特許 5950899 多層の血管チューブ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5950899

(24)【登録日】2016年6月17日

(45)【発行日】2016年7月13日

(54)【発明の名称】多層の血管チューブ

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/00 20060101AFI20160630BHJP

   A61K 35/33 20150101ALI20160630BHJP

   A61K 35/44 20150101ALI20160630BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20160630BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20160630BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20160630BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20160630BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20160630BHJP

【ＦＩ】

   A61L27/00 Q

   A61K35/33

   A61K35/44

   A61P3/10

   A61P13/12

   A61P9/00

   A61P9/10 101

   C12N5/071

【請求項の数】19

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2013-500188(P2013-500188)

(86)(22)【出願日】2011年3月16日

(65)【公表番号】特表2013-538064(P2013-538064A)

(43)【公表日】2013年10月10日

(86)【国際出願番号】US2011028713

(87)【国際公開番号】WO2011116125

(87)【国際公開日】20110922

【審査請求日】2013年7月3日

(31)【優先権主張番号】61/314,238

(32)【優先日】2010年3月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】GB1008781.5

(32)【優先日】2010年5月26日

(33)【優先権主張国】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】512240671

【氏名又は名称】オルガノボ，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】カティワラ，チラグ

(72)【発明者】

【氏名】マーフィー，キース

(72)【発明者】

【氏名】シェパード，ベンジャミン

【審査官】 井上 明子

(56)【参考文献】

【文献】 The FASEB Journal，１９９８年，Vol.12, No.1，p.47-56

【文献】 Biomaterials，２００９年，Vol.30, No.30，p.5910-5917

【文献】 Tissue Engineering : Part A，２０１０年 ３月 ８日，Vol.16, No.6，p.1901-1912

【文献】 Tissue Engineering，２００６年，Vol.12, No.8，p.2151-2160

【文献】 Tissue Engineering，２００５年，Vol.11, No.9/10，p.1553-1561，CAPLUS file [STN online], [retrieved on 2014.07.25] AN2005:1166221

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｌ ２７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

分化した成人の線維芽細胞の少なくとも１つの層、および分化した成人の平滑筋細胞の少なくとも１つの層を含む、人工的に作られた多層の血管チューブであって、ここで、任意の層は、分化した成人の内皮細胞をさらに含み、前記人工的に作られた多層の血管チューブは、１０：９０から４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合を有し、前記人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがなく、少なくとも１つの層が生物印刷の使用によって形成されるという条件で、前記人工的に作られた多層の血管チューブは、以下の特徴：
（ａ）前記人工的に作られた多層の血管チューブが生理学的な血圧に抵抗できるように柔軟である；
（ｂ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの内部径が、６ｍｍまたはそれ以下である；
（ｃ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの長さが３０ｃｍまでである；および
（ｄ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの厚さが、前記人工的に作られた多層の血管チューブの領域にわたって略均一である、
のうちの１又は２以上を有することを特徴とする、人工的に作られた多層の血管チューブ。

【請求項2】

分化した成人の線維芽細胞の外側層、および分化した成人の平滑筋細胞の少なくとも１つの内側層を含むことを特徴とする、請求項１に記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。

【請求項3】

分化した成人の平滑筋細胞、分化した成人の内皮細胞、および分化した成人の線維芽細胞を含む、人工的に作られた多層の血管チューブであって、前記人工的に作られた多層の血管チューブは、１０：９０から４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合を有し、ここで、前記平滑筋細胞、前記内皮細胞、および前記線維芽細胞は互いに凝集し、前記人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがなく、少なくとも１つの層が生物印刷の使用によって形成されるという条件で、前記人工的に作られた多層の血管チューブは、以下の特徴：
（ａ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの内部径が、６ｍｍまたはそれ以下である；
（ｂ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの長さが３０ｃｍまでである；および（ｃ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの厚さが、前記人工的に作られた多層の血管チューブの領域にわたって略均一である、
のうちの１又は２以上を有することを特徴とする、人工的に作られた多層の血管チューブ。

【請求項4】

前記人工的に作られた多層の血管チューブが、生理学的な血圧に抵抗するのに十分である破裂強さを有することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。

【請求項5】

内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合が、１５：８５から２５：７５までであることを特徴とする、請求項１乃至３に記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。

【請求項6】

前記人工的に作られた多層の血管チューブの内部径が、０．５ｍｍまたはそれ以下であることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれかに記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。

【請求項7】

前記人工的に作られた多層の血管チューブの厚さが、前記人工的に作られた多層の血管チューブの長さにわたって略均一であることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれかに記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。

【請求項8】

前記人工的に作られた多層の血管チューブには、分化していない成人の線維芽細胞、分化していない成人の平滑筋細胞、及び／又は分化していない成人の内皮細胞が本質的になく、及び／又は前記人工的に作られた多層の血管チューブが、分枝した構造を有することを特徴とする、請求項１乃至７のいずれかに記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。

【請求項9】

前記人工的に作られた多層の血管チューブが神経交配されないものであり、及び／又は前記分化した成人の線維芽細胞が、非血管性の線維芽細胞であることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれかに記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。

【請求項10】

ａ）薬物検査、または随意にステントである、心血管装置の検査；又は
ｂ）破損した血管の修復；又は
ｃ）冠状動脈バイパスまたは末端バイパスまたは動静脈のアクセスを必要とする患者の処置；又は
ｄ）末期腎疾患、糖尿病、動脈硬化症、または先天性の心臓疾患を有する患者の処置に使用するための、請求項４に記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。

【請求項11】

前記人工的に作られた多層の血管チューブの線維芽細胞、平滑筋細胞、及び／又は内皮細胞が自己由来の細胞であることを特徴とする、請求項１０に記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。

【請求項12】

人工的に作られた多層の血管チューブを形成する方法であって、該方法は、あらかじめ形成されたスキャフォールドがいかなる時も使用されなく、少なくとも１つの層が生物印刷の使用によって形成されるという条件で、所望の血管チューブ構造を形成するために、充填マトリックスの少なくとも１つの体、互いに凝集した平滑筋細胞の少なくとも１つの多細胞体、互いに凝集した内皮細胞の少なくとも１つの多細胞体、および互いに凝集する線維芽細胞の少なくとも１つの多細胞体を位置決めする工程を含み、人工的に作られた多層の血管チューブにおける内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合が、１０：９０から４５：５５までであり、ここで、１以上の充填マトリックス体は、前記人工的に作られた多層の血管チューブの内腔を形成し、複数の充填マトリックス体は、前記人工的に作られた多層の血管チューブを囲み、および該方法はさらに、前記人工的に作られた多層の血管チューブの多細胞体が凝集するのを可能にする工程を含むことを特徴とする方法。

【請求項13】

前記人工的に作られた多層の血管チューブ内での内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、１５：８５から２５：７５までであり、及び／又は前記人工的に作られた多層の血管チューブの内腔の直径が６ｍｍまたはそれ以下であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

熟成チャンバーにおいて前記人工的に作られた多層の血管チューブを培養する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

細胞の多細胞体の１以上が細長いことを特徴とする、請求項１２乃至１４に記載の方法。

【請求項16】

加圧された腔内の液体灌流によって、凝集した人工的に作られた多層の血管チューブを調整する工程をさらに特徴とする、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

前記腔内の液体灌流が、６０ｍｍＨｇから２００ｍｍＨｇまでの圧力で行われることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記腔内の液体灌流が、拍動力を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記分化した成人の内皮細胞が、ヒト大動脈の内皮細胞であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１０年３月１６日に出願の、米国仮特許出願第６１／３１４，２３８号、および２０１０年５月２６日に出願の、英国特許出願第１００８７８１．５号の利益を主張し、これらの各々の開示は、それらの全体が引用によって本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

米国において、病気にかかった動脈に関する血管または腹部器官を、特に、小さな直径の血管グラフトと置換する必要性がある。６ミリメートル未満の直径を有する小動脈は、血栓症の高い罹患率により人工材料と交換することができない（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ． （１９８８）； Ｇｒｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８））。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本明細書には、人工的に作られた（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）多層の血管チューブ、このようなチューブを生成する方法、およびこのようなチューブのための治療上、診断上、または研究上の用途が記載される。本明細書に記載される人工的に作られた血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがなく、なぜなら、あらかじめ形成されたスキャフォールドは、本明細書に記載される人工的に作られた多層の血管チューブの生成に利用されないからである。この革新は、あらかじめ形成されたスキャフォールド材料がなく、したがって、操作さていない多層の血管チューブに対する治療上許容可能な代替物である、実現可能な人工的に作られた多層の血管チューブをとりわけ提供する。

【0004】

１つの態様において、本明細書には、分化した成人の線維芽細胞の少なくとも１つの層、分化した成人の平滑筋細胞の少なくとも１つの層を含む、人工的に作られた多層の血管チューブが記載され、ここで、任意の層は、分化した成人の内皮細胞をさらに含み、ここで、前記チューブは、人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがないという条件で、以下の特徴：（ａ）約１：９９から約４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｂ）人工的に作られた多層の血管チューブは柔軟である（ｃｏｍｐｌｉａｎｔ）；（ｃ）人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｄ）チューブの長さは約３０ｃｍまでである；および（ｅ）人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である；を有する。

【0005】

１つの実施形態において、線維芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞は自己由来の細胞である。別の実施形態において、破裂強さは、生理学的な血圧に抵抗するのに十分である。さらに別の実施形態において、チューブの内腔は、除去可能な内腔を形成する充填体（ｆｉｌｌｅｒ ｂｏｄｙ）から形成された。さらに別の実施形態において、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約５：９５から約２５：７５までである。さらに別の実施形態において、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約１５：８５である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは柔軟である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約０．５ｍｍまたはそれ以下である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの長さにわたって略均一である。さらに別の実施形態において、チューブには、分化していない成人の線維芽細胞が本質的にない。さらに別の実施形態において、チューブには、分化していない成人の平滑筋細胞が本質的にない。さらに別の実施形態において、チューブには、分化していない成人の内皮細胞が本質的にない。さらに別の実施形態において、チューブは、分枝した構造を有する。さらに別の実施形態において、チューブは、磁気微粒子をさらに含む。さらに別の実施形態において、チューブは、バイパス移植術に使用するためのものである。さらに別の実施形態において、チューブは、動静脈へのアクセスに使用するためのものである。さらに別の実施形態において、チューブは、薬物検査に使用するためのものである。さらに別の実施形態において、チューブは、心血管装置の検査に使用するためのものである。さらに別の実施形態において、心血管装置は、ステントである。幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、神経交配しないものである（ｎｏｎ−ｉｎｎｅｒｖａｔｅｄ）。幾つかの実施形態において、前記分化した成人の線維芽細胞は、非血管性の線維芽細胞である。

【0006】

別の態様において、人工的に作られた多層の血管チューブを形成する方法があり、該方法は、あらかじめ形成されたスキャフォールドがいかなる時も使用されないという条件で、充填マトリックス（ｆｉｌｌｅｒ ｍａｔｒｉｘ）の少なくとも１つの体、互いに凝集した平滑筋細胞の少なくとも１つの多細胞体、互いに凝集した内皮細胞の少なくとも１つの多細胞体、および所望の血管チューブ構造を形成するための互いに凝集する線維芽細胞の少なくとも１つの多細胞体を位置決めする工程を含み、ここで、１以上の充填マトリックス体は、チューブの内腔を形成し、複数の充填マトリックス体は、チューブを囲み；および該方法はさらに、人工的に作られた多層の血管チューブの多細胞体が凝集するのを可能にする。

【0007】

１つの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブ内での、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約１：９９から約４５：５５までである。別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブ内での、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約５：９５から約２５：７５までである。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブ内での、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約１５：８５である。さらに別の実施形態において、チューブの内腔は、約６ｍｍまたはそれ以下である。さらに別の実施形態において、チューブの内腔は、約０．５ｍｍまたはそれ以下である。さらに別の実施形態において、平滑筋細胞、内皮細胞、及び／又は線維芽細胞は、自己由来の細胞である。さらに別の実施形態において、平滑筋細胞、内皮細胞、及び／又は線維芽細胞は、ヒト成人の分化細胞である。さらに別の実施形態において、前記方法は、熟成チャンバーにおいて人工的に作られた多層の血管チューブを培養する工程をさらに含む。幾つかの実施形態において、細胞の多細胞体の１以上は細長い。幾つかの実施形態において、細胞の多細胞体の１以上は略球状である。

