特許 5946170 デアザプリンヌクレオシド誘導体、デアザプリンヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5946170

(24)【登録日】2016年6月10日

(45)【発行日】2016年7月5日

(54)【発明の名称】デアザプリンヌクレオシド誘導体、デアザプリンヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体

(51)【国際特許分類】

   C07H 19/14 20060101AFI20160621BHJP

   C07H 21/04 20060101ALI20160621BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20160621BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160621BHJP

【ＦＩ】

   C07H19/14CSP

   C07H21/04 BZNA

   C12Q1/68 A

   C12N15/00 A

【請求項の数】10

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2012-21547(P2012-21547)

(22)【出願日】2012年2月3日

(65)【公開番号】特開2013-159574(P2013-159574A)

(43)【公開日】2013年8月19日

【審査請求日】2015年1月22日

(73)【特許権者】

【識別番号】899000057

【氏名又は名称】学校法人日本大学

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100128761

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 恭子

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】齋藤 義雄

(72)【発明者】

【氏名】齋藤 烈

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 梓

(72)【発明者】

【氏名】石下 真也

【審査官】 井上 千弥子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−０３７７９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／０８５２６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００６−０７６９０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 BALINTOVA, J. et al.，Anthraquinone as a Redox Label for DNA: Synthesis, Enzymatic Incorporation, and Electrochemistry of Anthraquinone-Modified Nucleosides, Nucleotides, and DNA，Chemistry - A European Journal，２０１１年，Vol. 17, No. 50，pp. 14063-14073

【文献】 JAGER, S. et al.，A Versatile Toolbox for Variable DNA Functionalization at High Density，Journal of the American Chemical Society，２００５年，Vol. 127, No. 43，pp. 15071-15082

【文献】 SEELA, F. et al.，Pyrrolo[2,3-d]pyrimidine Nucleosides: Synthesis and Antitumor Activity of 7-Substituted 7-Deaza-2'-Deoxyadenosines，Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids，２０００年，Vol. 19, No. 1 & 2，pp. 237-251

【文献】 CROW, F. W. et al.，Fast atom bombardment combined with tandem mass spectrometry for the determination of nucleosides，Analytical Biochemistry，１９８４年，Vol.139, No. 1，pp. 243-262

【文献】 BERGSTROM, D. E. et al.，Pyrrolo[2,3-d]pyrimidine nucleoside antibiotic analogs. Synthesis via organopalladium intermediates derived from 5-mercuritubercidin，Journal of Organic Chemistry，１９８１年，Vol. 46, No. 7，pp. 1423-1431

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｈ

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：

【化1】

［式中、環Ａ^１及び環Ａ^２は、ナフチレン基であり、
Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、
Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_１〜Ｃ_１０アシル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、シアノ基、ハロゲン原子、ニトロ基、置換基を有していてもよいアミノ基（−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、水酸基、チオール基及びＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基からなる群より選ばれる置換基であり、
ｍ及びｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、０、１又は２であり、
Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。］
で示されるデアザプリンヌクレオシド誘導体。

【請求項2】

前記Ｒ^１及びＲ^２が、水素原子である、請求項１記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体。

【請求項3】

前記置換基Ｙ^１及びＹ^２が、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_１〜Ｃ_１０アシル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基（−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、シアノ基、ハロゲン原子、ニトロ基及びチオール基からなる群より選ばれるものである、請求項１又は２に記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体。

【請求項4】

前記置換基Ｙ^１及びＹ^２が、シアノ基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体。

【請求項5】

下記式Ｉ（ａ）又はＩＩ（ａ）のいずれかで示される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体。

【化2】

［式中、Ｙ^１及びＹ^２の定義は、前記と同様である。］

【請求項6】

極性環境の変化に応答して蛍光発光波長が変化するものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体。

【請求項7】

下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：

【化3】

［式中、環Ａ^１及び環Ａ^２は、ナフチレン基であり、
Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、
Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_１〜Ｃ_１０アシル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、シアノ基、ハロゲン原子、ニトロ基、置換基を有していてもよいアミノ基（−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、水酸基、チオール基及びＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基からなる群より選ばれる置換基であり、
ｍ及びｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、０、１又は２であり、
Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、
ｓ及びｔは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１、２又は３である。］
で示されるデアザプリンヌクレオチド誘導体。

【請求項8】

前記Ｒ^１及びＲ^２が、水素原子である、請求項７記載のデアザプリンヌクレオチド誘導体。

【請求項9】

ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが請求項７又は８記載のデアザプリンヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体。

【請求項10】

請求項９記載のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、７−デアザプリンヌクレオシドのＣ７位に二重結合又は三重結合を介して蛍光分子が導入されてなるデアザプリンヌクレオシド誘導体に関する。また本発明は、該デアザプリンヌクレオシド誘導体を含むデアザプリンヌクレオチド誘導体、さらには少なくとも１つのヌクレオチドが該デアザプリンヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体に関する。

【背景技術】

【0002】

周囲の極性環境の違いによって蛍光発光波長を変化させる化合物については、これまでにも多く報告されている。同様の蛍光ヌクレオシドについても報告例がある。
本願発明者らも、先に、プリン塩基のＣ８位に二重結合又は三重結合を介して蛍光分子を導入してなる化合物（次式で示される化合物。以下、「Ｃ８位置換プリン塩基誘導体」という。）が周囲の極性環境の違いによって蛍光発光波長を大きく変化させることを報告した（例えば、特開２０１１−３７７９６号公報（特許文献１）、Tetrahedron Letters 51 (2010) 2606-2609（非特許文献１）参照。）

