特許 5946510 メラニン生成抑制剤、化粧料、及びメラニン生成抑制剤の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5946510

(24)【登録日】2016年6月10日

(45)【発行日】2016年7月6日

(54)【発明の名称】メラニン生成抑制剤、化粧料、及びメラニン生成抑制剤の製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/365 20060101AFI20160623BHJP

   A61K 8/97 20060101ALI20160623BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20160623BHJP

   A61K 31/19 20060101ALI20160623BHJP

   A61K 31/7024 20060101ALI20160623BHJP

   A61K 36/12 20060101ALI20160623BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20160623BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/365

   A61K8/97

   A61Q19/02

   A61K31/19

   A61K31/7024

   A61K36/12

   A61P17/00

【請求項の数】5

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2014-234698(P2014-234698)

(22)【出願日】2014年11月19日

(65)【公開番号】特開2016-98188(P2016-98188A)

(43)【公開日】2016年5月30日

【審査請求日】2015年11月30日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】505314022

【氏名又は名称】国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】000151966

【氏名又は名称】株式会社桃谷順天館

(74)【代理人】

【識別番号】100141586

【弁理士】

【氏名又は名称】沖中 仁

(74)【代理人】

【識別番号】100165685

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 信治

(72)【発明者】

【氏名】竹森 洋

(72)【発明者】

【氏名】熊谷 彩子

(72)【発明者】

【氏名】賀川 舞

(72)【発明者】

【氏名】伊東 祐美

(72)【発明者】

【氏名】川原 信夫

(72)【発明者】

【氏名】渕野 裕之

(72)【発明者】

【氏名】杉村 康司

(72)【発明者】

【氏名】黒井 梓

【審査官】 池田 周士郎

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１５０８１１４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特開２０００−１６９３５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−２４７８６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−０１６５８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 TANAKA, N. ET AL，Weitere Inhaltsstoffe von Pteris dispar Kunze，Chem Pharm Bull，１９７６年，Vol.24, No.8，pp.1965-1966

【文献】 MURAKAMI, T. ET AL，Chemische Untersuchungen der Inhaltsstoffe von Pteris dispar Kunze，Chem Pharm Bull，１９７６年，Vol.24, No.3，pp.549-551

【文献】 WANG, Fei ET AL，Pterisolic Acids A-F, New ent-Kaurane Diterpenoids from the Fern Pteris semipinnata，Chem Pharm Bull，２０１１年，Vol.59, No.4，pp.484-487

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ８／００− ８／９９

Ａ６１Ｑ １／００−９０／００

Ａ６１Ｋ ３１／３３−３１／８０

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｐ １７／００−１７／１８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（Ｉ）：

【化1】

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２は、それぞれＨ、ＯＨ、又はＣＨ_３であるか、Ｒ^１及びＲ^２が一緒になってＣＨ_２になり、
Ｒ^３及びＲ^４は、Ｈ又はＯＨであるとともに、少なくとも何れかがＯＨであり、
Ｒ^５は、Ｈ又はＯＨであり、
Ｒ^６は、Ｈ、グルコース基、ガラクトース基、キシロース基、又はマンノース基である。］
で示される化合物又はその塩を有効成分とするメラニン生成抑制剤。

【請求項2】

Ｒ^１、Ｒ^２は、一緒になってＣＨ_２であり、
Ｒ^３は、ＯＨであり、
Ｒ^４、Ｒ^５は、それぞれＨであり、
Ｒ^６は、Ｈ又はグルコース基である請求項１に記載のメラニン生成抑制剤。

【請求項3】

請求項１又は２に記載のメラニン生成抑制剤を含有する化粧料。

【請求項4】

請求項１又は２に記載のメラニン生成抑制剤を製造する方法であって、
アマクサシダ（Ｐｔｅｒｉｓ ｄｉｓｐａｒ Ｋｕｎｚｅ）乾燥物をメタノール、エタノール、ブチレングリコール、メタノール水溶液、エタノール水溶液、ブチレングリコール水溶液、ヘキサン、及び酢酸エチルからなる群から選択される少なくとも１種類の溶媒に浸漬してアマクサシダ抽出液を抽出する抽出工程
を包含するメラニン生成抑制剤の製造方法。

