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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5949556
(24)【登録日】2016年6月17日
(45)【発行日】2016年7月6日
(54)【発明の名称】融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20160623BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20160623BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20160623BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20160623BHJP
H01M 14/00 20060101ALN20160623BHJP
B01J 35/02 20060101ALN20160623BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 AZNA
C07K19/00
C12N1/21
C07K14/195
!H01M14/00 P
!B01J35/02 J
【請求項の数】16
【全頁数】43
(21)【出願番号】特願2012-549833(P2012-549833)
(86)(22)【出願日】2011年12月20日
(86)【国際出願番号】JP2011079529
(87)【国際公開番号】WO2012086647
(87)【国際公開日】20120628
【審査請求日】2014年8月26日
(31)【優先権主張番号】特願2010-286470(P2010-286470)
(32)【優先日】2010年12月22日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2011-173230(P2011-173230)
(32)【優先日】2011年8月8日
(33)【優先権主張国】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用 日本生物工学会 第６３回日本生物工学会大会講演要旨集（平成２３年８月２５日発行）第１２ページに発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用 日本生物工学会 生物工学会誌第８９巻第１１号（平成２３年１１月２５日発行）第６７０ページに発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用 応用物理学会 ２０１１年秋季 第７２回応用物理学会学術講演会 「講演予稿集」（平成２３年８月１６日発行）第１２−３４２ページに発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用 電気通信回線を通じて平成２３年１１月１日に発表（ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｅｎ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ａｒｔｉｃｌｅｌａｎｄｉｎｇ／２０１１／ｃｃ／ｃ１ｃｃ１５２２１ａ）
(73)【特許権者】
【識別番号】000000066
【氏名又は名称】味の素株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100089118
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 宏明
(74)【代理人】
【識別番号】100113103
【弁理士】
【氏名又は名称】香島 拓也
(72)【発明者】
【氏名】井之上 一平
(72)【発明者】
【氏名】山下 一郎
(72)【発明者】
【氏名】鄭 彬
(72)【発明者】
【氏名】安枝 寿
(72)【発明者】
【氏名】浦岡 行治
(72)【発明者】
【氏名】石河 泰明
【審査官】
西村 亜希子
(56)【参考文献】
【文献】
特開２０１０−２４０７９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００６／０６８２５０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
Nanotechnology，２０１０年 １月，Vol.21, No.4，045305，DOI:10.1088/0957-4484/21/4/045305
【文献】
Cell. Mol. Life Sci.，２０１０年 ２月，Vol.67, No.3，pp.341-351
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／０９
Ｃ０７Ｋ １４／１９５
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｂ０１Ｊ ３５／０２
Ｈ０１Ｍ １４／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｄｐｓ、ならびに第１の標的物質に結合し得る第１のペプチド部分および第２の標的物質に結合し得る第２のペプチド部分を含み、前記第１および第２のペプチド部分がそれぞれ異なる標的物質に結合し得るペプチド部分であり、前記第１のペプチド部分のＣ末端部が前記ＤｐｓのＮ末端部に融合し、前記第２のペプチド部分のＮ末端部が前記ＤｐｓのＣ末端部に融合している、融合タンパク質。
【請求項2】
Ｄｐｓが、配列番号４または配列番号２９のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記第１および第２のペプチド部分がそれぞれ、金属素材、シリコン素材または炭素素材に結合し得るペプチド部分である、請求項１または２記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記金属素材に結合し得るペプチド部分が金属の析出作用を有する、請求項３記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記第１および第２のペプチド部分の一方が炭素素材に結合し得るものであり、他方が金属素材またはシリコン素材に結合し得るものである、請求項３または４記載の融合タンパク質。
【請求項6】
金属素材がチタン素材または亜鉛素材である、請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項7】
シリコン素材が、シリコン、またはシリコンの酸化物である、請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項8】
炭素素材がカーボンナノ素材である、請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項9】
融合タンパク質が、配列番号２、配列番号２７または配列番号３２のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項10】
融合タンパク質の多量体であって、
内腔を有し、
融合タンパク質が、Ｄｐｓ、ならびに第１の標的物質に結合し得る第１のペプチド部分および第２の標的物質に結合し得る第２のペプチド部分を含み、前記第１および第２のペプチド部分がそれぞれ異なる標的物質に結合し得るペプチド部分であり、前記第１のペプチド部分のＣ末端部が前記ＤｐｓのＮ末端部に融合し、前記第２のペプチド部分のＮ末端部が前記ＤｐｓのＣ末端部に融合している、多量体。
内腔を有し、
融合タンパク質が、Ｄｐｓ、ならびに第１の標的物質に結合し得る第１のペプチド部分および第２の標的物質に結合し得る第２のペプチド部分を含み、前記第１および第２のペプチド部分がそれぞれ異なる標的物質に結合し得るペプチド部分であり、前記第１のペプチド部分のＣ末端部が前記ＤｐｓのＮ末端部に融合し、前記第２のペプチド部分のＮ末端部が前記ＤｐｓのＣ末端部に融合している、多量体。
【請求項11】
内腔中に物質を含む、請求項１０記載の多量体。
【請求項12】
複合体であって、
請求項１０または１１記載の多量体、ならびに第１および第２の標的物質を含み、
第１の標的物質が、前記融合タンパク質中の第１のペプチド部分に結合し、かつ第２の標的物質が、前記融合タンパク質中の第２のペプチド部分に結合している、複合体。
請求項１０または１１記載の多量体、ならびに第１および第２の標的物質を含み、
第１の標的物質が、前記融合タンパク質中の第１のペプチド部分に結合し、かつ第２の標的物質が、前記融合タンパク質中の第２のペプチド部分に結合している、複合体。
【請求項13】
請求項１〜９のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項14】
請求項１３記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項15】
請求項１４記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項16】
形質転換体がエスケリシア・コリである、請求項１５記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、融合タンパク質に関する。具体的には、本発明は、内腔を有する多量体を形成し得る融合タンパク質、融合タンパク質の多量体、および融合タンパク質の多量体を含む複合体などに関する。【背景技術】
【0002】
フェリチンは、２４量体を形成し、それにより生じる内腔中に、生体に必須の金属である鉄を貯蔵している。フェリチン様タンパク質は動植物から微生物まで普遍的に存在しており、生体あるいは細胞中の鉄元素のホメオスタシスに深く関わっている。微生物の有するフェリチン様タンパク質の一つはＤｐｓ（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）と呼ばれる。Ｄｐｓは、分子量約１８ｋＤａの単量体単位からなる１２量体を形成することにより、約５ｎｍの直径の内腔を有する外径９ｎｍからなるかご状構造を形成し、この内腔中に、鉄分子を酸化鉄ナノ粒子として貯蔵できる。さらに、フェリチンでは、鉄以外にも、ベリリウム、ガリウム、マンガン、リン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、クロムなどの金属の酸化物、また、セレン化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉄、硫化カドミウムなどの半導体・磁性体などのナノ粒子を人工的に貯蔵させられることが示されており、半導体素材工学分野や医療分野での応用研究が盛んにおこなわれている（非特許文献１）。【0003】
また、生体素材および無機素材または有機素材の複合体を作製することを目的として、無機素材または有機素材に対して結合し得るペプチドが、ファージを用いたスクリーニングにより開発されている。このようなペプチドとしては、例えば、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）およびカーボンナノホン（ＣＮＨ）（非特許文献２、特許文献１、特許文献３）、酸化チタン（特許文献２）、金（非特許文献３）、酸化亜鉛（非特許文献５）、酸化ゲルマニウム（非特許文献６）、ならびに硫化亜鉛および硫化カドミウム（非特許文献７）などを認識するペプチドが知られている。【0004】
炭素結晶構造であるＣＮＴやＣＮＨなどのナノ黒鉛構造物は、その電気特性や構造から他のナノ素材との複合体を構築することで電子素材や触媒、光素材および医療技術などへの応用が期待されており、ＣＮＨ結合ペプチドと融合したフェリチンを用いてナノ黒鉛構造物と金属ナノ粒子を結合させナノ複合体を構築する技術が報告されている（非特許文献２、特許文献３）。【0005】
また、酸化チタンは、光を受けることで、光エネルギーによりその表面に還元力を有する電子と酸化力を有する正孔を発生する。その酸化力や還元力を利用することで、抗菌素材や脱臭素材、大気浄化素材、防汚性素材、水素発生触媒、太陽電池などへの応用が試みられている（非特許文献１１）。例えば、光によって酸化チタン表面に発生した酸化力を使って水酸化物イオンを酸化すれば、強い酸化力を有するラジカルを発生させることができ、そのラジカルは、その酸化力により殺菌効果やアセトアルデヒドやアンモニアなどの臭い物質の分解効果、空気中のＮＯｘやホルムアルデヒドなど有害物質の分解効果、そして埃などを分解する効果を高めることができる。また、発生した酸化還元力を用いて水を電気分解し、酸素と水素を発生させ、水素をクリーンなエネルギーとして利用することも試みられている。さらに、光によって酸化チタン内に発生した励起電子を取り出すことで、太陽電池としても利用することができる。また、色素を増感剤として酸化チタン表面に吸着させ、その色素に光が照射されることで発生する励起電子を取り出すことで、太陽電池として機能させることができる。【0006】
酸化チタンを使ったそれらの素材の性能を向上させるためには、酸化チタンの表面積や電気特性を向上させることが考えられる。すなわち、酸化チタンの表面積を増大させることで、光エネルギーにより発生する還元力を有する電子と酸化力を有する正孔の総数や表面に吸着した色素の総数を増加させることができる。また、電気特性を向上させることで、光により励起した電子が正孔と再結合してしまう確率を低くすることができる。そのため、より多くの電子や酸化力を得ることができる。【0007】
現在までに、酸化チタンと融合された金属内包性タンパク質フェリチンを利用して、シリコン基板上にナノ粒子を配置し、そのナノ粒子の上に酸化チタン膜または酸化シリコン膜を形成させ、その酸化膜の上にナノ粒子を配置することによる、酸化膜とナノ粒子とを積層する技術が知られている（特許文献４）。さらに、酸化チタンと融合された金属内包性タンパク質フェリチンを利用して、コバルトや酸化鉄の金属ナノ粒子を内包するタンパク質をチタンで描かれたパターンの上に配向させた例も報告されている（非特許文献８）。【0008】
さらに、ＣＮＴ結合ペプチドおよび酸化チタン結合ペプチドが融合した３５個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを用いることで、ＣＮＴ表面を酸化チタンで被膜し、ＣＮＴの電気特性を変化させる技術も報告されている（非特許文献１０）。また、ウイルスを用いてカーボンナノチューブを酸化チタンでコーティングする技術（非特許文献１１）、およびポリオキソメタレート（ｐｏｌｙｏｘｏｍｅｔａｌａｔｅ）を用いてカーボンナノチューブをチタンでコーティングする技術（非特許文献１２）が、報告されている。【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】国際公開第２００６／０６８２５０号
【特許文献2】国際公開第２００５／０１００３１号
【特許文献3】特開２００４−１２１１５４号公報
【特許文献4】国際公開第２００６／１２６５９５号
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０１０，ｖｏｌ．１８００，ｐ．８４６．
【非特許文献2】Ｓ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００３，ｖｏｌ．２，ｐ．１９６．
【非特許文献3】Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．１５．ｐ．２６９．
【非特許文献4】Ｒ．Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＷＳＥＡＳ Ｔｒａｎｓ．Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．，２００６，ｖｏｌ．３６，ｐ．４４３．
【非特許文献5】Ｋ．Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｂｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，ｖｏｌ．６６．ｐ．１０．
【非特許文献6】Ｍ．Ｂ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，ｖｏｌ．１５．ｐ．１７７６．
【非特許文献7】Ｃ．Ｅ．Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００３，ｖｏｌ．１３．ｐ．２４１４．
【非特許文献8】Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００７，ｖｏｌ．７．ｐ．３２００．
【非特許文献9】Ｋ．Ｉｗａｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，２００７，ｖｏｌ．１９．ｐ．３１０５．
【非特許文献10】Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４４．
【非特許文献11】Ｍ．Ａ．Ｆｏｘ ａｎｄ Ｍ．Ｔ．Ｄｕｌａｙ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１９９３，ｖｏｌ．９３，ｐ．３４１．
【非特許文献12】Ｘｉａｎｇｎａｎ Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，ｖｏｌ．６，ｐ．３７７−３８４
【非特許文献13】Ｂｉｎ Ｆｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，ｖｏｌ．１７，ｐ．１５８９−１５９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
