特許 5951755 定量的ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ｑＮＰＡ）法および定量的ヌクレアーゼプロテクション配列決定（ｑＮＰＳ）法の改善

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5951755

(24)【登録日】2016年6月17日

(45)【発行日】2016年7月13日

(54)【発明の名称】定量的ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ｑＮＰＡ）法および定量的ヌクレアーゼプロテクション配列決定（ｑＮＰＳ）法の改善

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20160630BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160630BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12N15/00 A

【請求項の数】36

【全頁数】82

(21)【出願番号】特願2014-509323(P2014-509323)

(86)(22)【出願日】2012年4月26日

(65)【公表番号】特表2014-512838(P2014-512838A)

(43)【公表日】2014年5月29日

(86)【国際出願番号】US2012035260

(87)【国際公開番号】WO2012151111

(87)【国際公開日】20121108

【審査請求日】2015年4月15日

(31)【優先権主張番号】61/482,486

(32)【優先日】2011年5月4日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/537,492

(32)【優先日】2011年9月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/576,143

(32)【優先日】2011年12月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512112622

【氏名又は名称】エイチティージー モレキュラー ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】セレグマン， ブルース

(72)【発明者】

【氏名】トンプソン， デブラ

(72)【発明者】

【氏名】バシチェック， トム

(72)【発明者】

【氏名】ゴードン， デブラ エー．

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００８／００７６１２１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１２１９２７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子の配列を決定する方法であって、
フランキング配列を含む少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）と該サンプルを、該ＮＰＰＦが該標的核酸分子に特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程であって、ここで、該ＮＰＰＦは、
５’末端および３’末端、
該ＮＰＰＦと該標的核酸分子との特異的結合を可能にする、該標的核酸分子の領域に相補的な配列、
該標的核酸分子に相補的な配列に対して５’、３’またはその両方に位置するフランキング配列であって、ここで、該フランキング配列は、該サンプル中に存在する核酸分子に見られない少なくとも１２個連続したヌクレオチドを含むことにより、普遍的な増幅配列を提供し、該フランキング配列は、増幅プライマーの少なくとも一部に相補的である、フランキング配列
を含む、工程；
該フランキング配列に相補的な配列（ＣＦＳ）を含む核酸分子と該サンプルを、該フランキング配列が該ＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程；
一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと該サンプルを、未結合の核酸分子を除去するのに十分な条件下において接触させることによって、該標的核酸分子およびＣＦＳにハイブリダイズしたＮＰＰＦを含む消化されたサンプルを生成する工程；
該消化されたサンプル中のＮＰＰＦを、該増幅プライマーを用いて増幅することによってＮＰＰＦアンプリコンを生成する工程であって、ここで、少なくとも１つの増幅プライマーは、該ＮＰＰＦのフランキング配列に相補的な領域を含む、工程；および
該ＮＰＰＦアンプリコンの少なくとも一部を配列決定することによって、該サンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子の配列を決定する工程
を包含する、方法。

【請求項2】

サンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子を検出する方法であって、
フランキング配列を含む少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）と該サンプルを、該ＮＰＰＦが該標的核酸分子に特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程であって、ここで、該ＮＰＰＦは、
５’末端および３’末端、
該ＮＰＰＦと該標的核酸分子との特異的結合を可能にする、該標的核酸分子の領域に相補的な配列、
該標的核酸分子に相補的な配列に対して５’、３’またはその両方に位置するフランキング配列であって、ここで、該フランキング配列は、該サンプル中に存在する核酸分子に見られない少なくとも１２個連続したヌクレオチドを含むことにより、普遍的な増幅配列を提供し、該フランキング配列は、増幅プライマーの少なくとも一部に相補的である、フランキング配列
を含む、工程；
該フランキング配列に相補的な配列（ＣＦＳ）を含む核酸分子と該サンプルを、該フランキング配列が該ＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程；
一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと該サンプルを、未結合の核酸分子を除去するのに十分な条件下において接触させることによって、該標的核酸分子およびＣＦＳにハイブリダイズしたＮＰＰＦを含む消化されたサンプルを生成する工程；
該消化されたサンプル中のＮＰＰＦを、増幅プライマーを用いて増幅することによってＮＰＰＦアンプリコンを生成する工程であって、ここで、少なくとも１つの増幅プライマーは、該ＮＰＰＦのフランキング配列に相補的な領域を含む、工程；および
該ＮＰＰＦアンプリコンを検出することによって、該サンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子を検出する工程を包含する、方法。

【請求項3】

前記ＮＰＰＦが、ＤＮＡ分子を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＮＰＰＦが、３５〜１５０ヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記標的核酸分子の領域に相補的な配列が、１０〜６０ヌクレオチド長である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記フランキング配列が、１２〜５０ヌクレオチド長である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記ＮＰＰＦが、５’末端および３’末端にフランキング配列を含み、ここで、５’末端における該フランキング配列は、３’末端における該フランキング配列とは異なる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記少なくとも１つの増幅プライマーが、前記増幅工程中に前記ＮＰＰＦアンプリコンと実験用タグまたはシーケンシングアダプターとの付着を可能にする配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記フランキング配列が、実験用タグ、シーケンシングアダプターまたはその両方をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記実験用タグが、サンプル、被験体、処置または標的核酸配列の識別を可能にする核酸配列を含む、請求項８または９に記載の方法。