【請求項5】

前記アマクサシダ抽出液を、液液分配法、吸着クロマトグラフィー、及び分配クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１種類の処理法を用いてメラニン生成抑制剤を得る精製工程
をさらに包含する請求項４に記載のメラニン生成抑制剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、メラニン生成抑制剤、当該メラニン生成抑制剤を用いた化粧料及び医薬組成物、並びに当該メラニン生成抑制剤の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

シミ、ソバカス等の色素沈着は、太陽光等による紫外線の曝露、ホルモンバランスの異常等により、皮膚内に存在するメラニン細胞（メラノサイト）内において、メラニンが過剰生産されることにより生じることが知られている。メラニンは、チロシナーゼの作用により、必須アミノ酸であるチロシンからドーパキノンを合成し、このドーパキノンが酸化、重合して合成される。このメラニン合成経路をターゲットとしたメラニン生成抑制剤のスクリーニングが精力的に行われている。

【0003】

メラニン生成抑制効果を示す化合物としては、植物等の抽出物を用いるものが多く報告されている。例えば、トウセンダン、ソウカ、セネシオグラシリス、及びコクリロの抽出物が、チロシナーゼ活性の抑制作用を備え、美白作用に有効であることが報告されている（特許文献１）。また、カカオニブ、カカオマス、ココア、及びこれらの抽出物が、メラニンの生成抑制作用を備え、シミ、ソバカス等の色素沈着の予防や治療に有効であることが報告されている（特許文献２）。

【0004】

メラニン生成抑制効果を安定的に発揮させるためには、植物等の抽出物に含まれるメラニン生成抑制効果の有効成分を特定し、当該成分の最適な条件で使用することが望まれる。しかしながら、植物等に含まれるメラニン生成抑制効果を奏する有効成分は、特定されているものが少なく、ガジュツ（Ｃｕｒｃｕｍａ ｚｅｄｏａｒｉａ Ｒｏｓｃｏｅ）から単離されたゼデロン類化合物や（特許文献３）、ジャトバ（Ｈｙｍｅｎａｅａ ｃｏｕｒｂａｒｉｌ）から単離されたタンニン型物質（特許文献４）等が報告されている程度である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１０−１９５７３２号公報

【特許文献2】特開２００７−１５９４３号公報

【特許文献3】特許第５５１４７３９号公報

【特許文献4】特許第３６５０２４５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

特許文献１〜４に記載の化合物及び植物の抽出物には、メラニン生成を抑制する作用があることが開示され、一部の食品、化粧品、医薬品等の各種製品に配合されて実用化されているものもある。しかしながら、メラニン生成抑制効果、及びその安定性については、必ずしも満足のいくものではなかった。

【0007】

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、シミやソバカス等の色素沈着を効果的に予防、治療することができるメラニン生成抑制剤を提供することを目的とする。また、当該メラニン生成抑制剤を用いた化粧料、及び医薬組成物を提供することを目的とする。さらに、当該メラニン生成抑制剤の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

即ち、本発明は以下の発明を含む。
［発明１］
下記式（Ｉ）：

【化1】

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２は、それぞれＨ、ＯＨ、又はＣＨ_３であるか、Ｒ^１及びＲ^２が一緒になってＣＨ_２になり、
Ｒ^３及びＲ^４は、Ｈ又はＯＨであるとともに、少なくとも何れかがＯＨであり、
Ｒ^５は、Ｈ又はＯＨであり、
Ｒ^６は、Ｈ、グルコース基、ガラクトース基、キシロース基、又はマンノース基である。］
で示される化合物又はその塩を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
［発明２］
Ｒ^１、Ｒ^２は、一緒になってＣＨ_２であり、
Ｒ^３は、ＯＨであり、
Ｒ^４、Ｒ^５は、それぞれＨであり、
Ｒ^６は、Ｈ又はグルコース基である発明１に記載のメラニン生成抑制剤。
［発明３］
発明１又は２に記載のメラニン生成抑制剤を含有する化粧料。
［発明４］
発明１又は２に記載のメラニン生成抑制剤を製造する方法であって、
アマクサシダ（Ｐｔｅｒｉｓ ｄｉｓｐａｒ Ｋｕｎｚｅ）乾燥物をメタノール、エタノール、ブチレングリコール、メタノール水溶液、エタノール水溶液、ブチレングリコール水溶液、ヘキサン、及び酢酸エチルからなる群から選択される少なくとも１種類の溶媒に浸漬してアマクサシダ抽出液を抽出する抽出工程
を包含するメラニン生成抑制剤の製造方法。
［発明５］
前記アマクサシダ抽出液を、液液分配法、吸着クロマトグラフィー、及び分配クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１種類の処理法を用いてメラニン生成抑制剤を得る精製工程
をさらに包含する発明４に記載のメラニン生成抑制剤の製造方法。

