特許 5950818 遺伝性疾患の予防・改善剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5950818

(24)【登録日】2016年6月17日

(45)【発行日】2016年7月13日

(54)【発明の名称】遺伝性疾患の予防・改善剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/428 20060101AFI20160630BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20160630BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160630BHJP

   C07D 277/64 20060101ALN20160630BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20160630BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160630BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/428ZNA

   A61P21/00

   A61P43/00 111

   !C07D277/64

   !C12N9/12

   !C12N15/00 A

【請求項の数】6

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2012-522455(P2012-522455)

(86)(22)【出願日】2011年6月27日

(86)【国際出願番号】JP2011003655

(87)【国際公開番号】WO2012001941

(87)【国際公開日】20120105

【審査請求日】2014年4月28日

(31)【優先権主張番号】特願2010-146699(P2010-146699)

(32)【優先日】2010年6月28日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】506180969

【氏名又は名称】萩原 正敏

(73)【特許権者】

【識別番号】505190116

【氏名又は名称】松尾 雅文

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(72)【発明者】

【氏名】萩原 正敏

(72)【発明者】

【氏名】松尾 雅文

(72)【発明者】

【氏名】片岡 直行

(72)【発明者】

【氏名】西田 篤史

【審査官】 佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０８７２３８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５２１４０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 萩原正敏，ケミカルバイオロジーによる難治疾患への挑戦，日本薬理学会関東部会口演要旨集，２００９年，Vol.120th，p.14

【文献】 松尾雅文，ジストロフィン遺伝子のナンセンス変異にもかかわらずエクソンのスキッピングによりBecker型筋ジストロフィ，遺伝子医学，１９９９年，Vol.3, No.2,，pp.86-90

【文献】 Disset A., et al.，An exon skipping-associated nonsense mutation in the dystrophin gene uncovers a complex interplay between multiple antagonistic splicing elements.，Hum. Mol. Genet., 2006, Vol.15, No.6, pp.999-1013

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｋ ４１／００−４５／０８

Ａ６１Ｋ ３１／３３−３３／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝子のエクソンの変異に起因し、かつ、該変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る遺伝性疾患の予防・改善剤であって、分子量１５００以下の化合物を含有し、
前記化合物が、
（i）スプライシング調節作用を有する化合物であり、
（ii）前記変異が含まれるエクソンのスキッピングを誘導・促進させる効果を有する化合物であり、
（iii）一般式（１）

【化1】

［式中、Ｒ_１及びＲ_２はメチル基を示し；Ｒ_３はメトキシ基を示す。］
で表されるＣｄｃ−ｌｉｋｅキナーゼ阻害化合物であり、かつ、
（iv）前記変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質の発現を誘導及び／又は上昇させるための化合物であることを特徴とする予防・改善剤。

【請求項2】

前記変異が、ナンセンス変異であることを特徴とする請求項１に記載の予防・改善剤。

【請求項3】

前記ナンセンス変異が、前記遺伝子におけるエクソンスプライシングエンハンサー活性を抑制し、及び／又は、前記遺伝子におけるエクソンスプライシングサイレンサー活性を上昇させる、ナンセンス変異であることを特徴とする請求項２に記載の予防・改善剤。

【請求項4】

前記遺伝子がジストロフィン遺伝子であり、前記機能性トランケート型タンパク質が機能性トランケート型ジストロフィンタンパク質であり、前記遺伝性疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の予防・改善剤。

【請求項5】

前記ジストロフィン遺伝子のエクソンが、ジストロフィン遺伝子のエクソン３１又はエクソン２７であることを特徴とする請求項４に記載の予防・改善剤。

【請求項6】

前記ジストロフィン遺伝子のエクソン３１の変異が、配列番号１のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド番号４３０３におけるグアニンのチミンへのナンセンス変異であり、エクソン２７の変異が、配列番号１のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６１３におけるグアニンが欠失したアウトオブフレーム変異であることを特徴とする請求項５に記載の予防・改善剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子のエクソンの変異に起因し、かつ、該変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る遺伝性疾患の予防・改善剤であって、分子量１５００以下の化合物を含有することを特徴とする予防・改善剤に関する。

【背景技術】

【0002】

筋ジストロフィーは、筋線維の破壊・変性（筋壊死）と再生を繰り返しながら、次第に筋萎縮と筋力低下が進行していく遺伝性筋疾患の総称であり、中でも、進行性筋ジストロフィーがよく知られている。進行性筋ジストロフィーの１種であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Duchenne muscular dystrophy：ＤＭＤ）は、筋ジストロフィーの中でも最も一般的であり、Ｘ染色体上のジストロフィン遺伝子の変異によって発症する（非特許文献１参照）。幼少期から発症する進行性筋萎縮により、ＤＭＤ患者は通常２０歳代で、心不全又は呼吸器不全により死亡するとされている。

【0003】

ジストロフィンタンパク質（以下、単に「ジストロフィン」とも表示する。）は、筋細胞の細胞膜の内側に存在して、アクチン−ミオシンによる筋肉の収縮により生じる機械的なエネルギーを、細胞膜や周りの結合組織、腱などにバランス良く伝え、過度の衝撃が加わらないように調節することによって、筋細胞の構造を保つ役割等を果たしている。ＤＭＤ患者の場合、そのジストロフィン遺伝子の変異のため、筋繊維の中に全く、あるいはほんの少ししかジストロフィンが存在しないので、筋肉の収縮により筋細胞の細胞膜が壊れて、通常より多量のカルシウムイオンが筋繊維中に流入してしまう。過度のカルシウムは、カルペインやプロテアーゼ等の、筋肉を壊したりアポトーシスを誘導する酵素を活性化し、その結果、線維芽細胞が活性化されて繊維化が生じ、組織が瘢痕化して、筋細胞が再生されにくくなり、筋萎縮が進行していく。

【0004】

一方、進行性筋ジストロフィーの１種であるベッカー型筋ジストロフィー（Becker muscular dystrophy：ＢＭＤ）も、ジストロフィン遺伝子の変異により発症するが、その発症時期は通常成人であり、症状の進行もＤＭＤと比較して緩徐である。ＤＭＤとＢＭＤは、いずれもジストロフィン遺伝子の変異により発症するにもかかわらず、症状の程度や進行速度が異なっている。ＤＭＤとＢＭＤのこの違いは、読み枠ルールによって説明される。ジストロフィンｍＲＮＡにおいて中途終止コドン（premature termination codon：ＰＴＣ）を生じる変異（ナンセンス変異）では、重篤なＤＭＤ表現型（デュシェンヌ型）を通常もたらすが、ジストロフィンｍＲＮＡの元々の読み枠が維持される変異（インフレームの変異）では、より軽症のＢＭＤ表現型（ベッカー型）となる（非特許文献２参照）。しかし、意外なことに、いくつかの軽症ＢＭＤ患者では、ジストロフィン遺伝子上にナンセンス変異を有しているにもかかわらず、そのナンセンス変異を含むエクソンがスキッピングされることによって、新規なインフレームのジストロフィンｍＲＮＡが産生されているとの報告がされている（非特許文献３〜６参照）。スキッピングにより一部のエクソンを欠いたこのジストロフィンｍＲＮＡがコードするジストロフィン（トランケート型ジストロフィン）は、正常なジストロフィンよりも短いが、筋細胞の構造を保つ機能がある程度残存しているため、筋ジストロフィーの症状は比較的軽く、また、筋萎縮の進行速度も緩やかとなる。

【0005】

筋ジストロフィーの根本的な治療法は未だ確立されておらず、従来、機能訓練や関節拘縮予防のためのストレッチのほか、心不全・呼吸障害に対する対症療法が行われていたに過ぎなかった。しかし、近年、本発明者らや、他の研究者らによって、ＤＭＤに対する新たな治療法が開発され、期待が集まっている。この治療法は、ジストロフィンｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を用いて、エクソンスキッピングを誘導することによって、ＤＭＤ表現型からＢＭＤ表現型への転換を図り、症状を軽減させる方法（非特許文献３）である。ＤＭＤ患者の細胞でエクソンスキッピングを誘導するために、スプライス部位又はスプライシング促進エレメントのいずれかに対して何種類かの異なるＡＯＮがデザインされた。これらのＡＯＮは、ジストロフィンｍＲＮＡの読み枠を修復することができた。例えば、エクソン１９のエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）に対するＡＯＮによって、前述のＤＭＤ患者細胞におけるエクソン１９のスキッピングが生じ、トランケート型ジストロフィンの生成が観察された（非特許文献３〜５参照）。また、エクソン５１に対するＡＯＮもまた患者細胞に対して多く使用され、現在、これらのＡＯＮは臨床研究段階にある（非特許文献６〜８参照）。

【0006】

しかしながら、ＡＯＮは、定期的に筋肉注射又は静脈注射しなければならず、患者にとって煩わしいという問題点や、多量の調製には高額な費用がかかるという問題点があった。さらに、筋ジストロフィーモデルマウスであるｍｄｘマウスにＡＯＮ処理を行ったところ、骨格筋ではジストロフィンの発現がある程度回復したが、心臓におけるジストロフィン発現の回復は困難であった（非特許文献９）。したがって、エクソンスキッピングを調節する低分子が臨床上非常に望まれている。低分子の非アミノグリコシドナンセンス変異サプレッサー化合物であるＰＴＣ１２４（登録商標）（３−［５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾル−３−イル］安息香酸）が、ナンセンス変異を持つ一部のＤＭＤ患者を治療し得ることが報告されており（非特許文献１０や１１）、現在、米国等において、フェーズ２ｂの臨床試験が行われている。ＰＴＣ１２４は、リボゾームが翻訳時に中途終止コドン（ＰＴＣ）を読み飛ばす（read-through）ように誘導することにより、全長の機能的なジストロフィンの発現をある程度回復させる治療薬であるが、他の遺伝子のナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構に与える影響については、まだ不明である。

【0007】

ところで、本発明者らは、Ｃｄｃ−ｌｉｋｅキナーゼ（Ｃｌｋ）特異的なキナーゼ阻害剤として、ＴＧ００３（後述の一般式（１）において、Ｒ_１及びＲ_２がメチル基であり、Ｒ_３がメトキシ基である化合物）を同定した。ＴＧ００３は、インビトロとインビボの両方でスプライシングに影響を及ぼす化合物であり（非特許文献１２及び１３参照）、本発明者らが関わる特許出願（特許文献１参照）には、ＴＧ００３がＳＲタンパク質のリン酸化反応を介して、オルタナティブスプライシングを調節する作用を有していることや、かかる作用を利用して、がん等の疾患の予防や治療を行いうることが記載されている。しかし、ＴＧ００３が、ジストロフィン遺伝子のエクソンのスキッピングを促進し得ることはこれまで知られていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００５０１７１０２６号明細書

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Cell (1988) 53, 219-228.

【非特許文献2】Genomics (1988) 2, 90-95.

【非特許文献3】Pediatr Res (2006) 59, 690-694.