【化1】

［式中、環Ａ^１及び環Ａ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、２価又は３価の芳香環であり、Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、アシル基、アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基、シアノ基、チオール基、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びＣ_１〜Ｃ_２０炭化水素基からなる群より選ばれる置換基であり、ｍ及ｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１又は２であり、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。］
周囲の極性環境の違いによって蛍光発光波長を変化させる化合物は、対象物質の極性環境の変化を色の違いによって検出できるため、遺伝子検出用のプローブ、タンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用のプローブなどとしての利用が期待される。例えば、ＤＮＡ中の識別したい塩基の対面に蛍光ヌクレオシドを導入したプローブＤＮＡを作製し、対面塩基とのマッチ−ミスマッチの違いによる周辺極性環境の変化を利用することで、目的とする塩基の種類を色の違いで識別することができるため、このような化合物は遺伝子検出用のプローブとして有用である。
しかし、一般的に、プリン塩基のＣ８位に置換基を導入すると、置換基とＤＮＡの糖−リン酸バックボーンとが衝突し、その上、ヌクレオシドの糖と塩基とが通常のａｎｔｉ配座からｓｙｎ配座へと反転しやすくなってしまうため、Ｃ８位に置換基を導入したヌクレオシドを用いた場合にはＤＮＡの二重らせん構造が不安定化することが知られている。ＤＮＡの二重らせん構造が不安定化すると、その影響によっても周囲の極性環境が変化してしまうため、蛍光ヌクレオシドと対面塩基とのマッチ−ミスマッチの違いによる周辺極性環境の変化を正確に検出できない場合がある。
先のＣ８位置換塩基誘導体は、光学特性の面では優れていたが、より精度の高い遺伝子検出用のプローブとして実用化するためには分子の改良が必要とされている。
ところで、Synthesis, June 1996, 726-730（非特許文献２）では、７−デアザアデノシンのＣ７位に三重結合を介してフェニル基を導入してなる化合物が記載されているが、この論文は７−アルキニル−２’−デオキシツベルシジンの合成方法に関するものであり、化合物の蛍光発光波長の変化や蛍光プローブとしての利用については着目されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１１−３７７９６号公報（特許文献１）

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Tetrahedron Letters 51 (2010) 2606-2609

【非特許文献2】Synthesis, June 1996, 726-730

【非特許文献3】Tetrahedron Letters 52 (2011) 4726-4729

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

このような状況下、従来の分子の良い光学特性を維持しつつ、ＤＮＡに導入した場合にもＤＮＡの二重らせん構造を不安定化しない新規な蛍光核酸及びそれを利用したプローブの開発が求められている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本願発明者らは、従来技術の課題を解決するため、ＤＮＡを構成する天然のヌクレオシドであるアデノシン又はグアノシンと同様の水素結合パターンを有する７−デアザプリンヌクレオシドを用いて新規な蛍光核酸の開発を試みた。アデノシン又はグアノシンの７位は窒素原子であるため７位での化学修飾は通常不可能であるが、７−デアザアデノシン又は７−デアザグアノシンでは、７位がＣＨとなっており、その位置での化学修飾が可能である。また、プリン塩基の７位はＤＮＡに導入した際にＤＮＡの主溝に位置し、大きな空間が空いていることから、Ｃ８位を修飾した時のようなＤＮＡの二重らせん構造の不安定化は見られないと考えられる。さらに、先の化合物では、周囲の極性環境の違いによる蛍光発光波長の変化をより大きくするために、分子内に電子供与性及び電子吸引性の置換基を導入するように設計しており、核酸塩基が電子供与性基の役割を担っていたが、分子計算を行った結果、７−デアザプリン塩基は天然の核酸塩基と同程度がそれ以上の電子供与性を示すと予測され、この点からも好ましい分子設計であるといえる。
本願発明者らは、これらの予測の下、７−デアザアデノシンのＣ７位に効果的に共役構造を形成するように三重結合を介して電子供与性の蛍光分子を導入してなる化合物を合成した（Tetrahedron Letters 52 (2011) 4726-4729（非特許文献３）、下記式参照。）。

【化2】

しかし、この化合物は、蛍光発光波長を大きく変化させることはできるものの、ＤＮＡに導入した場合にＤＮＡの二重らせん構造を十分に安定化することができなかった。
そこで、本願発明者らは、さらに鋭意研究した結果、式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物が、従来のヌクレオシド誘導体の良い光学特性を維持しつつ、ＤＮＡに導入した場合にＤＮＡの二重らせん構造を不安定化しないことを見出して、本発明を完成させるに至った。

【0007】

すなわち、本発明は、以下に示したデアザプリンヌクレオシド誘導体、デアザプリンヌクレオチド誘導体及び少なくとも１つのヌクレオチドがデアザプリンヌクレオチド誘導体であるポリヌクレオチド誘導体ならびに該ポリヌクレオチド誘導体を含むプローブに関するものである。
［１］下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：

【化3】

［式中、環Ａ^１及び環Ａ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_６〜Ｃ_１８芳香環であり、
Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、
Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_１〜Ｃ_１０アシル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、シアノ基、ハロゲン原子、ニトロ基、置換基を有していてもよいアミノ基（−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、水酸基、チオール基及びＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基からなる群より選ばれる置換基であり、
ｍ及びｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、０、１又は２であり、
Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、
但し、環Ａ^１がフェニル基であり、Ｘ^１が炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、ｍが０であり、且つ、Ｒ^１が水素原子である場合を除く。］
で示されるデアザプリンヌクレオシド誘導体。
［２］前記Ｒ^１及びＲ^２が、水素原子である、［１］記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体。
［３］前記環Ａ^１及び環Ａ^２が、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基及びフェナントリレン基からなる群より選ばれるものである、［１］又は［２］記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体。
［４］前記環Ａ^１及び環Ａ^２が、ナフチレン基である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体。
［５］前記置換基Ｙ^１及びＹ^２が、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_１〜Ｃ_１０アシル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、シアノ基、ハロゲン原子、ニトロ基及びチオール基からなる群より選ばれるものである、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体。
［６］前記置換基Ｙ^１及びＹ^２が、シアノ基である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体。
［７］下記式Ｉ（ａ）又はＩＩ（ａ）のいずれかで示される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体。

【化4】

［式中、Ｙ^１及びＹ^２の定義は、前記と同様である。］
［８］極性環境の変化に応答して蛍光発光波長が変化するものである、［１］〜［７］のいずれか１項に記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体。
［９］下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：