【請求項11】

前記シーケンシングアダプターが、シーケンシングプラットフォーム上への捕捉を可能にする核酸配列を含む、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

前記実験用タグまたは配列タグが、前記ＮＰＰＦアンプリコンの５’末端または３’末端に存在する、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

１つ以上の標的核酸分子が、固定されているか、架橋されているか、または不溶性である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

前記サンプルが、固定されている、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

前記ＮＰＰＦが、ＤＮＡであり、前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

前記一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

前記方法が、複数のサンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子を同時に配列決定するかまたは検出する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

前記方法が、少なくとも２つの標的核酸分子を配列決定するかまたは検出し、前記サンプルが、少なくとも２つの異なるＮＰＰＦと接触され、各ＮＰＰＦは、異なる標的核酸分子に特異的である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。

【請求項19】

前記方法が、複数のサンプルにおいて行われ、少なくとも２つの標的核酸分子が、該複数のサンプルの各々において検出される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。

【請求項20】

少なくとも１つのＮＰＰＦが、ｍｉＲＮＡ標的核酸分子に特異的であり、少なくとも１つのＮＰＰＦが、ｍＲＮＡ標的核酸分子に特異的である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。

【請求項21】

前記サンプルを溶解する工程をさらに包含する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

配列決定が、可逆性のターミネーターの配列決定、アレイに基づく配列決定、鎖停止シーケンシング、色素停止シーケンシングまたはパイロシーケンシングを含む、請求項１または３〜２１のいずれかに記載の方法。

【請求項23】

配列決定が、一分子シーケンシングを含む、請求項１または３〜２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

得られたＮＰＰＦ配列を参照配列データベースと比較する工程；および
いくつかの同定された各ＮＰＰＦ配列を決定する工程
をさらに包含する、請求項１または３〜２３のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

前記ＮＰＰＦアンプリコンを検出する工程が、各領域が二機能性リンカーと会合した少なくとも１つのアンカーを含む複数の空間的に不連続の領域を含む表面と該ＮＰＰＦアンプリコンを、該ＮＰＰＦアンプリコンが該二機能性リンカーの第２の部分に特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程を包含し、ここで、該二機能性リンカーは、該アンカーに特異的に結合する第１の部分および該ＮＰＰＦアンプリコンのうちの１つの少なくとも一部に特異的に結合する第２の部分を含む、請求項２〜２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記ＮＰＰＦアンプリコンを検出する工程が、各領域が該ＮＰＰＦアンプリコンのうちの１つの少なくとも一部に相補的な領域を有する少なくとも１つの核酸アンカーを含む複数の空間的に不連続の領域を含む表面と該ＮＰＰＦアンプリコンを、該ＮＰＰＦアンプリコンが該核酸アンカーに特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程を包含する、請求項２〜２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記ＮＰＰＦアンプリコンを検出する工程が、該ＮＰＰＦアンプリコンを表面の集団と、該ＮＰＰＦアンプリコンが前記二機能性リンカーの第２の部分に特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程を包含し、ここで、該表面の集団は、表面の部分集団を含み、表面の各部分集団は、該ＮＰＰＦアンプリコンのうちの１つの少なくとも一部に特異的に結合する第１の部分を含む二機能性リンカーと会合した少なくとも１つのアンカーを含む、請求項２〜２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記ＮＰＰＦアンプリコンを検出する工程が、該ＮＰＰＦアンプリコンを表面の集団と、該ＮＰＰＦアンプリコンが前記核酸アンカーに特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程を包含し、ここで、該表面の集団は、表面の部分集団を含み、表面の各部分集団は、該ＮＰＰＦアンプリコンのうちの１つの少なくとも一部に相補的な領域を有する少なくとも１つの核酸アンカーを含む、請求項２〜２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記表面の集団が、ビーズの集団を含む、請求項２７または２８に記載の方法。

【請求項30】

前記二機能性リンカーの第２の部分が、前記標的核酸分子の領域に相補的なＮＰＰＦ領域に相補的であることによって、前記ＮＰＰＦアンプリコンと該二機能性リンカーとの特異的結合を可能にする、請求項２〜２１または２５または２７のいずれかに記載の方法。

【請求項31】

前記ＮＰＰＦアンプリコンが、検出可能な標識を含む、請求項２〜３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

前記検出可能な標識が、ハプテン、蛍光分子、酵素または放射性同位体を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記検出可能な標識が、ビオチンを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記ＮＰＰＦアンプリコンを検出する工程が、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼに結合体化されたアビジンまたはストレプトアビジンと該ＮＰＰＦアンプリコンを接触させる工程を包含する、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記少なくとも１つのＮＰＰＦが、少なくとも１０個のＮＰＰＦを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記サンプルが、ホルマリン固定されている、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
この出願は、２０１１年５月４日に出願された米国仮出願第６１／４８２，４８６号、２０１１年９月２１日に出願された米国仮出願第６１／５３７，４９２号および２０１１年１２月１５日に出願された米国仮出願第６１／５７６，１４３号（これらの全ては、参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。

