特許 5946604 キナーゼカスケードをモジュレートするための医薬組成物およびその使用の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5946604

(24)【登録日】2016年6月10日

(45)【発行日】2016年7月6日

(54)【発明の名称】キナーゼカスケードをモジュレートするための医薬組成物およびその使用の方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/5377 20060101AFI20160623BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20160623BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20160623BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20160623BHJP

   A61P 7/10 20060101ALI20160623BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160623BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160623BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/5377

   A61K37/02

   A61K37/66 G

   A61P1/16

   A61P7/10

   A61P35/00

   A61P43/00 121

【請求項の数】19

【全頁数】99

(21)【出願番号】特願2010-529985(P2010-529985)

(86)(22)【出願日】2008年10月20日

(65)【公表番号】特表2011-500689(P2011-500689A)

(43)【公表日】2011年1月6日

(86)【国際出願番号】US2008011977

(87)【国際公開番号】WO2009051848

(87)【国際公開日】20090423

【審査請求日】2011年8月25日

【審判番号】不服2014-20112(P2014-20112/J1)

【審判請求日】2014年10月6日

(31)【優先権主張番号】60/999,943

(32)【優先日】2007年10月20日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509002648

【氏名又は名称】アテネックス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ハンガウアー， デイビッド ジー． ジュニア

【合議体】

【審判長】 蔵野 雅昭

【審判官】 横山 敏志

【審判官】 穴吹 智子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０１６０８００（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５３５５８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５１４７７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２７３６１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｐ１／００−４３／００

Ａ６１Ｋ３８／００

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

ＣｉＮｉｉ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１日２回または３回で投与される１０ｍｇ／用量〜３００ｍｇ／用量の範囲の量の化合物（Ｉ）：

【化1】

またはその薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る担体とを含む、乳癌、膵臓癌および結腸癌から選択される状態または障害の処置または予防のための、経口、静脈内、筋肉内、または皮下投与のための医薬組成物であって、
該状態または障害が乳癌である場合には、該医薬組成物がタモキシフェンと組み合わせて投与されることを特徴とし、
該状態または障害が膵臓癌である場合には、該医薬組成物がゲムシタビンと組み合わせて投与されることを特徴とし、そして、
該状態または障害が結腸癌である場合には、該医薬組成物がオキサリプラチンと組み合わせて投与されることを特徴とする、医薬組成物。

【請求項2】

前記量が２０ｍｇ／用量〜２５０ｍｇ／用量である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記量が４０ｍｇ／用量〜２００ｍｇ／用量である、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記量が６０ｍｇ／用量〜１６０ｍｇ／用量である、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記量が１日２回で投与される、１０ｍｇ／用量、２０ｍｇ／用量、４０ｍｇ／用量、６０ｍｇ／用量、８０ｍｇ／用量、１２０ｍｇ／用量または１６０ｍｇ／用量である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記量が４０ｍｇ／用量、６０ｍｇ／用量または８０ｍｇ／用量である、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記組成物が１日２回で投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

１日１回で投与される２０ｍｇ／用量〜６００ｍｇ／用量の範囲の量の化合物（Ｉ）：

【化2】

またはその薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る担体とを含む、乳癌、膵臓癌および結腸癌から選択される状態または障害の処置または予防のための、経口、静脈内、筋肉内、または皮下投与のための医薬組成物であって、
該状態または障害が乳癌である場合には、該医薬組成物がタモキシフェンと組み合わせて投与されることを特徴とし、
該状態または障害が膵臓癌である場合には、該医薬組成物がゲムシタビンと組み合わせて投与されることを特徴とし、そして、
該状態または障害が結腸癌である場合には、該医薬組成物がオキサリプラチンと組み合わせて投与されることを特徴とする、医薬組成物。

【請求項9】

前記量が４０ｍｇ／用量〜５００ｍｇ／用量である、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記量が８０ｍｇ／用量〜４００ｍｇ／用量である、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記量が１２０ｍｇ／用量〜３２０ｍｇ／用量である、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記量が２０ｍｇ／用量、４０ｍｇ／用量、８０ｍｇ／用量または１２０ｍｇ／用量である、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記量が８０ｍｇ／用量または１２０ｍｇ／用量である、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

化合物（Ｉ）のメシル酸塩を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項15】

請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、該医薬組成物が、インターフェロン、インターロイキン、およびコロニー刺激因子から選択されるサイトカインとともに投与されることで特徴づけられる、医薬組成物。

【請求項16】

乳癌、膵臓癌および結腸癌から選択される状態または障害を処置または予防するための医薬の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。

【請求項17】

乳癌、膵臓癌および結腸癌から選択される癌を処置するための医薬の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用であって、該医薬が、インターフェロン、インターロイキン、およびコロニー刺激因子から選択されるサイトカインとともに投与される、医薬組成物の使用。

【請求項18】

経口投与のためのものである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項19】

静脈内投与のためのものである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連する出願）
本願は、２００７年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／９９９，９４３号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／９９９，９４３号の全ての内容は、本明細書中に参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）−Ｎ−ベンジルアセトアミド（化合物（Ｉ））、およびその薬学的に許容され得る塩、例えば、メシル酸塩を含む医薬組成物に関する。また、本発明は、かかる組成物の使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

本発明は、特定の状態または障害の処置または防御に有用なビアリール化合物およびその薬学的に許容され得る塩、例えばメシル酸塩に関する。より詳しくは、本発明は、式：

【0003】

【化1】

を有する化合物（Ｉ）である化合物２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）−Ｎ−ベンジルアセトアミド、またはその薬学的に許容され得る塩、例えばメシル酸塩に関する。

【0004】

化合物（Ｉ）は、米国特許第７，３００，９３１号に具体的に開示され、特許請求の範囲に記載されている。また、この特許には、細胞増殖障害の処置における化合物（Ｉ）の使用が開示されている。

【0005】

化合物（Ｉ）およびその薬学的に許容され得る塩は、強力なＳｒｃチロシンキナーゼインヒビターであり、癌、細胞増殖性障害、微生物感染、過剰増殖性障害、黄斑浮腫、骨粗鬆症、心血管障害、眼疾患、免疫機構機能不全、ＩＩ型糖尿病、肥満、移植片拒絶、難聴、脳卒中、アテローム性動脈硬化、慢性神経因性疼痛、Ｂ型肝炎、および自己免疫疾患などの状態または障害の処置または防御に使用され得る。これらの状態および障害の処置および防御のための化合物（Ｉ）の使用は、ＵＳ ２００７／００１５７５２、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４８４７、および特許文献１に記載されている。

【0006】

本発明は、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩を含む特定の医薬組成物を開示するものである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２００８／００２６７６号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、１日２回または３回で投与される２ｍｇ〜４００ｍｇ／用量の範囲の量の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る担体とを含む、経口、静脈内、筋肉内、または皮下投与のための医薬組成物を提供する。一態様において、該量は１０ｍｇ〜３００ｍｇである。別の態様において、該量は２０ｍｇ〜２５０ｍｇである。別の態様では、該量は４０ｍｇ〜２００ｍｇである。別の態様では、該量は６０ｍｇ〜１６０ｍｇである。一態様において、該用量は１日２回で投与される。別の態様では、該用量は１日３回で投与される。

【0009】

本発明は、１日１回で投与される４ｍｇ〜８００ｍｇ／用量の範囲の量の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る担体とを含む、経口、静脈内、筋肉内、または皮下投与のための医薬組成物を提供する。一態様において、該量は２０ｍｇ〜６００ｍｇである。別の態様において、該量は４０ｍｇ〜５００ｍｇである。別の態様では、該量は８０ｍｇ〜４００ｍｇである。別の態様では、該量は１２０ｍｇ〜３２０ｍｇである。

【0010】

本発明は、化合物（Ｉ）のメシル酸塩を含む医薬組成物を提供する。

【0011】

本発明は、投与が経口である医薬組成物を提供する。別の態様において、投与は静脈内である。別の態様において、投与は筋肉内である。別の態様では、投与は皮下である。

【0012】

本発明は、１種類以上の抗癌処置剤または抗癌剤と組み合わせて投与される医薬組成物を提供する。一態様において、該医薬組成物は、抗癌剤ゲムシタビンと組み合わせて投与される。別の態様では、該医薬組成物は、抗癌剤オキサリプラチンと組み合わせて投与される。

【0013】

本発明は、本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌、細胞増殖性障害、微生物感染、過剰増殖性障害、黄斑浮腫、骨粗鬆症、心血管障害、眼疾患、免疫機構機能不全、ＩＩ型糖尿病、肥満、移植片拒絶、難聴、脳卒中、アテローム性動脈硬化、慢性神経因性疼痛、Ｂ型肝炎、および自己免疫疾患から選択される状態または障害の処置または予防方法を提供する。一態様において、該状態または障害は癌である。一態様において、癌は、腎臓、前立腺、肝臓、肺、膵臓、脳、乳房、結腸、白血病、卵巣、上皮、および食道のものから選択される。別の態様において、癌は、進行した悪性腫瘍、充実性腫瘍、およびリンパ腫から選択される。一態様において、該状態または障害は細胞増殖性障害である。一態様において、細胞増殖性障害は、乾癬、糖尿病性網膜症、および黄斑変性から選択される。一態様において、該状態または障害は微生物感染である。一態様において、微生物感染は、細菌、真菌、寄生虫およびウイルスのものから選択される。一態様において、該障害または状態は、過剰増殖性障害、黄斑浮腫、骨粗鬆症、心血管障害、眼疾患、免疫機構機能不全、ＩＩ型糖尿病、肥満、移植片拒絶、難聴、脳卒中、アテローム性動脈硬化、慢性神経因性疼痛、Ｂ型肝炎、および自己免疫疾患から選択される。

【0014】

本発明は、本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、免疫機構の活性の調節方法を提供する。

【0015】

本発明は、癌、細胞増殖性障害、微生物感染、過剰増殖性障害、黄斑浮腫、骨粗鬆症、心血管障害、眼疾患、免疫機構機能不全、ＩＩ型糖尿病、肥満、移植片拒絶、難聴、脳卒中、アテローム性動脈硬化、慢性神経因性疼痛、Ｂ型肝炎、および自己免疫疾患から選択される状態または障害の処置または予防のための医薬の製造における本発明の医薬組成物の使用を提供する。一態様において、該状態または障害は癌である。一態様において、癌は、腎臓、前立腺、肝臓、肺、膵臓、脳、乳房、結腸、白血病、卵巣、上皮、および食道のものから選択される。別の態様において、癌は、進行した悪性腫瘍、充実性腫瘍、およびリンパ腫から選択される。一態様において、該状態または障害は細胞増殖性障害である。一態様において、細胞増殖性障害は、乾癬、糖尿病性網膜症、および黄斑変性から選択される。一態様において、該状態または障害は微生物感染である。一態様において、微生物感染は、細菌、真菌、寄生虫およびウイルスのものから選択される。一態様において、該障害または状態は、過剰増殖性障害、黄斑浮腫、骨粗鬆症、心血管障害、眼疾患、免疫機構機能不全、ＩＩ型糖尿病、肥満、移植片拒絶、難聴、脳卒中、アテローム性動脈硬化、慢性神経因性疼痛、Ｂ型肝炎、および自己免疫疾患から選択される。

【0016】

本発明は、免疫機構の活性の調節のための医薬の製造における本発明の医薬組成物の使用を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） １日２回または３回で投与される２ｍｇ／用量〜４００ｍｇ／用量の範囲の量の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る担体とを含む、経口、静脈内、筋肉内、または皮下投与のための医薬組成物。
（項目２） 前記量が１０ｍｇ〜３００ｍｇである、項目１に記載の医薬組成物。
（項目３） 前記量が２０ｍｇ〜２５０ｍｇである、項目２に記載の医薬組成物。
（項目４） 前記量が４０ｍｇ〜２００ｍｇである、項目３に記載の医薬組成物。
（項目５） 前記量が６０ｍｇ〜１６０ｍｇである、項目４に記載の医薬組成物。
（項目６） １日１回で投与される４ｍｇ／用量〜８００ｍｇ／用量の範囲の量の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る担体とを含む、経口、静脈内、筋肉内、または皮下投与のための医薬組成物。
（項目７） 前記量が２０ｍｇ〜６００ｍｇである、項目６に記載の医薬組成物。
（項目８） 前記量が４０ｍｇ〜５００ｍｇである、項目７に記載の医薬組成物。
（項目９） 前記量が８０ｍｇ〜４００ｍｇである、項目８に記載の医薬組成物。
（項目１０） 前記量が１２０ｍｇ〜３２０ｍｇである、項目９に記載の医薬組成物。
（項目１１） 化合物（Ｉ）のメシル酸塩を含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１２） 投与が経口である、項目１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１３） 投与が静脈内である、項目１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１４） 投与が筋肉内である、項目１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１５） 投与が皮下である、項目１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１６） 前記用量が１日２回で投与される、項目１〜５または１１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１７） 前記用量が１日３回で投与される、項目１〜５または１１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１８） １種類以上の抗癌処置剤または抗癌剤と組み合わせて投与される、項目１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１９） 抗癌剤ゲムシタビンと組み合わせて投与される、項目１８に記載の医薬組成物。
（項目２０） 抗癌剤オキサリプラチンと組み合わせて投与される、項目１８に記載の医薬組成物。
（項目２１） 項目１〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌、細胞増殖性障害、微生物感染、過剰増殖性障害、黄斑浮腫、骨粗鬆症、心血管障害、眼疾患、免疫機構機能不全、ＩＩ型糖尿病、肥満、移植片拒絶、難聴、脳卒中、アテローム性動脈硬化、慢性神経因性疼痛、Ｂ型肝炎、および自己免疫疾患から選択される状態または障害の処置または予防方法。
（項目２２） 前記状態または障害が癌である、項目２１に記載の方法。
（項目２３） 前記癌が、腎臓、前立腺、肝臓、肺、膵臓、脳、乳房、結腸、白血病、卵巣、上皮、および食道のものから選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４） 前記癌が、進行した悪性腫瘍、充実性腫瘍、およびリンパ腫から選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２５） 前記状態または障害が細胞増殖性障害である、項目２１に記載の方法。
（項目２６） 前記細胞増殖性障害が、乾癬、糖尿病性網膜症、および黄斑変性から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７） 前記状態または障害が微生物感染である、項目２１に記載の方法。
（項目２８） 微生物感染が、細菌、真菌、寄生虫およびウイルスのものから選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９） 前記障害または状態が、過剰増殖性障害、黄斑浮腫、骨粗鬆症、心血管障害、眼疾患、免疫機構機能不全、ＩＩ型糖尿病、肥満、移植片拒絶、難聴、脳卒中、アテローム性動脈硬化、慢性神経因性疼痛、Ｂ型肝炎、および自己免疫疾患から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目３０） 項目１〜２０いずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、免疫機構の活性の調節方法。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１Ａは、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＳｒｃ自己リン酸化に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである；図１Ｂは、ＨＴ−２９細胞におけるＳｒｃ自己リン酸化に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。

【図2】図２Ａは、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＦＡＫリン酸化に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである；図２Ｂは、ＨＴ−２９細胞におけるＦＡＫリン酸化に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。

【図3】図３Ａは、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＳｈｃリン酸化に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである；図３Ｂは、ＨＴ−２９細胞におけるＳｈｃリン酸化に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。

【図4】図４は、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＴＨ−３Ｔ３細胞におけるパキシリンリン酸化に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。

【図5】図５Ａは、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるカスパーゼ−３切断に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである；図５Ｂは、ＨＴ−２９細胞におけるカスパーゼ−３切断に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。

【図6】図６Ａは、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞における総ホスホチロシンレベルに対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである；図６Ｂは、ＨＴ−２９細胞における総ホスホチロシンレベルに対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。

【図7】図７は、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＰＤＧＦＲの自己リン酸化に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。

【図8】図８Ａは、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＦＡＫの自己リン酸化に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである；図８Ｂは、ＨＴ−２９細胞におけるＦＡＫの自己リン酸化に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。

【図9】図９Ａは、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＥＧＦＲの自己リン酸化に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである；図９Ｂは、ＨＴ−２９細胞におけるＥＧＦＲの自己リン酸化に対するＡＺ２８および化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。

【図10-1】図１０Ａおよび１０Ｂは、細胞全体におけるＳｒｃキナーゼ活性の阻害を示す一連のグラフである。図１０Ａは、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＳｒｃ自己リン酸化に対する化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである；図１０Ｂは、ＨＴ−２９細胞におけるＳｒｃ自己リン酸化に対する化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。

【図10-2】図１０Ｃ、および１０Ｄは、細胞全体におけるＳｒｃキナーゼ活性の阻害を示す一連のグラフである。図１０Ｃは、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＳｒｃトランスリン酸化に対する化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである；図１０Ｄは、ＨＴ−２９細胞におけるＳｒｃ自己リン酸化に対する化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。

【図11】図１１は、現在臨床試験中のＡＴＰ競合性Ｓｒｃインヒビターであるダサチニブと比較したときの、細胞全体におけるプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）に対する化合物（Ｉ）の選択性を示す図解である。

【図12】図１２は、ダサチニブおよびイマチニブ耐性白血病細胞に対するダサチニブの効果を示すグラフである。

【図13】図１３は、ダサチニブおよびイマチニブ抵抗性白血病細胞に対する化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。

【図14】図１４は、ＨＴ−２９細胞における、ダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）と比較したときの増殖阻害曲線および化合物（Ｉ）のＧＩ_５０を示す。

【図15】図１５は、ＳＫＯＶ−３細胞における、ダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）と比較したときの増殖阻害曲線および化合物（Ｉ）のＧＩ_５０を示す。

【図16】図１６は、Ａ５４９細胞における、ダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）と比較したときの増殖阻害曲線および化合物（Ｉ）のＧＩ_５０を示す。

【図17】図１７は、Ｋ５６２細胞におけるダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）と比較したときの増殖阻害曲線および化合物（Ｉ）のＧＩ_５０を示す。

【図18】図１８は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）と比較したときの増殖阻害曲線および化合物（Ｉ）のＧＩ_５０を示す。

【図19】図１９は、ＢｒｄＵアッセイを用いた、Ｌ３．６ｐｌ細胞株におけるジェムザール（登録商標）と化合物（Ｉ）の併用の増殖阻害曲線およびＧＩ_５０を示す。

【図20】図２０は、ＢｒｄＵアッセイを用いた、Ｌ３．６ｐｌ細胞株におけるジェムザール（登録商標）および化合物（Ｉ）の増殖阻害曲線およびＧＩ_５Ｏを示す。

【図21】図２１は、種々の濃度の化合物（Ｉ）でのインビボでの転移を調べるための正所性前立腺モデルでの腫瘍重量を示す。

【図22】図２２は、２．５ｍｇ／用量ｂｉｄ、５．０ｍｇ／用量ｂｉｄの化合物（Ｉ）および７．５ｍｇ／用量ｂｉｄのダサチニブでの処置後、第２週のＩＶＩＳ追跡試験を示す。

【図23】図２３は、抗ＨＢＶ有効性および細胞性細胞傷害に関するスクリーニング結果の棒グラフである。

【図24】図２４は、マウス異種移植片における化合物（Ｉ）の経口効力を示すグラフである。化合物（Ｉ）は、病期分類された（ｓｔａｇｅｄ）ＨＴ２９（ヒト結腸癌細胞株）マウスにおいて、ダサチニブよりも高い経口効力を示した。

【図25A】図２５Ａ〜Ｄは、頭蓋内ＧＬ２６１神経膠腫の生存試験の異なる処置群の各Ｃ５７ＢＬ／６マウスの体重増加を示す一連のグラフである。

【図25B】図２５Ａ〜Ｄは、頭蓋内ＧＬ２６１神経膠腫の生存試験の異なる処置群の各Ｃ５７ＢＬ／６マウスの体重増加を示す一連のグラフである。

【図25C】図２５Ａ〜Ｄは、頭蓋内ＧＬ２６１神経膠腫の生存試験の異なる処置群の各Ｃ５７ＢＬ／６マウスの体重増加を示す一連のグラフである。

【図25D】図２５Ａ〜Ｄは、頭蓋内ＧＬ２６１神経膠腫の生存試験の異なる処置群の各Ｃ５７ＢＬ／６マウスの体重増加を示す一連のグラフである。

【図26】図２６は、頭蓋内ＧＬ２６１神経膠腫生存試験の各処置群の４０日間にわたる平均重量を示すグラフである。

【図27】図２７は、ＭＣＦ−７細胞に対するタモキシフェンと化合物（Ｉ）の相乗的増殖阻害効果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、以下の付随の説明に示す。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料をここに記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は、本説明から明らかとなろう。本明細書において、文脈から明白にそうでないことが示される場合以外は、単数形は複数も含む。特に記載のない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、本発明の明細書に支配される。本明細書に挙げたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0019】

化合物（Ｉ）は、合成、経口でバイオアベイラブルであり、高度に選択的な小分子Ｓｒｃチロシンキナーゼインヒビターである。これは、ペプチド基質結合部位を標的化し、他の既知のすべてのＳｒｃキナーゼインヒビターのようにＡＴＰ結合部位を標的化するものでないため、化合物（Ｉ）の類型において最初のものである。その腫瘍細胞生物学的活性の規定において、化合物（Ｉ）は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）のＳｒｃ触媒性トランスリン酸化、Ｓｈｃ、パキシリンおよびＳｒｃキナーゼ自己リン酸化を、２０ｎＭ前後のＩＣ_５０で強力に阻害することが示された。また、ｐ５３発現を誘導し、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰ切断を刺激することが示され、これらはすべて腫瘍細胞アポトーシスをもたらす。

【0020】

化合物（Ｉ）は、広範な充実性腫瘍細胞型ならびに多くの白血病型、例えば、イマチニブおよび／またはダサチニブに耐性のものに対して強力である。市販のおよび現在開発中のＳｒｃキナーゼインヒビターとは異なり、化合物（Ｉ）は、ＡＴＰ結合部位に関して競合しない。該化合物は、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＬｃｋおよびＺＡＰ７０を阻害しないため高度に選択的である。該化合物は、Ｂｃｒ／Ａｂｌの阻害においてダサチニブよりも１０〜１００倍低い効力を有する。ダサチニブおよびイマチニブのメシル酸塩によるＢｃｒ／Ａｂｌの阻害は心臓毒性と関連していることが示されているため、化合物（Ｉ）は、おそらく心臓毒性が低い。

【0021】

インビボ有効性の点では、化合物（Ｉ）は、ＨＴ２９（ヒト結腸癌）異種移植片マウスモデルにおいて、腫瘍細胞増殖に対してダサチニブより約５倍強力である。ＰＣ３−ＭＭ２（ヒト前立腺癌）正所性マウスモデルにおいて、化合物（Ｉ）は、原発腫瘍増殖ならびにリンパ節転移の両方の強力な阻害を示した。

【0022】

キナーゼは多種多様な通常の細胞内シグナル伝達経路（例えば、細胞の増殖、分化、生存、接着、遊走など）の調節に関与しているため、キナーゼは、さまざまな疾患および障害に役割を果たしていると考えられる。したがって、キナーゼシグナル伝達カスケードのモジュレーションは、かかる疾患および障害を処置または予防または防御するための重要な一様式であり得る。かかる疾患および障害としては、例えば、癌、骨粗鬆症、心血管障害、免疫機構機能不全、ＩＩ型糖尿病、肥満、および移植片拒絶が挙げられる。

【0023】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、キナーゼシグナル伝達カスケードの一構成成分のモジュレーションに有用である。いくつかのプロテインキナーゼおよびホスファターゼが知られており、治療薬の開発の対象である。例えば、ＨｉｄａｋａおよびＫｏｂａｙａｓｈｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ，１９９２，３２：３７７−３９７；Ｄａｖｉｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０００，３５１：９５−１０５（各々は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【0024】

キナーゼファミリーの１つであるプロテインチロシンキナーゼは、２つの大きなファミリー：受容体型チロシンキナーゼまたはＲＴＫ（例えば、インスリン受容体型キナーゼ（ＩＲＫ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、塩基性線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶΕＧＦＲ−２もしくはＦｌｋｌ／ＫＤＲ）、および神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ））と、非受容体型チロシンキナーゼまたはＮＲＴＫ（例えば、Ｓｒｃファミリー（Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｙｒｋ、Ｆｇｒ、Ｈｃｋ、Ｌｃｋ、およびＬｙｎ）、Ｆａｋ、Ｊａｋ、ＡｂｌならびにＺａｐ７０）に分けられる。例えば、ＰａｒａｎｇおよびＳｕｎ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，２００５，１５：１１８３−１２０７（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【0025】

さまざまな癌におけるＳｒｃキナーゼにおける役割のため、これらのキナーゼは、高度に転移性の癌細胞の増殖などの癌の治療剤としてのＳｒｃインヒビターの開発に関するいくつかの研究の対象である。Ｓｒｃインヒビターは、さまざまな癌、例えば、結腸癌、前癌性結腸病変、卵巣癌、乳癌、上皮癌、食道癌、非小細胞肺癌、膵臓癌などの治療剤として探求されている。例えば、Ｆｒａｍｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１６０２：１１４−１３０ならびにＰａｒａｎｇおよびＳｕｎ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，２００５，１５：１１８３−１２０７を参照のこと。

【0026】

他のキナーゼの阻害は、他の型の疾患および障害の処置およびモジュレーションに有用であり得る。例えば、種々の眼疾患は、ＶＥＧＦ受容体型チロシンキナーゼインヒビターの投与によって抑制または予防され得る。チロシンホスファターゼＰＴＰ−１Ｂおよび／またはグリコゲンホスホリラーゼのインヒビターは、ＩＩ型糖尿病または肥満に対する処置をもたらすことがあり得る。ｐ５６１ｃｋのインヒビターは、免疫機構障害の処置に有用であり得る。他の標的としては、ＨＩＶ逆転写酵素、トロンボキサンシンターゼ、ＥＧＦＲＴＫ、ｐ５５ ｆｙｎなどが挙げられる。

【0027】

化合物（Ｉ）は、Ｓｒｃペプチド基質部位に結合するＳｒｃシグナル伝達インヒビターである。化合物（Ｉ）の活性は、ｃ−Ｓｒｃ（５２７Ｆ、構成的に活性で形質転換性）形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびヒト結腸癌細胞（ＨＴ２９）において試験した。例えば、これらの細胞株において、化合物（Ｉ）は、既知のＳｒｃタンパク質基質のリン酸化レベルを用量依存的様式で、増殖阻害効果と良好に相関して低減させることが示された。

【0028】

理論に拘束されることを望まないが、細胞外部の一部のキナーゼ（例えば、Ｓｒｃ）のコンホメーションは、細胞内部では多くのキナーゼが多タンパク質シグナル伝達複合体内に包埋されているため、細胞内部のコンホメーションと比べて顕著に異なると考えられる。したがって、ペプチド基質結合部位は、孤立型キナーゼ内では充分に形成されていない（Ｓｒｃのｘ線構造によって示される）ため、ペプチド基質結合インヒビターでは孤立型キナーゼに対する活性が弱いであろうと考えられる。孤立型キナーゼアッセイでのこの部位に対する結合は、孤立型酵素アッセイにおいて、該インヒビターが、細胞内部に存在するものと同じコンホメーションである非常に少数割合の全タンパク質を捕捉することが必要とされる。これには、検出可能であるために、アッセイにおいて触媒サイクルから相当な量の酵素を排出するための大過剰の該インヒビターが必要とされる。

【0029】

しかしながら、細胞系アッセイでは、ペプチド結合部位が形成されると予測されるため、大過剰のインヒビターは必要とされない。細胞系Ｓｒｃアッセイでは、ＳＨ２およびＳＨ３ドメイン結合タンパク質が、既に、Ｓｒｃコンホメーションにシフトしており、そのため、ペプチド基質結合部位が充分に形成される。したがって、すべての酵素が強力な結合コンホメーションであるため、低濃度のインヒビターによって酵素が触媒サイクルから除去され得る。

【0030】

既知のキナーゼインヒビターの大部分は、一連の孤立型キナーゼアッセイにおいてＡＴＰ競合性であり、不充分な選択性を示す。しかしながら、化合物（Ｉ）は、ペプチド基質結合インヒビターであると考えられる。したがって、Ｓｒｃなどの孤立型酵素に対する化合物（Ｉ）の従来のハイスループットスクリーニングにより、化合物（Ｉ）の発見がもたらされ得る。

【0031】

最近、相当な文献により、重篤な毒性を生じることなく癌治療に対して広く有用なアプローチとして、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ（Ｓｒｃ）の標的化が支持されている。例えば、ＥＧＦ受容体型ＰＴＫシグナル伝達の増強を示す腫瘍、または関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ受容体を過剰発現している腫瘍により、Ｓｒｃが構成的に活性化され、腫瘍浸潤性が増強された。このような細胞におけるＳｒｃの阻害により、増殖の停止が誘導され、アポトーシスが誘発され、形質転換表現型が逆転される（Ｋａｒｎｉら（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８（３３）：４６５４−４６６２）。Ｓｒｃ活性が異常に上昇すると、足場非依存的様式での形質転換細胞の増殖が可能になることがわかっている。これは、おそらく、細胞外マトリックスシグナル伝達によってＦＡＫ／Ｓｒｃ経路内のＳｒｃ活性が、マイトジェンシグナル伝達と協調的様式で増大し、それにより、通常では活性化されているアポトーシス機構がブロックされることによって引き起こされると思われる。そのため、細胞外マトリックスと無関係でなくなると通常は活性化した状態となり得るアポトーシス機構が誘導され得るため、腫瘍細胞内のＦＡＫ／Ｓｒｃ阻害によりアポトーシスが誘導され得る（Ｈｉｓａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３８：Ａ１９２５（１９９７））。また、Ｓｒｃを阻害すると、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現の低減が認められ、このようなＳｒｃ阻害細胞株に由来する腫瘍は、血管新生性の発達の低減を示した（Ｅｌｌｉｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７３（２）：１０５２−１０５７（１９９８））。

【0032】

例えば、マウスにおけるＳｒｃ遺伝子のノックアウトにより、唯一の欠陥、すなわち、波状縁を形成することができず、そのため骨を吸収しない破骨細胞がもたらされた。しかしながら、破骨細胞の骨吸収機能は、このようなマウスにおいて、キナーゼ欠損性Ｓｒｃ遺伝子を挿入することにより（Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇら（１９９７）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１：２８３５−２８４４）回復した。これにより、Ｓｒｃキナーゼ活性は、唯一の既知の毒性が誘発されることなく、インビボで阻害され得ることが示唆された。それは、Ｓｒｃタンパク質の存在が、おそらく、破骨細胞必須シグナル伝達複合体内の他のＰＴＫ（これらは、破骨細胞機能の維持に不可欠である）を漸増および活性化させるのに充分であると思われるためである。

【0033】

Ｓｒｃは、数が増加中のヒト腫瘍において過剰活性化されることがわかっているため、癌治療に対する「ユニバーサル」な標的であると提案されている（Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８，２３９−２４４（１９９６）；Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，１１，１７５−１８２（１９９６））。癌治療のためのＳｒｃ阻害の潜在的有益性は、オートクライン増殖因子ループ効果、細胞マトリックスと無関係でなくなると誘発されるアポトーシスによる転移の阻害、ＶＥＧＦレベルの低下による腫瘍の血管新生の阻害、低毒性によってもたらされる制御不能な細胞増殖の４倍阻害であると思われる。

【0034】

前立腺癌細胞は、パキシリンの過剰発現とｐｌ３０ｃａｓの両方を有することが報告されており、過剰リン酸化されており（Ｔｒｅｍｂｌａｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６８，１６４−１７１，１９９６）、したがって、Ｓｒｃインヒビターの主要標的であり得る。

【0035】

一部の特定の実施形態において、癌の型としては、充実性腫瘍および非充実性腫瘍が挙げられる。具体的な実施形態では、充実性腫瘍は、ＣＮＳ（中枢神経系）の腫瘍、肝臓癌、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌、頚部癌、頭頸部腫瘍、外陰癌ならびに皮膚科系の新生物（例えば、黒色腫、扁平上皮癌および基底細胞癌）から選択される。他の実施形態において、非充実性腫瘍としては、リンパ増殖性障害、例えば、白血病およびリンパ腫が挙げられる。他の実施形態において、障害は転移性疾患である。

【0036】

化合物（Ｉ）は、以下の表に報告するように、広範な充実性腫瘍活性を示す。

【0037】

【表1】

また、化合物（Ｉ）は、１種類以上の抗癌処置剤（放射線療法剤など）および／または抗増殖剤、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤および化学療法剤ならびにその塩および誘導体からなる群より選択される１種類以上の抗癌剤との併用療法にて、癌または細胞増殖障害の処置において使用され得る。一部の特定の実施形態によれば、化合物（Ｉ）は、アルカロイド、アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗薬、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビター、ヌクレオシド類似体、多剤耐性逆転剤、ＤＮＡ結合剤、微小管結合薬、毒素およびＤＮＡアンタゴニストからなる群より選択されるいずれか１種類の薬物との併用療法にて、癌または細胞増殖障害の処置において使用され得る。当業者には、上記の１つ以上の特定の類型の化学療法剤に分類される化学療法剤が認識されよう。

【0038】

好ましい実施形態によれば、化合物（Ｉ）は、代謝拮抗薬（例えば、ゲムシタビン）、トポイソメラーゼＩおよびＩＩのインヒビター、アルキル化剤および微小管インヒビター（例えば、タキソール）、ならびに チロシンキナーゼインヒビター（例えば、スラフェニブ）、ＥＧＦキナーゼインヒビター（例えば、タルセバまたはエルロチニブ）、白金複合体（例えば、オキサリプラチン）；ならびにＡＢＬキナーゼインヒビター（例えば、グリーベックまたはイマチニブ）からなる群より選択される１種類以上の薬剤との併用療法にて、癌または細胞増殖障害の処置において使用され得る。

【0039】

アルカロイドとしては、限定されないが、ドセタキセル、エトポシド、イリノテカン、パクリタキセル（タキソール）、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンが挙げられる。

【0040】

アルキル化剤としては、限定されないが、ブスルファン、イムプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾデパ、カルボクオン、メツレデパ、ウレデパ、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、クロラムブシル、クロラナファジン（ｃｈｌｏｒａｎａｐｈａｚｉｎｅ）、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドＨＣｌ、メルファランノベメビチン、ペルホスファミドフェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、セムスチンラニムスチン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、テモゾロミドが挙げられる。

【0041】

抗生物質およびその類似体としては、限定されないが、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−１−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、メノガリル、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、プロマイシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ジノスタチン、ゾルビシンが挙げられる。

【0042】

代謝拮抗薬としては、限定されないが、デノプテリン、エダトレキサート、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、メトトレキサート、ピリトレキシム、プテロプテリン、ペントスタチン（２’−ＤＣＦ）、トムデックス、トリメトレキサート、クラドリジン、フルダラビン、チアミプリン、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフール、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフル、ヒドロキシ尿素およびウレタンが挙げられる。

【0043】

白金複合体としては、限定されないが、カロプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、オキサリプラチンが挙げられる。

【0044】

抗有糸分裂剤または微小管結合剤としては、限定されないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびタキソールが挙げられる。

【0045】

さらなる抗増殖薬剤と併用して使用すると、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩により、該薬剤の活性が増強され（例えば、相乗作用が得られ）得る。さらに、かかる相乗作用により、化合物（Ｉ）、さらなる抗増殖薬剤または両方を、より少ない投薬量で投与することが可能となり得る、および／または任意の所与の用量の化合物の抗増殖特性が有意に向上し得る。下記の表は、化合物（Ｉ）およびさらなる抗増殖薬剤を用いた併用処置の結果を示す。

【0046】

【表2】

一実施形態において、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の脳の癌を処置または予防または防御するために使用される。本発明の別の態様は、脳の癌を処置または予防または防御するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。脳の癌を予防または防御するため、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体に脳の癌が発生する前に投与される。あるいはまた、該化合物は、被検体の脳の癌を処置するために使用され得る。脳の癌を処置または予防または防御するために使用される化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、キナーゼシグナル伝達カスケード、例えば、キナーゼインヒビター、非ＡＴＰ競合的インヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、プロテインキナーゼホスファターゼインヒビターまたはプロテインチロシンホスフェート１Ｂインヒビターのモジュレーションに関与するものであり得る。