【0008】

別の態様において、分化した成人の線維芽細胞の少なくとも１つの層、分化した成人の平滑筋細胞の少なくとも１つの層を含む、人工的に作られた多層の血管チューブがあり、ここで、任意の層は、分化した成人の内皮細胞をさらに含み、前記チューブは、人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがないという条件で、以下の特徴：（ａ）約５：９５から約２５：７５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｂ）人工的に作られた多層の血管チューブは柔軟である；（ｃ）人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｄ）チューブの長さは、約３０ｃｍまでである；および（ｅ）人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である；を有する。

【0009】

１つの実施形態において、破裂強さは、生理学的な血圧に抵抗するのに十分である。別の実施形態において、チューブの内腔は、内腔を形成する充填体から形成された。さらに別の実施形態において、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約１５：８５である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの全長にわたって略均一である。さらに別の実施形態において、チューブは、磁気微粒子をさらに含む。さらに別の実施形態において、チューブは、分枝した構造を有する。さらに別の実施形態において、チューブは、バイパス移植術に使用するためのものである。さらに別の実施形態において、チューブは、動静脈へのアクセスに使用するためのものである。さらに別の実施形態において、チューブは、薬物検査に使用するためのものである。さらに別の実施形態において、チューブは、心血管装置の検査に使用するためのものである。さらに別の実施形態において、心血管装置はステントである。幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、神経交配しないものである。幾つかの実施形態において、前記分化した成人の線維芽細胞は、非血管性の線維芽細胞である。

【0010】

別の態様において、分化した成人の線維芽細胞の外側層、分化した成人の平滑筋細胞および分化した成人の内皮細胞の少なくとも１つの中間層を含む、人工的に作られた多層の血管チューブがあり、ここで、チューブは、人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがないという条件で、以下の特徴：（ａ）約１：９９から約４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｂ）人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｃ）チューブの長さは、約３０ｃｍまでである；および（ｄ）人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である；を有する。

【0011】

１つの実施形態において、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約５：９５から約２５：７５までである。別の実施形態において、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約１５：８５である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約０．５ｍｍまたはそれ以下である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは柔軟である。さらに別の実施形態において、チューブは、分枝した構造を有する。さらに別の実施形態において、チューブの長さは、約１ｃｍ〜約３０ｃｍまでである。さらに別の実施形態において、チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である。さらに別の実施形態において、チューブの厚さは、チューブの長さにわたって略均一である。さらに別の実施形態において、チューブは、外側のサポート構造を有する。さらに別の実施形態において、チューブには、分化していない成人の線維芽細胞が本質的にない。さらに別の実施形態において、チューブには、分化していない成人の平滑筋細胞が本質的にない。さらに別の実施形態において、チューブには、分化していない成人の内皮細胞が本質的にない。さらに別の実施形態において、チューブは、磁気微粒子を含む。幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、神経交配しないものである。幾つかの実施形態において、前記分化した成人の線維芽細胞は、非血管性の線維芽細胞である。

【0012】

別の態様において、患者を処置するための方法であって、該方法は、分化した成人の線維芽細胞の少なくとも１つの層、分化した成人の平滑筋細胞の少なくとも１つの層を含む、人工的に作られた多層の血管チューブを提供する工程を含み、ここで、任意の層は、分化した成人の内皮細胞をさらに含み、前記チューブは、人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがないという条件で、以下の特徴：（ａ）約１：９９から約４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｂ）人工的に作られた多層の血管チューブは柔軟である；（ｃ）人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｄ）チューブの長さは、約３０ｃｍまでである；および（ｅ）人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である；を有する。

【0013】

１つの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの線維芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞は、自己由来の細胞である。別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約１５：８５である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの破裂強さは、生理学的な血圧に抵抗するのに十分である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの内腔は、内腔を形成する充填体から形成された。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは柔軟である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約０．５ｍｍまたはそれ以下である。さらに別の実施形態において、チューブの長さは、約１ｃｍから約３０ｃｍまでである。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの長さにわたって略均一である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、分枝した構造を有する。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、磁気微粒子をさらに含む。幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、神経交配されないものである。幾つかの実施形態において、前記分化した成人の線維芽細胞は、非血管性の線維芽細胞である。さらに別の実施形態において、患者は、冠状動脈バイパスまたは末梢バイパスを必要とする。さらに別の実施形態において、患者は、血液透析を必要とする。さらに別の実施形態において、必要のある患者は、末期腎疾患を有する。さらに別の実施形態において、必要のある患者は、糖尿病を有する。さらに別の実施形態において、必要のある患者は、動脈硬化症を有する。さらに別の実施形態において、必要のある患者は、先天性の心臓疾患を有する。

【0014】

別の態様において、分化した成人の線維芽細胞の外側層、分化した成人の平滑筋細胞および分化した成人の内皮細胞の少なくとも１つの内側層を含む、人工的に作られた多層の血管チューブがあり、これは、人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがないという条件で、以下の特徴：（ａ）約５：９５から約２５：７５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｂ）人工的に作られた多層の血管チューブは柔軟である；（ｃ）人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｄ）チューブの長さは、約１ｃｍから約３０ｃｍまでである；および（ｅ）人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である；を有する。

【0015】

１つの実施形態において、破裂強さは、生理学的な血圧に抵抗するのに十分である。別の実施形態において、チューブは、内腔を形成する充填体から形成された。別の実施形態において、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約１５：８５である。別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの全長にわたって略均一である。別の実施形態において、チューブには、分化していない成人の線維芽細胞が本質的にない。別の実施形態において、チューブには、分化していない成人の平滑筋細胞が本質的にない。別の実施形態において、チューブには、分化していない成人の内皮細胞が本質的にない。別の実施形態において、チューブは、磁気微粒子を含む。別の実施形態において、チューブは、分枝した構造を有する。幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、神経交配されないものである。幾つかの実施形態において、前記分化した成人の線維芽細胞は、非血管性の線維芽細胞である。別の実施形態において、チューブは、バイパス移植術に使用するためのものである。別の実施形態において、チューブは、動静脈へのアクセスに使用するためのものである。別の実施形態において、チューブは、薬物検査に使用するためのものである。別の実施形態において、チューブは、心血管装置の検査に使用するためのものである。別の実施形態において、心血管装置はステントである。１つの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブ内での内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約５：９５から約２５：７５までである。別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブ内での内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約１５：８５である。別の実施形態において、チューブの内腔は、約６ｍｍまたはそれ以下である。別の実施形態において、平滑筋細胞、内皮細胞、及び／又は線維芽細胞は、ヒト成人の分化細胞である。別の実施形態において、前記方法は、熟成チャンバーにおいて人工的に作られた多層の血管チューブを培養する工程を含む。

【0016】

別の態様において、分化した成人の線維芽細胞の外側層、分化した成人の平滑筋細胞および分化した成人の内皮細胞の少なくとも１つの内側層を含む、人工的に作られた多層の血管チューブがあり、これは、人工的に作られた多層の血管チューブが、神経交配されないものであり、あらかじめ形成されたスキャフォールドがないという条件で、以下の特徴：（ａ）除去可能な内腔を形成する充填体；（ｂ）約５：９５から約２５：７５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｃ）人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｄ）チューブの長さは、約１ｃｍから約３０ｃｍまでである；（ｅ）人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、略均一である；および（ｆ）外側のサポート構造；を有する。

【0017】

１つの実施形態において、外側のサポート構造は取り除かれる。別の実施形態において、内腔を形成する充填体は取り除かれる。別の実施形態において、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約１５：８５である。別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは柔軟である。別の実施形態において、チューブは、分枝した構造を有する。

【0018】

別の態様において、分化した成人の平滑筋細胞、分化した成人の内皮細胞、および分化した成人の線維芽細胞を含む、人工的に作られた多層の血管チューブがあり、ここで、前記細胞は互いに凝集され、前記チューブは、人工的に作られた血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがないという条件で、以下の特徴：（ａ）約１：９９から約４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｂ）人工的に作られた血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｃ）チューブの長さは、約３０ｃｍまでである；および（ｄ）人工的に作られた血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である；を有する。

【0019】

幾つかの実施形態において、分化した成人の平滑筋細胞、分化した成人の内皮細胞、および分化した成人の線維芽細胞は、人工的に作られた血管チューブ内に均一に分散される。他の実施形態において、分化した成人の平滑筋細胞、分化した成人の内皮細胞、および分化した成人の線維芽細胞は、人工的に作られた血管チューブ内に不均一に分散される。さらなる実施形態において、細胞は層内に分散される。またさらなる実施形態において、１以上の層は、１以上の他の層とは異なる、細胞タイプの分布によって特徴付けられる。幾つかの実施形態において、細胞は、人工的に作られた血管チューブが形成される時に不均一に分散される。幾つかの実施形態において、１以上の細胞タイプは、ある程度遊走または分離し、それによって、不均一の分布をもたらす。

【0020】

幾つかの実施形態において、人工的に作られた血管チューブは柔軟である。１つの実施形態において、線維芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞は、自己由来の細胞である。別の実施形態において、破裂強さは、生理学的な血圧に抵抗するのに十分である。さらに別の実施形態において、チューブの内腔は、除去可能な内腔を形成する充填体から形成された。さらに別の実施形態において、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約５：９５から約２５：７５までである。さらに別の実施形態において、内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約１５：８５である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは柔軟である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約０．５ｍｍまたはそれ以下である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である。さらに別の実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの長さにわたって略均一である。さらに別の実施形態において、チューブには、分化していない成人の線維芽細胞が本質的にない。さらに別の実施形態において、チューブには、分化していない成人の平滑筋細胞が本質的にない。さらに別の実施形態において、チューブには、分化していない成人の内皮細胞が本質的にない。さらに別の実施形態において、チューブは、分枝した構造を有する。さらに別の実施形態において、チューブは、磁気微粒子をさらに含む。さらに別の実施形態において、チューブは、バイパス移植術に使用するためのものである。さらに別の実施形態において、チューブは、動静脈へのアクセスに使用するためのものである。さらに別の実施形態において、チューブは、薬物検査に使用するためのものである。さらに別の実施形態において、チューブは、心血管装置の検査に使用するためのものである。さらに別の実施形態において、心血管装置はステントである。幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、神経交配されないものである。幾つかの実施形態において、前記分化した成人の線維芽細胞は、非血管性の線維芽細胞である。

【0021】

本明細書に使用されるような用語「凝集する（ｃｏｈｅｒｅ）」、「凝集した（ｃｏｈｅｒｅｄ）」、および「凝集（ｃｏｈｅｓｉｏｎ）」は、細胞、細胞集合体、多細胞体、及び／又は層に結合する細胞−細胞接着の特性を指す。該用語は、「融合する（ｆｕｓｅ）」、「融合した（ｆｕｓｅｄ）」、および「融合（ｆｕｓｉｏｎ）」と交換可能に使用される。

【0022】

本明細書に使用されるような用語「スキャフォールド」は、ポリマースキャフォールドなどの合成スキャフォールド、細胞外マトリックス層などの非合成スキャフォールド、および人工的に作られた多層の血管チューブの物理的構造に不可欠であり、チューブから取り除かれない、任意の他のタイプのあらかじめ形成されたスキャフォールドを指す。

【図面の簡単な説明】

【0023】

本発明の新しい特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される、具体例を明記する後述の詳細な説明を引用することによって、及び以下の添付図面によって得られる。

【図1】図１は、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ（ヒト大動脈の平滑筋細胞−ヒト大動脈の内皮細胞）を混合した細胞シリンダーのヘマトキシリンおよびエオジンの染色を例示する。

【図2】図２は、ＨＤＦ多細胞体およびＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣを混合した多細胞体を使用する、ＨＤＦの外側層およびＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣの内側層を有する血管チューブを構築するための幾何学的配置を例示する。

【図3A】図３Ａは、分離されていない多層の血管チューブを例示する。

【図3B】図３Ｂは、インキュベーションの２４時間後に、アガロースのサポート構造内にカプセル化されたシリンダー間の凝集によって形成された、分離された多層の血管チューブを例示する。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明は、再生医療と組織工学の領域に関する。より詳しく言うと、本発明は、線維芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞を含み、特定の特徴を有する多層の血管チューブの生成に関する。