【非特許文献4】Biochem Biophys Res Commun (1996) 226, 445-449.

【非特許文献5】J Clin Invest (1995) 95, 515-520.

【非特許文献6】Lancet neurology (2009) 8, 873-875.

【非特許文献7】The New England journal of medicine (2007) 357, 2677-2686.

【非特許文献8】Lancet neurology (2009) 8, 918-928.

【非特許文献9】Nature medicine (2006) 12, 175-177.

【非特許文献10】J Clin Pharmacol (2007) 47, 430-444.

【非特許文献11】Nature (2007) 447, 87-91.

【非特許文献12】The Journal of biological chemistry (2004) 279, 24246-24252.

【非特許文献13】Genes Cells (2008) 13, 233-244.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、遺伝子のエクソンの変異に起因し、かつ、該変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る遺伝性疾患の予防・改善剤であって、分子量１５００以下の化合物を含有することを特徴とする予防・改善剤を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、筋ジストロフィー患者４００名以上について、そのジストロフィン遺伝子の変異を解析したところ、背景技術記載の読み枠ルールでは、重篤なＤＭＤ表現型となることが予想されるナンセンス変異をエクソン３１に有するものの、症状はＢＭＤ型である患者を発見した。かかる患者のジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡを分析したところ、エクソン３１におけるそのナンセンス変異が、エクソン３１のスキッピングを誘導し、それによって、機能性トランケート型ジストロフィンをコードする成熟ｍＲＮＡを一部生成していることが判明した。そこで、本発明者らは、エクソンスキッピングを促進する低分子化合物を探し求め、Ｃｌｋ特異的阻害剤であるＴＧ００３が、内在性ジストロフィン遺伝子のエクソン３１やエクソン２７のスキッピングを用量依存的に促進し、患者の細胞において機能性トランケート型ジストロフィンの産生を増強させ得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。

【0012】

すなわち、本発明は、（１）遺伝子のエクソンの変異に起因し、かつ、該変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る遺伝性疾患の予防・改善剤であって、分子量１５００以下の化合物を含有することを特徴とする予防・改善剤や、（２）前記化合物が、スプライシング調節作用を有する化合物であることを特徴とする上記（１）に記載の予防・改善剤や、（３）前記化合物が、変異が含まれるエクソンのスキッピングを誘導・促進させる効果を有する化合物であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の予防・改善剤や、（４）前記化合物が、Ｃｄｃ−ｌｉｋｅキナーゼ阻害化合物であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の予防・改善剤や、（５）前記Ｃｄｃ−ｌｉｋｅキナーゼ阻害化合物が、一般式（１）

【化1】

［式中、Ｒ_１及びＲ_２は各々独立に、直鎖状、分岐鎖状のＣ_１−Ｃ_１０炭化水素基を示し；Ｒ_３はメトキシ基、エトキシ基、アセトキシ基又はハロゲン原子を示す。］
で表される化合物であることを特徴とする上記（４）に記載の予防・改善剤や、（６）前記変異が、ナンセンス変異であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の予防・改善剤や、（７）前記ナンセンス変異が、前記遺伝子におけるエクソンスプライシングエンハンサー活性を抑制し、及び／又は、前記遺伝子におけるエクソンスプライシングサイレンサー活性を上昇させる、ナンセンス変異であることを特徴とする上記（６）に記載の予防・改善剤や、（８）前記遺伝子がジストロフィン遺伝子であり、前記機能性トランケート型タンパク質が機能性トランケート型ジストロフィンタンパク質であり、前記遺伝性疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーであることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の予防・改善剤や、（９）前記ジストロフィン遺伝子のエクソンが、ジストロフィン遺伝子のエクソン３１又はエクソン２７であることを特徴とする上記（８）に記載の予防・改善剤や、（１０）前記ジストロフィン遺伝子のエクソン３１の変異が、配列番号１のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド番号４３０３におけるグアニンのチミンへのナンセンス変異であり、エクソン２７の変異が、配列番号１のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６１３におけるグアニンが欠失したアウトオブフレーム変異であることを特徴とする上記（９）に記載の予防・改善剤に関する。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、遺伝性疾患の要因となる変異が含まれる遺伝子のエクソンのスキッピングを誘導・促進させることによって、機能性トランケート型タンパク質の発現を誘導・上昇させ、その結果、該遺伝性疾患を予防・改善することができる。また、本発明で用いる分子量１５００以下の化合物は低分子であり、組織移行性等に優れているため、高分子である従来のＡＯＮでは十分な効果が得られなかった心臓等の臓器においても、十分な予防・改善効果が期待できる。さらに、本発明が対象とする変異はナンセンス変異に限らないため、遺伝性疾患の要因となる多様な変異への適用も期待できる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】患者のジストロフィン遺伝子のエクソン３１における点変異によりエクソンスキッピングが生じ、トランケート型ジストロフィン遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が修復される様子を示す図である。（ａ）患者番号ＫＵＣＧ７９７のジストロフィン遺伝子で見い出された点変異を示す。エクソン３１のｃ．４３０３Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｕ１４３５Ｘ）変異の位置をバーで示す。隣接するイントロン領域のＤＮＡ配列、並びに変異で変わったコドンを示す。（ｂ）パネルｅ〜ｇは、前記患者におけるジストロフィン発現を免疫組織化学法で調べた結果を示し、パネルｂ〜ｄは、健常者におけるジストロフィン発現を免疫組織化学法で調べた結果を示す。パネルｅ及びｂはＤＹＳ２で染色した結果を示し、パネルｆ及びｃはＤＹＳ３で染色した結果を示し、パネルｇ及びｄはＭＡＮＤＹＳ１で染色した結果を示す。スケールバー＝６０μＭ。（ｃ）コントロール及び患者筋肉から得たＲＴ−ＰＣＲ産物についてアガロースゲル分析を行った結果を示す。左レーン（Ｍ）は、φＸ１７４−ＨａｅＩＩＩで消化したＤＮＡサイズマーカーを用いた結果を表し、中央レーン（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、健常者由来のトータルＲＮＡをテンプレートした結果を表し、右レーン（Ｐａｔｉｅｎｔ）は、ＫＵＣＧ７９７由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を表す。これらのバンドのＤＮＡ配列を解析し、これらＰＣＲ産物の構造をそのヌクレオチド長と共にパネル右側に概略的に示した。番号付きボックスはジストロフィンのエクソン番号を示す。パネル左側には、ＤＮＡサイズマーカーの長さをヌクレオチド長として示す。（ｄ）前述の（ｃ）における小さいサイズの増幅産物の配列決定を行った結果を示す。（ｅ）ジストロフィン遺伝子の野生型（ＷＴ）又は変異型（ｃ．４３０３Ｇ＞Ｔ）のいずれかのエクソン３１を含むハイブリッドミニ遺伝子プラスミドの概略図を示す。パネル右側のボックス及びラインはそれぞれエクソン及びイントロンを示す。（ｆ）Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａから回収した変異型ｍＲＮＡや、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ／Ｈｅｌａから回収した野生型ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物などをアガロースゲル上で電気泳動した結果を示す。一番左のレーン（Ｍ）は、φＸ１７４−ＨａｅＩＩＩで消化したＤＮＡサイズマーカーを用いた結果を表し、左から２番目のレーン（ｗ）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を表し、左から３番目のレーン（ｍ）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を表す。これらＰＣＲ産物の構造をパネル右側に概略的に示す。また、ＤＮＡサイズマーカー及びＰＣＲ産物のヌクレオチド長を、それぞれパネルの左側及び右側に示す。また、右から２番目及び３番目のレーンは、逆転写酵素（ＲＴ）を添加しないこと以外は同様にＲＴ−ＰＣＲ処理したものをアガロースゲル上で電気泳動した結果を表し、右から２番目のレーン（ｗ）はＨ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を表し、一番右のレーン（ｍ）はＨ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を表す。

【図2】スプライシングを調節するＲＮＡ結合タンパク質に対するエクソン３１中の結合配列を予測する図である。（ａ）ジストロフィン遺伝子の野生型エクソン３１（左パネル）又はｃ．４３０３Ｇ＞Ｔのエクソン３１（右パネル）に結合できるＲＮＡ結合候補タンパク質をSpliceAidプログラムにより予測した結果を示す。エクソンであるとの定義を容易にするＥＳＥ（エクソンスプライシングエンハンサー）モチーフ等の配列にはポジティブなスコアを付与した。同じ基準により、イントロンであるとの定義を容易にする標的配列、すなわちＥＳＳ（エクソンスプライシングサイレンサー）モチーフにはネガティブなスコアを付与した。左右両方のパネルにおいて、ｃ．４３０３Ｇ＞Ｔで変異したヌクレオチドを強調表示している。かかる変異の有無によってスコアが大きく変わった２種類のタンパク質（ＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９及びｈｎＲＮＰＡ１）を白抜きボックスで示す。ＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９（左パネル）又はｈｎＲＮＰＡ１（右パネル）のＳＥＬＥＸコンセンサス配列と高い相同性を示す周辺配列には下線を付与した。（ｂ）ＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９又はｈｎＲＮＰＡ１のＳＥＬＥＸコンセンサス配列とエクソン３１配列とのアラインメントを示す。左パネルには、野生型エクソン３１ＲＮＡとＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９ＳＥＬＥＸコンセンサス配列との相同性を示す。Ｒはプリン残基を示す。右パネルには、ｃ．４３０３Ｇ＞Ｔ変異型エクソン３１とｈｎＲＮＰＡ１ＳＥＬＥＸコンセンサス配列とのＲＮＡ配列相同性を示す。Ｗは、Ａ又はＵを示す。両パネルにおける垂直のバーは、同じ残基を結びつけている。両パネルにおいて、ｃ．４３０３Ｇ＞Ｔで変異しているヌクレオチドは白抜きボックスで強調している。