【発明の効果】

【0009】

本構成のメラニン生成抑制剤は、メラニンの生成抑制に優れた効力を提供することができ、単離された当該成分を、配合することにより、安定性に優れ、且つ高い美白効果を有する化粧料及び医薬組成物を提供することができる。また、本構成のメラニン生成抑制剤の製造方法は、当該メラニン生成抑制剤を、簡単な方法で製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、アマクサシダ抽出液のメラニン生成抑制効果を示す図である。

【図2】図２は、本発明に係るメラニン生成抑制剤のメラニン生成抑制効果を示したグラフである。

【図3】図３は、本発明に係るメラニン生成抑制剤のメラニン生成抑制効果を示す図である。

【図4】図４は、本発明に係るメラニン生成抑制剤のメラニン生成抑制効果を示す図である。

【図5】図５は、本発明に係るメラニン生成抑制剤における毒性の評価結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明者らは、鋭意検討を行った結果、ある種のカウレン類の化合物にメラニン生成抑制効果が存在することを見出し、本発明を完成させた。カウレン類の化合物は、代表的なジテルペンであり、抗菌活性、抗腫瘍活性、抗炎症活性等を備えることが知られているが、カウレン類の化合物にメラニン生成抑制効果があることは、これまで、知られていない。

【0012】

本発明に係るメラニン生成抑制剤は、下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を有効成分とする。

【化2】

【0013】

式中、Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれＨ、ＯＨ、又はＣＨ_３であるか、Ｒ^１及びＲ^２が一緒になってＣＨ_２になり、
Ｒ^３及びＲ^４は、Ｈ又はＯＨであるとともに、少なくとも何れかがＯＨであり、
Ｒ^５は、Ｈ又はＯＨであり、
Ｒ^６は、Ｈ、グルコース基、ガラクトース基、キシロース基、又はマンノース基である。

【0014】

本発明の好ましい化合物としては、以下の化合物が挙げられる。
化合物１：

【化3】

【0015】

化合物２：

【化4】

【0016】

化合物３：

【化5】

【0017】

化合物４：

【化6】

【0018】

化合物５：

【化7】

【0019】

化合物６：

【化8】

【0020】

上記に挙げた化合物のうち、より好ましい化合物は、化合物１（１１ベータ−ヒドロキシ−１５−オキソ−エント−カウラ−１６−エン−１９−オイクアシッド：１１β−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１５−ｏｘｏ−ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎ−１９−ｏｉｃ Ａｃｉｄ）及び化合物４（プテリソリックアシッドＤ：Ｐｔｅｒｉｓｏｌｉｃ ａｃｉｄＤ）であり、さらに好ましい化合物は、化合物１である。また、上記化合物１〜６のグルコース基、ガラクトース基、キシロース基、又はマンノース基の配糖体も好ましい例として挙げられ、特にグルコース基の配糖体が好ましい。

【0021】

本発明のメラニン生成抑制剤は、アマクサシダ（Ｐｔｅｒｉｓ ｄｉｓｐａｒ Ｋｕｎｚｅ）から効率よく抽出、精製することができる。アマクサシダは、イノモトソウ科（Ｐｔｅｒｉｄａｃｅａｅ）に属し、千葉以西の本州、四国、九州、沖縄、台湾、中国等に広く分布するシダ植物である。アマクサシダの使用される部位は、特に限定されるものではないが、おもに葉が用いられる。