【0002】

分野
本開示は、改善された定量的ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ｑＮＰＡ）法および定量的ヌクレアーゼプロテクション配列決定（ｑＮＰＳ）法を提供する。このような方法は、核酸標的の識別、検出および／または配列決定において使用され得る。

【背景技術】

【0003】

背景
核酸分子を検出するおよび配列決定する方法が知られているが、複数のサンプルまたは複数の配列を同時または同時発生的に解析することを可能にする方法がなおも必要とされている。核酸分子の検出または配列決定の反応を多重化する方法は、最も望まれる性能または簡易さのレベルで実現されていない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

要旨
以前の定量的ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ｑＮＰＡ）法および定量的ヌクレアーゼプロテクション配列決定（ｑＮＰＳ）法を大幅に改善し、かつ現行の核酸の検出方法および配列決定方法の改善である方法が提供される。これらの方法は、核酸分子標的の識別、検出および／または配列決定において使用され得る。これらの方法は、１つ以上のフランキング配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）を使用する。ＮＰＰＦは、標的核酸分子の全部または一部に相補的な配列を含み、それにより、標的核酸分子とＮＰＰＦとの特異的結合またはハイブリダイゼーションを可能にする。例えば、標的核酸分子の領域に相補的なＮＰＰＦの領域は、その標的核酸分子の領域に高特異性で結合するかまたはハイブリダイズする（かついくつかの例では二機能性リンカーの領域にも結合し得る）。ＮＰＰＦはさらに、そのＮＰＰＦの５’末端および／または３’末端に１つ以上のフランキング配列を含む。したがって、その１つ以上のフランキング配列は、標的核酸分子に相補的な配列に対して５’、３’またはその両方に位置する。ＮＰＰＦが、５’末端と３’末端の両方にフランキング配列を含む場合、いくつかの例において、各ＮＰＰＦの配列は、異なり、かつ相補的でない。フランキング配列は、サンプル中に存在する核酸分子に見られない配列を有するいくつかの連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１２ヌクレオチドの配列）を含み、普遍的なハイブリダイゼーション配列および／または増幅配列を提供する。この普遍的なハイブリダイゼーション配列および／または増幅配列は、増幅プライマーの少なくとも一部に相補的な配列を有するとき、同じ増幅プライマーを、異なる標的核酸分子に特異的なＮＰＰＦを増幅するために使用できるので、多重化を可能にする。それは、検出可能な標識をＮＰＰＦに付加するためまたはＮＰＰＦを捕捉し、濃縮するために使用され得る、すべてのＮＰＰＦに対する普遍的なハイブリダイゼーション配列も提供する。例えば、同じフランキング配列が、異なる標的核酸分子に特異的なＮＰＰＦ上に存在する場合、そのＮＰＰＦが異なる核酸分子を標的にしていたとしても、同じフランキング配列を有する任意のＮＰＰＦを増幅するために同じプライマーを使用できる。例えば、フランキング配列は、ＮＰＰＦを表面上などに捕捉するために使用され得る。フランキング配列は、可変配列（例えば、各特定のＮＰＰＦに特異的な配列）を含み得、そのＮＰＰＦを表面上に捕捉するため、または他の目的のために、例えば、ＮＰＰＦを識別するために、使用され得る。したがって、いくつかの例において、開示される方法は、複数のＮＰＰＦ（ここで、各ＮＰＰＦは、特定の標的核酸分子に特異的に結合する）を使用して、サンプル中のいくつかの異なる標的核酸分子を検出するためまたは配列決定するために使用される。１つの例において、開示される方法は、複数のサンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子を同時に検出するためまたは配列決定するために使用される。

【0005】

本開示は、サンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子の配列を検出するためまたは決定するための方法を提供する。その方法は、サンプル（例えば、サンプル中の核酸分子を変性させるために加熱されたサンプル）を少なくとも１つのＮＰＰＦと、そのＮＰＰＦが標的核酸分子に特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程を包含し得る。そのＮＰＰＦ分子は、標的核酸分子の全部または一部に相補的な配列を含む。これにより、ＮＰＰＦと標的核酸分子との特異的結合またはハイブリダイゼーションが可能になる。その方法はさらに、フランキング配列の全部または一部に相補的な配列を有する１つ以上の核酸分子（そのような分子は、本明細書中でＣＦＳと称される）とサンプルを、そのフランキング配列がＣＦＳに特異的に結合するかまたはハイブリダイズするのに十分な条件下において接触させる工程を包含する。２つ以上のＣＦＳが、フランキング配列全体にハイブリダイズするために使用され得る（例えば、フランキング（ｆｌａｋｉｎｇ）配列全体が網羅されるように、複数の個別のＣＦＳが単一のフランキング配列にハイブリダイズし得る）。これにより、標的核酸分子ならびにＣＦＳに結合した（ハイブリダイズした）ＮＰＰＦ分子が生成され、それにより、少なくとも４つの連続したオリゴヌクレオチド配列（すべての塩基が相補的な塩基とのハイブリダイゼーションに関わっている）を含み得る二本鎖分子が生成される。