【図3】患者遺伝子で見い出されたジストロフィンエクソン３１の点変異により、インビトロ及びインビボの両方においてｈｎＲＮＰＡ１との結合性が増大し、エクソンスキッピングが増大する様子を示す図である。（ａ）ＧＳＴ−ｈｎＲＮＰＡ１及びジストロフィンエクソン３１ＲＮＡに対するゲルモビリティシフトアッセイの結果を示す図である。レーン３〜５は、ＧＳＴ−ｈｎＲＮＰＡ１をそれぞれ１００、２００及び４００ｎｇ用い、かつ、ジストロフィンの野生型エクソン３１ＲＮＡを用いた結果を表し、レーン８〜１０は、ＧＳＴ−ｈｎＲＮＰＡ１をそれぞれ１００、２００及び４００ｎｇ用い、かつ、ジストロフィンの変異型エクソン３１ＲＮＡを用いた結果を表し、レーン２及び７はＧＳＴのみを用いた結果を表す。レーン１及び６は、ＲＮＡ自体がゲル上のどの位置に移動したかを示す（パネル右側に“Ｆｒｅｅ ＲＮＡ”として示す）。ｈｎＲＮＰＡ１とＲＮＡとの複合体は“Ｂｏｕｎｄ ＲＮＡ”として示す。（ｂ）ジストロフィンエクソン３１を含むｍＲＮＡ前駆体のインビトロでのスプライシングアッセイの結果を示す。レーン１〜５は、ｐＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗを線状化したものをインビトロ転写の鋳型とし、かつ、インキュベート時間をそれぞれ０、１５、３０、６０、９０分間とした結果を表し、レーン６〜１０は、ｐＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍを線状化したものをインビトロ転写の鋳型とし、かつ、インキュベート時間をそれぞれ０、１５、３０、６０、９０分間とした結果を表す。また、ｍＲＮＡ前駆体と、２つの異なるｍＲＮＡの構造をパネル右側に示す。番号付きボックスはエクソンを表し、ボックス間のラインはイントロンを表す。エクソン１４及び１５は、ＣＤＣｍＲＮＡ前駆体に由来するニワトリδ−クリスタリンエクソンである。ジストロフィンエクソン３１を含むｍＲＮＡ（黒丸）は、ＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ ｃ．４３０３Ｇ＞Ｔ ｍＲＮＡ前駆体でよりもＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ ＷＴ ｍＲＮＡ前駆体によって、より効率的に産生された。（ｃ）いくつかのＲＮＡ結合タンパク質の過剰発現が変異型エクソン３１のスキッピング及びインクルージョンにどのような影響を及ぼすかを調べるために、ミニ遺伝子を利用して行った、細胞におけるスプライシング解析の結果を示す。一番左のレーン（Ｍ）は、φＸ１７４−ＨａｅＩＩＩで消化したＤＮＡサイズマーカーを表し、左から２番目のレーン（ｍｏｃｋ）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を表し、左から３番目のレーン（ＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ・Ｆｌａｇ−ＳＲｐ３０ｃ／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を表し、右から２番目のレーン（ＳＲｐ７５／ＳＲＳＦ４）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ・Ｆｌａｇ−ＳＲｐ７５／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を表し、一番右のレーン（ｈｎＲＮＰＡ）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ・Ｆｌａｇ−ｈｎＲＮＰＡ１プラスミド／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を表す。なお、ＤＮＡサイズマーカー及びＰＣＲ産物のヌクレオチド長を、それぞれパネルの左側及び右側に示す。（ｄ）図３（ｃ）の結果から算出したエクソンスキップ／インクルージョンレシオを示す。グラフには、個別に３回行った実験のレシオの平均値及び標準偏差を示す。^＊Ｐ＜０．００５

【図4】ＴＧ００３が、Ｈｅｌａ細胞において用量依存的に変異型エクソン３１のスキッピングを促進する様子を示す図である。（ａ）各種化合物がエクソン３１スキッピングにどのような影響を及ぼすかを調べるために、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａを利用して行った、細胞におけるスプライシング解析の結果を示す。一番左のレーン（Ｍ）は、φＸ１７４−ＨａｅＩＩＩで消化したＤＮＡサイズマーカーを表し、左から２番目のレーン（ＤＭＳＯ）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／ＨｅｌａをＤＭＳＯ処理した場合の結果を表し、左から３番目のレーン（ＴＧ００３）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／ＨｅｌａをＴＧ００３処理した場合の結果を表し、一番右のレーン（ＳＲＰＩＮ３４０）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／ＨｅｌａをＳＲＰＩＮ３４０処理した場合の結果を表す。なお、ＤＮＡサイズマーカー及びＰＣＲ産物のヌクレオチド長を、それぞれパネルの左側及び右側に示す。（ｂ）図４（ａ）の結果から算出したエクソンスキップ／インクルージョンレシオを示す。グラフには、個別に３回行った実験の該レシオの平均値及び標準偏差を示す。^＊Ｐ＜０．０００１（ｃ）変異型エクソン３１のスキッピングを促進するＴＧ００３が、野生型エクソン３１のスキッピングを促進するかを調べるために、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａに加えて、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ／Ｈｅｌａを利用して行った、細胞におけるスプライシング解析の結果を示す。左から１番目から６番目のレーンは、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ／Ｈｅｌａをパネル上部の濃度（μＭ）のＴＧ００３で処理した場合の結果を表し、右から１番目から６番目のレーンは、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａをパネル上部の濃度（μＭ）のＴＧ００３で処理した場合の結果を表し、中央のレーン（Ｍ）は、φＸ１７４−ＨａｅＩＩＩで消化したＤＮＡサイズマーカーを表す。（ｄ）図４（ｃ）の結果から算出したエクソンスキップ／インクルージョンレシオを示す。グラフには、個別に３回行った実験の該レシオの平均値及び標準偏差を示す。

【図5】ＴＧ００３が、Ｈｅｌａ細胞において用量依存的に変異型エクソン２７のスキッピングを促進する様子を示す図である。（ａ）Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｍ／Ｈｅｌａ、及び、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｗ／Ｈｅｌａを利用して行った、細胞におけるスプライシング解析の結果を示す。左から１番目から６番目のレーンは、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｗ／Ｈｅｌａをパネル上部の濃度（μＭ）のＴＧ００３で処理した場合の結果を表し、右から１番目から６番目のレーンは、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｍ／Ｈｅｌａをパネル上部の濃度（μＭ）のＴＧ００３で処理した場合の結果を表し、中央のレーン（Ｍ）は、φＸ１７４−ＨａｅＩＩＩで消化したＤＮＡサイズマーカーを表す。（ｂ）図５（ａ）の結果から算出したエクソンスキップ／インクルージョンレシオを示す。グラフには、個別に３回行った実験の該レシオの平均値及び標準偏差を示す。

【図6】ＴＧ００３は、変異型エクソン３１のスキッピングを促進するだけでなく、患者細胞におけるトランケート型ジストロフィン（エクソン３１欠失ジストロフィン）の発現も促進することを示す図である。（ａ）種々の量のＴＧ００３で処理した、患者筋肉の初代培養細胞を利用して行った、細胞におけるスプライシング解析の結果を示す。左から１番目のレーン（Ｍ）は、φＸ１７４−ＨａｅＩＩＩで消化したＤＮＡサイズマーカーを表し、左から２番目〜７番目のレーンは、初代培養細胞を、パネル上部に記載した数値の濃度（μＭ）のＴＧ００３で処理した場合の結果をそれぞれ表す。なお、ＤＮＡサイズマーカーをパネルの左側に示し、ＰＣＲ産物のヌクレオチド長及び構造の概略をパネルの右側に示す。パネル右側の番号ボックスはジストロフィンのエクソン番号を示す。（ｂ）図６（ａ）の結果から算出したエクソンスキップ／インクルージョンレシオを示す。グラフには、個別に２回行った実験の該レシオの平均値及び標準偏差を示す。（ｃ）ＴＧ００３で処理した患者細胞におけるジストロフィンの発現についてウエスタンブロッティング解析を行った結果を示す。上パネル（Dystrophin(C-terminal)）は、ジストロフィンのＣ末端に対する抗体を用いた結果を表し、中央パネル（Dystrophin(Exon 31/32)）は、ジストロフィンのエクソン３１に対応する部分に対する抗体を用いた結果を表し、下パネル（Desmin）は、抗デスミン抗体を用いた結果を表す。また、左のレーン（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ポジティブコントロールの結果を表し、真ん中のレーン（０）は、ＴＧ００３で処理しなかった患者細胞を用いた結果を表し、右のレーン（７）は、ＴＧ００３で処理した患者細胞を用いた結果を表す。なお、下パネルの結果から、このウエスタンブロッティング解析にはほぼ同数の細胞を使用したことが示された。

【図7】ヒトのジストロフィンの７９個のエクソン配置を示す図である。また、この図により、エクソン同士の境目がコドンの何文字目に該当するかも読み取ることもできる。

【発明を実施するための形態】

【0015】

１．本発明の予防・改善剤
本発明の予防・改善剤は、遺伝子のエクソンの変異に起因し、かつ、該変異が含まれるエクソン（以下、単に「変異型エクソン」とも表示する。）をスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る遺伝性疾患（以下、「本発明が対象とする遺伝性疾患」とも表示する。）の予防・改善剤であって、分子量１５００以下の化合物（以下、「本発明における化合物」とも表示する。）を含有している限り特に制限されないが、分子量１０００以下の化合物であることが好ましく、分子量７００以下の化合物であることがより好ましく、分子量５００以下の化合物であることがさらに好ましく、分子量３００以下の化合物であることがさらにより好ましい。また、本発明の予防・改善剤には、本発明における化合物を２種類以上併用してもよい。

【0016】

本発明における化合物としては、本発明が対象とする遺伝性疾患に対して予防効果及び／又は改善効果（以下、「本発明における予防・改善効果」とも表示する。）を発揮する化合物である限り特に制限されないが、好適には、スプライシング調節作用を有する化合物を例示することができ、より好適には、変異型エクソンのスキッピングを誘導及び／又は促進させる効果（以下、「本発明におけるスキッピング誘導・促進効果」とも表示する。）を有する化合物を例示することができ、さらに好適には、変異型エクソンのスキッピングを誘導及び／又は促進させて、機能性トランケート型タンパク質の発現を誘導及び／又は上昇させる効果（以下、「本発明における機能性トランケート型タンパク質の発現誘導・上昇効果」とも表示する。）を有する化合物を例示することができ、さらにより好適には、Ｃｌｋ阻害化合物を例示することができる。かかるＣｌｋ阻害化合物の中でも、上記一般式（１）［式中、Ｒ_１及びＲ_２は各々独立に、直鎖状、分岐鎖状のＣ_１−Ｃ_１０炭化水素基を示し；Ｒ_３はメトキシ基、エトキシ基、アセトキシ基又はハロゲン原子を示す。］で表される化合物を好適に例示することができ、中でも、ＴＧ００３（上記一般式（１）において、Ｒ_１及びＲ_２がメチル基であり、Ｒ_３がメトキシ基である化合物）を特に好適に例示することができる。上記一般式（１）で表される化合物は、前述の特許文献１に記載の方法等により合成することができる。

【0017】

本発明が対象とする遺伝性疾患に対する予防効果（以下、「本発明の予防効果」とも表示する。）とは、その遺伝性疾患の発症を抑制する効果や、発症を遅延させる効果を含み、本発明が対象とする遺伝性疾患に対する改善効果（以下、「本発明の改善効果」とも表示する。）とは、その遺伝性疾患の症状を改善する効果の他、本発明の予防・改善剤を投与しない場合と比較して症状の悪化の速度を遅延させる効果を含む。

【0018】

ある化合物が、本発明の予防・改善効果を有しているかどうかは、例えば、本発明が対象とする遺伝性疾患のモデル哺乳動物（すなわち、本発明が対象とする遺伝性疾患の要因となる変異を有するモデル哺乳動物（好ましくはモデル非ヒト哺乳動物））にその被検化合物を投与する工程Ａ；そのモデル哺乳動物における前記遺伝性疾患の症状を確認する工程Ｂ；前記工程Ｂにおける遺伝性疾患の症状の程度と、被検化合物を投与しなかった場合の症状の程度とを比較する工程Ｃ；前記工程Ｂにおける遺伝性疾患の症状の程度が、被検化合物を投与しなかった場合の症状の程度と比較して低い場合に、該被検化合物を本発明の予防・改善効果を有する化合物と評価する工程Ｄ；を有する方法により、確認することができる。

