナマイシン耐性および真核生物細胞におけるＧ４１８耐性を付与する選択マーカーであり（Ｂｅｃｋら、Ｇｅｎｅ、１９：３２７−３６、１９８２）、そしてＰＧＫポリＡは、ＰＧＫ遺伝子由来の３’非翻訳領域であり、ポリアデニル化部位およびシグナルを含む（Ｂｏｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｔ、２８：２９９−３０８、１９９０）。

【0083】

ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣを構築するために、改変カセット中のＬａｃＺ遺伝子の上流に結合したｍＯＣＲ１０相同性ボックス１（ｈｂ１）、および改変カセット中のｎｅｏ−ＰＧＫポリＡ配列の下流に結合したｍＯＣＲ１０相同性ボックス２（ｈｂ２）からなる第一のドナーフラグメント（図２）を、標準的な組換え遺伝子操作技術を使用して作製した。相同性ボックス１（ｈｂ１）は、ｍＯＣＲ１０のオープンリーディングフレーム（ｍＯＣＲ１０ ＯＲＦ）の開始メチオニンの直ぐ上流の、２１１ｂｐの非翻訳配列からなる（図３Ａ〜３Ｄ）。相同性ボックス２（ｈｂ２）は、終止コドンで終わる、ｍＯＣＲ１０ ＯＲＦの最後の２１６ｂｐからなる（図３Ａ〜３Ｄ）。

【0084】

続いて、細菌相同組換えを用いて（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、２０：１２３−８、１９９８；Ａｎｇｒａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、２７：ｅ１６、１９９９；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、２７：１５５５−７、１９９９；Ｎａｒａｙａｎａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、６：４４２−７、１９９９；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、９７：５９７８−８３、２０００）、このドナーフラグメントを使用して、ｍＯＣＲ１０コード領域（開始メチオニンから終止コドンまで）を挿入カセットで正確に置換し、ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣの構築を生じた（図２）。従って、このｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣにおいて、ｍＯＣＲ１０コード配列を、挿入カセットによって置換して、ｍＯＣＲ１０遺伝子座における約２０ｋｂの欠失を作製し、一方で約１３０ｋｂの上流相同性（上流相同性アーム）および３２ｋｂの下流相同性（下流相同性アーム）を残した。

【0085】

ＬＴＶＥＣが、入手可能なＢＡＣライブラリーから、先行技術を使用して作製された標的化ベクターよりも、より迅速かつ簡便に作製され得る（なぜなら、単一の細菌相同組換え工程のみが必要であり、必要な配列情報は、相同性ボックスを作製するために必要な配列情報のみであるからである）ことに注意することが重要である。対照的に、細菌相同組
換えを使用して標的化ベクターを作製するための先行技術のアプローチは、ＥＳ細胞への導入の前に、大きい標的化ベクターが「トリミング」される必要がある（Ｈｉｌｌら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６４：１１１−３、２０００）。先行技術のアプローチによって利用されるスクリーニング方法に対応するために、十分短い相同性アームを作製することが必要なので、このトリミングは必要とされる。Ｈｉｌｌらの方法の１つの主要な欠点は、２つのさらなる相同組換え工程が、単にトリミングのために必要とされることである（１つの工程は、改変された遺伝子座の上流領域をトリミングし、１つの工程は、改変された遺伝子座の下流領域をトリミングする）。これを行うために、実質的により多くの配列情報（トリミング部位にわたる配列情報を含む）が必要である。

【0086】

さらに、上記の実施例によって例示される別の明らかな利点は、ｍＯＣＲ１０遺伝子にわたる非常に大きい欠失（約２０ｋｂ）が、単一工程において容易に作製され得ることである。対照的に、先行技術を使用して同じ作業を達成することは、いくつかの工程を必要とし得、そしてＣｒｅリコンビナーゼを使用して、真核生物細胞において改変された遺伝子座の導入後にｌｏｘＰ部位が隣接する配列を除去するために、ｌｏｘＰ部位を有するコード配列の上流および下流の領域を作製する工程を含み得る。このことは、１工程では達成不能であり得、従って、異なる選択マーカーを使用する２つの標的化ベクターの構築、およびＥＳ細胞における２つの連続する標的化事象（１つの事象は、コード配列の上流領域にｌｏｘＰ部位を導入すること、そして他方の事象は、コード配列の下流領域にｌｏｘＰ部位を導入すること）を必要とし得る。相同組換えの達成頻度は、比較的短い相同性アームが隣接する大きい欠失を含む標的化ベクターを使用する場合、低い可能性があるので、大きい欠失の作製は、しばしば、真核生物細胞における先行の標的化技術を使用すると、低い効率で生じることもさらに注意されるべきである。本発明の方法（以下を参照のこと）を使用して得られる高い効率は、真核生物細胞における相同組換えの割合を増大させる、ＬＴＶＥＣ中に存在する非常に長い相同性アームに起因する。