【0025】

組織工学は、血管を含む、移植可能臓器の不足と相まった臓器置換の高まる需要によって引き起こされた問題に対する解決策を提供する。（Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｖａｃａｎｔｉ （１９９３））。米国において、病気にかかった動脈に関する血管または腹部器官を、特に、小さな直径の血管グラフトと置換する必要性がある。研究用途のための改善された血管の必要性も認識されている。５〜６ｍｍよりも短い直径を有する小動脈は、血栓症の高い罹患率により人工材料と交換することができない（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９８８）； Ｇｒｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８））。組織工学によって作製された血管グラフトは、天然の移植可能な血管の不足に対処する実現可能な方法を提供し、例えば、心血管装置の検査および薬物検査などにも適用される。

【0026】

天然の血管は３つの層：内皮細胞から成る内側層（内膜）、血管平滑筋の中心層（媒体）、および線維芽細胞の外側層（外膜）を含む。理想的な組織工学によって作製された血管グラフトは、合成スキャフォールドがないべきであり、そうでなければ、グラフトの長期的な作用に影響を与えかねない、又はその主要な生体機能を妨害しかねない。本明細書に記載される多層の血管チューブは、この結果を達成する。小径の組織工学によって作製された血管グラフトが所望され、それは、約６ｍｍまたはそれ以下で内部径を有する。本明細書に記載される多層の血管チューブは、この結果を達成する（必要に応じてより大きな直径も同様）。他のものは、生理学的な血圧に抵抗することができる合成スキャフォールドのない柔軟なグラフトを作り出すことができていない。本明細書に記載される多層の血管チューブは、この結果を達成する。他のものは、支持する生体材料なしでは、血管組織、線維芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞に存在する３つの主要細胞のタイプを含む血管の構成物を再び作り出すことができていない。本明細書に記載される多層の血管チューブは、この結果を達成する。

【0027】

柔軟であり、略均一であり、合成スキャフォールド材料がない、約０．５ｍｍまたはそれ以下の内部径を有している、線維芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞を含む多層の血管構成物のチューブのアセンブリは、まだ達成されていない。本明細書に記載される多層の血管チューブは、この結果を達成する。

【0028】

本明細書には、分化した成人の線維芽細胞の少なくとも１つの層、分化した成人の平滑筋細胞の少なくとも１つの層を含む人工的に作られた多層の血管チューブが記載され、ここで、任意の層は、分化した成人の内皮細胞をさらに含み、前記チューブは、人工的に作られた血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがないという条件で、以下の特徴：（ａ）約１：９９から約４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｂ）人工的に作られた多層の血管チューブは柔軟である；（ｃ）人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｄ）チューブの長さは、約３０ｃｍまでである；および（ｅ）人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である；の少なくとも１つを有する。具体的な実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、これらの特徴の少なくとも２つを有する。さらにより具体的な実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、これらの特徴の少なくとも３つを有する。またより具体的な実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、これらの特徴の少なくとも４つを有する。またさらにより具体的な実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、これらの特徴のすべてを有する。幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、神経交配されないものである。幾つかの実施形態において、前記分化した成人の線維芽細胞は、非血管性の線維芽細胞である。

【0029】

本明細書にはまた、人工的に作られた多層の血管チューブを形成する方法が記載され、該方法は、あらかじめ形成されたスキャフォールドがいかなる時も使用されないという条件で、充填マトリックスの少なくとも１つの体、互いに凝集した平滑筋細胞の少なくとも１つの多細胞体、互いに凝集した内皮細胞の少なくとも１つの多細胞体、および所望の血管チューブ構造を形成するための互いに凝集する線維芽細胞の少なくとも１つの多細胞体を位置決めする工程を含み、ここで、１以上の充填マトリックス体は、チューブの内腔を形成し、複数の充填マトリックス体は、チューブを囲み；および該方法はさらに、人工的に作られた多層の血管チューブの多細胞体が凝集するのを可能にする工程を含む。

【0030】

１つの実施形態において、多細胞体は細長い細胞体である。用語、細長い細胞体は、内容の全体にわたって使用されるように、例として単に提供され、限定する実施形態ではない。従って、本明細書の開示を使用する当業者は、任意の他の細胞体（例えば、細長くない細胞体）に細長い細胞体のための教示を適用することができるであろう。１つの実施形態において、細胞体は、略球状の細胞体である。

【0031】

本明細書にはまた、分化した成人の線維芽細胞の少なくとも１つの層、分化した成人の平滑筋細胞の少なくとも１つの層を含む人工的に作られた多層の血管チューブが記載され、ここで、任意の層は、分化した成人の内皮細胞をさらに含み、前記チューブは、人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがないという条件で、以下の特徴：（ａ）約５：９５から約２５：７５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｂ）人工的に作られた多層の血管チューブは柔軟である；（ｃ）人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｄ）チューブの長さは、約３０ｃｍまでである；および（ｅ）人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である；を有する。

【0032】

本明細書にはまた、分化した成人の線維芽細胞の外側層、分化した成人の平滑筋細胞および分化した成人の内皮細胞の少なくとも１つの内側層を含む、人工的に作られた多層の血管チューブが記載され、ここで、前記チューブは、人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがないという条件で、以下の特徴：（ａ）約１：９９から約４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｂ）人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｃ）チューブの長さは、約３０ｃｍまでである；および（ｄ）人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である；の少なくとも１つを有する。具体的な実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、これらの特徴の少なくとも２つを有する。さらにより具体的な実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、これらの特徴の少なくとも３つを有する。またより具体的な実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、これらの特徴の少なくとも４つを有する。またさらにより具体的な実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、これらの特徴のすべてを有する。幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、神経交配されないものである。幾つかの実施形態において、前記分化した成人の線維芽細胞は、非血管性の線維芽細胞である。

【0033】

さらに本明細書には、分化した成人の線維芽細胞の少なくとも１つの層、分化した成人の平滑筋細胞の少なくとも１つの層を含む人工的に作られた多層の血管チューブを提供する工程を含む、患者を処置するための方法が記載され、ここで、任意の層は、分化した成人の内皮細胞をさらに含み、前記チューブは、人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがないという条件で、以下の特徴：（ａ）約１：９９から約４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｂ）人工的に作られた多層の血管チューブは柔軟である；（ｃ）人工的に作られた多層の血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｄ）チューブの長さは、約３０ｃｍまでである；および（ｅ）人工的に作られた多層の血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である；を有する。

【0034】

本明細書にはまた、分化した成人の平滑筋細胞、分化した成人の内皮細胞、および分化した成人の線維芽細胞を含む、人工的に作られた血管チューブが記載され、ここで、前記細胞は、互いに凝集し、前記チューブは、人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがないという条件で、以下の特徴：（ａ）約１：９９から約４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｂ）人工的に作られた血管チューブの内部径は、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｃ）チューブの長さは、約３０ｃｍまでである；および（ｄ）人工的に作られた血管チューブの厚さは、チューブの領域にわたって略均一である；を有する。

【0035】

人工的に作られた多層の血管チューブ中で使用される細胞タイプは、同種異型の組織（レシピエントと同じ種類のドナーから始まる、またはドナーに由来する細胞または組織）から、または自己移植（レシピエントから始まる、またはレシピエントに由来する細胞または組織）から随意に供給され、随意に新鮮であるか、または凍結保存される。細胞は、幹細胞、例えば、１以上の特異的な機能を行ない、自分で再生する能力を有する、様々な他の細胞タイプへ分化する可能性を有する分化多能性の新生細胞、または始原細胞、例えば、少なくとも１つの細胞タイプへ分化する可能性を有し、自己再生する能力が限られている又はその能力のない、分化単能か分化多能性の新生細胞から分化し得る。細胞はまた、例えば、ヒト大動脈細胞、ヒト臍帯細胞、ヒト脂肪組織、ヒト骨髄、ヒト胎盤またはヒト分化細胞が得られ得る他のソースから供給され得る。好ましくは、本明細書に記載される人工的に作られた多層の血管チューブ中で使用される細胞タイプは、成人の分化細胞である。

【0036】

人工的に作られた多層の血管チューブ中で使用される細胞タイプは、当該技術分野に既知の任意の方法で培養され得る。細胞および組織の培養の方法は、当該技術分野に公知であり、例えば、Ｃｅｌｌ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ （１９８７）， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載され、それらの内容は、このような情報のための引用によって本明細書に組み込まれる。本発明と併用して使用され得る、一般的な哺乳動物の細胞培養技術、細胞株、および細胞培養システムはまた、Ｄｏｙｌｅ， Ａ．， Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｊ． Ｂ．， Ｎｅｗｅｌｌ， Ｄ． Ｇ．， （ｅｄｓ．） Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｗｉｌｅｙ （１９９８）に記載され、それらの内容は、このような情報のための引用によって本明細書に組み込まれる。

【0037】

培養中の哺乳動物細胞のための適切な増殖条件は、当該技術分野に周知である。細胞培地は、一般に、必須栄養素を含み、随意に、増殖因子、塩、無機質、ビタミンなどの、追加の要素を含み、これらは培養されている細胞タイプに従って選択され得る。特定の成分は、細胞の増殖、分化、特異タンパク質の分泌などを高めるために選択され得る。一般に、標準的な増殖培地は、１１０ｍｇ／Ｌのピルベートおよびグルタミンとともに、低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含み、それらは、１０−２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）または子ウシ血清および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補われ、当業者に周知の様々な他の標準的な培地のように適切である。好ましくは、細胞は、細胞の起源の動物の体温で、またはその体温に近い体温で、３−１５％のＣＯ_２、好ましくは、５％のＣＯ_２の雰囲気の中での無菌条件下で培養される。例えば、ヒト細胞は、好ましくは、約３７℃で培養される。

【0038】

細胞はまた、所望の株にわたって細胞の分化を誘発する細胞の分化剤によって培養され得る。例えば、細胞は、増殖因子、サイトカインなどによって培養され得る。本明細書に使用されるような用語「増殖因子」は、タンパク質、ポリペプチド、または細胞によって生成され、それ自体に及び／又は様々な他の隣接する又は離れた細胞に影響を与え得る、サイトカインを含むポリペプチドの複合体を指す。典型的に、増殖因子は、特異的なタイプの細胞の増殖及び／又は分化に対して、発達上、または多くの生理学的または環境上の刺激に反応してかのいずれかで影響を与える。すべてではないが、いくつかの増殖因子は、ホルモンである。典型的な増殖因子は、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性のＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＰＤＧＦ−ＡＢを含む血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を含む形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８などである。増殖因子は、中でも、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｄａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８６； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２ｄ ｅｄ．， Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２０００において考察される。当業者は、本明細書に記載される調整培地中の任意の及び全ての培養由来の増殖因子が本発明の範囲内であると理解するであろう。

【0039】

本発明の線維芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞は、血管チューブへの形成のために、多細胞体へ組み合わせられる前に別々に培養され得る。例えば、線維芽細胞、平滑筋細胞および内皮細胞は、組織培養フラスコ中の培養物において別々に増殖され、コンフルエントであるときに、１つの培養物へと一緒に継代および混合されることで、混合した細胞懸濁液を形成するために遠心分離にかけられ、上清が取り除かれることで、混合した細胞ペーストのための高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成し得る。適切な混合した細胞懸濁液は、線維芽細胞と平滑筋細胞、線維芽細胞と内皮細胞、および平滑筋細胞と内皮細胞の組み合わせを含む。混合した細胞懸濁液中の細胞は、例えば、オービタルシェーカー上のインキュベーションによって、互いに凝集し、細胞−細胞接着を開始することが可能となる。混合した細胞ペーストは、例えば、キャピラリーチューブへの吸収によって、多細胞体へと形成され得る。その後、細胞シリンダーは、例えば、プランジャーを使用することによって、キャピラリーチューブからモールドの溝へと押し出され得る。あるいは、線維芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞は、例えば、細長い細胞体を含む多細胞体に、別々に組み込まれ得る。細長い細胞体は、細胞とあらかじめ混合された１つより多くの細胞外マトリックス成分を含み得る。その後、多細胞体は、生物印刷機の使用を介する血管チューブへの後の取り込みのために３７℃および５％のＣＯ２で、インキュベートされ得る。