【0006】

標的核酸分子およびＣＦＳをＮＰＰＦに結合可能にさせた後、上記方法はさらに、一本鎖（ｓｓ）核酸分子（または核酸分子のｓｓ領域）に特異的なヌクレアーゼとサンプルを、相補的な塩基にハイブリダイズしていない核酸塩基を除去するのに十分な条件下において接触させる工程を包含し得る。したがって、例えば、標的核酸分子またはＣＦＳに結合していないＮＰＰＦならびに未結合の標的核酸分子、サンプル中の他のｓｓ核酸分子および未結合のＣＦＳが、分解されることになる。これによって、ＣＦＳおよび標的核酸分子との二本鎖付加物として存在するインタクトなＮＰＰＦを含む消化されたサンプルが生成される。いくつかの例において、上記方法はさらに、サンプルのｐＨを上昇させ、かつ／またはサンプルを加熱して、ＮＰＰＦに結合した標的核酸分子およびＣＦＳを解離するかもしくは除去する工程を包含する。

【0007】

標的核酸分子およびＣＦＳに結合し、ゆえにヌクレアーゼによる処理を乗り越えたＮＰＰＦは、増幅され得、かつ／または標識され得る。消化されたサンプル中のＮＰＰＦは、１つ以上の増幅プライマーを使用して増幅され、それにより、ＮＰＰＦアンプリコンが生成され得る。少なくとも１つの増幅プライマーが、ＮＰＰＦのフランキング配列の全部または一部に相補的な領域を含む。いくつかの例において、ＮＰＰＦは、５’末端と３’末端の両方にフランキング配列を含み、２つの増幅プライマーが使用される（ここで、一方の増幅プライマーは、５’末端フランキング配列に相補的な領域を有し、他方の増幅プライマーは、３’末端フランキング配列に相補的な領域を有する）。

【0008】

あるいは、ヌクレアーゼによる処理を乗り越えたＮＰＰＦを使用する代わりに、ＮＰＰＦにハイブリダイズした標的核酸鎖（例えば、ＤＮＡ鎖）が、直接使用され得る（例えば、増幅され得るか、標識される得か、検出され得るか、配列決定され得るか、またはそれらの組み合わせが行われ得る）。例えば、標的核酸鎖は、１つ以上の増幅プライマーを使用して増幅され、それにより、検出され得るおよび／または配列決定され得る標的アンプリコンが生成され得る。したがって、ＮＰＰＦアンプリコンが本明細書中で言及されるが、それの代わりに標的アンプリコンを用いることができることが認識されるだろう。

【0009】

次いで、得られたアンプリコン（またはその一部、例えば、３’部分）が、配列決定され得るか、または検出され得る。１つの例において、アンプリコンは、基材に付着される。例えば、その基材は、ＮＰＰＦアンプリコン上のフランキング配列の全部または一部に相補的な配列を有する少なくとも１つの捕捉プローブを含み、ゆえに、相補的なフランキング配列を有するＮＰＰＦアンプリコンの捕捉を可能にし得る。あるいは、その基材は、二機能性リンカーと会合した少なくとも１つのアンカーを含み得、ここで、その二機能性リンカーは、そのアンカーに特異的に結合する第１の部分およびＮＰＰＦアンプリコンのうちの１つの一部に特異的に結合する第２の部分を含む。次いで、捕捉されたＮＰＰＦアンプリコンは、配列決定されるかまたは検出され、それにより、サンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子の配列が決定され得るか、または検出され得る。

【0010】

他の例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、アレイ上に捕捉されずに検出されるかまたは配列決定される。例えば、ＮＰＰＦアンプリコンは、シーケンシングプラットフォームに移され得る。

【0011】

ＮＰＰＦは、例えば、増幅中に、または増幅のない工程として、検出可能な標識で標識され得る。あるいは、一方または両方のフランキング領域が、検出可能な標識をＮＰＰＦにハイブリダイズさせるために使用され得る。