【0087】

（ｃ．ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣ ＤＮＡの確認、調製およびＥＳ細胞への導入）
挿入カセットおよび相同性配列の連結部の周辺の配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣのサイズを、制限分析、その後のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によって確認した（Ｃａｎｔｏｒら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ、１７：２８７−３０４、１９８８；ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＣａｎｔｏｒ、Ｃｅｌｌ、３７：６７−７５、１９８４）。ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣの標準的なラージスケールのプラスミド調製を行って、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩ（これは、ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣのベクター骨格を切断する）で消化して、直線状ＤＮＡを作製した。続いて、直線化されたＤＮＡを、エレクトロポレーションによって、マウスＥＳ細胞に導入した（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、２５４、１９８７；Ｊｏｙｎｅｒ、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、２９３、１９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、１巻、２巻および３巻、１９８９）。ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣで首尾よくトランスフェクトされたＥＳ細胞を、標準的な選択方法を使用して、Ｇ４１８含有培地中で選択した（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、２５４、１９８７；Ｊｏｙｎｅｒ、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、２９３、１９９９）。

【0088】

（ｄ．定量的対立遺伝子改変（ＭＯＡ）アッセイを使用する、標的化ＥＳ細胞クローンの同定）
２つの内因性ｍＯＣＲ１０遺伝子のうち１つが改変カセット配列によって置換されたＥＳ細胞を同定するため、個々のＥＳ細胞クローン由来のＤＮＡを、標準的なＴａｑＭａｎ
（登録商標）方法論を、記載されたように使用する定量的ＰＣＲによって分析した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、カタログ番号Ｐ／Ｎ４３０４４３７；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏｄｏｃｓ．ｃｏｍ／ｐｅｂｉｏｄｏｃｓ／０４３０４４４９．ｐｄｆもまた参照のこと）。使用したプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、図３Ａ〜３Ｄに記載の通りである。合計６９個の個々のＥＳ細胞クローンをスクリーニングし、そして３個のクローンが陽性として、すなわち、内因性ｍＯＣＲ１０コード配列の１つが、上記の改変カセットによって置換されたクローンとして、同定された。

【0089】

ＭＯＡアプローチのいくつかの利点が明らかである：
（ｉ）改変されている遺伝子座の外側のプローブの使用を必要としない。従って、改変された遺伝子座に隣接する配列を知る必要を排除する。

【0090】

（ｉｉ）以前の選択方法であった従来のサザンブロット方法論（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、２５４、１９８７；Ｊｏｙｎｅｒ、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、２９３、１９９９）と比較して、実行するために必要な時間が非常に短い。従って、正確に改変された細胞を同定するための時間を、代表的には数日間からほんの数時間に減少させる。

【0091】

これは、過去にスクリーニングが実行された方法における有意な改善であり、この方法を、真核生物細胞における相同組換え事象についてスクリーニングするための、労力集約がかなり少なく、かつコスト効率のよいアプローチにしている。