【0040】

本発明の多細胞体はまた、複数の細胞に加えて、１以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分または１以上のＥＣＭ成分の１以上の誘導体を含み得る。例えば、細長い細胞体は、様々なＥＣＭタンパク質（例えば、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、及び／又はプロテオグリカン）を含み得る。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、細長い細胞体を形成するために使用される細胞ペーストに加えられ得る。細胞ペーストに加えられたＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、ヒトまたは動物のソースから精製され得るか、または当該技術分野に既知の組換え方法によって生成され得る。あるいは、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、細長い細胞体中の細胞によって自然に分泌され得るか、または細長い細胞体を作るために使用される細胞は、当該技術分野に公知の任意の適切な方法によって遺伝子操作され得ることで、１以上のＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体及び／又は１以上の細胞接着分子または細胞基質接着分子（例えば、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリンおよびカドヘリン）の発現レベルを変化させることができる。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、細長い細胞体中の細胞の凝集を促進し得る。例えば、ゼラチン及び／又はフィブリノゲンは、細長い細胞体を形成するために使用される細胞ペーストに適切に加えられ得る。その後、フィブリノゲンは、トロンビンの付加によってフィブリンに転換され得る。

【0041】

内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、多細胞体中の約１：９９から約４５：５５の内皮細胞対平滑筋細胞の間の任意の割合であり得る。例えば、人工的に作られた多層の血管チューブ内の内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約１：９９、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、または約１：９９から約４５：５５の内皮細胞対平滑筋細胞の間の任意の割合であり得る。

【0042】

幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブには、分化していない成人の線維芽細胞が本質的にない。幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブには、分化していない成人の平滑筋細胞が本質的にない。幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブには、分化していない成人の内皮細胞が本質的にない。

【0043】

本発明の線維芽細胞は、例えば、組織培養フラスコ中で培養され得る。コンフルエントであるときに、線維芽細胞は、継代される且つ遠心分離にかけられることで、上清が取り除かれ、単細胞ペーストを形成し得る。線維芽細胞ペーストは、例えば、キャピラリーチューブへの吸収によって、細長い細胞体へと形成され得る。その後、細長い細胞体は、例えば、プランジャーを使用することによって、キャピラリーチューブからモールドの溝へと押し出され得る。その後、細長い細胞体は、生物印刷機の使用を介する血管チューブへの後の取り込みのために３７℃および５％のＣＯ２で、インキュベートされ得る。

【0044】

本発明の平滑筋細胞も、例えば、組織培養フラスコ中で培養され得る。コンフルエントであるときに、平滑筋細胞は、継代される且つ遠心分離にかけられることで、上清が取り除かれ、単細胞ペーストを形成する。平滑筋細胞ペーストは、例えば、キャピラリーチューブへの吸収によって、細長い細胞体へと形成され得る。その後、細長い細胞体は、例えば、プランジャーを使用することによって、キャピラリーチューブからモールドの溝へと押し出され得る。その後、細長い細胞体は、生物印刷機の使用を介する血管チューブへの後の取り込みのために３７℃および５％のＣＯ２で、インキュベートされ得る。

【0045】

本発明の内皮細胞も、例えば、組織培養フラスコ中で培養され得る。コンフルエントであるときに、内皮細胞は、継代される且つ遠心分離にかけられることで、上清が取り除かれ、単細胞ペーストを形成する。内皮細胞ペーストは、例えば、キャピラリーチューブへの吸収によって、細長い細胞体へと形成され得る。その後、細長い細胞体は、例えば、プランジャーを使用することによって、キャピラリーチューブからモールドの溝へと押し出され得る。その後、細長い細胞体は、生物印刷機の使用を介する血管チューブへの後の取り込みのために３７℃および５％のＣＯ２で、インキュベートされ得る。

【0046】

ゲルマトリックスのモールドは、平滑筋／内皮および線維芽の細胞シリンダーのインキュベーションのために作られ得る。ゲルマトリックスのモールドは、アガロース、寒天などの、任意の生体適合性のゲルマトリックス、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの、他の生体適合性のヒドロゲルから成り得る。ゲルマトリックス材料は、栄養培地に対して透過性があるが、細胞の内部増殖、遊走、および接着に抵抗する。ゲルマトリックスのモールドは、殺菌され得る。ゲルマトリックスのモールドは、ゲルマトリックスの上に置かれ、ゲルをゲルマトリックスのモールドの形態へ形作ることが可能となる陰性モールドを使用して作製され得る。例えば、テフロン（登録商標）の陰性モールドが使用され得る。細長い細胞体は、例えば、血管構造物への形成のためにキャピラリーチューブへ再吸収される前に、２４時間ゲルマトリックスのモールド中でインキュベートされ得る。幾つかの実施形態において、ゲルマトリックスのモールドは、筒状体によって特徴付けられる。幾つかの実施形態において、ゲルマトリックスのモールドは、半筒状体によって特徴付けられる。幾つかの実施形態において、ゲルマトリックスのモールドは、長方形状によって特徴付けられる。

【0047】

細長い細胞体中の細胞は、例えば日常的な組織学的検査、例えば、Ｈ＆Ｅ染色によって、細胞の生存率のために評価され得る。細長い細胞体中の細胞はまた、取り扱いの容易性に関して評価され得る。例えば、シリンダーがインキュベーションの時点の終わりでカールする（ｃｕｒｌ）（例えば、カーリング）量が評価され得る。例えば、主観的プリファレンスのスコアリングシステムが使用され得る。例えば、カーリングスコアは、１−１０点ベースで細長い細胞体に割り当てられ得、ここで、１のスコアは、細長い細胞体がカーリングを示さないことを意味し、１０のスコアは、細長い細胞体が螺旋状の構造を形成するためにカールしたことを意味する。さらに、細長い細胞体の統合性、例えば、凝集は、主観的スコアを使用することによって、インキュベーションの時点の終わりで評価され得る。例えば、これらの２つのスコアは、細長い細胞体を調製するための好ましい条件の選択を可能にし、多層の血管チューブの形成中の取り扱いの容易性を確かなものとする。例えば、凝集スコアは、１０点ベースで細長い細胞体に割り当てられ得、ここで、１のスコアは、シリンダーがその平滑な円筒状の構造を完全に維持したことを意味し、１０の凝集スコアは、円筒状の構造が失われたことを意味する。

【0048】

多層の血管グラフトは、例えば、複数の多細胞体を集め、多細胞体の凝集を可能にすることによって形成され得る。幾つかの実施形態において、細胞、細胞集合体、多細胞体、及び／又は層は、細胞-細胞接着によって凝集する。他の実施形態において、細胞、細胞集合体、多細胞体、及び／又は層は、融合する。幾つかの実施形態において、多層の血管グラフトは、弾性の一貫性を有する所望のチューブ形状において複数の細長い細胞体を集め、細長い細胞体の凝集を可能にすることによって形成される。さらなる実施形態において、細長い細胞体中の細胞及び／又は細胞集合体は、一緒に凝集し、容易な操作および取り扱いのための、弾性の一貫性、所望の細胞密度および十分な統合性を有する血管チューブの構成物を形成する。

【0049】

細長い細胞体を生成する方法は、１）所望の細胞の密度および粘度を有する複数のあらかじめ選択された細胞または細胞集合体を含む細胞ペーストを提供する工程、２）細胞ペーストを所望のチューブ形状へと操作する工程、および３）細長い細胞体を熟成を介して形成する工程を含む。

【0050】

単独のまたは細長い細胞体と組み合わせた、略球状の細胞体は、本明細書に記載されるタイプの血管チューブを造るのにも適している。略球状の細胞体を生成する方法は、１）所望の細胞の密度および粘度を有する複数のあらかじめ選択された細胞または細胞集合体を含む細胞ペーストを提供する工程、２）細胞ペーストを筒状体へと操作する工程、３）シリンダーを等しいフラグメントへ切断する工程、４）フラグメントを旋回シェーカー上に一晩かき集めさせる工程、および５）略球状の細胞体を熟成を介して形成する工程を含む。

【0051】

細長い充填体は、血管チューブを造るために、前述の細長い細胞体と組み合わせて使用され得る。細長い充填体は、ロッドまたは他のモールドなどの、前もって決められた形状中に材料を含み、一方で、材料は、栄養培地に対して透過性があるが、細胞の内部増殖、遊走、および接着を防ぐ。充填体ユニットは、アガロース、寒天などの材料、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの、他の生体適合性のヒドロゲルで作られ得る。人工的に作られた多層の血管チューブの構築の間に、細長い充填体は、血管チューブのためのサポート構造を定義するために、前もって決められたパターンに従って、利用され得る。細長い充填体は、多層の血管グラフトの内腔を形成するために使用され得る。内腔を形成する充填体は、チューブの内腔を形成するために除去可能であり得る。細長い充填体および細長い細胞体の例、およびそれらを形成する方法は、米国特許出願第１２／４９１，２２８号において見られ得る。

【0052】

本発明の人工的に作られた多層の血管チューブは、幾つかの実施形態において、層を含む。さらなる実施形態において、層は、１以上の細胞タイプの存在によって特徴付けられる。またさらなる実施形態において、層は、人工的に作られた多層の血管チューブ内の位置によって特徴付けられる。幾つかの実施形態において、層は、１以上の成分、要素、または化合物の濃度及び／又は柔軟性、強度、または弾性などの物理的性質によって特徴付けられる。幾つかの実施形態において、１以上の層は異なる。さらなる実施形態において、１以上の層は別々である。幾つかの実施形態において、１以上の層は隣接している。さらなる実施形態において、１以上の層は分離できない。またさらなる実施形態において、１以上の層は、人工的に作られた多層の血管チューブの領域にわたって連続的な勾配が変化する性質によって特徴付けられる。幾つかの実施形態において、１以上の層は、時間をかけて変化する性質によって特徴付けられる。

【0053】

人工的に作られた多層の血管チューブは、平滑筋細胞および内皮細胞の細長い細胞体の内側層、および線維芽細胞の細長い細胞体の外側層を使用して作られ得る。図２に示されるような幾何学的配置が使用され得、ここで、平滑筋細胞および内皮細胞の細長い細胞体、線維芽細胞の細長い細胞体、および充填マトリックスの細長い体の幾何学パターンは、三次元の血管構造物を形成するように配され得る。多層の血管チューブは、アガロースなどの、ゲルマトリックスを有するベースプレート上で形成され得る。例えば、ゲルマトリックスは、キャピラリーチューブへ吸収され、例えば、冷たい（４℃）ＰＢＳ溶液中でゲル化され、キャピラリーから押し出され、ゲルマトリックスのベースプレート上に直接置かれ得ることで、充填マトリックスの細長い体を形成する。充填マトリックスの第２の細長い体は、第１の細長い体に近接され得、そのプロセスを、所望のサポート構造が形成されるまで、繰り返した。充填マトリックスの細長い体が、湿潤性を維持し、且つ体間の接着を可能にするために堆積されるとともに、ＰＢＳなどの、湿潤性溶液は、充填マトリックスの細長い体上に分配され得る。線維芽細胞の細長い体は、多層の血管チューブの外側層を形成するために、ゲルマトリックスの細長い体上の隣りの層に堆積され得、平滑筋細胞および内皮細胞の細長い体は、層ごとに、内側層を形成し続けるためにさらに押し出され得る。各々の細長い細胞体を押し出した後に、培地などの湿潤性溶液は、続く細長い細胞体の堆積を助け、既に堆積した細長い細胞体の脱水を防ぐために、堆積した体の上部に分配され得る。所望の血管構造物が形成されるまで、このプロセスを繰り返した。さらに、人工的に作られた多層の血管チューブは、略球状の細胞体の層を、単独でまたは細長い細胞体と組み合わせて使用することで作られ得る。所望の血管構造物は、真っすぐなチューブであり得るか、または１以上の分枝を有するチューブ（例えば、分枝した構造）であり得る。一旦全体的な血管の構成物が完成すれば、ゲルマトリックスは、構成物の各端部上に分配され得、ゲル化が可能と成り得る。ゲル化に続いて、全体的な構成物は、培地などの湿潤性溶液中に沈められ得、インキュベートされ得ることで、例えば、３７℃および５％のＣＯ_２で２４時間、細胞シリンダー間の凝集を可能にする。

【0054】

人工的に作られた多層の血管チューブは、当該技術分野で既知の任意の方法によって形成され得る。例えば、人工的に作られた多層の血管チューブは、微量ピペットによるなどの手動で、または特殊目的の生物印刷機（米国特許出願第１０／５９０，４４６号に記載されるものなど）によるなどの自動で、ゲルマトリックスの細長い及び／又は略球状の細胞体および細長い体を置くことによって形成され得る。