しかしながら、上述した従来の技術では、光触媒活性または電気特性等に優れたデバイスおよび素材等の開発に十分ではない。具体的には、ＣＮＴ結合ペプチドと酸化チタン結合ペプチドが融合したポリペプチドの使用により、ＣＮＴを酸化チタンで被膜させ電気的性質を変化させることは可能であったが、上記ポリペプチドのサイズは小さいため、酸化チタンの表面積を増大させ光触媒活性を向上させることは困難であった。また、ＣＮＴと酸化チタンの複合体の内部に金属ナノ粒子を導入し、新たな電気的特性を付与させることも困難であった。【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、鋭意検討した結果、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに第１の標的物質に結合し得る第１のペプチド部分および第２の標的物質に結合し得る第２のペプチド部分を含む融合タンパク質の多量体が、光触媒活性または電気特性等に優れたデバイスおよび素材等の作製等に有用であり得ることなどを見出し、本願発明を完成するに至った。【0013】
すなわち、本願発明は、以下のとおりである。〔１〕内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに第１の標的物質に結合し得る第１のペプチド部分および第２の標的物質に結合し得る第２のペプチド部分を含む、融合タンパク質。
〔２〕前記第１および第２のペプチド部分が、それぞれ異なる標的物質に結合し得るペプチド部分である、〔１〕の融合タンパク質。
〔３〕前記第１のペプチド部分のＣ末端部が前記ポリペプチド部分のＮ末端部に融合し、前記第２のペプチド部分のＮ末端部が前記ポリペプチド部分のＣ末端部に融合している、〔１〕または〔２〕の融合タンパク質。
〔４〕内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分がＤｐｓである、〔３〕の融合タンパク質。
〔５〕Ｄｐｓが、配列番号４または配列番号２９のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、〔４〕の融合タンパク質。
〔６〕第１の標的物質および第２の標的物質が、金属素材、シリコン素材または炭素素材である、〔１〕〜〔５〕のいずれかの融合タンパク質。
〔７〕金属素材がチタン素材または亜鉛素材である、〔６〕の融合タンパク質。
〔８〕シリコン素材が、シリコン、またはシリコンの酸化物である、〔６〕の融合タンパク質。
〔９〕炭素素材がカーボンナノ素材である、〔６〕の融合タンパク質。
〔１０〕融合タンパク質が、配列番号２、配列番号２７または配列番号３２のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、〔１〕の融合タンパク質。
〔１１〕融合タンパク質の多量体であって、
内腔を有し、
融合タンパク質が、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに第１の標的物質に結合し得る第１のペプチド部分および第２の標的物質に結合し得る第２のペプチド部分を含む、多量体。
〔１２〕内腔中に物質を含む、〔１１〕の多量体。
〔１３〕複合体であって、
〔１１〕または〔１２〕の多量体、ならびに第１および第２の標的物質を含み、
第１の標的物質が、前記融合タンパク質中の第１のペプチド部分に結合し、かつ第２の標的物質が、前記融合タンパク質中の第２のペプチド部分に結合している、複合体。
〔１４〕〔１〕〜〔１０〕のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１５〕〔１４〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１６〕〔１５〕の発現ベクターを含む形質転換体。
〔１７〕形質転換体がエスケリシア・コリである、〔１６〕の形質転換体。
【発明の効果】
【0014】
本発明の融合タンパク質、多量体および複合体は、電気特性および／または光触媒活性の向上した新規デバイスの作製、ならびに医療、バイオ研究分野等の分野に有用である。例えば、酸化チタンに結合し得るペプチド部分およびカーボンナノチューブに結合し得るペプチド部分を含む融合タンパク質の使用により、抗菌素材、脱臭素材、大気浄化素材、防汚性素材、水素発生装置、太陽電池、半導体などの提供が可能になる。【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明は、融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに第１の標的物質に結合し得る第１のペプチド部分および第２の標的物質に結合し得る第２のペプチド部分を含み得る。【0017】
用語「内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分」とは、内部に空間を有する多量体を、ポリペプチド部分の会合によって、形成する能力を有するポリペプチド部分をいう。このようなポリペプチド部分としては、幾つかのタンパク質が知られている。例えば、このようなポリペプチド部分としては、内腔を有する２４量体を形成し得るフェリチン、および内腔を有する多量体を形成し得るフェリチン様タンパク質が挙げられる。内腔を有する多量体を形成し得るフェリチン様タンパク質としては、例えば、内腔を有する１２量体を形成し得るＤｐｓが挙げられる。内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分は、微生物、植物および動物等の任意の生物に由来する、天然に生じるタンパク質であっても、または天然に生じるタンパク質の変異体であってもよい。以下、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分を、単にポリペプチド部分と称する場合がある。【0018】
一実施形態では、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分は、Ｄｐｓである。本発明で用いられる用語「Ｄｐｓ（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）」とは、発明の背景において説明したような、内腔を有する１２量体を形成し得るタンパク質をいう。用語「Ｄｐｓ」には、天然に生じるＤｐｓまたはその変異体が含まれる。天然に生じるＤｐｓの変異体としては、天然に生じるＤｐｓと同様に、１２量体を形成したときに、そのＮ末端部およびＣ末端部が１２量体の表面に露出し得るものが好ましい。なお、Ｄｐｓは、それが由来する細菌の種類によってはＮａｐＡ、バクテリオフェリチン、ＤｌｐまたはＭｒｇＡと称呼される場合があり、また、Ｄｐｓには、ＤｐｓＡ、ＤｐｓＢ、Ｄｐｓ１、Ｄｐｓ２等のサブタイプが知られている（Ｔ．Ｈａｉｋａｒａｉｎｅｎ ａｎｄ Ａ．Ｃ．Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｎ， Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２０１０ ｖｏｌ．６７，ｐ．３４１を参照）。したがって、本発明では、用語「Ｄｐｓ」は、これらの別名で称呼されるタンパク質も含むものとする。【0019】
Ｄｐｓが由来し得る微生物としては、Ｄｐｓを産生する微生物である限り特に限定されないが、例えば、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、エスケリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、サーモシネココッカス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびデイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ならびにコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が挙げられる。【0020】
リステリア属に属する細菌としては、例えば、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。スタフィロコッカス属に属する細菌としては、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。バチルス属に属する細菌としては、例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。ストレプトコッカス属に属する細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）が挙げられる。ビブリオ属に属する細菌としては、例えば、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）が挙げられる。エスケリシア属に属する細菌としては、例えば、エスケリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられる。ブルセラ属に属する細菌としては、例えば、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ Ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）が挙げられる。ボレリア属に属する細菌としては、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）が挙げられる。マイコバクテリウム属に属する細菌としては、例えば、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）が挙げられる。カンピロバクター属に属する細菌としては、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）が挙げられる。サーモシネココッカス属に属する細菌としては、例えば、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ Ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）が挙げられる。デイノコッカス属に属する細菌としては、例えば、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）が挙げられる。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が挙げられる。【0021】
好ましい実施形態では、Ｄｐｓは、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対して７０％以上の類似性パーセントを示すアミノ酸配列からなるタンパク質であり得る。リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対する、Ｄｐｓのアミノ酸配列の類似性パーセントは、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であり得る。Ｄｐｓは、二次構造として、５箇所のα−ヘリックス部分を有する（Ａ．Ｉｌａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２０００，Ｖｏｌ．７，ｐ．３８．、Ｒ．Ａ．Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１９９８，Ｖｏｌ ５，ｐ．２９４．、およびＲ．Ｒ．Ｃｒｉｃｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｖｏｌ．１８００，ｐ．７０６.を参照）。Ｄｐｓの機能の保持の観点からは、上記二次構造の維持が重要である。したがって、例えば、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対して７０％以上の類似性パーセントを示すアミノ酸配列からなるタンパク質を作製する場合、上記二次構造が維持されるように、部位特異的変異誘発法等の周知の変異導入法により所望の変異が導入され得る。リステリア・イノキュアに由来するＤｐｓを例に挙げて、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸残基の位置と、上記二次構造等との間の関係を、Ｎ末端側から具体的に説明すると、以下のとおりである：（ｉ）１〜８位のアミノ酸残基（１２量体表面上に露出しているＮ末端領域）；（ｉｉ）９〜３３位のアミノ酸残基（α−ヘリックス）；（ｉｉｉ）３９〜６６位のアミノ酸残基（α−ヘリックス）；（ｉｖ）７５〜８１位のアミノ酸残基（α−ヘリックス）；（ｖ）９５〜１２２位のアミノ酸残基（α−ヘリックス）；（ｖｉ）１２６〜１４９位のアミノ酸残基（α−ヘリックス）；（ｖｉｉ）１５０〜１５６位のアミノ酸残基（１２量体表面上に露出しているＣ末端領域）。ここで、内腔を有する多量体を形成する能力の保持には、上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうち、（ｉｉ）〜（ｖｉ）が重要であり得る。ＤｐｓのＮ末端部の１２量体表面上への露出には、ＤｐｓのＮ末端部に隣接するα−ヘリックスが１２量体の外側に向いている必要があることから、（ｉ）および（ｉｉ）、特に（ｉｉ）が重要であり得る。ＤｐｓのＣ末端部の１２量体表面上への露出には、ＤｐｓのＣ末端部に隣接するα−ヘリックスが１２量体の外側に向いている必要があることから、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）、特に（ｖｉ）が重要であり得る。したがって、上述した重要な領域中に存在するアミノ酸残基を変異させる場合には、保存的アミノ酸置換が好ましい。一方、上述した重要な領域以外の領域中に存在するアミノ酸残基を変異させる場合には、任意の変異が導入され得る。当業者は、これらの指針に基づき、天然に生じるＤｐｓに対して、その機能が保持されるような所望の変異を導入することにより、天然に生じるＤｐｓの変異体を容易に作製できる。【0022】
アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置は、上述したとおり当業者に明らかであるが、配列アライメントをさらに参考にして、天然に生じるＤｐｓの変異体を作製してもよい。具体的には、当業者は、１）複数のＤｐｓのアミノ酸配列（例、配列番号４で表されるアミノ酸配列、および他のＤｐｓのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、上述した二次構造情報単独でも、Ｄｐｓのアミノ酸配列において変異を導入すべき位置を特定でき、また、二次構造情報および配列アライメント情報を併用して、Ｄｐｓのアミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置を特定できる。【0023】
一実施形態では、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対して７０％以上の類似性パーセントを示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、欠失、置換、付加および挿入）を含むアミノ酸配列からなり、かつＤｐｓの機能を保持するタンパク質であり得る。１または数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。Ｄｐｓのアミノ酸残基の変異に関する用語「１または数個」が示す数は、例えば、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１、２、３、４または５個である。【0024】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。【0025】
別の実施形態では、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対して７０％以上の類似性パーセントを示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号３または配列番号２８で表されるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつＤｐｓの機能を保持するタンパク質であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性（例、同一性または類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。【0026】
特定の実施形態では、Ｄｐｓは、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性パーセントを示すアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。Ｄｐｓのアミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。【0027】
更に特定の実施形態では、Ｄｐｓは、配列番号４または配列番号２９で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなる、またはそれを含むタンパク質であってもよい。配列番号４または配列番号２９で表されるアミノ酸配列に対する、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。【0028】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性（例、同一性または類似性）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ Ｓｉｚｅ ｔｏ Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。【0029】