【0047】

用語「脳の癌」はさまざまな癌を包含する。脳腫瘍は、実際に脳自体から生じるものであり得、これは脳の原発性癌として知られ、いくつか種類が存在する。用語「脳の癌」は悪性腫瘍、すなわち、攻撃的に増殖および拡延し、健常細胞をその空間、血液および栄養分を取り上げることによって圧倒している腫瘍をいう。攻撃的に拡延しない腫瘍は良性腫瘍と称される。良性腫瘍は、一般的に悪性腫瘍よりも重篤性が低いが、それでもなお、良性腫瘍が脳において問題を引き起こすことがあり得る。また、脳への転移が生じることがあり得、これは、肺または乳房などの他の癌の脳への拡延に相当する。

【0048】

脳腫瘍は、その脳を構成している細胞と、顕微鏡下での腫瘍の外観との両方によって分類される。原発脳腫瘍は、脳内の任意の細胞、または脳内の特定の構造体から生じる。グリア細胞は脳のニューロンを支持しており、この細胞から生じる腫瘍はグリア腫瘍として知られている。また、脳を囲む膜から腫瘍が発生することがあり得、これは、髄膜腫として知られている。脳の他の構造体が関与している他の型の腫瘍も存在し、脳室上衣腫が挙げられる。最も一般的な原発脳腫瘍は神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、および未分化神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）である。

【0049】

本発明は、中枢神経系および通常は大脳半球の悪性急速増殖性星状細胞腫である神経膠芽腫の処置または予防または防御方法を提供する。神経膠芽腫の同義語としては、多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）、巨細胞神経膠芽腫、および多形性海綿芽細胞腫が挙げられる。神経膠芽腫は、最も一般的な悪性原発脳腫瘍であり、処置するのが非常に困難であることが示されている。この腫瘍は、多くの場合、攻撃的であり、周囲の脳組織に浸潤する。神経膠芽腫はグリア細胞から生じ、グリア細胞は、脳内および脊髄内に見られる他の神経細胞を囲んで保護する組織を形成している細胞である。神経膠芽腫は、主に、星状細胞として知られている星型形状のグリア細胞で構成されている。用語「神経膠腫」は、星状細胞腫、希乏突起神経膠腫、脳室上衣腫、および脈絡叢乳頭腫などの任意の型の脳腫瘍を包含する。星状細胞腫は、細胞がどれだけ速く再生しているか、および近隣組織に浸潤する尤度に基づいて４つの悪性度に分かれる。Ｉ度またはＩＩ度の星状細胞腫は非悪性であり、低度と称されることがあり得る。ＩＩＩ度およびＩＶ度の星状細胞腫は悪性であり、高度星状細胞腫と称されることがあり得る。ＩＩ度星状細胞腫は未分化星状細胞腫として知られている。ＩＶ度星状細胞腫は多形性神経膠芽腫として知られている。

【0050】

本発明は、髄芽細胞腫の処置または予防または防御方法を提供する。髄芽細胞腫は、小脳または後頭蓋窩に起源を有する高度に悪性の原発脳腫瘍である。当初は神経膠腫とみなされていたが、現在では、髄芽細胞腫は、頭蓋未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）ファミリーであることがわかった。

【0051】

小脳に起源を有する腫瘍は、脳の大脳半球を小脳と隔てる厚い膜である天幕（ｔｅｎｔｏｒｉｕｍ）の下方に生じるため、天幕下と称される。髄芽細胞腫に対する別の用語は天幕下ＰＮＥＴである。髄芽細胞腫は、脳に起源を有する最も一般的なＰＮＥＴである。脳のＰＮＥＴ腫瘍はすべて、ほとんどの脳腫瘍とは異なり、脳脊髄液（ＣＳＦ）を介して拡延し、脳および脊椎内の種々の位置に高頻度で転移する浸潤性で急速増殖性の腫瘍である。髄芽細胞腫（ｍｅｄｕｌｌａｂｌａｓｔｏｍａ）の発生のピークは７歳である。髄芽細胞腫の７０パーセントは１６歳未満の個体に発生する。線維形成髄芽細胞腫は、特に成人期に見られる。この型の腫瘍は、５０代を過ぎて発生することは稀である。

【0052】

本発明は、神経組織内で形成される癌である神経芽腫を処置または予防または防御するための方法を提供する。神経芽腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）の細胞は、通常、胚または胎児に見られる非常に初期の発生中の神経細胞と似ている。ｎｅｕｒｏという用語は「神経」を示し、一方、ｂｌａｓｔｏｍａは、未成熟細胞または発生中の細胞が冒される癌をいう。ニューロン（神経細胞）は、脳および脊髄ならびにこれらをその他の身体部と連結する神経の主要な構成要素である。神経芽腫は、通常、副腎内で発生し始めるが、脊髄内で発生し始めることもあり得る。神経芽腫は、小児期の最も一般的な頭蓋外充実性癌である。２００７年では、神経芽腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｏｍａ）は、乳児期の最も一般的な癌であった。米国の年間発生数は、毎年、約６５０例が新たに発生する。神経芽腫の症例の５０パーセント近くは２歳未満の小児に発生する。これは、交感神経系またはＳＮＳの任意の神経堤要素から生じる神経内分泌腫瘍である。自律神経系の分枝であるＳＮＳは、脳からの指令を全身に伝え、攻撃・逃避応答およびアドレナリンまたはエピネフリンの生成を担う神経網である。

【0053】

本発明は、神経上皮の悪性腫瘍である神経上皮腫の処置または予防または防御方法を提供する。神経上皮腫は、小児期および青年期に最も多く見られる。これは、ほとんどの場合、胸壁、骨盤、または骨内もしくは軟組織内いずれかの端部に生じる。診断に使用される手順としては、血液検査および尿検査、罹患骨および全身および肺のＸ線、骨髄吸引、ＣＴスキャン、ならびに透視検査が挙げられ得る。処置としては、手術、放射線療法および化学療法が挙げられる。ユーイング腫瘍は、末梢神経上皮腫の類型の一例である。

【0054】

キナーゼは、脳の癌に役割を果たしていることが示されている。多形性神経膠芽腫の遺伝子発現プロフィールにより、チロシンキナーゼが神経膠腫の遊走／浸潤に役割を果たしていると特定された。例えば、ＰＹＫ２は、非受容体型チロシンキナーゼの接着斑ファミリーの一構成員である；これは、線維芽細胞周囲におけるｓｒｃ誘導性のアクチン重合の増大と密接に関与している。その神経膠腫の遊走／浸潤における役割は、ＰＹＫ２の過剰発現によって培養状態での神経膠芽腫細胞の遊走が誘導されたため、より明白になった。活性化ＰＹＫ２のレベルは、４種類の神経膠芽腫細胞株（ＳＦ７６７、Ｇ１１２、Ｔ９８ＧおよびＵ１１８）において遊走表現型と正に相関していた。インサイチュでのＧＢＭ浸潤（ｉｎｖａｓｔｉｏｎ）における活性化ＰＹＫ２の解析により、浸潤ＧＢＭ細胞において強い染色が示された（Ｈｏｅｌｚｉｎｇｅｒら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，第７巻（１）７−１６参照）。したがって、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩を用いたキナーゼ受容体のモジュレーションは、多形性神経膠芽腫などの脳の癌の防御、予防または処置に有用であり得る。

【0055】

あるいはまた、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の腎癌を処置または予防または防御するために使用され得る。本発明の別の態様は、腎癌を処置または予防または防御するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩を含む。腎癌の予防または防御のためには、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体に腎癌が発生する前に投与される。あるいはまた、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の腎癌を処置するために使用され得る。

【0056】

腎臓に発生し得る癌にはいくつかの型がある。腎細胞癌（ＲＣＣ）は、最も一般的な形態であり、全症例のおよそ８５％を占める。本発明は、腎細胞癌の処置または予防方法を提供する。また、本発明は、他の型の腎臓癌、例えば、腎盂癌（尿が収集される腎臓中心部に形成される癌）、ウィルムス腫瘍（これは、通常、５歳未満の小児に発生する型の腎臓癌である）、明細胞癌（明細胞腺癌および中腎腫とも称され、通常は女性の生殖管の腫瘍型であり、顕微鏡下で見ると細胞内部が透明に見える）、腎腺癌（少なくとも一部の腫瘍において指様突起状の発生特徴とする腎臓腫瘍の一類型）、ならびに腎横紋筋肉腫（成人集団における稀で高度に攻撃的な腫瘍）などの処置方法を提供する。

【0057】

ＲＣＣでは、癌性（悪性）細胞は腎尿細管の内層に発生し、増殖して腫瘍塊になる。ほとんどの場合、単一の腫瘍が発生するが、一方または両方の腎臓に１つより多くの腫瘍が発生することもあり得る。ＲＣＣは、警告性の初期の徴候がないこと、多様な臨床症状、放射線および化学療法に対する抵抗性、ならびに免疫療法剤（インターフェロンαおよびインターロイキン（ＩＬ）−２など）に対する稀であるが再現性のある応答を特徴とする。かつて、ＲＣＣ腫瘍は副腎に由来すると考えられていた；したがって、副腎腫という用語がしばしば使用されていた。

【0058】

腎細胞癌の起源の組織は、近位腎尿細管上皮である。腎癌には、散発性（非遺伝性）形態および遺伝性形態の両方が存在し、両形態とも第３染色体の短腕（３ｐ）の構造的改変と関連している。腎癌発生リスクの高い家族の遺伝子の研究により、改変によって腫瘍形成がもたらされる遺伝子のクローニングが行なわれた。これらの遺伝子は腫瘍抑制遺伝子（ＶＨＬ、ＴＳＣ）または癌遺伝子（ＭＥＴ）のいずれかである。腎細胞癌と関連している少なくとも４種類の遺伝性症候群：（１）フォン・ヒッペル‐リンダウ（ＶＨＬ）症候群、（２）遺伝性乳頭状腎癌（ＨＰＲＣ）、（３）バート−ホッジ−デューブ症候群（ＢＨＤＳ）と関連している家族性腎臓膨大細胞腫（ＦＲＯ）、および（４）遺伝性腎癌（ＨＲＣ）が認められる。

【0059】

ＲＣＣは主に、限局性疾患を有する全患者のほぼ３０％において、その４０％に原発腫瘍の除去後に遠隔転移が発生するため、予後が非常に不良である。年齢を調整した腎細胞癌の発生率は、毎年３％上昇している。米国癌協会によると、２００７年では、米国において、およそ５１，５００例の悪性腎臓腫瘍が診断され、およそ１２，５００例が死亡し；腎臓細胞癌がこの発生率および死亡率の８０％を占めた。根治的腎摘出術は、限局性ＲＣＣの主な処置法である。しかしながら、進行した転移性のＲＣＣに対しては、放射線療法および利用可能な化学療法剤は有効でない。

【0060】

インターフェロン−αおよびインターロイキン−２が使用される免疫療法は、転移性ＲＣＣを有する患者には少数割合でのみ有効であり、極めて毒性である。最近、腎癌の処置のためのキナーゼインヒビターが開発され、例えば、グリーベック（登録商標）および多受容体型キナーゼの標的化による抗血管形成効果を有する他の新規な薬剤（ソラフェニブおよびスニチニブなど）は、免疫療法が効かない患者において活性が示された。しかしながら、これらの処置剤もまた、制限がない訳ではない。例えば、グリーベック（登録商標）の効果は、特定の型の腫瘍に限定的であり、抵抗性が発現され得ることがわかっている。また、スニチニブを受けている患者は、高血圧などの心血管副作用についてモニターすべきであることが推奨されている。そのため、腎癌の処置および予防のための方法の開発の必要性が存在している。

【0061】

あるいはまた、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の肝臓癌を処置または予防または防御するために使用され得る。本発明の別の態様は、肝臓癌を処置または予防または防御するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。肝臓癌を予防または防御するため、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体に肝臓癌が発生する前に投与される。あるいはまた、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の肝臓癌を処置するために使用され得る。

【0062】

いくつかの型の癌は、肝臓内に発生し得る。肝細胞癌（ＨＣＣ）は全肝臓癌の８０〜９０％を占める。本発明は、肝細胞癌の処置または予防方法を提供する。ＨＣＣは、主要な肝臓細胞型である肝細胞内で最初に発生する。原発性肝臓癌の４例のうち約３例は、この型である。ＨＣＣは、異なる増殖パターンを有し得る。一部のものは、最初に単一の腫瘍として発生し、大きく成長する。疾患後期の場合のみ、肝臓の他の部分に拡延する。また、ＨＣＣは、単一の腫瘍ではなく、最初から肝臓全体に多くの斑点状に発生することもあり得る。

【0063】

また、本発明は、他の型の肝臓癌、例えば、胆嚢の胆管内で最初に発生する胆管癌の処置のための方法を提供する；脈管肉腫および血管肉腫は、肝臓の血管内で最初に発生する他の形態の癌の２つの例である。このような腫瘍は急速に増殖する。多くの場合、発見されるまでに広く拡延し過ぎて除去できず、処置はあまり効果がないことがあり得る；胚芽細胞腫は、小児に発生する癌であり、通常、４歳以下の小児に見られる。

【0064】

キナーゼは、肝臓癌の一因であることが示されている。例えば、ヒトＨＣＣにおいて発生することがわかっている変化は、受容体型プロテインチロシンキナーゼＭｅｔをコードするプロト癌遺伝子ＭＥＴの過剰発現、増幅または変異である（Ｔｗａｒｄら、ＰＮＡＳ，第１０４巻（３７）１４７７１−１４７７６参照）。また、ＦＡＫは、インビトロおよびインビボにおいて、体液流中で循環している癌腫細胞のインテグリン媒介性接着の初期事象に関与していることが示されている。このキナーゼは、接着性腫瘍細胞が剪断力に耐えるのを可能にする明白な接着相互作用の確立に関与している可能性があると考えられる（Ｓｅｎｇｂｕｓｃｈら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，第１６６巻（２）５８５−５９５参照）。２００７年では、肝臓癌は、世界規模で癌関連死亡例の３番目に主要な原因であり、最も広範に世界中に拡延した癌の第６位であった。世界中で年間６００，０００人が肝臓癌と診断されており、発生率は上昇している。したがって、肝臓癌の処置、予防および防御ための方法の開発の必要性が存在している。

【0065】

別の実施形態によれば、患者に化合物（Ｉ）を投与することを含む、宿主の白血病を処置、予防または防御するための方法が提供される。別の実施形態では、患者に、有効量の化合物（Ｉ）と、抗増殖剤、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤および化学療法剤ならびにその塩および誘導体からなる群より選択される少なくとも１種類のさらなる治療用薬剤とを投与することを含む、宿主の白血病の処置方法が提供される。一部の特定の実施形態によれば、化合物（Ｉ）は、アルカロイド、アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗薬、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビター、ヌクレオシド類似体、多剤耐性逆転剤、ＤＮＡ結合剤、微小管結合薬、毒素およびＤＮＡアンタゴニストからなる群より選択される１種類以上の薬物との併用療法にて、白血病の処置において使用され得る。当業者には、上記の１つ以上の特定の類型の化学療法剤に分類される化学療法剤が認識されよう。

【0066】

白血病は、骨髄および血液の悪性の癌であり、制御不能な血液細胞の増殖を特徴とする。一般的な型の白血病は、４つのカテゴリー：急性または慢性で骨髄性（骨髄の骨髄系要素（白血球、赤血球、巨核球）が関与している）、および急性または慢性でリンパ性（リンパ系統の細胞が関与している）に分けられる。白血病の処置は、一般的に白血病の型に依存する。白血病の標準的な処置は、通常、化学療法および／または骨髄移植および／または放射線療法を伴う。例えば、米国特許第６，６４５，９７２号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【0067】

白血病における化学療法は、２種類以上の抗癌薬の併用を伴うことがあり得る。およそ４０種類の異なる薬物が、現在、白血病の処置に単独または併用のいずれかで使用されている。また、白血病の他の処置としては、多剤耐性の逆転（悪性細胞が化学療法剤の損傷効果を逸れること（そして、不応性または再発をもたらすこと）を可能にする機構を低減させる薬剤の使用を伴う）；生物学的療法（モノクローナル抗体の使用を伴う、この場合、悪性細胞が担持している相補抗原と反応する抗体に毒素を結合させる）；ならびにサイトカイン（例えば、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子ＣＳＦ）（これらは、血液細胞の生成を刺激し、処置後、より速やかに血液細胞計数の回復を補助する天然の化学物質である）が挙げられる。このような薬物の例としては、多剤耐性逆転剤ＰＳＣ ８３３、モノクローナル抗体リツキサンおよび以下のサイトカイン：エリスロポエチンおよびポエチン（これらは、赤血球の生成を刺激する）；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、フィリグラスチム、およびサルグラモスチム（これらは、白血球の生成を刺激する）；ならびにトロンボポエチン（これは、血小板の生成を刺激する）が挙げられる。

【0068】

多くのヌクレオシド類似体は、抗癌活性を有することがわかっている。シタラビン、フルダラビン、ゲムシタビンおよびクラドリビンは、白血病の処置において現在重要な薬物であるヌクレオシド類似体の一例である。β−Ｌ−ＯｄｄＣ（（−）−β−Ｌ−ジオキソラン−シチジン、トロキサチル（登録商標）、Ｓｈｉｒｅ ＢｉｏＣｈｅｍ Ｉｎｃ．製）もまたヌクレオシド類似体であり、これは、最初は抗ウイルス薬として、Ｂｅｌｌｅａｕら（ＥＰ ３３７７１３、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって報告され、強力な抗腫瘍活性を有することが示された（Ｋ．Ｌ．Ｇｒｏｖｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５（１４），３００８−１１，１９９５；Ｋ．Ｌ．Ｇｒｏｖｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６（１８），４１８７−４１９１，１９９６，Ｋ．Ｌ．Ｇｒｏｖｅら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６：１２２９−３３，１９９７；Ｓ．Ａ Ｋａｄｈｉｍら、Ｃａｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７（２１），４８０３−１０，１９９７）。臨床試験では、β−Ｌ−ＯｄｄＣは、進行した白血病の患者において有意な活性を有することが報告された（Ｇｉｌｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第１９巻，Ｎｏ ３，２００１）。

【0069】

Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビター、例えば、ＳＴＩ−５７１（グリーベック（登録商標）、イマチニブメシル酸塩（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．製）では、特に慢性骨髄性白血病において有意な抗白血病活性が示されている。例えば、ＳＴＩ−５７１は、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害が標的化される患者群において有望な治療剤となっている。しかしながら、有意な血液学的応答および細胞発生性応答にもかかわらず、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビターに対する耐性が、特に、進行期相の慢性骨髄性白血病において生じる。かかる耐性は、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビターであるイマチニブ、ダサチニブ、ＡＺＤ０５３０で示された。

【0070】

したがって、以前にＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビターで処置されたことがあり、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビターに対して耐性となった白血病患者の処置のための薬剤のさらなる開発の必要性が高い。したがって、別の実施形態では、以前にＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビターで処置されたことがあり、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビター処置に対して抵抗性となった患者に、ある量の化合物（Ｉ）を投与することを含む、宿主の白血病を処置するための方法が提供される。さらに、患者に、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビターをある量の化合物（Ｉ）と併用して投与することを含む、宿主の白血病の併用療法のための方法が提供される。一実施形態において、該併用薬は、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビター処置に対して抵抗性となった患者に投与される。

【0071】

化合物（Ｉ）は、以下の表に示されるように、既存の治療用薬剤と比較した場合、抗白血病活性を示す。

【0072】

【表3】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、乾癬などの他の細胞増殖関連障害のために使用され得る。

【0073】

本明細書に記載のように、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の難聴を処置または防御または予防するために使用され得る。本発明の別の態様は、難聴を予防または防御または処置するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。難聴を防御または予防するため、該化合物は、騒音への曝露または難聴を誘発する薬物への曝露の前に投与され得る。かかる薬物としては、化学療法薬（例えば、毛細胞を標的化する白金系薬物）およびアミノグリコシド抗生物質が挙げられ得る。化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、特定の癌用薬物とともに相乗効果をもたらすものであり得る。例えば、有望なインヒビターは、原発性ヒト腫瘍組織アッセイにおいて、特に、他の既知の抗癌薬との相乗作用を調べるためにスクリーニングされ得る。また、プロテインキナーゼインヒビターは、特定の癌用薬物（例えば、蝸牛および腎臓に対して毒性である白金系薬物）の毒性を低下させ、それにより投薬量の増加を可能にするものであり得る。

【0074】

あるいはまた、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の難聴を処置するために使用され得る。この実施形態では、該化合物は被検体に、難聴が起こった後に、難聴レベルを低下させるために投与される。化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、キナーゼカスケード、例えば、キナーゼインヒビター、非ＡＴＰ競合的インヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、Ｓｒｃインヒビターまたは接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）モジュレーターのモジュレーションに関与するものであり得る。理論に拘束されることを望まないが、キナーゼインヒビターの投与により蝸牛毛細胞のアポトーシスが抑制され、それにより難聴が抑制されると考えられる。一実施形態において、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、難聴に苦しむ被検体に、さらなる難聴を抑制するために投与される。別の実施形態において、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、難聴に苦しむ被検体に、失われた聴力を回復させるために投与される。特に、騒音曝露後、蝸牛毛細胞間の緊密な細胞間連結、ならびに細胞−細胞外マトリックス相互作用が壊れ、ストレスがかかる。このような緊密な細胞間連結へのストレス負荷により、チロシンキナーゼが分子スイッチとして作用し、接着斑キナーゼと相互作用し、細胞−マトリックス破壊シグナルを核に伝達する複雑なシグナル伝達経路によって、細胞内でアポトーシスが起こる。キナーゼインヒビターの投与により、このカスケードにおけるアポトーシスの発生が抑制されると考えられる。

【0075】

騒音に曝露された蝸牛内でのアポトーシスの確認により、騒音性難聴（ＮＩＨＬ）の予防のためのいくつかの新たな可能性が生じている（Ｈｕら；２０００，Ａｃｔａ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ，１２０，１９−２４）。例えば、耳の正円窓への抗酸化薬の投与によって、耳がＮＩＨＬから保護され得る（Ｈｉｇｈｔら；２００３，Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．，１７９，２１−３２；Ｈｕら；Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．１１３，１９８−２０６）。具体的には、チンチラにおいて、ＦＤＡ承認抗酸化性化合物（Ｎ−Ｌ−アセチルシステイン（Ｌ−ＮＡＣ）およびサリチル酸塩）を投与することによって、ＮＩＨＬが低減された（Ｋｏｐｋｅら；２０００，Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．，１４９，１３８−１４６）。さらに、Ｈａｒｒｉｓらにより、最近、Ｓｒｃ−ＰＴＫインヒビターによるＮＩＨＬの予防が報告された（Ｈａｒｒｉｓら；２００５，Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．，２０８，１４−２５）。したがって、キナーゼの活性をモジュレートする本発明の化合物の投与は難聴の処置に有用であるという仮説が立てられる。

【0076】

細胞結合または細胞ストレスにおける変化により、インテグリンの活性化およびＰＴＫ（例えば、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリー）のリン酸化によって、さまざまなシグナルが活性化され得る。Ｓｒｃ相互作用は、細胞骨格を修飾し、細胞の生存と遺伝子の転写を調節しているさまざまなプロテインキナーゼカスケードを活性化させるシグナル伝達経路と関連している（概説については、ＧｉａｎｃｏｔｔｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ；１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５、１０２８−１０３２）。実際、最近の結果により、大きな騒音曝露後に細胞基部で剥離した外毛細胞（ＯＨＣ）で、アポトーシス細胞死が起こったことが示された。具体的には、Ｓｒｃ ＰＴＫシグナル伝達カスケードは、蝸牛の感覚細胞のアポトーシスの代謝性の発生と機械的誘導性発生の両方に関与していると考えられる。最近の研究において、Ｓｒｃインヒビターが、４時間の４ｋＨｚオクターブ帯域の１０６ｄＢの騒音からの保護を提供し、これは、Ｓｒｃ−ＰＴＫが騒音曝露後に、外毛細胞において活性化され得ることを示す（Ｈａｒｒｉｓら；２００５，Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．，２０８，１４−２５）。したがって、Ｓｒｃの活性をモジュレートする化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、難聴の処置に有用である。

【0077】

本発明は、被検体の骨粗鬆症を予防または防御または処置するための方法に関する。本発明の別の態様は、骨粗鬆症を予防または防御または処置するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。この方法は、骨粗鬆症を予防または防御または処置するための被検体への有効量の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の投与を伴う。骨粗鬆症を予防または防御するため、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、骨粗鬆症の発生前に投与される。あるいはまた、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の骨粗鬆症を処置するために使用され得る。この実施形態では、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体に、骨粗鬆症が起こった後に、骨粗鬆症レベルを低下させるために投与される。

【0078】

Ｓｒｃの欠損は、破骨細胞機能の低下のため、骨粗鬆症と関連していることがマウスにおいて示されている（Ｓｏｒｉａｎｏら；１９９１，Ｃｅｌｌ，６４，６９３−７０２）。また、ＩＲＡＫ−Ｍが欠損しているマウスは重度の骨粗鬆症を発現し、これは、破骨細胞の分化の加速、破骨細胞の半減期およびその活性化と関連していることがわかっている。（Ｈｏｎｇｍｅｉら；２００５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０１，１１６９−１１７７）。

【0079】

多核破骨細胞は、単核食細胞の融合体から発生し、骨吸収による骨の発生とリモデリングに主な役割を果たしている。破骨細胞は多核性であり、鉱化マトリックスを分解する最終分化細胞である。正常な骨組織では、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収が均衡している。この動的な高度に調節されたプロセスの均衡が破壊されると、骨吸収が骨形成を上回ることになり得、定量的な骨量減少がもたらされ得る。破骨細胞は、骨の発生とリモデリングに不可欠であるため、その数および／または活性の増加により、全身の骨量減少と関連する疾患（例えば、骨粗鬆症）および限局性の骨量減少を伴う他の疾患（例えば、関節リウマチ、歯周病）がもたらされる。

【0080】

破骨細胞および骨芽細胞はともに、プロテインキナーゼが関与する多くの細胞内シグナル伝達経路を指令する。破骨細胞の活性化は、骨への接着、細胞骨格の再構成、封止ゾーンの形成、および極性波状膜の形成によって起始される。プロテインチロシンキナーゼ２（ＰＹＫ２）は、破骨細胞内の接着開始型シグナル伝達によってチロシンリン酸化され、活性化されるため、細胞表面から細胞骨格へのシグナルの伝達に参与していると考えられる（Ｄｕｏｎｇら；１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２，８８１−８９２）。最近の証拠により、ＰＹＫ２タンパク質レベルが低下すると、インビトロで破骨細胞の形成と骨吸収の阻害がもたらされることが示された。（Ｄｕｏｎｇら；２００１，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２７６，７４８４−７４９２）。したがって、ＰＹＫ２または他のプロテインチロシンキナーゼを阻害すると、破骨細胞の形成と骨吸収が低減されることにより、骨粗鬆症レベルが低下するかもしれない。したがって、理論に拘束されることを望まないが、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の投与により、キナーゼ（例えば、ＰＴＫ）活性がモジュレートされ、したがって、破骨細胞の形成および／または骨吸収の阻害がもたらされ、それにより骨粗鬆症が処置されるという仮説が立てられる。

【0081】

Ｓｒｃチロシンキナーゼは、破骨細胞（正）および骨芽細胞（負）の両方におけるＳｒｃの調節的役割を示すＳｒｃノックアウトマウス試験およびインビトロ細胞実験で確認されるように、骨疾患の有望な治療標的として卓越している。破骨細胞において、Ｓｒｃは、運動性、分極、生存、活性化（波状縁形成）および接着において、種々のシグナル伝達経路（特に、サイトカインおよびインテグリンシグナル伝達）を媒介することにより重要な役割を果たしている（ＰａｒａｎｇおよびＳｕｎ；２００５，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，１５，１１８３−１２０７）。さらに、マウスのｓｒｃ遺伝子を標的化破壊すると、骨吸収の低減を特徴とする障害である大理石骨病が誘発されるが、他の組織または細胞にはなんら明白な形態的または機能的異常が示されない（Ｓｏｒｉａｎｏら；１９９１，Ｃｅｌｌ，６４，６９３−７０２）。Ｓｒｃ^−／−マウスの大理石骨病表現型は、細胞自律性であり、成熟破骨細胞（これは、通常、高レベルのＳｒｃタンパク質を発現する）の欠陥に起因する（Ｈｏｍｅら；１９９１，Ｃｅｌｌ，１１９，１００３−１０１３）。破骨細胞活性を誘発し、骨芽細胞を阻害するＳｒｃチロシンキナーゼの有効性を制限することにより、Ｓｒｃインヒビターは、骨の崩壊を低減させ、骨形成を促すと考えられる。破骨細胞は、通常、高レベルのＳｒｃを発現するため、Ｓｒｃキナーゼ活性の阻害は、骨粗鬆症の処置に有用であり得る（Ｍｉｓｓｂａｃｈら；１９９９，Ｂｏｎｅ，２４、４３７−４４９）。

【0082】

本明細書に記載のように、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の肥満を処置、防御または予防するために使用され得る。本発明の別の態様は、肥満を予防、防御または処置するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。肥満を予防または防御するため、該化合物は、被検体が肥満になる前に投与される。あるいはまた、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の肥満を処置するために使用され得る。

【0083】

肥満は、糖尿病ならびにインスリン応答性組織（骨格筋、肝臓および白色脂肪組織など）におけるインスリン抵抗性の増大と関連している（Ｋｌａｍａｎら；２０００，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，２０，５４７９−５４８９）。インスリンは、グルコース恒常性、脂質代謝およびエネルギー均衡の調節に重要な役割を果たしている。インスリンシグナル伝達は、インスリンが、受容体型チロシンキナーゼであるインスリン受容体（ＩＲ）に結合することによって起始される。インスリン結合により、多数のチロシル残基上のＩＲの自己リン酸化から始まるリン酸化事象のカスケードが誘起される。自己リン酸化により、ＩＲキナーゼ活性が向上し、下流のシグナル伝達事象が誘発される。プロテインチロシンキナーゼの刺激効果とプロテインチロシンホスファターゼの阻害効果は、インスリンの作用を大きく規定する。適切なインスリンシグナル伝達は、血中グルコース濃度の大きく変動するのを最小限に抑え、細胞へのグルコースの充分な送達を確保する。インスリン刺激によって多様なチロシルリン酸化事象がもたらされるため、１種類以上のプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）の活性の向上により、インスリン抵抗性がもたらされ得、これにより肥満となり得る。実際、いくつかのインスリン抵抗性状態（例えば、肥満）において、ＰＴＰ活性の増大が報告されている（Ａｈｍａｄら；１９９７，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，４６，１１４０−１１４５）。したがって、理論に拘束されることを望まないが、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の投与により、キナーゼ（例えば、ＰＴＰ）活性がモジュレートされ、それにより被検体の肥満が処置される。

【0084】

インスリンシグナル伝達は、チロシンリン酸化によるＩＲの活性化から始まり、グルコース輸送体ＧＬＵＴ４による細胞内へのグルコースの取込み時に最大となる（ＳａｌｔｉｅｌおよびＫａｈｎ；２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１４，７９９−８０６）。次いで、この活性化ＩＲは不活化され、基底状態に戻るはずである（プロテインチロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）が関与していると考えられているプロセス）（Ａｈｍａｄら；１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２０５０３−２０５０８）。マウスにおいてＰＴＰ−１Ｂをコードする遺伝子を破壊すると、インスリンに対する感受性および食事誘導性肥満に対する抵抗性の増大がもたらされる（Ｅｌｃｈｅｂｌｙら；１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，１５４４−１５４８；Ｋｌａｍａｎら；２０００，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，２０，５４７９−５４８９）。ＰＴＰ−１Ｂ欠損マウスにおける脂肪過多の低減は、脂肪細胞数は減少することなく脂肪細胞質量が著しく減少したことによるものであった（Ｋｌａｍａｎら；２０００，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，２０、５４７９−５４８９）。さらに、ＰＴＰ−１Ｂ欠損マウスにおける痩身は、基礎代謝率および総エネルギー消費量の上昇によって達成されたものであり、非カップリングタンパク質のｍＲＮＡ発現に著しい改変はなかった。ＰＴＰ−１Ｂ遺伝子の破壊により、ＰＴＰ−１Ｂの活性の改変によってインスリンシグナル伝達および食事誘導性肥満がインビボでモジュレートされ得ることが示された。したがって、理論に拘束されることを望まないが、インスリンシグナル伝達（例えば、ＰＴＰ−１Ｂ活性）をモジュレートする化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の投与は、被検体の肥満の処置に有用である。

【0085】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の糖尿病を予防または防御または処置するために使用され得る。本発明の別の態様は、糖尿病を予防、防御または処置するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。糖尿病を予防または防御するため、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体が糖尿病になる前に投与される。あるいはまた、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の糖尿病を処置するために使用され得る。

【0086】

２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）は、エネルギー代謝調節不全の障害である。エネルギー代謝は、主に、タンパク質、炭水化物および脂質の合成と貯蔵を促進し、その崩壊を抑止して循環系内に放出し戻す強力なアナボリック因子であるホルモンインスリンによって制御される。インスリンの作用は、そのチロシンキナーゼ受容体への結合によって該キナーゼの自己リン酸化と触媒活性の増大がもたらされることにより起始される（Ｐａｔｔｉら；１９９８，Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９、８９−１０９）。チロシンのリン酸化により、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）タンパク質と、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のｐ８５調節性サブユニットとの相互作用が引き起こされ、該酵素の活性化および特定の細胞内局在に対する標的化（細胞型に応じて）がもたらされる。該酵素により、数多くのタンパク質の局在と活性を調節する脂質生成物ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ_３）が生成される（Ｋｉｄｏら；２００１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８６，９７２−９７９）。ＰＩ３Ｋは、インスリン刺激性のグルコースの取込みと貯蔵、脂肪分解の抑止および肝臓内遺伝子発現の調節に不可欠な役割を有する（Ｓａｌｔｉｅｌら；２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１４，７９９−８０６）。ＰＩ３Ｋの優性干渉（ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）形態が過剰発現されると、グルコース取込みおよび原形質膜へのグルタミン酸輸送体４（ＧＬＵＴ４）のトランスロケーションがブロックされ得る（Ｑｕｏｎら；１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１５，５４０３−５４１１）。したがって、キナーゼ（例えば、ＰＩ３Ｋ）活性をモジュレートし、したがってグルコース取込みの増大をもたらす本発明の化合物の投与は、糖尿病の処置に有用である。

【0087】

ＰＴＥＮは、多くの（ｍａｙ）細胞型におけるＰＩ３Ｋシグナル伝達の主要な調節因子であり、ＰＩ３Ｋ経路の抗アポトーシス性、増殖性および肥大性活性という拮抗作用のため、腫瘍抑制因子としての機能を果たす（Ｇｏｂｅｒｄｈａｎら；２００３，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１２，Ｒ２３９−Ｒ２４８；Ｌｅｓｌｉｅら；２００４，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３８２，１−１１）。理論に拘束されることを望まないが、ＰＴＥＮは、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ_３分子の脱リン酸化によってこの重要な脂質セカンドメッセンジャーをＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ_２に分解し、ＰＩ３Ｋ経路を減衰させると考えられる。最近の研究において、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて内因性ＰＴＥＮタンパク質を５０％減少させると、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ_３レベルおよびグルコース取込みのインスリン依存性増大が増強された（Ｔａｎｇら；２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８０，２２５２３−２２５２９）。したがって、理論に拘束されることを望まないが、ＰＴＥＮ活性をモジュレートし、したがってグルコース取込みの増大をもたらす化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の投与は、糖尿病の処置に有用であるという仮説が立てられる。

【0088】

ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ_３レベルは、ＳＲＣ相同性２（ＳＨ２）含有イノシトール５’−ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）タンパク質ファミリーのＳＨＩＰ１およびＳＨＩＰ２によっても制御される（ＬａｚａｒおよびＳａｌｔｉｅｌ；２００６，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５，３３３−３４２）。ＳＨＩＰ２は、数あるインスリン感受性組織の中でも骨格筋において発現され、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ_３のＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ_２への変換を触媒する（Ｐｅｓｅｓｓｅら；１９９７；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３９、６９７−７００；Ｂａｃｋｅｒｓら；２００３，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．，４３、１５−２８；Ｃｈｉら；２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９，４４９８７−４４９９５；Ｓｌｅｅｍａｎら；２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，１１，１９９−２０５）。ＳＨＩＰ２の過剰発現により、インスリン刺激型ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ_３レベルが著しく低下し、これは、ＳＨＩＰ２がＰＩ３Ｋの下流エフェクターの活性化を減衰させる能力を有するという提案と整合する（Ｉｓｈｉｈａｒａら；１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６０，２６５−２７２）。