【0055】

あるいは、多層の血管チューブは、細胞播種および複数の細長い細胞体及び／又は複数の細長い充填体のアセンブリングなどの、様々な方法の組み合わせを使用することによって形成され得る。例えば、内皮細胞は、平滑筋細胞の細長い細胞体および線維芽細胞の細長い細胞体から形成された血管チューブの内腔に播種され得る（例えば、内腔を通って流され得る）。別の例として、線維芽細胞の層は、平滑筋細胞および内皮細胞の細長い細胞体から形成された血管チューブのまわりを包み得る。また別の例として、血管チューブを形成するために使用されるあらかじめ形成された細胞体は、１つより多くの細胞タイプを含む。また別の例として、血管チューブを形成するために使用される層は、１つより多くの細胞タイプを含む。

【0056】

幾つかの実施形態において、血管チューブを形成するために使用されるあらかじめ形成された細胞体は、３つの細胞タイプ（内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞）すべてを含み；そのような例において、各細胞タイプは、人工的に作られた多層の血管チューブを形成するために、（例えば、熟成チャンバー内での時間の間）適切な位置へ遊走する。他の実施形態において、血管チューブを形成するために使用されるあらかじめ形成された細胞体は、（内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞から選択される）２つの細胞タイプを含み、両方の細胞タイプは、人工的に作られた多層の血管チューブを形成するために、（例えば、熟成チャンバー内での時間の間）適切な位置へ遊走する。幾つかの実施形態において、各タイプの細胞は、血管チューブの細胞体または層内に均一に分散される。他の実施形態において、各タイプの細胞は、血管チューブの細胞体または層内の特定の領域に集中する。

【0057】

幾つかの実施形態において、本発明の多層の血管チューブは、神経交配されないものである。幾つかの実施形態において、本発明の多層の血管チューブは、非血管性の線維芽細胞である分化した成人の線維芽細胞を含む。

【0058】

インキュベーション期間の終わりに、取り囲むゲルマトリックスのサポート構造は取り除かれ得、凝集した多層の血管チューブは、増殖のために、および細胞外マトリックスの形成のために、熟成チャンバー（例えば、バイオリアクター）内に置かれ得る。サポート構造／充填体は、血管チューブの内腔及び／又は充填体を引き抜くことによって、または熱可逆性又は光感受性の方法などの他の方法によって血管チューブを囲む内腔から取り除かれ得る。

【0059】

腔内の液体灌流は、人工的に作られた多層の血管チューブの熟成中に使用され得る。例えば、腔内灌流は、多層の血管チューブが熟成チャンバー（例えば、バイオリアクター）内に置かれるときに使用され得る。腔内灌流は、比較的低い圧力で始まり、人工的に作られた多層チューブの熟成の進行中に増加され得る。例えば、腔内灌流は、天然組織中で圧力および剪断力を模倣する又は超過するレベルまで増加され得る。例えば、動脈および静脈の多層チューブのための内圧は、正常な及び／又は高い血圧を模倣するために、６０ｍｍ Ｈｇ未満、６０−１５０ｍｍ Ｈｇ、１５０−２００ｍｍ Ｈｇ、または２００ｍｍ Ｈｇ以上の圧力にさらされ得る。より低い圧力は、組織の破壊を回避するために、人工的に作られた多層チューブの熟成の初期段階中にあるのが望ましい。同様に、人工的に作られた多層チューブは、循環系において正常な及び／又は高い剪断力を模倣するために、５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２未満、５−３０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２、３０−６０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２、または６０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２以上の剪断力にさらされ得、好ましくは、より低いレベルが最初に使用される。腔内灌流用のためのこのような技術は、当該技術分野に公知である。

【0060】

当該技術分野に公知であるように、拍動力も腔内灌流に含まれ得る。拍動力は、例えば、動脈および静脈内で循環する血液の天然のパルシングを模倣するために使用され得る。例えば、成人または胎児の休息時の脈拍を模倣するために、６０／分未満、６０−９０／分、７５／分、９０／分以上、または１４０−１６０／分、または１６０／分以上の脈拍数、または任意の他の脈拍数が使用され得る。拍動力の使用は、最初は比較的低くなり得、該拍動力は、組織構成物がより十分に成熟するにつれ、生理学的レベルまで増加する。

【0061】

本発明の人工的に作られた多層の血管チューブは、例えば、血管チューブの任意の層の形成、またはチューブ形状の形成のために、あらかじめ形成されたスキャフォールドを利用しない。限定しない例として、本発明の人工的に作られた多層の血管チューブは、ポリマースキャフォールド、細胞外マトリックス層、または任意の他のタイプのあらかじめ形成されたスキャフォールドなどの、あらかじめ形成された、合成のスキャフォールドを利用しない。幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがない。幾つかの実施形態において、人工的に作られた多層の血管チューブは、例えば、全組成物の０．５％未満の、検知可能な量であるが、微量または取るに足らない量のスキャフォールドを含む。さらなる実施形態において、微量または取るに足らない量のスキャフォールドは、グラフトの長期的な作用に影響を与える又はその主要な生体機能を妨害するには不十分である。

【0062】

本発明の人工的に作られた多層の血管チューブは、血管チューブを形成するために、細胞のシート、例えば、線維芽細胞のシートの形成のみを利用しない。

【0063】

本発明の人工的に作られた多層の血管チューブは、約６ｍｍ、約５ｍｍ、約４ｍｍ、約３ｍｍ、約２ｍｍ、約１ｍｍ、または約０．５ｍｍまたはそれ以下の内部径、またはそれらの間の内部径、好ましくは、約６ｍｍまたはそれ以下の内部径を有し得る。人工的に作られた多層の血管チューブは、約１ｃｍまたはそれ以下から約３０ｃｍまたはそれ以上までの範囲の長さを有し得る。好ましくは、血管チューブは、約１ｃｍから約３０ｃｍの範囲の長さを有する。

【0064】

人工的に作られた多層チューブが、例えば、約４日またはそれ以上灌流にさらされた後に、線維芽細胞の外側層と関連させた、混合した平滑筋細胞および内皮細胞の内側層は、内膜、培地、および外膜の天然構造を形成させる細胞の接着、再生および遊走を可能にし、内皮細胞は内側に遊走し、平滑筋細胞は内側部に遊走し、および線維芽細胞は外側層上にとどまる。

【0065】

あるいは、磁界は、人工的に作られた多層チューブにおいて様々な細胞タイプの細胞の再生および遊走を誘導するために使用され得る。例えば、人工的に作られた多層チューブは、磁気微粒子（例えば、強磁性のナノ粒子など）を含み得、細胞の再生および遊走を誘導するために磁界にさらされる。

【0066】

血管チューブの３つの層の厚さは、例えば、±２０％またはそれ以下の、少なくとも血管チューブの長さの領域に対して略均一である。幾つかの実施形態において、血管チューブの厚さは、±１０％またはそれ以下、または±５％またはそれ以下である。血管チューブの厚さはまた、血管チューブの長さにわたって略均一であり得る。血管チューブの各々の層の厚さはまた、天然の血管組織の厚さに類似し得る。

【0067】

本発明の人工的に作られた多層の血管チューブはまた、柔軟であり得、天然の生理学的な血圧に匹敵する圧力に耐えるための厚さであり得る。例えば、人工的に作られた多層の血管チューブの破裂強さは、生理学的な血圧に耐えるのに十分であり得る。人工的に作られた多層の血管チューブの生体力学的特性を試験するために、様々な方法が利用され得る。血管チューブの生体力学的特性を試験するための適切な方法は、破裂強さ及び柔軟性の測定を含む。また、単一荷重対伸長の試験（ｓｉｎｇｌｅ ｌｏａｄ ｖｅｒｓｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）、リラクセーション試験、および引張破断試験などの、応力歪み解析も適切であり、適用され得る。当業者に既知の追加の試験も使用され得る。

【0068】

本発明の人工的に作られた多層の血管チューブは、いくつかの適用に使用され得；例えば、血管チューブは、動静脈のアクセスのために、バイパス移植術において、薬物検査の適用において、または心血管装置の検査の適用において使用され得る。血管チューブが使用され得る心血管装置の例は、ステントを含む。

【0069】

さらに本明細書には、本発明の少なくとも１本の人工的に作られた多層の血管チューブを提供する工程を含む、患者を処置するための方法が記載される。人工的に作られた多層の血管チューブを必要とする患者は、例えば、冠状動脈バイパスまたは末梢バイパスを必要とする患者、または、血液透析を必要とする患者であり得る。必要のある患者は、破損した血管を有し得る。必要のある患者は、例えば、末期腎疾患、糖尿病、動脈硬化症、または先天性の心臓疾患を有する患者であり得る。本発明の人工的に作られた多層の血管チューブは、血管の置換を必要とする任意の患者を処置するために使用され得る。本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されているが、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白となるであろう。ここで、本発明から逸脱することなく、多数の変更、変化、及び置換がなされることが、当業者によって理解される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行する際に利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義するものであり、これらの特許請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内の方法及び構造が、それによって包含されることが意図される。

【実施例】

【0070】

以下の具体的な例は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、方法はどうであれ、開示の残りを限定するものとして、解釈されるべきではない。さらなる精錬なしで、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明をその十分な程度まで利用することができると考えられる。本明細書に引用されるすべての公報は、それらの全体が引用によって本明細書に組み込まれる。それらに対する引用によって、このような情報の利用可能性及び一般的な普及が確証される。

【0071】

（実施例１：ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣを混合した細胞シリンダー）
材料および方法

【0072】

１．細胞培養

【0073】

１．１ 平滑筋細胞：主要なヒト大動脈の平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を、３７℃および５％のＣＯ_２で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから）、５０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０ｍｇ／Ｌのグリシン、２０ｍｇ／Ｌのアラニン、５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、および３μｇ／ＬのＣｕＳＯ_４（すべてＳｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯから）によって補われた、低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）において維持し拡張した。継代４と８の間のＨＡＳＭＣのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。

【0074】

１．２ 内皮細胞：主要なヒト大動脈の内皮細胞（ＨＡＥＣ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を、２％のＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから）によって補われた、Ｍｅｄｉｕｍ ２００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）において維持し拡張した。細胞を、３７℃および５％のＣＯ_２で、ゼラチン（ブタの血清から；Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）でコーティングした組織培養において処理されたフラスコ上で増殖させた。継代４と８の間のＨＡＥＣのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。

【0075】

２．アガロースのモールド

【0076】

２．１ ２％のｗ／ｖアガロース溶液の調製：１ｇの低融点アガロース（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＬＭＰ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を、５０ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中に溶解した。簡潔に言うと、アガロースが完全に溶解するまで、ＤＰＢＳおよびアガロースを、持続的に撹拌しながら、ホットプレート上で８５℃まで加熱する。アガロース溶液を、１２５℃で２５分間、蒸気滅菌によって殺菌する。温度が３６．５℃を超えて維持される限り、アガロース溶液は液相にとどまる。この温度以下で、相転移が生じ、アガロース溶液の粘度が増加し、およびアガロースが固形ゲルを形成する。

【0077】

２．２ アガロースのモールドの調製：アガロースのモールドを、１０ｃｍのペトリ皿に合うテフロン（登録商標）のモールドを使用して、細胞シリンダーのインキュベーションのために作る。簡潔に言うと、テフロン（登録商標）のモールドを、７０％のエタノール溶液を使用して、および４５分間モールドを紫外線にさらして、あらかじめ殺菌する。殺菌したモールドを、１０ｃｍのペトリ皿（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）の上に置き、安全に取り付ける。このアセンブリ（テフロン（登録商標）のモールド＋ペトリ皿）を、縦に維持し、４５ｍｌのあらかじめ暖められた、無菌の２％のアガロース溶液を、テフロン（登録商標）のモールドとペトリ皿の間の空間に注ぐ。その後、アセンブリを１時間室温で横に置き、アガロースの完全なゲル化を可能にする。ゲル化の後、テフロン（登録商標）のプリント（ｐｒｉｎｔ）を取り除き、アガロースのモールドを、ＤＰＢＳを使用して２回洗浄する。その後、１７．５ｍｌのＨＡＳＭＣ培地を、アガロースのモールドに加える。