用語「第１の標的物質に結合し得る第１のペプチド部分」および「第２の標的物質に結合し得る第２のペプチド部分」とは、任意の標的物質に対して親和性を有するペプチドを有し、かつ当該標的物質に対して結合できる部分をいう。第１のペプチド部分および第２のペプチド部分は、同じであっても、互いに異なっていてもよい。標的物質に対して親和性を有する種々のペプチドが知られているので、本発明では、このようなペプチドを有する部分を、上記ペプチド部分として用いることができる。以下、第１のペプチド部分および第２のペプチド部分を、単に、標的物質に結合し得るペプチド部分と称する場合がある。表現「標的物質に結合し得るペプチド部分」は、用語「第１の標的物質に結合し得る第１のペプチド部分」および「第２の標的物質に結合し得る第２のペプチド部分」を包括する表現であり、また、これらの表現は交換可能に使用される。標的物質に結合し得るペプチド部分は、任意の標的物質に対して親和性を有する１個のペプチドのみを有していてもよいし、あるいは任意の標的物質に対して親和性を有する同種または異種の複数（例、２個、３個、４個、５個または６個等の数個）のペプチドを有していてもよい。例えば、標的物質に結合し得るペプチド部分が、任意の標的物質に対して親和性を有する異種の複数のペプチドを有する場合、当該ペプチド部分としては、カーボンナノ素材と結合し得るＰ１ペプチド（配列番号１３）と、チタン素材またはシリコン素材に結合し得るＲ５ペプチド（配列番号１５）との融合ペプチドであるＰ１Ｒ５ペプチド（ＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬＧＧＧＧＨＳＳＹＷＹＡＦＮＮＫＴ（配列番号２１））を用いることができる（例、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４を参照）。標的物質に結合し得るペプチド部分が上記のような複数のペプチドを有する場合、複数のペプチドは、当該ペプチド部分中に任意の順序で融合され得る。融合は、アミド結合を介して達成され得る。融合は、直接的なアミド結合、あるいは１個のアミノ酸残基（例、メチオニン）または数個（例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１５個または２〜１０個、最も好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチド（ペプチドリンカー）が介在したアミド結合により達成され得る。種々のペプチドリンカーが知られているので、本発明でも、このようなペプチドリンカーを使用することができる。【0030】
標的物質（あるいは第１または第２の標的物質）としては、例えば、無機素材および有機素材、あるいは導体素材、半導体素材および磁性体素材が挙げられる。具体的には、このような標的物質としては、金属素材、シリコン素材、炭素素材、低分子化合物（例、ポルフィリン等の生体物質、放射性物質、蛍光物質、色素、薬物）、ポリマー（例、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリエチレンオキシドまたはポリ（Ｌ−乳酸）等の疎水性有機ポリマーまたは伝導性ポリマー）、タンパク質（例、オリゴペプチドまたはポリペプチド）、核酸（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）、糖質（例、モノサッカリド、オリゴサッカリドまたはポリサッカリド）、脂質が挙げられる。【0031】
金属素材としては、例えば、金属および金属化合物が挙げられる。金属としては、例えば、チタン、クロム、亜鉛、鉛、マンガン、カルシウム、銅、カルシウム、ゲルマニウム、アルミニウム、ガリウム、カドミウム、鉄、コバルト、金、銀、プラチナ、パラジウム、ハフニウム、テルルが挙げられる。金属化合物としては、例えば、金属の酸化物、硫化物、炭酸化物、砒化物、塩化物、フッ化物およびヨウ化物、ならびに金属間化合物が挙げられる。金属の酸化物としては、種々の酸化物が挙げられる。このような酸化物についてチタンの酸化物を例として説明すると、チタンの酸化物としては、例えば、一酸化チタン（ＣＡＳ番号１２１３７−２０−１）、二酸化チタン（ＣＡＳ番号１３４６３−６７−７）、二酸化チタン（アナタース、アナターゼ：ＣＡＳ番号１３１７−７０−０）、二酸化チタン（ルチル：１３１７−８０−２）、三酸化二チタン（ＣＡＳ番号１３４４−５４−３）が挙げられる。より具体的には、金属化合物としては、上述したようなチタンの酸化物、酸化クロム、酸化亜鉛、酸化鉛、酸化マンガン、ゼオライト、炭酸カルシウム、酸化銅、酸化マンガンカルシウム、酸化ゲルマニウム、酸化アルミニウム、酸化ハフニウム、チタンジルコン酸鉛、砒化ガリウム、硫化亜鉛、硫化鉛、硫化カドミウム、白金鉄、白金コバルト、カドミウムテルルが挙げられる。【0032】
シリコン素材としては、例えば、シリコンまたはシリコン化合物が挙げられる。シリコン化合物としては、例えば、シリコンの酸化物（例、一酸化ケイ素（ＳｉＯ）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2））、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、シラン（ＳｉＨ４）、シリコーンゴムが挙げられる。【0033】
炭素素材としては、例えば、カーボンナノ素材（例、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、カーボンナノホン（ＣＮＨ））、フラーレン（Ｃ６０）、グラフェンシート、グラファイトが挙げられる。【0034】
標的物質に結合し得るペプチド部分は、上述したような標的物質に対して親和性を有する限り特に限定されない。標的物質に対して親和性を有する種々のペプチドが知られており、また、開発されている。例えば、生体素材および無機素材または有機素材の複合体を作製することを目的として、無機素材または有機素材に対して結合し得るペプチドが、ファージを用いたスクリーニング等の手法により開発されている。このような手法により開発されたペプチドとしては、例えば、チタンおよびチタンの酸化物ならびに銀（Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、国際公開第２００５／０１００３１号）、金（Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．１５．ｐ．２６９．）、酸化亜鉛（Ｋ．Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，ｖｏｌ．６６．ｐ．１０．、Ｕｍｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１７，２５７１−２５７５（２００５））、酸化ゲルマニウム（Ｍ．Ｂ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，ｖｏｌ．１５．ｐ．１７７６．）、硫化亜鉛および硫化カドミウム（Ｃ．Ｅ．Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００３，ｖｏｌ．１３．ｐ．２４１４．）等の金属素材に結合し得るペプチド；シリコンおよびシリコンの酸化物（Ｈ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．，２００６，ｖｏｌ．７８，，ｐ．４８７２、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４、Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、国際公開第２００５／０１００３１号）等のシリコン素材に結合し得るペプチド；カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、カーボンナノホン（ＣＮＨ）等の炭素素材に結合し得るペプチド（Ｓ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００３，ｖｏｌ．２，ｐ．１９６．および特開２００４−１２１１５４号公報）；ならびに疎水性有機ポリマー等のポリマーに結合し得るペプチド（特開２００８−１３３１９４号公報）が挙げられる。したがって、本発明でも、標的物質に結合し得るペプチド部分として、このようなペプチドを使用することができる。【0035】
なお、金属に結合し得るペプチドは、金属の析出（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）作用を有し得ること、および金属化合物に結合し得るペプチドは、金属化合物の析出作用を有し得ることが知られている（Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、Ｍ．Ｕｍｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２００５，ｖｏｌ．１７，ｐ．２５７１．）。したがって、標的物質に結合し得るペプチド部分として、金属素材（金属または金属化合物）に結合し得るペプチドを用いる場合、金属素材に結合し得るペプチドは、このような析出作用を有し得る。【0036】
ポリペプチド部分、ならびに第１および第２のペプチド部分の融合は、アミド結合を介して達成され得る。融合は、直接的なアミド結合、あるいは１個のアミノ酸残基（例、メチオニン）または数個（例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１５個または２〜１０個、最も好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチド（ペプチドリンカー）が介在したアミド結合により達成され得る。種々のペプチドリンカーが知られているので、本発明でも、このようなペプチドリンカーを使用することができる。【0037】
本発明の融合タンパク質において、ポリペプチド部分、ならびに第１および第２のペプチド部分が融合する順序は、特に限定されず、１）ポリペプチド部分のＮ末端部およびＣ末端部がそれぞれ第１および第２のペプチド部分のＣ末端部およびＮ末端部（またはＮ末端部およびＣ末端部）と融合していてもよいし、あるいは２）ポリペプチド部分のＮ末端部が第１のペプチド部分のＣ末端部と融合し、かつ当該第１のペプチド部分のＮ末端部が第２のペプチド部分のＣ末端部とさらに融合していてもよく、または３）ポリペプチド部分のＣ末端部が第１のペプチド部分のＮ末端部と融合し、かつ当該第１のペプチド部分のＣ末端部が第２のペプチド部分のＮ末端部とさらに融合していてもよい。例えば、ポリペプチド部分としてフェリチンを用いる場合、フェリチンはそのＮ末端部が多量体の表面上に露出され、そのＣ末端部は表面上に露出しないことから、好ましくは、フェリチンは、上記２）の順序で融合される。一方、ポリペプチド部分としてＤｐｓを用いる場合、ＤｐｓはＮ末端部およびＣ末端部の両方が多量体の表面上に露出し得ることから、Ｄｐｓは、上記１）〜３）のいずれかの順序で融合され得る。【0038】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ポリペプチド部分のＮ末端側およびＣ末端側にそれぞれ第１および第２のペプチド部分（それぞれ、１個または複数）を有し得る。換言すれば、第１のペプチド部分のＣ末端部は、ポリペプチド部分のＮ末端部と融合され、かつ、第２のペプチド部分のＮ末端部は、ポリペプチド部分のＣ末端部と融合される。【0039】
第１のペプチド部分は、翻訳開始コドンによりコードされるメチオニン、またはメチオニンをＮ末端に含む部分を、第１のペプチド部分のＮ末端側に有するように設計され得る。このような設計により、本発明の融合タンパク質の翻訳が促進され得る。メチオニンをＮ末端に含むペプチド部分は、数個（例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１５個または２〜１０個、最も好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチドであり得る。【0040】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、第１および第２のペプチド部分が異なる標的物質に結合し得る。第１および第２のペプチド部分が結合する標的物質の組合せとしては、例えば、無機素材と有機素材との組合せ、２種の無機素材の組合せ、２種の有機素材の組合せが挙げられる。より具体的には、このような組合せとしては、金属素材とシリコン素材との組合せ、金属素材と炭素素材との組合せ、シリコン素材と炭素素材との組合せ、２種の金属素材の組合せ、２種のシリコン素材の組合せ、２種の炭素素材の組合せが挙げられる。したがって、第１および第２のペプチド部分の組合せは、上述したような標的物質に結合し得るペプチド部分の組合せであり得る。【0041】
より好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、第１および第２のペプチド部分の一方が炭素素材に結合し、かつ、他方が金属素材またはシリコン素材に結合し得る。換言すれば、本発明の融合タンパク質は、第１のペプチド部分として、炭素素材に結合し得るペプチド部分を有し、かつ、第２のペプチド部分として、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分を有するか、あるいは、第１のペプチド部分として、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分を有し、かつ、第２のペプチド部分として、炭素素材に結合し得るペプチド部分を有する。【0042】
炭素素材に結合し得るペプチド部分としては、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）またはカーボンナノホン（ＣＮＨ）等のカーボンナノ素材に結合し得るペプチド部分が好ましい。このようなペプチド部分としては、例えば、後述する実施例および特開２００４−１２１１５４号公報に開示されるＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号６）、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４に開示されるＨＳＳＹＷＹＡＦＮＮＫＴ（配列番号１３）、ならびに特開２００４−１２１１５４号公報に開示されるＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号１４）、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。【0043】
金属素材に結合し得るペプチド部分としては、チタンまたはチタン化合物（例、酸化チタン）等のチタン素材に結合し得るペプチド部分、および亜鉛または亜鉛化合物（例、酸化亜鉛）等の亜鉛素材に結合し得るペプチド部分が好ましい。チタン素材に結合し得るペプチド部分としては、例えば、後述する実施例および国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるＲＫＬＰＤＡ（配列番号８）、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４に開示されるＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬ（配列番号１５）、ならびに国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるＲＫＬＰＤＡＰＧＭＨＴＷ（配列番号１６）およびＲＡＬＰＤＡ（配列番号１７）、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。亜鉛素材に結合し得るペプチド部分としては、例えば、後述する実施例およびＵｍｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１７，２５７１−２５７５（２００５）に開示されるＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰＧＧＧＳＣ（配列番号３０）、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。【0044】
シリコン素材に結合し得るペプチド部分としては、シリコンまたはシリコン化合物（例、シリコンの酸化物）に結合し得るペプチド部分が好ましい。このようなペプチド部分としては、例えば、後述する実施例および国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるＲＫＬＰＤＡ（配列番号８）、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４に開示されるＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬ（配列番号１５）、ならびに国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるＭＳＰＨＰＨＰＲＨＨＨＴ（配列番号１８）、ＴＧＲＲＲＲＬＳＣＲＬＬ（配列番号１９）、およびＫＰＳＨＨＨＨＨＴＧＡＮ（配列番号２０）、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。【0045】
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２、配列番号２７または配列番号３２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなる、またはそれを含むタンパク質であってもよい。配列番号２、配列番号２７または配列番号３２で表されるアミノ酸配列に対する、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。【0046】
本発明の融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質を発現する形質転換体から得ることができる。この形質転換体は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、本発明の融合タンパク質の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製することができる。本発明の融合タンパク質を発現させるための宿主としては、例えば、エスケリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエスケリシア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、およびバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞が挙げられる。【0047】