【0089】

本明細書に記載のように、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の眼疾患を処置、防御または予防するために使用され得る。本発明の別の態様は、眼疾患を処置、防御または予防するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。眼疾患を防御または予防するため、該化合物は、被検体に眼疾患が発生する前に投与される。あるいはまた、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の眼疾患、例えば、黄斑変性、網膜症および黄斑浮腫を処置するために使用され得る。

【0090】

生理学的に無血管の角膜に、視力障害性の新生血管形成が起こることがあり得る。増殖性網膜症、主に糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性は、血管透過性の増大により、網膜浮腫および網膜下への液体の蓄積、ならびに出血性の新たな血管の増殖がもたらされることを特徴とする。血管新生（既に存在している毛細血管からの新たな血管の形成）は、正常な発生および数多くの病理過程の両方において不可欠である。ＶＥＧＦは、複雑な血管新生カスケードの中心的な媒介因子であり、かつ強力な透過性因子であり、新規治療薬の魅力的な標的である。ＶＥＧＦは、２つの膜結合型チロシンキナーゼ受容体ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２のリガンドである。リガンド結合により、ＶＥＧＦＲの二量体化および後に細胞内チロシンキナーゼドメインの活性化を伴うトランスリン酸化が誘発される。その後の細胞内シグナル伝達軸により、血管内皮細胞の増殖、遊走および生存がもたらされる。したがって、理論に拘束されることを望まないが、キナーゼ活性（例えば、チロシンキナーゼ活性）をモジュレートし、血管新生および／または新生血管形成の阻害をもたらす本発明の化合物の投与は、眼疾患、例えば、黄斑変性、網膜症および／または黄斑浮腫の処置に有用であるという仮説が立てられる。

【0091】

黄斑変性は、ＶＥＧＦ媒介性網膜漏出（血管透過性の増大）および目の裏側での小血管の異常増殖（血管新生）を特徴とする。ＶＥＧＦは、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性の両方において血管新生膜内で確認され、該因子の眼内レベルは、糖尿病性網膜症での新生血管形成の重症度と相関している（Ｋｖａｎｔａら；１９９６，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３７，１９２９−１９３４．；Ａｉｅｌｌｏら；１９９４，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３１，１４８０−１４８７）。このモデルにおいて、ＶＥＧＦの治療的拮抗作用により、網膜および脈絡膜両方での新生血管形成の有意な阻害ならびに血管透過性の低減がもたらされる（Ａｉｅｌｌｏら；１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９２、１０４５７−１０４６１；Ｋｒｚｙｓｔｏｌｉｋら；２００２，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌ．，１２０，３３８−３４６；Ｑａｕｍら；２００１，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４２，２４０８−２４１３）。したがって、理論に拘束されることを望まないが、ＶＥＧＦ活性をモジュレートし、血管新生および／または新生血管形成の阻害をもたらす化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の投与は、眼疾患、例えば、黄斑変性、網膜症および／または黄斑浮腫の処置に有用であるという仮説が立てられる。

【0092】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、脳卒中に苦しむリスクがあるか、脳卒中に苦しんでいるか、または脳卒中に苦しんだことがある被検体において、脳卒中を予防または防御または処置するための方法に使用される。化合物（Ｉ）または薬学的に許容され得る塩は、脳卒中後のリハビリテーションを受けている患者の処置方法に有用である。本発明の別の態様は、脳卒中を処置、予防または防御するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。

【0093】

脳卒中は、脳血管障害（ＣＶＡ）としても知られており、脳の一部分への血液供給が動脈の閉塞または血管の破断のいずれかのために遮断される急性の神経学的傷害である。血液供給が遮断された脳部分は、もはや血液によって運ばれる酸素および／または栄養分を受けられなくなる。脳細胞は損傷または壊死状態となり、それにより該脳部分内または該脳部分由来の機能が損なわれる。脳組織は、酸素が６０秒を超えて９０秒間枯渇すると機能しなくなり、数分後、場合によっては不可逆性の損傷となり、組織の死滅、すなわち梗塞に至る。

【0094】

脳卒中は、主に２つの型：虚血性（すなわち、脳への血管供給の閉塞）、および出血性（すなわち、脳内または脳周囲への出血）に分類される。すべての脳卒中のほとんどは虚血性脳卒中である。虚血性脳卒中は、一般的に、血栓性脳卒中、塞栓性脳卒中、全身性灌流低下（ｈｙｐｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）（分水界脳卒中）、または静脈血栓症に分けられる。血栓性脳卒中では、血栓形成過程は罹患動脈内で発生し、血栓、すなわち血餅が徐々に動脈内腔を狭くし、それにより遠位組織への血流が阻止される。このような血餅は、通常、アテローム硬化性斑周囲に形成される。また、血栓性脳卒中には、血栓が形成された血管の型に基づいて分類される２つの型がある。大血管血栓性脳卒中は、総頚動脈および内頚動脈、椎骨動脈、ならびにウィリス輪が関与している。小血管血栓性脳卒中は、大脳内動脈、ウィリス輪の側枝、中大脳動脈幹部、ならびに遠位椎骨動脈および脳底動脈から生じている動脈が関与している
血栓は、たとえ非閉塞性であっても、血栓が破れた場合（この時点で塞栓となる）、塞栓性脳卒中をもたらすことがあり得る。塞栓は、他の個所に起源を有する動脈血流中の移動性の粒子または残屑をいう。塞栓性脳卒中は、塞栓により脳の一部分への動脈の到達が遮断されることをいう。塞栓は、ほとんどの場合は血餅であるが、アテローム硬化性血管由来の分解物の斑またはいくつかの他の物質（脂肪、空気、さらには癌性細胞）である場合もあり得る。塞栓は別の個所で生じるため、局所療法は、一時的にしか問題は解決されない。したがって、塞栓源を特定しなければならない。塞栓性脳卒中には、４つのカテゴリーがある：心臓内の原因がわかっているもの；おそらく心臓または大動脈に原因があるもの（経胸腔または経食道心エコー図により）；動脈に原因があるもの；および原因が未知であるもの。

【0095】

全身性灌流低下は、体内のあらゆる部分への血流の低下である。これは、心停止もしくは不整脈による、または心筋梗塞、肺動脈塞栓症、心膜液浸出もしくは出血の結果としての心臓の拍出量の低下による心臓のポンプ機能不全に起因するものが最も一般的である。低酸素血症（すなわち、低い血中酸素含量）は、灌流低下を促進することがあり得る。血流の低下は全般的であるため、脳のあらゆる部分、特に、主要な大脳動脈が供給される境界ゾーン領域である「分水界」領域が罹患状態となり得る。この領域への血流は必ずしも停止されないが、その代わり、脳損傷が起こった場所への血流が少なくなり得る。

【0096】

脳内の静脈は、血液を身体部に流し戻す機能を果たす。静脈が血栓症によって閉塞されると、血液の流れが遮断され、血液が滞留し、脳浮腫が引き起こされる。この脳浮腫によって、虚血性脳卒中と出血性脳卒中の両方がもたらされ得る。これは、一般的には、稀な疾患である静脈洞（ｓｉｎｕｓ ｖｅｉｎ）血栓症で起こる。

【0097】

脳卒中は、被検体または患者において、当該技術分野で知られた１種類以上のさまざまな手法、例えば、神経学的検査、血液検査、ＣＴスキャン（コントラスト増強なし）、ＭＲＩスキャン、ドップラー超音波法、および動脈造影（すなわち、血流中に放射線不透過性（ｒａｄｉｏｐａｃｑｕｅ）物質を注入後、動脈のＸ線撮影）などを用いて診断される。画像化で脳卒中が確認された場合、末梢に塞栓の原因があるかどうかを調べるために種々の他の試験が行なわれる。このような試験としては、例えば、頚動脈の超音波／ドップラー試験（頚動脈の狭窄を検出するため）；心電図（ＥＣＧ）および心エコー図（不整脈およびそれにより心臓内に生じた血塊（これは、血流によって脳血管に拡延し得る）を確認するため）；間欠性不整脈を確認するためのホルター監視試験および脳血管構造の血管造影（出血が、動脈瘤または動静脈先天異常に起源を有すると考えられる場合）が挙げられる。

【0098】

脳卒中または脳卒中と関連している症状を処置、予防または防御するためのこのような方法に有用な化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、脳卒中の前、脳卒中時または脳卒中後の１つ以上のキナーゼシグナル伝達カスケードを、モジュレートする化合物である。一実施形態において、脳卒中または本明細書に記載の脳卒中と関連している症状を処置、予防または防御するための方法に使用される化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、脳卒中の前、脳卒中時または脳卒中後のキナーゼシグナル伝達カスケードのアロステリックインヒビターである。一態様において、脳卒中または本明細書に記載の脳卒中と関連している症状を処置、予防または防御するための方法に使用される化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、脳卒中の前、脳卒中時または脳卒中後のキナーゼシグナル伝達カスケードの非ＡＴＰ競合的インヒビターである。

【0099】

Ｓｒｃ活性を阻害すると、脳卒中時に脳の保護がもたらされることが示されている（Ｐａｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第７巻（２）：２２２−２２７（２００１）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）参照）。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、虚血性損傷に応答して生成され、血管透過性を促進させることが示されている。研究により、Ｓｒｃキナーゼは、脳卒中後に脳内のＶＥＧＦ媒介性ＶＰを調節し、脳卒中の前および後にＳｒｃインヒビターを投与すると、浮腫が低減され、脳内灌流が改善され、損傷が起こった後の梗塞の容積が減少することが示された（Ｐａｕｌら、２００１）。したがって、Ｓｒｃ阻害は、脳卒中後の二次損傷の予防、処置または改善に有用であり得る。

【0100】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、脳卒中または脳卒中と関連している症状を予防、処置または防御する。本発明の別の態様は、脳卒中または脳卒中と関連している症状を予防、処置または防御するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。脳卒中の症状としては、突然のしびれ感または脱力感、特に、身体の片側；突然の錯乱状態または発話もしくは会話理解の支障；突然の片目または両目の視力の支障；突然の歩行の支障、眩暈、または平衡感覚もしくは協調性の低下；あるいは原因不明の突然の重度の頭痛が挙げられる。

【0101】

一般的に、脳卒中に対しては、３段階での処置：予防、脳卒中直後の治療、および脳卒中後のリハビリテーションがなされる。最初または再発性の脳卒中を予防するための治療は、原因となる脳卒中のリスクファクター（例えば、高血圧、高コレステロール、心房性細動、および糖尿病など）の処置が主体である。急性脳卒中の治療は、脳卒中を止めようとするものであり、その際、これは、虚血性脳卒中を引き起こす血餅を速やかに溶解させること、または出血性脳卒中の出血を止めることにより行なわれる。脳卒中後のリハビリテーションは、個体が、脳卒中による損傷に起因する身体障害を克服するのを補助する。薬物適用または薬物療法は、脳卒中の最も一般的な処置である。脳卒中を予防または処置するために使用される薬物の最も一般的な類型は、抗血栓薬（例えば、抗血小板剤および抗凝固薬）ならびに血栓溶解薬である。化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、脳卒中に苦しむリスクがあるか、脳卒中に苦しんでいるか、または脳卒中に苦しんだことがある患者に、脳卒中の発生前、発生時、発生後またはその任意の組合せの時点で投与される。化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、医薬組成物であるか、あるいは任意のさまざまな既知の処置剤、例えば、抗血小板薬物適用（例えば、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール）、抗凝固薬（例えば、ワルファリン）、または血栓溶解薬（例えば、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、レテプラーゼ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、テネクタプラーゼ、ラノテプラーゼ、もしくはアニストレプラーゼなどの薬物適用と併用される。

【0102】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、アテローム性動脈硬化のリスクがあるか、またはアテローム性動脈硬化に苦しんでいる被検体のアテローム性動脈硬化またはその症状を処置、予防または防御するための方法において使用される。本発明の別の態様は、アテローム性動脈硬化を処置、予防または防御するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。

【0103】

アテローム性動脈硬化は、動脈血管を侵す疾患であり、一般的に、動脈が「硬化している」と称される。これは、動脈内での多数の斑の形成によって引き起こされる。アテローム硬化性斑は、動脈の拡大によって代償されるが、最終的に、斑の破裂および動脈の狭窄（すなわち、狭小化）に至り、これにより供給先の器官への血液供給が不充分となる。あるいはまた、代償性動脈拡大プロセスが過剰な場合、正味、動脈瘤となる。このような合併症は、慢性的、低速進行性および累積性である。通常ほとんどの場合、軟性斑が突然破裂し、血餅（すなわち、血栓）の形成が引き起こされ、これにより即時的に血流が遅滞または停止し、次いで、動脈によって供給物を得ていた組織が死に至る。この破局的事象は梗塞と称される。例えば、冠動脈の冠動脈血栓症によって心筋梗塞が引き起こされ、一般的には心臓発作として知られている。心筋梗塞は、アテローム硬化性斑が冠動脈の内側層内にゆっくりと蓄積され、次いで突然破裂し、動脈が完全に閉塞されて下流への血流が妨げられた場合に起こる。

【0104】

アテローム性動脈硬化および急性心筋梗塞は、患者において、任意のさまざまな臨床試験および／または検査試験（身体検査、Ｘ線検査もしくは超音波検査および血液分析など）を用いて診断される。例えば、医師または臨床担当者が被検体の動脈の音を聞き、雑音と称される異常なシューシューという音が検出され得る。雑音は、聴診器を罹患動脈上に置いて聞くことができる。あるいはまたさらに、臨床担当者または医師が、例えば、脚部または足の脈拍で、脱力感などの異常またはアブサンスについて調べることができる。医師または臨床担当者は、血液検査を行ない、コレステロールレベルを確認したり、心臓内の酵素（クレアチンキナーゼ、トロポニンおよび乳酸デヒドロゲナーゼなど）のレベルを確認したりして異常を検出することもあり得る。例えば、トロポニンサブユニットＩまたはＴは、心筋に対して非常に特異的であり、永続的な損傷が発生する前に上昇する。胸の痛みがある状況でトロポニンが陽性だと、近い将来、心筋梗塞になる可能性が高いと正確に予測され得る。アテローム性動脈硬化および／または心筋梗塞を診断するための他の試験としては、例えば、ＥＫＧ（心電図）（被検体の心拍の速度と規則性を測定）；胸部Ｘ線（足首／上腕指数を測定、これは足首の血圧を腕の血圧と比較）；動脈の超音波解析；対象領域のＣＴスキャン；血管造影；運動負荷試験、核心臓スキャン；ならびに心臓の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）および陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）スキャンが挙げられる。

【0105】

Ｓｒｃによる細胞内シグナル伝達は、血管の透過性の増大（血管透過性（ＶＰ）として知られている）に重要な役割を果たしていると考えられる。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、虚血性障害（例えば、心筋梗塞など）に応答して生成され、血管透過性を促進させることが示されている。研究により、Ｓｒｃキナーゼを阻害するとＶＥＧＦ媒介性ＶＰが低減されることが示されている（ＰａｒａｎｇおよびＳｕｎ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，第１５巻（９）：１１８３−１２０６（２００５）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）参照）。Ｓｒｃインヒビターで処置したマウスによって示された心筋梗塞後の血管に対する外傷または損傷に関連する組織損傷は、未処置マウスと比べて少なかった（例えば、Ｃｈｅｒｅｓｈらによる米国特許公開公報第２００４０２１４８３６号および同第２００３０１３０２０９号（その内容は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）参照）。したがって、Ｓｒｃ阻害は、アテローム性動脈硬化による損傷後の二次損傷（例えば、心筋梗塞など）の予防、処置または防御に有用であり得る。

【0106】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、アテローム性動脈硬化またはアテローム性動脈硬化と関連している症状を予防、処置または防御するために使用される。本発明の別の態様は、アテローム性動脈硬化またはアテローム性動脈硬化と関連している症状を予防、処置または防御するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。アテローム性動脈硬化は、一般的に、動脈が重度に狭小化し、血流が制限されるまで、または突然の閉塞が引き起こされるまで症状が生じない。症状は、斑および狭小化が発生した場所（例えば、心臓、脳、他の重要な臓器および脚または体内のほとんどの任意の個所）に依存する。アテローム性動脈硬化の初期症状は、体がより多くの酸素を必要としている場合（例えば、運動中）の痛みまたは痙攣であり得、心臓への酸素欠乏のため胸の痛み（アンギナ）を感じたり、脚への酸素欠乏のため脚の痙攣を感じたりすることがあり得る。脳に血液を供給する動脈の狭小化により、眩暈または一過性の虚血性発作（ＴＩＡ）が引き起こされることがあり得、この場合、脳卒中の症状および徴候の持続は２４時間未満である。典型的には、これらの症状は徐々に発現される。

【0107】

心筋梗塞の症状は、種々の程度の胸の痛み、不快感、発汗、脱力感、吐き気、嘔吐および不整脈を特徴とし、場合によっては、意識の消失が引き起こされる。胸の痛みは急性心筋梗塞の最も一般的な症状であり、多くの場合、窮屈感、圧迫感または締付け感と記録される。痛みは、顎、首、腕、背中および上腹部に放散され得、ほとんどの場合、左腕または首である。胸の痛みは、３０分間より長く続く場合は、心筋梗塞によって引き起こされている可能性が高い。心筋梗塞に苦しんでいる患者は、特に、梗塞による心筋の収縮性の減少が左心室機能不全を引き起こすのに充分であり、肺内欝血あるいはさらに肺内浮腫を伴う場合、息切れ（呼吸困難）を示すことがあり得る。

【0108】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、医薬組成物にて、または任意のさまざまな既知のアテローム性動脈硬化処置剤、例えば、コレステロール低下薬（例えば、スタチン）、抗血小板薬の適用または抗凝固薬などと併用して投与される。

【0109】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、神経因性疼痛に苦しむリスクがあるか、神経因性疼痛に苦しんでいるか、または神経因性疼痛に苦しんだことがある被検体において、神経因性疼痛（慢性神経因性疼痛など）またはその症状を処置、予防または防御するため方法において使用される。本発明の別の態様は、神経因性疼痛を処置、予防または防御するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。

【0110】

神経因性疼痛は、神経痛としても知られており、通常の侵害受容性の痛みとは質的に異なる。神経因性疼痛は、通常、定常的な灼熱感および／または「チクチク」感および／または「電気ショック」感として現れる。侵害受容性の痛みと神経因性疼痛の違いは、「通常の」侵害受容性の痛みでは痛みの神経のみが刺激されるが、神経障害は、多くの場合、同じ領域内の痛み感覚神経と非痛み感覚神経（例えば、触覚、温かさ、冷たさに応答する神経）の両方の刺激をもたらし、それにより、通常、脊髄と脳が知覚することを予測していないシグナルが生成されることによるものである。

【0111】

神経因性疼痛は、複雑な慢性の痛み状態であり、通常、組織の損傷を伴う。神経因性疼痛があると、神経線維自体が損傷、機能不全または傷害された状態となり得る。このような損傷状態の神経線維は他の痛み中心に誤ったシグナルを送る。神経線維傷害の影響としては、傷害部位および傷害周囲領域の両方における神経機能の変化が挙げられる。

【0112】

神経因性疼痛は、被検体または患者において、当該技術分野で知られた１種類以上のさまざまな検査的および／または臨床的手法（例えば、身体検査など）を用いて診断される。

【0113】

ｃ−Ｓｒｃは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体の活性を調節することが示されている（Ｙｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９６巻：７６９７−７７０４（１９９９）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）参照）。研究により、低分子量ＳｒｃキナーゼインヒビターであるＰＰ２は、ＮＭＤＡ受容体ＮＭ２サブユニットのリン酸化を低減させることが示されている（Ｇｕｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．，第２２巻：６２０８−６２１７（２００２）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）参照）。したがって、Ｓｒｃの阻害は、これにより活性ＮＭＤＡ受容体が阻害され、神経因性疼痛（慢性神経因性疼痛など）の予防、処置または改善に有用であり得る。

【0114】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、神経因性疼痛（慢性神経因性疼痛など）または神経因性疼痛と関連している症状を予防、処置または防御するために使用される。神経因性疼痛の症状としては、うずくような焼けるような痛み、刺痛およびしびれ感が挙げられる。

【0115】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、単独、医薬組成物にて、または任意のさまざまな既知の処置剤、例えば、鎮痛薬、オピオイド、三環系抗鬱薬、鎮痙薬またはセロトニン・ノルエピネフリン再取り込み阻害剤などと併用して投与される。

【0116】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、Ｂ型肝炎のリスクがあるか、またはＢ型肝炎に苦しんでいる被検体において、Ｂ型肝炎またはその症状を処置、予防または防御するための方法において使用される。本発明の別の態様は、Ｂ型肝炎を処置、予防または防御するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。

【0117】

Ｂ型肝炎ウイルスは、ヘパドナウイルスファミリーの一構成員であり、単鎖領域を有する二本鎖ＤＮＡの形態のウイルスゲノムと、包埋タンパク質を有する外側の脂質系エンベロープとを含むタンパク質性のコア粒子からなる。エンベロープタンパク質は、ウイルスの結合と感受性細胞内への放出に関与している。内側のキャプシドは、ＤＮＡゲノムを細胞の核に移動させ、そこでウイルスのｍＲＮＡが転写される。エンベロープタンパク質をコードする３種類のサブゲノム転写物が、Ｘタンパク質をコードする転写物とともに作製される。第４のプレゲノムＲＮＡが転写され、これはサイトゾルに送出され、ウイルスポリメラーゼとコアタンパク質を翻訳する。ポリメラーゼとプレゲノムＲＮＡは、コア粒子の合成時にキャプシド内に封入され、そこで、このポリメラーゼタンパク質によってプレゲノムＲＮＡからゲノムＤＮＡへの逆転写が行われる。次いで、成熟コア粒子は通常の分泌経路によって細胞から退去し、その間にエンベロープを獲得する。

【0118】

Ｂ型肝炎は、複製プロセスの一部として逆転写を用いるいくつかの既知の非レトロウイルス系ウイルスの１つである。逆転写を用いる他のウイルスとしては、例えば、ＨＴＬＶまたはＨＩＶが挙げられる。

【0119】

ＨＢＶ感染時、宿主の免疫応答は、肝細胞の損傷とウイルスのクリアランスの両方を担う。生得免疫応答は、これらのプロセスにおいて有意な役割を果たさず、適応的免疫応答、特に、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が、ＨＢＶ感染と関連するほぼすべての肝臓の傷害に寄与する。また、ＣＴＬは、感染細胞を死滅させること、および生存肝細胞からＨＢＶを一掃し得る抗ウイルスサイトカインを産生することにより、ウイルスを排除する。肝臓傷害は、ＣＴＬによって起始および媒介され、抗原非特異的炎症細胞によってＣＴＬ誘導性免疫病理が悪化され得、血小板により、肝臓内へのＣＴＬの蓄積が助長され得る。

【0120】

Ｂ型肝炎は、患者において、任意のさまざまな臨床試験および／または検査試験（身体検査、および血液または血清の分析など）を用いて診断される。例えば、血液または血清は、ウイルス抗原および／または宿主によって生成された抗体の存在についてアッセイされる。一般的なＢ型肝炎の試験では、感染の存在についてのスクリーニングのためにＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の検出が使用される。これは、このウイルスによる感染時に出現する最初に検出可能なウイルス抗原である；しかしながら、感染の初期では、この抗原が存在しない場合があり得、また、感染後期では宿主によって除去されるため検出不可能な場合があり得る。宿主は依然として感染状態であるが、ウイルスは成功裡に排除されたこの「時間枠」の間、Ｂ型肝炎コア抗原（抗ＨＢｃ ＩＧＭ）に対するＩｇＭ抗体が、疾患の唯一の血清学的証拠となり得る。

【0121】

ＨｂｓＡｇの出現の直後、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）と称する別の抗原が出現する。従来より、宿主の血清中のＨｂｅＡｇの存在は、かなり高いウイルス複製速度と関連している；しかしながら、Ｂ型肝炎ウイルスの一部のバリアントは「ｅ」抗原を全く生成しない。自然な感染過程では、ＨｂｅＡｇが除去され得、直後に「ｅ」抗原に対する抗体（抗ＨＢｅ）が生じる。この変換は、通常、ウイルス複製の劇的な減少と関連している。宿主が感染を排除することができたら、最終的にＨｂｓＡｇは検出不可能となり、続いて、Ｂ型肝炎表面抗原（抗ＨＢ）に対する抗体が生じる。ＨｂｓＡｇに対して陰性であるが抗ＨＢには陽性である人は、感染が排除されたか、以前にワクチン接種を受けた人である。ＨｂｓＡｇに対して陽性である多くの人は、ウイルスの増殖がほとんどなく、したがって、長期の合併症または他者への感染の伝播のリスクがほとんどない人であり得る。

【0122】

Ｓｒｃは、Ｂ型肝炎ウイルスの複製に役割を果たしている。ウイルスにコードされた転写因子ＨＢｘは、ＨＢＶウイルスの増殖に必要とされる段階で、Ｓｒｃを活性化する（例えば、Ｋｌｅｉｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．，第１８巻：５０１９−５０２７（１９９９）；Ｋｌｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，第１７巻：６４２７−６４３６（１９９７）（各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）参照）。したがって、Ｓｒｃ阻害は、それによりＨＢＶウイルスのＳｒｃ媒介性増殖が阻害され、Ｂ型肝炎またはその症状の予防、処置または防御に有用であり得る。

【0123】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、Ｂ型肝炎またはＢ型肝炎と関連している症状を予防、処置または防御する。Ｂ型肝炎の症状は、典型的には、ウイルスへの曝露から３０〜１８０日以内に発現する。しかしながら、Ｂ型肝炎ウイルスに感染したすべて人のうち半数までは症状がない。Ｂ型肝炎の症状は、多くの場合、流感と比較され、
例えば、食欲減退；疲労；吐き気および嘔吐、全身掻痒；肝臓上部の痛み（例えば、腹部の右側、下側胸郭の下方）、黄疸、および排出機能の変化が挙げられる。

【0124】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、医薬組成物にて、または任意のさまざまな既知のＢ型肝炎処置剤、例えば、インターフェロンα、ラミブジン（Ｅｐｉｖｉｒ−ＨＢＶ）またはバラクルード（エンテカビル）などと併用して投与される。

【0125】

本明細書に記載のように、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体において免疫機構の活性を調節し、それにより自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、敗血症および狼瘡ならびに移植片拒絶およびアレルギー性疾患を防御または予防するために使用され得る。本発明の別の態様は、免疫機構を調節するための医薬の製造における化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の使用を含む。あるいはまた、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、被検体の自己免疫疾患を処置するために使用され得る。例えば、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩により、症状の重症度の低減がもたらされ得るか、または被検体の自己免疫疾患の進行の切迫が停止され得る。

【0126】

自己免疫疾患は、適応的免疫機構が自己抗原に応答して細胞および組織の損傷を媒介するような自己寛容の崩壊によって引き起こされる疾患である。自己免疫疾患は、器官特異的（例えば、甲状腺炎もしくは糖尿病）または全身性（例えば、全身性エリテマトーデス）であり得る。Ｔ細胞は、適応的免疫機構において細胞媒介性免疫応答をモジュレートする。通常の条件下において、Ｔ細胞は抗原受容体（Ｔ細胞受容体）を発現し、該受容体は、自己主要組織適合複合体分子に結合された外来タンパク質のペプチド断片を認識する。数ある中で、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後に最も早期に認識可能な事象は、ＬｃｋおよびＦｙｎの活性化であり、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ内のチロシン残基上のＴＣＲのリン酸化がもたらされる（Ｚａｍｏｙｓｋａら；２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１９１，１０７−１１８）。チロシンキナーゼ、例えば、Ｌｃｋ（これは、プロテインチロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの一構成員である）は、ペプチドおよびタンパク質のチロシン残基をリン酸化することにより、細胞シグナル伝達と細胞増殖の調節に必須の役割を果たしている（Ｌｅｖｉｔｚｋｉ；２００１，Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２１１，１−１５；Ｌｏｎｇａｔｉら；２００１，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，２，４１−５５；ＱｉａｎおよびＷｅｉｓｓ；１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９，２０５−２１１）。したがって、理論に拘束されることを望まないが、チロシンキナーゼ（例えば、Ｓｒｃ）活性をモジュレートする化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の投与は、自己免疫疾患の処置に有用であるという仮説が立てられる。

【0127】

チロシンキナーゼｌｃｋおよびｆｙｎはともに、ＴＣＲ経路において活性化される；したがって、ｌｃｋおよび／またはｆｙｎのインヒビターは、自己免疫用薬剤として有用である可能性を有する（ＰａｌａｃｉｏｓおよびＷｅｉｓｓ；２００４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２３，７９９０−８０００）。ＬｃｋおよびＦｙｎは、主に、Ｔ細胞がその寿命の大部分において発現する。Ｔ細胞の発生、恒常性および活性化におけるＬｃｋおよびＦｙｎの役割が、動物試験および細胞株試験によって示された（ＰａｒａｎｇおよびＳｕｎ；２００５，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅ．Ｐａｔｅｎｔｓ，１５，１１８３−１２０７）。Ｌｃｋ活性化は、自己免疫疾患および移植片拒絶に関与している（Ｋａｍｅｎｓら；２００１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，２，１２１３−１２１９）。結果により、ｌｃｋ（−）ジャーカット細胞株は、増殖、サイトカイン産生、ならびにＴ細胞受容体刺激に応答した細胞内カルシウム、イノシトールリン酸およびチロシンリン酸化の増大を行なうことができないことが示された（ＳｔｒａｕｓおよびＷｅｉｓｓ；１９９２，Ｃｅｌｌ．，７０，５８５−５９３；Ｙａｍａｓａｋｉら；１９９６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１６，７１５１−７１６０）。したがって、ｌｃｋを阻害する薬剤は、Ｔ細胞機能を有効にブロックし、免疫抑制剤としての機能を果たし、自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症および狼瘡、ならびに移植片拒絶およびアレルギー性疾患の分野などに有用である可能性を有するものであり得る（ＨａｎｋｅおよびＰｏｌｌｏｋ；１９９５，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．，４４，３５７−３７１）。したがって、理論に拘束されることを望まないが、プロテインチロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの１種類以上の構成員（例えば、ｌｃｋおよび／またはｆｙｎ）をモジュレートする化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の投与は、自己免疫疾患の処置に有用であるという仮説が立てられる。

【0128】

マウス、ラットおよびイヌにおける化合物（Ｉ）の薬物動態学的特性評価により、化合物（Ｉ）は経口でバイオアベイラブルであり、薬物曝露および最大血漿濃度の増大において用量依存性を有することが示された。

【0129】

化合物（Ｉ）・２ＨＣｌ（二塩酸塩）と化合物（Ｉ）・ＭＳＡ（メシル酸塩）の両方を開発した。２つを関連づけた薬物動態試験により、化合物（Ｉ）のこれらの２つの塩形態は、ラットとイヌの両方において、同様の薬物動態プロフィールを共有していることが示された。したがって、化合物（Ｉ）・２ＨＣｌの所見は、化合物（Ｉ）・ＭＳＡの開発に適用可能である。

【0130】

化合物（Ｉ）は、承認されたキナーゼインヒビターおよび開発中のものと比較すると、癌細胞に対して非常に強力な特異的かつ選択的なＳｒｃキナーゼインヒビターであり、患者の重篤な副作用（心臓毒性など）を抑制し得る。

【0131】

化合物（Ｉ）は、純粋で単離された形態（すなわち、合成により作製されたもの）である。

【0132】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、例えば、ＵＳ ２００８／０２２１１０２およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６４１９に記載された手法によって慣用的に調製され得る。

【0133】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩を含む医薬組成物は、１種類以上の薬学的に許容され得る担体を用いて、慣用的な様式で製剤化され得る。化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、経口、経鼻、経皮、肺内、吸入により、口腔内、舌下、腹腔内、皮下、筋肉内、静脈内、経直腸、胸膜腔内、髄腔内または非経口投与される。一実施形態において、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、経口投与される。当業者には、特定の投与経路の利点が認識されよう。

【0134】

化合物（Ｉ）を用いる投薬レジメンは、さまざまな要素、例えば、患者の型、種、年齢、体重、性別および状態；処置対象の状態の重症度；投与経路；患者の腎臓および肝臓の機能；ならびに使用される具体的な化合物またはその塩に応じて選択される。

【0135】

一実施形態において、本発明は、１日２回または３回で投与される２ｍｇ〜４００ｍｇ／用量の範囲の量の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る担体とを含む、経口、静脈内、筋肉内、または皮下投与のための医薬組成物を含む。別の実施形態において、該量は１０ｍｇ〜３００ｍｇである。別の実施形態では、該量は２０ｍｇ〜２５０ｍｇである。別の実施形態では、該量は４０ｍｇ〜２００ｍｇである。別の実施形態では、該量は６０ｍｇ〜１６０ｍｇである。一実施形態において、該用量は１日２回で投与される。一実施形態において、該用量は１日３回投与される。

【0136】

一実施形態において、本発明は、１日１回で投与される４ｍｇ〜８００ｍｇ／用量の範囲の量の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る担体とを含む、経口、静脈内、筋肉内、または皮下投与のための医薬組成物を含む。別の実施形態において、該量は２０ｍｇ〜６００ｍｇである。別の実施形態では、該量は４０ｍｇ〜５００ｍｇである。別の実施形態では、該量は８０ｍｇ〜４００ｍｇである。別の実施形態では、該量は１２０ｍｇ〜３２０ｍｇである。

【0137】

一実施形態において、本発明は、化合物（Ｉ）のメシル酸塩を含み、上記のようにして投与される医薬組成物を含む。一実施形態において、投与は経口である。別の実施形態では、投与は静脈内である。別の実施形態では、投与は筋肉内である。別の実施形態では、投与は皮下である。

【0138】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の製剤化および投与のための手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）に見られる。一実施形態において、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、薬学的に許容され得る担体または希釈剤と組み合わせて医薬調製物にて使用される。好適な薬学的に許容され得る担体としては、不活性で固形の充填剤または希釈剤および滅菌された水性または有機系の溶液が挙げられる。化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、かかる医薬組成物内に、本明細書に記載の範囲の所望の投薬量が供給されるのに充分な量で存在させる。

【0139】

一実施形態において、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、経口投与用に調製され、この場合、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩を適当な固形または液状の担体または希釈剤と合わせ、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤などを形成する。

【0140】

錠剤、丸剤、カプセル剤などには、約１〜約９９重量パーセントの活性成分ならびに結合剤（ガムトラガカント、アカシアゴム、コーンスターチもしくはゼラチンなど）；賦形剤（リン酸二カルシウムなど）；崩壊剤（コーンスターチ、イモデンプンもしくはアルギン酸など）；滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムなど）；および／または甘味剤（スクロース、ラクトース、サッカリン、キシリトールなど）などが含有される。単位投薬形態がカプセル剤である場合、多くの場合、上記の型の物質に加えて、脂肪油などの液状担体が含有される。

【0141】

一部の実施形態では、種々の他の物質をコーティングとして、または投薬単位の物理的形態を変更するために存在させる。例えば、一部の実施形態では、錠剤をシェラック、糖または両方でコーティングする。一部の実施形態では、シロップ剤またはエリキシル剤には、活性成分に加えて、甘味剤としてスクロース、保存料としてメチルおよびプロピルパラベン、色素およびフレーバー（チェリーまたはオレンジフレーバーなど）などを含める。

【0142】

非経口投与に関する一部の実施形態では、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩を、滅菌された水性または有機の媒体と合わせ、注射用液剤または懸濁剤を形成する。一実施形態において、注射用組成物は、水性で等張性の液剤または懸濁剤である。該組成物は、滅菌されたもの、および／または佐剤、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤などを含有するものであり得る。また、他の治療上有益な物質が含有されていてもよい。該組成物は、それぞれ慣用的な混合法、造粒法またはコーティング法に従って調製され、約０．１〜７５％の活性成分を含み、別の実施形態では、該組成物は約１〜５０％の活性成分を含む。

【0143】

例えば、注射用液剤は、ゴマ油もしくはピーナッツ油などの溶媒または水性プロピレングリコール、ならびに化合物（Ｉ）の水溶性の薬学的に許容され得る塩の水溶液を用いて作製される。一部の実施形態では、分散剤が、グリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびその油中混合物中にて調製される。通常の保存および使用条件下において、このような調製物には、微生物の増殖を抑制する保存料を含める。用語「非経口投与」および「非経口投与される」は、本明細書で用いる場合、経腸投与および局所性投与以外の投与様式、通常、注射による投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内および胸骨内注射ならびに注入が挙げられる。