【0078】

３．ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣシリンダー

【0079】

３．１ ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣを混合した細胞シリンダーの作製：混合した細胞シリンダーを組み立てるために、ＨＡＳＭＣおよびＨＡＥＣを個別に集め、その後、前もって決められた割合で混合した。簡潔に言うと、培地を、コンフルエントな培養フラスコから取り除き、細胞を、ＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ^２の増殖領域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（１ｍｌ／１５ｃｍ^２の増殖領域；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）の存在下でインキュベーションによって培養フラスコの表面から分離した。ＨＡＳＭＣを０．１５％のトリプシンを使用して分離し、一方で、ＨＡＥＣを０．１％のトリプシンを使用して分離した。インキュベーション後に、適切な培地をフラスコに加えた（トリプシンの容積に対して２Ｘの容積）。細胞懸濁液を、６分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培地中に再懸濁し、血球計を使用して数えた。ＨＡＳＭＣおよびＨＡＥＣの適切な容積を混合し、５、７．５、１０、１２．５、および１５％のＨＡＥＣ（総細胞集団の％として）を含む、混合した細胞懸濁液を産出した。混合した細胞懸濁液を、５分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。混合した細胞ペレットを、６ｍｌのＨＡＳＭＣ培地中に再懸濁し、２０ｍｌのガラスバイアル（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）に移動させ、その後、６０分間１５０ｒｐｍで、および３７℃および５％のＣＯ_２で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。これによって、細胞が互いに凝集し、細胞−細胞接着を開始することが可能となる。インキュベーション後に、細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブに移動させ、５分間２００ｇで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、４００μｌのＨＡＳＭＣ培地中に再懸濁し、数回ピペットアップおよびピペットダウン（ｐｉｐｅｔｔｅｄ ｕｐ ａｎｄ ｄｏｗｎ）することで、すべての細胞塊が壊れたことを確かなものとした。細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心チューブの内部に置いた０．５ｍｌのマイクロチューブ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）へ移動させ、その後、４分間２０００ｇで遠心分離にかけ、高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成した。上清培地を吸収し、５０ｍｍの長さの細胞シリンダーを生み出すように、細胞を、吸収によってキャピラリーチューブ（ＯＤ １．５ｍｍ， ＩＤ ０．５ｍｍ， Ｌ ７５ｍｍ； Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．， Ｂｒｏｏｍａｌｌ， ＰＡ）へ移動させた。キャピラリーチューブの内部の細胞ペーストを、２０分間、３７℃および５％のＣＯ_２で、ＨＡＳＭＣ培地中にインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーが供給されたプランジャーを使用して、キャピラリーチューブから（ＨＡＳＭＣ培地によって覆われた）アガロースのモールドの溝へと押し出した。細胞シリンダーを、２４時間および４８時間、３７℃および５％のＣＯ_２でインキュベートした。

【0080】

４．混合した細胞シリンダーでの生存率および取り扱いの容易性の評価

【0081】

４．１ 細胞生存率の評価：２４、４８および７２時間のインキュベーションの終わりに混合した細胞シリンダー中の細胞生存率を評価するために、日常的な組織学的検査を行った。簡潔に言うと、各時点で、混合した細胞シリンダーを、吸収してキャピラリーチューブに戻し（手でプランジャーを使用して）、マルチウェルプレートに移動させた。シリンダーを、パラフィンが埋め込まれる前に、１０％の中性緩衝ホルマリンを少なくとも２４時間使用して固定した。埋め込まれたシリンダーを区分し（横方向）、Ｈ＆Ｅ染色を行った。

【0082】

４．２ 取り扱いの容易性の評価：混合した細胞シリンダーの取り扱いの容易性を評価するために、２つの別々のパラメーターを評価した。最初に、シリンダーが各々のインキュベーション時点の終わりにカールした量を評価した。主観的プリファレンスのスコアリングシステムを使用した。次に、細胞シリンダーの完全性も、第２の主観的スコアを使用して、各々のインキュベーション時点の終わりに評価した。組み合わせた、これらの２つのスコアは、シリンダーを調製するための好ましい条件の選択を可能にし、後の工程中の取り扱いの容易性を確かなものとした。

【0083】

結果

【0084】

１．ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣを混合した細胞シリンダーの細胞生存率および取り扱いの容易性

【0085】

ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣを混合した細胞シリンダーを、上に記載の方法によって５、７．５、１０、１２．５および１５％のＨＡＥＣを含むように作った。シリンダーを、２４時間および４８時間、アガロースのモールド中にインキュベートした。各時点で、シリンダーに、カーリングおよび凝集のスコアを割り当てた。表１および２はその結果を要約する。参照され得るように、インキュベーション時間が２４時間から４８時間に増加するにつれ、取り扱いの容易性は、すべての混合した細胞シリンダーに関して低下する。１５％のＨＡＥＣおよび残りの８５％−ＨＡＳＭＣを含むシリンダーは、アガロースのモールド中の２４時間のインキュベーション後に取り扱うのが最も容易である。さらに、５％のＨＡＥＣおよび９５％のＨＡＳＭＣを含むシリンダーは、両方の時点で取り扱うのが最も難しい。

【0086】

Ｈ＆Ｅ染色（図１）を、すべての時点で各条件に対する細胞生存率に関して評価するために利用した。染色によって、アガロースのモールド中で２４時間インキュベートされたすべてのシリンダーが、最も生存可能である細胞を含み（ピンク染色の最小量によって証拠づけられるように）、細胞生存率が、増加するインキュベーション時間とともに減少することが明らかになった。さらに、アガロースのモールド中の２４時間のインキュベーション後に、１５％のＨＡＥＣおよび８５％のＨＡＳＭＣを含むシリンダー中の細胞生存率は最も高かった。

【0087】

「カーリングスコア」を、１０点ベースで各シリンダーに割り当て、ここで、１のスコアは、シリンダーがカーリングを示さなかったことを意味し、１０のスコアは、シリンダーが螺旋状の構造を形成するためにカールしたことを意味した。

【0088】

「凝集スコア」を、１０点ベースで各シリンダーに割り当て、ここで、１のスコアは、シリンダーがそれらの平滑な円筒状の構造を完全に維持したことを意味し、１０の凝集スコアは、円筒状の構造が完全に失われたことを意味した。

【0089】

【表1】

【0090】

【表2】

【0091】

（実施例２：多層の血管チューブ）
材料および方法

【0092】

１．細胞培養

【0093】

１．１ 平滑筋細胞：主要なヒト大動脈の平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を、３７℃および５％のＣＯ_２で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから）、５０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０ｍｇ／Ｌのグリシン、２０ｍｇ／Ｌのアラニン、５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、および３μｇ／ＬのＣｕＳＯ_４（すべてＳｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯから）によって補われた、低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）において維持し拡張した。継代４と８の間のＨＡＳＭＣのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。

【0094】

１．２ 内皮細胞：主要なヒト大動脈の内皮細胞（ＨＡＥＣ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を、２％のＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから）によって補われた、Ｍｅｄｉｕｍ ２００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）において維持し拡張した。細胞を、３７℃および５％のＣＯ_２で、ゼラチン（ブタの血清から；Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）でコーティングした組織培養で処理したフラスコ上で増殖させた。継代４と８の間のＨＡＥＣのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。

【0095】

１．３ 線維芽細胞：主要なヒトの皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を、３７℃および５％のＣＯ_２で、２％のＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから）によって補われた、Ｍｅｄｉｕｍ １０６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）において維持し拡張した。継代４と８の間のＨＤＦのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。

【0096】

２．アガロース溶液およびモールド

【0097】

２．１ ２％および４％（ｗ／ｖ）のアガロース溶液の調製：（それぞれ、２％または４％に対する）１ｇまたは２ｇの低融点アガロース（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＬＭＰ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を、５０ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中に溶解した。簡潔に言うと、アガロースが完全に溶解するまで、ＤＰＢＳおよびアガロースを、持続的に撹拌しながら、ホットプレート上で８５℃まで加熱する。アガロース溶液を、１２５℃で２５分間、蒸気滅菌によって殺菌する。温度が３６．５℃を超えて維持される限り、アガロース溶液は液相にとどまる。この温度以下で、相転移が生じ、アガロース溶液の粘度が増加し、およびアガロースが固形ゲルを形成する。

【0098】

２．２ アガロースのモールドの調製：アガロースのモールドを、１０ｃｍのペトリ皿に合うテフロン（登録商標）のモールドを使用して、細胞シリンダーのインキュベーションのために作った。簡潔に言うと、テフロン（登録商標）のモールドを、７０％のエタノール溶液を使用して、および４５分間モールドを紫外線にさらして、あらかじめ殺菌した。殺菌したモールドを、１０ｃｍのペトリ皿（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）の上に置き、安全に取り付けた。このアセンブリ（テフロン（登録商標）のモールド＋ペトリ皿）を、縦に維持し、４５ｍｌのあらかじめ暖められた、無菌の２％のアガロース溶液を、テフロン（登録商標）のモールドとペトリ皿の間の空間に注いだ。その後、アガロースの完全なゲル化を可能にするために、アセンブリを１時間室温で横に置いた。ゲル化の後、テフロン（登録商標）のプリントを取り除き、アガロースのモールドを、ＤＰＢＳを使用して２回洗浄した。その後、１７．５ｍｌのＨＡＳＭＣ培地を、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣを混合した細胞シリンダーをインキュベートするためにアガロースのモールドに加えるか、または、１７．５ｍｌのＨＤＦ培地を、ＨＤＦ細胞シリンダーをインキュベートするためにアガロースのモールドに加える。

【0099】

３．細胞シリンダー

【0100】

３．１ ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣを混合した細胞のシリンダーの作製：混合した細胞シリンダーを調製するために、ＨＡＳＭＣおよびＨＡＥＣを個別に集め、その後、前もって決められた割合で混合した。簡潔に言うと、培地を、コンフルエントな培養フラスコから取り除き、細胞を、ＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ^２の増殖領域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（１ｍｌ／１５ｃｍ^２の増殖領域；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）の存在下でインキュベーションによって培養フラスコの表面から分離した。ＨＡＳＭＣを０．１５％のトリプシンを使用して分離し、一方で、ＨＡＥＣを０．１％のトリプシンを使用して分離した。インキュベーション後に、適切な培地をフラスコに加えた（トリプシンの容積に対して２Ｘの容積）。細胞懸濁液を、６分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培地中に再懸濁し、血球計を使用して数えた。適切な容積のＨＡＳＭＣおよびＨＡＥＣを組み合わせ、１５％のＨＡＥＣおよび残りの８５％のＨＡＳＭＣ（総細胞集団の％として）を含む、混合した細胞懸濁液を産出した。混合した細胞懸濁液を、５分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。混合した細胞ペレットを、６ｍｌのＨＡＳＭＣ培地中に再懸濁し、２０ｍｌのガラスバイアル（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）に移動させ、その後、６０分間１５０ｒｐｍで、および３７℃および５％のＣＯ_２で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。これによって、細胞が互いに凝集し、細胞−細胞接着を開始することが可能となる。インキュベーション後に、細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブに移動させ、５分間２００ｇで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、４００μｌのＨＡＳＭＣ培地中に再懸濁し、数回ピペットアップおよびピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確かなものとした。細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心チューブの内部に置いた０．５ｍｌのマイクロチューブ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）へ移動させ、その後、４分間２０００ｇで遠心分離にかけ、高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成した。
上清培地を吸収し、５０ｍｍの長さの細胞シリンダーを生み出すように、細胞を、吸収によってキャピラリーチューブ（ＯＤ １．５ｍｍ， ＩＤ ０．５ｍｍ， Ｌ ７５ｍｍ； Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．， Ｂｒｏｏｍａｌｌ， ＰＡ）へ移動させた。キャピラリーチューブの内部の細胞ペーストを、２０分間、３７℃および５％のＣＯ_２で、ＨＡＳＭＣ培地中にインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーが供給されたプランジャーを使用して、キャピラリーチューブから（ＨＡＳＭＣ培地によって覆われた）アガロースのモールドの溝へと押し出した。細胞シリンダーを、２４時間、３７℃および５％のＣＯ_２でインキュベートした。