【化5】

［式中、環Ａ^１及び環Ａ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_６〜Ｃ_１８芳香環であり、
Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、
Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_１〜Ｃ_１０アシル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、シアノ基、ハロゲン原子、ニトロ基、置換基を有していてもよいアミノ基（−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、水酸基、チオール基及びＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基からなる群より選ばれる置換基であり、
ｍ及びｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、０、１又は２であり、
Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、
ｓ及びｔは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１、２又は３であり、
但し、環Ａ^１がフェニル基であり、Ｘ^１が炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、ｍが０であり、且つ、Ｒ^１が水素原子である場合を除く。］
で示されるデアザプリンヌクレオチド誘導体。
［１０］前記Ｒ^１及びＲ^２が、水素原子である、［９］記載のデアザプリンヌクレオチド誘導体。
［１１］ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが［９］又は［１０］記載のデアザプリンヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体。
［１２］［１１］記載のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブ。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、７−デアザプリン塩基のＣ７位に二重結合又は三重結合を介して蛍光分子を導入してなる新規なデアザプリンヌクレオシド誘導体、該デアザプリンヌクレオシド誘導体にリン酸がエステル結合してなるデアザプリンヌクレオチド誘導体、さらには少なくとも１つのヌクレオチドが、該デアザプリンヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体が得られる。
本発明の好ましいデアザプリンヌクレオシド誘導体は、周囲の極性環境の違いによって蛍光発光波長を変化させることができる。このような本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体を導入してなるポリヌクレオチド誘導体は、周囲の極性環境の変化を色の変化によって検出することができるので、遺伝子検出用プローブあるいはタンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用プローブなどとして利用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】本発明の実施例化合物であるデアザプリンヌクレオシド誘導体(5b)を各種溶媒に溶かして得られる溶液の蛍光発光波長を示したグラフ及び蛍光発光波長とその変化量を示した表(表１Ａ)、ならびに本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体(5b)を含むオリゴヌクレオチドＤＮＡ(ODN1(5b)に各種相補鎖(ODN2(N)(N = A,G,C,T))を加えたときのTm値とその変化量を示した表(表１Ｂ)である。

【図2】本発明の実施例化合物であるデアザプリンヌクレオシド誘導体(5c)を各種溶媒に溶かして得られる溶液の蛍光発光波長を示したグラフ及び蛍光発光波長とその変化量を示した表(表２Ａ)、ならびに本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体(5c)を含むオリゴヌクレオチドＤＮＡ(ODN1(5c)に各種相補鎖(ODN2(N)(N = A,G,C,T))を加えたときのTm値とその変化量を示した表(表２Ｂ)である。

【図3】比較例化合物である化合物(C1)を各種溶媒に溶かして得られる溶液の蛍光発光波長を示したグラフ及び蛍光発光波長とその変化量を示した表(表３Ａ)、ならびに比較例化合物である化合物(C1)を含むオリゴヌクレオチドＤＮＡ(ODN1(C1)に各種相補鎖(ODN2(N)(N = A,G,C,T))を加えたときのTm値とその変化量を示した表(表３Ｂ)である。

【図4】比較例化合物である化合物(C2)を各種溶媒に溶かして得られる溶液の蛍光発光波長を示したグラフ及び蛍光発光波長とその変化量を示した表(表４Ａ)、ならびに比較例化合物である化合物(C2)を含むオリゴヌクレオチドＤＮＡ(ODN1(C2)に各種相補鎖(ODN2(N)(N = A,G,C,T))を加えたときのTm値とその変化量を示した表(表４Ｂ)である。

【図5】比較例化合物である化合物(C3)を各種溶媒に溶かして得られる溶液の蛍光発光波長を示したグラフ及び蛍光発光波長とその変化量を示した表(表５Ａ)、ならびに比較例化合物である化合物(C3)を含むオリゴヌクレオチドＤＮＡ(ODN1(C3)に各種相補鎖(ODN2(N)(N = A,G,C,T))を加えたときのTm値とその変化量を示した表(表５Ｂ)である。

【図6】比較例化合物である化合物(C4)を各種溶媒に溶かして得られる溶液の蛍光発光波長を示したグラフ及び蛍光発光波長とその変化量を示した表(表６Ａ)、ならびに比較例化合物である化合物(C4)を含むオリゴヌクレオチドＤＮＡ(ODN1(C4)に各種相補鎖(ODN2(N)(N = A,G,C,T))を加えたときのTm値とその変化量を示した表(表６Ｂ)である。

【図7】本発明の実施例化合物であるデアザプリンヌクレオシド誘導体(5b)を各種溶媒に溶かして得られる溶液の蛍光発光を観察した写真である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体、デアザプリンヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド誘導体及びプローブ等について詳細に説明する。

【0011】

本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体は、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物である。

【化6】

［式中、環Ａ^１及び環Ａ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_６〜Ｃ_１８芳香環であり、
Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、
Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_１〜Ｃ_１０アシル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、シアノ基、ハロゲン原子、ニトロ基、置換基を有していてもよいアミノ基（−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、水酸基、チオール基及びＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基からなる群より選ばれる置換基であり、
ｍ及びｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、０、１又は２であり、
Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、
但し、環Ａ^１がフェニル基であり、Ｘ^１が炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、ｍが０であり、且つ、Ｒ^１が水素原子である場合を除く。］

【0012】

本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体は、７−デアザプリン骨格のＣ７位に炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合を介して蛍光分子を導入するように設計されている。本発明の好ましいデアザプリンヌクレオシド誘導体は、周辺環境たとえば極性環境の変化に応答して蛍光発光波長が変化するため、周辺環境（極性環境）の変化を色の変化によって識別するプローブ等として利用可能である。

【0013】

本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体において、７−デアザプリン塩基と結合する五炭糖は、２−デオキシリボースでもリボースでもよく、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体をヌクレオチドに導入してＤＮＡ型のプローブとして用いるときは、Ｒ^１及びＲ^２は水素原子が好ましく、ＲＮＡ型のプローブとして用いるときは、Ｒ^１及びＲ^２は水酸基が好ましい。

【0014】

Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）である。Ｘ^１及びＸ^２は、共役構造をより高めるため、炭素−炭素三重結合が好ましい。

【0015】

環Ａ^１及び環Ａ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_６〜Ｃ_１８芳香環である。前記芳香環は、炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合を介してデアザプリン塩基との間に共役構造を形成できるものであれば特に制限されない。このような芳香環としては、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントリレン基及びピレニレン基などが挙げられる。中でも、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基及びフェナントリレン基が好ましく、ナフチレン基が特に好ましい。