【0092】

本発明の方法のなお別の利点は、難しい遺伝子座を標的化する能力に起因してもまた、先行技術より優れていることである。先行技術を使用すると、特定の遺伝子座についての首尾よい標的化頻度は、２０００の組み込み事象のうち１、おそらくそれより低い頻度でさえあり得ることが示された。本発明の方法を使用して、本出願人は、このような難しい遺伝子座が、長い相同性アーム（すなわち、先行技術によって可能な長さよりも長い）を含むＬＴＶＥＣを使用して、かなり効率的に標的化され得ることを実証した。上記の非限定的な実施例が実証するように、本出願人は、ＯＣＲ１０遺伝子座（この遺伝子座は、従来技術を使用する標的化が困難であることが以前に証明された）を標的化した。本発明の方法を使用して、本出願人は、ｍＯＣＲ１０ ＬＴＶＥＣ（１６０ｋｂより長い相同性アームを含み、２０ｋｂの欠失を導入する）が組み込まれた６９個のＥＳ細胞クローンのうち３個において、首尾よい標的化を得たが、一方、ＥＳ細胞標的化の先行技術（Ｊｏｙｎｅｒ、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、２９３、１９９９）を使用すると、１０〜２０ｋｂより短い相同性アームを有し、一方でまた１５ｋｂ未満の欠失を導入する、プラスミドベースのベクターを使用して、ベクターの６００を超える構成要素のうち、標的化事象は同定されなかったことを示した。これらのデータは明らかに、本発明の方法が、先行技術よりも優れていることを実証する。

【0093】

（実施例２：ＬＴＶＥＣが標的化ベクターとして使用される場合の、増大した標的化頻度および同質遺伝子ＤＮＡを使用する必要性の撤廃）
上記のように、長い相同性アームを使用して得られた増大した標的化頻度は、存在する場合、ＬＴＶＥＣを構築する際の、標的化される真核生物細胞のＤＮＡと同質遺伝子の（すなわち、このＤＮＡの配列と同一の）ゲノムＤＮＡを使用することに由来する利点を低減するはずである。この仮説を試験するため、本出願人は、標的化されるべき真核生物細胞と同じマウス亜系に由来するゲノムＤＮＡ（おそらく同質遺伝子）を使用して、いくつかのＬＴＶＥＣを、そして標的化されるべき真核生物細胞と異なるマウス亜系に由来するゲノムＤＮＡ（おそらく非同質遺伝子）を使用して、多数の他のＬＴＶＥＣを構築した。この非同質遺伝子ＬＴＶＥＣは、６％（１〜２０％の範囲、表１）の平均標的化頻度を示
し、一方、同質遺伝子ＬＴＶＥＣは、３％（２〜５％の範囲）の平均標的化頻度を示した。このことは、ＬＴＶＥＣを使用した首尾よい標的化の割合が、遺伝子同質性に依存しないことを示す。