【0019】

また、ある化合物が、本発明におけるスキッピング誘導・促進効果を有しているかどうかは、例えば、変異型エクソンと、該エクソンに隣接する領域（エクソン領域又はイントロン領域）を含むＤＮＡ断片（ミニ遺伝子）を適当な哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで組換えベクターを作製する工程；かかる組換えベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクションする工程；トランスフェクションにより得られた形質転換細胞（以下、「本発明における形質転換細胞」とも表示する。）と、被検化合物とを接触させた状態で、該形質転換細胞を培養する工程：培養した形質転換細胞からＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによりミニ遺伝子に対応するＲＮＡを増幅する工程；増幅産物を解析（例えば電気泳動や配列決定）することによって、変異型エクソンのスキッピングが誘導及び／又は促進されているかどうかを確認する工程；変異型エクソンのスキッピングが誘導及び／又は促進されている場合に、その被検化合物を、本発明におけるスキッピング誘導・促進効果を有する化合物と評価する工程；を含む、本発明におけるスキッピング誘導・促進効果を有する化合物の判定方法により、確認することができる。

【0020】

さらに、ある化合物が、トランケート型タンパク質の発現誘導・上昇効果を有しているかどうかは、本発明における形質転換細胞と、被検化合物とを接触させた状態で、該形質転換細胞を培養する工程；培養した形質転換細胞中に発現するタンパク質を解析することによって、トランケート型タンパク質の発現が誘導及び／又は上昇しているかどうかを確認する工程；トランケート型タンパク質の発現が誘導及び／又は上昇している場合に、その被検化合物を、トランケート型タンパク質の発現誘導・上昇効果を有する化合物と評価する工程；を含む、トランケート型タンパク質の発現誘導・上昇効果を有する化合物の判定方法により、確認することができる。トランケート型タンパク質の検出は、変異型エクソンにコードされるペプチドに対する抗体や、それ以外のエクソンにコードされるペプチドに対する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析において、変異型エクソンにコードされるペプチドに対するシグナルが検出されず、かつ、それ以外のエクソンにコードされるペプチドに対するシグナルが検出されることを確認すること等によって行うことができる。また、そのトランケート型タンパク質が機能性トランケート型タンパク質であるかどうかは、本発明が対象とする遺伝性疾患のモデル哺乳動物においてそのトランケート型タンパク質を発現させたときに、その遺伝性疾患の症状が改善されること等を指標にして確認することができる。なお、本発明における「機能性トランケート型タンパク質」とは、遺伝性疾患の要因となる遺伝子のエクソンが少なくとも１つ欠失した成熟ｍＲＮＡによりコードされたトランケート型タンパク質であって、かつ、その遺伝子に対応する正常遺伝子の全長タンパク質の機能（特に、遺伝性疾患に関連する機能）が少なくともある程度残存しているタンパク質を意味する。

【0021】

また、ある化合物が、Ｃｌｋ阻害化合物であるかどうかは、被検化合物の存在下で、Ｃｌｋのリン酸化活性を測定する工程；測定の結果得られたリン酸化活性の値を、被検化合物の非存在下におけるＣｌｋのリン酸化活性の値と比較する工程；被検化合物の存在下におけるＣｌｋのリン酸化活性の値が、被検化合物の非存在下におけるＣｌｋのリン酸化活性の値より低い場合に、その被検化合物をＣｌｋ阻害化合物と評価する工程；を有する方法により、容易に確認することができる。上記のＣｌｋは、公知のＣｌｋの配列情報に基づいて、所望の哺乳動物からＣｌｋ遺伝子を単離し、該遺伝子を適当な発現ベクターにインテグレイトして発現させた後、そのＣｌｋを単離することによって容易に入手することができる。Ｃｌｋのリン酸化活性は、Ｃｌｋの基質であるＳＲタンパク質がリン酸化されたリン酸化ＳＲタンパク質に特異的に結合する抗体等を用いて測定することができる。また、Ｃｌｋ遺伝子の由来となる前述の哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。

【0022】

本発明が対象とする遺伝性疾患における「変異」の種類としては、該変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る限り特に制限されず、ナンセンス変異、スプライシング異常の他、正常な野生型の遺伝子と比較してアミノ酸の読み枠がずれる（アウトオブフレーム）変異などを例示することができ、中でも、ナンセンス変異やアウトオブフレーム変異を好適に例示することができ、中でも、該遺伝性疾患の要因となる遺伝子におけるエクソンスプライシングエンハンサー活性を抑制し、及び／又は、該遺伝子におけるエクソンスプライシングサイレンサー活性を上昇させる、ナンセンス変異やアウトオブフレーム変異をより好適に例示することができ、中でも、そのナンセンス変異やアウトオブフレーム変異が含まれるエクソンのスキッピングが誘導・促進されるようなナンセンス変異やアウトオブフレーム変異を特に好適に例示することができる。なお、前述のアウトオブフレーム変異としては、遺伝子の欠失、重複又は逆位であって、かつ、正常な野生型の遺伝子と比較してアミノ酸の読み枠がずれる変異を例示することができる。

【0023】

本発明においてスキッピングさせる対象となる「該変異が含まれるエクソン」とは、かかる変異が含まれる１個のエクソンに限らず、そのエクソンを含む隣接した複数個（好ましくは２〜８個、より好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個、より好ましくは２個）のエクソンであってもよく、かかるエクソンの好ましい個数や範囲は、かかるエクソンをスキッピングさせたときに残りのエクソンがインフレームとなるように連結されることや、残りのエクソンにより構成される成熟ｍＲＮＡがコードするトランケート型タンパク質が機能性トランケート型タンパク質となることを指標にして、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、遺伝子がジストロフィン遺伝子である場合は、公知のエクソン情報（図７）に基づいて、スキッピングさせるエクソンの個数や範囲を決定することができる。この図７において、２つのエクソンの境目が垂直な直線（例えばエクソン３とエクソン４の間の直線を参照）であればエクソンの境目はコドンの境目と一致しており、２つのエクソンの境目が角度の緩い斜線（例えばエクソン１とエクソン２の間の斜線を参照）であればエクソンの境目はコドンの１文字目と２文字目の間にあり、２つのエクソンの境目が角度の急な斜線（例えばエクソン６とエクソン７の間の斜線を参照）であればエクソンの境目はコドンの２文字目と３文字目の間にあることを示している。したがって、例えばアウトオブフレーム変異がエクソン５１中に存在する場合は、エクソン５１と５２をスキッピングさせたり、エクソン５０と５１をスキッピングさせれば、残りのエクソンはインフレームとなり、また、アウトオブフレーム変異がエクソン５３に存在する場合は、エクソン５３〜５８をスキッピングさせたり、エクソン５２と５３をスキッピングさせれば残りのエクソンはインフレームとなる。

【0024】

本発明における「エクソンのスキッピング」あるいは「エクソンをスキッピングさせる」とは、遺伝子から転写されて生成したｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体）から成熟ｍＲＮＡにプロセシングされる際に、ｍＲＮＡ前駆体からそのエクソンが消失すること、あるいは、そのエクソンを消失させることを意味する。

【0025】

本発明が対象とする遺伝性疾患の種類としては、遺伝子のエクソン中の変異に起因する遺伝性疾患であって、かつ、該変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る遺伝性疾患である限り特に制限されないが、中でも、遺伝子のエクソン中の変異に起因し、かつ、該変異が含まれるエクソンがスキッピングされ、機能性トランケート型タンパク質を一部に生成している遺伝性疾患を好適に例示することができ、より具体的には、前述の遺伝性疾患において、遺伝子がジストロフィン遺伝子であり、前述の機能性トランケート型タンパク質が機能性トランケート型ジストロフィンであるデュシェンヌ型筋ジストロフィーをより好適に例示することができ、中でも、前述のデュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて、ジストロフィン遺伝子のエクソンがジストロフィン遺伝子のエクソン３１やエクソン２７であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーをより好適に例示することができ、中でも、前述のデュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて、ジストロフィン遺伝子のエクソン３１中の変異が、配列番号１のポリヌクレオチド配列（ジストロフィンｃＤＮＡ配列）のヌクレオチド番号４３０３におけるグアニンのチミンへのナンセンス変異であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーや、ジストロフィン遺伝子のエクソン２７中の変異が、配列番号１のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６１３におけるグアニンが欠失したアウトオブフレーム変異であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを特に好適に例示することができる。

【0026】

本発明の予防・改善剤の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。また、本発明の予防・改善剤にＣｌｋ阻害化合物を用いる場合において、かかるＣｌｋ阻害化合物が阻害作用を発揮するＣｌｋの由来は、本発明の予防・改善剤の投与対象となる哺乳動物の種類と一致していることが、本発明の予防効果や改善効果をより多く享受し得ることから好ましい。

【0027】

本発明における化合物が有する本発明におけるスキッピング誘導・促進効果の好ましい程度としては、前述の本発明における形質転換細胞と、本発明における化合物（３０μＭ）とを接触させた状態で、該形質転換細胞を培養する工程：培養した形質転換細胞からＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによりミニ遺伝子に対応するＲＮＡを増幅する工程：増幅産物を解析（例えば電気泳動や配列決定）することによって、変異型エクソンがスキッピングされていない増幅産物に対する、変異型エクソンがスキッピングされている増幅産物の割合を算出する工程：により算出されるエクソンスキップ／インクルージョンレシオが、本発明における化合物を用いなかった場合のエクソンスキップ／インクルージョンレシオに対して、２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、さらに好ましくは５倍以上に上昇していることを好適に例示することができる。また、本発明における化合物を用いなかった場合のエクソンスキップ／インクルージョンレシオが０であったときに、エクソンスキップ／インクルージョンレシオを０より大きい正の値に誘導する効果は、本発明におけるスキッピング誘導・促進効果の特に好ましい程度として例示することができる。

【0028】

本発明の予防・改善剤は、本発明の予防・改善効果が得られる限り、前述の本発明における化合物の他に、他の遺伝性疾患予防・改善剤等の任意成分を含んでいてもよい。

【0029】

本発明の予防・改善剤に含有される本発明における化合物は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、本発明のより優れた予防・改善効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えば本発明における化合物を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明における化合物を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。

【0030】

本発明の予防・改善剤に含有される本発明における化合物の量としては、本発明の予防・改善効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、本発明の予防・改善剤の全量に対して例えば０．０００１〜９９．９９９９質量％、好ましくは０．００１〜８０質量％、より好ましくは０．００１〜５０質量％、さらに好ましくは０．００５〜２０質量％を好適に例示することができる。