【0016】

環Ａ^１及び環Ａ^２は、置換基Ｙ^１又はＹ^２を一つ又は二つ有していてもよい。
置換基Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_１〜Ｃ_１０アシル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、シアノ基、ハロゲン原子、ニトロ基、置換基を有していてもよいアミノ基（−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、水酸基、チオール基及びＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基からなる群より選ばれる。
中でも、置換基Ｙ^１及びＹ^２としては、電子吸引性の基であることが好ましい。置換基Ｙ^１及びＹ^２が電子吸引性の基であると、二重結合又は三重結合を介して、デアザプリン塩基部分と置換基Ｙ^１又はＹ^２を有する環Ａ^１及び環Ａ^２との間で、共役電子の「push-pull」構造が形成されるため、蛍光発光波長の変化をより大きくすることができ、蛍光発光の色による識別をより容易にすることができる。具体的には、Ｃ_１〜Ｃ_１０アシル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、シアノ基、ハロゲン原子、ニトロ基及びチオール基からなる群より選ばれる置換基が好ましい。特にシアノ基が好ましい。
置換基Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ、前記芳香環のいずれの位置で結合していてもよい。共役構造がより安定化することから、少なくとも一つは炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合に対してパラ位で結合していることが好ましい。

【0017】

ｍ及びｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、０、１又は２であり、１が好ましい。

【0018】

なお、本明細書において、「Ｃ_１〜Ｃ_１０アシル基」は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキルカルボニルが好ましく、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルカルボニルがより好ましく、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルカルボニルがさらに好ましい。アシル基の例としては、制限するわけではないが、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ベンゾイル、メチルベンゾイル、ジメチルベンゾイル、メチルエチルベンゾイル、ジエチルベンゾイル、ベンジルカルボニル等が挙げられる。

【0019】

本明細書において、「Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシカルボニル基」は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシカルボニル基が好ましく、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシカルボニル基がより好ましい。アルコキシカルボニル基の例としては、制限するわけではないが、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル等が挙げられる。

【0020】

本明細書において、「カルボン酸アミド基」は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ^ａＲ^ｂで表される基である。式中、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基であり、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_６アルキル基が好ましく、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_４アルキル基がより好ましい。

【0021】

本明細書において、「ハロゲン原子」は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。

【0022】

本明細書において、「Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基」は、線状でもよいし、枝分かれでもよく、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基が好ましく、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル基がより好ましい。アルキル基の例としては、制限するわけではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ドデカニル等が挙げられる。

【0023】

本明細書において、「置換基を有していてもよいアミノ基」は、−ＮＲ^ａＲ^ｂで表される。式中、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。置換基を有していてもよいアミノ基の例としては、制限するわけではないが、アミノ基、ジメチルアミノ基、メチルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルアミノ基等が挙げられる。

【0024】

本発明の好ましいデアザプリンヌクレオシド誘導体としては、下記式Ｉ（ａ）又はＩＩ（ａ）で示される化合物が挙げられる。式中のＹ^１及びＹ^２の定義は上記と同じである。

【0025】

【化7】

【0026】

上記のとおり、本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体は、デアザプリン骨格のＣ７位に二重結合又は三重結合を介して蛍光分子を導入し共役構造を形成させることで、蛍光発光波長が変化するように設計されている。蛍光発光波長の変化の程度は、周囲の極性環境によって異なる。本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体を利用することで、周囲の極性環境の違いを蛍光発光の色の変化によって識別することが可能である。例えば、本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体は、ＤＮＡ又はＲＮＡ中の局所的な極性環境の違いにより対面塩基の種類を識別する遺伝子検出用のプローブとして利用することができる。また、本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体は、タンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用プローブとして利用することができる。

【0027】

本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体は、７−デアザアデノシン又は７−デアザグアノシンなどのＣ７位に蛍光分子を導入することにより簡便に製造することができる。

【0028】

本発明の式（Ｉ）で示されるデアザプリンヌクレオシド誘導体は、例えば、下記のスキームＡに従って製造することができる。

【化8】

【0029】

＜工程（ａ）＞
まず、化合物１を溶媒に溶かし、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）、ヨウ化銅、トリメチルシリルアセチレン、トリエチルアミンを加えて、４０〜６０℃の範囲内で１〜４時間撹拌する。その後、反応溶媒を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物２を得る。
トリメチルシリルアセチレンは、化合物１に対して等モルないしやや過剰に用いることが好ましく、その使用量は、化合物１に対して１．２〜１．５（モル倍量）が好ましい。
テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）及びヨウ化銅は、触媒量で用いればよく、化合物１に対して０．０１〜０．１（モル倍量）が好ましい。
トリエチルアミンは、化合物１に対して５〜１０（モル倍量）の範囲で用いることが好ましい。
溶媒は、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、塩化メチレン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物などを用いることができる。

【0030】

＜工程（ｂ）＞
次に、化合物２を溶媒に溶かし、テトラブチルアンモニウムフルオリドを加えて、室温（２０〜２５℃）で１〜３時間撹拌する。その後、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物３を得る。
テトラブチルアンモニウムフルオリドの使用量は、化合物１に対して１．１〜１．２（モル倍量）の範囲で用いることが好ましい。
溶媒は、工程（ａ）で用いたものと同じものを用いることができる。

【0031】

＜工程（ｃ）＞
次に、化合物３と化合物４とを溶媒に溶かし、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）、ヨウ化銅、トリエチルアミンを加えて、５０〜６０℃の範囲内で１〜４時間撹拌する。その後、反応溶媒を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して目的の化合物（式（Ｉ’）で示される化合物）を得る。
化合物３は、化合物４に対して等モルないしやや過剰に用いることが好ましい。なお、化合物４は、公知の化合物であり、Synthesis, June 1996, 726-730（非特許文献２）記載の方法により簡便に製造することができる。また市販品を用いてもよい。例えば、2Daybiochem Co., Ltd.,社製「7-Deaza-7-iodo-2’-deoxyadenosine」などを用いることができる。
テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）及びヨウ化銅は、触媒量で用いればよく、化合物４に対して０．０１〜０．１（モル倍量）が好ましい。
トリエチルアミンは、化合物４に対して５〜１０（単位：モル倍量）の範囲で用いることが好ましい。
溶媒は、工程（ａ）で用いたものと同じものを用いることができる。

【0032】

上記いずれの反応も窒素又はアルゴン雰囲気下で行うことが好ましい。

【0033】

なお、上記では、式（Ｉ）においてＸ^１が炭素−炭素三重結合である化合物の製造方法を記載したが、式（Ｉ）においてＸ^１が炭素−炭素二重結合である化合物の製造方法は、工程（ａ）においてトリメチルシリルアセチレンに代えて、テトラビニルすず（ＩＶ）を用いることを除いて、スキームＡと同様である。