【0012】

本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
サンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子の配列を決定する方法であって、
フランキング配列を含む少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）と該サンプルを、該ＮＰＰＦが該標的核酸分子に特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程であって、ここで、該ＮＰＰＦは、
５’末端および３’末端、
該ＮＰＰＦと該標的核酸分子との特異的結合を可能にする、該標的核酸分子の領域に相補的な配列、
該標的核酸分子に相補的な配列に対して５’、３’またはその両方に位置するフランキング配列であって、ここで、該フランキング配列は、該サンプル中に存在する核酸分子に見られない少なくとも１２個連続したヌクレオチドを含むことにより、普遍的な増幅配列を提供し、該フランキング配列は、増幅プライマーの少なくとも一部に相補的である、フランキング配列
を含む、工程；
該フランキング配列に相補的な配列（ＣＦＳ）を含む核酸分子と該サンプルを、該フランキング配列が該ＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程；
一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと該サンプルを、未結合の核酸分子を除去するのに十分な条件下において接触させることによって、該標的核酸分子およびＣＦＳにハイブリダイズしたＮＰＰＦを含む消化されたサンプルを生成する工程；
該消化されたサンプル中のＮＰＰＦを、該増幅プライマーを用いて増幅することによってＮＰＰＦアンプリコンを生成する工程であって、ここで、少なくとも１つの増幅プライマーは、該ＮＰＰＦのフランキング配列に相補的な領域を含む、工程；および
該ＮＰＰＦアンプリコンの少なくとも一部を配列決定することによって、該サンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子の配列を決定する工程
を包含する、方法。
（項目２）
サンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子を検出する方法であって、
フランキング配列を含む少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）と該サンプルを、該ＮＰＰＦが該標的核酸分子に特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程であって、ここで、該ＮＰＰＦは、
５’末端および３’末端、
該ＮＰＰＦと該標的核酸分子との特異的結合を可能にする、該標的核酸分子の領域に相補的な配列、
該標的核酸分子に相補的な配列に対して５’、３’またはその両方に位置するフランキング配列であって、ここで、該フランキング配列は、該サンプル中に存在する核酸分子に見られない少なくとも１２個連続したヌクレオチドを含むことにより、普遍的な増幅配列を提供し、該フランキング配列は、増幅プライマーの少なくとも一部に相補的である、フランキング配列
を含む、工程；
該フランキング配列に相補的な配列（ＣＦＳ）を含む核酸分子と該サンプルを、該フランキング配列が該ＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程；
一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと該サンプルを、未結合の核酸分子を除去するのに十分な条件下において接触させることによって、該標的核酸分子およびＣＦＳにハイブリダイズしたＮＰＰＦを含む消化されたサンプルを生成する工程；
該消化されたサンプル中のＮＰＰＦを、増幅プライマーを用いて増幅することによってＮＰＰＦアンプリコンを生成する工程であって、ここで、少なくとも１つの増幅プライマーは、該ＮＰＰＦのフランキング配列に相補的な領域を含む、工程；および
該ＮＰＰＦアンプリコンを検出することによって、該サンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子を検出する工程を包含する、方法。
（項目３）
前記ＮＰＰＦが、ＤＮＡ分子を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記ＮＰＰＦが、３５〜１５０ヌクレオチドを含む、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記標的核酸分子の領域に相補的な配列が、１０〜６０ヌクレオチド長である、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記フランキング配列が、１２〜５０ヌクレオチド長である、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記ＮＰＰＦが、５’末端および３’末端にフランキング配列を含み、ここで、５’末端における該フランキング配列は、３’末端における該フランキング配列とは異なる、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記少なくとも１つの増幅プライマーが、前記増幅工程中に前記ＮＰＰＦアンプリコンと実験用タグまたはシーケンシングアダプターとの付着を可能にする配列をさらに含む、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記フランキング配列が、実験用タグ、シーケンシングアダプターまたはその両方をさらに含む、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記実験用タグが、サンプル、被験体、処置または標的核酸配列の識別を可能にする核酸配列を含む、項目８または９に記載の方法。
（項目１１）
前記シーケンシングアダプターが、シーケンシングプラットフォーム上への捕捉を可能にする核酸配列を含む、項目８〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記実験用タグまたは配列タグが、前記ＮＰＰＦアンプリコンの５’末端または３’末端に存在する、項目８〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
１つ以上の標的核酸分子が、固定されているか、架橋されているか、または不溶性である、項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記サンプルが、固定されている、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記ＮＰＰＦが、ＤＮＡであり、前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたはそれらの組み合わせを含む、項目１〜１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼを含む、項目１〜１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
前記方法が、複数のサンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子を同時に配列決定するかまたは検出する、項目１〜１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
前記方法が、少なくとも２つの標的核酸分子を配列決定するかまたは検出し、前記サンプルが、少なくとも２つの異なるＮＰＰＦと接触され、各ＮＰＰＦは、異なる標的核酸分子に特異的である、項目１〜１７のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記方法が、複数のサンプルにおいて行われ、少なくとも２つの標的核酸分子が、該複数のサンプルの各々において検出される、項目１〜１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
少なくとも１つのＮＰＰＦが、ｍｉＲＮＡ標的核酸分子に特異的であり、少なくとも１つのＮＰＰＦが、ｍＲＮＡ標的核酸分子に特異的である、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
前記サンプルを溶解する工程をさらに包含する、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
配列決定が、Ｓｏｌｅｘａシーケンシング、４５４シーケンシング、鎖停止シーケンシング、色素停止シーケンシングまたはパイロシーケンシングを含む、項目１または３〜２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
配列決定が、一分子シーケンシングを含む、項目１または３〜２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
得られたＮＰＰＦ配列を参照配列データベースと比較する工程；および
いくつかの同定された各ＮＰＰＦ配列を決定する工程
をさらに包含する、項目１または３〜２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記ＮＰＰＦアンプリコンを検出する工程が、各領域が二機能性リンカーと会合した少なくとも１つのアンカーを含む複数の空間的に不連続の領域を含む表面と該ＮＰＰＦアンプリコンを、該ＮＰＰＦアンプリコンが該二機能性リンカーの第２の部分に特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程を包含し、ここで、該二機能性リンカーは、該アンカーに特異的に結合する第１の部分および該ＮＰＰＦアンプリコンのうちの１つの少なくとも一部に特異的に結合する第２の部分を含む、項目２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記ＮＰＰＦアンプリコンを検出する工程が、各領域が該ＮＰＰＦアンプリコンのうちの１つの少なくとも一部に相補的な領域を有する少なくとも１つの核酸アンカーを含む複数の空間的に不連続の領域を含む表面と該ＮＰＰＦアンプリコンを、該ＮＰＰＦアンプリコンが該核酸アンカーに特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程を包含する、項目２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記ＮＰＰＦアンプリコンを検出する工程が、該ＮＰＰＦアンプリコンを表面の集団と、該ＮＰＰＦアンプリコンが前記二機能性リンカーの第２の部分に特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程を包含し、ここで、該表面の集団は、表面の部分集団を含み、表面の各部分集団は、該ＮＰＰＦアンプリコンのうちの１つの少なくとも一部に特異的に結合する第１の部分を含む二機能性リンカーと会合した少なくとも１つのアンカーを含む、項目２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記ＮＰＰＦアンプリコンを検出する工程が、該ＮＰＰＦアンプリコンを表面の集団と、該ＮＰＰＦアンプリコンが前記核酸アンカーに特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程を包含し、ここで、該表面の集団は、表面の部分集団を含み、表面の各部分集団は、該ＮＰＰＦアンプリコンのうちの１つの少なくとも一部に相補的な領域を有する少なくとも１つの核酸アンカーを含む、項目２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記表面の集団が、ビーズの集団を含む、項目２７または２８に記載の方法。
（項目３０）
前記二機能性リンカーの第２の部分が、前記標的核酸分子の領域に相補的なＮＰＰＦ領域に相補的であることによって、前記ＮＰＰＦアンプリコンと該二機能性リンカーとの特異的結合を可能にする、項目２〜２１または２５または２７のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
前記ＮＰＰＦアンプリコンが、検出可能な標識を含む、項目２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記検出可能な標識が、ハプテン、蛍光分子、酵素または放射性同位体を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記検出可能な標識が、ビオチンを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記ＮＰＰＦアンプリコンを検出する工程が、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼに結合体化されたアビジンまたはストレプトアビジンと該ＮＰＰＦアンプリコンを接触させる工程を包含する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記少なくとも１つのＮＰＰＦが、少なくとも１０個のＮＰＰＦを含む、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記サンプルが、ホルマリン固定されている、項目１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
本開示の前述のおよび他の目標および特徴が、添付の図面を参照して進められる以下の詳細な説明から明らかになるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、フランキング配列を有する例示的なヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）１００を示している模式図である。ＮＰＰＦ１００は、標的核酸配列および二機能性（またはプログラミング）リンカーに特異的に結合する配列を有する領域１０２を含む。このＮＰＰＦは、５’−フランキング配列１０４および３’−フランキング配列１０６も含む。