【0144】

経直腸投与では、好適な医薬組成物は、例えば、局所用製剤、坐剤または注腸剤である。坐剤は、脂肪性乳剤または懸濁剤から好都合に調製される。該組成物は、滅菌されたもの、および／または佐剤、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤などを含有するものであり得る。また、他の治療上有益な物質が含有されていてもよい。該組成物は、それぞれ慣用的な混合法、造粒法またはコーティング法に従って調製され、約０．１〜７５％の活性成分を含み、別の実施形態では、該組成物は約１〜５０％の活性成分を含む。

【0145】

一部の実施形態において、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、活性薬剤が肺内投与によって、例えば、手動式ポンプスプレー、ネブライザまたは加圧式定量吸入器などからの活性薬剤含有エーロゾル製剤の投与によって送達されるように製剤化される。一部の実施形態において、この型の適当な製剤にはまた、他の薬剤（例えば、開示化合物を有効なエーロゾル剤として維持するための静電気防止剤）もまた含むものである。

【0146】

エーロゾル剤を送達するための薬物送達デバイスは、定量弁を有し、記載の医薬用エーロゾル製剤の入った適当なエーロゾルキャニスターと、キャニスターを収容するように適合され、薬物送達を可能にするアクチュエータハウジングとを備えている。薬物送達デバイス内のキャニスターは、キャニスターの全容積の約１５％より大きい容積に相当する頭隙を有する。多くの場合、肺内投与が意図されるポリマーを、溶媒、界面活性剤および噴射剤の混合物に溶解、懸濁または乳化させる。この混合物を、密封された定量弁を有するキャニスター内で加圧下に維持する。

【0147】

経鼻投与では、固形または液状いずれかの担体を使用してもよい。固形担体としては、例えば約２０〜約５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末が挙げられ、かかる製剤は、鼻道から即時吸入によって投与される。液状担体が使用される一部の実施形態では、製剤は、経鼻スプレー剤または点鼻薬として投与され、活性成分の油性または水性液剤を含む。

【0148】

また、即時分散性投薬形態であり、「フラッシュ用量（ｆｌａｓｈ ｄｏｓｅ）」形態としても知られている製剤が想定される。特に、本発明の一部の実施形態は、活性成分を短時間内、例えば、典型的には約５分未満、別の実施形態では約９０秒未満、別の実施形態では約３０秒未満、別の実施形態では約１０ないし１５秒未満で放出する組成物として製剤化される。かかる製剤は、さまざまな経路、例えば、体腔内への挿入または湿性体表面もしくは開放創への適用による被検体への投与に適している。

【0149】

典型的には、「フラッシュ投薬物」は、経口投与され、口内で即時分散し、したがって嚥下に大きな労力が必要とされず、該化合物が口内粘膜から即時的に摂取または吸収されることが可能な固形投薬形態である。また、一部の実施形態では、適当な即時分散性投薬形態が他の適用において、例えば、創傷および他の身体の傷害ならびに外部供給湿分による医薬の放出が可能でない疾患状態の処置に使用される。

【0150】

「フラッシュ用量」形態は、当該技術分野で知られている；例えば、米国特許第５，５７８，３２２号および同第５，６０７，６９７号の発泡性投薬形態および不溶性微粒子の即放コーティング；米国特許第４，６４２，９０３号および同第５，６３１，０２３号の凍結乾燥型泡状形態および液状形態；米国特許第４，８５５，３２６号、同第５，３８０，４７３号および同第５，５１８，７３０号の投薬形態の融解紡糸；米国特許第６，４７１，９９２号の固形の自由形態の作製；米国特許第５，５８７，１７２号、同第５，６１６，３４４号、同第６，２７７，４０６号および同第５，６２２，７１９号の糖類系担体マトリックスおよび液状結合剤；ならびに当該技術分野で知られた他の形態を参照のこと。

【0151】

また、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、「パルス型放出」製剤として製剤化され、これは、該化合物または塩が医薬組成物から、直列的な放出（すなわち、パルス）で放出されるものである。また、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩は、「徐放」製剤として製剤化され、これは、該化合物または塩が医薬組成物から長期間にわたって連続的に放出されるものである。

【0152】

また、環状もしくは非環状のカプセル化剤もしくは溶媒和剤（例えば、シクロデキストリン、ポリエーテル、あるいは多糖類（例えば、メチルセルロース））を含む、または別の実施形態では、アルキルエーテルスペーサー基もしくは多糖類によって脂肪親和性腔から分離するスルホン酸ナトリウム塩基を有するポリアニオン系β−シクロデキストリン誘導体を含む製剤、例えば液状製剤が想定される。一実施形態において、該薬剤はメチルセルロースである。別の実施形態では、該薬剤は、ブチルエーテルスペーサー基によって脂肪親和性腔から分離するスルホン酸ナトリウム塩基を有するポリアニオン系β−シクロデキストリン誘導体、例えば、ＣＡＰＴＩＳＯＬ（登録商標）（ＣｙＤｅｘ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ，ＫＳ）である。当業者は、薬剤の水溶液（例えば、４０重量％溶液）を調製し；連続希釈液を調製し（例えば、２０％、１０、５％、２．５％、０％（対照）の溶液の作製など）；過剰量（該薬剤によって可溶化され得る量と比べて）の開示化合物を添加し；適切な条件下（例えば、加熱、攪拌、超音波処理など）で混合し；得られた混合物を遠心分離または濾過して清浄な溶液を得；この溶液を開示化合物の濃度について解析することにより、薬剤／開示化合物の製剤の適当な比率を評価することができよう。

【0153】

本明細書に挙げた刊行物および特許文献はすべて、引用により、かかる各刊行物または文献が具体的に個々に引用により本明細書に組み込まれて示されているかのように本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文献の引用は、これらがいずれも直接関係のある先行技術であるという是認を意図するものではなく、その内容または日付に関する是認をなんら構成するものでもない。ここに、本発明を書面にて説明しているが、当業者には、本発明がさまざまな実施形態で実施され得ること、および前述の説明および後述の実施例は、例示の目的のためであって、後述の特許請求の範囲の限定のためではないことが認識されよう。

【0154】

定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用している一部の用語をここにまとめる。

【0155】

プロテインキナーゼは、ＡＴＰからタンパク質およびペプチド内のＳｅｒ／ＴｈｒまたはＴｙｒの側鎖上のヒドロキシル基へのγ−リン酸基の転移を触媒する酵素であって、種々の重要な細胞機能、おそらく最も顕著には：シグナル伝達、分化、および増殖の制御に密接に関与している酵素の大型類型の１つである。ヒトの体内には、約２，０００種類の相違するプロテインキナーゼが存在すると推定されており、これらは各々、特定のタンパク質／ペプチド基質をリン酸化するが、これらはすべて、高度に保存されたポケット内の同じ第２の基質ＡＴＰに結合する。既知の癌遺伝子産物の約５０％はプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）であり、そのキナーゼ活性は、細胞の形質転換をもたらすことが示されている。

【0156】

ＰＴＫは、２つのカテゴリー、膜受容体型ＰＴＫ（例えば、増殖因子受容体型ＰＴＫ）および非受容体型ＰＴＫ（例えば、プロト癌遺伝子産物のＳｒｃファミリーおよび限局性接着キナーゼ（ＦＡＫ））に分類され得る。Ｓｒｃの過剰活性化は、いくつかのヒトの癌、例えば、結腸、乳房、肺、膀胱、および皮膚のもの、ならびに胃癌、ヘアリー細胞白血病、および神経芽腫で報告されている。

【0157】

語句「プロテインキナーゼシグナル伝達カスケードの１種類以上の成分を阻害する」とは、キナーゼシグナル伝達カスケードの１種類以上の成分が、細胞の機能が変更されるように影響されることを意味する。プロテインキナーゼシグナル伝達カスケードの成分としては、キナーゼのシグナル伝達経路に直接または間接的に関与している任意のタンパク質、例えば、セカンドメッセンジャーならびに上流および下流の標的が挙げられる。

【0158】

「処置すること」は、状態、疾患、障害などの改善がもたらされる任意の効果、例えば、低下、低減、モジュレーション、または排除を包含する。疾患状態を「処置すること」または「処置」としては、（ａ）すでに存在している疾患状態の抑止、すなわち、その進展もしくは臨床症状の停止；および／または（ｂ）疾患状態の軽減、すなわち、疾患の後退をもたらすことが挙げられる。

【0159】

「予防すること」は、疾患状態の臨床症状が発現しないようにすること、すなわち、疾患状態に曝露されているかもしれない、またはその素因を有するかもしれないが、まだ該疾患状態の症状を経験または発現していない被検体において疾患の発症を抑止することを意味する。

【0160】

「防御すること」は、疾患状態に曝露されているかもしれない、またはその素因を有するかもしれない被検体において、該化合物を該被検体に、該疾患状態の症状を経験または発現する前に投与することにより、疾患状態の臨床症状の重症度を低減（低下）させることを意味する。

【0161】

「疾患状態」は、任意の疾患、障害、状態、症状、または適応症を意味する。

【0162】

本明細書で用いる場合、用語「細胞増殖性障害」は、無秩序および／または異常な細胞増殖によって望ましくない状態または疾患（これは、癌性または非癌性であり得る）の発生、例えば、乾癬性の状態の発生がもたらされ得る状態をいう。本明細書で用いる場合、用語「乾癬性の状態」または「乾癬」は、ケラチノサイトの過剰増殖、炎症細胞の浸潤、およびサイトカインの改変を伴う障害をいう。

【0163】

一実施形態において、細胞増殖障害は癌である。本明細書で用いる場合、用語「癌」は、充実性腫瘍（肺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、脳の癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌など）、悪性黒色腫、非黒色腫皮膚癌、ならびに血液系の腫瘍および／または悪性腫瘍、例えば、小児白血病およびリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキン病、リンパ球起源および皮膚起源のリンパ腫、急性および慢性白血病（急性リンパ芽球性、急性骨髄性または慢性骨髄性白血病など）、形質細胞腫、リンパ系の腫瘍およびＡＩＤＳに関連する癌を包含する。

【0164】

乾癬性の状態に加え、本発明の組成物を用いて処置され得る増殖性疾患の型は、表皮嚢腫および類皮嚢腫、脂肪腫、腺腫、毛細血管腫および皮膚血管腫、リンパ管腫、母斑病変、奇形腫、腎腫、筋線維腫症、骨形成性腫瘍、ならびに他の異形成塊などである。増殖性疾患には、異形成および同様の疾患が包含され得る。

【0165】

化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の「有効量」は、疾患または障害を有する被検体に投与すると、該被検体の疾患または障害の後退がもたらされる量である。例えば、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の有効量は細胞増殖障害を有する被検体に投与すると、該被検体の細胞増殖の後退がもたらされる量である。被検体に投与される該化合物またはその薬学的に許容され得る塩の量は、具体的な障害、投与様式、共投与化合物（あれば）、ならびに被検体の特徴、例えば、一般健康状態、他の疾患、年齢、性別、遺伝子型、体重および薬物に対する耐容性などに依存する。

【0166】

本明細書で用いる場合、用語「有効量」は、単独または抗増殖剤と併用して投与した場合、有効な化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩または化合物の組合せの量をいう。例えば、有効量は、レシピエント患者または被検体に与える製剤中または医療用デバイスに存在させる化合物（Ｉ）の量であって、生物学的活性、例えば抗増殖活性（例えば、抗癌活性または抗新生物活性など）が誘発されるのに充分な量をいう。化合物の組合せは、任意選択で相乗的な組合せである。相乗作用（例えば、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．第２２巻，ｐｐ．２７−５５（１９８４）に記載）は、併用して投与した場合の化合物の効果が、単一の薬剤として単独で投与した場合の化合物の相加的効果よりも大きい場合に生じる。一般に、相乗効果は、化合物の最適以下の濃度で最も明白に示される。相乗作用は、低細胞傷害、または抗増殖性効果の増大、または個々の成分と比較したときの併用のなんらかの他の有益な効果に関するものであり得る。

【0167】

有効量の１種類以上の該化合物は、ヒトまたは動物への投与に薬学的に許容され得る担体を用いて製剤化され得る。したがって、該化合物または製剤は、例えば経口、非経口または局所経路によって、有効量の該化合物が供給されるように投与され得る。別の実施形態では、本発明に従って調製された化合物（Ｉ）またはその塩は、医療用デバイス（例えば、ステント）をコーティングするため、または該デバイスに含浸させるために使用され得る。

【0168】

用語「予防有効量」は、望ましくない細胞増殖を予防するため、またはそのリスクを低減するために投与される化合物（Ｉ）またはその塩の有効量を意味する。

【0169】

「薬理効果」は、本明細書で用いる場合、被検体にもたらされる効果であって、治療の意図される目的が達成される効果を包含する。一実施形態において、薬理効果は、処置対象の被検体の主適応症が抑制、軽減または低減されることを意味する。例えば、薬理効果は、処置被検体の主適応症の抑制、軽減または低減がもたらされるものであり得る。別の実施形態において、薬理効果は、処置対象の被検体の主適応症の障害または症状が抑制、軽減または低減されることを意味する。例えば、薬理効果は、処置被検体の主適応症の抑制または低減がもたらされるものであり得る。

【0170】

「医薬組成物」は、化合物（Ｉ）またはその塩を被検体に投与するのに適した形態で含む製剤である。一実施形態において、医薬組成物は、バルク状態または単位投薬形態である。単位投薬形態は任意のさまざまな形態であり、例えば、カプセル剤、ＩＶバッグ、錠剤、エーロゾル剤吸入器の単回用量（ｓｉｎｇｌｅ）ポンプ、またはバイアルが挙げられる。該組成物の単位用量における活性成分（例えば、開示した化合物またはその塩、水和物、溶媒和物もしくは異性体の製剤）の量は有効量であるが、関与する具体的な処置により異なる。当業者には、患者の年齢および状態に応じて投薬量の常套的な変更を行なうことが、場合によっては必要であることが認識されよう。また、投薬量は投与経路にも依存する。さまざまな経路が想定され、経口、肺内、経直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、口腔内、舌下、胸腔内、髄腔内、鼻腔内などが挙げられる。本発明の化合物の局所投与または経皮投与のための投薬形態としては、粉末剤、スプレー剤、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、貼付剤および吸入剤が挙げられる。一実施形態において、活性化合物は、滅菌条件下で、薬学的に許容され得る担体、および必要とされる任意の保存料、緩衝剤または噴射剤と混合される。

【0171】

用語「フラッシュ用量」は、即時分散性投薬形態である化合物製剤をいう。

【0172】

用語「即時放出」は、比較的短期間での、一般的には約６０分間まででの投薬形態からの化合物の放出と定義する。用語「改良放出」は遅延放出、持続放出、およびパルス型放出を含むと規定する。用語「パルス型放出」は、投薬形態からの薬物の直列的な放出と定義する。用語「徐放」または「持続放出」は、長期間にわたる投薬形態からの化合物の連続的な放出と定義する。

【0173】

「被検体」は、哺乳動物、例えば、ヒト、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、トリなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、家禽など）および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、トリなど）を包含する。一実施形態において、被検体はヒトである。

【0174】

本明細書で用いる場合、語句「薬学的に許容され得る」は、妥当な医学的判断の範囲内であり、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適し、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答または他の問題もしくは合併症がなく、相応した適度な便益／リスク比を有する化合物、物質、組成物、担体および／または投薬形態をいう。

【0175】

語句「薬学的に許容され得る担体」は、当該技術分野で認知されており、任意の対象組成物をある器官または身体の一部から別の器官身体の一部に運搬または輸送することに関与していて、例えば、薬学的に許容され得る物質、組成物またはビヒクル、例えば、液状または固形の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などが挙げられる。各担体は、対象組成物のその他の成分と適合性であり、患者に対して有害でないという意味において「許容され得る」ものでなければならない。一部の特定の実施形態において、薬学的に許容され得る担体は、パイロジェンフリーである。薬学的に許容され得る担体として有用であり得る物質の一例としては、（１）糖類（ラクトース、グルコースおよびスクロースなど）；（２）デンプン（コーンスターチおよびイモデンプンなど）；（３）セルロースおよびその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末化トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤（ココアバターおよび坐剤用ワックスなど）；（９）油類（ピーナッツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油など）；（１０）グリコール（プロピレングリコールなど）；（１１）ポリオール（グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど）；（１２）エステル（オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど）；（１３）寒天；（１４）緩衝剤（水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど）；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸バッファー溶液；ならびに（２１）医薬用製剤に使用される他の無毒性の適合性物質が挙げられる。

【0176】

「薬学的に許容され得る賦形剤」は、医薬組成物の調製に有用であり、一般的に、安全で無毒性であり、生物学的にも他の様式での望ましくないものでない賦形剤を意味し、獣医学的使用ならびにヒト用医薬での使用に許容され得る賦形剤を包含する。「薬学的に許容され得る賦形剤」は、本明細書および特許請求の範囲で用いる場合、１種類のかかる賦形剤とその１種類より多くの両方を包含する。

【0177】

本発明の化合物（Ｉ）は、さらに塩を形成し得るものである。このような形態もすべて、特許請求の範囲に記載の発明の範囲内であることが想定される。

【0178】

本発明の化合物（Ｉ）は、内在している原子の同位体を含むものであり得る。本発明は、本発明の化合物内に存在する原子のあらゆる同位体を包含するものとする。同位体は、同じ原子番号を有するが異なる質量数を有する原子を包含する。一般的な一例として、限定されないが、水素の同位体としては、トリチウムおよび重水素が挙げられ、炭素の同位体としては、Ｃ−１３およびＣ−１４が挙げられる。

【0179】

化合物の「薬学的に許容され得る塩」は、薬学的に許容され得る塩であって、親化合物の所望の薬理学的活性を有するものを意味する。

【0180】

本明細書で用いる場合、「薬学的に許容され得る塩」は、化合物（Ｉ）の誘導体であって、酸塩または塩基塩の作製によって化合物（Ｉ）を修飾したものをいう。薬学的に許容され得る塩の例としては、限定されないが、塩基性残基（アミンなど）の有機酸塩または有機酸塩、酸性残基（カルボン酸など）のアルカリ塩または有機塩などが挙げられる。薬学的に許容され得る塩としては、例えば、無毒性の無機酸または有機酸から形成した親化合物の慣用的な無毒性の塩または第４級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、かかる慣用的な無毒性の塩としては、限定されないが、２−アセトキシ安息香酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、１，２−エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリルアルサニル酸、ヘキシルレゾルシン酸、ヒドラバミン（ｈｙｄｒａｂａｍｉｃ）酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシル（ｎａｐｓｙｌｉｃ）酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、塩基性酢酸、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、および一般的に存在するアミン酸、例えば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、アルギニンなどから選択される無機酸および有機酸から誘導されるものが挙げられる。

【0181】

他の例としては、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ピルビン酸、マロン酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ−［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三ブチル酢酸、ムコン酸などが挙げられる。また、本発明は、親化合物内に酸性プロトンが存在しており、金属イオン（例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、もしくはアルミニウムイオン）；または有機塩基（エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなど）との配位結合体のいずれかで置き換えられた場合に形成される塩を包含する。

【0182】

薬学的に許容され得る塩に対する言及はすべて、同塩の本明細書に規定の溶媒付加形態（溶媒和物）または結晶形態（多形）を包含することを理解されたい。

【0183】

用語「結晶多形」または「多形」または「結晶形態」は、化合物（Ｉ）（またはその塩もしくは溶媒和物）が異なる結晶充填構成で結晶化し得るが、すべて同じ元素組成を有する結晶構造を意味する。結晶形態が異なると、通常、異なるＸ線回折パターン、赤外線スペクトル、融点、密度硬度、結晶形態、光学的および電気的特性、安定性ならびに可溶性を有する。再結晶溶媒、晶出速度、保存温度および他の要素により、一方の結晶形態が優位になることがあり得る。化合物（Ｉ）の結晶多形は、種々の条件下での晶出によって調製され得る。

【0184】

また、化合物（Ｉ）、例えば、化合物（Ｉ）の塩は、水和物もしくは非水和物（無水）形態のいずれかで、または他の溶媒分子との溶媒和物として存在し得る。水和物の非限定的な例としては、一水和物、二水和物などが挙げられる。溶媒和物の非限定的な例としては、エタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物などが挙げられる。

【0185】

「溶媒和物」は、化学量論または非化学量論いずれかの量溶媒を含む溶媒付加形態を意味する。一部の化合物は、結晶性の固体状態で一定モル比の溶媒分子を捕捉し、したがって溶媒和物を形成する傾向を有する。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物であり、溶媒がアルコールである場合、形成される溶媒和物はアルコラートである。水和物は、１つ以上の水分子と、水がその分子状態Ｈ_２Ｏとして保持している物質の１つとの組合せによって形成され、かかる組合せにより１つ以上の水和物が形成され得る。

【0186】

本発明の薬学的に許容され得る塩は、化合物（Ｉ）から慣用的な化学的方法によって合成され得る。一般に、かかる塩は、化合物（Ｉ）を化学量論量の適切な塩基または酸と、水または有機溶媒または両者の混合物中で反応させることにより調製され得る。非水性の媒体、例えば、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルを使用してもよい。適当な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）を見るとよい。

【0187】

また、化合物（Ｉ）は、プロドラッグ、例えば、薬学的に許容され得るプロドラッグとして調製してもよい。用語「プロ−ドラッグ」および「プロドラッグ」は、本明細書において互換的に使用し、活性な親薬物をインビボで放出する任意の化合物をいう。プロドラッグは、医薬品の数多くの望ましい特質（例えば、可溶性、バイオアベイラビリティ、製造性など）を向上させることがわかっているため、化合物（Ｉ）はプロドラッグ形態で送達されることがあり得る。したがって、本発明は、化合物（Ｉ）のプロドラッグ、その送達方法および該プロドラッグを含む組成物を包含することを意図する。「プロドラッグ」は、かかるプロドラッグを被検体に投与したとき、活性化合物（Ｉ）をインビボで放出する任意の共有結合担体を包含することを意図する。プロドラッグは、化合物（Ｉ）に存在する官能基を、修飾によって常套的操作またはインビボのいずれかで切断されて化合物（Ｉ）となるように修飾することにより調製される。

【0188】

「併用療法」（または「同時療法」）は、化合物（Ｉ）またはその塩と、意図される特定の処置レジメンの一部としての少なくとも第２の薬剤との投与によって、これらの治療用薬剤の共作用により有益な効果がもたらされることを包含する。併用の有益な効果としては、限定されないが、治療用薬剤の併用によって生じる薬物動態学的または薬力学的共作用が挙げられる。これらの治療用薬剤の併用投与は、典型的には、規定された期間（選択される組合せに応じて通常、数分間、数時間、数日間または数週間）にわたって行なわれる。「併用療法」は、このような治療用薬剤の２種類以上を別々の単独療法レジメンの一部として投与し、偶発的または自由裁量で本発明の併用がもたらされる場合を包含することが意図されることがあり得るが、一般的にはそうではない。

【0189】

「併用療法」は、これらの治療用薬剤の逐次様式での投与（すなわち、各治療用薬剤が異なる時点で投与される）、ならびにこれらの治療用薬剤または該治療用薬剤の少なくとも２種類の実質的同時様式での投与を包含することを意図する。実質的同時投与は、例えば、被検体に、一定比率の各治療用薬剤を有する単一のカプセル剤または各治療用薬剤の単一のカプセル剤を多重に投与することにより行なわれ得る。各治療用薬剤の逐次投与または実質的同時投与は、任意の適切な経路、例えば限定されないが、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織からの直接吸収によって行なわれ得る。治療用薬剤は、同じ経路で投与してもよく、異なる経路で投与してもよい。例えば、選択した組合せの第１の治療用薬剤を静脈内注射によって投与し、一方、該組合せの他方の治療用薬剤は経口投与してもよい。あるいはまた、例えば、すべての治療用薬剤を経口投与してもよく、すべての治療用薬剤を静脈内注射によって投与してもよい。治療用薬剤を投与する順序は、あまり重要ではない。

【0190】

また、「併用療法」は、上記の治療用薬剤を、さらに、他の生物学的活性成分および非薬物療法（例えば、手術または放射線処置）と併用した投与を包含する。併用療法がさらに非薬物処置を含む場合、非薬物処置は、治療用薬剤と非薬物処置の併用の共作用により有益な効果が得られる限り、任意の適当な時点で行なわれ得る。例えば、適切な場合では、治療用薬剤の投与から非薬物処置を一時的に除いても、数日間さらには数週間、なお有益な効果が得られる。

【0191】

本記載全体を通して、組成物が特定の成分を有する、包含するまたは含むと記載している場合、該組成物はまた、記載の成分から本質的になるもの、ならびに記載の成分からなるものであることが想定される。同様に、方法が特定のプロセス工程を有する、包含するまたは含むと記載している場合、該方法はまた、記載のプロセス工程から本質的になるもの、ならびに記載のプロセス工程からなるものである。さらに、工程の順序または特定の操作を行なう順序は、本発明が実施可能である限り、重要ではないことを理解されたい。さらに、２つ以上の工程または操作は同時に行われてもよい。

【実施例】

【0192】

実施例１：化合物（Ｉ）の小規模合成

【0193】

【化2】

以下に記載する予備合成は、ＵＳ２００６０１６０８００Ａ１に示されていたものである。この手順は、小規模反応、例えば、５０ｇまでの生成物を得る反応に有用である。

【0194】

以下の合成では、特に記載のない限り、試薬と溶媒は、市販の供給元から受領したままの状態で使用した。プロトンおよびカーボン核磁気共鳴スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣ ３００またはＢｒｕｋｅｒ ＡＶ ３００スペクトロメータにおいて、プロトンでは３００ＭＨｚおよびカーボンでは７５ＭＨｚで取得した。スペクトルは単位ｐｐｍ（δ）で示し、結合定数Ｊは単位ヘルツで報告する。テトラメチルシランをプロトンスペクトルの内部標準として使用し、溶媒ピークをカーボンスペクトルの参照ピークとして使用した。質量スペクトルおよびＬＣ−ＭＳ質量データは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ １００大気圧イオン化（ＡＰＣＩ）質量スペクトル測定装置にて取得した。ＬＣ−ＭＳ解析は、Ｌｕｎａ Ｃ８（２）Ｃｏｌｕｍｎ（１００×４．６ｍｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用し、標準的な溶媒勾配プログラム（方法Ｂ）を用いた２５４ｎｍでのＵＶ検出により行なった。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ａｎａｌｔｅｃｈシリカゲルプレートを用いて行ない、紫外（ＵＶ）光、ヨウ素または２０ｗｔ％リンモリブデン酸含有エタノールによって可視化した。ＨＰＬＣ解析は、Ｐｒｅｖａｉｌ Ｃ１８カラム（５３×７ｍｍ，Ａｌｌｔｅｃｈ）を使用し、標準的な溶媒勾配プログラム（方法ＡまたはＢ）を用いた２５４ｎｍでのＵＶ検出により行なった。

【0195】

【表4】

Ｎ−ベンジル−２−（５−ブロモピリジン−２−イル）アセトアミドの合成：

【0196】

【化3】

フラスコに、５−（５−ブロモピリジン−２（１Ｈ）−イリデン）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン（１．０３９ｇ，３．４６ｍｍｏｌ）、ベンジルアミン（０．５０ｍＬ，４．５８ｍｍｏｌ）、およびトルエン（２０ｍＬ）を仕込んだ。反応液を窒素下で１８時間還流し、次いで冷却し、低温度になるまで冷凍庫内に入れた。生成物を濾過によって回収し、ヘキサンで洗浄すると、明るい白色の結晶塊（１．０１８ｇ，９６％）が得られた。

【0197】

４−（２−（４−（４，４，５，５−テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−フェノキシ）エチル）モルホリンの合成：

【0198】

【化4】

４−（４，４，５，５−テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−フェノール（２．５５ｇ，１１．５８ｍｍｏｌ）、２−モルホリン−４−イルエタノール（１．６０ｍＬ，１．７３ｇ，１３．２ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（３．６４ｇ，１３．９ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（６０ｍＬ）攪拌溶液に０℃で、ＤＩＡＤ（２．８２ｇ，１３．９ｍｍｏｌ）を滴下した。反応液を室温まで昇温させ、一晩攪拌した。１８時間後、さらに一部のトリフェニルホスフィン（１．５１ｇ，５．８ｍｍｏｌ）、２−モルホリン−４−イルエタノール（０．７０ｍＬ，５．８ｍｍｏｌ）、およびＤＩＡＤ（１．１７ｇ，５．８ｍｍｏｌ）を添加した。室温でさらに２時間攪拌後、反応液を濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると（５％〜２５％ＥｔＯＡｃ含有ＣＨＣｌ_３）、生成物が白色固形物として得られた（２．８５５ｇ，７４％）。

【0199】

２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）−Ｎ−ベンジルアセトアミド化合物（Ｉ）の合成

【0200】

【化5-1】

セプタム閉鎖部および攪拌バーを備えた１０ｍＬ容反応チューブに、Ｎ−ベンジル−２−（５−ブロモピリジン−２−イル）アセトアミド（１２３ｍｇ，０．４０３ｍｍｏｌ）、４−（２−（４−（４，４，５，５−テトラメチル［ｌ，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−フェノキシ）エチル）モルホリン（１７１ｍｇ，０．５１３ｍｍｏｌ）、およびＦｉｂｒｅＣａｔ １００７^１（３０ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）を仕込んだ。エタノール（３ｍＬ）を添加した後、炭酸カリウム水溶液（０．６０ｍＬ，１．０Ｍ、０．６０ｍｍｏｌ）を添加した。チューブを密封し、マイクロ波条件下、１５０℃で１０分間加熱した。反応液を冷却し、濃縮して大部分のエタノールを除去し、次いで１０ｍＬの酢酸エチル中に溶解させ、水と飽和塩化ナトリウム溶液で逐次洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して白色固形物とした。この白色固形物を、エチルエーテルを用いて摩砕すると、化合物（Ｉ）が白色固形物として得られた（１３７ｍｇ，７９％）：ｍｐ １３５〜１３７℃；

【0201】

【化5-2】

^１ ポリマー結合ジ（アセタト）ジシクロヘキシルフェニルホスフィンパラジウム（ＩＩ）、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ，Ｉｎｃ．製でＡｌｄｒｉｃｈから入手可能（カタログ番号５９０２３１）。

【0202】

実施例２：化合物（Ｉ）二塩酸塩の中規模合成
この実施例に概要を示す合成は、中規模反応において使用され得る。少なくとも５０ｇのバッチの化合物（Ｉ）の二塩酸塩の調製をスキーム１に示す。この線形合成は６工程からなり、第７の工程は、試薬の１つである６−フルオロピリジン−３−イルボロン酸（これは、市販もされている）の調製とした。このシーケンスの全収率は３５％であり、平均収率は８３％、最低収率工程では６８％であった。この７つの工程のうち、１工程のみ、クロマトグラフィーが必要であった。以下に示す手順は７０ｇ規模にて行なった。

【0203】

【化6】

第１工程は、Ｋ_２ＣＯ_３粉末（３〜３．５当量）を塩基として使用し、アセトニトリルを溶媒とした、４−ブロモフェノール（１３１ｇ）とＮ−クロロエチルモルホリン（ＨＣｌ塩としての１；１４１ｇ）間のＷｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成である。成分を混合し、還流下で一晩攪拌すると、高度に変換された（９６．３〜９９．１％）。ジクロロメタンとヘプタンで希釈後、反応混合物を濾過し、エバポレートすると、所望の生成物２が本質的に定量的収率（２１６ｇ）で得られた。類似した基質（例えば、４−ブロモ−３−フルオロフェノール）を使用した場合、変換率は（充分な加熱を行なっても）、常にこのように高いとは限らないことに注意されたい（例えば、５９．９〜９８．３％）。塩化アルキルおよびＫ_２ＣＯ_３はともに、好ましくはＡｌｄｒｉｃｈから購入されるものである。加熱を継続しても反応の終了が推進されない場合、未反応ブロモフェノールは、粗反応混合物を４部のトルエンに溶解させ、フェノールを４部の１５％ＮａＯＨ水溶液で洗い流すことにより、容易に除去され得る。

【0204】

第２工程（スズキカップリング）に必要な試薬の１つは、６−フルオロピリジン−３−イルボロン酸（４）であった。市販されているが、この試薬は、ＴＢＭＥ中、低温（＜−６０℃）でのｎ−ブチルリチウム（１．２当量）との５−ブロモ−２−フルオロピリジン（３，１０２ｇ）の臭化リチウム交換後、トリイソプロピルボレート（１．６５当量）の添加によって容易に調製されるものであった。両反応段階とも短時間であり、全反応時間（添加時間を含む）は約３時間である。クエンチングは２４％ＮａＯＨ水溶液を用いて行ない、また、これにより生成物も抽出され、有機層中に不純物が残留する。水層を取り出し、次いで、これをＨＣｌで中和し、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機層を乾燥させ、少量のヘプタンで希釈した後、濃縮により生成物の析出／晶出がもたらされる。濾過により、ボロン酸４が比較的高純度（９６．４％ＡＵＣ）および良好な収率（６９ｇ，７９〜９０％；実験セクションの収率の推定に関する注釈を参照のこと）で得られ、これは、さらに精製せずに使用され得る。

【0205】

この線形シーケンスの第２反応工程（スズキカップリング）は、設定するのが簡単な反応である；すべての試薬［２（１１１ｇ）、Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液、ＤＭＥ、およびＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（０．０４当量）］を反応フラスコに仕込み、混合物を還流下で加熱した；反応混合物を酸素を除去するために脱気したことに注意のこと。反応が終了したら（７時間以内）、処理に、フラスコの側面上（目に見える水層はなかった）での有機塩からの反応溶液のデカンテーション（または吸引除去）を含めフラスコをすすぎ、乾燥させ、合わせた有機層から溶媒を除去した。イソプロパノール／ヘプタンからの粗製５の晶出により、粗製物と比べて純度が改善されたが、それでも、充分な純度（＞９８％）の物質を得るためにクロマトグラフィー（粗製物に対するシリカゲルの比は約８．５：１であった）が必要である物質が得られた；収率は６８％（７９．５ｇ）であった。清浄な５の使用により、次の工程、フッ素原子のアセトニトリル置換でのクロマトグラフィーの必要性が回避された。

【0206】

アセトニトリルでのフッ化物の置換もまた単純な反応であり、単純な室温での粗製生成物の晶出によって、清浄な６が高い収率および純度で得られた。この反応は、最初にカリウムヘキサメチルジシランＫＨＭＤＳ（８当量）／ＴＨＦを−１０℃で用いてアセトニトリル（６．５当量）から「エノレート」を形成した直後、フッ化物５（７９ｇ）の添加を伴うものであった。反応は高速であり、１時間後、飽和ブラインでクエンチングを行なった。有機層の乾燥および溶媒のエバポレーション後、得られた粗製混合物は２種類のみの成分、所望の生成物と、見かけ上アセトニトリルの自己縮合による非常に少量の極性生成物からなるものであった。この粗製混合物をイソプロパノール／ヘプタン中で旋回させ、一晩放置すると生成物の完全な晶出がもたらされ、該生成物を濾別し、洗浄すると高純度の６（９９．３％ＡＵＣ）が良好な収率で得られた（６４ｇ，７６％）。

【0207】

６（６４ｇ）のメタノール分解を、反応が終了するまで（２５時間）４０％Ｈ_２ＳＯ_４（ＭｅＯＨ中）中で加熱することにより行なった。次いで反応液を冷却し、ＭｇＳＯ_４とともに攪拌して微量の加水分解生成物（ＡｒＣＨ_２−ＣＯ_２Ｍｅ）を生成物に変換し戻し、次いで冷却Ｋ_２ＣＯ_３水溶液に添加し、同時にジクロロメタン中での抽出を行なった。乾燥および大部分のＤＣＭのエバポレーション後、５％ＥｔＯＡｃ（ヘプタン中）の添加およびさらなる濃縮により、生成物の晶出がもたらされた。固形物の濾過および洗浄により、高純度（９８．９％ＡＵＣ）の７が良好な収率（８２％）で得られ、さらに高純度の生成物（４ｇ）が母液から得られ、総収量は６１．７ｇ（８７％）となった。

【0208】

また、アミド化工程は、反応槽への成分（７（６１ｇ）、ベンジルアミン（３当量）、および高沸点アニソール）の仕込み、次いで、反応が終了するまでの還流下での加熱を伴うものであった。反応混合物の冷却により、高純度（９８．９％）および良好な収率（８１％）での目的化合物の完全な晶出がもたらされた。