【0094】

【表1】

（実施例３：標的化ＥＳクローンの同定のためのＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースのＭＯＡの詳細な説明）
ＬＴＶＥＣを取り、相同組換えによって標的化遺伝子座のゲノム中にＬＴＶＥＣを組み込んだＥＳ細胞クローンは、標的ＥＳ細胞クローン（ここで、２つの標的化対立遺伝子の１つが改変される）と非標的ＥＳ細胞クローン（ここで、両方の対立遺伝子は、改変されないままである）との間の差異を区別するためのリアルタイム定量的ＰＣＲを使用する、
対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイによって同定される。ＭＯＡアッセイは、一次スクリーニングおよび二次スクリーニングからなる。一次スクリーニングは、以下の工程を包含する：（１）ゼラチンコーティングした９６ウェルプレート上での、ＬＴＶＥＣでトランスフェクトしたＥＳ細胞クローンの増殖；（２）各ＥＳ細胞クローンからのゲノムＤＮＡの単離；（３）２つの３８４ウェルプレート上での８回の別々の定量的ＰＣＲにおける鋳型としての各ゲノムＤＮＡサンプルの使用であって、ここで、２回のＰＣＲは、欠失について標的化されたゲノムフラグメントの１つの末端のＤＮＡ配列にハイブリダイズする標的−遺伝子座特異的プライマーセットを使用し（「上流ＰＣＲ」）、２回のＰＣＲは、欠失について標的化されたゲノムフラグメントの他の末端のＤＮＡ配列にハイブリダイズする標的−遺伝子座特異的プライマーセットを使用し（「下流ＰＣＲ」）、４回のＰＣＲは、４つの非標的参照遺伝子座を認識するプライマーセットを使用し（「参照ＰＣＲ」）、そして各ＰＣＲは、蛍光プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）［ＡＢＩ］、Ｅｃｌｉｐｓｅ^ＴＭ、またはＭｏｌｅｃｕｌｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ［Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ］）（これは、増幅配列を認識し、そしてその蛍光シグナルがＰＣＲ産物の量に直接比例する）を含む；（４）サーモサイクラーを蛍光検出器と組み合わせるデバイス（例えば、ＡＢＩ７９００ＨＴ）（これは、ＰＣＲの間に増幅産物の蓄積を定量し、そして閾値サイクル（Ｃ_Ｔ）（蛍光シグナルがバックグラウンドノイズを超えて検出可能であるＰＣＲにおける地点）を決定する）中で、ＰＣＲを実行する工程；（５）各ＥＳ細胞クローンＤＮＡサンプルについて、上流ＰＣＲと４つの参照ＰＣＲの各々との間で、そして下流ＰＣＲと４つの参照ＰＣＲの各々との間で、Ｃ_Ｔ値における差異（ΔＣ_Ｔ）を計算して９６個のΔＣ_Ｔ値の８つの表を作製する工程；（６）ΔＣ_Ｔ値を正の値に対して正規化する工程；（７）各標的−参照比較表についてのメジアンΔＣ_Ｔ値の計算；（８）８つのΔＣ_Ｔ表を調査し、メジアンΔＣ_Ｔよりも０．５〜１．５、０．２５〜１．５、０．５〜２．０、０．２５〜２．０、０．５〜３．０および０．２５〜３．０サイクル大きい許容範囲内でΔＣ_Ｔ値を生じる、所定のＥＳ細胞クローンＤＮＡサンプルを数回計算するコンピュータプログラムの使用による信頼スコアの決定（このようなプログラムを作製または書き込むのに適したコンピュータプログラミング言語の例としては、ビジュアルベーシック、Ｊａｖａ（登録商標）、または当業者によく知られた任意の他のコンピュータプログラミング言語が挙げられる）；（９）ヒストグラムとして８つのΔＣ_Ｔ表の各々についての値およびそれらのメジアンをプロットする工程；ならびに（１０）信頼スコアおよびΔＣ_Ｔヒストグラムの検査からの正確に標的化されたＥＳ細胞クローン候補の同定。好ましい例において、候補標的化クローンについてのΔＣ_Ｔ値は、８つの参照比較のうちの８つにおいてのメジアンよりも０．５〜１．５サイクル大きい範囲である。

【0095】

ＭＯＡアッセイ一次スクリーニングによって同定された候補クローンは、二次スクリーニングにおいて確認されるかまたは拒絶され、この二次スクリーニングは、以下の工程を包含する：（１）ポジティブ候補ＥＳ細胞クローンの各々由来のゲノムＤＮＡ、より多数のネガティブクローン由来のゲノムＤＮＡ、および２つの３８４ウェルプレート上の８つの別々の定量的ＰＣＲにおける鋳型としての２倍体ゲノム当り１または２コピーのＬＴＶＥＣ ＬａｃＺ−Ｎｅｏカセットを保有するマウス由来のゲノムＤＮＡコピー数標準由来のゲノムＤＮＡの使用であって、ここで、１つの反応は、上流ＰＣＲであり（一次スクリーニングにおけるように）、１つの反応は、下流ＰＣＲであり（一次スクリーニングにおけるように）、４つの反応は、一次スクリーニングにおいて使用される参照遺伝子座とは異なる２つの参照遺伝子座を用いる参照ＰＣＲであり、１つの反応は、ＬＴＶＥＣのＬａｃＺ遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを用いるＰＣＲであり、そして１つの反応は、ＬＴＶＥＣのＮｅｏ遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを用いるＰＣＲである；（２）一次スクリーニングにおけるように、定量的ＰＣＲデバイスにおいてＰＣＲを実行する工程；（３）一次スクリーニングにおけるように、上流ＰＣＲと２つの参照ＰＣＲの各々との間で、下流ＰＣＲと２つの参照ＰＣＲの各々との間で、ＬａｃＺ ＰＣＲと２つの参照ＰＣＲの各々との間で、そしてＮｅｏ ＰＣＲと２つの参照ＰＣＲの各々と
の間で、ΔＣ_Ｔ値を計算して、８つのΔＣ_Ｔ表を作製する工程；（４）ΔＣ_Ｔ値を正の値に正規化する工程；（５）各ΔＣ_Ｔ表についてのメジアンの計算；（６）一次スクリーニングにおけるような信頼スコアの計算；ならびに（７）ヒストグラムとして８つのΔＣ_Ｔ表の各々についての値およびそれらのメジアンをプロットする工程。