【0022】

本発明のメラニン生成抑制剤は、アマクサシダの乾燥物を粉砕した粉砕物から有機溶媒により抽出される（抽出工程）。抽出に使用する有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ブチルアルコール等の低級アルコール類；ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類等が挙げられる。上記有機溶媒には、水を加水して含水有機溶媒としてもよい。好ましい有機溶媒は、メタノール、エタノール、ブチレングリコール、ヘキサン、及び酢酸エチルであり、好ましい含水溶媒は、メタノール水溶液、エタノール水溶液、ブチレングリコール水溶液である。より好ましい有機溶媒は、エタノール、ブチレングリコールであり、より好ましい含水溶媒は、エタノール水溶液、ブチレングリコール水溶液である。有機溶媒は、一種単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。含水有機溶媒を調製する場合、有機溶剤の割合は、好ましくは３０質量％以上であり、さらに好ましくは５０〜９９質量％であり、特に好ましくは７０〜９９質量％である。

【0023】

アマクサシダを有機溶媒で抽出する方法は、特に限定されないが、例えば、アマクサシダの乾燥粉末１質量部に対して、上記有機溶媒又は含水有機溶媒を１〜５０質量部、好ましくは５〜２０質量部添加し、抽出温度を５〜６０℃、好ましくは１０〜４０℃で、抽出時間を５〜１２０時間、好ましくは８〜７２時間で、静置又は撹拌しながらアマクサシダのエキス分を抽出した後、遠心分離機等で固形分を除去する方法等が挙げられる。得られたアマクサシダ抽出物は、メラニン生成抑制剤を比較的高い濃度（０．２質量％以上）で含有しているため、当該アマクサシダ抽出物をそのままメラニン生成抑制剤として使用することも可能である。

【0024】

得られたアマクサシダの抽出液を液液分配法、吸着クロマトグラフィー、又は分配クロマトグラフィー等により精製を行うことができる（精製工程）。吸着クロマトグラフィーの担体としてはスチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着材（例えば、ＨＰ−２０、三菱化学株式会社製）を、分配クロマトグラフィーの担体としてはシリカゲルを好適に用いることができる。抽出液は、一種の抽出法で精製してもよく、二種以上の抽出法を組み合わせて精製してもよい。

【0025】

本発明のメラニン生成抑制剤は、化粧料として許容される各種の基材や担体と組み合わせて提供される。化粧料には、必要に応じて、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、分散剤、安定剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、紫外線吸収剤、保湿剤、着色剤、香料、増粘剤、殺菌剤、細胞賦活剤、抗炎症剤等の添加剤を適宜配合することもできる。

【0026】

化粧料として、具体的には、乳液、クリーム、クレンジング、パック、オイルリキッド、マッサージ料、美容液、洗浄剤、脱臭剤、ハンドクリーム、リップクリーム等のスキンケア化粧料；メイクアップ下地、白粉、リキッドファンデーション、油性ファンデーション、頬紅、アイシャドウ、マスカラ、アイライナー、アイブロウ、口紅等のメイクアップ化粧料；制汗剤、日焼け止め乳液や日焼け止めクリーム等の紫外線防御化粧料、皮膚外用剤等が挙げられ、医薬部外品として使用されるものも含まれる。

【0027】

化粧料におけるメラニン生成抑制剤の配合割合は、その有効量や、化粧料の形態等に応じて適宜設定されるが、例えば、化粧料の総量に対して、０．００１〜１０質量％であり、好ましくは０．００１〜１質量％であり、さらに好ましくは０．００１〜０．１質量％である。

【0028】

医薬組成物は本発明のメラニン生成抑制剤を有効成分とし、薬学的に許容される基材や担体と組み合わせて提供される。医薬組成物には、薬学的に許容される限度において、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、分散剤、安定剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、紫外線吸収剤、保湿剤、着色剤、香料、増粘剤、殺菌剤、細胞賦活剤、抗炎症剤等の添加剤を適宜配合することもできる。

【0029】

医薬組成物としては、医薬品又は医薬部外品を含み、本発明のメラニン生成抑制剤を有効成分として含有する。当該医薬組成物は、経口又は非経口のいずれで適用される剤型であってもよい。経口投与で投与される医薬組成物の剤型としては、例えば、丸剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤等が挙げられる。非経口で投与される医薬組成物の剤型としては、例えば、外用剤、経皮剤、経鼻剤、液剤、貼付剤、皮膚外用剤等が挙げられる。

【0030】

医薬組成物における本発明のメラニン生成抑制剤の配合割合は、その有効量や、医薬組成物の剤形や、投与形態等に応じて適宜設定されるが、例えば、医薬組成物の総量に対して、０．００１〜１０質量％であり、好ましくは０．００１〜１質量％であり、さらに好ましくは０．００１〜０．１質量％である。