【図2】図２は、開示される方法を使用して核酸分子を検出するかまたは配列決定するためにＮＰＰＦ２０２を使用する方法の最初の工程を示している模式図である。破線バーは、第１の標的に特異的なＮＰＰＦを表しており（いくつかの例において、そのＮＰＰＦは、ビオチン（Ｂ）で標識されている）、灰色の実線バーは、第２の標的に特異的なＮＰＰＦを表しており（いくつかの例において、そのＮＰＰＦは、Ｂで標識されている）、緑色の点線バーは、ＮＰＰＦのフランキング配列に相補的な核酸分子（ＣＦＳ）２０４を表しており、黒色の実線バーは、標的核酸２００（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を表している。ビオチンは、ビオチン（またはジゴキシン）標識されたプライマーを使用することによって、増幅中に付加され得る。あるいは、プライマーは、別の標識（例えば、フルオロフォア）で標識され得、それにより、標識されたＮＰＰＦが得られる。（１）サンプル（例えば、細胞またはＦＦＰＥ組織）を、サンプル破壊緩衝液と接触させ（例えば、サンプル中の細胞および組織を溶解させるために）、ＮＰＰＦおよびＣＦＳとインキュベートする。（２）未結合の（例えば、一本鎖）核酸を、ｓｓ核酸分子に特異的なヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）で消化する。（３）例えば、塩基を加えることおよび加熱することによって、そのヌクレアーゼは、不活性化され得、ＮＰＰＦは、結合した標的分子および結合したＣＦＳから解離される。（４）残ったＮＰＰＦを、例えば、適切なプライマー２０８を用いるＰＣＲを使用することによって、増幅する。いくつかの例において、プライマー２０８は、得られるアンプリコン２１０の標識を可能にする検出可能な標識を含む。得られたアンプリコン２１０は、検出され得る（図３）かまたは配列決定され得る（図４）。