【0031】

本発明の予防・改善剤の投与方法としては、本発明の予防・改善効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等を例示することができる。また、本発明の予防・改善剤の投与量は、投与対象の遺伝性疾患の状態や投与対象の体重等に応じて、適宜調節することができるが、本発明における化合物換算で成人１人１日当たり、例えば０．１μｇ〜１００００ｍｇ、より好ましくは１μｇ〜３０００ｍｇ、さらに好ましくは１０μｇ〜１０００ｍｇを好適に例示することができる。

【0032】

なお、本発明における化合物を含有する本発明の予防・改善剤は、遺伝性疾患の要因となる変異が含まれる遺伝子のエクソンのスキッピングを誘導・促進させるエクソンスキッピング誘導・促進剤としても使用することができる。また、本発明の他の態様として、本発明の予防・改善剤の製造における、本発明における化合物の使用：や、本発明における化合物を、本発明の予防・改善剤に使用する方法：や、遺伝性疾患の要因となる変異が含まれる遺伝子のエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質の発現を誘導・上昇することにおける、本発明における化合物の使用：や、本発明が対象とする遺伝性疾患の予防・改善における、本発明の化合物の使用：や、本発明の予防・改善剤を対象に投与することにより、本発明が対象とする遺伝性疾患を予防・改善する方法や、本発明におけるエクソンスキッピング誘導・促進剤を対象に投与することにより、遺伝性疾患の要因となる変異が含まれる遺伝子のエクソンのスキッピングを誘導・促進する方法も例示することができる。これらの使用や方法における文言の内容やその好ましい態様は、前述したとおりである。

【0033】

以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例1】

【0034】

［筋ジストロフィー患者のジストロフィン遺伝子の変異解析］
筋ジストロフィー患者４００名以上について、以下の方法により、そのジストロフィン遺伝子の変異を解析した。

【0035】

（変異解析）
標準的なフェノール−クロロフォルム抽出法により、患者の血液試料からＤＮＡを単離した。フィコールパーク密度勾配法（Amersham Biosciences AB社製）を用いて全血から回収した末梢リンパ球から、或いは凍結筋試料を薄片化した筋切片から、トータルＲＮＡを単離した。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）及びＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法により、骨格筋で発現したジストロフィンｍＲＮＡを分析した。骨格筋由来のジストロフィンｍＲＮＡについて、内側プライマーセット（フォワードｃ２７ｆ：CCTGTAGCACAAGAGGCCTTA（配列番号２）、及び、リバース２Ｆ：TCCACACTCTTTGTTTCCAATG（配列番号３））を使用してエクソン２７〜３２を含む領域を増幅した。増幅産物を精製し、そのまま、或いはpT7 Blue-T ベクター（Novagen社製）にサブクローニングしてから、増幅産物の配列を決定した。この配列の決定には、自動ＤＮＡ配列決定装置（モデル３１０；Applied Biosystems社製）を用いた。

【0036】

解析した筋ジストロフィー患者の一人（ＫＵＣＧ７９７）の症例は以下のとおりである。この患者は５歳の男児である。この男児の両親は健常な日本人で筋肉疾患の家族歴はなかった。１歳４ヶ月で一人歩きを始め、運動発達は正常だったが、２歳のときの定期血液検査で血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）値が２５６７ＩＵ／ｌ（正常値は１６９ＩＵ／ｌ未満）を示し、入院した。神戸大学病院で診察を受け、ジストロフィン遺伝子の変異について調べられた。ＣＫ値はその後、緩やかに上昇し続けた（１３３１〜４７４０ＩＵ／ｌ）が、筋力低下や歩行異常は認められなかった。５歳のときに筋バイオプシーを行った。以上の研究は神戸大学倫理委員会の承認を得て実施した。

【0037】

前述のＫＵＣＧ７９７のジストロフィン遺伝子には、エクソン３１に点変異が認められた。この変異は、ジストロフィンｃＤＮＡの４３０３番目のヌクレオチドがＧからＴ（ＲＮＡではＧからＵ）に置き換わったものである（ｃ．４３０３Ｇ＞Ｔ：図１ａ）。このヌクレオチドの変更は、グルタミン酸をコードするＧＡＧコドンからストップコドンをコードするＴＡＧへの置換だったため（ｐ．Ｇｌｕ１４３５Ｘ）、背景技術に記載の読み枠ルールにしたがえば、この症例ではジストロフィンが産生されず、重篤なＤＭＤとなることが予想された。

【0038】

（骨格筋バイオプシー、及び、ジストロフィン免疫染色）
次に、以下の方法で、前記患者（５歳）に骨格筋バイオプシーを行い、ジストロフィン免疫染色を行った。

【0039】

ＫＵＣＧ７９７について、大腿直筋のバイオプシーを行い、骨格筋試料を得た。この骨格筋試料を、液体窒素で冷却したイソペンタンで急速凍結した。凍結した骨格筋試料から、厚さ１０μｍの凍結連続切片を作製し、かかる切片を免疫組織化学染色により分析した。具体的には、前述の厚さ１０μｍの凍結連続切片を冷却アセトン中に５分間入れて固定した。この切片をヤギ正常血清でブロッキングし、抗ジストロフィン抗体（一次抗体）の共存下、４℃にて一晩インキュベートした。抗ジストロフィン抗体としては、ＤＹＳ２（Novocastra社製）、ＤＹＳ３（Novocastra社製）、及び、ＭＡＮＤＹＳ１（Glenn E. Morris教授・博士からの寄贈）の３種類を用いた。ＤＹＳ２は、ジストロフィン遺伝子のエクソン７７〜７９（Ｃ末端側）のエピトープを認識し、ＤＹＳ３は、ジストロフィン遺伝子のエクソン１０〜１２（Ｎ末端側）のエピトープを認識し、ＭＡＮＤＹＳ１は、ジストロフィン遺伝子のエクソン３１／３２（ｒｏｄドメイン）のエピトープを認識する。インキュベート後の切片をＰＢＳで６回洗浄した後、二次抗体としてAlexa Fluor 488で標識したヤギ抗マウス抗体又はヤギ抗ウサギ抗体の共存下、室温で９０分間インキュベートした。切片を洗浄した後、蛍光顕微鏡で切片を観察した。その結果を図１ｂに示す。図１ｂのパネルｅはＤＹＳ２で染色した結果を示し、図１ｂのパネルｆはＤＹＳ３で染色した結果を示し、図１ｂのパネルｇはＭＡＮＤＹＳ１で染色した結果を示す。

【0040】

ＫＵＣＧ７９７のジストロフィン遺伝子の遺伝子型からすると、重篤なＤＭＤが予想されたが、免疫組織化学染色の結果はその予想に反し、ＢＭＤにおける場合と同じように、Ｎ末端又はＣ末端のジストロフィンドメインを認識する抗体に対するまばらで不連続なシグナルが認められた（図１ｂのパネルｅやパネルｆ）。また、ジストロフィン遺伝子のエクソン３１／３２を認識するＭＡＮＤＹＳ１抗体に対するシグナルは認められなかった（図１ｂのパネルｇ）。なお、ポジティブコントロールとして、健常者由来の骨格筋試料について同様の免疫組織科学染色を行ったところ、ＤＹＳ２、ＤＹＳ３、ＭＡＮＤＹＳ１のいずれの抗体に対してもシグナルが確認された（図１ｂのパネルｂ、パネルｃ、パネルｄ）。

【0041】

（ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の解析）
ＫＵＣＧ７９７のジストロフィン遺伝子の遺伝子型（ＤＭＤ型）と、免疫染色パターンとの間のこの矛盾を説明するため、本発明者らは、ジストロフィン遺伝子のエクソン３１におけるナンセンス変異がエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）を破壊し、変異型エクソン（変異を含むエクソン）のスキッピングをもたらしたと推定した。この推定の可能性を証明するため、ＫＵＣＧ７９７の骨格筋のジストロフィンｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ増幅法で解析した。

【0042】

具体的には、ＫＵＣＧ７９７から単離したトータルＲＮＡをテンプレートとし、プライマーとして前述のフォワードｃ２７ｆ及びリバース２Ｆを使用してエクソン２７からエクソン３２に至る領域を増幅した。その増幅産物を、Tris−ホウ酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液中、２％アガロースゲル上で電気泳動した結果を図１ｃに示す。一番右のレーン（Ｐａｔｉｅｎｔ）は、ＫＵＣＧ７９７由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を示し、中央のレーン（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、健常者由来のトータルＲＮＡをテンプレートした結果を示す。コントロールでは、エクソン２７からエクソン３２に及ぶ領域の増幅産物は１種類であったが、ＫＵＣＧ７９７では、驚いたことに、２種類のほぼ同量の増幅産物が得られた。この２種類のうちの一方の増幅産物は予想通りのサイズであり、他方の増幅産物はより小さいサイズであった（図１ｃ）。この小さいサイズの増幅産物の配列決定を行ったところ、エクソン３１がスキッピングされていることが確認された（図１ｄ）。一方、予想通りのサイズの増幅産物の配列決定を行ったところ、エクソン３１のＴＡＧストップコドンを含む、エクソン２７〜３２の配列（７９３ｎｔ）が示された。他方、小さいサイズの増幅産物ではエクソン３１の配列が完全に欠失していたが、他のエクソンは完全なまま残った配列（６８２ｎｔ）となっており、変異型エクソン３１がスキッピングされたことが示唆された（図１ｃ）。ＫＵＣＧ７９７のジストロフィン遺伝子の他のイントロンのスプライシングも調べたが、他のイントロンは全て正しくスプライシングされていた（データは示さず）。エクソン３１（１１１ｎｔ）を欠失するジストロフィンｍＲＮＡ（６８２ｎｔ）はインフレームであり、トランケート型ではあるが機能は残存するジストロフィン（トランケート型ジストロフィン）を産生する。前述の免疫染色では、Ｎ末端又はＣ末端のジストロフィンドメインを認識する抗体を用いたので、前述のトランケート型ジストロフィンも染色されるはずであった。そこで、エクソン３１を含む領域に対するモノクローナル抗体であるＭＡＮＤＹＳ１を用いて免疫染色を行ったところ、かかるトランケート型ジストロフィンはＭＡＮＤＹＳ１には認識されなかった（図１ｂのパネルｇ）。

【0043】

以上の結果より、ｃ．４３０３Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｕ１４３５Ｘ）の点変異をそのジストロフィン遺伝子にもつ前記患者は、完全長のジストロフィンｍＲＮＡと、エクソン３１を欠失（Δエクソン３１）したジストロフィンｍＲＮＡの２種類を発現することが示された。また、これらの結果からは、この点変異がジストロフィン遺伝子のＯＲＦを破壊するだけでなく、エクソン３１のスプライスシグナルも破壊することも示唆された。