【0096】

信頼スコアならびに一次スクリーニングおよび二次スクリーニングの両方についてのΔＣ_Ｔヒストグラムの検査から、正確に標的化されたＥＳクローン候補は、確認されるかまたは拒絶される。好ましい例において、候補標的化クローンについてのΔＣ_Ｔ値は、一次スクリーニングおよび二次スクリーニングの組み合わせ由来の１２の参照比較のうちの１２においてのメジアンよりも０．５〜１．５サイクル大きい範囲である。

【0097】

確認された、正確に標的化されたＥＳクローン中の２倍体ゲノム当りのＬＴＶＥＣのコピー数をスコアするために、ＬａｃＺ ＰＣＲおよびＮｅｏ ＰＣＲの、２つの参照ＯＣＲとの比較由来のこれらのΔＣ_Ｔ値を、ＬａｃＺ−Ｎｅｏコピー数標準についてのΔＣ_Ｔ値と比較する。各ＥＳ細胞クローンは、１、２または２より大きいコピーのＬＴＶＥＣを有するとしてスコアされる。各改変された対立遺伝子プロジェクトについて、ＭＯＡアッセイにおいてポジティブをスコアし、単一コピーのＬａｃＺ−Ｎｅｏカセットを有する３つのクローンが同定されるまで、ＥＳ細胞クローンを、９６の群（通常、合計２８８クローンより少ない）でスクリーニングする。

【0098】

（実施例４：ＥＳ細胞中の正確に標的化されたＬＴＶＥＣを同定するためのＦＩＳＨの使用）
本明細書中に記載されるＬＴＶＥＣ技術を使用して、出願人らは、ＥＳ細胞中のＳＭ２２α遺伝子をノックアウトした。ＳＭ２２αは、２２ｋＤａの平滑筋細胞（ＳＭＣ）系統に限定されたタンパク質であり、これは、収縮性ＳＭＣにおいて細胞骨格アクチンフィラメント束と物理的に会合する。次いで、標的化ＥＳ細胞を、遺伝子が適切に標的化されたことを確認するために、中期染色体スプレッド上で標準的な蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に供した。実験を以下の２つのプローブで実施した：１）ＬＴＶＥＣを生成するために使用される未改変のＳＭ２２α ＢＡＣクローンからなるＳＭ２２α遺伝子プローブ、および２）標的化事象（ＬａｃＺおよびＮｅｏ遺伝子カセットの挿入）によって行なわれる遺伝子改変のみを検出するＬａｃＺおよびネオマイシンＤＮＡプローブ。中期染色体スプレッドを、細胞から調製し、そしてハイブリダイゼーションを両方のプローブを用いて同時に実施した。これらのプローブは、異なる色のフルオロフォアで標識され、同じスプレッド中の各プローブのハイブリダイゼーションの検出を可能にする。非標的化ＥＳ細胞株を、コントロールとして並行して分析した。予期されるように、コントロールスプレッドにおいて、ＳＭ２２αの２つの対立遺伝子が、相同な染色体アーム上で検出されたが、ＬａｃＺ−Ｎｅｏプローブのハイブリダイゼーションは存在しなかった。コントロールにおけるように、標的化ＥＳ細胞スプレッドにおいて、２つの対立遺伝子がまた、同じ染色体遺伝子座および相同な染色体において検出されたが、ＬａｃＺ−Ｎｅｏプローブでの二重標識は、２つの染色体中の１つで明らかであり、ＳＭ２２αの対立遺伝子におけるＳＭ２２αおよびＬａｃＺ−Ｎｅｏ ＤＮＡ配列の同時局在を示す。重要なことに、スプレッド中の不適切な遺伝子座において、ＳＭ２２αの遺伝子配列もＬａｃＺ−Ｎｅｏの遺伝子配列も検出されなかった。ＳＭ２２α遺伝子配列の余分な組み込みの欠如、および１つの染色体の相同な対におけるＬａｃＺ−ＮｅｏのＳＭ２２αとの同時局在は、相同組換えを介するＬａｃＺ−Ｎｅｏの、ＳＭ２２α対立遺伝子の１つに対する正確な標的化が生じたことを強力に示唆する。