【0034】

本発明の式（ＩＩ）で示されるデアザプリンヌクレオシド誘導体は、下記のスキームＢに従って製造することができる。

【化9】

【0035】

スキームＢの工程（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ、スキームＡの工程（ａ）及び（ｂ）と同じである。スキームＢの工程（ｃ）は、化合物４に代えて、化合物４’を用いることを除いてスキームＡの工程（ｃ）と同様である。なお、化合物４’は、公知の化合物であり、Synthesis, June 1996, 726-730（非特許文献２）記載の方法により簡便に製造することができる。また市販品を用いてもよい。例えば、2Daybiochem Co., Ltd.,社製「7-Deaza-7-iodo-2’-deoxyguanosine」などを用いることができる。

【0036】

本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体は、上記のように７−デアザヌクレオシドを利用して簡便な方法で製造することができるので、実用性が高い。

【0037】

次に、本発明のヌクレオチド誘導体について述べる。
本発明のヌクレオチド誘導体は、上述した本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体にリン酸がエステル結合したものであり、下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：

【化10】

［式中、環Ａ^１及び環Ａ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_６〜Ｃ_１８芳香環であり、
Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、
Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ_１〜Ｃ_１０アシル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、シアノ基、ハロゲン原子、ニトロ基、置換基を有していてもよいアミノ基（−ＮＲ^ａＲ^ｂで表され、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはそれぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。）、水酸基、チオール基及びＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基からなる群より選ばれる置換基であり、
ｍ及びｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、０、１又は２であり、
Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、
ｓ及びｔは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１、２又は３であり、
但し、環Ａ^１がフェニル基であり、Ｘ^１が炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、ｍが０であり、且つ、Ｒ^１が水素原子である場合を除く。］
で示される。

【0038】

式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）におけるＡ^１、Ａ^２、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｙ^１、Ｙ^２、Ｒ^１、Ｒ^２、ｍ、ｎは、式（Ｉ）又は（ＩＩ）におけるＡ^１、Ａ^２、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｙ^１、Ｙ^２、Ｒ^１、Ｒ^２、ｍ、ｎと同義であり、好ましい例も同じである。
ｓ及びｔはそれぞれ１、２又は３であるが、１又は３が好ましく、ポリヌクレオチド誘導体に容易に導入できることから３が特に好ましい。

【0039】

本発明のヌクレオチド誘導体（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の一リン酸体（ｓ，ｔ＝１）は、通常、本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体（Ｉ）又は（ＩＩ）をトリメチルホスファイトなどの溶媒に溶解し、０℃でオキシ塩化リンを加えて反応させた後に水を加えることで簡単に合成することができる。また、三リン酸体（ｓ，ｔ＝３）は、水を加える前にトリブチルアンモニウムピロリン酸（二リン酸）を加えるステップを加えることを除いて一リン酸体と同様にして合成することができる。

【0040】

また、本発明のヌクレオチド誘導体（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の三リン酸体は、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡに容易に導入することができ、ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが本発明のヌクレオチド誘導体で置換された本発明のポリヌクレオチド誘導体を得ることができる。あるいは、実施例２に示したように、本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールを反応させ、その後、触媒量の４，４’−ジメトキシトリチルクロリドを加えて反応させて得られる化合物を、トリエチルアミンの存在下、更に２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロアミジトと反応させて、得られたアミジト体を直接ＤＮＡ自動合成機にかけることで、本発明のポリヌクレオチド誘導体を得ることができる。

【0041】

本発明において、ポリヌクレオチド誘導体はオリゴヌクレオチド誘導体であってもよい。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の塩基数は特に制限されなく、例えば２から１０００が好ましく、２から２００がより好ましく、２から１００が特に好ましい。

【0042】

本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ＤＮＡ中の局所的な極性環境の違いを利用して対面塩基の種類を識別する塩基識別型蛍光核酸塩基（遺伝子検出用プローブ）として、あるいは、タンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用のプローブとして用いることができる。

【0043】

本発明のプローブを標的ＤＮＡとハイブリダイズさせフルマッチしたときの極性環境の変化による前記プローブの蛍光発光の色の違いで標的ＤＮＡの対面塩基を識別することができる。

【0044】

以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は、下記の実施例に制限されるものではない。

【実施例1】

【0045】

下記スキーム１に従って本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体を合成した。

【化11】

【0046】

化合物(2a)の製造
化合物(1a)(500mg, 2.41mmol)を無水DMF(5ml) に溶かし、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(27.9mg, 0.024mmol)、ヨウ化銅(4.6mg, 0.024mmol)、トリメチルシリルアセチレン(409μl, 2.89mmol)、トリエチルアミン(0.5ml) を加えて、60℃で1時間撹拌した。その後、反応溶媒を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサンのみ)で精製して化合物(2a)(0.4207g, 77.67%)を得た。

【0047】

化合物(2b)の製造
化合物(1b)(500mg, 2.15mmol)を無水DMF(5ml)に溶かし、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(24.9mg, 0.021mmol)、ヨウ化銅(4.1mg, 0.021mmol)、トリメチルシリルアセチレン(365μl, 2.58mmol) 、トリエチルアミン(0.5ml)を加えて、60℃で1時間撹拌した。その後、反応溶媒を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=3:1)で精製して化合物(2b)(0.5068g, 94.35%)を得た。

【0048】

化合物(2c)の製造
化合物(1c)(100mg, 0.34mmol) を無水DMF(5ml) に溶かし、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(38.7mg, 0.034mmol )、ヨウ化銅(6.4mg, 0.034mmol)、トリメチルシリルアセチレン(71.1μl, 0.50mmol ) 、トリエチルアミン(0.5ml) を加えて、60℃で1時間撹拌した。その後、反応溶媒を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=3:1)で精製して化合物(2c)(0.100g, quantitative)を得た。

【0049】

化合物(3a)の製造
化合物(2a)(400mg, 1.78mmol)をTHF(10ml)で溶かし、テトラブチルアンモニウムフルオリド( 557μl, 1.96ml)を加えて、室温で3時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー(TLC)で原料の消失を確認した後、分液操作を行い(酢酸エチル/10% HCl水)の条件で反応物を抽出した有機層を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサンのみ)で精製して化合物(3a)(0.2699g, 94.58%) を得た。