【0209】

最終工程は、目的化合物の二塩酸塩の形成であった。両塩基性部位の完全なプロトン化を確実にするため、反応を、二塩酸塩が溶けやすい無水エタノール中で行なった。ほぼ乾固するまでエバポレーション後、反応混合物をエタノールで２回「チェイス（ｃｈａｓｅ）」し、過剰の塩化水素を除去した。得られた粘性の油状物をエタノール（２部）に溶解させ、次いで高速攪拌しながら、大容量（２０部）のＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）に添加した。濾過、酢酸エチル（ヘプタンなし）での洗浄および真空乾燥により、化合物（Ｉ）の二塩酸塩が乳白色粉末として得られた。合計６８ｇ（収率９７％）の最終塩が高純度（９９．６％ＡＵＣ）で得られ、これには、微量のＥｔＯＡｃ（４．８％ｗ／ｗ）、ＥｔＯＨ（０．３％ｗ／ｗ）、およびヘプタン（０．６％ｗ／ｗ；真空乾燥前のヘプタンでの最終洗浄によるもの）が含まれていた。また、この塩を（上記の析出方法ではなく）高温ＥｔＯＨ／ＥｔＯＡｃから晶出させると結晶性ビーズ状物が得られ、これは、ずっと少ない捕捉溶媒レベル（わずか０．２６％ｗ／ｗのＥｔＯＡｃおよび０．４５％ｗ／ｗのＥｔＯＨ）を有しており、自由流動性であった。

【0210】

【化7-1】

４−（２−（４−ブロモフェノキシ）エチル）モルホリン（２）の調製：
機械的攪拌子、アダプターを有する温度計、冷却器、および窒素供給口（冷却器の上部）を取り付けた５Ｌ容の三ツ口丸底フラスコに、１（１４０．７ｇ，０．７５６ｍｏｌ）、４−ブロモフェノール（１３０．６ｇ，０．７５５ｍｏｌ）、無水Ｋ_２ＣＯ_３粉末（３６７．６ｇ，２．６６ｍｏｌ，３．５当量）、およびアセトニトリル（１．３Ｌ）を仕込んだ。混合物を、８０℃で（一晩）激しく攪拌した（羽根がフラスコ底面に接触）後、ＤＣＭ（５００ｍＬ）とヘプタン（２００ｍＬ）で希釈し、セライトに通して濾過した。蒸発乾固（回転式エバポレーション、次いで高真空）により、２が淡黄色油状物として得られた（２１６．００ｇ，収率１００％、９６．３％ＡＵＣ、３．７％の未反応ブロモフェノールを含有）。この物質を、さらに精製せずに成功裡に使用された。

【0211】

【化7-2】

ブロモフェノールが容易に除去され得ることは、２ｇの試料において、最初に試料をトルエン（８ｇ）に溶解させ、８ｇの１５％ＮａＯＨ水溶液で洗浄することにより示された；液体クロマトグラフィーでは、回収された生成物（１．９７ｇ；９８．５％回収率）中に未反応ブロモフェノールの痕跡は示されなかった。

【0212】

【化8】

６−フルオロピリジン−３−イルボロン酸（４）の調製：
攪拌冷却（ドライアイス−アセトン浴）無水［ＴＢＭＥ］
（６２０ｍＬ；機械的攪拌子、アダプターを有する温度プローブ、および窒素供給口を取り付けた３Ｌ容の三ツ口丸底フラスコ内）に、２ＭのＢｕＬｉ（３５２ｍＬ，０．７０４ｍｏｌ，１．２当量）を添加した（シリンジによって）。この高速攪拌冷却（＜−７５℃）混合物に、３（１０２．２ｇ，０．５８１ｍｏｌ）の無水ＴＢＭＥ（１００ｍＬ）溶液を１３分間かけて添加し、この間、内部温度は−６２℃に上昇した。反応液をさらに４５分間攪拌した（温度は−６２℃〜−８０℃に維持した）後、トリイソプロピルボレートを４分割して（合計１８０ｇ，０．９５７ｍｏｌ，１．６５当量）速やかに連続的に添加した。添加終了時、内部温度は−３３℃に上昇していた。冷却浴でさらに４５分間攪拌後（内部温度は−３３℃から−６５℃に低下した）、冷却浴を除き、攪拌混合物それ自体で５０分間かけて−２２℃まで昇温した。１５分間かけて６℃まで昇温後（水浴によって）、攪拌反応混合物を氷水浴内に入れ、次いで、ＮａＯＨ（１６０ｇ）の冷却水（５００ｍＬ）溶液で、窒素下にてクエンチングした。添加が終了すると、内部温度は２０℃となった。この混合物を室温で１．５時間攪拌した。水層を取り出し、約３５０ｍＬの濃ＨＣｌでｐＨ７に中和し、次いでＥｔＯＡｃ（３×１Ｌ）で抽出した。このときｐＨが８〜９となったため、水層を、約１５ｍＬの濃ＨＣｌを用いてｐＨ７に調整し、酢酸エチル（２×１Ｌ）でさらに抽出した。合わせたＥｔＯＡｃ抽出物を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、約１５０ｍＬの容量に濃縮した。この濃縮物を旋回させながら、ヘプタンを分割して添加すると（総容量３００ｍＬ）、生成物の析出／晶出がもたらされた。濾過、ヘプタン（１００ｍＬ，３００ｍＬ，次いでさらに３００ｍＬ）での固形物の洗浄、および風乾により、標題生成物がオフホワイト色固形物で得られ（６８．６ｇ，収率７９〜９０％＊；ＬＣ純度９６．４％、ＮＭＲにより推定５．５％ｗ／ｗのヘプタンが示された）、これは、さらに精製せずに成功裡に使用された。ＬＣ／ＭＳにより、これは、下記の２種類の存在体の混合物であることが示され、高分子量の存在体の強度の方が大きかった（＊注：反応の収率は、ボロン酸が唯一の構成成分であると仮定した場合では７９％であり、環状ボレートが唯一の構成成分であると仮定した場合は９０％である）：

【0213】

【化9】

【0214】

【化10】

４−（２−（４−（６−フルオロピリジン−３−イル）フェノキシ）エチル）モルホリン（５）の調製：
機械的攪拌子、温度計とアダプター、冷却器、および窒素供給口（冷却器の上部）を取り付けた２Ｌ容の三ツ口丸底フラスコに、２（１１０．７ｇ，０．３８７ｍｏｌ）、４（７１．０５ｇ，０．４７７ｍｏｌ，１．２３当量）およびＤＭＥ（７００ｍＬ）を仕込んだ。得られた攪拌溶液を、この攪拌溶液中に高速窒素流を５分間かけて通すことによって脱気した後、Ｎａ_２ＣＯ_３（１２１．０６ｇ，１．１４２ｍｏｌ，３当量）のＨ_２Ｏ（２５０ｍＬ）脱気溶液を添加し、また、固形Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４（１９．８ｇ，０．０４４当量）も添加した。最後の添加直後、反応混合物上部のヘッドスペースに窒素をパージし、次いで、混合物を８０〜８５℃（内部温度）で７時間攪拌した後、室温まで冷却した。水層がないため、上清みをデカンテーションすると、無機塩（吸着水を有する）が残留した。この無機塩が入った反応フラスコを５０％ジクロロメタン／酢酸エチル（２×２５０ｍＬ）で洗浄し、洗浄液をデカンテーションした上清みに添加した。合わせたこの有機層を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、蒸発乾固させると暗褐色油（１４８ｇ）となった。この油状物に、１５０ｇの５０％ヘプタン／イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を添加し、旋回および冷却（氷水浴によって）すると、晶出が始まった。さらにヘプタン（５０ｇ）を添加し、得られた固形物を濾過し、洗浄し、風乾させると、４８ｇの淡褐色固形物が得られた。濾液の蒸発乾固後、得られた混合物を１００ｍＬの５０％ヘプタン／ＩＰＡ中で旋回させた後、さらにヘプタン（約１００ｍＬ）を添加し、栓をし、晶出のために冷凍庫内に入れた。得られた固形物を濾過し、ヘプタンで洗浄し、風乾させると６１ｇのゴム状固形物が得られた。得られた濾液のエバポレーションにより油状物（３４ｇ）が得られ、これは、含有された極性不純物（例えば、Ｐｈ_３Ｐ＝Ｏ）が有意に少なく、そのため、２Ｎ ＨＣｌ（２４０ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（２２０ｍＬ）間に分配した。底部の水層を取り出し、次いで、Ｋ_２ＣＯ_３でｐＨ７〜８に中和しながらＥｔＯＡｃとともに攪拌した。ＥｔＯＡｃ層を乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させた（２２ｇ）。４８ｇ、６１ｇおよび２２ｇに分割したものを、ＤＣＭ中に充填したシリカゲル（１．１Ｋｇ）でクロマトグラフィー処理した。ＤＣＭ（４００ｍＬ）、５０％ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ（５Ｌ）、次いで、漸増量のＭｅＯＨ／Ｅｔ_３Ｎ（１．５％ＭｅＯＨ／１％Ｅｔ_３Ｎで開始し、５％ＭｅＯＨ／３％Ｅｔ_３Ｎで終了）を含有する５０％ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ（８Ｌ）での溶出により、７７．６８ｇの粘性油状物が得られ（純度９８．０％）、これをヘプタン（３００ｍＬ）中で旋回すると、すぐに結晶化した。濾過、ヘプタンでの洗浄および風乾により、７５．５５ｇ（９８．７％ＡＵＣ）の固形物５が得られた。さらなる純粋な５（合計３．９ｇ，９８．６〜９９．３％ＡＵＣ）が、Ｐｈ_３Ｐ＝Ｏを含有する最初の方のクロマトグラフィー画分から、上記の３４ｇの試料で行なったようにして、清浄化した後、エバポレーション晶出により得られた。５の総収量は７９．５ｇ（６８％）であった。

【0215】

【化11】

２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）アセトニトリル（６）の調製：
３Ｌ容の三ツ口丸底フラスコに、機械的攪拌子、温度計とアダプター、滴下漏斗、および窒素供給口（滴下漏斗の上部、バブラーによる正圧）を取り付けた。バブラーによって高速窒素流を流しながら、栓を外し、フラスコにＫＨＭＤＳ（４１５．８ｇ，２．０８ｍｏｌ）、次いで無水ＴＨＦ（１Ｌ）を仕込んだ。この攪拌冷却ＫＨＭＤＳ／ＴＨＦ溶液（氷／メタノール浴、溶液の内部温度は−８℃であった）に、ＭｅＣＮ（７０ｇ）のＴＨＦ（１１０ｍＬ）溶液を２２分間かけて滴下した直後、比較的高速（４分間）で、５（７９．０６ｇ，０．２６２ｍｏｌ）のＴＨＦ（４００ｍＬ）溶液を添加し、この間の後、反応混合物の内部温度は１０℃に達した。冷却を継続すると（１時間）、内部温度は−６℃になり、ＴＬＣによると、反応は終了したようであった。さらに３０分後（内部温度-３℃）、反応混合物を飽和ブライン（１Ｌ）でクエンチングし、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で希釈した。水層を除去し、有機溶液を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、蒸発乾固させた（油状物になった）後、ＩＰＡ（１５０ｍＬ）に完全に溶解させ、ヘプタン（３００ｍＬ）で希釈し、種晶（約１００ｍｇの粗製油をＩＰＡ（約１５０ｍｇ）に溶解させ、ヘプタン（約２．５ｍＬ）で希釈することによって調製）を添加し、一晩放置した。この結晶性の固形物を攪拌して分解させた後、固形物を濾過し、２５０ｍＬの２：１ヘプタン／ＩＰＡで洗浄し、次いでヘプタンで多数回洗浄し、風乾させると、６４．３８ｇ（収率７６％）の標題生成物６が結晶性の黄褐色固形物として得られた（ＬＣ純度９９．３％）。さらに５．８８ｇの低純度の物質が濾液から得られた。

【0216】

【化12】

２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）酢酸メチル（７）の調製：
２Ｌ容の一ッ口丸底フラスコに、６（６４．００ｇ，０．１９８ｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（３６０ｇ）を仕込んだ後、Ｈ_２ＳＯ_４（２４０ｇ）をゆっくりと注意深く滴下し、得られた均一な溶液を還流下で、反応が終了するまで（２５時間、０．８％の未反応出発材料を有した）３．５％ＡｒＣＨ_２ＣＯ_２Ｈとともに攪拌した（１１５℃油浴）。短時間冷却後、ＭｇＳＯ_４（７５ｇ）を添加し、混合物を旋回させ、さらに４５分間放置した（このとき、組成は、９６．３％の生成物、０．８％の未反応出発材料、および２．５％のＡｒＣＨ_２ＣＯ_２Ｈ）。次いで反応混合物を、ＤＣＭ（２Ｌ）とＫ_２ＣＯ_３（４５０ｇ）のＨ_２Ｏ（６００ｍＬ）溶液との高速攪拌冷却（氷水浴）混合物にゆっくりと添加した。得られた乳濁液を一晩放置した。有機溶液の透明な部分を吸引除去し、残りの部分を水とＤＣＭで繰り返し処理し、透明な有機溶液部分を吸引除去した元の部分と合わせた。合わせた有機溶液部分を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、約１．２Ｌの容量に濃縮した後、３００ｍＬの５％ＥｔＯＡｃ（ヘプタン中）、次いでヘプタン（３００ｍＬ）を添加し、混合物を再度濃縮して（加熱を伴う回転式エバポレーション）ＤＣＭを除去した。この時点で、１５ｍＬのＥｔＯＡｃを添加し、この高温混合物を晶出が始まるまで旋回させ、晶出がほぼ完了するまで旋回を継続し、次いで、完全な晶出のために放置して室温まで冷却させた。次いで、この固形物を濾過し、３００ｍＬの５％ＥｔＯＡｃ（ヘプタン中）およびヘプタン（１００ｍＬ）で洗浄し、次いで、充分に風乾させると、５７．７４ｇ（収率８２％）の７が淡黄色固形物として得られた（９８．９％ＡＵＣ）。さらに３．９４ｇの清浄な生成物（９７．９％ＡＵＣ）が濾液から得られた（総収量８７％）。

【0217】

【化13】

２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）−Ｎ−ベンジルアセトアミド（化合物（Ｉ）遊離塩基）の調製
１Ｌ容の一ッ口丸底フラスコに、７（６１．４ｇ，０．１７２ｍｏｌ）、ベンジルアミン（５５．６ｇ，０．５１９ｍｏｌ，３当量）、および無水アニソール（３００ｇ）を仕込み、次いで、反応が本質的に終了するまで還流下で攪拌し（２３時間、１６５℃油浴温度；内部温度は１４７℃であった）、次いで、ほぼ室温まで放冷した。反応混合物の一部（１ｍＬ）をトルエン（１ｍＬ）で希釈すると、該部分の完全な晶出がもたらされた。次いで、この種晶を反応混合物に添加し、全反応混合物が晶出して単一の塊になるまで放置した。トルエン（１５０ｍＬ）を添加し、混合物を旋回させて固形物を分解させた。ヘプタン／トルエン（１：１、１００ｍＬ）を添加し、固形混合物をさらに分解させた。最後に、ヘプタン（５０ｍＬ，次いで２５ｍＬ）を添加し、混合物をまたさらに分解させ、さらに３０分間放置した後、固形物を濾過した。固形物の濾過、２：１トルエン／ヘプタン（３００ｍＬ）、１：２トルエン／ヘプタン（３００ｍＬ）で、次いでヘプタン（２×３００ｍＬ）での洗浄、次いで乾燥（風乾、次いで高真空）により、６０．１６ｇ（収率８１％）の標題生成物が白色固形物として得られた（≧９８．９％ＡＵＣ）。さらに２．５ｇの低純度（９７．４％）の物質が母液から得られた。

【0218】

【化14-1】

４−（２−（４−（６−（２−（ベンジルアミノ）−２−オキソエチル）ピリジニウム−３−イル）フェノキシ）エチル）−モルホリン−４−イウムクロリド（化合物（Ｉ）、二ＨＣｌ塩）の調製
化合物（Ｉ）（遊離塩基、６０．００ｇ）の無水ＥｔＯＨ（６００ｍＬ）攪拌懸濁液に、１７０ｍＬの２．５Ｍ ＨＣｌ（エタノール中）を添加し、２５ｍＬのＥｔＯＨをフラスコの側面を洗い流すように添加した。得られた均一な溶液を室温で（２０分間）攪拌し、次いで、ほぼ乾固するまで（起泡するまで）エバポレートした。ＥｔＯＨ（２×１５０ｍＬ）でチェイスした後、残渣を再度ＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）に溶解させた後、次いで、混合物が飽和したと思われるまでヘプタンをゆっくりと添加した（混濁したままとなるのに３３ｍＬが必要であった）。一晩攪拌後、２層が形成された。さらなるヘプタン（２５０ｍＬ）を添加後、依然として晶出は誘導され得ず、そのため反応混合物を約２００ｍＬの容量に濃縮し、この時点で混合物は均一であった。この高粘度の均一な溶液を、非常に高速で攪拌下の（機械的）ＥｔＯＡｃ（２Ｌ）に滴下した。添加終了後、元のフラスコと滴下漏斗の２５ｍＬのＥｔＯＨすすぎ液を、この高速攪拌混合物に添加した。高速攪拌をさらに約１時間継続し、次いで混合物を濾過し、固形物（一部ゴム状）をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で、次いでヘプタンで洗浄した。ヘプタン洗浄を開始するとすぐ、固形物はさらにゴム状となった。ガラス製ブフナー漏斗およびその内容物を被覆し（ペーパータオル／輪ゴム）、直ちに真空炉内に入れた。約４５℃で一晩真空後、窒素下で真空を解除し、生成物（泡状固形物）の入ったブフナー漏斗を、直ちにジップロック内に入れ戻し、次いで、窒素下で（グローブバッグ）、瓶に移し、泡状固形物を粉末に分解した（へら）。高真空下（約４５℃）で第二夜に、わずかに１．３ｇのさらなる重量減少がもたらされた。定重量は、本質的に高真空（約４５℃）で第三夜に得られ、このとき、わずかに０．２ｇ重量が減少していた。物質は、最終重量が６８．０５ｇであり（収率９７％）、０．２９当量（４．８％ｗ／ｗ）のＥｔＯＡｃ、０．０３５当量（０．３％ｗ／ｗ）のＥｔＯＨ、および０．０３当量（０．６％ｗ／ｗ）のヘプタンを含有していた。純度は９９．６％であった。

【0219】

【化14-2】

元素分析（Ｃ_２６Ｈ_２９Ｎ_３Ｏ_３・２ＨＣｌ・０．０３５ＥｔＯＨ・０．２９ＥｔＯＡｃ・０．０３ヘプタン・０．８Ｈ_２Ｏの場合）：
ａ．計算値（％）：Ｃ、６０．０３；Ｈ、６．５４；Ｎ、７．６５；Ｃｌ、１２．９１
ｂ．観測値（％）：Ｃ、５９．８５／５９．９７；Ｈ、６．５４／６．４７；Ｎ、７．６７／７．６７；Ｃｌ、１３．１０／１３．２４
計算値ＦＷ：５３４．６３（^１Ｈ ＮＭＲでは、Ｈ_２Ｏの形跡が示されないため、おそらく、この非常に吸湿性のある粉末の取り扱い中に生じた０．８Ｈ_２Ｏを考慮していない）。

【0220】

この物質の塩化エチルレベルを測定すると、９８ｐｐｍであることがわかった。また、試料を解析すると、５，８００ｐｐｍのヘプタンを含むことがわかった。

【0221】

この試料の別の一部分の分析により、以下の結果：９９．６％のＡＵＣ、１６４０ｐｐｍのエタノール、４１，４８０ｐｐｍの酢酸エチル、５６００ｐｐｍのヘプタン、アニソールは未検出、および１２０ｐｐｍの塩化エチルが得られた。

【0222】

また、上記の乾燥塩を使用し、塩の再結晶のための手順を開発した。この手順は、ＨＣｌ塩形成性反応混合物の濃縮によって得られる非常に純粋な粗製塩（残留ＥｔＯＨ含有）に対しても、同様に良好に（ｊｕｓｔ ｗａｓ ｗｅｌｌ）有効であり得る。

【0223】

塩（５７５ｍｇ）を２倍質量の無水ＥｔＯＨ（１．１５７ｇ）に溶解させ、次いで窒素下で加熱した。この高温溶液（攪拌）に、１．６ｇの２５％ＥｔＯＨ（ＥｔＯＡｃ中）を添加した後、ＥｔＯＡｃ（０．２５ｍＬ）を添加すると、混濁したままとなった。この混濁高温溶液を室温まで放冷し、この間に晶出が起こった。晶出が終了後（２時間）、結晶性固形物を濾過し、無水ＥｔＯＡｃ（約４０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥させると、わずかに０．０５当量（０．４５％ｗ／ｗ）のＥｔＯＨおよび０．０１５当量（０．２６％ｗ／ｗ）のＥｔＯＡｃを含有する４２４ｍｇの化合物（Ｉ）の二塩酸塩が自由流動性固形物として得られた（小ビーズ、９９．８％ＡＵＣ）。イソプロパノール／ＥｔＯＡｃを使用すると、わずかに良好な回収率（５８６ｍｇから４６０ｍｇ）が得られたが、溶媒捕捉レベルは高くなった［０．０８５当量（１．０％ｗ／ｗ）のイソプロパノールおよび０．０２３当量（０．４％ｗ／ｗ）のＥｔＯＡｃ］。

【0224】

実施例３：化合物（Ｉ）二ＨＣｌの大規模合成
試薬と溶媒は、市販の供給元から受領したままの状態で使用した。反応の進行は、ＨＰＬＣ、ＧＣ／ＭＳ、または^１Ｈ ＮＭＲによってモニターした。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ａｎａｌｔｅｃｈ製シリカゲルプレートを用いて行ない、ＵＶ光（２５４ｎｍ）によって可視化した。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ装置にて行なった。プロトンおよびカーボン核磁気共鳴スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶ ３００を使用し、プロトンでは３００ＭＨｚおよびカーボンでは７５ＭＨｚで取得した。溶媒ピークは、プロトンおよびカーボンのスペクトルの参照ピークとして使用した。

【0225】

４−（２−（４−ブロモフェノキシ）エチル）モルホリン（２）の調製
還流冷却器と温度プローブを取り付けた５０Ｌ容のジャケット付き反応器に、４−（３−クロロプロピル）モルホリン（２．４４ｋｇ，０．５４ｍｏｌ）、４−ブロモフェノール（２．２７ｋｇ，０．５４ｍｏｌ，１．０当量）、粉末化炭酸カリウム（６．３３１ｋｇ，１．８８ｍｏｌ，３．５０当量）、およびＤＭＦ（１２．２Ｌ）を仕込み、攪拌した。次いで反応混合物を６０〜６５℃まで加熱し、一晩攪拌した。１７．５時間後、反応混合物を２０〜２５℃まで冷却した。反応混合物を、処理のためのボトムバルブを取り付けた別の反応器に仕込んだ。温度を２０〜３０℃に維持しながら、ＤＩ水（４８．７Ｌ）を反応器に仕込んだ。相分離が起こった。水層をＭＴＢＥ（３×２４．４Ｌ）で抽出した。合わせた有機層に、ＤＩ水（１８．３Ｌ）、次いで、６Ｍ水酸化ナトリウム（１８．２Ｌ）を添加した。混合物を２〜５分間攪拌すると、相分離が起こった。有機相を水（２４．４Ｌ）とブライン（２４．４Ｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、３３７０ｇの黄色油状物が得られた（８９％粗収率、ＨＰＬＣにより９９．４％ＡＵＣ）。

【0226】

６−フルオロピリジン−３−イルボロン酸（４）の調製
７２Ｌ容反応器に、還流冷却器と温度プローブを取り付けた。この反応器に、５−ブロモ−２−フルオロピリジン（１．１７Ｌ，０．５６８ｍｏｌ）、トルエン（１８．２Ｌ）、およびトリイソプロピルボレート（３．１３Ｌ，０．６８ｍｏｌ，１．２当量）を仕込み、攪拌した。テトラヒドロフラン（４．４Ｌ）を反応器に添加し、反応混合物を-３５〜−５０℃まで冷却した。温度を−３５〜−４５℃に維持しながら、ｎ−ブチルリチウム（２．５Ｍのヘキサン溶液、５．４４Ｌ，０．６８ｍｏｌ，１．２当量）を、反応器に注意深く添加した。５時間後、反応が終了したとみなし、反応混合物を−１５〜−２０℃に昇温させた。温度を−１５℃〜０℃に維持しながら、反応器の反応液に、２Ｍ ＨＣｌ（１１．８０Ｌ）を添加した。反応混合物を１８〜２３℃で１６時間攪拌すると、相分離が起こった。次いで、有機相を６Ｍ水酸化ナトリウム（６．０Ｌ）で抽出した。酸性で非塩基性の水相を反応器内で混合し、ｐＨ７．５になるまで６Ｍ ＨＣｌ（２．５Ｌ）を添加した。次いで、塩化ナトリウム（６．０ｋｇ）を水相に添加した。次いで水相をＴＨＦ（３×２０Ｌ）で抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮すると、１３００ｇの黄褐色固形物が得られた（８１％粗収率）。

【0227】

４−（２−（４−（６−フルオロピリジン−３−イル）フェノキシ）エチル）モルホリン（５）の調製
還流冷却器、スパージチューブ、バブラー、および温度プローブを取り付けた７２Ｌ容反応器に、６−フルオロピリジン−３−イルホウ酸（２．８４ｋｇ，１．２４当量）、４−（２−（４−ブロモフェノキシ）エチル）モルホリン（４．２７ｋｇ，１．０当量）、およびＤＭＥ（２７Ｌ）を仕込んだ。攪拌を開始し、次いで、炭酸ナトリウム（４．７４ｋｇ，３．０当量）をＤＩ水（１７．１Ｌ）溶液として反応混合物に仕込んだ。アルゴンを反応混合物中で５０分間起泡させた。アルゴン雰囲気下、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（７５０ｇ，０．０４当量）を、ＤＭＥ（１．０Ｌ）中のスラリーとしての反応混合物に添加した。反応混合物を７５〜８５℃まで加熱し、一晩攪拌した（１７時間）。反応混合物を１８〜２２℃まで冷却した。ＤＩ水（２６．６８１ｋｇ）およびＭＴＢＥ（２６．６８１Ｌ）を反応器に仕込み、５分間攪拌した。相分離が起こり、水相をＭＴＢＥ（２×２６．７Ｌ）で抽出した。合わせた有機相を２Ｍ ＨＣｌ（１×１５．０Ｌ，３×２１．８Ｌ）で抽出した。次いで水相を反応器に仕込んで戻し、酢酸エチルを添加した（２６．７Ｌ）。温度を１５〜２５℃に維持しながら、６Ｍ水酸化ナトリウム（２６．７Ｌ）を用いてｐＨを６．２に調整した。相分離が起こり、水相を酢酸エチル（２×２６．７Ｌ）で抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮すると、４５５５ｇの残渣が得られた（１０１％粗収率、ＨＰＬＣにより６７．１％ＡＵＣ）。

【0228】

４−（２−（４−（６−フルオロピリジン−３−イル）フェノキシ）エチル）モルホリン（５）の精製
粗製生成物（５７５ｇ）をシリカゲルクロマトグラフィーによって、メタノール／酢酸エチル／ヘプタン（３０％酢酸エチル／ヘプタン、５０％酢酸エチル／ヘプタン、７５％酢酸エチル／ヘプタン、１００％酢酸エチル、および５％メタノール／酢酸エチル）で溶出することにより精製した。純粋な画分をＴＬＣ（１０％メタノール／ジクロロメタン、Ｒ_ｆ＝０．３）によって濃縮することにより、４２０ｇの淡褐色固形物が得られた（７３％回収率、ＨＰＬＣにより＞９９．９％ＡＵＣ）。

【0229】

２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）アセトニトリル（６）の調製
１ＭのＮａＨＭＤＳ（２．０Ｌ，５．０当量）のＴＨＦ溶液を、５Ｌ容フラスコに仕込み、−２０〜−１５℃まで冷却した。温度を−１０℃未満に維持しながら、フッ化物（１１９．７ｇ、１．０当量）含有ＴＨＦ（５００ｍＬ）を、このフラスコに２０分間かけて仕込んだ。アセトニトリル（８２．５ｍＬ，４．０当量）含有ＴＨＦ（１７０ｍＬ）を、このフラスコに２０分間かけて添加し、この間、温度を-１０℃未満に維持した。次いで反応混合物を１時間攪拌した。この反応液にブライン（１．５Ｌ，１２．６容量）を、温度が１０℃未満に維持されるような速度で添加した。次いで溶液を室温まで昇温させ、層分離させた。混合物をセライト上で濾過し、ＴＨＦ（１×２００ｍＬ，１×１００ｍＬ）で洗浄した。水相をトルエン（７５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、トルエン（２×２５０ｍＬ）で洗浄し、濃縮乾固した。トルエン（１Ｌ）を添加し、溶液を再度濃縮乾固すると、１６９．８ｇの油状物が得られた。ＭＴＢＥ（１１９０ｍＬ，７容量）を、この油状物に５０℃で添加し、１５分間攪拌した。ヘプタン（８５０ｍＬ，５容量）を５０℃で１０分間かけて添加した。次いで混合物を室温まで１．５時間かけて冷却し、２時間攪拌した。このスラリーを濾過し、１：４ ＭＢＴＥ／ヘプタン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、炉内で一晩４５℃にて乾燥させると、１０２．３ｇのオフホワイト色固形物が得られた（８０％収率、ＨＰＬＣにより９８．８％ＡＵＣ）。

【0230】

２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）酢酸メチル（７）の調製
ニトリル６（１０１ｇ）およびメタノール（１．０１Ｌ，１０容量）を、攪拌バーと熱電対を取り付けた３Ｌ容フラスコに仕込んだ。濃Ｈ_２ＳＯ_４（１７５ｍＬ，１０．０当量）をこの溶液に１５分間かけて滴下し、この間、温度を６０℃未満に維持した。続いて、３０％発煙硫酸（１２４ｍＬ）をこの溶液に滴下し、この間、温度を６０℃未満に維持した。次いで溶液を加熱マントルを用いて還流加熱し、一晩攪拌した。反応が終了したとみなされたら、２０℃まで冷却した。第２のフラスコ（２２Ｌ）に、飽和重炭酸ナトリウム（１０．７Ｌ）とジクロロメタン（１．１Ｌ）を仕込み、１５℃まで冷却した。温度を２０℃未満に維持しながら、反応混合物を重炭酸ナトリウム／ジクロロメタン混合物に添加した。クエンチ液を１５分間攪拌すると、相分離が起こった。水相をジクロロメタン（１×５５０ｍＬ，１×３００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮乾固すると、１０５ｇの橙色の固形物が得られた（９４％粗収率、ＨＰＬＣにより９７．７％ＡＵＣ）。

【0231】

２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）−Ｎ−ベンジルアセトアミド（化合物（Ｉ））の調製
エステル７（１０３ｇ）、アニソール（５１３ｍＬ，５容量）、およびベンジルアミン（９４ｍＬ，３．０当量）を、熱電対とオーバーヘッドスターラーを取り付けた３Ｌ容フラスコに仕込んだ。次いで反応混合物を１４２℃まで加熱し、２日間攪拌した。反応混合物を４５〜５０℃まで冷却し、２時間攪拌した。この混合物に、ｎ−ヘプタン（１．５Ｌ）を１時間かけて滴下した。溶液を室温まで３時間かけて冷却し、次いで一晩攪拌した。得られたスラリーを濾過し、４：１アニソール／ｎ−ヘプタン（２００ｍＬ）とｎ−ヘプタン（３×１００ｍＬ）で洗浄した。炉内で一晩乾燥させると、得られた生成物は、１１２．１ｇの黄褐色固形物であった（９０％収率、ＨＰＬＣにより９９．６％ＡＵＣ）。残留溶媒を充分に定量するのに、ヘプタンの単一の異性体の使用は不可欠であった。

【0232】

２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）−Ｎ−ベンジルアセトアミド二塩酸塩（化合物（Ｉ）・２ＨＣｌ）の調製
ＥｔＯＨ（１．０Ｌ）を２Ｌ容フラスコに仕込み、塩化アセチル（６２．５ｍＬ、３．０当量）をこのフラスコにゆっくりと添加し、４０分間攪拌した。得られた溶液を、化合物（Ｉ）（１００ｇ）に３０分間かけて添加し、この間、３０℃の温度を維持した。溶液を２７０ｇの質量まで濃縮した。この濃縮溶液を酢酸エチル（２Ｌ）に、高速攪拌しながら２０分間かけて添加した。混合物を一晩攪拌し、次いで窒素下で濾過すると、黄褐色固形物（７３．５ｇ）とより暗色の固形物（４２．２ｇ）の２種類の相違する固形生成物が得られた。これらの固形物をドライブレンドすると、９９％の総収率が得られた。ＨＰＬＣ解析により９９．０％純度（ＡＵＣ）が示された。

【0233】

解析により、２５３０ｐｐｍのエタノール、４８，１１０ｐｐｍの酢酸エチル、１７０ｐｐｍの塩化エチルが存在していることが示され、ヘプタンおよびアニソールは検出されなかった。パラジウム含有量を３回アッセイすると、２９ｐｐｍ、２ｐｐｍ、および１ｐｐｍ未満と測定された。

【0234】

化合物（Ｉ）・２ＨＣｌの晶出試験
以下の表に示した実験は、化合物（Ｉ）・２ＨＣｌの種々の晶出条件および析出条件を検討するために行なった。

【0235】

【表5-1】

【0236】

【表5-2】

析出は、化合物（Ｉ）・２ＨＣｌのエタノール濃縮溶液を大容量の高速攪拌酢酸エチルに逆添加することによって行なった。この析出手順は、デモンストレーションバッチで実施し、２種類の相違する型の固形物の形成がもたらされた。この２種類の相違する型の固形物を物理的に分離し、個々に濾過した。濃密性が低い方の黄褐色固形物（ロット０２ＢＰ１１１Ｅ、７４ｇ，ＨＰＬＣにより９９．１％ＡＵＣ）を最初に濾過した後、濃密性が高い方のより暗色の固形物（ロット０２ＢＰ１１１Ｆ、４３ｇ，ＨＰＬＣにより９９．１％ＡＵＣ）を濾過した。真空炉内で乾燥後、この２種類の固形物をブレンドする前に、各々の試料を解析用に確保した。この２つの試料のＨＰＬＣデータは同等であったが、ＤＳＣおよびＸＲＰＤは異なっていた。

【0237】

両方のＨＰＬＣ調製物とも、純度は９９．０％より高く（面積％による）、ロット０２ＢＰ１１１Ｅ試料では、およそ１９８℃で単一の吸熱事象が示されたが、ロット０２ＢＰ１１１Ｆ試料では、１１７℃および１８９℃で２つの吸熱事象が示された。また、２つの試料のＸＲＰＤデータも異なっており、ロット０２ＢＰ１１１Ｅ試料は結晶性のようであったが、ロット０２ＢＰ１１１Ｆ試料は非晶質のようであった。ＨＰＬＣデータ、ＸＲＰＤデータおよびＤＳＣデータにより、２つの試料が同じ物質の異なる形態であることが裏付けられる。

【0238】

化合物（Ｉ）・２ＨＣｌの２つのロット（ロット０２ＢＰ１１１Ｅおよび０２ＢＰ１１１Ｆ）をドライブレンドし、化合物（Ｉ）・２ＨＣｌの新たなロット（ロット０２ＢＰ１１１Ｇ）を得た。化合物（Ｉ）・２ＨＣｌ（ロット０２ＢＰ１１１Ｇ）１７０ｐｐｍの塩化エチルを含んでいた。