【0099】

（実施例５：ＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために使用されたＤＮＡの量を低下することは、標的化効率を改善する）
マウス胚性幹（ＥＳ）細胞における遺伝子の標的化改変のための標準的な方法は、代表
的に、エレクトロポレーション手順において２０〜４０μｇの標的化ベクターを利用する。出願人らは、ＬＴＶＥＣを用いて、はるかに低量のＤＮＡ（１×１０^７細胞当り約１〜５μｇの範囲）でのエレクトロポレーションは、正確に標的化された相同組換え事象の頻度を２倍にするが、二次的な非相同性挿入事象の数を非常に減少させることを発見した。標的化効率におけるこの明らかな改善は、重要である。なぜなら、これは、正確に標的化された単一コピーの改変を有するいくつかのポジティブクローンを見出するためにスクリーニングされる必要のあるＥＳクローン細胞数を有意に減少させるためである。関連した利益は、減少した費用および増加したスループットである。

【0100】

（実施例６：筋萎縮症を研究するためのＭＡ６１ノックアウトマウスを作製するための本発明の方法の使用）
ＭＡ６１（ＭＡＦｂｘとも呼ばれる）は、筋萎縮症の種々の状態においてアップレギュレートされる、近年発見されたユビキチンリガーゼである（米国仮出願番号６０／２６４，９２６（２００１年１月３０日出願）、米国仮出願番号６０／３１１，６９７（２００１年８月１０日出願）、および米国仮出願（番号はまだ知られていない）（２００１年１０月２２日出願）（これらは全て、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．に割り当てられ、これらの各々は、本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）。筋萎縮症におけるこの遺伝子の生物学的重要性をさらに研究するために、以下の通りに本発明の方法を使用して、ノックアウトマウスを作製した。

【0101】

最初に、ＭＡ６１遺伝子を含む大きいクローニングされたゲノムフラグメントを得るために、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）ライブラリーを、ＭＡ６１ ｃＤＮＡ配列に由来するプライマーを使用してスクリーニングした。次いで、このようにして得たＢＡＣクローンを使用して、以下の通りにＬａｒｇｅ
Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ（ＬＴＶＥＣ）を作製した。５’相同性ボックス／ｌａｃＺ遺伝子／ポリＡ／ＰＧＫプロモーター／ｎｅｏ／ポリＡ／３’相同性ボックスを含む改変カセットを設計した。相同性ボックスを、ＬＴＶＥＣの生成の間に細菌の相同組換えの部位を標識するために付加した。ＬａｃＺは、その開始コドンが、ＭＡ６１の開始コドンと同じ位置に存在するように配置されたレポーター遺伝子である。細菌における相同組換え後、改変カセットは、ＭＡ６１遺伝子を置換した。このようにして、ＭＡ６１ ＬＴＶＥＣを作製し、ここで、ＢＡＣクローンにおけるＭＡ６１コード配列は、上記のように設計された改変カセットによって置換された。次いで、ＬＴＶＥＣ ＤＮＡを調製し、精製し、そして以下に記載されるように、真核生物細胞への導入のために直鎖状にした。

【0102】

細菌相同組換え工程に利用される組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）タンパク質をコードするプラスミドを除去するために（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２０：１２３−８，１９９８；Ｎａｒａｙａｎａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，６：４４２−７，１９９９）、ＭＡ６１ ＬＴＶＥＣ ＤＮＡミニプレップを調製し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、第１、２、および３巻、１９８９；ＴｉｌｌｅｔｔおよびＮｅｉｌａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４：５６８−７０，５７２，１９９８；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ／ｈａｎｄｂｏｏｋｓ／ｐｌｋｍｉｎｉ／ｐｌｍ ３９９．ｐｄｆ）、そしてエレクトロポレーションを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ中に再び形質転換した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、第１、２、および３巻、１９８９）。ＭＡ６１ ＬＴＶＥＣを真核生物細胞に導入する前に、大量のＭＡ６１ ＬＴＶＥＣを、標準的な方法論によって調製した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ／ｈａｎｄｂｏｏｋｓ／ｐｌｋ／ｐｌｋｌ
ｏｗ．ｐｄｆ； Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、第１、２、および３巻、１９８９；ＴｉｌｌｅｔｔおよびＮｅｉｌａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４：５６８−７０，５７２，１９９８）。