【実施例】

【0031】

本発明のメラニン生成抑制剤について、メラニン生成を抑制する作用を評価する試験を実施した。試験結果を以下に示す。

【0032】

＜アマクサシダ抽出液の評価＞
アマクサシダは、種子島で採取した葉を、換気・循環型乾燥用恒温器（株式会社いすゞ製作所製、型番ＥＰＦＨ−３４３−２Ｔ）を用いて５０℃で２日間温風乾燥した。乾燥した葉は、卓上粉砕機（株式会社東京ユニコム、型番Ｔ−３５１）を用いて粉末化した。アマクサシダの粉末５０ｇを、５００ｍｌのブチレングリコールに浸漬し、２３℃で、７２時間抽出を行った。その後、フィルター濾過を行い、４５０ｍｌのアマクサシダ抽出液を回収した。回収したアマクサシダ抽出液について、メラニン生成抑制を評価した。アマクサシダ抽出液を評価するために、メラニン産生細胞であるＢ１６メラノーマ細胞を使用し、培養後のＢ１６メラノーマ細胞のメラニン生成量を目視観察により行った。

【0033】

（Ｂ１６メラノーマ細胞の培養）
メラニン生成量の評価を行うために、メラニン産生細胞であるＢ１６メラノーマ細胞の培養を行った。以下にＢ１６メラノーマ細胞の培養方法を示す。
（１）６穴−ディッシュに、メラニン産成細胞であるＢ１６メラノーマ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク、細胞番号：ＪＣＲＢ０２０２）を１×１０^４細胞（１ｍｌ／ウェル）となるように播種し、１ｍｌの前培養培地を添加後、３７℃、５％二酸化炭素気流下で１日間培養した。
前培養培地：１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（抗生物質ＭＩＸ（和光純薬工業株式会社製）を終濃度が１Ｘになるように添加）を使用した。
（２）（１）で培養したＢ１６メラノーマ細胞の前培養培地を除去した後、２ｍｌのＢ１６メラノーマ細胞の処理用培地を添加して７２時間培養した。
（３）（２）で培養したＢ１６メラノーマ細胞を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに回収して、細胞の色を目視により比較した。
処理用培地：前培養と同じ培地に、アマクサシダ抽出液を３００倍希釈及び１０００倍希釈となるように添加した（容量比）。各試験サンプルには、ホルスコリン（ＦＳＫ）を２０μＭ（最終濃度）、ＤＭＳＯを０．２％（最終濃度）となるように添加した。ＦＳＫは、Ｂ１６メラノーマ細胞のαメラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）と同様にシグナル誘導を生じさせ、メラニン合成を促進させる物質である。
コントロール用処理用培地：上記処理用培地にアマクサシダ抽出液を無添加とした。
ブランク用処理用培地：上記処理用培地にアマクサシダ抽出液及びＦＳＫを無添加とした。

【0034】

図１は、アマクサシダ抽出液のメラニン生成抑制効果を示す図であり、アマクサシダのブチレングリコール抽出液の濃度とメラニン生成抑制効果との関係を示すものである。アマクサシダ抽出液を１０００倍に希釈しても、メラニン生成抑制効果が確認された。