形質転換される宿主としてＥ．ｃｏｌｉについて詳述すると、Ｅ．ｃｏｌｉとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株亜種のＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。形質転換方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ （２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを作製し、これを用いて本発明の融合タンパク質を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。【0048】
本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ、Ｔ５プロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＱＥ３０およびその誘導体が挙げられる。【0049】
また、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子の下流に、転写終結配列であるターミネータを連結してもよい。このようなターミネータとしては、例えば、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータが挙げられる。【0050】
本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉに導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう「改変」とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。【0051】
ベクターは、形質転換体の選別のため、アンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製））。【0052】
得られた発現ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、得られたＥ．ｃｏｌｉを培養すると、本発明の融合タンパク質が発現される。【0053】
培地としては、例えば、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地が挙げられる。培養および生産誘導等の条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択することができる。【0054】
本発明の融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。本発明の融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質を産生する形質転換体を回収した後、形質転換体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、精製タンパク質、粗精製タンパク質、または本発明の融合タンパク質含有画分を得ることができる。【0055】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質の作製に用いることができる、上述したような、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびに当該発現ベクターを含む形質転換体を提供する。【0056】
本発明のポリヌクレオチドは、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分をコードするポリヌクレオチド部分、ならびに第１の標的物質に結合し得る第１のペプチド部分をコードする第１のポリヌクレオチド部分および第２の標的物質に結合し得る第２のペプチド部分をコードする第２のポリヌクレオチド部分を含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の融合タンパク質をコードするので、本発明の融合タンパク質に関する上述した説明に基づいて、種々の観点から特定することができる。【0057】
特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２６または配列番号３１で表されるヌクレオチド配列に対して９０％以上の同一性を示すヌクレオチド配列からなる、またはそれを含むポリヌクレオチドであってもよい。配列番号１、配列番号２６または配列番号３１で表されるヌクレオチド配列に対する、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の同一性パーセントは、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。【0058】
本発明はまた、融合タンパク質の多量体を提供する。本発明の多量体は、内腔を有し得る。本発明の多量体を構成する融合タンパク質は、上述したとおりである。本発明の多量体は、本発明の融合タンパク質を発現させることで、自律的に形成され得る。本発明の多量体を構成する単量体単位の数は、本発明の融合タンパク質におけるポリペプチド部分の種類により決定され得る。好ましくは、本発明の多量体は、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分としてＤｐｓを有し得ることから、１２量体であり得る。【0059】
本発明の多量体は、単量体単位として、単一の融合タンパク質から構成されるホモ多量体であってもよいが、異なる複数の種類（例、２種、３種、４種、５種または６種）の融合タンパク質から構成されるヘテロ多量体であってもよい。本発明の多量体では、多量体形成の観点から、多量体を構成する融合タンパク質中のポリペプチド部分は単一のポリペプチド部分であることが好ましいが、第１のペプチド部分および第２のペプチド部分は、多量体を構成する融合タンパク質間で異なるものであってもよい。例えば、本発明の多量体が２種の融合タンパク質から構成され、かつ当該融合タンパク質中のポリペプチド部分がそのＮ末端側およびＣ末端側にそれぞれ融合されたペプチド部分を有する場合、２種の融合タンパク質の組合せとしては、以下が挙げられる：（ｉ）第１のペプチド部分（ａ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ｂ）と、第１のペプチド部分（ｃ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ｄ）との組合せ；
（ｉｉ）第１のペプチド部分（ａ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ｂ）と、第１のペプチド部分（ａ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ｃ）との組合せ；
（ｉｉｉ）第１のペプチド部分（ａ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ｂ）と、第１のペプチド部分（ｃ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ｂ）との組合せ；
（ｉｖ）第１のペプチド部分（ａ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ｂ）と、第１のペプチド部分（ｃ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ａ）との組合せ；
（ｖ）第１のペプチド部分（ａ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ａ）と、第１のペプチド部分（ｂ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ｃ）との組合せ；
（ｖｉ）第１のペプチド部分（ａ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ｂ）と、第１のペプチド部分（ｂ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ａ）との組合せ；
（ｖｉｉ）第１のペプチド部分（ａ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ａ）と、第１のペプチド部分（ａ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ｂ）との組合せ；ならびに
（ｖｉｉｉ）第１のペプチド部分（ａ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ａ）と、第１のペプチド部分（ｂ）−ポリペプチド部分−第２のペプチド部分（ａ）との組合せ。
〔ここで、ａ〜ｄは、異なるペプチド部分（例、異なる標的物質に結合し得るペプチド部分）であることを示す。（ｉ）は、４種のペプチド部分を利用する態様であり、（ｉｉ）〜（ｖ）は、３種のペプチド部分を利用する態様であり、（ｖｉ）〜（ｖｉｉｉ）は、２種のペプチド部分を利用する態様である。〕
【0060】
具体的には、本発明の多量体が２種の融合タンパク質から構成され、かつ、ペプチド部分として、炭素素材に結合し得るペプチド部分、および金属素材（例、チタン素材、亜鉛素材）またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分を少なくとも用いる場合には、本発明の多量体を利用して作製されるデバイスの電気特性等を変化させる観点から、２種の融合タンパク質の組合せとしては、例えば、以下が挙げられる：（ｉ−１）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分と、第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−第２の他の素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉ−２）金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分と、第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第２の他の素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉ−３）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第２の他の素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉ−４）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分と、第２の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉ−５）第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第２の他の素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉ−６）第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第２の他の素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｉ−１）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分と炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｉ−２）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分と、炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｉ−３）金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｉ−４）金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｉ−５）第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分と、第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｉ−６）第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分と、第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｉｉ−１）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分と、第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｉｉ−２）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｉｉ−３）金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分と、第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｉｉ−４）金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分と、炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｉｉ−５）第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分と、炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｉｉ−６）第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｖ−１）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分と、第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｖ−２）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｖ−３）金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分と、第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｖ−４）金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分と、炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｖ−５）第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分と、炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｉｖ−６）第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｖ−１）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｖ−２）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分と、第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｖ−３）金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分と、炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｖ−４）金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分と、第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｖ−５）第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｖ−６）第１の他の素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−第１の他の素材に結合し得るペプチド部分と、炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｖｉ）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｖｉｉ−１）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分と、炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｖｉｉ−２）金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；
（ｖｉｉｉ−１）炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分と、金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−炭素素材に結合し得るペプチド部分との組合せ；ならびに
（ｖｉｉｉ−２）金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分と、炭素素材に結合し得るペプチド部分−ポリペプチド部分−金属素材またはシリコン素材に結合し得るペプチド部分。
【0061】