【0239】

実施例４：２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）−Ｎ−ベンジルアセトアミドメシル酸塩（化合物（Ｉ）・ＭＳＡ）の調製
２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）アセトニトリル（６）の調製
丸底反応器１に、ナトリウムビス（トリメチルジシリル）アミド（ＴＨＦ中１．０Ｍ、２３．２Ｌ）を仕込み、溶液を≦−１０℃まで５２分間かけて冷却した。ガラス製カーボイに、窒素下で、化合物５（１４００ｇ，１重量）およびＴＨＦ（７．０Ｌ，無水、５容量））を仕込んだ。バッチを、窒素下で空気攪拌器で攪拌した。バッチは完全に溶解せず、濁った溶液であった。この化合物５の溶液を反応器１に、５Ｌ容滴下漏斗によって４１分間かけて添加した。アセトニトリル（９６５ｍＬ，無水、０．６９容量）のＴＨＦ（２．０Ｌ，無水、１．４３容量）溶液を調製し、反応器１に≦−１０℃で４８分間かけて、同じ滴下漏斗によって（少量の黄色固形物が反応器壁上に存在していた）添加した。≦−１０℃で４５分間熟成後、バッチから解析用に試料採取すると、化合物５は変換により０．０３％であった（仕様≦変換により１．５％）。試料採取から１時間２４分後、ブライン（１７．６Ｌ，１２．６容量）を反応器１に５２分間かけて添加し、不充分な攪拌バッチ（外観は乳濁液）を得た。珪藻土パッドを２４インチポリプロピレン製漏斗上に作製した（１０２６ｇのセライト５４５を３．３Ｌの水中でスラリー状態にし、濾液は廃棄）。パッドを介してバッチを吸引濾過し、反応器をＴＨＦ（１．７５Ｌ，１．２５容量）ですすぎ、すすぎ液をケークに移した。このケークを２回目の一部のＴＨＦ（１．７５Ｌ，１．２５容量）ですすぎ、総濾過時間は１時間１７分であった。濾液を反応器２に移すと、相分離が起こり、一晩放置した（バッチは窒素下で反応器内に保持した）。有機相（およそ３４．５Ｌ）を廃棄し、水相をトルエン（８．１Ｌ，５．８容量）で抽出し、１６分間攪拌し、１２分間かけて沈降させた。トルエン抽出を省略し、分離後、有機相に直接トルエンを単に添加することも可能である。水相（およそ１９Ｌ）を除去し、有機相を反応器２内で合わせて、硫酸マグネシウム（１４００ｇ，１重量、無水）で５５分間かけて乾燥させた。このバッチを、ガラス製カーボイ内にインラインフィルターを取り付けた２４インチポリプロピレン製漏斗を介して濾過した。バッチをアルゴンでガスシールし、濃縮状態のまま冷所（２〜８℃）で保存した。翌日、バッチを濃縮して残渣とし、トルエン（１１．８Ｌ，８．４容量）ですすぎ、次に、これを濃縮した（水浴５０±５℃）。トルエン添加の時点でバッチは橙色のスラリーであり、濃縮後もそのままであった。総濃縮時間は５時間３分であった。

【0240】

反応器３にＭＴＢＥ（１３．９Ｌ，９．９容量，ＡＣＳ）を仕込み、次いで、これを４５±５℃まで加熱した。ＭＴＢＥを廃棄し、およそ２ＬのＭＴＢＥを使用し、ガラス球のバッチを反応器３内にスラリー状にした。バッチを４５±５℃に維持しながら残留ＭＴＢＥを反応器３に添加し、次いで、バッチをこの温度範囲で３３分間熟成させた。次いで、バッチを４５±５℃に維持しながら、ｎ−ヘプタン（１０Ｌ，７．１容量，９９％）を反応器３に３９分間かけて添加した。熱源のスイッチを切り、バッチを、４時間５分かけて２５±５℃まで冷却し、この温度範囲で２７時間４分熟成させた。次いで、２４インチポリプロピレン製漏斗（ＰＴＦＥ布）を介してバッチを吸引濾過し、窒素下で被覆および吸引乾燥させた。総濾過時間は２０分間であった。この橙色のバッチ（正味湿潤重量１３２２ｇ）を４５±５℃に設定した真空炉内で定重量まで４８時間３分かけて乾燥させた。バッチを２つの８０オンス容琥珀色ガラスビン（閉鎖部の内側はＴｅｆｌｏｎ処理）に移し、アルゴンでガスシールした（１２１７ｇの６、理論量の８１％）。

【0241】

２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）酢酸メチル（７）の調製
２２Ｌ容反応器に、化合物６（９００ｇ，２．７８ｍｏｌ）およびメタノール（９．０Ｌ，１０容量，無水）を仕込んだ。硫酸（１１１５ｍＬ，発煙）を、この懸濁液に２時間１１分かけて添加すると、暗色溶液が得られた。最大温度は６５．５℃であった（目標＜６５℃）。硫酸（１５６５ｍＬ，１．７４容量，濃硫酸）を、このバッチに１時間４９分かけて添加し、次いで、バッチを１８分間かけて可視還流加熱した（７４℃）。バッチをこの温度に１６時間５７分維持した。この穏やかな可視還流によって非存在が認められたため、次いで、再度バッチを７９〜８０℃で２時間１５分かけて還流加熱した。バッチをこの温度（８０±５℃）に１０時間５７分維持し、次いで熱源のスイッチを切った。２６時間４分後、さらにメタノール（０．７５Ｌ，０．８容量，無水）を仕込み、失われた溶媒容量を補給した。２．５〜３．３Ｌの溶媒がエバポレーションによって失われたと推定された。還流から４２時間３１分後のＨＰＬＣ解析により、化合物６のレベルは変換により０．６％（仕様≦１．０％）であることが示された。反応器１および２のそれぞれに、塩化メチレン（４．８Ｌ，５．３容量）と炭酸水素ナトリウム溶液（４８Ｌ，５３．３容量，飽和）を仕込んだ。炭酸水素ナトリウム溶液を一晩２〜８℃で保存し、翌朝取り出した。２２Ｌ容反応器から半量のバッチを各反応器に、それぞれ、４７分間および４４分間かけて分割して添加した（バッチ温度は、それぞれ、１２〜１３および１４〜１５℃であった）。二酸化炭素の放出（ボルテックスで激しく）によってクエンチングを行なった。次いで、各反応器のバッチを２００Ｌ容反応器に移し、バッチを１６分間攪拌し、次いで２５分間かけて沈降させ、有機相を分離した。水相を２回分の塩化メチレン（５Ｌ，５．６容量および２．７Ｌ，３容量）で逐次抽出した。各抽出は、攪拌しながら１５分間かけて行ない、それぞれ、６分間および９分間かけて沈降させた。合わせた有機相を反応器３に移し、硫酸マグネシウム（９００ｇ，１重量，無水）で３５分間かけて乾燥させた。次いで、サメ皮膚布を装着し、インラインフィルター（１０ミクロン、Ｐａｌｌ Ｐ／Ｎ １２０７７）を取り付けた２４インチポリプロピレン製漏斗を介してバッチを吸引濾過した。濾液を回転式エバポレータ上で、合計２時間１８分間かけて４０±５℃（水浴温度）で濃縮した。５４分後、バッチは固化し、球状体が形成された。これを分解させ、濃縮を継続した。次いで、バッチ（微細な固形の脆性塊状物の混合物）をさらに摩砕し、ガラス球に戻し、濃縮を継続した。バッチを８０オンス容琥珀色のビン（蓋の内側はＴｅｆｌｏｎ処理）に移し、アルゴンでガスシールすると、化合物７が得られた（８７１ｇ，理論量の８８％）。

【0242】

２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）−Ｎ−ベンジルアセトアミド（化合物（Ｉ））の調製
２２Ｌ容反応器に、化合物７（６５０ｇ，１．８２ｍｏｌ）、アニソール（３．２５Ｌ、５容量，無水）およびベンジルアミン（６００ｍＬ，０．９２容量，３当量）を仕込んだ。バッチ（およそ１８℃）を１４２±５℃まで１時間４４分かけて加熱し、溶解は３０℃で起こった。バッチを１４２±５℃に６９時間３０分維持し、この時点で、ＨＰＬＣ解析により、化合物７は変換により０．９％（仕様≦変換により１．７％）であることが示された。バッチを４５〜５０℃まで５時間１２分かけて冷却した（冷却を補助するため、バッチがおよそ７２℃になったら、窒素流を多くした）。この温度範囲では、バッチの攪拌は不充分であり、混合すると、バッチ温度は５２℃まで上昇した。≦１５分の間、＞５０℃であった。最初に＜５０℃になったときに、バッチを２時間２分熟成させ、次いで、バッチ温度を４５〜５０℃に維持しながら、ｎ−ヘプタン（９．７５Ｌ，１５容量，９９％）をバッチに１時間５６分かけて添加した。次いで、加熱を中止し、バッチを２５℃まで１０時間３２分かけて冷却し、次いで、およそ２０℃まで２０分間かけて冷却した。バッチを≦２５℃に維持した総時間は、４時間５０分間（２時間４７分間はおよそ２０℃）であった。２４インチポリプロピレンフィルター漏斗（ＰＴＦＥ布を装着）を介してバッチを吸引濾過し、反応器をアニソール／ｎ−ヘプタン（１．３Ｌ，４：１）ですすぎ、すすぎ液をケークに移した。次いで、ケークを２回分のｎ−ヘプタン（１．３Ｌ，０．６５Ｌ）で逐次洗浄した。総濾過時間は３９分間であった。バッチ（正味湿潤重量１００４ｇのＫＸ２３９１）を３つのガラストレイに移し、５０℃に設定した真空炉内に入れ、定重量まで９６時間２６分かけて乾燥させた。

【0243】

２−（５−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ピリジン−２−イル）−Ｎ−ベンジルアセトアミドメシル酸塩（化合物（Ｉ）・ＭＳＡ）の調製
化合物（Ｉ）（５２０ｇ，１．２１ｍｏｌ）を、移送を容易にするためにアセトン（４１．６容量，８０容量，ＡＣＳ）を使用して反応器１に移した。バッチを５０±５℃まで３３分間かけて加熱し、溶解は３０℃で起こった。インラインフィルター（Ｐａｌｌ Ｐ／Ｎ １２０７７、１０ミクロン）を装着した移送ポンプによって、バッチを第２の反応器内に清澄化し、４６℃から５０±５℃まで再加熱した。メタンスルホン酸（１２１．４ｇ，１．０５当量，９９％超純粋）を、この薄黄色バッチに１２分間かけて添加し、次いで加熱を中止した。１４分後、白色固形物が観察され、その数は増加し、５９分後に白色懸濁液となった。バッチは、７時間５１分後に２５±５℃の範囲となり、さらに１９時間２１分間熟成させた（１０時間３０分間は≦２７℃）。２４インチポリプロピレンフィルター（ＰＴＦＥ布）を介してバッチを吸引濾過し、反応器をアセトン（２．０Ｌ，清澄化、ＡＣＳ）ですすぎ、すすぎ液をケークに移した。ケークをステンレス鋼製カバーで覆い、窒素流下で吸引乾燥した。総濾過時間は２１分間であった。バッチ（正味湿潤重量７６４ｇ）を３つのガラス製乾燥用トレイに移し、真空炉内で定重量まで、２５±５℃にて２１時間５４分間かけて乾燥させた（５６５ｇ，理論量の８９％）。解析用に試料を取り出し、バッチを真空下に２５±５℃で維持した。次いで、バッチを２つの８０オンス容琥珀色ガラス瓶（ポリプロピレン栓の内側はＴｅｆｌｏｎ処理）に移し、アルゴンでガスシールし、−１０〜−２０℃で保存した。

【0244】

実施例５：単回用量漸増（ＲＳＤ）および反復用量漸増（ＲＭＤ）試験のための用量決定
開始用量は、イヌおよびラットでの２８日間の毒性試験の結果に基づいて選択した。これらの試験において、イヌの方が敏感な種であることがわかった。最低毒性レベルは、経口強制投与による０．５ｍｇ／ｋｇ／用量ＢＩＤであった。このレベルでは、臨床徴候、体重の変化または肉眼による所見は観察されなかった。試験物関連かもしれないと考えられる唯一の所見は、アラニンアミノトランスフェラーゼの軽微ないし軽度の増加であった。多くの顕微鏡検査所見が、０．５ｍｇ／ｋｇ／用量ＢＩＤを与えた動物において認められたが、これらは、高用量群よりも重症度が低く、罹患した動物も少なく、なんら臨床徴候と関連していなかった。ＦＤＡの手引きに基づき、開始用量を、１平方メートルあたり齧歯類の１０％に対して重度に毒性である（ＳＴＤ１０）用量の１０分の１、すなわち２ｍｇとして計算した。

【0245】

ＲＳＤの部では３つの用量レベルを選択して化合物（Ｉ）の単回用量経口薬物動態を調べ、試験のＲＭＤの部での投与スケジュールを支持または精緻化した。試験のＲＳＤの部で選択した化合物（Ｉ）用量レベルは、２、５および１０ｍｇ（遊離塩基当量）であり、経口溶液として投与する。

【0246】

ＲＭＤの部での用量レベルは、迅速かつ注意深く化合物（Ｉ）の最大耐用量に達するように選択した。高用量レベルでの毒性を見越して、８０ｍｇ用量レベルの後は、用量を４０ｍｇずつ増加する。１日２回の投与を、イヌでの経口投与で観察された５〜８時間の半減期範囲によって補助する。試験のＲＭＤの部で選択した化合物（Ｉ）用量レベルは、２、５、１０、２０、４０、８０、１２０、１６０ｍｇまたはそれ以上（４０ｍｇずつ増加）であり、安全性と耐容性に応じて、経口溶液として１日２回投与する。用量および投与頻度はともに、化合物（Ｉ）の単回用量薬物動態および安全性に応じて変更してもよい。

【0247】

実施例６：単回用量漸増（ＲＳＤ）および反復用量漸増（ＲＭＤ）試験
化合物（Ｉ）の単回用量薬物動態（ＰＫ）を調べるため、単回用量漸増（ＲＳＤ）試験を行なう。３例の患者の連続コホートを用量漸増コホートに登録する。登録された各患者に、単回経口投与で化合物（Ｉ）溶液を２、５または１０ｍｇで与え（投与前および投与後に少なくとも２時間の絶食が必要である）、少なくとも７日間観察する。毒性の発現（以下に定義）がなければ、患者は、試験のＲＭＤの部で、化合物（Ｉ）の１日２回投与のスケジュールを２サイクル続ける。

【0248】

多数の悪性腫瘍を有する患者に反復経口溶液として投与したときの化合物（Ｉ）の最大耐用量（ＭＴＤ）を調べるため、反復用量漸増試験を行なう。試験のＲＭＤの部の実施は以下のとおりである。

【0249】

第１サイクル
３例の患者の連続コホートに、化合物（Ｉ）を経口溶液として２、５、１０、２０、４０、８０、１２０、１６０ｍｇまたはそれ以上（４０ｍｇずつ増加）で、１日２回（約１０時間あける；投与前および投与後に少なくとも２時間の絶食が必要である）２１日間与え、長期ＰＫ試料採取の都合で第２２日の午前中に、さらなる用量を与える。第１サイクルのみ、２２日の投与期間を有する。その後のサイクルはすべて、２１日の投与期間を有する。

【0250】

投与スケジュールは、現状のＰＫ所見および安全性の懸念に基づいて変更されることがあり得る。

【0251】

試験の第１部または第２部の際にコホート内で臨床的に有意なグレード２の毒性（以下に定義）が発生した場合、有害事象が明白に疾患の進行の結果である場合を除き、用量増大を減速させる。次の投与コホートの用量増分を少なくする。
３例の患者のうち１例が用量限界毒性（ＤＬＴ、以下に定義）を発現した場合、コホートを３例から６例の患者に拡大する。拡大したコホートの６例の患者のうち１例がＤＬＴを発現した場合、またはいずれも発現しなかった場合、用量増大を次のレベルに進める（セクション６．３．１参照）。拡大したコホートの３例または６例の患者のうち≧２例がＤＬＴを発現した場合、その用量レベルでの処置を中止する。３例の患者の別のコホートに、低減した用量を１日２回与える。このプロセスを、ＭＴＤが決定されるまで継続する。ＭＴＤは、６例の患者のうち１例以下がＤＬＴを発現する最高用量レベルと定義する。さらに１０例の患者にＭＴＤで投与し、化合物（Ｉ）の安全性薬物動態と生物学的効果をさらに充分に特性評価する。もしＤＬＴが生じた患者の数が＞３３％になったときは、投与を中止する。このレベルよりもごくわずかに少ない用量をＭＴＤとみなし、１０例のさらなる患者を、このレベルに登録する。

【0252】

第２サイクル
コホートの患者は、ＤＬＴなしで第１サイクルの洗い流し期間を終えたら、２１日の投与期間と７日間の洗い流しの第２サイクルに進める。２サイクルの投与後、化合物（Ｉ）に耐容性を有し、疾患が進行しなかった患者に、さらなるサイクルで化合物（Ｉ）を与える（２１日間投与および７日間休止）。

【0253】

毒性は、場合によっては、おそらく、または明確に治験処置に関連していることに原因を有する有害事象と定義する。

【0254】

用量限界毒性（ＤＬＴ）は、第１処置サイクル中に評価し、
・有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）バージョン３．０による≧グレード３の任意の非血液学的毒性。吐気、嘔吐、下痢および電解質平衡異常は、これらが、充分な支持的ケアにもかかわらず≧グレード３である場合のみ、ＤＬＴとみなす；
・グレード４の好中球減少の持続が≧５日間；
・熱性好中球減少（絶対好中球数［ＡＮＣ］＜１．０×１０９／Ｌおよび≧３８．５℃の発熱と定義）またはＡＮＣ＜１．０×ｌ０９／Ｌを伴うグレード＞３の感染の記録；
・グレード４の血小板減少または血小板輸血が必要とされる血小板減少；
・毒性による第２サイクルでの投与の＞１４日間の遅延と定義する。

【0255】

試験期間
上記の試験は、患者１例あたり、スクリーニングから始まってＲＳＤの終了およびＲＭＤ投与の最初の２サイクルまでの１４週間で最大１８日間の予定された来院日数を含む。試験のＲＭＤの部のみに登録されたコホートは、必要とされる来院日数が少ない。来院日数は、試験のエンドポイントの評価に使用される。２サイクルの投与で７つの用量レベルを評価し、試験は約１２ヶ月間続ける。ＲＭＤの最初の２サイクルの終了後、化合物（Ｉ）に耐容性を有し、疾患が進行しなかった患者には、さらなるサイクルの投与が許可される。

【0256】

試験のエンドポイント
試験のエンドポイントは以下に記載のようにして評価される。安全性は、有害事象ならびに検査評価（すなわち、血液検査、血清化学分析および尿検査）によって評価される。

【0257】

薬物動態学は、以下のようにして評価される。有効なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ生物学的解析法を使用し、化合物（Ｉ）の血漿レベルを解析する。尿を採取し、解析して排出と代謝の半定量的評価を得る。生物学的効果は、以下のようにして測定する。試料を採取して血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の血漿レベルを測定する。また、ホスホ−Ｓｒｃ Ｔｙｒ４１９のレベルおよび選択した基質のトランスリン酸化のレベルを、末梢血単核細胞および腫瘍生検材料において評価する。生検材料での生物学的効果の解析は、ＭＴＤの化合物（Ｉ）を受けた患者、および採取可能な腫瘍を有する患者のサブセットで行なう。安全性パラメータは、第１サイクルの最後に評価して用量増大を許容する。最初の２サイクルで収集した上記のすべてのパラメータを、試験のエンドポイントとして試験の最後に解析する。

【0258】

患者の選択
以下は、患者を試験に登録させるための組み入れ（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｔ）基準要件である。
１．書面のインフォームドコンセントに署名済
２．年齢１８歳より上の成人
３．転移性または切除不可能であり得、標準的な治癒手段または待機手段が存在しないか、またはもはや有効でない進行した充実性腫瘍またはリンパ腫が確認されている；脳処置部または眼内転移を有する患者もまた適格である
４．ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが０〜２
５．余命が少なくとも１４週間
６．絶対好中球数（ＡＮＣ）≧１．５×１０９／Ｌ、血小板数（ＰＬＴ）≧１００×１０９／Ｌまたはヘモグロビン（Ｈｇｂ）≧１０ｇ／Ｌによって示される充分な骨髄が保持されている
７．血清ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）≦２．５×正常値の上限（ＵＬＮ）によって示される充分な肝臓機能
８．充分な腎機能（血清クレアチニン≦１．５×ＵＬＮまたはクレアチニンクリアランスの計算値が＞６０ｍｌ／分）
９．腫瘍生検に同意した人について、該処置前の１週間以内は正常な凝固プロフィール（ＰＴ／ＩＮＲおよびａＰＴＴが施設内正常範囲内）
１０．好ましくは投与の第１日以前の１週間以内に行われるスクリーニング時、妊娠試験で陰性の女性（両方の卵巣摘出および／または子宮摘出を受けた患者に対しては適用不可能）
１１．投与の第１日以前の２８日間および最後の投与後６ヶ月間、性生活または避妊具の装着の自制に同意した患者
１２．ＭＴＤで投与を受ける採取可能な腫瘍を有するさらに１０例の被検体について、腫瘍生検に対する書面のインフォームドコンセントに署名済
以下は、試験参加からの患者の除外基準である。
１．以前の抗癌処置剤または治験薬に由来する重症度グレード１より高い未解決の毒性
２．治験薬または全身性抗癌剤を投与の第１日目の１４日までの間に受けているか、もしくは受けていた、または該薬剤を２８日間受けて排出半減期が未知である、または半減期が５０時間より長い
３．長期間放射線療法を、例えば胸骨、骨盤、肩甲骨、椎骨もしくは頭蓋に、≦４週間受けた、または試験薬物の開始前に、低用量の緩和放射線療法を四肢限定で＜１週間受けた、またはかかる治療法の副作用から回復していない
４．現在ホルモン剤（すなわち、エストロゲン避妊薬、ホルモン補充、抗エストロゲン）、抗血小板薬剤または抗凝固薬、例えばクーマディンを服用中（静脈内カテーテルの留置のために予防用量の抗凝固薬を受けている人を除く）
５．投与の第１日目の前の２週間または５半減期および試験時に、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４酵素の強力なインヒビターまたはインデューサを使用
６．妊娠中または授乳期
７．投与の第１日目より前の４週間以内に大きな手術
８．上部消化管に大きな手術、または炎症性腸疾患、吸収不良症候群または経口吸収の妨げとなり得る他の状態
９．終末器不全、癌以外の主要な慢性の疾病、または治験担当医の意見で、被検体を試験に参加させるのは望ましくないとされるか、もしくはプロトコルのコンプライアンスに適合し得ない任意の重度の合併症の徴候または症状
１０．狭心症、冠動脈疾患または脳血管障害の既往歴、薬物治療が必要とされる一過性の虚血性発作または不整脈
１１．Ｂ型またはＣ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、凝固障害、または溶血性の状態、例えば、鎌状赤血球貧血の証拠
試験手順
以下の手順を、予定された患者の来院日に行なう。

【0259】

インフォームドコンセントおよび病歴の記入
インフォームドコンセントおよび病歴の記入をスクリーニング時に行う。

【0260】

ＲＳＤ薬物動態学（ＰＫ）試料採取
血液試料を薬物動態解析用に：
第１日の０時間目（投与前）、ならびに投与後１、２、３、４、６、９、１１、２４（第２日）、４８（第３日）、９６時間目（第５日）および１６８時間目（第８日）に採取する（１２例の試料）。尿を薬物動態解析用に：第１日の０時間目（投与前）、０〜６時間、６〜１２時間、１２〜２４時間および２４〜４８時間に採取する（５例の試料）。

【0261】

血漿試料の採取および調製は、以下のとおりとする：血液試料（およそ２．０ｍＬ）を留置カテーテルから、または直接静脈穿刺によって、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ収集チューブ内（抗凝固薬として、ＥＤＴＡカリウム（Ｋ３）（サイズ約３ｍＬ）を入れている）に抜き取り、遠心分離まで氷上で維持する。採取から３０分以内に試料を遠心分離する（約２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間）。直ぐに、ポリプロピレン製トランスファーピペットを用いて血漿を回収し、この血漿を、ほぼ等容量（約４００マイクロリットル）で、プレラベルポリプロピレン製トランスポートチューブ内に２つに分ける。得られた血漿試料にキャップし、直ちに冷凍庫内（−７０℃に維持）に入れる。

【0262】

尿試料の採取および調製は、以下のとおりとする：尿を採尿バッグ内に、指定した各時間の間に採取する。採尿バッグは、採取期間が終了するまで約４℃（冷蔵または氷上）で保存する。採取後、各尿試料を振とうすることにより充分混合する。各採取時間の最後に容量を測定し、ＣＲＦに記録する。尿検査のため、約２ｍＬの尿アリコートをトランスファーピペットによって採取し、ディップスティックによって試験する。ＰＫ測定のため、各採取物から約５ｍＬの尿アリコートを、２つのプレラベルポリプロピレン製トランスポートチューブのそれぞれに移す。採取した尿試料にキャップし、直ちに冷凍庫内（−７０℃に維持）に入れる。

【0263】

ＲＭＤ薬物動態学的試料採取
血液試料を薬物動態解析用に採取する（上記のようにして）：
第１サイクル（２、５および１０ｍｇで投与した患者からは２０例の試料を採取；＞１０ｍｇで投与した患者からは２５例の試料を採取）：第１日の０時間目（最初の午前中の投与前）、および１、２、３、４、６、１０（午後の投与前）、１１時間目（午後の投与の１時間後）；第２日の０時間目（午前中の投与前）、１時間後；第３日の０時間目（午前中の投与前）、１時間後；第８日の０時間目（午前中の投与前）、１時間後；第１５日の０時間目（午前中の投与前）、１時間後；第２２日の０時間目（午前中の投与前、すなわち最後の投与）、および１、２、３、４、６、９、１１、２４時間目（第２３日）、ならびに４８時間目（第２４日）。

【0264】

ＲＳＤを受けた最初の３つのコホート（すなわち、２、５または１０ｍｇ）の患者からは、第１日目に以下のとおり：第１日の０時間目（午前中の投与前）、および１１時間（午後の投与の１時間後）にＰＫ試料採取を行なう。

【0265】

第２サイクル（５例の試料）：第２９日の０時間目（午前中の投与前）；第３６日の０時間目（午前中の投与前）；第４３日の０時間目（午前中の投与前）；第５０日；ならびに第５７日。さらなる投与に耐容性であり得、疾患が進行せず、最初の２サイクル後、投与サイクルの継続に選出された患者からは、後続の各サイクルで、投与開始の直前および投与終了時（最後の投与の２時間後）にＰＫ試料採取を行なう。

【0266】

生命徴候（ＲＳＤおよびＲＭＤ）
脈拍数、収縮期および拡張期の血圧、呼吸、ならびに体温を、スクリーニング時；ＲＳＤおよびＲＭＤ：第１日の０時間目（投与前）、投与の２時間後および８時間後；クリニックへの各来院日に測定する。

【0267】

脈拍数は、患者が安静な状態（座ったままで少なくとも５分間）で得、脈を３０秒間計測し、２倍し、心拍数／分で記録する。収縮期／拡張期の血圧は、血圧計を使用し、患者が安静な状態（背筋をまっすぐにして座ったまま少なくとも５分間）で測定する（毎回、同じアームを使用）。血圧は単位：ｍｍＨｇで記録する。呼吸は、患者が安静な状態（座ったままで少なくとも５分間）で得、呼吸回数を３０秒間計測し、２倍し、呼吸数／分で記録する。体温は、経口または耳式体温計を使用し、患者が安静な状態（背筋をまっすぐにして座ったまま少なくとも５分間）で得る。

【0268】

体重および身長
患者の体重（キログラム）と身長（インチ）は、スクリーニング時；ＲＭＤ：第１、２２、２９、５０および５７日目に得る。

【0269】

安全性の検査評価
血液検査、血清化学分析および尿検査のための血液を、スクリーニング時；ＲＳＤ：第２、３および８日目；ＲＭＤ：第２、３、８、１５、２２、２９、３６、４３、５０および５７日目に採取する。最初の２サイクル後のさらなるサイクル下の患者を、安全性について、後続の各サイクルで、投与開始直前および投与終了時に検査評価する。ＰＴ／ＩＮＲおよびａＰＴＴ用の血液を、該手順より前の１週間以内に腫瘍生検材を受けた患者において試験する。

【0270】

身体検査
精密な身体検査をスクリーニング時に行なう。変化があれば更新するための部分的身体検査を、ＲＳＤ：第１日目および第８日目；ＲＭＤ：第１、２２、２９、５０および５７日目に行う。

【0271】

ＥＣＧ試験
１２リード型ＥＣＧおよびｌｏｎｇ Ｌｅａｄ ＩＩを、スクリーニング時；ＲＳＤ：第１日目の投与１時間後および４時間後ならびに第８日目；ＲＭＤ：第１日目の投与１時間後および４時間後、ならびに第８、２２、５０および５７日目に行なう。ＲＳＤを受けた最初の３つのコホート（すなわち、２、５または１０ｍｇ）の患者は、ＲＭＤの部の第８、２２、５０および５７日目のみにＥＣＧを行なう。

【0272】

妊娠試験
血清妊娠試験用の血液を、スクリーニング時に女性患者から、好ましくは投与の第１日目より前の１週間以内に採取する（両方の卵巣摘出および／または子宮摘出を受けた患者に対しては適用不可能）。

【0273】

有害事象
有害事象は、試験全体を通してモニターする。各来院日に、治験担当医は、各患者に「前回の来院日以来、気分は如何ですか？」などの一般的な非指示的な質問を行なうことにより、有害事象についての質問を開始する。指示的な質問および検査は、適宜行なう。

【0274】

併用薬物適用
各来院日に、処方箋または店頭販売品の併用薬物適用の使用があれば、それを、該薬物適用が行われた理由とともに記録する。

【0275】

生物学的効果の評価
血液を、血漿中のＶＥＧＦの測定のために採取する；Ｓｒｃおよび選択した基質のリン酸化を、ＲＭＤの第１、２２および５０日目にＰＢＭＣにおいて評価する。

【0276】

生検の基準を満たす患者に対し、投与前生検を、投与の第１日目より前の４週間以内に行ない、投与後生検を第−２０日目〜第２２日目に行なう。生検のときと同時に、生物学的効果の測定用に血液を採取する。また、生物学的効果の解析用に、血液を第５０日に採取する。

【0277】

併用療法
患者は、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４または凝固の強力なインヒビターまたはインデューサの慢性的併用薬物適用の使用はいずれも許可されない。例えば、以下のＣＹＰ３Ａ４モジュレーターの全身性使用は、投与の第１日目より前の１４日以内または５半減期（いずれか長い方）および試験全体を通して禁止される。

【0278】

ＣＹＰ３Ａ４インデューサ：バルビツレート、カルバマゼピン、エファビレンツ、グルココルチコイド、モダフィニル ネビラピン、フェノバルビタール、フェニトイン、リファンピン、セントジョーンズワート、トログリタゾン、オキシカルバゼピン、ピオグリタゾン、リファブチン
ＣＹＰ３Ａ４インヒビター：アミオダロン、アプレピタント、クロラムフェニコール、シメチジン、クラリスロマイシン、ジエチル−ジチオカルバメート、ジルチアゼム、エリスロマイシン、フルコナゾール、フルボキサミン、ゲストデン、グレープフルーツ果汁、イマチニブ、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミフェプリストン、ネファゾドン、ノルフロキサシン、ノルフルオキセチン、ミベフラジル、スターフルーツ、ベラパミル、ボリコナゾール
静脈内の斑またはカテーテルの開存性を維持するための控えめな抗凝固薬の使用は許可される。ホルモン剤（すなわち、エストロゲン避妊薬、ホルモン補充、抗エストロゲン）の併用的使用は禁止される（下記参照、洗い流し期間）。

【0279】

洗い流し期間
ＲＳＤにて単回用量投与後、洗い流しまたは観察期間を少なくとも７日間設ける。ＲＭＤの部の第１サイクル後の洗い流し期間は６日間である。他のサイクルはすべて、２つの連続するサイクル間に７日間の洗い流し期間を有する。

【0280】

処置コンプライアンス
プロトコル指定の基準から大きく外れ、不注意で登録されたことがわかった患者は、試験を中止する。患者を、投与スケジュールに対する忠実性について評価する。彼らには、自宅で投与を進め、試験日程を終了するよう指示する。予定された毎週の来院日に、患者に、この日程表を、すべての使用および未使用の投与瓶とともに当該外来診療所（１つまたは複数）に持参させる。これらを、患者に試験薬物の新たな供給が不要となるまで、診療所の担当者が点検する。治験担当医は、各再来院日に患者に、前回の来院日数以降、何らかの併用薬物適用を行なったかどうかを尋ね、かかる使用がプロトコル違反かどうかを判定し、データおよび結論を記録する。

【0281】

試験薬物適用
化合物（Ｉ）は、この試験において、遊離塩基Ｎ−ベンジル−２−｛５−［４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−フェニル］−ピリジン−２−イル｝−アセトアミドのメシル酸塩として提供する。治験用量は、溶液中の遊離塩基の重量として計算する。化合物（Ｉ）メシル酸塩は白色の結晶性の粉末であり、実験式はＣ_２６Ｈ_２９Ｎ_３Ｏ_３・ＨＯ_３ＳＣＨ_３および分子量は５２７．６３ダルトンである。遊離塩基の分子量は４３１．５３ダルトンである。

【0282】

化合物（Ｉ）メシル酸塩粉末を、コホート毎に、用量：２、５、１０、２０、４０、８０、１２０、１６０ｍｇまたはそれ以上（遊離塩基当量）に対応する異なる量の試験薬物が入った単位用量瓶で与える。また、安全性に関して修正した用量レベルも単位用量瓶として調製し、外来診療所（１つまたは複数）に届ける。溶解させると、得られる化合物（Ｉ）メシル酸塩溶液は透明になり、患者に対して、単位用量瓶にて、０．２〜４．０ｍｇ／ｍＬ（遊離塩基当量）の範囲の濃度で施薬する。

【0283】

投薬量および投薬レジメン
化合物（Ｉ）メシル酸塩は、患者の用量コホートに従って、すなわち、ＲＳＤ：２、５または１０ｍｇ；ＲＭＤ：２、５、１０、２０、４０、８０、１２０、１６０ｍｇ（遊離塩基当量）またはそれ以上（４０ｍｇずつ増加）で経口投与する。ＲＭＤの部では、化合物（Ｉ）を１日２回（約１０時間空ける、少なくとも２時間の絶食後に投与した後、２時間の絶食）で２１日間投与した後、サイクル毎に７日間の洗い流しを行なう。唯一の例外は第１サイクルであり、この場合では、長期ＰＫ試料採取を容易にするために、さらなる用量を第２２日目に投与する。このサイクルでは、洗い流しは６日間である。試験薬物に耐容性を有し、疾患が進行しなかった患者は、最初の２回のＲＭＤサイクル後のさらなるサイクルの投与を受ける患者に選出され得る。

【0284】

一定容量の滅菌水を化合物（Ｉ）メシル酸塩の単位用量瓶に添加し、透明な液が得られるまでよく振る（およそ１０回反転させる）。

【0285】

【表6】

少なくとも２時間の絶食後に化合物（Ｉ）を摂取する。水の摂取はいつでも可能とする。現場管理下、初回用量の投与では、患者が自身で単位用量瓶の全量を投与する。２０ｍＬアリコートの滅菌水を瓶に入れて濯ぎ、内容物を初回用量の残部として経口摂取する。このプロセスを繰り返す。その後２時間まで食事をとらない。

【0286】

ＲＭＤでは、７日間分の化合物（Ｉ）溶液の供給物を調製し、現場薬局で患者に分配する。患者は、使用済みの瓶を戻すために第８、１５、２２、３６、４３および５０日目に毎週戻る。第８、１５、３６および４３日目、患者は、新たな７日分の供給物を得る。

【0287】

用量の修正
用量増加の遅延
グレード２の毒性が生じたら、用量増大を遅らせてもよい。次の用量レベルコホートは、以下のとおりに増分を少なくする。

【0288】

【表7】

増大用量レベルでグレード２以下またはグレード２より高い毒性が生じた場合、最初の用量増大スケジュールを再使用してもよい。

【0289】

ＤＬＴでの用量修正
コホート内の３例または６例の患者のうち≧２例にＤＬＴが生じた場合、用量増大を止める。次のコホートにおける低減用量でのさらなる投与は、以下のとおりとする。

【0290】

【表8】

薬物動態学的解析
ノンコンパートメント薬物動態解析を、個々の血漿化合物（Ｉ）濃度−時間データに対して、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ バージョン４．１）または他の適当なソフトウェアを用いて行なう。個々の患者のデータを解析することができない場合は、平均血漿化合物（Ｉ）濃度−時間データを使用し、薬物動態パラメータを計算する。以下の薬物動態パラメータ：Ｃｍａｘ（最大血清濃度）、ｔｍａｘ（最大濃度に達するまでの時間）、ＡＵＣ_Ｔ（時間点ゼロから最後の測定可能濃度（ＣＴ）である時間点Ｔまでの濃度−時間曲線下面積、ＡＵＣ_０〜∞（時間点ゼロから無限大までの濃度−時間曲線下面積）、ｔ_１／２（末期半減期）、Ａｅ（尿中に排出された薬物の量）を血漿濃度から計算する。薬物動態データの説明および解釈に適切とみなされるさらなるパラメータを、試験薬物動態学者の裁量で測定する。