【0035】

＜アマクサシダからのメラニン生成抑制剤の抽出及び精製＞
＜アマクサシダ抽出液の評価＞の項で説明した同じ方法で得たアマクサシダの粉末５０ｇを、５００ｍｌのエタノールに浸漬し、２３℃で、７２時間抽出を行い、その後、２０００ｒｐｍ、１０分間で遠心分離し、４５０ｍｌのアマクサシダ抽出液を回収した。アマクサシダ抽出液をエバポレーターにかけてエタノールを揮発させ、１０ｍｌに濃縮した。濃縮液にクロロホルム５００ｍｌを添加し、１週間放置してクロロホルムに溶解させてクロロホルム溶解液を調製した。クロロホルム溶解液をフィルターでろ過し、ろ液をエバポレーターにかけて５ｍｌに濃縮した。次いで、濃縮液を２０ｇのシリカゲル（型番：３０７２１、ナカライテスク株式会社製）を詰めたカラムを用いて分画した。濃縮したクロロホルム溶解液９０ｍｌをシリカゲルカラムにアプライし、メタノールをそれぞれ２．５容量％、５容量％、７．５容量％、１０容量％、１２．５容量％、１５容量％、１７．５容量％、２０容量％に調整したメタノール／クロロホルムの溶出液９０ｍｌを用いて順次溶出させ、１９画分を得た。（Ｂ１６メラノーマ細胞の培養）の項で説明した同じ方法により、各画分のメラニン生成抑制効果を確認したところ、画分（１６）、画分（１７）、及び画分（１８）の３画分に強いメラニン生成抑制の活性が存在した。当該３画分を１本にまとめて乾燥し、１ｍｌのクロロホルムを添加した。このクロロホルム添加物を、クロロホルムに溶解する画分と、クロロホルムに溶解しない画分とに分離した。何れの画分にもメラニン生成抑制効果を確認した。クロロホルムに溶解しない画分を硫酸（最終濃度１％）により１００℃、３０分で加水分解した。当該加水分解物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて下記条件で分析し、メインピークを回収した。回収溶液を減圧乾燥して化合物１（１１ベータ−ヒドロキシ−１５−オキソ−エント−カウラ−１６−エン−１９−オイクアシッド）の精製物を得た。クロロホルムに溶解する画分も同様にＨＰＬＣを用いてメインピークを回収すると、同じ化合物１が得られた。化合物１は、アマクサシダの粉末５０ｇから約１０ｍｇ得られた。また、質量分析により、加水分解前のクロロホルム非溶解画分は、化合物１のグルコース配糖体であることが確認された。

【0036】

カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標） ５Ｃ_１８−ＭＳ−ＩＩ（ナカライテスク株式会社製）
移動相：アセトニトリル：水＝１０：９０から６０：４０（グラジュエント溶出）
流速：２ｍｌ／分
検出波長：２４５ｎｍ

【0037】

構造決定は、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲに基づいて行った。以下に、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのシグナルを示す。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３＋ＣＤ_３ＯＤ）：０．８５（３Ｈ,ｓ）,１．１４（３Ｈ,ｓ）,２．２９（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝１２．０Ｈｚ）,２．９５（１Ｈ,ｂｒｏａｄｓ）,３．９３（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝４．６Ｈｚ），５．１６（１Ｈ,ｓ）,５．７３（１Ｈ,ｓ）
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３＋ＣＤ_３ＯＤ）：４０．５（Ｃ−１）,１８．７（Ｃ−２）,３７．８（Ｃ−３）,４３．４（Ｃ−４）,５５．８（Ｃ−５）,１９．８（Ｃ−６）,３３．７（Ｃ−７）,５０．６（Ｃ−８）,６２．８（Ｃ−９）,３８．８（Ｃ−１０），６５．７（Ｃ−１１）,６５．７（Ｃ−１２）,３６．８（Ｃ−１３）,３６．４（Ｃ−１４）,２１０．７（Ｃ−１５）,１５０．３（Ｃ−１６）,１１２．７（Ｃ−１７）,２８．８（Ｃ−１８）,１８０．４（Ｃ−１９),１５．４（Ｃ−２０）

【0038】

＜Ｂ１６メラノーマ細胞を用いたメラニン生成抑制の評価＞
メラニン生成抑制の試験化合物としてアマクサシダから精製した化合物１、アマクサシダから精製した化合物１のグルコース基の配糖体、化合物４（プテリソリックアシッドＤ：Ｐｔｅｒｉｓｏｌｉｃ ａｃｉｄＤ、ＣｈｅｍＦａｃｅｓ社製）、比較化合物１（１１，１５−ジヒドロキシ−エント−カウラ−１６−エン−１９−オイクアシッド、ＣｈｅｍＦａｃｅｓ社製）、及び比較化合物２（プテリソリックアシッドＡ：Ｐｔｅｒｉｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ａ、ＣｈｅｍＦａｃｅｓ社製）について、メラニン生成抑制を評価した。これら試験化合物を評価するために、メラニン産生細胞であるＢ１６メラノーマ細胞を使用した。Ｂ１６メラノーマ細胞の培養は、（Ｂ１６メラノーマ細胞の培養）の項で説明した同じ方法により培養した。評価は、試験化合物（最終濃度：１０μＭ）を添加したＢ１６メラノーマ細胞について、培養後の各Ｂ１６メラノーマ細胞のメラニン生成量の目視観察及び定量分析により行った。以下、メラニンの定量法について説明する。