【0050】

化合物(3b)の製造
化合物(2b)(453mg, 1.81mmol)をTHF(17ml)で溶かし、テトラブチルアンモニウムフルオリド(620μl, 2.18ml) を加えて、室温で2時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー(TLC)で原料の消失を確認した後、分液操作を行い(酢酸エチル/10% HCl水)の条件で反応物を抽出した有機層を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=5:1) で精製して化合物(3b)(0.3211g, 99.18%) を得た。

【0051】

化合物(3c)の製造
化合物(2c)(100mg, 0.374mmol) をTHF(8ml)で溶かし、テトラブチルアンモニウムフルオリド( 161μl, 1.12ml) を加えて、室温で3時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー(TLC)で原料の消失を確認した後、分液操作を行い(酢酸エチル/10% HCl水)の条件で反応物を抽出した有機層を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=3:1) で精製して化合物(3c)(0.0928g, quantitative) を得た。

【0052】

化合物(5a)の製造
化合物(4)(100mg, 0.36mmol)と化合物(3a)(42.1mg, 0.43mmol)をDMF(5ml)で溶かし、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(42.1mg, 0.036mmol) 、ヨウ化銅(2.1mg, 0.010mmol)、トリエチルアミン(5ml) を加えて、60℃で1時間撹拌した。反応溶媒を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール:クロロホルム=1:10) で精製して化合物(5a)(0.1343g, 91.99%)を得た。
¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 2.24 (ddd, J = 2.6, 5.8, 13.1 Hz, 1H), 2.54 (m, 1H, overlapped with DMSO), 3.52-3.64 (complex, 2H), 3.86 (m, 1H), 4.38 (m, 1H), 5.09 (m, 1H), 5.31 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.54 (m, 1H), 6.87 (br, 2H), 7.57-7.60 (complex, 2H), 7.66-7.69 (complex, 2H), 7.94-7.97 (complex, 4H), 8.23 (s, 1H)

【0053】

化合物(5b)の製造
化合物(4)(150mg, 0.39mmol)と化合物(3b)(84.8mg, 0.478mmol) をDMF(5ml)で溶かし、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(46.0mg, 0.04mmol)、ヨウ化銅 (7.6mg, 0.04mmol)、トリエチルアミン(0.5ml)を加えて、60℃で1時間撹拌した。反応溶媒を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (メタノール:クロロホルム=1:30) で精製して化合物(5b)(0.1400g, 84.00%)を得た。
¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 2.24 (ddd, J = 2.8, 6.0, 13.2 Hz, 1H), 2.54 (m, 1H, overlapped with DMSO), 3.55-3.63 (complex, 2H), 3.86 (m, 1H), 4.38 (m, 1H), 5.12 (m, 1H), 5.32 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 6.0, 7.8 Hz, 1H), 6.88 (br, 2H), 7.82-7.86 (complex, 2H), 7.98 (s, 1H), 8.09-8.14 (complex, 2H) 8.18 (s, 1H), 8.34 (m, 1H), 8.61 (m, 1H)

【0054】

化合物(5c)の製造
化合物(4)(50mg, 0.13mmol)と化合物(3c)(28.5mg, 0.15mmol)をDMF(5ml)で溶かし、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(76.8mg, 0.07mmol) 、ヨウ化銅(12.6mg, 0.07mmol)、トリエチルアミン(0.3ml)を加えて、55℃で1時間撹拌した。反応溶媒を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール:クロロホルム=1:10) で精製して化合物(5c)(0.0490g, 84.98%)を得た。
¹H-NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ 2.35 (ddd, J = 2.7, 6.0, 13.4 Hz, 1H), 2.66 (ddd, J = 5.9, 8.0, 13.4 Hz, 1H), 3.05 (s, 6H), 3.73 (dd, J = 3.6, 12.1 Hz, 1H), 3.81 (dd, J = 3.3, 12.1 Hz, 1H), 4.02 (m, 1H), 4.53 (m, 1H), 6.51 (dd, J = 6.0, 8.0 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 2.6, 9.1 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 1.6, 8.6 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.66-7.68 (complex, 2H), 7.85 (m, 1H), 8.11 (s, 1H)

【実施例2】

【0055】

下記スキーム２に従って本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体をＤＮＡ鎖に導入した。

【化12】

【0056】

化合物(6a)の製造
化合物(5a)(180mg, 0.449mmol)をDMF(5ml)で溶かし、DMFジエチルアセタール(95μl, 0.585mmol)を加えて、60℃で2時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認した後、反応溶媒を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール:クロロホルム=1:30 )で精製して化合物(6a)(0.2033g, 99.40%)を得た。
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 2.28 (m, 1H), 2.98 (ddd, J = 5.1, 9.2, 13.1 Hz, 1H), 3.07 (s, 3H), 3.19 (s, 3H), 3.76 (m, 1H), 3.96 (dd, J = 1.6, 12.4 Hz, 1H), 4.18 (m, 1H), 4.71 (m, 1H), 6.27 (dd, J = 5.6, 9.2 Hz, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.42-7.48 (complex, 2H),7.54 (dd, J = 1.5, 8.5 Hz, 1H), 7.71-7.79 (complex, 3H), 8.00 (m, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.68 (s, 1H)

【0057】

化合物(6b)の製造
化合物(5b)(120mg, 0.282mmol)をDMF(5ml)で溶かし、DMFジエチルアセタール(55μl, 0.338mmol)を加えて、60℃で2時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認した後、反応溶媒を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール:クロロホルム=1:30 )で精製して化合物(6b)(0.1248g, 95.00%)を得た。
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 2.29 (m, 1H), 3.04 (ddd, J = 5.1, 9.4, 13.4 Hz, 1H), 3.14 (s, 3H), 3.22 (s, 3H), 3.78 (m, 1H), 3.98 (dd, J = 1.7, 12.6 Hz, 1H), 4.19 (m, 1H), 4.74 (m, 1H), 6.26 (dd, J = 5.6, 9.4 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.58 (dd, J = 1.4, 8.4 Hz, 1H), 7.65 (dd, J = 1.5, 8.3 Hz, 1H), 7.81 (complex, 2H), 8.01 (m, 1H), 8.17 (m, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.76 (s, 1H)