【0103】

次に、真核生物細胞への導入のためのＭＡ６１ ＬＴＶＥＣを調製するために、ＭＡ６１ ＬＴＶＥＣを直鎖状にした。これを、長い相同アームに隣接する改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を残す制限酵素ＮｏｔＩでの消化によって達成した。

【0104】

次いで、ＭＡ６１ ＬＴＶＥＣを、標準的なエレクトロポレーション方法論を使用して真核生物細胞に導入した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、第１、２、および３巻、１９８９）。ＭＡ６１ ＬＴＶＥＣが首尾良く導入された細胞を、選択剤への曝露によって選択した。改変カセットにおいて使用される選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子（Ｂｅｃｋら、Ｇｅｎｅ，１９：３２７−３６，１９８２）であったので、ＭＡ６１ ＬＴＶＥＣを取り込む細胞を、Ｇ４１８を含む培地中で選択した；ＭＡ６１ ＬＴＶＥＣを有さない細胞は、死滅したが、ＭＡ６１ ＬＴＶＥＣを取り込んだ細胞は、生存した（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ，３０：１４７−５６，１９８４）。

【0105】

ＭＡ６１ ＬＴＶＥＣをＭＡ６１遺伝子座に標的化することによって首尾良く改変された真核生物細胞を、定量的なＰＣＲ方法ＴａｑＭａｎ（登録商標）で同定した（ＬｉｅおよびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９：４３−８，１９９８）。

【0106】

最後に、遺伝子改変したＥＳ細胞を使用して、標準的な胚盤胞注入技術によって、遺伝子改変された（この場合、ノックアウト）マウスを作製した。このように作製されたマウスは、ＭＡ６１遺伝子が欠失したＭＡ６１ノックアウトマウスであった。

【0107】

これらのノックアウトマウスおよび野生型（ＷＴ）マウスを、萎縮を誘導する条件（マウスを脱神経することによって作製される）に曝露し、そして萎縮のレベルを比較した。最初に、坐骨神経を、右後肢の中間大腿領域で分離し、マウスで切除した。座骨神経の切除は、１４日間にわたって除神経および１４日間にわたって後肢（特に、前脛骨筋および腓腹筋）の筋肉の萎縮を生じる。除神経の７日および１４日後、動物を、二酸化炭素の吸入によって屠殺した。次いで、前脛骨（ＴＡ）および腓腹複合体（ＧＡ）を、右後肢（除神経）および左後肢（インタクト）から取り出し、秤量し、そして液体窒素で冷却したイソペンタン中で一定の長さで凍結した。萎縮の量を、除神経した肢由来の筋肉の重量と、除神経していない肢由来の筋肉の重量と比較することによって、評価した。

【0108】

筋萎縮を、右坐骨神経の切除の７日および１４日後に評価した。右側の除神経した筋肉の湿重量を、左側の除神経していない筋肉の湿重量と比較した。右側：左側の比較を表２に示す。

【0109】

【表2】

７日および１４日において、ノックアウトマウス由来の筋肉は、野生型マウス由来の筋肉よりも有意に（ｐ＜０．００１）少ない萎縮を示した。ノックアウトマウスと野生型マウスとの間の差異は、７日よりも１４日において大きかった。野生型マウスは、７日と１４日との間で萎縮し続けたが、ノックアウトマウスは、さらなる萎縮を示さなかった。

【0110】

要約すると、ＬＴＶＥＣを作製するアプローチ、およびＥＳ細胞における相同組換え事象のためのＭＯＡスクリーニングと組み合わせて、標的化ベクターとしてこれらを直接使用するアプローチは、迅速で安価である遺伝子改変された遺伝子座を設計するための新規な方法を作成し、そして以前に使用された退屈な時間のかかる方法を超える有意な改善を示す。従って、これは、以前の方法論によって必要とされた時間および費用の一部で、生物のゲノム中の本質的に任意の遺伝子および全ての遺伝子の、迅速で大規模なインビボの機能的ゲノム学分析の可能性を開く。

【0111】

前述の本発明は、例示および例としていくらか詳細に記載されているが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の教示に対してなされることが、当業者に容易に明らかである。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]