【図3】図３は、どのようにＮＰＰＦアンプリコン２１０が、（５）アンカー２１４と会合した二機能性リンカー２１６を含むかまたは核酸捕捉分子２２０を含むアレイ２１２上に捕捉され得るのかを示している模式図である。二機能性リンカー２１６は、ＮＰＰＦアンプリコン２１０の領域に相補的な領域（例えば、標的核酸にハイブリダイズした配列に相補的な領域）およびアンカーの一部に相補的な領域を含む。核酸捕捉分子２２０は、ＮＰＰＦアンプリコン２１０の領域（例えば、フランキング配列またはその一部）に相補的な領域を含む。（６）１つの例において、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用して、結合したＮＰＰＦが検出され、（７）基質を加えた後にアレイが撮像される。アレイ上のシグナルの位置によって、標的核酸分子によって生成されたシグナルの識別が可能になる。

【図4】図４は、ＮＰＰＦアンプリコン２１０が（５）配列決定され得ることを示している模式図である。

【図5A】図５Ａ〜Ｂは、開示される方法を使用して核酸分子を検出するかまたは配列決定するためにＮＰＰＦ４０２を使用する方法の工程において処理されるときの核酸分子の詳細を示している模式図である。より長い有色の実線バーは、標的核酸分子４００を表しており、末端にそれよりも薄いおよび濃い色を有するバーは、標的に特異的なＮＰＰＦ４０２であり、異なる色の末端４０４は、フランキング配列を表している。標的の色は、その対応するＮＰＰＦの色と一致している。より短い有色の実線バーは、ＮＰＰＦのフランキング配列に相補的な核酸分子（ＣＦＳ）４０６を表している。

【図5B】図５Ａ〜Ｂは、開示される方法を使用して核酸分子を検出するかまたは配列決定するためにＮＰＰＦ４０２を使用する方法の工程において処理されるときの核酸分子の詳細を示している模式図である。より長い有色の実線バーは、標的核酸分子４００を表しており、末端にそれよりも薄いおよび濃い色を有するバーは、標的に特異的なＮＰＰＦ４０２であり、異なる色の末端４０４は、フランキング配列を表している。標的の色は、その対応するＮＰＰＦの色と一致している。より短い有色の実線バーは、ＮＰＰＦのフランキング配列に相補的な核酸分子（ＣＦＳ）４０６を表している。

【図6】図６Ａ〜Ｆは、（ＡおよびＢ）ＮＰＰＦの一方の末端だけにフランキング配列を有する実施形態または（Ｃ〜Ｆ）ＮＰＰＦの両端にフランキング配列を有する実施形態を含む、ＮＰＰＦ分子の例示的な実施形態を示している模式図である。

【図7】図７は、７つのユニークなＮＰＰＦの各々に対して検出されたアンプリコンの数を示している棒グラフである。エラーバーは、平均値からの１標準偏差を表している。

【図8】図８は、７つのユニークなＮＰＰＦの各々に対して観察された比と、元のＰＣＲ反応に加えられたＮＰＰＦの量に基づいて予想される比を比較している棒グラフである。

【図9】図９は、増幅なし（通常）または増幅あり（極高感度，ＥＳ）で検出されたＮＰＰＦプローブを比較している棒グラフおよび表である。各実験を３つ組で行った。ＰＣＲ増幅された反応物を、捕捉および測定の前に希釈した。

【図10】図１０は、投入材料、ＮＰＰＦタイプ、および細胞株の溶解産物を配列決定するために使用された実験タグを示している表である。各実験を、２つ組または３つ組で行った。

【図11】図１１は、ＴＨＰ１細胞溶解産物を使用した３つ組の配列決定実験からの４６個のＮＰＰＦの配列決定数を示している棒グラフである。エラーバーは、平均値からの１標準偏差を表している。

【図12】図１２Ａおよび１２Ｂは、滴定配列決定からのＮＰＰＦの配列決定数の折れ線グラフである。この実験では、投入量の範囲ならびにｑＮＰＳカウント法の検出の範囲および限界に対するアウトプットの線形性に注目した。４つの濃度のＴＨＰ１細胞溶解産物を、投入材料として使用した。（Ａ）は、最低数を用いた８つのＮＰＰＦを示しており、（Ｂ）は、最高数を用いた４つのＮＰＰＦを示している。この実験を３つ組で行った；このプロットは、ただ１つの反復の結果を示している。

【図13】図１３は、ｍｉＲＮＡを測定するＮＰＰＦの配列決定数の折れ線グラフである。３つの濃度のＨｅｐＧ２細胞溶解産物を、投入材料として使用した。代表的な５つのＮＰＰＦに対するカウントを示す。この実験を３つ組で行った；このプロットは、ただ１つの反復の結果を示している。

【図14】図１４は、ある範囲のＰＣＲサイクル数および投入量を使用して増幅されたＮＰＰＦからの配列決定数の棒グラフである。各バーは、３つの異なる投入濃度のうちの１つおよび３つのＰＣＲサイクル数のうちの１つを使用した１つのｑＮＰＡ実験を表している。結果の比較を容易にするために、リードの総数を等しく設定するようにすべての実験を正規化した。