【0044】

（ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析１）
この仮説をさらに分析するため、細胞におけるスプライシング解析に用いられているＨ４９２ベクター（Mol Genet Metab (2005) 85, 213-219., J Med Genet (2006) 43, 924-930., Hum Genet (2007) 120, 737-742.）に、変異型エクソン３１とその両側の隣接イントロンとを含むジストロフィン遺伝子断片（変異型ミニ遺伝子）を挿入したプラスミド（Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１プラスミド）を構築し、かかるプラスミドをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞において、その遺伝子断片のｍＲＮＡを調べることにした。なお、Ｈ４９２ベクターは、２つのカセットエクソン（Ａ及びＢ）とマルチクローニングサイトを含むイントロン配列とをコードしている。

【0045】

Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１プラスミドは以下のような方法で構築した。ＫＵＣＧ７９７のゲノムＤＮＡから、ジストロフィン遺伝子の変異型エクソン３１とその両側の隣接イントロン領域とを含む断片をＰＣＲで増幅した。プライマーとして、イントロン３０ｆ−NheI（GCGGCTAGCGTGATCCACCTGCCTCGAC：配列番号４）、及び、イントロン３１ｒ−BamHI（GCGGGATCCTCAAATCCAATCTTGCCAAT：配列番号５）を使用した。前述の増幅産物をＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ（New England Biolabs社製）で消化した断片を、両酵素で消化したＨ４９２に挿入した。これにより、ＫＵＣＧ７９７由来の変異型エクソン３１とその両側の隣接イントロン領域とを含む断片（変異型ミニ遺伝子）を含むプラスミド（Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍプラスミド）を構築した（図１ｅ）。また、健常者のゲノムＤＮＡを利用した同様の方法により、ジストロフィン遺伝子の野生型エクソン３１とその両側の隣接イントロン領域とを含む断片（野生型ミニ遺伝子）を含むプラスミド（Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗプラスミド）を構築した（図１ｅ）。Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍプラスミド及びＨ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗプラスミドのいずれも、プラスミドの全配列の決定を行い、目的断片が含まれていることを確認した。

【0046】

Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍプラスミド、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗプラスミドを、Ｈｅｌａ細胞にそれぞれトランスフェクションし、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ及びＨ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ／Ｈｅｌａを得た。トランスフェクションは、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）を製造者マニュアルに従って使用して行った。トランスフェクションにより得られたこれらの細胞内では、ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶｐ）からｍＲＮＡ前駆体が転写される。

【0047】

Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ又はＨ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ／Ｈｅｌａから単離したトータルＲＮＡをテンプレートとし、プライマーとして前述のイントロン３０ｆ及びイントロン３０ｒを使用してミニ遺伝子を含む領域をＲＴ−ＰＣＲで増幅した。その増幅産物を、Tris−ホウ酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液中、２％アガロースゲル上で電気泳動した結果を図１ｆに示す。左から３番目のレーン（ｍ）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を示し、左から２番目のレーン（ｗ）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を示す。野生型ミニ遺伝子を含む形質転換細胞（Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ／Ｈｅｌａ）では、エクソンＡ、３１及びＢを含む１つのＲＴ−ＰＣＲ産物が認められた。他方、変異型ミニ遺伝子を含む形質転換細胞（Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ）では２つのＰＣＲ産物が検出された（図１ｆ）。配列決定の結果、小さい方のＤＮＡ産物はエクソン３１を含まないことが確認された（データは示さず）。なお、ネガティブコントロールとして、逆転写酵素（ＲＴ）を添加しないこと以外は同様にＲＴ−ＰＣＲ処理したものをアガロースゲルに電気泳動した結果を図１ｆの一番右のレーン（ｍ）及び右から２番目のレーン（ｗ）に示す。以上の結果から、この患者における点変異がジストロフィンのエクソン３１のスキッピングを引き起こし、Ｈ４９２ベクターにクローニングしたジストロフィン遺伝子の一部が、患者の筋肉で観察されたエクソン３１のスキッピングの再現能力を有することが明らかになった。

【実施例2】

【0048】

［エクソン３１スプライシングに関与するスプライシング調節因子の解析］
前述の実施例１の結果から、ＫＵＣＧ７９７のジストロフィン遺伝子のエクソン３１の点変異が、エクソンスキッピングを引き起こすことが示されたので、エクソン３１のスキッピングやインクルージョン（inclusion）を調節する候補因子の同定を試みた。

【0049】

（SpliceAidプログラムによる配列解析）
ジストロフィン遺伝子の野生型エクソン３１と、変異型エクソン３１のＲＮＡ配列をSpliceAidプログラム（http://www.introni.it/splicing.html）（Bioinformatics (2009) 25, 1211-1213.）で解析したところ、この変異型エクソン３１の点変異は、ＳＲタンパク質のメンバーであるＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９（ＳＦＳＲ９）との結合力を低下させることが分かった（図２ａ）。ＳＲタンパク質は、プリンリッチであることが多いエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）と結合することが知られている。エクソン３１の配列は、ＳＥＬＥＸで同定されたＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９に対する高親和性結合配列と高い類似性を有する（図２ｂ）（Rna (2007) 13, 1287-1300.）。上記変異型エクソン３１の変異は、ＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９に対する結合部位を破壊するだけでなく、ｈｎＲＮＰＡ１高親和性結合部位をも生じさせる（図２ａ）。つまり、上記変異型エクソン３１の変異は、ｈｎＲＮＰＡ１のＳＥＬＥＸ winner配列と高い相同性をもつＲＮＡ配列を生じさせる（図２ｂ）（Embo J (1994) 13, 1197-1204.）。ｈｎＲＮＰＡ１がエクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）と結合し、エクソンスキッピングを生じさせることはよく知られている。SpliceAidプログラムでの結果から、ジストロフィン遺伝子のエクソン３１のＥＳＥはＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９に認識され、変異によりＥＳＥがｈｎＲＮＰＡ１に結合するＥＳＳに変わることが示唆された。

【0050】

（ゲルモビリティシフトアッセイ）
ジストロフィン遺伝子のエクソン３１のＥＳＥはＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９に認識され、変異によりＥＳＥがｈｎＲＮＰＡ１に結合するＥＳＳに変わるという仮説を検証するため、先ず、ゲルモビリティシフトアッセイにより、ｈｎＲＮＰＡ１に対する結合活性を、変異型エクソン３１ＲＮＡと野生型エクソン３１ＲＮＡとで比較した。具体的には以下の方法で行った。

【0051】

ヒトｈｎＲＮＰＡ１ｃＤＮＡについてＰＣＲ増幅を行い、得られた増幅断片を、ＧＳＴ−ｐＣＤＮＡ３のＢａｍＨＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に挿入して、ＧＳＴ−ｈｎＲＮＰＡ１プラスミドを作製した。このプラスミドの全配列の決定を行い、目的断片が含まれていることを確認した。このＧＳＴ−ｈｎＲＮＰＡ１プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、得られた形質転換細胞を培養した。回収した形質転換細胞から、文献（Methods Mol Biol (2008) 488, 357-365.）記載の方法にしたがって全細胞溶解物を調製した。カラムから溶出する前に緩衝液Ｅ（２０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ ｐＨ７．９、１０００ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、及び１ｍＭ ＤＴＴ）で樹脂を２回洗浄すること以外は基本的に文献（The Journal of biological chemistry (2002) 277, 7540-7545.）記載のとおりに、抗ＧＳＴ親和性樹脂（SIGMA社製）を使用して、前述の全細胞溶解物からＧＳＴ−ｈｎＲＮＰＡ１タンパク質を精製した。次いで、^３２Ｐで標識した変異型エクソン３１ＲＮＡ又は野生型エクソン３１ＲＮＡを、前述のＧＳＴ−ｈｎＲＮＰＡ１タンパク質と混合し、２０℃で３０分間インキュベートして得られた複合体についてゲルモビリティシフトアッセイを行った。具体的には以下の方法を用いた。

【0052】

ゲルモビリティシフトアッセイは基本的に文献（Nucleic acids research (1995) 23, 3638-3641.）記載の方法のとおりに行った。すなわち、前述の各複合体を、８％天然ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動することによってアッセイを行った。バンドの分析は、オートラジオグラフィーにより行った。このアッセイで使用した結合緩衝液は、１６ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、８０ｍＭＫＣｌ、０．１６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．８ｍＭ ＤＴＴ、８％グリセロール、１００ｎｇ／μｌのＢＳＡ、５０ｎｇ／μｌのE. coli ｔＲＮＡ（Sigma Chemical Co.社製）、５×１０^４ｃｐｍのＲＮＡ（^３２Ｐで標識したジストロフィン遺伝子の変異型エクソン３１ＲＮＡ又は野生型エクソン３１ＲＮＡ）、及び、１Ｕ／μｌのRNasin（登録商標）（Promega社製）を含有していた。このゲルモビリティシフトアッセイの結果を図３ａに示す。

【0053】

図３ａに示すように、ｈｎＲＮＰＡ１が低濃度のときは、野生型エクソン３１ＲＮＡと変異型エクソン３１ＲＮＡの両方にほぼ同様に結合した（図３ａのレーン３、４及びレーン８、９）。これは恐らく、共通のｈｎＲＮＰＡ１結合部位が、野生型及び変異型の両方のエクソン３１上に存在するからであると考えられる（Hum Mol Genet (2006) 15, 999-1013.）。しかし、ｈｎＲＮＰＡ１がより高濃度のときは、ｈｎＲＮＰＡ１は、野生型エクソン３１ＲＮＡよりも変異型エクソン３１ＲＮＡにより効率的に結合し、ｈｎＲＮＰＡ１マルチマーを含む、より大きな複合体を形成した（図３ａのレーン５及びレーン１０）。これらの結果より、前記の患者でみられるエクソン３１の点変異は、ｈｎＲＮＰＡ１に対する新たな高親和性結合部位をエクソン３１上に生じさせ、その結果、変異型エクソン３１ＲＮＡ上のｈｎＲＮＰＡ１がより多く分布することを容易にしていることが示唆される。この結果から、変異型エクソン３１は、ｈｎＲＮＰＡ１とより強い結合親和性を持つようになったことで、スプライシングの際に、エクソンとして効率的に認識されなかった可能性が強く示唆された。この可能性を調べるため、次に、インビトロでのスプライシングアッセイを行った。

【0054】

（インビトロでの転写及びスプライシングアッセイ）
変異型エクソン３１は、ｈｎＲＮＰＡ１とより強い結合親和性を持つようになったことで、スプライシングの際に、エクソンとして効率的に認識されなかった可能性が考えられたので、この可能性を検証するために、インビトロでのスプライシングアッセイを行った。