【0101】

３．２ ＨＤＦ細胞シリンダーの作製：ＨＤＦシリンダーを、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣを混合した細胞シリンダーを調製する方法に類似した方法を使用して調製した。簡潔に言うと、培地を、コンフルエントなＨＤＦ培養フラスコから取り除き、細胞を、ＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ^２の増殖領域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（０．１％；１ｍｌ／１５ｃｍ^２の増殖領域；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）の存在下でインキュベーションによって培養フラスコの表面から分離した。インキュベーション後に、ＨＤＦ培地をフラスコに加えた（トリプシンの容積に対して２Ｘの容積）。細胞懸濁液を、６分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、６ｍｌのＨＤＦ培地中に再懸濁し、２０ｍｌのガラスバイアル（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）に移動させ、その後、７５分間１５０ｒｐｍで、および３７℃および５％のＣＯ_２で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。インキュベーション後に、細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブに移動させ、５分間２００ｇで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、４００μｌのＨＤＦ培地中に再懸濁し、数回ピペットアップおよびピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確かなものとした。細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心チューブの内部に置いた０．５ｍｌのマイクロチューブ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）へ移動させ、その後、４分間２０００ｇで遠心分離にかけ、高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成した。上清培地を吸収し、５０ｍｍの長さの細胞シリンダーを生み出すように、細胞を、吸収によってキャピラリーチューブ（ＯＤ １．５ｍｍ， ＩＤ ０．５ｍｍ， Ｌ ７５ｍｍ； Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．， Ｂｒｏｏｍａｌｌ， ＰＡ）へ移動させた。キャピラリーチューブの内部の細胞ペーストを、２０分間、３７℃および５％のＣＯ_２で、ＨＤＦ培地中にインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーチューブから（ＨＤＦ培地によって覆われた）アガロースのモールドの溝へと押し出した。細胞シリンダーを、２４時間、３７℃および５％のＣＯ_２でインキュベートした。

【0102】

４．多層の血管チューブの作製

【0103】

４．１ アガロースのベースプレートの調製：アガロースのベースプレートを、１０ｍｌのあらかじめ暖められた（＞４０℃）アガロース（２％ｗ／ｖ）を１０ｃｍのペトリ皿に分配することによって生成した。分配直後に、アガロースを、皿の全ベースをカバーし、均一な層を形成するように、等しく広げる。ペトリ皿を、２０分間室温でインキュベートし、アガロースが完全にゲル化することを可能にする。

【0104】

４．２ 多層の血管チューブ：ＨＤＦの外側層およびＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣの内側層から成る血管チューブを、ＨＤＦシリンダー、およびＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣを混合した細胞シリンダーを利用して作った。図２に示されるような幾何学的配置を利用した。簡潔に言うと、２４時間のインキュベーション期間の終わりに、熟成したＨＤＦおよびＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣのシリンダーを吸収し、キャピラリーチューブへと戻し、さらに使用するまで適切な培地中に置いた。アガロースのロッドから成るサポート構造を、以下のように調製した。あらかじめ暖められた２％のアガロースを、キャピラリーチューブ（Ｌ＝５０ｍｍ）へ吸収し、冷たいＰＢＳの溶液（４℃）中で急速に冷却した。５ｃｍの長さのゲル化したアガロースシリンダーを、キャピラリーから押し出し（プランジャーを使用して）、アガロースのベースプレート上に真っすぐに置いた。第２のアガロースシリンダーを、第１のシリンダーに隣接させ、１０のアガロースシリンダーが堆積し、第１の層を形成するまで、そのプロセスを繰り返した。この時点で、２０μｌのＰＢＳを、アガロースシリンダー上に分配し、それらが湿るのを維持した。さらなる６のアガロースシリンダーを、図２に示されるような位置で層１の上に堆積させた（層２）。その後、３つのＨＤＦシリンダーを、位置４、５および６で堆積させ、層２を完成させた。各々のＨＤＦシリンダーを押し出した後に、４０μｌのＨＤＦ培地を、堆積したシリンダー上に分配することで、続くシリンダーの堆積を助け、且つ細胞シリンダーの脱水を防いだ。層３に対する次のアガロースシリンダーを堆積させ、その後、位置３および６でＨＤＦシリンダーを堆積させた。ＨＤＦ培地で構造を再び湿らせた後、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣを混合したシリンダーを、位置４および５に置いた。続いて、４０μｌのＨＡＳＭＣ培地および４０μｌのＨＤＦ培地を、細胞シリンダー上に分配した。位置１および７でアガロースシリンダーを、位置２および６でＨＤＦシリンダーを、位置３および５でＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣを混合したシリンダーを、および最終的に位置４で４％のアガロースシリンダーを堆積させることによって、層４を完成させた。図２に示される位置で、アガロースシリンダーを、続いてＨＤＦシリンダーを、および最終的にＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣシリンダーを置くことによって、層５、６および７を同様に完成させた。一旦全体的な構成物が完成すると、０．５ｍｌの暖かいアガロースを、構成物の各端部上に分配し、５分間室温でのゲル化を可能にした。そのアガロースのゲル化の後に、３０ｍｌのＨＡＳＭＣ培地をペトリ皿に加えた（それによって、全体的な構成物が完全に沈んだことを確かなものにした）。構成物を、２４時間、３７℃および５％のＣＯ_２でインキュベートし、細胞シリンダー間の凝集を可能にした。２４時間の終わりに、取り囲むアガロースのサポート構造を取り除き、凝集した多層の血管チューブを得た（図３）。

【0105】

（実施例３：脂肪組織のＳＶＦからの細胞を有する血管構成物（Ｂｌｏｏｄ Ｖｅｓｓｅｌｓ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ））
材料および方法

【0106】

１．細胞培養

【0107】

１．１ ＳＶＦからのＳＭＣ様の細胞：ＳＭＣ様の細胞を、リポアスピレート（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅｓ）のコラゲナーゼ消化の後に分離した細胞の付着する切片から作り出した。この消化は、間質血管細胞群（ＳＶＦ）として知られる細胞の集団を生み出す。ＳＶＦの細胞を、標準的な組織培養のプラスチック上に平板培養することができ、付着細胞を、適切な培養条件でさらに選択することができる。脂肪組織リポアスピレートのＳＶＦからのＳＭＣ様の細胞を、３７℃および５％のＣＯ_２で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから）、５０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０ｍｇ／Ｌのグリシン、２０ｍｇ／Ｌのアラニン、５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、および３μｇ／ＬのＣｕＳＯ_４（すべてＳｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯから）によって補われた、高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）において維持し拡張した。継代３と８の間のＳＶＦ−ＳＭＣのコンフルエントな副次培養物を、すべての研究において使用した。

【0108】

１．２ ＳＶＦ−ＥＣ：間質血管細胞群（ＳＶＦ）からの内皮細胞を、本物の内皮細胞（ＥＣ）の主要な分離物を増殖させるために一般に使用される増殖培地中で維持し拡張した。特に、１０％のＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンによって補われた、Ｍ１９９中で、ＳＶＦ−ＥＣを維持した。細胞を、３７℃および５％のＣＯ_２で、組織培養で処理したフラスコ上で増殖させた。継代３と８の間のＳＶＦ−ＥＣのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。

【0109】

２．アガロース溶液およびモールド

【0110】

２．１ ２％および４％（ｗ／ｖ）のアガロース溶液の調製：（それぞれ、２％または４％に対する）１ｇまたは２ｇの低融点アガロース（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＬＭＰ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を、５０ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中に溶解した。簡潔に言うと、アガロースが完全に溶解するまで、ＤＰＢＳおよびアガロースを、持続的に撹拌しながら、ホットプレート上で８５℃まで加熱する。アガロース溶液を、１２５℃で２５分間、蒸気滅菌によって殺菌する。温度が３６．５℃を超えて維持される限り、アガロース溶液は液相にとどまる。この温度以下で、相転移が生じ、アガロース溶液の粘度が増加し、およびアガロースが固形ゲルを形成する。

【0111】

２．２ アガロースのモールドの調製：アガロースのモールドを、１００ｍｍのペトリ皿に合うテフロン（登録商標）のモールドを使用して、細胞シリンダーのインキュベーションのために作った。簡潔に言うと、テフロン（登録商標）のモールドを、７０％のエタノール溶液を使用して、および４５分間モールドを紫外線にさらして、あらかじめ殺菌した。殺菌したモールドを、１００ｍｍのペトリ皿（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）の上に置き、安全に取り付けた。このアセンブリ（テフロン（登録商標）のモールド＋ペトリ皿）を、縦に維持し、４５ｍｌのあらかじめ暖められた、無菌の２％のアガロース溶液を、テフロン（登録商標）のモールドとペトリ皿の間の空間に注いだ。その後、アセンブリを１時間室温で横に置き、アガロースの完全なゲル化を可能にした。ゲル化の後、テフロン（登録商標）のプリントを取り除き、アガロースのモールドを、ＤＰＢＳを使用して２回洗浄した。その後、１７．５ｍｌのＨＡＳＭＣ培地を、ＳＶＦ−ＳＭＣ：ＳＶＦ−ＥＣを混合した細胞シリンダーをインキュベートするためにアガロースのモールドに加えるか、または１７．５ｍｌのＨＤＦ培地を、ＨＤＦ細胞シリンダーをインキュベートするためにアガロースのモールドに加えた。

【0112】

３．細胞シリンダー

【0113】

３．１ ＳＶＦ−ＳＭＣ：ＳＶＦ−ＥＣを混合した細胞シリンダーの作製：混合した細胞シリンダーを調製するために、ＳＶＦ−ＳＭＣおよびＳＶＦ−ＥＣを個別に集め、その後、前もって決められた割合で混合した。簡潔に言うと、培地を、コンフルエントな培養フラスコから取り除き、細胞を、ＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ^２の増殖領域）で洗浄した。細胞を、５〜１０分間、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）の存在下でインキュベーションによって培養フラスコの表面から分離した。インキュベーション後に、適切な培地をフラスコに加え、酵素活性をクエンチした。細胞懸濁液を、６分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培地中に再懸濁し、血球計を使用して数えた。ＳＶＦ−ＳＭＣおよびＳＶＦ−ＥＣの適切な容積を組み合わせ、１５％のＳＶＦ−ＥＣおよび残りの８５％のＳＶＦ−ＳＭＣ（総細胞集団の％として）を含む混合した細胞懸濁液を産出した。混合した細胞懸濁液を、５分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。混合した細胞ペレットを、６ｍｌのＳＶＦ−ＳＭＣ培地中に再懸濁し、２０ｍｌのガラスバイアル（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）に移動させ、その後、６０分間１５０ｒｐｍで、および３７℃および５％のＣＯ_２で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。これによって、細胞が互いに凝集し、細胞−細胞接着を開始することが可能となる。インキュベーション後に、細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブに移動させ、５分間２００ｇで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、４００μｌのＳＶＦ−ＳＭＣ培地中に再懸濁し、数回ピペットアップおよびピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確かなものとした。細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心チューブの内部に置いた０．５ｍｌのマイクロチューブ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）へ移動させ、その後、４分間２０００ｇで遠心分離にかけ、高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成した。上清培地を吸収し、５０ｍｍの長さの細胞シリンダーを生み出すように、細胞を、吸収によってキャピラリーチューブ（ＯＤ １．２５ｍｍ， ＩＤ ０．２６６ｍｍ， Ｌ ７５ｍｍ； Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．， Ｂｒｏｏｍａｌｌ， ＰＡ）へ移動させた。キャピラリーチューブの内部の細胞ペーストを、２０分間、３７℃および５％のＣＯ_２で、ＳＶＦ−ＳＭＣ培地中にインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーが供給されたプランジャーを使用して、キャピラリーチューブから（ＳＶＦ−ＳＭＣ培地によって覆われた）アガロースのモールドの溝へと押し出した。細胞シリンダーを、６〜１２時間、３７℃および５％のＣＯ_２でインキュベートした。

【0114】

４．血管チューブの作製

【0115】

４．１ アガロースのベースプレートの調製：１２ｍｌのあらかじめ暖められた（＞６０℃）アガロース（２％ｗ／ｖ）を、１０ｃｍのペトリ皿へ分配することによって、アガロースのベースプレートを作った。分配直後に、アガロースを、皿の全ベースをカバーし、均一な層を形成するように、等しく広げる。ペトリ皿を、２０分間室温でインキュベートし、アガロースが完全にゲル化することを可能にする。