【0291】

生物学的効果の評価
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の血漿レベルは、ＥＬＩＳＡによって測定する。ホスホ−Ｓｒｃ Ｔｙｒ４１９および選択した基質のトランスリン酸化のレベルは、末梢血単核細胞において測定する。ＭＴＤでの処置の前と後に腫瘍生検を行なう目的は、腫瘍増殖に関与している可能性があるＳｒｃキナーゼのリン酸化の阻害における化合物（Ｉ）の生物学的効果を調べることである。対比較生検を、ＭＴＤの拡大コホートの１０例の患者において行なう。組織を半分に分け、一方の部分は常套的な病理検査によって評価し、他方の半分は、ホスホ−Ｓｒｃ Ｔｙｒ４１９および選択した基質のトランスリン酸化のレベルについて評価する。

【0292】

疾患進行の評価
測定可能な疾患について、腫瘍の応答を、ＲＥＣＩＳＴ基準に従って評価する（Ｔｈｅｒａｓｓｅ，Ｐ．ら、Ｎｅｗ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｔｏ Ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ Ｎａｔ Ｃａｎ Ｉｎｓｔ．２０００，９２（３），ｐ．２０５−２１６）。測定値は、ベースラインおよびその後、隔サイクル（２サイクル）毎に取得する。全応答患者（完全応答群および一部応答群）では、応答が、ベースライン測定と同じ測定方法を用いて応答の最初の記録の４週間後に確認されたはずであった。測定不可能な疾患を有する患者では、応答は、臨床的に表示されるとおりに評価する（腫瘍マーカー、Ｘ線撮影による測定、超音波など）。骨転移が疾患部位のみである場合、ＷＨＯの骨における疾患応答評価基準（Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ Ｂｏｎｅ）を用いて応答を評価する。他の測定不可能な疾患の進行は、毎月の測定で２回連続して腫瘍マーカーが２５％上昇、または有意なＸ線撮影による疾患の進行と定義する。腫瘍の応答の再評価は、ベースライン腫瘍測定値の確立に使用した同じ方法で行なう。腫瘍の応答の評価は、以下のとおりとする。

【0293】

対象病変
・完全応答（ＣＲ）：すべての対象病変の消失
・一部応答（ＰＲ）：ベースラインの最も長い直径（ＬＤ）の和を参照としたとき、対象病変のＬＤの和の少なくとも３０％の減少
・進行性疾患：処置開始以降に記録された最も小さいＬＤの和を参照としたとき、対象病変のＬＤの和の少なくとも２０％の増加、または１つ以上の新たな病変の出現
・安定な疾患：処置開始以降で最も小さいＬＤの和を参照としたとき、一部応答とみなすのに充分な減少もなく、進行性疾患とみなすのに充分な増加もない
非対象病変
・完全応答：すべての非対象病変の消失
・不完全応答／安定な疾患：１つ以上の非対象病変の持続
・進行性疾患：１つ以上の新たな病変の出現または既に存在している非対象病変の明確な進行または両方
非対象病変のみの明白な進行は例外とする。しかしながら、治験担当医が、非対象病変のみの進行が起こったと考えた場合、この進行を、４週間後に確証的ＣＴスキャンによって検証する。腫瘍の応答≧ＰＲは、ベースライン評価と同じ測定方法を用いて、４週間後に確認される。

【0294】

対象および非対象病変における腫瘍の応答の考えられ得るすべての組合せについて、全般的な臨床応答を下記の表に従って調べる。

【0295】

【表9】

実施例７：細胞増殖阻害
対照試料と比べて正味の細胞増殖を５０％ブロックするのに必要とされる薬物濃度をＧＩ_５０として測定する。化合物（Ｉ）のＧＩ_５０を本明細書に記載のようにしてアッセイした。

【0296】

ＨＴ２９細胞株は、ＮＣＩ標準ヒト結腸癌腫細胞株である。ＨＴ−２９細胞を、ＡＴＣＣから１２５回継代時のものを入手し、１２６〜１５１回継代時のものを阻害試験に使用した。ＨＴ２９細胞を、ウシ胎仔血清（１．５％ｖ／ｖ）およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補給したＭｃＣｏｙ ５Ａ培地中で常套的に培養した。

【0297】

ｃ−Ｓｒｃ ３Ｔ３は、ヒトｃ−Ｓｒｃの点変異型（チロシン５２７がフェニルアラニンに変換されている）でトランスフェクトされたマウス線維芽細胞ＮＩＨ ３Ｔ３正常細胞株である。この変異により、チロシン５２７におけるリン酸化によって、自身のＳＨ２ドメインにおいてフォールディングによって元に戻ることによりＳｒｃの自己阻害がもたらされるため、「構成的に活性な」ｃ−Ｓｒｃがもたらされる。ここにＰｈｅが存在すると、このリン酸化は起こり得ず、したがって自己阻害は起こり得ない。したがって、常に充分に活性な変異型Ｓｒｃは、次いで、正常なマウス線維芽細胞を急速増殖性の腫瘍細胞に変換させる。過剰反応性のＳｒｃは、このような細胞の増殖を駆動するの主要な因子であるため（特に、低血清増殖条件下で培養した場合）、この増殖のブロックに活性な化合物は、Ｓｒｃシグナル伝達をブロックするすることにより奏功すると考えられる（例えば、直接的なＳｒｃキナーゼインヒビターとして、またはＳｒｃシグナル伝達カスケード内のどこか他の個所で作用するインヒビターとして）。細胞は、ウシ胎仔血清（２．０％ｖ／Ｖ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）およびピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）を補給したＤＭＥＭ中で常套的に培養した。

【0298】

細胞増殖阻害のＢｒｄＵアッセイにおいて、細胞増殖の定量は、ＤＮＡ合成中のＢｒｄＵ取込みの測定に基づいて行なった。Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ＢｒｄＵアッセイキット（比色分析用）をＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅから入手し、供給元の使用説明書のとおりに実施した。

【0299】

増殖阻害をＧＩ_５０で示した。ここで、ＧＩ_５０は細胞増殖の５０％が阻害される試料の用量である。増殖阻害（ＧＩ）は、式ＧＩ＝（Ｔ_０−Ｔ_ｎ×１００／Ｔ_０−ＣＯＮ_ｎ）から求められ、式中、Ｔ_０は、時間点「０」における未処理細胞でのＢｒｄＵ増加であり、Ｔ_ｎは、第「ｎ」日目における処理細胞でのＢｒｄＵ増加であり、ＣＯＮ_ｎは、第「ｎ」日目における対照細胞の対象ＢｒｄＵ増加である。ＧＩ_５０を外挿し、ＸＬ−Ｆｉｔ ４．０ソフトウェアを用いてデータをプロットした。

【0300】

活発に増殖中の培養物をトリプシン処理し、細胞を、９６ウェル培養プレートの各ウェル内で、１．０５％ＦＢＳを補給した１９０μＬの適切な培養培地中に再懸濁させた（１０００個のＨＴ−２９細胞；２５００個のｃ−Ｓｒｃ ３Ｔ３細胞）。９６ウェル培養プレート実験では、ｃ−Ｓｒｃ ３Ｔ３培地に１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーを補給した。ＨＴ−２９細胞を標準的な組織培養９６ウェルプレートに播種し、ｃ−Ｓｒｃ ３Ｔ３細胞は、ポリ−Ｄ−リシンでコートした９６ウェルプレート（ＢＩＯＣＯＡＴ^ＴＭ）に播種した。ＣＯ_２拡散を増大させるため、ｃ−Ｓｒｃ ３Ｔ３の９６ウェルプレートは、滅菌ラバーキャップの使用により蓋を約２ｍｍ上げてインキュベートした。

【0301】

播種した９６ウェルプレートを、一晩１８〜２４時間、ＨＴ−２９では３７℃および５％ＣＯ_２、またはｃ−Ｓｒｃ ３Ｔ３では３７℃でおよび１０％ＣＯ_２のいずれかで付着を行なわせた。播種のほぼ１８〜２４時間後、初期細胞増殖（Ｔ_０）を、未処理細胞でＢｒｄＵアッセイを用いて調べた。試料をＤＭＳＯ中２０ｍＭで再構成し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて中間希釈物を作製した。最終アッセイ濃度は、ＦＢＳでは１．５％、ＤＭＳＯでは０．０５％とした。試料を１０μＬアリコートとして３連で添加し、プレートを上記のようにして約７２時間インキュベートした。陰性（ビヒクル）および陽性対照（例えば、ＡＺ２８（ＫＸ２−３２８））を含めた。プレートをＢｒｄＵについてアッセイし、データを、ＧＩ_５０について上記のようにして解析した。

【0302】

結果を下記の表に示す。この表では、データを対照と比べた増殖％で示しているため、表示濃度の数値が小さいほど、該腫瘍細胞株の増殖のブロックにおける該化合物の効力が大きいことを示す。化合物はすべて、まず２０ｍＭのＤＭＳＯストック溶液として調製し、次いで、バッファー中でインビトロ腫瘍増殖アッセイ用に希釈した。ＮＧは、対照を超える細胞増殖がないことを意味し、Ｔは、薬物処理ウェル内の細胞の数が対照のものより少なかったこと（すなわち、正味細胞減少）を意味する。ＮＴは、試験を行なわなかったことを示す。化合物ＡＺ２８（ＫＸ２−３２８）は、Ｐｌｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，４７：８７１−８８７（２００４）に記載のＡＴＰ競合的チロシンキナーゼインヒビターである。

【0303】

下記の表に示すように、ＧＩ_５０は、他の細胞株における化合物（Ｉ）について得た。これらのＧＩ５０は、上記のＨＴ２９細胞株で詳細に記載したものと同様の標準的な腫瘍増殖阻害アッセイ、ならびに以下の細胞株：結腸腫瘍細胞株ＫＭ１２、肺癌細胞株Ｈ４６０および肺癌細胞株Ａ５４９（すべてＮＣＩ標準腫瘍細胞株）を用いて測定した。

【0304】

【表10】

下記の表は、Ｓｒｃ駆動型腫瘍細胞増殖の化合物（Ｉ）による阻害を、現在臨床試験中のＡＴＰ競合的Ｓｒｃインヒビターとの比較において示す。

【0305】

【表11】

下記の表は、脳腫瘍細胞株での化合物（Ｉ）による阻害を示す。これらのＧＩ_５０は、この実施例７で詳細に記載したものと同様の標準的な腫瘍増殖阻害アッセイを用いて測定した。

【0306】

【表12】

下記の表は、
腎臓腫瘍細胞株における化合物（Ｉ）による阻害を示す。
これらのＧＩ_５０は、本実施例のセクションで詳細に記載したものと同様の標準的な腫瘍増殖阻害アッセイを用いて測定した。

【0307】

【表13】

下記の表は、５種類の肝細胞癌細胞株における化合物（Ｉ）による阻害の結果のまとめを示す。下記の表に、肝細胞癌細胞株（８．０×１０３細胞／ウェル，１．５％ＦＢＳ）（７８時間目）の化合物（Ｉ）のメシル酸塩とダサチニブのＩＣ_５０およびＩＣ_８０を示す；標準化した応答データの結果：

【0308】

【表14】

試験化合物の試料を１００％ＤＭＳＯ中にて製剤化し、２０ｍＭストック溶液を得た；４℃で保存。ＩＣ_５０およびＩＣ_８０を、下記のようにして測定した。Ｈｕｈ７、ＷＲＬ−６８、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｈｅｐ ３Ｂ、およびＨｅｐ Ｇ２ヒトの癌細胞株を常套的に培養し、２％ＦＢＳを含有する基礎培地中に３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。細胞を、９６ウェルプレートのウェル１つあたり４．０×１０^３／１９０μｌおよび８．０×１０^３／１９０μｌで播種した。アッセイ培地は基礎培地／１．５％ＦＢＳとした。細胞を一晩９６ウェルプレート内で、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した後、化合物（Ｉ）のメシル酸塩（化合物（Ｉ）・ＭＳＡ）およびダサチニブを添加した。試験物の希釈液を以下のようにして調製した：２０ｍＭストック溶液試料を基礎培地／１．５％ＦＢＳ中で、１：３ 希釈度を用いて連続希釈し、２０×濃度；１３１μＭ〜０．２４ｎＭの範囲を得た。１０μＬの２０×希釈液を１９０μＬの癌細胞株を入れた適切なウェル（ｎ＝３）に添加した；６５６１ｎＭ〜０．０１２ｎＭの範囲の終濃度。ビヒクル対照は、細胞を含み、試料なしのものとした。培地対照は、細胞を含み、試料なしで、０．０３％のＤＭＳＯ（試料中に存在させる最高ＤＭＳＯ濃度）を含むものとした。処理細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。第３日目、１０μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。細胞をＭＴＴの存在下、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。９０μＬの１０％ＳＤＳ（＋ＨＣ１）を各ウェルに添加して細胞を溶解し、ホルマザンを可溶化させた。次いで、細胞を３７°、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴマルチプラットフォーム・マイクロプレート・リーダーを使用し、ＯＤ_５７Ｏの測定を行なった。増殖阻害曲線のＩＣ_５０およびＩＣ_８０は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５統計ソフトウェアを用いて測定した。

【0309】

実施例８：単離型キナーゼの阻害
細胞外部と細胞内部とでは、Ｓｒｃのコンホメーションは、細胞内部ではＳｒｃが多タンパク質シグナル伝達複合体内に包埋されているため、著しく異なると考えられる。したがって、単離型Ｓｒｃではペプチド基質結合部位が充分形成されていないため（Ｓｒｃのｘ線構造によって示される）、ペプチド基質結合インヒビターの単離型Ｓｒｃに対する活性は弱いであろうと考えられる。この部位に対する結合には、孤立型酵素アッセイにおいて、該インヒビターが、細胞内部に存在するものと同じコンホメーションである非常に少数割合の全Ｓｒｃタンパク質を捕捉することが必要とされる。これには、アッセイにおいて触媒サイクルから相当な量の酵素を排出するための大過剰の該インヒビターが必要とされる。

【0310】

しかしながら、細胞内部では、ＳＨ２およびＳＨ３ドメイン結合タンパク質が、既に、Ｓｒｃコンホメーションにシフトしており、そのため、ペプチド基質結合部位が充分に形成されるため、このような大過剰のインヒビターは必要とされない。そこで、すべての酵素が強力結合性コンホメーションであるため、低濃度でのインヒビターによって酵素が触媒サイクルから除去され得る。

【0311】

ＫＸ２−３２８は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ社によって公表されたＡＴＰ競合性Ｓｒｃインヒビター（ＡＺ２８）であり、これは、本明細書に記載の多くの実験で陽性対照として使用している。ＫＸ２−３２８は構造：

【0312】

【化15】

を有する化合物である。化合物（Ｉ）は、細胞外部ではペプチド結合部位が充分に形成されていないが、細胞全体の内部では非常に強力な活性を有するため、孤立型キナーゼに対しては弱い活性を有することに注意のこと。理論に拘束されることを望まないが、この活性の違いは、多タンパク質シグナル伝達複合体では孤立型キナーゼアッセイと比べて、結合タンパク質パートナーのアロステリック効果のため、細胞でペプチド結合部位が充分に形成されることによるものと考えられる。

【0313】

下記の表に、対照（未処理）孤立型キナーゼに対するＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＡＴＰ競合性インヒビター（ＫＸ２−３２８、ＡＺ２８）または化合物（Ｉ）の存在下での孤立型キナーゼの活性割合を示す。

【0314】

【表15】

ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＡＴＰ競合的インヒビターは、Ａｂｌ、ＥＧＦＲＴＫ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＬｙｎおよびＹｅｓの強力な阻害によって示されるように、ＡＴＰ競合性インヒビターに対して典型的なオフターゲットキナーゼ阻害活性、不充分な選択性を示す。対照的に、化合物（Ｉ）では、このようなオフターゲットキナーゼの不充分な阻害が見られる。

【0315】

しかしながら、化合物（Ｉ）は、上記の実施例に記載のようにしてアッセイすると、Ｓｒｃ駆動型細胞増殖に対してより強力なインヒビターである。ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３操作細胞株では、ＡＺ２８のＧＩ_５０が９９ｎＭであるのに対して化合物（Ｉ）では１３ｎｍであり、ＮＣＩヒト結腸癌細胞株ＨＴ２９では、ＡＺ２８のＧＩ_５０が７９４ｎＭであるのに対して化合物（Ｉ）では２３ｎｍである。

【0316】

別の実施例では、滴定データにより、ＡＺ２８が単離型Ｓｒｃの強力なインヒビターであることが示されている（ＩＣ_５０＝８ｎＭ）。ＦＡＫでの滴定データは、ＡＺ２８が、単離型ＦＡＫに対して効力が少なくとも約１００倍低いことを示す（ＩＣ５０＞５００ｎＭ）。一方、滴定データは、化合物（Ｉ）が単離型Ｓｒｃに対して効力が低いインヒビターであることを示す（ＩＣ５０＝４６μＭ）。ＦＡＫでの滴定データでは、化合物（Ｉ）が単離型ＦＡＫに対して同様に強力であることが示される（ＩＣ_５０＞４８μＭ）。

【0317】

ＡＺ２８は、単離型Ｓｒｃよりも細胞増殖に対して１０〜１００倍効力が低いことに注意。これは、競合ＡＴＰの濃度が、孤立型酵素アッセイよりも細胞全体においての方がずっと高いため、ＡＴＰ競合的インヒビターに典型的である。化合物ＩはｃＳｒｃに対してＩＣ_５０＝４６ｍＭを示した。

【0318】

実施例９：細胞内リン酸化レベルに対する効果
ＨＴ２９（結腸癌）およびｃ−Ｓｒｃ５２７Ｆ／ＮＩＨ−３Ｔ３（Ｓｒｃ形質転換）細胞株を、化合物（Ｉ）またはＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのＡＴＰ競合的ＳｒｃインヒビターＡＺ２８で処理した。ＡＺ２８は、有効なＳｒｃインヒビターが、このようなアッセイにおいてどのような挙動を示すはずであるかを示す陽性比較物質として供される。化合物で処理後、細胞を溶解させ、ＰＡＧＥに供し、一連の抗体を用いてプローブ結合させた。抗体は、該化合物によって既知のＳｒｃ基質のリン酸化の変化が引き起こされるかどうかが判定されるように選択した。また、オフターゲットタンパク質のリン酸化も調べた。さらに、アポトーシスの誘導をカスパーゼ３切断によって評価した。薬物濃度の漸増に応答した傾向が最も信頼性のある活性のインジケータであるため、各化合物を複数用量で試験した。

【0319】

１×濃度での該２種類の各細胞株におけるこの化合物のＧＩ５０を使用し、化合物（Ｉ）の用量応答曲線を作成した。また、薬物なしの対照「Ｃ」に加えて、ＧＩ５０の０．２倍、５倍および２５倍の３つのさらなる用量も試験した。Ｓｒｃ−Ｙ４１６自己リン酸化について、図１の同じ倍数範囲の予測された用量応答が、両方の細胞株においておよび両方の化合物の場合で得られた。このデータは、化合物（Ｉ）が細胞内部でＳｒｃインヒビターであることを示す。

【0320】

図２は、細胞内の既知のＳｒｃトランスリン酸化基質であるＦＡＫ Ｔｙｒ ９２５のリン酸化を示す。化合物（Ｉ）およびＡＺ２８はＳｒｃトランスリン酸化を阻害した。このデータは、化合物（Ｉ）が細胞内部のＳｒｃインヒビターであることを示す。

【0321】

図３は、細胞内の既知のＳｒｃトランスリン酸化基質であるＳｈｃ Ｙ２３９／２４０のリン酸化を示す。化合物（Ｉ）およびＡＺ２８はＳｒｃ トランスリン酸化を阻害した。このデータは、化合物（Ｉ）が細胞内部のＳｒｃインヒビターであることを示す。

【0322】

図４は、細胞内の既知のＳｒｃトランスリン酸化基質であるパキシリンＹ−３１のリン酸化を示す。化合物（Ｉ）およびＡＺ２８はＳｒｃ トランスリン酸化を阻害した。このデータは、化合物（Ｉ）が細胞内部のＳｒｃインヒビターであることを示す。注：パキシリンＹ−３１は、薬物の添加ありでもなしでも、ＨＴ２９細胞において検出されなかった。

【0323】

カスパーゼ−３の切断は、アポトーシスの誘導の良好な尺度である。ＡＺ２８は、ＨＴ２９（結腸癌）およびｃ−Ｓｒｃ５２７Ｆ／ＮＩＨ−３Ｔ３（Ｓｒｃ形質転換）細胞株におけるアポトーシスの誘導に有効でないことがわかっている。対照的に、図５に示されるように、化合物（Ｉ）はアポトーシスの誘導に非常に有効である。

【0324】

Ｓｒｃ活性は、ＨＴ２９（結腸癌）細胞株およびｃ−Ｓｒｃ５２７Ｆ／ＮＩＨ−３Ｔ３（Ｓｒｃ形質転換）細胞株の両方において非常に高いため、Ｓｒｃ活性が阻害されると、総ホスホチロシンレベルの低下がみられることが予測され得る。図６は、このことが、ＡＺ２８と化合物（Ｉ）の両方に当てはまることを示す。このデータは、化合物（Ｉ）が細胞内部のＳｒｃインヒビターであることを示す。

【0325】

ＰＤＧＦ受容体型チロシンキナーゼは、Ｙ５７２／５７４に対して自己リン酸化する。これは、細胞内で直接的なＳｒｃ基質ではないと考えられる。ＡＺ２８は、単離型ＰＤＧＦ受容体型チロシンキナーゼの強力なインヒビターではないことがわかっている（実施例８の表参照）。それでもなお、図７に示されるように、ＡＺ２８では、ＰＤＧＦ受容体自己リン酸化の用量応答の低減がみられる。これは、その間接的な効果を示唆する。化合物（Ｉ）では、ある程度の効果はみられるが、いくぶん効力は低い。したがって、化合物（Ｉ）はＡＺ２８よりも、間接的ＰＤＧＦ自己リン酸化阻害に対する活性が低い。ＰＤＧＦ受容体型チロシンキナーゼＹ５７２／５７４は、薬物添加しなかった場合（薬物添加した場合も）ＨＴ２９細胞において検出されなかった。

【0326】

ＦＡＫ Ｙ３９７は、主にＦＡＫの自己リン酸化部位であり、不充分なわずかなＳｒｃのトランスリン酸化部位である。ＡＺ２８は、強力なＦＡＫインヒビターではない（実施例８の単独酵素のデータ参照）。それでもなお、ＡＺ２８によりｃ−Ｓｒｃ５２７Ｆ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＦＡＫ自己リン酸化のある程度の阻害が図８に示されている。しかしながら、化合物（Ｉ）では、ｃ−Ｓｒｃ５２７Ｆ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＦＡＫ自己リン酸化の阻害はみられない。ＮＣＩヒト結腸癌細胞株ＨＴ２９では反対のことがいえる。

【0327】

実施例８で示された単独酵素のデータにより、ＡＺ２８が強力なＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターであることが示された。このことと整合して、図９の腫瘍細胞データは、ＡＺ２８が、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ自己リン酸化を強力に阻害することを示す。この部位は、直接的なＳｒｃリン酸化部位ではない。また、図９の腫瘍細胞データは、化合物（Ｉ）のＥＧＦＲＴＫのオフターゲット自己リン酸化に対する活性が低いことを示す。

【0328】

自己リン酸化の阻害は、化合物（Ｉ）のＧＩ_５０と相関している。図１０Ａおよび１０Ｂは、ｃ−Ｓｒｃ５２７Ｆ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞およびＨＴ−２９細胞における、ＡＺ２８と比較したときの化合物（Ｉ）によるＳｒｃ自己リン酸化（Ｙ４１６）の阻害を示す。また、トランスリン酸化の阻害も化合物（Ｉ）のＧＩ_５０と相関している。図１０Ｃおよび１０Ｄは、ｃ−Ｓｒｃ５２７Ｆ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞およびＨＴ−２９細胞における、ＡＺ２８と比較したときの化合物（Ｉ）によるＳｈｃ Ｙ２３９／２４０のＳｒｃトランスリン酸化の阻害を示す。

【0329】

化合物（Ｉ）は、全細胞アッセイにおいて非常に高いプロテインチロシンキナーゼ選択性を示す。例えば、図１１は、ダサチニブとの比較において、プロテインチロシンキナーゼに対する化合物（Ｉ）の選択性を示す。

【0330】

実施例１０：
騒音性難聴の防御
チンチラ（Ｎ＝６）を騒音性難聴の試験に使用する。動物の聴力感度は、実験操作の前に、標準的な電気物理学的手法を用いて測定する。特に、聴力閾値は、標準的な実験手順に従い、下丘内に慢性的に埋め込んだ導出電極からの誘発電位によって測定される。動物に麻酔し、鼓胞を切開し、左と右の蝸牛を露出させる。蝸牛の鼓室階に至る正円窓を、薬物適用のためのアクセスポイントとして使用した。動物を化合物（Ｉ）またはＫＸ２−３２８（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ製の非ＡＴＰ競合的インヒビター、ＫＸ２−２３８）で処理し、ＤＭＳＯ含有１０００ｍＭ生理食塩水溶液中で乳化させ、これを一方の耳の正円窓に入れる。

【0331】

対照溶液である３ｍＭのＤＭＳＯ含有１０００ｍＭ生理食塩水溶液を他方の耳を正円窓に入れる。この溶液を正円窓に３０分間置き、次いで、鼓胞を閉鎖する。続いて、動物を４ｋＨｚ帯域の１０５ｄＢ ＳＰＬの騒音に４時間曝露する。騒音への曝露後、動物の聴力を第１日、第７日、および第２１日に試験し、誘発電位の閾値シフトを調べる。永続的な閾値シフトは第２１日であると評価される。

【0332】

実施例１１：シスプラチン誘導性難聴の防御
高レベルの騒音の影響と、シスプラチンまたはアミノグリコシド類などの耳毒性薬物の影響は、内耳において、いくつかの共通の特徴を共有している。第１に、騒音および／または該薬物は、蝸牛（内耳）内のフリーラジカル／抗酸化物質レベルを変化させる。フリーラジカルの増加は、感覚細胞のアポトーシス死の原因因子であることが示されている。モルモット（例えば、Ｎ＝７）を、シスプラチン誘導性難聴の試験に使用する。動物の聴力感度は、実験操作の前に、標準的な電気物理学的手法を用いて測定する。特に、聴力閾値は、標準的な実験手順に従い、下丘内に慢性的に埋め込んだ導出電極からの誘発電位によって測定される。動物に麻酔し、シスプラチンで処理する。続いて、動物の聴力を試験し、誘発電位の閾値シフトを調べる。

【0333】

実施例１２： 破骨細胞の形成に対する効果
破骨細胞の形成に対する化合物（Ｉ）の効果を調べるため、化合物を、脾臓細胞由来の破骨細胞前駆細胞に添加する。脾臓由来破骨細胞の生成のため、破骨細胞前駆細胞を含む脾臓細胞を、ラパマイシン、化合物（Ｉ）またはＫＸ２−３２８（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ製化合物）で５日間、核性因子−κＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）の受容体活性化因子とマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の存在下で処理する。インビトロのマウスまたはヒト破骨細胞モデルにおいて、可溶性ＲＡＮＫＬにより、Ｍ−ＣＳＦの存在下での破骨細胞前駆細胞の分化が可能になる（Ｑｕｉｎｎら；１９９８，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３９，４４２４−４４２７；Ｊｉｍｉら；１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６３，４３４−４４２）。未処理の対照細胞は、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦ単独の存在下でインキュベートした。ラパマイシンは、破骨細胞の形成の阻害の陽性対照として使用する。

【0334】

実施例１３：破骨細胞の生存に対する効果
破骨細胞の生存に対する化合物（Ｉ）の効果を調べるため、破骨細胞を、ラパマイシン、化合物（Ｉ）またはＫＸ２−３２８で４８時間、ＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦの存在下で処理する。未処理の対照細胞は、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦ単独の存在下でインキュベートする。ラパマイシンは、破骨細胞の生存の阻害の陽性対照として使用する。

【0335】

実施例１４：インビトロでの骨吸収に対する効果
骨薄片上での破骨細胞の形成に対する化合物（Ｉ）の効果を調べるため、骨薄片を、漸増濃度、例えば、０．１ｎＭ、１ｎＭまたは１０ｎＭのラパマイシン、化合物（Ｉ）またはＫＸ２−３２８で処理する。骨薄片上の破骨細胞の数を計数する。

【0336】

骨吸収の際、吸収小窩で破骨細胞が形成される。骨薄片上での吸収小窩形成に対する化合物（Ｉ）の効果を調べるため、骨薄片を、上記のようにしてラパマイシン、化合物（Ｉ）またはＫＸ２−３２８で処理する。骨薄片上の吸収小窩の数を測定する。

【0337】

骨薄片を上記のようにして処理し、次いでＴＲＡＰで染色する。ＴＲＡＰ陽性破骨細胞の数を測定する。

【0338】

骨薄片を上記のようにして処理し、次いでトルイジンブルーで染色し、破骨細胞媒介性骨吸収のインジケータである吸収小窩を顕現させる。

【0339】

実施例１５：骨芽細胞に対する効果
酵素アルカリホスファターゼは、リン酸塩を骨の石灰化に利用可能にすることに関与しているため、これを骨芽細胞活性のインジケータとして使用した。骨芽細胞活性に対する化合物（Ｉ）の効果を調べるため、骨芽細胞を、漸増濃度の化合物（Ｉ）またはＫＸ２−３２８で処理し、アルカリホスファターゼの発現を測定する（ｎＭアルカリホスファターゼ／μｇタンパク質／分）。対照として、骨芽細胞を、培地単独、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）で処理する。ＢＭＰは、骨外部位内に移植すると骨形成を誘導する能力によって骨誘導性であると規定されており、未分化間葉細胞が骨生成性骨芽細胞に変換されるのを媒介していると考えられている。

【0340】

骨芽細胞活性およびタンパク質発現に対する化合物（Ｉ）の効果を調べるため、骨芽細胞を、培地、ＤＭＳＯ、ＢＭＰ２、化合物（Ｉ）またはＫＸ２−３２８で、上記のようにして処理する。細胞溶解物中のタンパク質濃度を測定する。

【0341】

実施例１６：肥満に対する効果
以下の実験は、化合物（Ｉ）が肥満の処置に使用され得ることを示す。化合物（Ｉ）を、既報の方法を用いて試験する（Ｍｉｎｅｔ−Ｒｉｎｇｕｅｔら；２００６，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，出版前に電子公開，引用により本明細書に組み込まれる）。３０匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（初期重量１７５〜２００ｇ）を、２４±１℃および５５±５％湿度に維持され、人工的１２：１２時間明暗サイクル（０８：００時間に点灯）の室内で、個々のＰｌｅｘｉｇｌａｓケージに収容する。飼料と水は、終始、随意に摂取可能にする。ラットにはすべて、１４０ｇ／ｋｇの全乳タンパク質、５３８．１ｇ／ｋｇのコーンスターチ、８７．６ｇ／ｋｇのスクロース、および１３７ｇ／ｋｇのダイズ油で構成された中脂肪飼料（代謝エネルギー１７．５０ｋＪ／ｇ）を与え、この飼料には、ミネラル分とビタミン類（ミネラル塩類３５ｇ／ｋｇ、ビタミン類１０ｇ／ｋｇ、セルロース５０ｇ／ｋｇ、およびコリン２．３ｇ／ｋｇ）を補給する。この飼料は、Ｐ１４−Ｌと称し、通常のヒトの食事（１４％タンパク質、３１％脂質、および５４％炭水化物）と類似しており、実験室で粉末形態で調製したものである。

【0342】

対照溶液に加え、いくつかの用量：０．０１、０．１、０．５、および２ｍｇ／ｋｇの化合物（Ｉ）を試験する。化合物を水中に可溶化させ、次いで飼料中に組み込む。馴化期間中に基礎飼料摂取量を記録し、飼料中に組み込む本発明の化合物１日量を決定するのに使用する。化合物は飼料中に実験室で混合する。１週間の実験条件への馴化後、ラットを、体重が均質な５つの群（ｎ＝６／群）に分け、本発明の化合物を飼料にて６週間与える。体重を週に３回記録する。体組成を試験の最後に、解剖ならびに主要な器官および組織の重量計測によって測定する。簡単には、ラットを、過剰用量の麻酔薬（ペントバルビタールナトリウム４８ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって深く麻酔し、ヘパリン投与する（１００Ｕのヘパリン／１００ｇ体重）。大静脈および腹大動脈を切開することにより採血を行ない（組織中での凝固が回避されるように）、その後、主要な新鮮器官（肝臓、脾臓、腎臓、および膵臓）ならびに組織（腎臓周囲および肩甲部の褐色脂肪組織、精巣上体、腹膜後、内臓、および皮下の白色脂肪組織（ＷＡＴ）、および筋肉と骨格によって規定される屠体）を取り出して重量計測を行なう。

【0343】

実施例１７：３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるインスリン誘導性ＧＬＵＴ４トランスロケーションに対する効果
以下の実施例は、化合物（Ｉ）が糖尿病の処置に使用され得ることを示す。化合物（Ｉ）を、既報の方法を用いて試験する（Ｎａｋａｓｈｉｍａら；２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，１２８８９−１２８９５）。対照ＩｇＧまたは本発明の化合物のいずれかを、カバーガラス上で分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の核内に注入する。グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ融合タンパク質を各々、検出目的のために５ｍｇ／ｍｌのヒツジＩｇＧとコンジュゲートさせる。染色の前に、細胞を１時間回復させる。細胞を、無血清培地中で２時間飢餓状態にし、インスリン（０．５ｎＭまたは１７ｎＭ）あり、またはなしで２０分間刺激し、固定する。

【0344】

免疫染色を、ウサギポリクローナル抗ＧＬＵＴ４（Ｆ３４９）（１μｇ／ｍｌ）を用いて行なう。マイクロインジェクションした各フルオレセインイソチオシアネート陽性細胞を、原形質膜結合ＧＬＵＴ４の染色の存在について評価する。対照細胞には、予備免疫ヒツジＩｇＧを注入し、次いで、実験注入細胞と同様にして処理する。免疫蛍光ＧＬＵＴ４染色によって定量されるように、インスリンにより、原形質膜へのＧＬＵＴ４のトランスロケーションの増大がもたらされる。細胞を、対照としてのワートマニンとともにインキュベートし、基礎およびインスリン誘導性ＧＬＵＴ４トランスロケーションをブロックする。本発明の化合物は、インスリン誘導性ＧＬＵＴ４トランスロケーションを刺激し得るものであり、このことは、本発明の化合物の投与によってキナーゼ活性（例えば、ＰＴＥＮ機能）が阻害されて、細胞内ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸レベルの増大がもたらされ、これにより、ＧＬＵＴ４トランスロケーションが刺激されることを示し得る。

【0345】

実施例１８： 腎新生血管形成に対する効果
以下の実験は、化合物（Ｉ）が、眼疾患、例えば、黄斑変性、網膜症および黄斑浮腫の処置に使用され得ることを示す。腎新生血管形成に対する化合物（Ｉ）の効果は、腎新生血管形成モデルを用いて既報のようにして測定される（Ａｉｅｌｌｏら；１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２，１０４５７−１０４６１）。簡単には、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスを生後第７日（Ｐ７）からＰ１２まで、母獣とともに７５％Ｏ_２に曝露する。Ｐ１２に、マウスを室内大気に戻す。Ｐ１２および場合によってはＰ１４に、以下に記載するようにして眼内注射を行なう。Ｐ１７に、マウスを、４％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝生理食塩水の心臓灌流によって致死させ、眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中で一晩４℃で固定した後、パラフィン包埋する。

【0346】

マウスは、すべての手順で、トリブロモエタノールにより深く麻酔する。瞼裂を切開し（例えば、１１番のメスの刃を使用）、目を突出させた。硝子体内注射は、まず、左目の後縁にＥｔｈｉｃｏｎ ＴＧ１４０−８縫合針を進入させることにより行なう。３２ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎ針とシリンジを使用し、Ａｌｃｏｎ平衡塩溶液中で希釈した本発明の化合物を、既にある進入部位から送達する。次いで、この目を元の位置に戻し、瞼を角膜上に近づける。２日間後、先の非操作縁部分から反復注射を行なう。対照として、等量の生理食塩水を右目に注入する。