【0055】

まず、かかるアッセイのために、ニワトリδクリスタリン（ＣＤＣ）ｍＲＮＡ前駆体（Molecular cell (2000) 6, 673-682.）のイントロン領域に、ジストロフィン遺伝子の野生型エクソン３１又は前述の変異型エクソン３１を含むｍＲＮＡ前駆体を調製した（図３ｂのパネルの右側の構築物参照）。具体的には、ＰＣＲで増幅した野生型エクソン３１を、ｐＣＤＣ（Molecular cell (2000) 6, 673-682.）のＳａｃＩ部位とＳｔｙＩ部位との間に挿入することにより、ｐＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗを作製した。また、野生型エクソン３１に代えて変異型エクソン３１を用いて、同様の方法でｐＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍを作製した。ｐＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ及びｐＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍを、それぞれＳｍａＩで線状化し、インビトロ転写の鋳型とした。文献（Molecular cell (2000) 6, 673-682.）記載の方法にしたがって、ｍＲＮＡ前駆体が^３２Ｐで標識されるようにインビトロで転写を行い、次いで、転写されたｍＲＮＡ前駆体の精製を行った。また、インビトロスプライシングアッセイは、文献（Molecular cell (2000) 6, 673-682.）記載の方法にしたがって、１０μｌスケールでこれらのｍＲＮＡ前駆体（ＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ ｍＲＮＡ前駆体又はＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ ｍＲＮＡ前駆体）とＨｅｌａ細胞核抽出物（Cilbiotech社製）を混合し、次いで、３０℃下でパネル上部に示す時間（０、１５、３０、６０、９０分）、インキュベートすることにより行った。インキュベートして得られたｍＲＮＡ産物を、６％変性ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、次いで、オートラジオグラフィーによりＲＮＡバンドの分析を行った。その結果を図３ｂに示す。

【0056】

野生型エクソン３１を含むＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ ｍＲＮＡ前駆体を用いた結果（図３ｂのレーン３〜５）と、変異型エクソン３１を含むＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ ｍＲＮＡ前駆体を用いた結果（図３ｂのレーン８〜１０）を比較したところ、前者と比較して後者では、エクソン３１を含むｍＲＮＡ産物（図３ｂのパネルの右側に黒丸が付された位置の構造のｍＲＮＡ産物）の生成効率が低かった。他方、エクソン３１を含まないｍＲＮＡ産物（エクソン１４及び１５からなるｍＲＮＡ産物）については、変異型エクソン３１を含むＣＤＣ−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ ｍＲＮＡ前駆体を用いた場合の方がより効率的に生成していた。

【0057】

（ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析２）
次に、前述の実施例１で作製したＨ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ（変異型ミニ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションしたＨｅｌａ細胞）において、ＲＮＡ結合タンパク質（ＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９又はＳＲｐ７５／ＳＲＳＦ４）をさらに過剰発現させることによって、変異型ミニ遺伝子のスプライシングパターンにどのような影響が生じるかを調べることにした。

【0058】

ＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９の過剰発現に用いたプラスミド（Ｆｌａｇ−ＳＲｐ３０ｃプラスミド）は、ＰＣＲで増幅したヒトＳＲｐ３０ｃのｃＤＮＡを、Ｆｌａｇ−ｐＣＤＮＡ３（The Journal of biological chemistry (2004) 279, 7009-7013.）のＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入して作製し、ＳＲｐ７５／ＳＲＳＦ４の過剰発現に用いたプラスミド（Ｆｌａｇ−ＳＲｐ７５プラスミド）は、ＰＣＲで増幅したマウスＳＲｐ７５のｃＤＮＡを、Ｆｌａｇ−ｐＣＤＮＡ３のＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入して作製した。

【0059】

また、Ｆｌａｇ−ｈｎＲＮＰＡ１プラスミドは以下のような方法で作製した。ヒトｈｎＲＮＰＡ１ｃＤＮＡについてＰＣＲ増幅を行い、得られた増幅断片を、Ｆｌａｇ−ｐＣＤＮＡ３（Nucleic acids research (2009) 37, 6515-6527.）のＢａｍＨＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に挿入して、Ｆｌａｇ−ｈｎＲＮＰＡ１プラスミドを作製した。このプラスミドの全配列の決定を行い、目的断片が含まれていることを確認した。このＦｌａｇ−ｈｎＲＮＰＡ１プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、得られた形質転換細胞を培養した。回収した形質転換細胞から、文献（Methods Mol Biol (2008) 488, 357-365.）記載の方法にしたがって全細胞溶解物を調製した。カラムから溶出する前に緩衝液Ｅ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ ｐＨ７．９、１０００ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、及び１ｍＭ ＤＴＴ）で樹脂を２回洗浄すること以外は基本的に文献（The Journal of biological chemistry (2002) 277, 7540-7545.）記載のとおりに、抗Ｆｌａｇ−Ｍ２親和性樹脂（SIGMA社製）を使用して、前述の全細胞溶解物からＦｌａｇ−ｈｎＲＮＰＡ１タンパク質を精製した。

【0060】

Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍプラスミド及びＦｌａｇ−ＳＲｐ３０ｃプラスミドを、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）を用いてコトランスフェクションし、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ・Ｆｌａｇ−ＳＲｐ３０ｃ／Ｈｅｌａを得た。また、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍプラスミド及びＦｌａｇ−ＳＲｐ７５プラスミドを、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）を用いてコトランスフェクションし、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ・Ｆｌａｇ−ＳＲｐ７５／Ｈｅｌａを得た。さらに、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍプラスミド及びＦｌａｇ−ｈｎＲＮＰＡ１プラスミドを、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）を用いてコトランスフェクションし、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ・Ｆｌａｇ−ｈｎＲＮＰＡ１プラスミド／Ｈｅｌａを得た。

【0061】

これらの各形質転換細胞について、前述の実施例１の「ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析１」と同様のスプライシング解析を行った結果を図３ｃに示す。図３ｃの一番左のレーンはマーカーを示し、左から２番目のレーン（ｍｏｃｋ）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を示し、左から３番目のレーン（ＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ・Ｆｌａｇ−ＳＲｐ３０ｃ／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を示し、右から２番目のレーン（ＳＲｐ７５／ＳＲＳＦ４）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ・Ｆｌａｇ−ＳＲｐ７５／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を示し、一番右のレーン（ｈｎＲＮＰＡ）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ・Ｆｌａｇ−ｈｎＲＮＰＡ１プラスミド／Ｈｅｌａ由来のトータルＲＮＡをテンプレートとした結果を示す。また、図３ｃのバンド濃度を定量して、エクソン３１を含むｍＲＮＡに対するエクソン３１がスキッピングされたｍＲＮＡの割合（Exon skip/inclusion ratio：エクソンスキップ／インクルージョンレシオ）を算出した結果を図３ｄに示す。

【0062】

図３ｃ及びｄの結果から分かるように、ＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９が過剰発現している場合（図３ｃ及びｄのＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９）は、コントロールの場合（図３ｃ及びｄのｍｏｃｋ）と比較して、エクソンスキップ／インクルージョンレシオが有意に低下した。他方、ｈｎＲＮＰＡ１が過剰発現している場合（図３ｃ及びｄのｈｎＲＮＰＡ１）は、コントロールの場合（図３ｃ及びｄのｍｏｃｋ）と比較して、エクソンスキップ／インクルージョンレシオが有意に上昇した。なお、他のコントロールとして、ＳＲタンパク質の他のメンバーであるＳＲｐ７５／ＳＲＳＦ４（Molecular and cellular biology (1993) 13, 4023-4028.）を用いた場合（図３ｃ及びｄのＳＲｐ７５／ＳＲＳＦ４）は、コントロールの場合（図３ｃ及びｄのｍｏｃｋ）とエクソンスキップ／インクルージョンレシオは変わらず、スプライシングパターンに変化はなかった。

【0063】

以上の結果から、ジストロフィンエクソン３１は、ＳＲｐ３０ｃ／ＳＲＳＦ９依存性ＥＳＥを含み、このＥＳＥが変異し、ｈｎＲＮＰＡ１に結合するＥＳＳに変わることで、エクソン３１スキッピングが起きていることが強く示唆された。

【実施例3】

【0064】

［Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａの変異型エクソン３１のスキッピングに対するＴＧ００３の効果］
本発明者らは、ジストロフィン遺伝子のエクソン３１のスキッピングを促進し得る低分子化合物を見つけるために、様々な低分子化合物を探索した。その代表例として、以下には、ＴＧ００３とＳＲＰＩＮ３４０についての結果を記載する。

【0065】

ＴＧ００３及びＳＲＰＩＮ３４０はいずれも、オルタナティブスプライシングに影響する低分子化合物として知られている。ＳＲＰＩＮ３４０は、ＳＲ蛋白キナーゼ（ＳＲＰＫｓ）（Proc Natl Acad Sci U S A (2006) 103, 11329-11333.）に対する特異的阻害剤であり、恐らくＳＲＰＫによるＳＲタンパク質のリン酸化阻害を通じて、オルタナティブスプライシングを調節することができる（Biochem J (2009) 417, 15-27., Genome Biol (2009) 10, 242.）。もう一つは、ＴＧ００３と命名したＣｌｋキナーゼの阻害剤である。ＴＧ００３は、アデノウイルスＥ１Ａ、ＳＣ３５、及びＣｌｋ自体（非特許文献１２及び１３）のオルタナティブスプライシングに影響することも明らかにされている。

【0066】

（ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析３）
Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ（変異型ミニ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションしたＨｅｌａ細胞）を、３０μＭのＴＧ００３を含むＤＭＳＯ溶液又は３０μＭのＳＲＰＩＮ３４０を含むＤＭＳＯ溶液中で２４時間インキュベートした。ネガティブコントロールとしてＤＭＳＯ溶液を用いて同様にインキュベートした。インキュベートした各細胞について、前述の実施例１の「ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析１」と同様のスプライシング解析（細胞抽出したトータルＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ解析）を行った結果を図４ａに示す。図４ａの一番左のレーンは、φＸ１７４−ＨａｅＩＩＩで消化したＤＮＡサイズマーカーを示し、左から２番目のレーン（ＤＭＳＯ）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／ＨｅｌａをＤＭＳＯ処理した場合の結果を示し、左から３番目のレーン（ＴＧ００３）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／ＨｅｌａをＴＧ００３処理した場合の結果を示し、一番右のレーン（ＳＲＰＩＮ３４０）は、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／ＨｅｌａをＳＲＰＩＮ３４０処理した場合の結果を示す。また、図４ａのバンド濃度を定量して、エクソンスキップ／インクルージョンレシオを算出した結果を図４ｂに示す。

【0067】

図４ａ及びｂの結果から分かるように、ＳＲＰＩＮ３４０処理した場合（図４ａ及びｂのＳＲＰＩＮ３４０）は、コントロールの場合（図４ａ及びｂのＤＭＳＯ）とほとんど変わらないエクソンスキップ／インクルージョンレシオを示したが、ＴＧ００３処理した場合（図４ａ及びｂのＴＧ００３）は、コントロールの場合（図４ａ及びｂのＤＭＳＯ）と比較して、エクソンスキップ／インクルージョンレシオが有意に上昇した。すなわち、ＳＲＰＩＮ３４０はエクソン３１のスキッピングには殆ど影響しないが、ＴＧ００３は、エクソン３１のスキッピングを有意に促進することが示された。