【0039】

（メラニンの定量）
回収した各Ｂ１６メラノーマ細胞からメラニンを抽出した。メラニンの抽出方法を以下に示す。
（１）タンパク質量を合わせた各試験サンプルからＰＢＳを除去し、３００μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加え、細胞の破片が見えなくなるまでホモジナイズした。
（２）各試験サンプルを４５℃、２時間でインキュベートした。
（３）各試験サンプルにメタノール：クロロホルム（１：２）混合溶液を１００μｌ加え、撹拌し、メラニンを抽出した。
（４）１２００ｒｐｍ、１０分で遠心分離し、上清を回収し、メラニン抽出液を得た。
（５）メラニン抽出液１００μｌを、９６穴プレートに分注し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
（６）メラニン標準溶液の吸光度から検量線を作成し、各試験サンプルのメラニン量の濃度を算出した。メラニン標準溶液は、メラニンの濃度が０μｇ／ｍｌ，６．２５μｇ／ｍｌ，１２．５μｇ／ｍｌ，２５μｇ／ｍｌ，５０μｇ／ｍｌ，１００μｇ／ｍｌとなるように、メラニンを、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液に溶解して調製した。メラニン標準溶液の３００μｌ（ｎ＝３）を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに加え、上記（３）〜（５）と同じ方法でメラニンを測定し、検量線を作成した。
メラニン生成抑制効果は、各試験サンプルのタンパク質量を測定し、タンパク質１ｍｇ当たりのメラニンの生成量（μｇ）で示した。

【0040】

図２は、本発明に係るメラニン生成抑制剤のメラニン生成抑制効果を示したグラフである。コントロールと比較すると、アマクサシダから抽出された化合物１及び化合物１のグルコース配糖体に非常に強いメラニン生成抑制効果が確認された。また、化合物４にもメラニン生成抑制効果が認められた。これに対して、同じカウレン類の化合物の中でも、カウレン骨格の１５位の炭素に酸素の二重結合を有さない比較化合物１、及び９位及び１１位の炭素の何れにも水酸基を有さない比較化合物２には、メラニン生成抑制効果が認められなかった。

【0041】

＜メラニン生成抑制剤の濃度とメラニン生成抑制効果＞
図３は、本発明に係るメラニン生成抑制剤のメラニン生成抑制効果を示す図であり、本発明に係るメラニン生成抑制剤の濃度とメラニン生成抑制効果との関係を示すものである。メラニン生成抑制効果が認められた化合物１及び化合物４を使用して、メラニン生成抑制剤の濃度とメラニン生成抑制効果との関係を評価した。評価方法としては、化合物１及び化合物４の濃度を３μＭ、１０μＭ、及び３０μＭに調整した試験サンプルを用いて、（Ｂ１６メラノーマ細胞の培養）の項で説明した同じ方法により、Ｂ１６メラノーマ細胞を培養後、目視観察により比較した。

【0042】

図３の写真から、化合物１は、３μＭの低濃度でも、十分なメラニン生成抑制効果が認められた。また、化合物４についても、３０μＭの濃度において、メラニン生成抑制効果が認められた。

【0043】

＜三次元培養皮膚モデルを用いたメラニン生成抑制の評価＞
図４は、本発明に係るメラニン生成抑制剤のメラニン生成抑制効果を示す図であり、本発明に係るメラニン生成抑制剤の三次元培養皮膚モデルを用いたメラニン生成抑制効果を示すものである。化合物１を使用して、三次元培養皮膚モデルによるメラニン生成抑制試験を行った。メラニン生成抑制試験は、市販されている三次元培養皮膚モデル（ＭＥＬ-３００キットＡｓｉａｎ ｄｏｎｏｒ：倉敷紡績株式会社製）を用いて行った。キットの使用方法に従い、ＭＥＬ-３００皮膚モデルカップを６ウエルプレートの各ウエルにセットし、３７℃インキュベーターで温めたキット用維持培地（ＥＰＩ−１００：培地添加時にＳＣＦを最終濃度１０ｎｇ/ｍＬになるように添加した）を皮膚モデルカップに無菌的に５ｍＬずつ入れた。皮膚モデルカップに化合物１を３００μＭとなるように添加し、皮膚モデルカップの入った６ウエルプレートをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）に入れ、１４日間培養した。培地交換は、３日に一度行った。コントロール及び化合物１を添加した試験サンプルには、ＵＶを３０ｍＪ／ｃｍ^２となるように照射し、ブランクは、ＵＶを照射しなかった。培養後、各サンプルの黒色度を測定し、メラニン生成抑制効果を評価した。画像処理ソフトであるＩｍａｇｅＪ（無料ソフトウエアー）を用いて階調を測定し、ブランクを１．０として、黒色度を比較した。