異なる複数の種類の融合タンパク質から構成される多量体は、例えば、異なる種類の融合タンパク質を発現する複数のベクター、または異なる種類の融合タンパク質を発現する単一のベクター（例、ポリシストロニックｍＲＮＡを発現し得るベクター）を、単一の宿主細胞に導入し、次いで、異なる種類の融合タンパク質を単一の宿主細胞中で発現させることにより、得ることができる。このような多量体はまた、単一の融合タンパク質から構成される第１の単量体と、単一の融合タンパク質（第１の多量体を構成する融合タンパク質とは異なる）から構成される第２の単量体とを、同一の媒体（例、緩衝液）中で共存させ、放置することにより、得ることができる。融合タンパク質の単量体は、例えば、本発明の多量体を、低ｐＨの緩衝液下に放置することにより調製することができる。詳細については、例えば、Ｂ．Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，ｖｏｌ．２１，ｐ．４４５６０２を参照のこと。【0062】
本発明の多量体は、内腔中に物質を含んでいてもよい。物質は、錯体または粒子（例、ナノ粒子、磁性粒子）のような形態で、本発明の多量体中に内包されていてもよい。当業者は、本発明の多量体の内腔のサイズ、および本発明の多量体における物質の取り込みに関与し得る領域（例、Ｃ末端の領域：Ｒ．Ｍ．Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．１３２８２を参照）中のアミノ酸残基の電荷特性等を考慮することにより、本発明の多量体に内包され得る物質を適切に選択できる。例えば、ポリペプチド部分としてＤｐｓを有する本発明の多量体の場合、Ｄｐｓは、４０〜６０ｎｍ３（直径 約５ｎｍ）の程度の内腔を有する。したがって、このような多量体に内包され得る物質のサイズは、例えば６０ｎｍ３以下、好ましくは４０ｎｍ３以下、より好ましくは２０ｎｍ３以下、さらにより好ましくは１０ｎｍ３以下、最も好ましくは５ｎｍ３以下であり得る。また、多量体における物質の取り込みに関与し得る領域中の電荷特性（例、正または負に荷電し得る側鎖を有するアミノ酸残基の種類および数）を変化させることにより、多量体の内腔中への物質の取り込みをより促進できることが報告されているので（例、Ｒ．Ｍ．Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．１３２８２を参照）、本発明においても、電荷特性が変化された領域を有する融合タンパク質の多量体を用いることができる。本発明の多量体に内包され得る物質としては、例えば、上述した標的物質と同様の無機素材が挙げられる。具体的には、本発明の多量体に内包され得る物質としては、上述したような金属素材やシリコン素材が挙げられる。より具体的には、このような物質としては、酸化鉄、ニッケル、コバルト、マンガン、リン、ウラン、ベリリウム、アルミニウム、硫化カドミウム、セレン化カドミウム、パラジウム、クロム、銅、銀、ガドリウム錯体、白金コバルト、酸化シリコン、酸化コバルト、酸化インジウム、白金、金、硫化金、セレン化亜鉛、カドミウムセレンが挙げられる。【0063】
本発明の多量体の内腔中への物質の内包は、周知の方法により行うことができ、例えば、フェリチンまたはＤｐｓ等のフェリチン様タンパク質の多量体の内腔中への物質の内包方法（例、Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．，ｌｅｔｔ．，２００５．ｖｏｌ．３３，ｐ．１１５８を参照）と同様にして行うことができる。具体的には、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液中に、本発明の多量体（または本発明の融合タンパク質）および内包されるべき物質を共存させ、次いで適切な温度（例、０〜３７℃）で放置することにより、本発明の多量体の内腔中に物質を内包させることができる（実施例３もまた参照のこと）。【0064】
本発明の多量体は、内腔中に物質を含む場合、異なる複数の種類（例、２種、３種、４種、５種または６種）の物質を含む、異なる複数の種類の多量体のセットとして提供されてもよい。例えば、本発明の多量体が２種の物質を含む２種の多量体のセットとして提供される場合、このようなセットは、各々別々に調製された、第１の物質を内包する第１の多量体と、第２の物質（第１の物質とは異なる）を内包する第２の多量体とを、組み合せることにより、得ることができる。上述したような融合タンパク質の多様なパターンと、内包物質の多様なパターンとを適宜組み合せることにより、非常に多様性に富む本発明の多量体を得ることができる。【0065】
本発明はまた、複合体を提供する。本発明の複合体は、本発明の多量体、ならびに第１および／または第２の標的物質を含み得る。本発明の複合体では、第１の標的物質が、融合タンパク質中の第１のペプチド部分に結合し得、かつ第２の標的物質が、融合タンパク質中の第２のペプチド部分に結合し得る。標的物質は、上述したとおりである。第１および第２の標的物質は、好ましくは、異なる標的物質である。標的物質は、他の物質または物体と結合していてもよい。例えば、標的物質は、固相（例、ウェルプレート等のプレート、支持体、基板、素子、デバイス）上に固定されていてもよい。したがって、本発明の複合体は、本発明の多量体、ならびに第１の標的物質および／または第２の標的物質を含み得る限り、他の物質または物体をさらに含んでいてもよい。【0066】
本発明の複合体を焼成することで、多孔質構造体を作製することができる。以下、図２０Ａ〜Ｅに示される模式図に基づいて、多孔質構造体を説明する。なお、図２０Ａ〜Ｅに示される多孔質構造体２０は、あくまで模式的なものである。例えば、タンパク質を消滅し得る温度条件下で本発明の複合体を焼成することにより、本発明の多量体が存在していた部位に第１の空孔部３２が形成された多孔質構造体１０を得ることができる（図２０Ａ、図２０Ｂ）。第２の空孔部は、第２の標的物質２０の析出過程および／または焼成過程において生じ得る空孔部を示している。また、タンパク質、および凝集体を構成する第１の標的物質３０（例、カーボンナノチューブ等の炭素素材）の双方を消滅し得る温度条件下で本発明の複合体を焼成することにより、本発明の多量体が存在していた部位に第１の空孔部３２が形成され、かつ第１の標的物質が存在していた部位に第３の空孔部３８が形成された多孔質構造体を得ることができる（図２０Ｄ）。本発明の複合体を構成する多量体の内腔中に物質（例、金属粒子３６）が内包されていた場合には、第１の空孔部３２中に物質（例、金属粒子３６）を残存させることができる（図２０Ｃ、Ｅ）。本発明の複合体を構成する多量体の内腔中に物質（例、金属粒子３６）が内包されており、かつ当該物質を溶融させた場合には、第１の空孔部３２の内側に当該物質からなる皮膜（例、金属皮膜３６ａ）を形成することができる（図２０Ｃ、Ｅ）。このように作製された多孔質構造体は、光触媒活性または電気特性等に優れたデバイスおよび素材等の開発に有用である。例えば、多孔質構造体は、光電変換素子（例、色素増感太陽電池等の太陽電池）、水素発生素子、水浄化素材、抗菌素材、半導体メモリ素子の作製における材料または構成要素として、有用である。【0067】
以下の実施例により、本発明を詳細に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。【実施例】
【0068】
実施例１：融合タンパク質ＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ−ＴＢＰ（ＣＤＴ）発現用株の作製Ｎ末端にカーボンナノホン結合ペプチド（ＣＮＨＢＰと標記；アミノ酸配列ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号６）からなる。国際公開第２００６／０６８２５０号を参照）が融合され、Ｃ末端に酸化チタン結合ペプチド（ＴＢＰと標記；アミノ酸配列ＲＫＬＰＤＡ（配列番号８）からなる。国際公開第２００５／０１００３１号を参照）が融合されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａの金属内包性タンパク質Ｄｐｓ（ＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ−ＴＢＰあるいはＣＤＴと標記、配列番号１および配列番号２）を下記の手順により構築した。
はじめに、合成ＤＮＡ（配列番号９、配列番号１０）の混合溶液を、９８℃で３０秒熱した後、速やかに４℃にすることでアニールさせた。その合成ＤＮＡ溶液とＬ．ｉｎｎｏｃｕａのＤｐｓ遺伝子が搭載されたｐＥＴ２０（Ｋ．Ｉｗａｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．ｌｅｔｔ．，２００７，ｖｏｌ．１９，ｐ．３１０５を参照）を各々制限酵素ＮｄｅＩで完全消化した。それらのＤＮＡ産物をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社、日本）でライゲーションし、Ｎ末端にＣＮＨＢＰが融合されたＤｐｓ（ＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ，ＣＤと略す）をコードする遺伝子が搭載されたプラスミドｐＥＴ２０−ＣＤを得た。続いて、ｐＥＴ２０−ＣＤを鋳型ＤＮＡ、配列番号１１および配列番号１２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製し、制限酵素ＤｐｎＩとＢａｍＨＩで消化した。制限酵素で消化されたＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用いてセルフライゲーションさせた。セルフライゲーションされたＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（タカラバイオ社、日本）に形質転換し、Ｎ末端にカーボンナノホン結合ペプチド、Ｃ末端にチタン結合ペプチドが融合されたＤｐｓ（ＣＤＴ）をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＣＤＴ）を保持したＪＭ１０９を構築した。その形質転換株からＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を使いｐＥＴ２０−ＣＤＴを精製した。最後にＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社、ＵＳＡ）をｐＥＴ２０−ＣＤＴで形質転換し、タンパク質発現用株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２０−ＣＤＴとした。一方、対照実験に用いるＣＤの発現株も、同様に作製した。
【0069】
実施例２：融合タンパク質ＣＤＴの精製ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２０−ＣＤＴを５ｍＬのＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含む）にて３７℃で培養した。培養開始１８時間後、その培養液を新しいＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含む） ３Ｌに植菌し、ＢＭＳ−１０／０５（ＡＢＬＥ社、日本）を用いて３７℃で２４時間振とう培養した。得られた菌体を遠心分離（５０００ ｒｐｍ、５分間）により回収し、−８０℃で保存した。冷凍保存された菌体の半分（６ ｇ）を５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） ４０ｍＬで懸濁した。次に、その懸濁液にＤｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、ＵＳＡ）を使い１秒間隔の超音波パルス（２００Ｗ、Ｄｕｔｙ ４５％）を１２分間与えることで、菌体を破砕した。その溶液を１５０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離（ＪＡ−２０、Ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒ社、ＵＳＡ）し、上清画分を回収した。回収された溶液を６０℃で２０分間加熱し、加熱後は速やかに氷上で冷却した。冷却された溶液を１７０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離（ＪＡ−２０）し、再度、上清を回収（約２０ｍＬ）した。その溶液をディスクフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰ ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で滅菌した。そして、その溶液をＡｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ−１５（ＮＭＷＬ．５００００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で液量が１０ｍＬになるまで限外ろ過濃縮し、タンパク質溶液を得た。
続いて、そのタンパク質溶液からゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、目的タンパク質であるＣＤＴ画分を精製した。すなわち、ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０））で平衡化したＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＵＳＡ）にタンパク質溶液１０ｍＬを注入し、流速１．４ｍＬ／分で分離精製を行い、ＣＤＴに相当するフラクションを回収した。その精製されたＣＤＴを用いて以下の実験を行った。また、対照実験として使用したＣＤも、ＣＤＴと同様に遺伝子発現を行い、その菌体を集菌、熱処理を経て、その後、熱処理後の上清に終濃度０．５ＭとなるようにＮａＣｌを加え、６０００ｒｐｍで５分間、遠心分離（ＪＡ−２０）し上清を捨て、沈殿物を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。その作業を３回繰り返してＣＤを精製した。また、Ｄｐｓの精製はＫ．Ｉｗａｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，２００７，ｖｏｌ．１９．ｐ．３１０５．に従った。
【0070】
実施例３：融合タンパク質ＣＤＴによる金属粒子の内包ＣＤＴ多量体が、Ｄｐｓ多量体と同様に、金属粒子を内包できることを確かめるために、ＣＤＴ多量体の内腔中に酸化鉄ナノ粒子を形成させた。すなわち、ＣＤＴを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、０．５ｍｇ／ｍＬ ＣＤＴ、そして１ｍＭ 硫酸アンモニウム鉄を各々終濃度で含む）を１ｍＬ調製し、４℃で３時間放置した。冷蔵放置後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上清に含まれるタンパク質を３％リンタングステン酸（ＰＴＡ）あるいは１％金グルコース（Ａｕ−Ｇｌｃ）で染色し、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ２２００−ＦＳ、２００ｋＶ）で観察を行った。
酸化鉄ナノ粒子を形成させた後のＣＤＴをＰＴＡ染色で観察したところ、外径９ｎｍ程度のＣＤＴ多量体の内腔中に直径５ｎｍ程度の酸化鉄ナノ粒子が形成されていた（図１）。また、Ａｕ−Ｇｌｃ染色でも、この内腔中に酸化鉄ナノ粒子が形成されることが観察できた（図３）。一方、酸化鉄ナノ粒子を形成させる前のＣＤＴをＰＴＡ染色で電子顕微鏡観察したところ、外径９ｎｍ程度の球形タンパク質のみが観察された（図２）。
以上の結果から、ＣＤＴ多量体が、その内腔中に物質を内包できることが確認された。
【0071】
実施例４：ＣＤＴ中のＣＮＨＢＰの結合能の確認ＣＤＴのＮ末端に融合されたカーボンナノホン結合ペプチド（ＣＮＨＢＰ）の活性を調べた。ＣＮＨＢＰはカーボンナノホン（ＣＮＨ）ばかりでなくカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を認識することが知られている（国際公開第２００６／０６８２５０号を参照）。まず、ＣＤＴまたはＤｐｓを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、０．３ｍｇ／ｍＬのＣＤＴまたはＤｐｓ、そして０．３ｍｇ／ｍＬ ＣＮＴ（Ｓｉｇｍａ社、５１９３０８， ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅ， ｓｉｎｇｌｅ ｗａｌｌｅｄ）を各々終濃度で含む）を調製した。その溶液に、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、ＵＳＡ）を使い１秒間隔の超音波パルス（２００Ｗ、Ｄｕｔｙ ２０％）を５分間与えた。超音波処理されたタンパク質−ＣＮＴ混合溶液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上清に含まれるタンパク質とＣＮＴの複合体を３％ ＰＴＡで染色し、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−２２００ＦＳ、２００ｋＶ）で観察を行った。
Ｎ末にＣＮＨＢＰを有するＣＤＴを含む溶液では、ＣＮＴの周囲にＣＤＴが結合している様子が観察できた（図４）。一方、ＣＮＴを認識できるペプチドを持たないＤｐｓを含む溶液ではＣＮＴとタンパク質の顕著な結合は観察できなかった（図５）。
以上の結果から、ＣＤＴに提示されたＣＮＨＢＰはＣＮＴに結合する活性を保持していることがわかった。
【0072】
実施例５：ＣＤＴ中のＴＢＰの結合能の確認次に、ＣＤＴのＣ末端に融合された酸化チタン結合ペプチド（ＴＢＰ）の活性を調べた。ＴＢＰは、チタンおよび酸化チタン、銀、ならびにシリコンおよび酸化シリコンと結合することが知られている（国際公開第２００５／０１００３１号を参照）。今回、ＣＤＴとチタンあるいは酸化シリコンとの結合を、チタンセンサーを使った水晶発振子マイクロバランス測定法（ＱＣＭ）を用いて測定した。