【0068】

（ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析４）
「ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析３」の結果からは、ＴＧ００３が、変異型エクソン３１のスキッピングだけでなく、野生型エクソン３１のスキッピングをも促進する可能性もあった。そこで、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ（変異型ミニ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションしたＨｅｌａ細胞）と共に、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ／Ｈｅｌａ（野生型ミニ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションしたＨｅｌａ細胞）を用いて、前述の「ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析３」と同様の方法でスプライシング解析を行った。なお、細胞を処理する溶液としては、種々の濃度（０μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、５０μＭ）のＴＧ００３を含むＤＭＳＯ溶液を用いた。その結果を図４ｃに示す。また、図４ｃのバンドの濃度を定量して、エクソンスキップ／インクルージョンレシオを算出した結果を図４ｄに示す。

【0069】

図４ｃ及びｄの結果から分かるように、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ（変異型ミニ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションしたＨｅｌａ細胞）では、ＴＧ００３はエクソン３１のスキッピングを用量依存的に促進した。一方、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｗ／Ｈｅｌａ（野生型ミニ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションしたＨｅｌａ細胞）では、ＴＧ００３が５０μＭであっても、エクソン３１のスキッピングを起こさず、図４ｄのグラフでは横軸にほとんど沿う結果となった。これらの結果より、ＴＧ００３は、野生型エクソン３１ではエクソンスキッピングを促進せず、変異型エクソン３１のエクソン３１のスキッピングを特異的に促進することが示された。

【実施例4】

【0070】

［Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｍ／Ｈｅｌａの変異型エクソン２７のスキッピングに対するＴＧ００３の効果］
ＴＧ００３が、ジストロフィン遺伝子のエクソン３１以外のエクソンの変異に対してもスキッピングを促進させる効果を発揮するか否かを確認するために、ＫＵＣＧ７９７の患者とは別の筋ジストロフィー患者由来のジストロフィン遺伝子の変異を解析した。この患者のジストロフィン遺伝子の変異はエクソン２７に認められた。この変異は、ジストロフィンｃＤＮＡ（配列番号１）の３６１３番目のグアニンヌクレオチドが欠失したものである（ｃ．３６１３ｄｅｌＧ）。この変異は、ジストロフィンｃＤＮＡ（配列番号１）の読み枠をシフトさせるアウトオブフレーム変異であり、その結果、その変異の少しＣ末端側（ジストロフィンｃＤＮＡ（配列番号１）の３６４１番目から３６４３番目のヌクレオチド部分）にストップコドン（終止コドン）を生じさせる。本明細書の背景技術に記載の読み枠ルールにしたがえば、この症例ではジストロフィンが産生されず、重篤なＤＭＤとなることがその遺伝子型から予想されたが、実際の症状はそれより軽症であった。

【0071】

この患者のゲノムＤＮＡから、ジストロフィン遺伝子の変異型エクソン２７とその両側の隣接イントロン領域とを含む断片をＰＣＲで増幅した。プライマーとして、イントロン２６ｆ-NheI（GCGGCTAGCAAATTTATGGAAGAGACTGGAGTTCA：配列番号６）、及び、イントロン２７ｒ-BamHI（GCGGGATCCCAAGTTAAGCAAATGGCCCAAA：配列番号７）を使用した。この増副産物をNheI（New England Biolabs社製）、及び、 BamHI (New England Biolabs社製)で消化した断片を、それら両酵素で消化したＨ４９２ベクターに挿入した。これにより、この患者由来の変異型エクソン２７とその両側の隣接イントロン領域とを含む断片を含むプラスミド（Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｍ）を構築した。また、健常者のゲノムＤＮＡを利用した同様の方法により、ジストロフィン遺伝子の野生型エクソン２７と、その両側の隣接イントロン領域とを含む断片を含むプラスミド（Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｗ）を構築した。Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｍプラスミド及びＨ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｗプラスミドのいずれも、プラスミドの全配列の決定を行い、目的断片が含まれていることを確認した。

【0072】

前述の「ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析１」における方法と同様の方法で、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｍ、及び、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｗを、Ｈｅｌａ細胞にそれぞれトランスフェクションし、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｍ／Ｈｅｌａ、及び、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｍ／Ｈｅｌａを得た。

【0073】

Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａ、及び、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ３１ｍ／Ｈｅｌａに代えて、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｍ／Ｈｅｌａ、及び、Ｈ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｍ／Ｈｅｌａをそれぞれ用いたこと以外は、前述の「ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析４」における方法と同様の方法でスプライシング解析を行った。その結果を図５ａに示す。また、図５ａのバンドの濃度を定量して、エクソンスキップ／インクルージョンレシオを算出した結果を図５ｂに示す。

【0074】

図５ａ及びｂの結果から分かるように、変異型エクソン２７を利用したＨ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｍ／Ｈｅｌａでは、ＴＧ００３はそのエクソン２７のスキッピングを用量依存的に促進した。一方、野生型エクソン２７を利用したＨ４９２−ｄｙｓ Ｅｘ２７ｗ／Ｈｅｌａでは、ＴＧ００３が５０μＭであっても、エクソン２７のスキッピングを起こさず、図５ｂのグラフでは横軸にほとんど沿う結果となった。すなわち、ＴＧ００３は、野生型エクソン２７ではエクソンスキッピングを促進せず、変異型エクソン２７のエクソン２７のスキッピングを特異的に促進することが示された。これらの結果より、ＴＧ００３は、変異型エクソン３１だけでなく、変異型エクソン２７のスキッピングも促進することが明らかとなった。

【実施例5】

【0075】

［ＫＵＣＧ７９７由来の細胞における、変異型エクソン３１のスキッピングに対するＴＧ００３の効果］
次に、ジストロフィン遺伝子のスプライシングに対してＴＧ００３が及ぼす影響を、患者（ＫＵＣＧ７９７）由来の筋細胞において調べることとした。

【0076】

（ＫＵＣＧ７９７由来の筋細胞におけるスプライシング解析）
まず、ＫＵＣＧ７９７から採取した筋細胞について初代培養を行った。具体的には、以下のような方法で行った。６ウエルプレート（Gelatin-Coated micro plate 6 well with Lid；IWAKI社製）中に、２０％のＦＢＳ（Gibco社製）、４％のUltroser（登録商標）G（PALL社製）及び１％のAntibiotic-Antimyotic（Gibco社製）をコンフルエントになるまで添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma社製）にて、患者由来の筋細胞を培養した。筋細胞を筋管に分化させるため、２％ウマ血清（Gibco社製）及び１％Antibiotic-Antimyotic（Gibco社製）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma社製）において、種々の濃度（１μＭ、２μＭ、５μＭ、７μＭ、１０μＭ）のＴＧ００３の存在下又は不在下で、前述の初代筋細胞を２週間培養した。培地とＴＧ００３は２日毎に入れ替えた。

【0077】

培養したこれらの筋細胞を用いて、スプライシング解析を行った。その方法としては、イントロン３０ｆ−NheI、及び、イントロン３１ｒ−BamHIの両プライマーに代えて、前述のフォワードｃ２７ｆ及びリバース２Ｆの両プライマーを用いたこと以外は、前述の「ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析３」と同様の方法を用いた。前述のフォワードｃ２７ｆ及びリバース２Ｆの両プライマーは、ジストロフィン遺伝子のエクソン２７から３２に至る領域を増幅するプライマーセットである。かかるスプライシング解析の結果を図６ａに示す。また、図６ａのバンドの濃度を定量して、エクソンスキップ／インクルージョンレシオを算出した結果を図６ｂに示す。

【0078】

図６ａ及びｂの結果から分かるように、ＫＵＣＧ７９７由来の筋細胞を用いた場合であっても、ＴＧ００３はエクソン３１のスキッピングを用量依存的に促進した。これらの結果から、ＴＧ００３は、患者細胞の変異型エクソン３１のスキッピングを促進し得ることが示唆され、さらには、ジストロフィンの機能がある程度残存したトランケート型ジストロフィンの発現を増加させ得ることも強く期待された。

【0079】

（ＫＵＣＧ７９７由来の筋細胞におけるトランケート型ジストロフィンの発現解析）
前述のＫＵＣＧ７９７由来の筋細胞において、実際にトランケート型ジストロフィンが発現しているかどうかを確認するために、以下のウエスタンブロッティング解析を行った。

【0080】

２％ウマ血清（Gibco社製）及び１％Antibiotic-Antimyotic（Gibco社製）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma社製）において、前述のＫＵＣＧ７９７由来の初代筋細胞を、７μＭのＴＧ００３の存在下又は不在下で２週間培養した。培地とＴＧ００３は２日毎に入れ替えた。培養したこれらの筋細胞をＰＢＳで２回洗浄し、1XCell Lysis Buffer（Cell Signaling Technology社製）を用いて回収した。回収した細胞から抽出した総タンパク質を３〜１０％勾配ポリアクリルアミドゲル（PAGEL、ATTO社製）にアプライした。なお、総タンパク質のアプライ量としては、コントロールについては４μｇ、変異ＴＧ００３（０μＭ）については２０μｇ、変異ＴＧ００３（７μＭ）については６０μｇとした。ポリアクリルアミドゲルで泳動したタンパク質画分をHYBOND-Pメンブレン（GE Healthcare社製）にトランスファーした。ECL advance Western Blotting Detection kit（GE Healthcare社製）を製造者マニュアルに従って使用し、前述のメンブレンについてウエスタンブロッティング解析を行った。ジストロフィンのＣ末端に対する抗体（ＮＣＬ−ＤＹＳ２、Leica社製）、又は、ジストロフィンのエクソン３１に対応する部分に対する抗体（８Ｈ１１、Santa Cruz社製）を、それぞれ１：１０及び１：１００の希釈倍率にて使用し、前述のメンブレンのインキュベーションを行った。ジストロフィン抗ジストロフィン免疫複合体の検出には、抗マウスＩｇＧ抗体（GE Healthcare社製）を用いた。上述したものと同じプロトコールによって、デスミンのウエスタンブロッティング解析を行った。デスミン抗体（Ｈ−７６、Santa Cruz社製）は希釈倍率１：５０で使用した。デスミン抗デスミン免疫複合体の検出には、抗ウサギＩｇＧ抗体（GE Healthcare社製）を用いた。

【0081】

以上のウエスタンブロッティング解析の結果を図６ｃに示す。ジストロフィンのＣ末端に対する抗体を用いた結果（Dystrophin(C-terminal))から分かるように、ＴＧ００３を投与すると、ジストロフィンの発現が増加することが示された。ただし、このジストロフィンは、エクソン３１に対応する部分に対する抗体では検出できなかったことから（図６のDystrophin(Exon 31/32)の結果）、このジストロフィンでは、エクソン３１に対応する部分（エクソン３１にコードされるペプチド）が欠失していると考えられる。以上の結果から、ＴＧ００３は、ｃ．４３０３Ｇ＞Ｔ変異を有するＫＵＣＧ７９７由来の細胞においてエクソン３１スキッピングを促進することにより、トランケート型ジストロフィンの発現を促進することが示された。

【産業上の利用可能性】

【0082】

本発明は、遺伝性疾患の予防・改善の分野に好適に利用することができる。より詳細には、遺伝子のエクソンの変異に起因し、かつ、該変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る遺伝性疾患の予防・改善の分野に好適に利用することができる。

【図7】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]