【0044】

図４の写真から、化合物１は、ＵＶを照射しないブランクと黒色度において略同じ値となり、三次元培養皮膚モデルにおいても、メラニンの生成が抑制されることが確認された。

【0045】

＜三次元培養皮膚モデルを用いた毒性評価＞
図５は、本発明に係るメラニン生成抑制剤における毒性の評価結果を示すグラフである。化合物１を使用して、三次元培養皮膚モデルによるメラニン生成抑制剤の毒性試験を行った。メラニン生成抑制剤の毒性試験では、化合物１の添加量を、３０μＭ、１００μＭ、及び３００μＭに調整し、上記三次元培養皮膚モデルの試験と同じ方法により培養を行った。ＭＥＬ-３００皮膚モデルを培養後、１／１０容量の細胞毒性試験試薬を直接培地に添加し、３０分間さらに培養した。その後、培地を回収し、光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレート分光光度計（６８０型、バイオ・ラッド社製）を用いて４５０ｎｍで測定した。細胞毒性試験試薬は、ＷＳＴ−８［２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、モノナトリウム塩］（Ｃｅｌｌ−Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（登録商標）、株式会社同仁化学研究所製）を用いて判定した。

【0046】

図５のグラフから、化合物１は、ブランクと略同じ値となり、３００μＭの濃度でも、三次元培養皮膚モデルにおいて毒性を示さないことが確認された。なお、化合物１は、三次元培養皮膚モデルにおいて９００μＭの濃度でも毒性を示さないことが確認されている（データ示さず）。

【0047】

＜安全性試験＞
ヒトに対する安全性試験として皮膚パッチテストを行った。精製したアマクサシダ抽出物の粉末(化合物１)を０.０１質量％、０.０５質量％、０.１質量％となるように白色ワセリン（日本薬局方、和光純薬工業株式会社製）に練りこみ、フィンチャンバー（株式会社スマートプラクティスジャパン社製）を用いて、クローズドパッチテストを実施した。敏感肌が２名、やや敏感肌が２名、普通肌が２名の成人男女６人で行った。試験サンプル５点（ブランク２点、濃度の異なる化合物１のサンプル３点）を塗布したフィンチャンバーを、上腕内側に貼り付けてから２４時間後に剥離し、その１時間後及び２４時間後に判定を行った。
皮膚に異常がなかった場合を０ポイント、軽度の赤みのみの場合を１ポイント、赤みや腫れ等の異常が見られた場合を３ポイントとし、６名の合計ポイントを計算して、試験サンプルを１９段階（０〜１８ポイント）で評価した。判定は合計５ポイント以上で不合格とした。化合物１を含まないブランクについては、同じ試験を二回繰り返した。以下、試験結果を示す。

【0048】

【表1】

【0049】

化合物１を含むサンプル及びブランクは、何れも合格判定であったが、化合物１を含むサンプルはブランクよりも合計ポイントが低く、より良好な結果が得られることが判明した。従って、本発明のメラニン生成抑制剤は、ヒトの皮膚に対して使用することに問題はなく、安全性が高いため、化粧品や医薬組成物等の製品に適用できることが示唆された。

【産業上の利用可能性】

【0050】

本発明に係るメラニン生成抑制剤、当該メラニン生成抑制剤を用いた化粧料及び医薬組成物、並びに当該メラニン生成抑制剤の製造方法は、例えば、食品分野、化粧品分野、及び医薬品分野に利用することができる。

【図2】

【図5】

【図1】

【図3】

【図4】