はじめに、洗浄液（９８％（ｗ／ｖ）硫酸と３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素水を３対１で混合した溶液）５０μｌを、測定用のチタンセンサー上に乗せ１分間放置した後、水で洗い流すことでチタンセンサー表面を洗浄した。この洗浄を３回行った後、チタンセンサーを本体（ＱＣＭ９３４、ＳＥＩＫＯ ＥＧ ａｎｄ Ｇ社）に取り付けた。チタンセンサーにＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）５００μｌを滴下し、３時間室温で放置することで、センサーの周波数値を安定させた。次にＴＢＳ緩衝液４００μｌを除去し、ＣＤＴあるいはＣＤが同じＴＢＳ緩衝液に溶解したタンパク質溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）４００μｌを乗せ周波数の変化を測定した。その結果、ＣＤＴ溶液を載せたほうが、ＣＤ溶液を載せたときよりも、大きな周波数の変化が観察された。すなわち、ＴＢＰを有するＣＤＴの方がＣＤよりも多くのタンパク質がチタンセンサーに結合していることが示唆された（図６中、測定開始３分後付近での矢印ＣＤＴと矢印ＣＤの差異）。周波数の変化が安定した後、ＴＢＳ緩衝液でセンサーを洗浄しセンサーに結合しなかったタンパク質を除去した。続いて、脱水縮合反応により酸化シリコンとなるテトラメチルオキシシラン（ＴＥＭＯＳ、信越シリコーン社）水溶液をセンサーに乗せ、周波数の変化を測定した。ＴＥＭＯＳ水溶液は１ｍＭ ＨＣｌ １４３μｌとＴＥＭＯＳ液 ２５μｌをよく混合し、５分間室温で放置した後、ＴＢＳ緩衝液に１０倍希釈することで調製した。ＴＥＭＯＳ水溶液をセンサーへ乗せることで、周波数の減少が観察され酸化シリコンの析出（ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅ）が観察された（図６中、測定開始２５分後付近、矢印ＴＥＭＯＳを参照）。次に、酸化シリコンが析出したセンサーをＴＢＳ緩衝液でセンサーを洗浄した後、タンパク質溶液を乗せた。その結果、ＣＤＴ溶液を乗せたときには周波数の減少が観察されたが、ＣＤ溶液を乗せた場合には周波数の減少は観察されなかった（図６中、測定開始４０分後付近、矢印ＣＤＴと矢印ＣＤを参照）。すなわち、ＴＢＰを持たないＣＤは酸化シリコンと結合することができなかったが、ＴＢＰを有するＣＤＴは酸化シリコンと結合できることが示唆された。
以上の結果から、ＣＤＴに提示されたＴＢＰは酸化チタンと酸化シリコンに結合する活性を保持していることがわかった。
【0073】
実施例６：Ｄｐｓのアミノ酸配列の相同性解析他の細菌に由来するＤｐｓのアミノ酸配列（表１に示されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号で特定されるアミノ酸配列）を、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対する相同性解析に付した。相同性解析は、遺伝子情報解析ソフトＧｅｎｅｔｙｘ（株式会社ゼネティックス）を用いて行った。このソフトのアルゴリズムは、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．１９８５．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１４３５−１４４１．）に基づいていた。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対する解析結果（同一性および類似性）を、表２および図７に示す。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対する解析結果（同一性および類似性）を、表３および図８に示す。また、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するＤｐｓに対する類似性の解析結果を、表４および図９に示す。
【0074】
【表1】
【0075】
【表2】
【0076】
【表3】
【0077】
【表4】
【0078】
実施例７：標的物質に対する融合タンパク質ＣＤＴの結合における結合速度定数および解離速度定数の測定（１）ＤＴ発現用株の作製
Ｃ末端にＴＢＰが融合されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａの金属内包性蛋白質Ｄｐｓ（Ｄｐｓ−ＴＢＰあるいはＤＴと標記）を構築するために、ｐＥＴ２０−ＣＤＴを鋳型ＤＮＡとして、および以下のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。
【0079】
ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ（配列番号２２）ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＣＡＧＴＡＧ（配列番号２３）
【0080】
得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製し、制限酵素ＤｐｎＩとＮｄｅＩで消化した。制限酵素で消化されたＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用いてセルフライゲーションさせた。セルフライゲーションされたＰＣＲ産物でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（タカラバイオ社、日本）を形質転換し、ＤＴをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＤＴ）を保持したＪＭ１０９を構築した。その形質転換株からＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用いてｐＥＴ２０−ＤＴを精製した。最後に、ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社、ＵＳＡ）をｐＥＴ２０−ＤＴで形質転換し、蛋白質発現用株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２０−ＤＴを得た。ＤＴの発現は、ＣＤＴと同様にして行った。【0081】
（２）ＣＤＴ、ＣＤおよびＤＴの精製ＱＣＭ解析用のタンパク質を調製するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２０−ＣＤＴ、ならびにＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２０−ＤＴ、およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２０−ＣＤを、それぞれ１ｍＬのＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含む）にて３７℃で培養した。培養開始１８時間後、その培養液を新しいＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含む）１００ｍＬに植菌し、容量５００ｍＬフラスコを用いて３７℃で２４時間振とう培養した。得られた菌体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分間）により回収し、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） ５ｍＬで懸濁した。その菌液に超音波をかけ、菌体を破砕した。その溶液を６０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離し、上清画分を回収した。回収された溶液を６０℃で２０分間加熱し、加熱後は速やかに氷上で冷却した。冷却された溶液を６０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離し、再度、上清を回収（約５ｍＬ）した。その溶液をディスクフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰ ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で滅菌した。そして、その溶液をＡｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ−１５（ＮＭＷＬ．５００００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で限外ろ過濃縮し、タンパク質が溶解している緩衝液をＴｒｉｓＨＣｌ−Ｓａｌｔ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ溶液、ｐＨ８．０）に置換し、タンパク質溶液２．５ｍｌを得た。
得られたタンパク質溶液からＣＤＴ、ＣＤおよびＤＴを精製した。まず、ＣＤＴとＤＴの精製には、ゲルろ過および陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた。すなわち、ＴｒｉｓＨＣｌ−Ｓａｌｔ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ溶液、ｐＨ８．０）で平衡化したＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＵＳＡ）に粗抽出溶液２．５ｍｌを注入し、流速１．４ｍｌ／分で分離精製を行い、各蛋白質に相当する画分を回収した。続いて、得られた各蛋白質溶液を限外ろ過濃縮することで、蛋白質溶液の緩衝液を５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その蛋白質溶液２．５ｍｌを、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＬｏａｒｄ ２６／１０ Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＵＳＡ）に注入した。そして、流速４．０ｍｌ／分、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、分離精製を行い、各蛋白質に相当する画分を回収した。ＣＤは塩析により精製を行った。
【0082】
（３）ＣＤＴとＣＮＴの結合速度定数および解離速度定数の測定ＣＤＴとＣＮＴの結合速度定数および解離速度定数をＱＣＭ法により測定した。はじめに、洗浄液（９８％（ｗ／ｖ）硫酸と３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素水を３対１で混合した溶液）５０μｌを、測定用の金センサー上に乗せ５分間放置した後、水で洗い流すことでセンサー表面を洗浄した。また、透過型電子顕微鏡で蛋白質と複合体形成が確認できたＣＮＴ（Ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅ， ｓｉｎｇｌｅ−ｗａｌｌｅｄ， ５１９３０８， Ａｌｄｒｉｃｈ） を １ｍｇ／ｍＬ となるように １％ ＳＤＳ 溶液と混合し、３０分間超音波処理調製されたＣＮＴ 溶液２ μＬを金電極上にマウントし、室温で自然乾燥した。乾燥後、水で２回洗浄し、結合しなかったＣＮＴを洗い流した。さらに、リン酸緩衝液Ａ（５０ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液。０．００１％（ｗ／ｖ） ｔｗｅｅｎ−２０を含む。ｐＨ７．０）で１回洗浄した。そのＣＮＴセンサーを本体（Ａｆｆｉｎｉｘ ＱＮμ、Ｉｎｉｔｉｕｍ社）に取り付け、ＣＮＴセンサーにリン酸緩衝液Ａを滴下し、３０分から一時間室温で放置することで、センサーの周波数値を安定させた。周波数値が安定した後、反応溶液量が５００μｌ、終濃度が０．５ｍｇ／ｌから１０ｍｇ／ｌとなるようにＣＤＴあるいはＣＤを添加し、周波数の変化を測定した。そして得られた周波数の変化が、以下の関係に則ると仮定して、解析ソフトＡＱＵＡ （Ｉｎｉｔｉｕｍ社）を用いて蛋白質とＣＮＴの結合速度定数ｋｏｎと解離速度定数ｋｏｆｆを求めた。ＣＤＴとＣＤは各々１２量体を形成しているとして、各分子量は２４６ｋＤａと２３６ｋＤａとして計算に用いた。
【0083】
【数1】
Ｐ：反応に用いた蛋白質の濃度（Ｍ）
ｋｏｎ：結合速度定数（Ｍ−１・ｓｅｃ−１）
ｋｏｆｆ：解離速度定数（ｓｅｃ−１）
ｔ：反応時間（ｓｅｃ）
Ｓｍａｘ：平衡到達時の蛋白質とセンサーの複合体の濃度（Ｍ）
Ｋｄ：解離定数（Ｍ）
【0084】
その結果、ＣＤＴとＣＤのｋｂｏｓと蛋白質濃度の関係は、図１０のとおりであった。その図１０の直線から求めることのできた各蛋白質のｋｏｎとｋｏｆｆは、表５のとおりであった。すなわち、ＣＤＴはＣＤと同等の強さでＣＮＴに結合できることがわかった。これらのＣＮＴへの結合能力はＣＮＴＢＰによるものであると考えられた。【0085】
【表5】
【0086】
（４）ＣＤＴと酸化チタンの結合速度定数および解離速度定数の測定ＣＤＴと酸化チタンの結合速度定数および解離速度定数をＱＣＭ法により測定した。酸化チタンセンサーはＩｎｉｓｉｕｍ社製のものを使用した。はじめに、酸化チタンセンサーの上に１％ ＳＤＳ溶液を載せ、ピペッティングによりセンサーを洗浄した後、余分なＳＤＳ溶液を水で５回洗い流した。この洗浄作業を２回行った。そして、リン酸緩衝液Ｂ（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液。ｐＨ７．０）で１回洗浄した。その酸化チタンセンサーを本体（ＡｆｆｉｎｉｘＱＮμ、Ｉｎｉｔｉｕｍ社）に取り付け、センサー上にリン酸緩衝液Ｂを滴下し、３０分から一時間室温で放置することで、センサーの周波数値を安定させた。周波数値が安定した後、反応溶液量が５００μｌ、終濃度が０．５ｍｇ／ｌから１０ｍｇ／ｌとなるようにＣＤＴあるいはＤＴを添加し、周波数の変化を測定した。そして得られた周波数の変化から、ＣＮＴへの結合定数を求めたのと同様に、解析ソフトＡＱＵＡ（Ｉｎｉｔｉｕｍ社）を用いて蛋白質と酸化チタンの結合速度定数ｋｏｎと解離速度定数ｋｏｆｆを求めた。ＤＴは１２量体を形成しているとして、分子量は２２６ｋＤａとして計算に用いた。
その結果、ＣＤＴとＣＤのｋｂｏｓと蛋白質濃度の関係は、図１１のとおりであった。その図１１の直線から求めることのできた各蛋白質のｋｏｎとｋｏｆｆは、表６のとおりであった。すなわち、ＣＤＴはＤＴと同等の強さで酸化チタンに結合できることがわかった。これらの酸化チタンへの結合能力はＴＢＰによるものであると考えられた。そして、表５と表６からＣＤＴはＣＮＴと酸化チタンの両方への結合能力を持つことがわかった。
【0087】
【表6】
【0088】
実施例８：融合タンパク質ＣｃＤＴの調製（１）ＣｃＤＴ発現用株の作製
ＣＤＴと同様の性質を有する変異蛋白質をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のＤｐｓを用いて構築した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対する、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに由来するＤｐｓのアミノ酸配列解析結果（同一性および類似性）を、表７に示す。
【0089】
【表7】
【0090】
先ず、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムＤＮＡを鋳型として、および以下のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。【0091】
ｔｔｔｃａｔＡｔｇｇａｃｔａｃｔｔｃｔｃｔｔｃｔｃｃｇｔａｃｔａｃｇａａｃａｇｃｔｇｔｔｔＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣ（配列番号２４）ｔｔｔＧＡＡＴＴＣｔｔａＣＧＣＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＧＴＴＴＣＣＧＴＣ（配列番号２５）
【0092】
得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製し、制限酵素ＮｄｅＩそしてＥｃｏＲＩで消化した。一方で、ｐＥＴ２０ｂプラスミド（Ｍｅｒｃｋ社、ドイツ）を制限酵素ＮｄｅＩそしてＢａｍＨＩで消化した。制限酵素で消化されたＰＣＲ産物とプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用いて結合させた。そのＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（タカラバイオ社、日本）を形質転換し、Ｎ末端にカーボンナノホン結合ペプチド（ＣＮＨＢＰ）、Ｃ末端にチタン結合ペプチド（ＴＢＰ）が融合されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のＤｐｓ（ＣｃＤＴ、配列番号２６および配列番号２７）をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＣｃＤＴ）を保持したＪＭ１０９を構築した。その形質転換株からＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を使いｐＥＴ２０−ＣｃＤＴを精製した。最後にＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社、ＵＳＡ）をｐＥＴ２０−ＣＤＴで形質転換し、タンパク質発現用株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２０−ＣｃＤＴとした。【0093】