【0116】

４．２ 血管チューブ：ＳＶＦ−ＳＭＣ：ＳＶＦ−ＥＣを混合した細胞シリンダーから成る血管チューブを作った。簡潔に言うと、６時間のインキュベーション期間の終わりに、熟成したＳＶＦ−ＳＭＣおよびＳＶＦ−ＥＣのシリンダーを吸収し、キャピラリーチューブへと戻し、さらに使用するまで適切な培地中に置いた。アガロースのロッドから成るサポート構造を、以下のように調製した。あらかじめ暖められた２％のアガロースを、キャピラリーチューブ（Ｌ＝５０ｍｍ）へ吸収し、冷たいＰＢＳ溶液（４℃）中で急速に冷却した。５ｃｍの長さのゲル化したアガロースシリンダーを、キャピラリーから押し出し（プランジャーを使用して）、アガロースのベースプレート上に真っすぐに置いた。第２のアガロースシリンダーを、第１のシリンダーに隣接させ、適切な数のアガロースシリンダーが押し出され、最終的なチューブ形状が組み込まれるまで、そのプロセスを繰り返した。ＳＶＦ−ＳＭＣおよびＳＶＦ−ＥＣの多細胞シリンダーを含むチューブ状の血管構成物を、層ごとの印刷プロセス（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）を使用して作り、ここで、チューブ状の細胞構成物の中心にあるアガロースシリンダーは、４％のアガロースから成る。一旦全体的な構成物が完成すると、０．５ｍｌの暖かいアガロースを、構成物の各端部上に分配し、５分間室温でのゲル化を可能にした。そのアガロースのゲル化の後に、３０ｍｌのＳＶＦ−ＳＭＣ培地をペトリ皿に加えた（それによって、全体的な構成物が完全に沈んだことを確かなものにした）。構成物を、１２〜２４時間、３７℃および５％のＣＯ_２でインキュベートし、隣接する細胞シリンダー間の凝集を可能にした。１２〜２４時間の終わりに、取り囲むアガロースのサポート構造を取り除き、凝集した血管チューブを分離した。

【0117】

（実施例４．ＨＡＳＭＣ−ＨＤＦ−ＨＡＥＣの多細胞シリンダーを有する血管構成物）
材料および方法

【0118】

１．細胞培養

【0119】

１．１ 平滑筋細胞：主要なヒト大動脈の平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を、３７℃および５％のＣＯ_２で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから）、５０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０ｍｇ／Ｌのグリシン、２０ｍｇ／Ｌのアラニン、５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、および３μｇ／ＬのＣｕＳＯ_４（すべてＳｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯから）によって補われた、低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）において維持し拡張した。継代４と８の間のＨＡＳＭＣのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。

【0120】

１．２ 内皮細胞：主要なヒト大動脈の内皮細胞（ＨＡＥＣ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を、１０％のＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから）によって補われた、Ｍｅｄｉｕｍ １９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）において維持し拡張した。細胞を、３７℃および５％のＣＯ_２で、ゼラチン（ブタの血清から；Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）でコーティングした組織培養において処理されたフラスコ上で増殖させた。継代４と８の間のＨＡＥＣのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。

【0121】

１．３ 線維芽細胞：主要なヒトの皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を、３７℃および５％のＣＯ_２で、２％のＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから）によって補われた、Ｍｅｄｉｕｍ １０６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）において維持し拡張した。継代４と８の間のＨＤＦのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。

【0122】

２．アガロースの溶液およびモールド

【0123】

２．１ ２％および４％（ｗ／ｖ）のアガロース溶液の調製：（それぞれ、２％または４％に対する）１ｇまたは２ｇの低融点アガロース（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＬＭＰ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を、５０ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中に溶解した。簡潔に言うと、アガロースが完全に溶解するまで、ＤＰＢＳおよびアガロースを、持続的に撹拌しながら、ホットプレート上で８５℃まで加熱する。アガロース溶液を、１２５℃で２５分間、蒸気滅菌によって殺菌する。温度が３６．５℃を超えて維持される限り、アガロース溶液は液相にとどまる。この温度以下で、相転移が生じ、アガロース溶液の粘度が増加し、およびアガロースが固形ゲルを形成する。

【0124】

２．２ アガロースのモールドの調製：アガロースのモールドを、１０ｃｍのペトリ皿に合うテフロン（登録商標）のモールドを使用して、細胞シリンダーのインキュベーションのために作った。簡潔に言うと、テフロン（登録商標）のモールドを、７０％のエタノール溶液を使用して、および４５分間モールドを紫外線にさらして、あらかじめ殺菌した。殺菌したモールドを、１０ｃｍのペトリ皿（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）の上に置き、安全に取り付けた。このアセンブリ（テフロン（登録商標）のモールド＋ペトリ皿）を、縦に維持し、４５ｍｌのあらかじめ暖められた、無菌の２％のアガロース溶液を、テフロン（登録商標）のモールドとペトリ皿の間の空間に注いだ。その後、アセンブリを１時間室温で横に置き、アガロースの完全なゲル化を可能にした。ゲル化の後、テフロン（登録商標）のプリントを取り除き、アガロースのモールドを、ＤＰＢＳを使用して２回洗浄した。その後、１７．５ｍｌのＨＡＳＭＣ培地を、混合した細胞シリンダーをインキュベートするために、アガロースのモールドに加えた。

【0125】

３．ＨＡＳＭＣ−ＨＤＦ−ＨＡＥＣシリンダー

【0126】

３．１ ＨＡＳＭＣ−ＨＤＦ−ＨＡＥＣを混合した細胞シリンダーの作製：混合した細胞シリンダーを調製するために、ＨＡＳＭＣ、ＨＤＦ、ＨＡＥＣを個々に集め、その後、前もって決められた割合（例えば、７０：２５：５のＨＡＳＭＣ：ＨＤＦ：ＨＡＥＣの割合）で混合した。簡潔に言うと、培地を、コンフルエントな培養フラスコから取り除き、細胞を、ＤＰＢＳ（１ｍｌ／１０ｃｍ^２の増殖領域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（１ｍｌ／１５ｃｍ^２の増殖領域；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）の存在下でインキュベーションによって培養フラスコの表面から分離した。ＨＡＳＭＣおよびＨＤＦを０．１５％のトリプシンを使用して分離し、一方で、ＨＡＥＣを０．１％のトリプシンを使用して分離した。インキュベーション後に、適切な培地をフラスコに加えた（トリプシンの容積に対して２Ｘの容積）。細胞懸濁液を、６分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培地中に再懸濁し、血球計を使用して数えた。適切な容積のＨＡＳＭＣ、ＨＤＦおよびＨＡＥＣを組み合わせ、混合した細胞懸濁液を産出した。混合した細胞懸濁液を、５分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を吸収した。混合した細胞ペレットを、６ｍｌのＨＡＳＭＣ培地中に再懸濁し、２０ｍｌのガラスバイアル（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）に移動させ、その後、６０分間１５０ｒｐｍで、および３７℃および５％のＣＯ_２で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。これによって、細胞が互いに凝集し、細胞−細胞接着を開始することが可能となる。インキュベーション後に、細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブに移動させ、５分間２００ｇで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、４００μｌのＨＡＳＭＣ培地中に再懸濁し、数回ピペットアップおよびピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確かなものとした。細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心チューブの内部に置いた０．５ｍｌのマイクロチューブ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）へ移動させ、その後、４分間２０００ｇで遠心分離にかけ、高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成した。上清培地を吸収し、５０ｍｍの長さの細胞シリンダーを生み出すように、細胞を、吸収によってキャピラリーチューブ（ＯＤ １．２５ｍｍ， ＩＤ ０．２６６ｍｍ， Ｌ ７５ｍｍ； Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．， Ｂｒｏｏｍａｌｌ， ＰＡ）へ移動させた。キャピラリーの内部の細胞ペーストを、２０分間、３７℃および５％のＣＯ_２で、ＨＡＳＭＣ培地中にインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーが供給されたプランジャーを使用して、キャピラリーチューブから（ＨＡＳＭＣ培地によって覆われた）アガロースのモールドの溝へと押し出した。細胞シリンダーを、６〜２４時間、３７℃および５％のＣＯ_２でインキュベートした。

【0127】

４．多細胞シリンダー（ＨＡＳＭＣ：ＨＤＦ：ＨＡＥＣ）を有する血管チューブの作製

【0128】

４．１ アガロースのベースプレートの調製：１０ｍｌのあらかじめ暖められた（＞４０℃）アガロース（２％ｗ／ｖ）を、１０ｃｍのペトリ皿へ分配することによって、アガロースのベースプレートを作った。分配直後に、アガロースを、皿の全ベースをカバーし、均一な層を形成するように、等しく広げる。ペトリ皿を、２０分間室温でインキュベートし、アガロースが完全にゲル化することを可能にする。

【0129】

４．２ 多細胞の血管チューブ：すべての３つの細胞タイプ、ＨＡＳＭＣ：ＨＤＦ：ＨＡＥＣを含むシリンダーから成る血管チューブを、多細胞シリンダーを利用して作った。６または１２の細胞シリンダーおよび１または７の中心のアガロースシリンダーをそれぞれ有する幾何学的配置を利用した。簡潔に言うと、６〜１２時間のインキュベーション期間の終わりに、熟成したＨＡＳＭＣ−ＨＤＦ−ＨＡＥＣシリンダーを吸収し、キャピラリーチューブへと戻し、さらに使用するまで適切な培地中に置いた。アガロースのロッドから成るサポート構造を、以下のように調製した。あらかじめ暖められた２％のアガロースを、キャピラリーチューブ（Ｌ＝５０ｍｍ）へ吸収し、冷たいＰＢＳ溶液（４℃）中で急速に冷却した。５ｃｍの長さのゲル化したアガロースシリンダーを、キャピラリーから押し出し（プランジャーを使用して）、アガロースのベースプレート上に真っすぐに置いた。第２のアガロースシリンダーを、第１のシリンダーに隣接させ、７または１０のアガロースシリンダーが堆積し、第１の層を形成するまで、そのプロセスを繰り返した。６の多細胞のシリンダーおよび１の中心のアガロースシリンダーを有する血管チューブの作製が、さらに詳細に記載される。この時点で、２０μｌのＰＢＳを、アガロースシリンダー上に分配し、それらが水和するのを維持した。さらなる２つのアガロースシリンダーを、層１の上に堆積させ、第１のアガロースシリンダーを、最左端で堆積させ、および第２のアガロースシリンダーを、その右に堆積させた。その後、２つの多細胞のＨＡＳＭＣ−ＨＤＦ−ＨＡＥＣシリンダーを、層２において２つのアガロースシリンダーの右に堆積させた。続いて、２０μｌのＨＡＳＭＣ培地を、細胞シリンダーの上に分配した。その後、もう２つのアガロースシリンダーを、２つの多細胞シリンダーの右に堆積させた。層３を、層の最左端でアガロースシリンダーによって構築した。多細胞シリンダーを、そのシリンダーの右に堆積させた。その後、４％のアガロースシリンダーを、多細胞シリンダーの右に堆積させた。別の多細胞シリンダーを、４％のアガロースシリンダーの右に堆積させた。最終的に、別の２％のアガロースシリンダーを、第２の多細胞シリンダーの右に堆積させた。続いて、２０μｌのＨＡＳＭＣ培地を、細胞シリンダーの上に分配した。層４は、最右端で２％のアガロースシリンダーとともに始まり、その後、２つの細胞シリンダーをアガロースシリンダーの右に堆積させた。層４は、２つの多細胞シリンダーの右への最終的なアガロースシリンダーとともに終了した。続いて、２０μｌのＨＡＳＭＣ培地を、細胞シリンダーの上に分配した。層４の上に３つのアガロースシリンダーを堆積させることによって、層５を構築した。一旦全体的な構成物が完成すると、０．５ｍｌの暖かいアガロースを、構成物の各端部上に分配し、５分間室温でのゲル化を可能にした。そのアガロースのゲル化の後に、３０ｍｌのＨＡＳＭＣ培地をペトリ皿に加えた（それによって、全体的な構成物が完全に沈んだことを確かなものにした）。構成物を、１２〜２４時間、３７℃および５％のＣＯ_２でインキュベートし、隣接する細胞シリンダー間の凝集を可能にした。１２〜２４時間の終わりに、取り囲むアガロースのサポート構造を取り除き、凝集した多層の血管チューブを得た（図３）。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】