【0058】

化合物 (6c) の製造
化合物(5c)(60mg, 0.135mmol) をDMF(3ml)で溶かし、DMFジエチルアセタール(26μl, 0.162mmol)を加えて、60℃で2時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認した後、反応溶媒を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール:クロロホルム=1:10 )で精製して化合物(6c)(0.0640g, 95.08%)を得た。
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 2.27 (m, 1H), 3.07-3.15 (complex, 10H), 3.22 (s, 3H), 3.80 (m, 1H), 4.01 (dd, J = 1.7, 12.6 Hz, 1H), 4.21 (m, 1H), 4.79 (m, 1H), 6.24 (dd, J = 5.6, 9.5 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 2.6, 9.1 Hz, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.46 (dd, J = 1.6, 8.6 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.88 (m, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.74 (s, 1H)

【0059】

化合物(7a)の製造
化合物(6a)(200mg, 0.439mmol)を無水ピリジン(8ml)に溶解し、4,4'-ジメトキシトリチルクロリド(193mg, 0.571mmol)を加えて、室温で6時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認した後、減圧留去して分液操作を行い(酢酸エチル/炭酸水素ナトリウム水溶液)、有機層を回収して繰り返し減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(メタノール:クロロホルム/トリエチルアミン=30:1/10ml)で精製し、化合物(7a)(0.3101g, 93.17%)を得た。
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 2.50 (ddd, J = 4.4, 6.4, 13.6 Hz, 1H), 2.59 (m, 1H), 3.12 (s, 3H), 3.24 (s, 3H), 3.36 (dd, J = 4.8, 10.2 Hz, 1H), 3.44 (dd, J = 4.4, 10.2 Hz, 1H), 3.72 (s, 6H), 4.11 (m, 1H), 4.61 (m, 1H), 6.76 (m, 1H), 6.82 (m, 2H), 6.85 (m, 2H), 7.19 (m, 1H), 7.30 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.36 (m, 2H), 7.44-7.52 (complex, 4H), 7.54 (dd, J = 1.6, 8.5 Hz, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.76-7.83 (complex, 3H), 7.99 (m, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.75 (s, 1H)

【0060】

化合物(7b)の製造
化合物(6b)(100mg, 0.208mmol)を無水ピリジン(10ml)に溶解し、4,4'-ジメトキシトリチルクロリド(91.6mg, 0.270mmol)を加えて、室温で6時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認した後、減圧留去して分液操作を行い(酢酸エチル/炭酸水素ナトリウム水溶液)、有機層を回収して繰り返し減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(メタノール:クロロホルム/トリエチルアミン=30:1/10ml)で精製し、化合物(7b)(0.1800g, quantitative)を得た。
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 2.52 (ddd, J = 4.4, 6.3, 13.5 Hz, 1H), 2.60 (m, 1H), 3.16 (s, 3H), 3.25 (s, 3H), 3.37-3.45 (complex, 2H), 3.72 (s, 6H), 4.12 (m, 1H), 4.64 (m, 1H), 6.75 (m, 1H), 6.82 (m, 2H), 6.85 (m, 2H), 7.19 (m, 1H), 7.30 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 7.37 (m, 2H), 7.45-7.47 (complex, 2H), 7.60-7.65 (complex, 3H), 7.82-7.84 (complex, 2H), 7.98 (m, 1H), 8.20 (m, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.79 (s, 1H)

【0061】

化合物(7c)の製造
化合物(6c)(80mg, 0.160mmol)を無水ピリジン(6ml)に溶解し、4,4'-ジメトキシトリチルクロリド(70mg, 0.209mmol)を加えて、室温で6時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認した後、減圧留去して分液操作を行い(酢酸エチル/炭酸水素ナトリウム水溶液)、有機層を回収して繰り返し減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (メタノール:クロロホルム/トリエチルアミ=25:1/10ml)で精製し、化合物(7c)(0.1032g, 80.53%)を得た。
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 2.48 (ddd, J = 4.6, 6.4, 13.6 Hz, 1H), 2.58 (m, 1H), 3.07 (s, 6H), 3.10 (s, 3H), 3.22 (s, 3H), 3.35 (dd, J = 5.0, 10.1 Hz, 1H), 3.43 (dd, J = 4.6, 10.1 Hz, 1H), 3.72 (s, 6H), 4.10 (m, 1H), 4.59 (m, 1H), 6.74 (m, 1H), 6.82 (m, 2H), 6.85 (m, 2H), 6.88 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.16 (m, 1H), 7.20 (m, 1H), 7.30 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.36 (m, 2H), 7.42-7.46 (complex, 3H), 7.51 (s, 1H), 7.57 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.84 (m, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.71 (s, 1H)

【0062】

化合物(8a)の製造
化合物(7a)(70mg, 0.0923mmol)を無水アセトニトリル(1.5ml)に溶解し、トリエチルアミン(1ml) 、2-シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト(150μl)を加えて、室温で1時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認した後、分液操作を行い(酢酸エチル/炭酸水素ナトリウム水溶液)、有機層を回収して繰り返し減圧留去した。残渣を無水アセトニトリル600μlで溶解し、コスモナイスフィルターSでろ過した。ろ液を減圧留去し、目的の化合物(8a)を粗生成物として得た。DNA合成には化合物(8a)の粗生成物をそのまま用いた。

【0063】

化合物(8b)の製造
化合物(7b)(100mg, 0.1277mmol)を無水アセトニトリル(2.0ml)に溶解し、トリエチルアミン(1ml) 、2-シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト(150μl) を加えて、室温で1時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認した後、分液操作を行い(酢酸エチル/炭酸水素ナトリウム水溶液)、有機層を回収して繰り返し減圧留去した。残渣を無水アセトニトリル600μlで溶解し、コスモナイスフィルターSでろ過した。ろ液を減圧留去し、目的の化合物(8b)を粗生成物として得た。DNA合成には化合物(8b)の粗生成物をそのまま用いた。

【0064】

化合物(8c)の製造
化合物(7c)(60mg, 0.0749mmol)を無水アセトニトリル(2.0ml)に溶解し、トリエチルアミン(1ml) 、2-シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト(150μl)を加えて、室温で1時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認した後、分液操作を行い(酢酸エチル/炭酸水素ナトリウム水溶液)、有機層を回収して繰り返し減圧留去した。残渣を無水アセトニトリル600μlで溶解し、コスモナイスフィルターSでろ過した。ろ液を減圧留去し、目的の化合物(8c)を粗生成物として得た。DNA合成には化合物 (8c) の粗生成物をそのまま用いた。