（２）ＣｃＤＴの精製ＣｃＤＴタンパク質を得るために、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２０−ＣｃＤＴを１ｍＬのＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含む）にて３７℃で培養した。培養開始１８時間後、その培養液を新しいＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含む）１００ｍＬに植菌し、容量５００ｍＬフラスコを用いて３７℃で２４時間振とう培養した。得られた菌体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分間）により回収し、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） ５ｍＬで懸濁した。その菌液に超音波をかけ、菌体を破砕した。その溶液を６０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離し、上清画分を回収した。回収された溶液を６０℃で２０分間加熱し、加熱後は速やかに氷上で冷却した。冷却された溶液を６０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離し、再度、上清を回収（約５ｍＬ）した。その溶液をディスクフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰ ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で滅菌した。そして、その溶液をＡｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ−１５（ＮＭＷＬ．５００００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で限外ろ過濃縮し、タンパク質が溶解している緩衝液をＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ溶液、ｐＨ８．０）に置換してタンパク質溶液２．５ｍｌを得た。
得られたタンパク質溶液からＣｃＤＴを精製するために、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた。すなわち、そのタンパク質溶液２．５ｍｌを５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＬｏａｒｄ ２６／１０ Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＵＳＡ）に注入した。そして、流速４．０ｍｌ／分、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、分離精製を行い、ＣｃＤＴを含む画分を回収した。
【0094】
実施例９：ＣｃＤＴ多量体の形成の確認得られたＣｃＤＴを３％ ＰＴＡ（リン・タングステン酸）染色し、透過型電子顕微鏡解析を行った。その結果、ＣｃＤＴは、ＣＤＴと同様に、直径９ｎｍ程度のカゴ状の多量体を形成していることがわかった（図１２）。
【0095】
実施例１０：融合タンパク質ＣｃＤＴとカーボンナノチューブとの結合の確認ＣｃＤＴとＣＮＴの結合をＱＣＭ法により測定した。はじめに、洗浄液（９８％（ｗ／ｖ）硫酸と３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素水を３対１で混合した溶液）５０μｌを、測定用の金センサー上に乗せ５分間放置した後、水で洗い流すことでセンサー表面を洗浄した。また、ＣＮＴを１ｍｇ／ｍＬとなるように１％ ＳＤＳ溶液と混合し、３０分間超音波処理調製されたＣＮＴ溶液２μＬを金電極上にマウントし、室温で自然乾燥した。乾燥後、水で２回洗浄し、結合しなかったＣＮＴを洗い流した。さらに、リン酸緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液。０．００１％（ｗ／ｖ） ｔｗｅｅｎ−２０を含む。ｐＨ７．０）で１回洗浄した。そのＣＮＴセンサーを本体（Ａｆｆｉｎｉｘ ＱＮμ、Ｉｎｉｔｉｕｍ社）に取り付け、ＣＮＴセンサーにリン酸緩衝液Ａを滴下し、３０分から一時間室温で放置することで、センサーの周波数値を安定させた。周波数値が安定した後、反応溶液量が５００μｌ、終濃度が１ｍｇ／ｌとなるようにＣｃＤＴを添加し、周波数の変化を測定した。
その結果、ＣＮＨＢＰを有するＣｃＤＴは、ＣＮＨＢＰを有しないＤＴよりも、多くのＣＮＴに結合することが観察できた（図１３）。すなわち、ＣｃＤＴは、ＤＴよりも強いＣＮＴへの結合能力を持つことがわかった。このＣｃＤＴのＣＮＴへの結合能力はＣＮＨＢＰによるものであると推測された。
【0096】
実施例１１：融合タンパク質ＣｃＤＴと酸化チタンとの結合の確認ＣｃＤＴと酸化チタンの結合をＱＣＭ法により測定した。はじめに、洗浄液（９８％（ｗ／ｖ）硫酸と３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素水を３対１で混合した溶液）５０μｌを、測定用の酸化チタンセンサー上に乗せ５分間放置した後、水で洗い流すことでセンサー表面を洗浄した。その酸化チタンセンサーを本体（Ａｆｆｉｎｉｘ ＱＮμ、Ｉｎｉｔｉｕｍ社）に取り付け、酸化チタンセンサーにリン酸緩衝液Ｂ（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液。ｐＨ７．０）を滴下し、３０分から一時間室温で放置することで、センサーの周波数値を安定させた。周波数値が安定した後、反応溶液量が５００μｌ、終濃度が１ｍｇ／ｌとなるようにＣｃＤＴを添加し、周波数の変化を測定した。
その結果、ＴＢＰを有するＣｃＤＴは、ＴＢＰを有しないＣＤよりも、多くの酸化チタンに結合することが観察できた（図１４）。すなわち、ＣｃＤＴは、ＣＤよりも強い酸化チタンへの結合能力を持つことがわかった。このＣｃＤＴの酸化チタンへの結合能力はＴＢＰによるものであると推測された。
【0097】
実施例１２：金属粒子を内包した融合タンパク質ＣＤＴとＣＮＴとの結合はじめに、ＣＤＴ多量体の内腔中に酸化鉄ナノ粒子を形成した。すなわち、ＣＤＴを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、０．５ｍｇ／ｍＬ ＣＤＴ、１ｍＭ 硫酸アンモニウム鉄を各々終濃度で含む）を１ｍＬ調製し、４℃で３時間放置した。放置後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）して、タンパク質を含む上清を回収した。そして、その上清をＡｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ−１５（ＮＭＷＬ．５００００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で限外ろ過濃縮し、酸化鉄ナノ粒子を内腔に持つＣＤＴ多量体（Ｆｅ−ＣＤＴ）溶液の緩衝液を水に置換してタンパク質溶液を得た。そのタンパク質溶液を用いて、酸化鉄ナノ粒子を内腔に持つＣＤＴ多量体とＣＮＴとを含むリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、０．３ｍｇ／ｍＬのＦｅ−ＣＤＴ、０．３ｍｇ／ｍＬ ＣＮＴを各々終濃度で含む）を調製した。調製された溶液に、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、ＵＳＡ）を用いて氷上で、３秒間隔で１秒間の超音波パルス処理（２００Ｗ、Ｄｕｔｙ ２０％）を合計５分間行った。超音波パルス処理されたＦｅ−ＣＤＴ−ＣＮＴ混合溶液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）して、多数のＣＤＴ多量体がＣＮＴに結合したＣＮＴ／Ｆｅ−ＣＤＴ複合体を得た。結果を図１５に示す。図１５は、酸化鉄ナノ粒子を内腔に持つＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ−ＴＢＰ（ＣＤＴ多量体）とＣＮＴとの複合体の透過型電子顕微鏡像を示す図である。透過型電子顕微鏡像は、サンプルを３％ＴＰＡ染色して撮影された。
【0098】
結果として、酸化鉄ナノ粒子を内腔に持つＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ−ＴＢＰ（ＣＤＴ多量体）とＣＮＴとの複合体（ＣＮＴ／Ｆｅ−ＣＤＴ複合体）が得られていることが確認できた。【0099】
実施例１３：ＣＮＴ／Ｆｅ−ＣＤＴ／Ｔｉ複合体の調製例得られたＣＮＴ／Ｆｅ−ＣＤＴ複合体溶液に、終濃度２．５ｗｔ％となるようにチタン前駆体Ｔｉｔａｎｉｕｍ（ＩＶ） ｂｉｓ（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｌａｃｔａｔｏ）ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社、３８８１６５）を加え、室温（２４℃）で放置した。反応を開始して３０分後と１５時間後のサンプルを遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）して、沈殿を回収した。その沈殿を水で３回洗浄して、最後に水に懸濁することでＣＮＴ／Ｆｅ−ＣＤＴ／Ｔｉ水溶液を得た。
【0100】
図１６は、酸化鉄ナノ粒子を内腔に持つＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ−ＴＢＰ（ＣＤＴ多量体）とＣＮＴとの複合体にチタン前駆体を添加して得られた黒い析出物の透過型電子顕微鏡像を示す図である。ＣＮＴ／Ｆｅ−ＣＤＴ／Ｔｉ水溶液を無染色でＴＥＭ解析したところ、図１６に示されるように、黒いロッド状の構造体の中に、酸化鉄ナノ粒子を内腔に内包したＣＤＴ多量体を観察することができた。【0101】
この黒いロッド状の構造体は、ＥＤＳ解析の結果からチタンを含有するものと推測できた。このＴＥＭ像から、ＣＤＴ多量体により増大したと考えられる、チタンナノロッド構造体の表面積について解析した。すなわち、図１６のＴＥＭ像から、長尺方向の長さが１０２ｎｍであり、長尺方向と直交する方向の直径が３１ｎｍであるチタンナノロッド構造体の中に６４個のＣＤＴ多量体が内包されていると推定できた。チタンナノロッド構造体の表面積は、１．１×１０４（ｎｍ２）である。そして、直径９ｎｍであるＣＤＴ多量体の表面積は、２５４（ｎｍ２）であることから、ＣＤＴ多量体６４個分の表面積の合計は１．６×１０４（ｎｍ２）である。すなわち、今回観察されたＣＤＴ多量体を内包するチタンナノロッド構造体の長尺方向の長さ１００ｎｍ当りの表面積は２．６×１０４（ｎｍ２）であり、ＣＤＴ多量体が内包されていない場合の同様のチタンナノロッド構造体の長尺方向の長さ１００ｎｍ当りの表面積である１．１×１０４（ｎｍ２）よりも２．４倍大きいことが推定できた。【0102】
また、ＣＤＴ多量体に内包された酸化鉄ナノ粒子をチタン膜に導入することができたことから、ＣＤＴ多量体に内包させ得ると予測されるニッケル、コバルト、マンガン、リン、ウラン、ベリリウム、アルミニウム、硫化カドミウム、セレン化カドミウム、パラジウム、クロム、銅、銀、ガドリウム錯体、白金コバルト、酸化シリコン、酸化コバルト、酸化インジウム、白金、金、硫化金、セレン化亜鉛、カドミウムセレンなどの金属ナノ粒子のＣＮＴを被膜するチタン膜、酸化チタン膜への導入が期待される。【0103】
続いて、ＣＮＴ／Ｆｅ−ＣＤＴ／Ｔｉ水溶液１０μｌを、ＵＶ／オゾン処理（１１５℃、５分間、１ｍｌ／ｍｉｎ）された、厚さが１０ｎｍのＳｉＯ２膜で被膜されているシリコン基板に載せ、４５０℃で３０分間加熱した。その後、室温で放置して冷却し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で解析した。結果を図１７に示す。図１７は、酸化チタンで被膜されたＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ−ＴＢＰ（ＣＤＴ多量体）とＣＮＴとの複合体を加熱して得られた構造体の走査型電子顕微鏡像を示す図である。結果として、繊維状に観察されるＣＮＴの周囲を粒子状の構造体、膜状の構造体が覆っている様子が観察された。また、ＥＤＳによる分析から、ＣＮＴを被膜している構造体が酸化チタンにより構成されていることが示唆された。
【0104】
実施例１４：ＣＮＴ／ＴｉＯ２複合体の調製例はじめに、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に終濃度０．３ｍｇ／ｍｌ ＣＤＴ及び０．３ｍｇ／ｍｌ ＣＮＴ（Ｓｉｇｍａ社、５１９３０８， ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅ， ｓｉｎｇｌｅ ｗａｌｌｅｄ）を加えた。得られた溶液４０ｍｌに氷上でＤｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、ＵＳＡ）を用いて、１秒間超音波（２００Ｗ、２５％）処理して、３秒間超音波を停止するサイクルで、超音波処理する時間が計５分間となるように処理した。超音波処理には直径１０ｍｍの太い素子を用いた。超音波処理後、容量５０ｍｌのチューブに溶液を移し変え、８５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離することで、ＣＤＴ多量体と結合しなかったＣＮＴを除去した。その溶液に、終濃度が２．５ｗｔ％となるようにＴｉｔａｎｉｕｍ（ＩＶ） ｂｉｓ（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｌａｃｔａｔｏ）ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社、３８８１６５）を加え、室温で２時間放置した。ここで、凝集体の沈殿が観察された。その後、容量５０ｍｌの遠沈管で８５００ｒｐｍで、１０分間遠心分離して、沈殿を回収することで、ＣＮＴ／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を精製した。さらに、水を４０ｍｌ加え、遠心分離することで洗浄し、最後に水を０．８ｍｌ加え、容量１．５ｍｌのマイクロチューブに移した。得られたＣＮＴ／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を含む溶液２００μｌを、石英ボードに載せ、４５０℃から８００℃の範囲で（５００℃、６００℃、７００℃及び８００℃の各温度で）、３０分間加熱した（昇温速度５０℃/分）。
【0105】
各温度で焼成された黒い粉体を３％ＰＴＡ染色し、ＴＥＭ解析した。結果を図１８に示す。図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ及び図１８Ｄは、酸化チタンで被膜されたＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ−ＴＢＰ（ＣＤＴ多量体）とＣＮＴとの複合体を加熱して得られた構造体の透過型電子顕微鏡像を示す図である。【0106】
図１８Ａに示されるように５００℃で焼成した場合には、多数の線状の構造体を観察することができた。図１８Ｂに示されるように６００℃で焼成した場合には、線状の構造体はほとんど観察できなかった。図１８Ｃ及び図１８Ｄに示されるように７００℃以上で焼成した場合には線状の構造体はまったく観察できなかった。【0107】
さらに、得られた黒い粉体の結晶状態を調べるために、４５０℃で加熱された黒い粉体をＸ線回折（ＸＲＤ）により解析した。結果を図１９に示す。図１９は、酸化チタンで被膜されたＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ−ＴＢＰ（ＣＤＴ）とＣＮＴとの複合体を４５０℃で焼成して得られた構造体のＸＲＤ分析の結果を示す図である。【0108】
図１９に示されるように、アナターゼ型ＴｉＯ２結晶の（１０１）面、（２００）面に特有のピークを観察することができた。【0109】
しかしながら、アナターゼ型ＴｉＯ２結晶以外のピークも観察されたことから、ＴｉＯが混合していると推定された。同様にして、５００℃、６００℃で焼成された黒い粉体についてもＸＲＤ解析したところ、同様のピークパターンを示した。よって、少なくとも６００℃以下で焼成された黒い粉体には、光触媒活性を持つアナターゼ型ＴｉＯ２結晶が含まれていることが示唆された。【0110】
実施例１５：光電変換素子（色素増感太陽電池）の製造例実施例１４で得られたＣＮＴ／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を光電変換素子（色素増感太陽電池）の光電変換層の材料として用い、色素増感太陽電池の特性に与える影響を評価した。色素増感太陽電池の作製方法はＳＯＬＡＲＯＮＩＸ社のプロトコールを改変して行った。
【0111】
はじめに、上記方法にて、ＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉを反応溶液１ｍｌ分合成し、水で洗浄後、エタノール溶液に懸濁した。そのＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を酸化チタンペースト（Ｔｉ−Ｎａｎｏｘｉｄｅ Ｄ、ＳＯＬＡＲＯＮＩＸ社）に練りこみ、色素増感太陽電池の材料とした。光電変換層を形成するために、２５ｍｍｘ２５ｍｍにカットされた透明電極基板であるＦＴＯ基板（ｆｌｕｏｒｉｎｅ−ｄｏｐｅｄ ｔｉｎ ｏｘｉｄｅ、ＳＯＬＡＲＯＮＩＸ社）の両端に、５ｍｍにカットされ２重に貼り合わされたメンディングテープ（３Ｍ社、厚さ１００μｍ程度)をそれぞれ貼り付けた。テープ同士間の距離は１０ｍｍとした。【0112】
テープ同士の間にＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を含有する酸化チタンペーストを載せ、スライドガラスを用いて平らに伸ばし、３０℃で３０分間放置することで、酸化チタンペーストを乾燥させた。酸化チタンペーストを載せた基板を焼成炉にいれ、４５０℃で３０分間焼成した。昇温速度は、９０℃／ｍｉｎとして行った。焼成後に自然冷却で１００℃以下に冷却した。焼成された基板に、０．２ｇ／ｌ ルテニウム（Ｒｕ）増感色素溶液（Ｎ７１９、無水エタノール溶解液、ＳＯＬＡＲＯＮＩＸ社）を１ｍｌつけ、室温で２４時間放置した。２４時間放置することで赤く染まった電極基板をエタノールで洗い、酸化チタン表面に吸着しなかった色素を除去し、ドライヤーで乾燥させて光電極とした。【0113】
フッ素ドープ酸化スズ（ＦＴＯ）膜の表面を厚さ５０ｎｍの白金（Ｐｔ）でコーティングしたＰｔ電極（対向電極）と、上記光電極を備えた構造体とを用いて色素増感太陽電池を作製した。【0114】