【0347】

視神経先端から始めて５０枚を超える連続６μｍパラフィン包埋軸位切片を得る。過ヨウ素酸／シッフ試薬およびヘマトキシリンで染色後（Ｐｉｅｒｃｅら；１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９２，９０５−９０９；Ｓｍｉｔｈら；１９９４，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３５，１０１−１１１）、各々３０μｍ離れた等しい長さの１０枚のインタクトな切片を、３００μｍにわたって評価する。網膜剥離または眼内炎を示す目は、評価から除外する。内部境界膜前のすべての網膜血管細胞核を、各切片において、完全にマスクされたプロトコルによって計数する。計数された１０枚すべての切片の平均により、平均血管新生細胞核／６μｍ切片／目を得る。内部境界膜前の血管細胞核は、正常な非操作動物では観察されない（Ｓｍｉｔｈら；１９９４，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３５，１０１−１１１）。生理食塩水対照群の目と比較した場合、該化合物で処理した目では、新生血管形成の低減が観察され得る。

【0348】

実施例１９：脳卒中と関連しているキナーゼシグナル伝達カスケードのモジュレーション
脳卒中の多くの動物モデルが開発され、特性評価されている。例えば，Ａｎｄａｌｕｚら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．，第１３巻：３８５−３９３（２００２）；Ａｓｈｗａｌ，Ｓ．およびＷ．Ｊ．Ｐｅａｒｃｅ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，ｖｏｌ １３：５０６−５１６（２００１）；Ｄｅ Ｌｅｃｉｎａｎａら、Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ．Ｄｉｓ．，第１１巻（Ｓｕｐｐｌ．１）：２０−３０（２００１）；ＧｉｎｓｂｅｒｇおよびＢｕｓｔｏ，Ｓｔｒｏｋｅ，第２０巻：１６２７−１６４２（１９８９）；Ｌｉｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，第１２３巻：８９−９７（２００３）；Ｍａｃｒａｅ，Ｉ．Ｍ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，第３４巻：３０２−３０８（１９９２）；ＭｃＡｕｌｅｙ，Ｍ．Ａ．，Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ．Ｂｒａｉｎ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．，第７巻：１５３−１８０（１９９５）；Ｍｅｇｙｅｓｉら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，第４６巻：４４８−４６０（２０００）；Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃｈ，Ｖ．（編）．，Ｓｔｒｏｋｅ：ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８３）；ならびにＴｒａｙｓｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，ＩＬＡＲ Ｊ．４４：８５−９５（２００３）（各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。限局性（脳卒中）および総体性（心停止）脳虚血の動物モデル概説については、例えば、Ｔｒａｙｓｔｍａｎ，ＩＬＡＲ Ｊ．，第４４巻（２）：８５−９５（２００３）およびＣａｒｍｉｃｈａｅｌ，ＮｅｕｒｏＲｘ（登録商標）：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＮｅｕｒｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第２巻：３９６−４０９（２００５）（各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【0349】

脳卒中における細胞死をモジュレートする化合物は、当該技術分野で認知された任意の脳卒中モデルを用いて同定される。本明細書に記載の試験では、ＭＣＡｏとして知られる処置である内頸動脈経由の中大脳動脈（ＭＣＡ）動脈内縫合糸閉塞を、脳卒中における細胞死のモデルとして使用する。対照および試験群のラットにおいて、外頸動脈を離断し、総頸動脈を結紮し、次いで、外頸動脈を内頸動脈経由で縫合糸を通すための経路として使用する。ここで、縫合糸は、前大脳動脈と中大脳動脈の接合部で留める。クモ膜下出血および早期再灌流の低減のため、縫合糸は、好ましくはシリコーンなどの薬剤でコーティングする。縫合糸は、ＭＣＡを例えば６０、９０または１２０分の間閉塞するため、およびＭＣＡを永続的に閉塞するために使用する。

【0350】

試験群では、ラットに化合物（Ｉ）を、縫合糸でのＭＣＡの閉塞前、閉塞時および閉塞後のさまざまな時点で投与する。試験群に対する化合物の効果を対照群で観察された効果と、例えば、各ＭＣＡｏ群における細胞死の程度を測定することにより比較する。典型的には、対照群では、細胞死のパターンは、線条内の初期梗塞から線条を覆う背外側皮質内の遅延型梗塞への進行に従う。線条体は、ほとんどが壊死性となり、急速に発生する。試験群の細胞死のパターンを対照群のものと比較し、脳卒中における細胞死をモジュレートする化合物を同定する。

【0351】

実施例２０：アテローム性動脈硬化と関連しているキナーゼシグナル伝達カスケードのモジュレーション
アテローム性動脈硬化の多くの動物モデルが開発され、特性評価されている。アテローム性動脈硬化、再狭窄および血管内移植片の研究の動物モデルの概説については、例えば、Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｙら、ＪＶＩＲ、第１１巻（１）：５−１７（２０００）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。アテローム性動脈硬化は、適当な動物モデルにおいて、高脂肪／高コレステロール（ＨＦＨＣ）飼料を用いて誘導される。試験動物は、コレステロールエステルトランスフェラーゼを含む動物（ウサギまたはブタ）である。ＨＦＨＣ飼料は、例えば、脂肪分を補給した市販の餌を用いて作製される。コレステロール摂取量は、飼料の０．５〜２．０％とする。試験群の動物（例えば、ウサギまたはブタ）には化合物（Ｉ）を与える。試験化合物の効果を、未処置対照群の動物におけるアテローム性動脈硬化の効果と比較する。比較対象の効果としては、例えば、斑形成の程度、各動物群で観察された心筋梗塞の回数および／または頻度、ならびに冠動脈組織内に示された心筋梗塞に続発性の組織損傷の程度が挙げられる。

【0352】

心筋梗塞は、ラットおよびマウスなどのさまざまな動物モデルを用いて研究されている。心筋梗塞のほとんどは、冠動脈内に既に存在しているアテローム硬化性斑の急性トランスボティック（ｔｒａｎｓｂｏｔｉｃ）閉塞に起因しており、これは、例えばラットおよびマウスの左冠動脈結紮によって、動物モデルにおいて模倣される。心筋梗塞は、心室リモデリングと称される過程である心室構造の総体的変化を誘発する。梗塞が生じた心臓は進行的に拡張し、心室機能不全という損傷を加速させ、これにより最終的に心不全になる。

【0353】

心筋虚血は、試験群および対照群の動物（例えば、マウスまたはラット）において、左前下行冠動脈を結紮することにより誘導される。罹患心臓組織を化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩と、例えば、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって虚血の誘導後に接触させる。高解像度磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、乾燥重量測定、梗塞の大きさ、心臓容積、およびリスク領域を、施術２４時間後に測定する。化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容され得る塩の注射を受けたラットにおいて、生存率の測定と心エコー検査を術後の種々の時点で行なう。試験化合物の他の効果を対照群のラットと比較する。例えば、左心室の形態と機能の変化を、心エコー検査を用いて特性評価し、拡張末期の直径、相対壁厚、および短縮画分の割合を比較する。切除した心臓で梗塞の大きさを計算し、左心室の表面積に対する割合で示す。

【0354】

実施例２１：神経因性疼痛と関連しているキナーゼシグナル伝達カスケードのモジュレーション
慢性神経因性疼痛などの神経因性疼痛の多くの動物モデルが開発され、特性評価されている。例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ＆ Ｘｉｅ，Ｐａｉｎ，第３３巻、８７−１０７（１９８８）；Ｓｅｌｔｚｅｒら、Ｐａｉｎ，第４３巻、２０５−１８（１９９０）；Ｋｉｍ ＆ Ｃｈｕｎｇ，Ｐａｉｎ，第５０巻、３５５−６３（１９９２）；Ｍａｌｍｂｅｒｇ ＆ Ｂａｓｂａｕｍ，Ｐａｉｎ，第７６巻、２１５−２２（１９９８）；Ｓｕｎｇら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．，第２４６巻、１１７−９（１９９８）；Ｌｅｅら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，第１１巻、６５７−６１（２０００）；Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄ ＆ Ｗｏｏｌｆ，Ｐａｉｎ，第８７巻、１４９−５８（２０００）；Ｖａｄａｋｋａｎら、Ｊ Ｐａｉｎ，第６巻、７４７−５６（２００５）（各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。神経因性疼痛に使用される動物モデルの概説については、例えば、Ｅａｔｏｎ，Ｊ．Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，第４０巻（４増刊）４１−５４（２００３）（これらの内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【0355】

神経因性疼痛をモジュレートする化合物は、当該技術分野で認知された任意の神経因性疼痛モデルを用いて同定される。例えば、神経因性疼痛のモデルは、一般的には、坐骨神経に対する損傷を伴うものであるが、損傷の誘導に使用される方法は種々である。例えば、坐骨神経は、該神経の部分狭窄、完全な離断、凍結、および該神経に対する代謝性、化学的または免疫性の傷害により損傷される。このような型の神経損傷を有する動物は、神経因性疼痛患者で報告されているものと同様の異常痛覚が生じることが示されている。本明細書に記載の試験では、試験群および対照群の被検体（マウスなど）の坐骨神経を損傷させる。試験群では、被検体に化合物（Ｉ）を、坐骨神経に対する損傷の前、損傷時および損傷後のさまざまな時点で投与する。試験群に対する化合物の効果を対照群で観察された効果と、例えば、被検体の身体の観察および検査によって比較する。例えば、マウスでは、被検体の後足を使用し、非有毒性刺激（触覚刺激など）に対する応答を試験するか、または通常の出来事の過程で有害となり得る刺激（例えば、後足に送達された輻射熱）に対する被検体の応答を試験する。試験被検体における異痛症（通常は痛みのない刺激によって痛みが誘発される状態）または痛覚過敏（痛みに対する過剰な過敏性もしくは感受性）の徴候は、試験化合物によって試験被検体の神経因性疼痛が有効にモジュレートされていないことを示す。

【0356】

実施例２２：Ｂ型肝炎と関連しているキナーゼシグナル伝達カスケードのモジュレーション
Ｂ型肝炎の多くの動物モデルが開発され、特性評価されている。Ｂ型肝炎の動物モデルの概説については、例えば、Ｇｕｈａら、Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ，第３３巻（７）：３７−４６（２００４）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。好適な動物モデルとしては、例えば、チンパンジー、ツパイ（霊長類と系統発生的に近縁の非齧歯類の小動物、Ｗａｌｔｅｒら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，第２４巻（１）：１−５（１９９６）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）参照）、ウッドチャック、アヒルおよびジリスなどの代用モデル（例えば、ＴｅｎｎａｎｔおよびＧｅｒｉｎ，ＩＬＡＲ Ｊｏｕｒｎａｌ，第４２巻（２）：８９−１０２（２００１）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）参照）が挙げられる。

【0357】

例えば、一次肝細胞をツパイ種ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉの肝臓から単離し、ＨＢＶに感染させる。インビトロ感染により、肝細胞内でのウイルスＤＮＡおよびＲＮＡの合成、ならびに培養培地中へのＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の分泌がもたらされる。また、ＴｕｐａｉａｓをインビボでＨＢＶに感染させると、ｔｕｐａｉａの肝臓内でウイルスＤＮＡの複製および遺伝子発現がもたらされ得る。ヒトにおける急性自己制限Ｂ型肝炎と同様、ＨｂｓＡｇは血清から速やかに除去された後、抗ＨＢｅおよび抗ＨＢｓへのセロコンバージョンが起こる。

【0358】

Ｂ型肝炎をモジュレートする化合物は、当該技術分野で認知された任意のＢ型肝炎モデルを用いて同定される。本明細書に記載の試験では、試験群および対照群の動物（例えば、チンパンジーまたはツパイ）をＨＢＶに感染させる。試験群では、被検体に化合物（Ｉ）を、ＨＢＶへの曝露の前、曝露時および曝露後のさまざまな時点で投与する。試験群に対する化合物の効果を対照群で観察された効果と、例えば、被検体の身体の観察および検査によって、ならびに血液または血清の分析によって比較し、どの時点で感染が被検体から消失するかを調べる。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原と称されるおよびその断片の存在および／または量を検出するためのアッセイを実施する。あるいはまたさらに、被検体の肝臓を解析する。肝臓機能試験により、特定のタンパク質および酵素、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ、以前は、血清グルタミン酸‐オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ））およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ、以前は、血清グルタミン酸‐ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ））などのレベルを解析する。

【0359】

実施例２３：チロシンキナーゼ阻害に対する効果
以下の実験は、化合物（Ｉ）が自己免疫疾患の処置に使用され得ることを示す。化合物（Ｉ）を、既報の方法を用いて試験する（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら；２００３，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３３７−１３４９）。キナーゼ活性は、ＤＥＬＦＩＡ（解離増強型ランタニド フルオロイムノアッセイ）を用いて測定される。これは、ユーロピウムキレート標識抗ホスホチロシン抗体を用いて、ランダムポリマーであるポリ−Ｇｌｕ４−Ｔｙｒｌ（ＰＧＴＹＲ）へのリン酸塩転移を検出するものである。キナーゼアッセイは、ニュートラビジンコート９６ウェル白色プレートにおいて、キナーゼアッセイバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０，２５ｍＭ ＭｇＣ１２，５ｍＭ ＭｎＣ１２，５０ｍＭ ＫＣｌ，１００μＭ Ｎａ３ＶＯ４，０．２％ＢＳＡ，０．０１％ＣＨＡＰＳ）中で行なう。最初にＤＭＳＯ中に１ｍｇ／ｍＬで溶解させた試験試料（化合物（Ｉ））を、用量応答（１μｇ／ｍＬの終濃度から始めて１〜３．５の連続希釈した１０種の用量）のためにアッセイバッファーで予備希釈する。この希釈試料の２５μＬアリコートおよび希釈酵素（ｌｃｋ）（０．８ｎＭ終濃度）の２５μＬアリコートを、各ウェルに逐次添加する。反応を、５０μＬ／ウェルの基質混合物（２μＭ ＡＴＰ（最終ＡＴＰ濃度は１μＭである）および７．２ｎｇ／μＬ ＰＧＴＹＲ−ビオチン含有キナーゼバッファー）により開始させる。バックグラウンドウェルをバッファーおよび基質のみとともにインキュベートする。室温で４５分間のインキュベーション後、アッセイプレートを３００μＬ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ洗浄バッファーで３回洗浄する。１００μＬ／ウェルのユーロピウム標識抗ホスホチロシン（Ｅｕ^３＋−ＰＴ６６，１ｎＭ，Ｗａｌｌａｃ ＣＲ０４−１００）のアリコート（ＤＥＬＦＩＡアッセイバッファー中で希釈したもの）を各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートする。インキュベーションが終了したら、プレートを３００μＬ／ウェルの洗浄バッファーおよび１００μＬ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ洗浄バッファーで４回洗浄する。増強溶液（Ｗａｌｌａｃ）を各ウェルに添加する。１５分後、ＬＪＬの分析担当者が２５０μｓの遅延時間後の時間分解蛍光を測定する（３６０ｎｍで励起、６２０ｎｍで発光、ＥＵ ４００光二色性ミラー）。本発明の化合物はｌｃｋのキナーゼ活性を阻害するものであり得、これは、この化合物が被検体の自己免疫疾患を処置するために使用され得ることを示す。

【0360】

実施例２４：ダサチニブ耐性細胞株における化合物（Ｉ）およびダサチニブのＩＣ_５０；各細胞株において１２種類の濃度のインヒビター
現在、文献においてダサチニブ耐性であると報告されている癌細胞株（すなわち、ＣＯＬＯ−３２０ＤＭ、Ｈ４６０、Ｈ２２６、ａｎｄ ＨＣＴ−１１６）を、細胞増殖阻害に対する化合物（Ｉ）の効果を調べるために、化合物（Ｉ）Ｓｒｃインヒビターまたはダサチニブ対照の存在下で培養した。細胞増殖／増殖阻害は、ＭＴＴ比色分析アッセイを用いて評価した。また、化合物（Ｉ）とダサチニブ対照の両方のＩＣ_５０を調べた。下記の表は、この増殖阻害試験で使用した細胞株の一覧を示す。

【0361】

【表16】

ＣＯＬＯ−３２０ＤＭ、Ｈ４６０、Ｈ２２６、およびＨＣＴ−１１６ヒト癌細胞株を常套的に培養し、２％のＦＢＳを含有する基礎培地中に３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。実験では、細胞を、９６ウェルプレート内の基礎培地／１．５％ＦＢＳ中に４．０×１０^３／１９０μＬおよび８．０×１０^３／１９０μＬ／ウェルで播種する。細胞の培養は、化合物（Ｉ）およびダサチニブの添加前に、適切なＣＯ_２条件下、３７℃で９６ウェルプレート内にて一晩（１６時間）で行なう。

【0362】

化合物（Ｉ）およびダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）の希釈のため、２０ｍＭストック溶液試料を１：３の希釈度を用いて基礎培地／１．５％ＦＢＳ中で連続希釈し、１３１μＭ〜０．７４ｎＭの範囲の２０×濃度を得た。次いで、１０μＬの２０×希釈液を、１９０μＬ癌細胞株を入れた適切なウェル（ｎ＝３）に添加し、終濃度を６５６１ｎＭ〜０．０３７ｎＭの範囲とする。以下の対照：細胞のビヒクル対照、試料なし；細胞の培地対照、試料なし、および０．０３％ＤＭＳＯ（試料中に存在させる最高ＤＭＳＯ濃度；結果は報告せず）を使用した。

【0363】

処理した癌細胞を、適切なＣＯ_２条件下、３７℃で３日間（７８時間）インキュベートした。第３日目、１０μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、細胞をＭＴＴの存在下で、適切なＣＯ_２条件下、３７℃で４時間インキュベートした。このインキュベーション期間後、９０μＬの１０％ＳＤＳ（＋ＨＣ１）を、各ウェルに添加して細胞を溶解させ、ホルマザンを可溶化させた。次いで、細胞を適切なＣＯ_２条件下、３７℃で一晩インキュベートした。

【0364】

マイクロプレートリーダーを用いてＯＤ_５７Ｏを測定した。増殖阻害曲線およびＥＣ_５０／ＩＣ_５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４統計ソフトウェアを用いて測定した。データを標準化し、最大応答に対する割合を示した。

【0365】

下記の表は、７８時間の時点での癌細胞株（８．０×１０^３細胞／ウェル、１．５％ＦＢＳ）における化合物（Ｉ）およびダサチニブのＩＣ_５０を示す（標準化した応答データの結果）。

【0366】

【表17】

実施例２５：ダサチニブおよびイマチニブ耐性白血病細胞に対する化合物（Ｉ）の効果
Ｂａ／Ｆ３細胞（例えば、Ｐａｌａｃｉｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３０９：１２６−１３１（１９８４）；Ｐａｌａｃｉｏｓら、Ｃｅｌｌ ４１：７２７−７３４（１９８５）参照）を、９６ウェルプレート内の完全培地＋ＩＬ−３中で培養した。また、Ｂａ／Ｆ３細胞の培養物を、野生型（ＷＴ）Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ｂｃｒ−ＡｂｌのＥ２５５Ｋ変異、またはＢｃｒ−ＡｂｌのＴ３１５Ｉ変異を発現するようにトランスフェクトし、９６ウェルプレート内のＩＬ−３無含有完全培地中で培養した。Ｂａ／Ｆ３細胞株は、Ｂｃｒ／ＡｂｌチロシンキナーゼＥ２２５Ｋに変異が存在する場合、グリーベック耐性となる。Ｂａ／Ｆ３細胞株は、Ｂｃｒ／ＡｂｌチロシンキナーゼＴ３１５Ｉ変異が存在する場合、グリーベックとダサチニブの両方に耐性となる。次いで、各群の細胞を１０倍希釈液中で、薬物なし、０．１〜１０，０００ｎＭのダサチニブ、または０．１〜１０，０００ｎＭの化合物（Ｉ）で９６時間処理した。ＭＴＴアッセイを行なった（プレートは５７０ｎＭで読み取る）。アッセイはすべて３連で行なう。

【0367】

この試験の結果（図１２〜１３および以下の表にまとめる）は、化合物（Ｉ）がＧＩ_５０＝３５でＢＣＲ−ＡｂｌのＴ３１５Ｉ変異型を阻害するが、ダサチニブは１０，０００ｎＭでも阻害しないことを示す。さらに、ダサチニブは、Ｂａ／Ｆ３細胞のＩＬ−３誘導性増殖を阻害しないが、化合物（Ｉ）は強力なインヒビターである（ＧＩ_５０＝３．５ｎＭ）。

【0368】

【表18】

実施例２６：化合物（Ｉ）およびＢＭＳ３５４８２５を用いた５つの細胞株におけるＧＩ_５０ｓ／ＢｒｄＵアッセイ
化合物（Ｉ）およびＢＭＳ３５４８２５を使用し、５つの細胞株（ＳＫＯ Ｖ−３、Ｋ５６２、ＨＴ−２９、Ａ５４９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）のＧＩ５０の評価を、ＢｒｄＵを用いてＴ＝０およびＴ＝７２においてアッセイした。
この実験では、細胞株１つあたり２つの９６ウェルプレートに、細胞を、以下に表示した細胞数で２００μＬの１．５％ＦＢＳ含有増殖培地中に播種した。評価対象の細胞株は：ＳＫＯＶ−２、Ｋ５６２、ＨＴ−２９、Ａ５４９、およびＭＤＡ２３１である。ＨＴ−２９（２０００細胞）およびＭＤＡ ＭＢ ２３１（５０００細胞）以外はすべて１０００細胞／ウェルで播種した。３７℃＋５％ＣＯ_２で播種後、プレートを２４時間インキュベートした。ＭＤＡ２３１は別とし、この細胞株は３７℃および０％ＣＯ_２で培養する。

【0369】

播種の２４時間後、化合物（Ｉ）およびＢＭＳ３５４８２５を、１２８ｎＭ、６４ｎＭ、３２ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、および１ｎＭで、各細胞株（ｎ＝３）のプレートの１つに添加した。化合物（Ｉ）およびＢＭＳ３５４８２５で処理した細胞株プレートの組を、３７℃＋５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。ＭＤＡ２３１は別とし、この細胞株は３７℃および０％ＣＯ_２で培養する。ＢｒｄｕアッセイをＴ＝０およびＴ＝７２に行なった。

【0370】

増殖阻害。ＢｒｄＵデータを使用し、式：
ＧＩ＝［ＣＴ_１−Ｔ_０）／（Ｃｏｎ−Ｔ_０）］×１００
（式中、Ｔ_０＝時間点０での細胞の蛍光；Ｔ_１＝時間点ｘでの処理細胞の蛍光；Ｃｏｎ＝時間点ｘでの対照細胞の蛍光）を用いて、各試料濃度での％増殖阻害を求めた。Ｔ_１値≦Ｔ_０値をＴ、細胞傷害と表示した。ＧＩ_５０は、Ｔ_１値≦Ｔ_０値（細胞傷害）を除外し、ＸＬＦｉｔを用いて推定した。この試験の結果を図１４〜１８および以下の表にまとめる。

【0371】

【表19】

実施例２７：
ＢｒｄＵアッセイを用いた、Ｌ３．６ｐｌ細胞株における、ジェムザール（登録商標）および化合物（Ｉ）の併合ＧＩ_５０
この試験は、ＢｒｄＵ Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ：カタログ番号１１６４７２２９００１）を使用し、Ｔ＝０およびＴ＝７２にアッセイしたＬ３．６ｐｌ細胞株におけるジェムザール（登録商標）±化合物（Ｉ）のＧＩ_５０の評価を伴うものであった。ヒト膵臓癌細胞株であるＬ３．６ｐｌ細胞を、３つの９６ウェルプレートに、１９０μＬの１．５％ＦＢＳ含有増殖培地中のＬ３．６ｐｌに対して２０００細胞／ウェルで播種した。Ｌ３．６ｐｌ細胞は、Ｔｒｅｖｉｎｏら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００６年３月；１６８（３）：９６２−７２（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に既報のものである。細胞を３７℃＋５％ＣＯ_２で播種後、１８〜２４時間インキュベートした。２４時間後、ジェムザール（登録商標）＋化合物（Ｉ）、ジェムザール（登録商標）、および化合物（Ｉ）をＬ３．６ｐｌ細胞（ｎ＝３）に添加した。ジェムザール（登録商標）を、８ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．１２５ｎＭ、０．０６３ｎＭの濃度で評価した。化合物（Ｉ）は、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６ｎＭ、および０．７８ｎＭの濃度で評価した。各試料で処理したプレートを、３７℃＋５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。ＢｒｄＵアッセイをＴ＝０に、および７２時間のインキュベーション後のＴ＝７２に再度行なった。試験の結果を図１９と２０に示す。下記の表は、ジェムザール（登録商標）±化合物（Ｉ）の計算値ＧＩ_５０のまとめを示す。

【0372】

【表20】

実施例２８：インビボ転移を調べるための正所性前立腺モデル
Ｎｕ／Ｎｕマウス（８〜１２週齢）の前立腺にＰＣ３−ＭＭ２前立腺癌細胞を、Ｐｅｔｔａｗａｙら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６，２：１６２７−１６３６（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に既報のようにして注射した。ＰＣ３−ＭＭ２細胞の正所性注射の１４日後、マウスを無作為に４つの群：ダサチニブ（１５ｍｇ／ｋｇ／日）処置；化合物（Ｉ）（５ｍｇ／ｋｇ／日）処置；化合物（Ｉ）（１０ｍｇ／ｋｇ／日）処置；および対照（ビヒクル）に分けた。ダサチニブ、化合物（Ｉ）およびビヒクルは、経口強制投与によって投与した。マウスはすべて、ほぼ第４２日目に頸部脱臼によって致死させた。腫瘍体積（カリパスによって測定）、重量および限局性（腹腔または大動脈傍の）リンパ節転移の発生を記録した。実験の結果を以下の表に報告し、図２１と２２に示す。

【0373】

【表21】

実施例２９：ＨＢＶ一次アッセイ
開発したＨＢＶ一次アッセイを、ウイルスＤＮＡの検出および定量を改善し、単純化した（Ｋｏｒｂａら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．１９：５５−７０（１９９２））こと以外は、Ｋｏｒｂａら（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．１５：２１７−２２８（１９９１）およびＡｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．１９：５５−７０（１９９２））に記載のものと同様にして行なった。

【0374】

化合物（Ｉ）を抗ＨＢＶ活性の可能性について、標準化されたＨｅｐＧ２−２．２．１５抗ウイルスアッセイにおいて、単一の高試験濃度の化合物を用いて評価した。ＨｅｐＧ２−２．２．１５は、高レベルのＨＢＶ野生型ａｙｗｌ株を産生する安定な細胞株である。簡単には、ＨｅｐＧ２−２．２．１５細胞を９６ウェルプレート内で平板培養した。細胞培養中に観察される「エッジ効果」が低減されるように、ウェルの内側のみを使用した。ウェルの外側は、完全培地で満たし、試料の蒸発の最小化を補助する。翌日、コンフルエントなＨｅｐＧ２−２．２．１５細胞の単層を洗浄し、培地を、試験濃度の試験物を含有する完全培地と交換した（３連）。３ＴＣを陽性対照として使用し、一方、未処理対照としては培地単独を細胞に添加した。３日間後、培養培地を、適切に希釈した試験化合物を含有する新鮮培地と交換した。試験化合物の最初の投与の６日後、細胞培養上清みを回収し、プロナーゼとＤＮＡｓｅで処理し、次いで、ＨＢＶ ＤＮＡコピー数の直接測定のためのリアルタイム定量的ＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイにおいて使用した（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用）。

【0375】

各試験化合物の抗ウイルスの活性を、そのＨＢＶ ＤＮＡコピー数を未処理対照細胞（１００％）のものと比較して阻害レベル割合を得ることにより計算した。上清みを除去し、残留細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）溶液細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ−ｂａｓｅｄ）に供し、細胞バイアビリティを測定した。化合物の細胞傷害性を、その細胞バイアビリティを未処理対照細胞のものと比較し、対照細胞に対する割合を得ることにより調べた。この試験の結果を以下の表および図２３に示す。

【0376】

【表22】

実施例３０：細胞全体におけるＳｒｃキナーゼ活性の阻害
化合物（Ｉ）は、図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１０Ｄに示されるように、細胞全体におけるＳｒｃキナーゼ活性を阻害する。図１０Ａは、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＳｒｃ自己リン酸化に対する化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである；図１０Ｂは、ＨＴ−２９細胞におけるＳｒｃ自己リン酸化に対する化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである；図１０Ｃは、ｃ−Ｓｒｃ／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＳｒｃトランスリン酸化に対する化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである；および図１０Ｄは、ＨＴ−２９細胞におけるＳｒｃ自己リン酸化に対する化合物（Ｉ）の効果を示すグラフである。化合物（Ｉ）は、細胞全体におけるＳｒｃキナーゼ活性の強力なインヒビターである。図１０Ａ〜１０Ｄに示されるように、化合物（Ｉ）は、細胞全体におけるＳｒｃキナーゼ活性の強力なインヒビターである。特に、化合物（Ｉ）は、種々の細胞株において、Ｓｒｃ自己リン酸化（図１０Ａおよび１０Ｂ）とＳｒｃトランスリン酸化（図１０Ｃおよび１０Ｄ）の強力なインヒビターであった。さらなるトランスリン酸化の基質、すなわち、ＦＡＫ Ｙ９２５およびパキシリンＹ３１で、細胞全体阻害の同様の結果が得られた。ＰＤＧＦ Ｙ５７２／５７４、ＥＧＦ Ｙ８４５、ＪＡＫ１ Ｙ１０２２／１０２３ ＆ ＪＡＫ２ Ｙ１００７／１００８、Ｌｃｋ Ｙ４０５ ＆ ＺＡＰ７０ Ｙ３１９のリン酸化は、細胞全体において阻害されなかった。Ｌｙｎ Ｙ４１６およびＢｃｒ／Ａｂｌ＆２４５は、低度に強力に阻害された。

【0377】

実施例３１：細胞全体におけるプロテインチロシンキナーゼに対する選択性
化合物（Ｉ）は、プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）に対して選択的である。図１１は、現在臨床試験中のＡＴＰ競合性Ｓｒｃインヒビターであるダサチニブと比較したときの、細胞全体におけるプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）に対する化合物（Ｉ）の選択性を示す図解である。ＳＹＦ細胞は、Ｓｒｃキナーゼファミリー構成員Ｓｒｃ、ＹｅｓおよびＦｙｎが欠損しているマウス線維芽細胞である。化合物（Ｉ）は、ダサチニブと比較した場合、細胞全体において非常に高いＰＴＫ選択性を示した。

【0378】

実施例３２：経口効力
化合物（Ｉ）は高い経口効力を示す。例えば、図２４は、ダサチニブとの比較における化合物（Ｉ）の経口効力を示す。経口効力は、病期分類されたＨＴ２９（ヒト結腸癌）マウス異種移植片を使用し、２８日の処置期間にわたって調べた。化合物（Ｉ）は２．０および４ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄで試験した。ダサチニブは２５ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄで試験した。第５日目、体重減少のため、ダサチニブ用量を１５ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄに減らした。

【0379】

実施例３３：ＨＣＶ一次アッセイ
化合物（Ｉ）はＨＣＶの処置に使用され得る。化合物（Ｉ）を、Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．ら Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４００８−４０２１の方法を用いて試験する。ＥＴ細胞（ｃａｌｌ）株は、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコン（ｇｅｎｏ型 Ｉｂ）を有し、安定なルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）レポーターおよび３つの細胞培養適応変異を有するヒトヘパトーム細胞株Ｈｕｈ−７である。この細胞を、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベータ内で、ダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ）、１％グルタミン、５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８中で培養する。細胞培養試薬はすべて、例えば、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）製のものである。

【0380】

実施例３４：血漿および脳内曝露
化合物（Ｉ）は、良好な血漿／脳内曝露を示す。例えば、化合物（Ｉ）の血漿および脳内曝露は以下のように説明される。経口投与後、マウスの血漿濃度を測定した。用量はすべて、精製水中で配合した。雄ＣＤ−１マウスに一晩絶食後、投与を行ない、投与後４時間で餌を与えた。投与は以下のとおりとした。

【0381】

【表23】

タンパク質を、血漿では０．２５ｍＬのアセトニトリル、脳では０．２５ｍＬにより沈降させた。遠心分離後、上清みをＬＣ／ＭＳシステム内に直接注入した。定量限界は、血漿５０μＬアリコートおよび脳５０μＬアリコートの使用で１ｎｇ／ｍＬであった。標準曲線は、血漿および脳の両方に対して１〜１，０００ｎｇ／ｍＬとした。ＨＰＬＣ条件は以下のとおりとした。

【0382】

ＨＰＬＣシステム：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ−１０ Ｓｙｓｔｅｍ
分析カラム：Ａｑｕａｓｉｌ Ｃ１８ ５μｍ １００×２ｍｍカラム
カラム温度：周囲温度
自動試料採取装置の温度：周囲温度
移動相 Ａ）１０ｍＭギ酸アンモニウム含有水（ｐＨ４）。

【0383】

Ｂ）アセトニトリル
流速：０．６ｍＬ／分
インジェクション容量：２μＬ
勾配：

【0384】

【表24】

質量分析条件は以下のとおりとした。

【0385】

装置：ＡＢＩ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００
モード：ＥＳＩ＋
実験：ＭＲＭ（反復反応モニタリング）
遷移：化合物（Ｉ）：ｍ／ｚ ４３２．４→１１４．２（Ｒｔ＝３．１１分）
真下の４つの表は、１０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇの用量の化合物（Ｉ）の単回経口投与後の血漿濃度および脳内濃度を示す。

【0386】

【表25】

【0387】

【表26】

【0388】

【表27】

【0389】

【表28】

１０ｍｇ／ｋｇの化合物（Ｉ）の単回投与後のマウス（第１群）における脳内および血漿中の薬物動態パラメータは以下のとおりである。

【0390】

【表29】

ＡＵＣｌａｓｔ脳／ＡＵＣｌａｓｔ血漿比は０．４２である。

【0391】

５０ｍｇ／ｋｇの化合物（Ｉ）の単回投与後のマウス（第２群）における脳内および血漿中の薬物動態パラメータは以下のとおりである。

【0392】

【表30】

ＡＵＣｌａｓｔ脳／ＡＵＣｌａｓｔ血漿比は０．３９である。

【0393】

実施例３５：神経膠腫生存試験
脳腫瘍マウス異種移植片試験を、化合物（Ｉ）をテモダール（登録商標）と比較して行なった。試験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて行なった。ＧＬ２６１神経膠腫細胞（５μｌのＤＭＥＭ中１×１０^５）を頭蓋内座標：ブレグマ側方２．０ｍｍ、前方１．２ｍｍ、３．０ｍｍ深度の硬膜内に移植した。処置は、移植３日後に開始した。群は以下のとおりとした（用量はすべて１００μｌのＨ_２Ｏ中）。

【0394】

【表31】

下記の表は、結果のまとめを示す。メジアン生存範囲およびログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）統計学的検定の結果を、試料の生存分布と比較している。

【0395】

【表32】

図２４および２５Ａ〜Ｄは、異なる処置群の各Ｃ５７ＢＬ／６マウスの体重増加を示す。各処置群のエンドポイントでの平均重量を以下の表に示す。図２６は、各処置群の４０日間にわたる平均重量を示すグラフである。

【0396】

【表33】

実施例３６．併用による相乗的細胞増殖阻害
化合物（Ｉ）とタモキシフェンの併用を、ＭＣＦ−７ 乳癌細胞においてインビトロで試験し、併用による細胞増殖阻害能を調べた。ある範囲の濃度をＭＴＴアッセイにより、以下に示すようにして試験した。最初のカラムは化合物（Ｉ）の濃度に相当する。

【0397】

【表34】

ＭＴＴ細胞増殖のデータを、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ）によって解析した。このプログラムでは、メジアン効果原則（７７）を使用し、２つの薬物間の相互作用が示される。各用量の組合せについて、このプログラムにより組合せ指数（ＣＩ）が作成される。＜１、１または＞の組合せ指数（ＣＩ）は、それぞれ相乗作用、相加作用または拮抗作用を表す。図２７は、１００ｎＭタモキシフェン＋７５ｎＭ化合物（Ｉ）での相乗的増殖阻害効果を示す。この組合せのＣＩ値は０．５０５であると算出された。

【0398】

他の実施形態
本発明を、その詳細説明とともに説明したが、前述の説明は説明を意図し、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって規定される。他の態様、利点および変形例は、以下の特許請求の範囲の範囲に含まれる。当業者には、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書において形態および詳細において種々の変更がなされ得ることが理解されよう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図26】

【図27】