【0065】

ＤＮＡ合成
得られた化合物(8a)、(8b)及び(8c)をそれぞれ、アセトニトリル600μlに溶解し、ＤＮＡ自動合成機（製造元：アプライドバイオシステムズ社、型番：3400 DNAシンセサイザー）を用いてＤＮＡ鎖へ導入した。

【実施例3】

【0066】

［１］蛍光スペクトルの測定
実施例２で得られた化合物 (5b)及び(5c)について、それぞれ、各種溶媒（メタノール（MeOH）、エタノール（EtOH）、２−プロパノール（2-prOH）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）、アセトニトリル（MeCN）、テトラヒドロフラン（THF）、酢酸エチル（AcOEt）、クロロホルム（CHCl₃）、水（water））に溶解したときの蛍光スペクトル（λmax）及びその変化量（Δλem max）を次の手順に従って測定した。
化合物(5b)及び(5c)を各溶媒に溶解させ、濃度10μM（全量1ml）に調製した。600μlを石英セルに移し、分光蛍光光度計（製造元：島津製作所、型番：RF-5300PC）を用いて蛍光スペクトル（λmax）を測定した。また、溶媒ごとのλmaxから変化量（Δλem max）を算出した。
測定結果を図１及び２のグラフ及び表（表１Ａ及び２Ａ）にそれぞれ示す。参考として、Ｃ８位置換塩基誘導体及びTetrahedron Letters 52 (2011) 4726-4729（非特許文献３）記載の化合物についても同様の方法で各種溶媒に溶解したときの蛍光スペクトルの変化を観察した。測定結果を図３〜６のグラフ及び表（表３Ａ〜６Ａ）にそれぞれ示す。

【0067】

図１及び２のグラフ及び表に示されるとおり、本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体(5b)及び(5c)をそれぞれ各種溶媒に溶解すると、溶媒の種類（極性環境）に応じて蛍光発光波長が変化した。特に化合物(5b)では、蛍光発光波長の変化をより大きくすることができた。これは、化合物(5b)が置換基Ｙ^１に電子吸引性のシアノ基を有しており、三重結合を介して、デアザプリン塩基とシアノ基を有するビフェニル環との間で、共役電子の「push-pull」構造が形成されるため、極性環境の変化に応答して蛍光発光波長の変化をより効果的にすることができるためであると考えられる。
Ｃ８位置換塩基誘導体である化合物(C1)、(C2)及び(C3)、さらにはTetrahedron Letters 52 (2011) 4726-4729（非特許文献３）記載の化合物(C4)を用いた場合にも、極性環境の変化に応答して蛍光発光波長が変化した。

【0068】

［２］ＤＮＡ高次構造の熱安定性の評価
Tm値（融解温度：melting temperature）は、特定の条件下における固有のＤＮＡ高次構造の熱安定性の指標である。実施例２で得られた本発明の化合物(8b)及び(8c)をそれぞれＤＮＡ鎖に導入してなるオリゴヌクレオチドＤＮＡ（ODN1(X)、X = 5b, 5c）に各種相補鎖（N = A,G,C,T）を加えたときのTm値及びその変化量ΔTmを次の手順に従って測定し、ＤＮＡ二重らせん構造の熱安定性を評価した。
濃度2.5μMに調製したＤＮＡ溶液を８連マイクロセルに移し、紫外可視分光光度計（製造元：島津製作所、型番：UV-2550）を用いて４〜９０℃の範囲で測定を行い、中線法を用いてTm値を算出した。また、天然オリゴヌクレオチドＤＮＡのTm値をもとに、変化量ΔTmを算出した。
測定結果を図１及び２の表１Ｂ及び表２Ｂにそれぞれ示す。参考として、Ｃ８位置換塩基誘導体及びTetrahedron Letters 52 (2011) 4726-4729（非特許文献３）記載の化合物についても同様の方法でTm値及びその変化量ΔTmを測定した。測定結果を図３〜６の表３Ｂ〜表６Ｂにそれぞれ示す。

【0069】

なお、本測定に用いたオリゴヌクレオチドDNAの塩基配列は下表に示したとおりである。

【表1】

【0070】

表１Ｂ及び２Ｂに示されるとおり、本発明の化合物(5b)及び(5c)をそれぞれＤＮＡ鎖に導入したときは、Tm値の変化量が小さく、天然の核酸塩基と同程度のＤＮＡ二重鎖安定性を示した。特に、本発明の化合物(5b)をＤＮＡ鎖に導入した場合、相補鎖の対面塩基とマッチしたとき（すなわちODN1(5b)/ODN2(T)のとき）のTm値の変化量は０であり、天然の核酸塩基と同じＤＮＡ二重鎖安定性を示した。一方、表３Ｂ〜６Ｂに示されるとおり、比較例化合物(C1)〜(C4)を用いた場合はTm値の変化量が大きく、ＤＮＡの二重らせん構造を不安定化した。

【0071】

以上の結果に示されるとおり、本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体は、周囲の極性環境の違いに応答して蛍光発光波長を変化させることができ、しかもＤＮＡの二重らせん構造を不安定化することもないため、本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体をＤＮＡ中の識別したい塩基の対面に導入したプローブを作製し、対面塩基とのマッチ−ミスマッチの違いによる周辺極性環境の変化を利用することで、目的とする塩基の種類を蛍光発光の色の違いで識別することができる。本発明のプローブは、発光強度ではなく、蛍光発光の色の違いで識別することができるので、検査用キットとして一般の人にも利用しやすい。また、周囲の極性の程度を色で示すことができるので、タンパク質や細胞内の局所的な極性環境の調査を目的とするプローブとしても利用することができる。

【産業上の利用可能性】

【0072】

本発明のデアザプリンヌクレオシド誘導体は、周囲の極性環境の違いによって蛍光発光波長を変化させることができ、しかもＤＮＡ鎖に導入したときにＤＮＡ二重らせん構造を不安定化しないため、遺伝子検出用のプローブあるいはタンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用プローブなどとして幅広く利用できる。

【配列表フリーテキスト】

【0073】

配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]