封止材として封止シート（ＳＸ１１７０−２５、ＳＯＬＡＲＯＮＩＸ社）を用い、ホットプレートを用いて、１２０℃で５分間加熱した。さらに、完全に封止されていない接着面に、エポキシ系接着剤であるアラルダイトラピッド（昭和高分子社）をつけ、３０℃で２時間放置することで密封した。最後にヨウ素電解液（ＳＯＬＡＲＯＮＩＸ社）を入れて色素増感太陽電池を得た。【0115】
製造された色素増感太陽電池に、キセノンランプで１００ｍＷ／ｃｍ２の強さの光を照射して評価を行った。【0116】
色素増感太陽電池の特性として、開放電圧Ｖｏｃ（Ｖ）、短絡電流密度Ｊｓｃ（ｍＡ／ｃｍ２）、フィルファクターＦＦ及び光電変換効率η（％）を評価した。なお、太陽電池において、照射光による入射エネルギーのうち、電力に変換された割合を、光電変換効率ηと呼ぶ。そして、電圧０Ｖ時に計測される電流密度を短絡電流密度Ｊｓｃ、電流が流れていないときの電圧を開放電圧Ｖｏｃと呼ぶ。また、光電変換効率η＝Ｊｓｃ×Ｖｏｃ×ＦＦの関係が成り立ち、ＦＦをフィルファクターと呼ぶ。結果を表８に示す。【0117】
表８から明らかな通り、酸化チタンペーストのみで形成された光電極を備える色素増感太陽電池（デバイス２（−））では、短絡電流密度が１２ｍＡ／ｃｍ２であったのに対し、ＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を練りこんだ酸化チタンペーストを光電極の機能性材料として用いた色素増感太陽電池（デバイス１（＋））では、短絡電流密度が１５ｍＡ／ｃｍ２であり、ＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を電極の機能性材料として用いたことにより、電流量が２５％増加していた。さらに、光電変換効率ηは、ＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を練りこんだ酸化チタンペーストを光電極の機能性材料として用いることで１．４倍向上していた。【0118】
【表8】
【0119】
実施例１６：光電変換素子（色素増感太陽電池）の製造例実施例１４で得られたＣＮＴ／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を光電変換素子（色素増感太陽電池）の光電変換層の材料として用い、色素増感太陽電池の特性に与える影響を評価した。色素増感太陽電池の作製方法はＳＯＬＡＲＯＮＩＸ社のプロトコールを改変して行った。
【0120】
はじめに、上記方法にて、ＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉを反応溶液１ｍｌ分合成し、水で洗浄後、エタノール溶液に懸濁した。そのＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体の終濃度が焼成後の酸化チタン電極中に０．２重量％で含有されるように酸化チタンペースト（Ｔｉ−Ｎａｎｏｘｉｄｅ Ｄ、ＳＯＬＡＲＯＮＩＸ社）に練りこみ、色素増感太陽電池の材料とした。光電変換層を形成するために、２５ｍｍｘ２５ｍｍにカットされた透明電極基板であるＦＴＯ基板（ｆｌｕｏｒｉｎｅ−ｄｏｐｅｄ ｔｉｎ ｏｘｉｄｅ、ＳＯＬＡＲＯＮＩＸ社）を４０mＭ 四塩化チタン水溶液に８０℃で３０分間つけ、そのＦＴＯ基板 の両端に、５ｍｍにカットされ２重に貼り合わされたメンディングテープ（３Ｍ社、厚さ１００μｍ程度)をそれぞれ貼り付けた。テープ同士間の距離は５ｍｍとした。テープ同士の間に上記ＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を含有する酸化チタンペーストを載せ、スライドガラスを用いて平らに伸ばし、３０℃で３０分間放置することで、酸化チタンペーストを乾燥させた。酸化チタンペーストを載せた基板を焼成炉にいれ、４５０℃で３０分間焼成した。昇温速度は、９０℃／ｍｉｎとして行った。焼成後に自然冷却で１００℃以下に冷却した。焼成後、ＦＴＯ基板上の酸化チタン部分を５ｍｍｘ１０ｍｍ角にカットし、その基板を０．２ｇ／ｌ ルテニウム（Ｒｕ）増感色素溶液（Ｎ７１９、無水エタノール溶解液、ＳＯＬＡＲＯＮＩＸ社）に１ｍｌつけ、室温で２４時間放置した。２４時間放置することで赤く染まった電極基板をエタノールで洗い、酸化チタン表面に吸着しなかった色素を除去し、室温で乾燥させて光電極とした（デバイス１１）。
【0121】
また、対照として、酸化処理により合成されたＣＮＴ／酸化チタン複合体を０．２重量％含有する酸化チタン電極で光電極を作製したデバイス（デバイス１２）、０．２重量％でＣＮＴを含有する酸化チタン電極で光電極を作製したデバイス（デバイス１３）、ＣＮＴを含有しない酸化チタン電極で光電極を作製したデバイス（デバイス１４）をそれぞれ作製した。酸化処理によるＣＮＴ／酸化チタン複合体の合成は参考文献（Ｗ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ａ： Ｃｈｅｍｉｃａｌ，２３５，１９４−１９９．）の方法を参考にした。すなわち、エタノール２００ｍｌ中に、チタンブトキシド溶液３４ｍｌ（０．１ｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。その後、硝酸（３５重量％）を２８ｍｌ加え、続いてＣＮＴを適当量添加し、ゲル状になるまで一晩室温にて攪拌した。その後、沈殿物を遠心回収し、８０℃で一晩放置することで乾燥させＣＮＴ/酸化チタン複合体を得た。【0122】
フッ素ドープ酸化スズ（ＦＴＯ）膜の表面を厚さ５０ｎｍの白金（Ｐｔ）でコーティングしたＰｔ電極（対向電極）と、上記光電極を備えた構造体とを用いて色素増感太陽電池を作製した。封止材として封止シート（ＳＸ１１７０−２５、ＳＯＬＡＲＯＮＩＸ社）を用い、ホットプレートを用いて、１２０℃で５分間加熱した。さらに、完全に封止されていない接着面に、エポキシ系接着剤であるアラルダイトラピッド（昭和高分子社）をつけ、３０℃で２時間放置することで密封した。最後にヨウ素電解液（ＳＯＬＡＲＯＮＩＸ社）を入れて色素増感太陽電池を得た。
製造された色素増感太陽電池に、キセノンランプで１００ｍＷ／ｃｍ２の強さの光を照射して評価を行った。
色素増感太陽電池の特性として、開放電圧Ｖｏｃ（Ｖ）、短絡電流密度Ｊｓｃ（ｍＡ／ｃｍ２）、フィルファクターＦＦ及び光電変換効率η（％）を評価した。結果を表９に示す。
【0123】
表９から明らかな通り、酸化チタンペーストのみで形成された光電極を備える色素増感太陽電池（デバイス１４）よりも、ナノ素材を含有する酸化チタンペーストで形成された光電極を備える色素増感太陽電池（デバイス１１、デバイス１２、およびデバイス１３）では、大きな短絡電流密度が計測された。特に、ＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を電極の機能性材料として用いることで、短絡電流量は１８０％増加していた。さらに、ＣＤＴを用いて合成されたＣＮＴと酸化チタンの複合体を電極の機能性材料として用いたデバイス（デバイス１１）の短絡電流密度は、ＣＮＴ単独で極の機能性材料として用いたデバイス（デバイス１３）の短絡電流密度や酸化処理により合成されたＣＮＴと酸化チタンの複合体を電極の機能性材料として用いたデバイス（デバイス１２）の短絡電流密度よりも大きかった。【0124】
まず、ＣＮＴが酸化チタン電極に導入されることで短絡電流密度が向上した理由として、ＣＮＴが発生したキャリアの通り道となり、キャリアが再結合し電流量が低下する前に導電膜に移動できたためと考えられた。また、ＣＤＴ処理や酸化処理によりＣＮＴと酸化チタンの複合体を形成させることで、ＣＮＴと酸化チタンを密着させることができ、ＣＮＴと酸化チタン間の抵抗が低くなったと考えられた。そのため、無処理のＣＮＴを酸化チタンペースト内に導入した場合よりも、酸化チタン周囲で発生したキャリアが効率よくＣＮＴへと移動したと考えられた。酸処理により合成されたＣＮＴ／酸化チタン複合体では、酸よりＣＮＴの構造が一部破壊され、ＣＮＴ内のキャリアの移動が阻害されると考えられている。しかし、蛋白質ＣＤＴを用いればＣＮＴの構造を傷つけることなくＣＮＴと酸化チタンの複合体を合成することができる。さらに、ＣＤＴ由来の空孔により表面積が向上し、より多くの色素を担持できたと考えられた。そのため、酸処理により合成されたＣＮＴ／酸化チタン複合体よりも、ＣＤＴを用いて合成されたＣＮＴ／酸化チタン複合体の方が、発生するキャリアの量が多く、さらにＣＮＴ内のキャリアの移動速度も維持されており、大きな短絡電流が観察されたと考えられた。【0125】
短絡電流密度が向上した結果、ＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を練りこんだ酸化チタンペーストを光電極の機能性材料として用いたデバイス（デバイス１１）での光電変換効率ηは、ＣＮＴを含有しない酸化チタンペーストを光電極の機能性材料として用いたデバイス（デバイス１４）での光電変換効率ηの２．２倍に向上していた。そして、今回作製されたデバイスのうち、ＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を練りこんだ酸化チタンペーストを光電極の機能性材料として用いたデバイスでもっとも高い光電変換効率が計測された。すなわち、ＣＤＴを用いて、緩やかな条件で合成されたＣＮＴと酸化チタンの複合体を用いることで、太陽電池の性能を向上させうることがわかった。なお、ＦＴＯ基板の四塩化チタン処理やＣＮＴ（ＳＷＮＴ）／ＣＤＴ／Ｔｉ複合体を終濃度０．２重量％にて酸化チタン電極に練り込むことにより、実施例１５で製造されたデバイスに比べ、短絡電流密度や光電変換効率ηの向上が認められることも確認された。
【0126】
【表9】
【0127】
実施例１７：融合タンパク質ＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ−ＺｎＯ１’（ＣＤＺ）発現用株の作製Ｎ末端にカーボンナノホン結合ペプチド（ＣＮＨＢＰと標記；アミノ酸配列ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号６）からなる。国際公開第２００６／０６８２５０号を参照）が融合され、Ｃ末端に酸化亜鉛析出ペプチド（ＺｎＯ１’と標記；アミノ酸配列ＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰＧＧＧＳＣ（配列番号３０）からなる。Ｕｍｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１７，２５７１−２５７５（２００５）を参照）が融合されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａの金属内包性タンパク質Ｄｐｓ（ＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ−ＺｎＯ１’あるいはＣＤＺと標記、配列番号３１および配列番号３２）を下記の手順により構築した。
はじめに、ｐＥＴ２０−ＣＤＴを鋳型ＤＮＡ、配列番号１１のヌクレオチド配列およびｔｔｔＧＧＡＴＣＣｔｔａＡｃａＡＣＴＡｃｃＴｃｃＡｃｃＡｇｇＡｃＧＴｇｇＡｇｃＡａｃＴｔｔＡｔｇｃａｔＴａｃＡｔｇＴｇｃＴｔｃｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃ（配列番号３３）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製し、制限酵素ＤｐｎＩとＢａｍＨＩで消化した。制限酵素で消化されたＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用いてセルフライゲーションさせた。セルフライゲーションされたＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社、日本）に形質転換し、Ｎ末端にカーボンナノホン結合ペプチド、Ｃ末端に酸化亜鉛析出ペプチドが融合されたＤｐｓ（ＣＤＺ）をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＣＤＺ）を保持したＢＬ２１（ＤＥ３）を構築した。
【0128】
実施例１８：融合タンパク質ＣＤＺの精製ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２０−ＣＤＺをＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含む）１００ｍＬに植菌し、容量５００ｍＬフラスコを用いて３７℃で２４時間振とう培養した。得られた菌体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分間）により回収し、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） ５ｍＬで懸濁した。その菌液に超音波をかけ、菌体を破砕した。その溶液を６０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離し、上清画分を回収した。回収された溶液を６０℃で２０分間加熱し、加熱後は速やかに氷上で冷却した。冷却された溶液を６０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離し、再度、上清を回収（約５ｍＬ）した。その溶液をディスクフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰ ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で滅菌した。そして、その溶液をＡｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ−１５（ＮＭＷＬ．５００００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で限外ろ過濃縮し、タンパク質が溶解している緩衝液をＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ溶液、ｐＨ８．０）に置換してタンパク質溶液２．５ｍｌを得た。
得られたタンパク質溶液からＣＤＺを精製するために、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた。すなわち、そのタンパク質溶液２．５ｍｌを５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＬｏａｒｄ ２６／１０ Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＵＳＡ）に注入した。そして、流速４．０ｍｌ／分、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、分離精製を行い、ＣＤＺを含む画分を回収した。さらに、その回収された溶液を、Ａｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ−１５（ＮＭＷＬ．５００００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で限外ろ過濃縮し、タンパク質が溶解している緩衝液を純水に置換してＣＤＺ溶液を得た。
【0129】
実施例１９：ＣＤＺ多量体の形成の確認緩衝液が純水置換される前の５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解したＣＤＺを３％ ＰＴＡ（リン・タングステン酸）染色し、透過型電子顕微鏡解析を行った。その結果、ＣＤＺは、ＣＤＴと同様に、直径９ｎｍ程度のカゴ状の多量体を形成していることがわかった（図２１）。
【0130】
実施例２０：ＣＤＺによる硫酸亜鉛水溶液からの白色沈殿形成促進はじめに、０．１Ｍ 硫酸亜鉛水溶液に、純水に溶解したＣＤＺ、ＣＤＴあるいはＣＤをそれぞれ終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。その溶液を一時間室温で放置した後、６００ｎｍの光を用いて濁度を測定した。その結果を図２２に示す。ＣＤＺが添加された溶液では、顕著な白色沈殿が生じた。この白色沈殿は、水酸化亜鉛あるいは酸化亜鉛と考えられる。一方、タンパク質を加えなかった溶液ではまったく沈殿が生じなかった。水酸化亜鉛は１２５℃程度で加熱されることで酸化亜鉛になることが知られている。以上のことから、ＣＤＺは亜鉛化合物を沈殿させる活性があることが示唆された。
【0131】
実施例２１：ＣＤＺ中のＣＮＨＢＰの結合能の確認ＣＤＺのＮ末端に融合されたカーボンナノホン結合ペプチド（ＣＮＨＢＰ）の活性を調べた。リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるようにＣＤＺとＣＮＴ（Ｓｉｇｍａ社、５１９３０８， ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅ， ｓｉｎｇｌｅ ｗａｌｌｅｄ）を各々加えた。その溶液に、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、ＵＳＡ）を使い１秒間の超音波パルス（２００Ｗ、Ｄｕｔｙ ２０％）を３秒間の間隔を空けながら計５分間与えた。超音波処理されたＣＤＺ−ＣＮＴ混合溶液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上清に含まれるタンパク質とＣＮＴの複合体を３％ ＰＴＡで染色し、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−２２００ＦＳ、２００ｋＶ）で観察を行った。
その結果、Ｎ末にＣＮＨＢＰを有するＣＤＺを含む溶液では、ＣＮＴの周囲にＣＤＺが結合している様子が観察できた（図２３）。すなわち、ＣＤＺはＣＮＴに結合する活性を保持していることがわかった。
【符号の説明】
【0132】
１０ 多孔質構造体２０ 第２の標的物質
３０ 第１の標的物質の凝集体
３２ 第１の空孔部
３４ 第２の空孔部
３６ 金属粒子
３６ａ 金属皮膜
３８ 第３の空孔部
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図20D】
【図20E】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]