【図15】図１５Ａおよび１５Ｂは、分割され、（Ａ）アレイにハイブリダイズしたまたは（Ｂ）配列決定され、カウントされた、３つ組の反応におけるＮＰＰＦを表している棒グラフである。３つ組の反応を平均し、エラーバーは、平均値からの１標準偏差を表している。

【発明を実施するための形態】

【0014】

配列表
本明細書中に列挙される核酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されているようなヌクレオチド塩基に対する標準的な文字の省略形を使用して示される。各核酸配列の一方の鎖だけが示されるが、その相補鎖は、表示されている鎖に対する任意の参照によって含められると理解される。提供される配列において：
配列番号１〜１６は、開示される方法とともに使用され得る例示的なアンカー核酸配列を提供する。

【0015】

配列番号１７および１８は、ＮＰＰＦとともに使用され得る、それぞれ例示的な５’および３’フランキング配列を提供する。

【0016】

配列番号１９および２０は、例示的なＰＣＲプライマーを提供する。

【0017】

配列番号２１〜４４は、ヌクレオチド２５〜３０に存在するバーコード配列を含む例示的なプライマーを提供する。

【0018】

詳細な説明
Ｉ．概要
本開示は、多重化を可能にする、標的核酸分子を検出するかまたは配列決定する改善された方法を提供する。開示される方法は、現在利用可能な配列決定方法および検出方法にまさるいくつかの改善を提供する。例えば、それらの方法は、標的核酸分子の処理をより必要としないので、そのような処理によって導入されるバイアスを減少させるかまたは排除することができる。例えば、現行の方法では、例えば標的がＲＮＡであるとき、方法は、代表的には、サンプルからＲＮＡを単離するかもしくは抽出する工程、それをＲＴ−ＰＣＲに供する工程、そのＲＮＡをライゲートする工程、またはそれらの組み合わせを使用する。開示される方法では、そのような工程は必要ない。結果として、本方法は、別段、検出配列決定の影響を受けやすくない、一連のサンプルタイプの解析を可能にする。さらに、これにより、サンプルからのＲＮＡの損失が少なくなり、より正確な結果が提供される。それにより、酵素のバイアスも減少する。開示される方法は、所望の核酸分子の標的化された検出および配列決定も提供する。これは、データ解析を大幅に簡単にする。現行の全ゲノム配列決定法は、生成される大量のデータ、および複雑なバイオインフォマティクスの必要性という難題に見舞われている。配列決定のコストは減少してきたが、配列を決定する能力は、研究者がデータを保存する、伝送するおよび解析する能力を越えている。結果として、通常、妥当な長さの時間で解析され得るよりも多くのデータが生成されている。開示される方法は、標的化されているので、これらの障害を克服し得る。例えば、標的の一部しか検出されるまたは配列決定される必要がないので、生成されるデータの量が、簡素化される。ヌクレオチドの長いリードは、必要ないし、配列のフラグメントも、参照配列に対して適切にアラインメントされる必要がない。さらに、それらの結果は、複雑なバイオインフォマティクス解析の必要なく、容易にカウントされ得る。

【0019】

例えば、本方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、変異（例えば、遺伝子の融合、挿入または欠失）、タンデム反復、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）およびＤＮＡメチル化を検出するために使用され得る。本方法は、本明細書中でヌクレアーゼ保護プローブと称される、フランキング配列を含むプローブ（ＮＰＰＦ）を使用する。そのプローブ上のフランキング配列が、化学量論を損なわずに、増幅のための普遍的なプライマー結合部位をもたらし、シーケンシングアダプターおよび実験用タグの付加（３’もしくは５’末端のいずれか、または両端における付加、例えば、多重化を増加させるため）を可能にするので、ＮＰＰＦの使用は、多重化を可能にし、かつ、検出されるかまたは配列決定される標的核酸分子の化学量論を保存する。フランキング部位は、普遍的であり得るので、任意の標的配列に対する任意のＮＰＰＦを増幅するために同じプライマーを使用することができ、ゆえに、多重化および化学量論の保存が可能になる。１つの例において、ＮＰＰＦの両端から増幅することによって、開示される方法は、以前のｑＮＰＡ法およびｑＮＰＳ法よりも高い特異性を提供する。インタクトな３’および５’フランキング配列を有するＮＰＰＦだけが、指数関数的に増幅され、ヌクレアーゼによって切断されたＮＰＰＦは、配列決定されるかまたは検出されるのに十分には増幅されない。

【0020】

さらに、上記プライマーは、タグ（例えば、ＮＰＰＦ自体全体の配列決定を必要とせずに標的の識別を可能にする実験タグ、あるいは、３’もしくは５’末端のいずれかまたは両端において、異なる患者由来のサンプルを単一のランに組み合わせる（例えば、多重化を増加させる）ことを可能にする実験タグ、ならびに特定のシーケンシングプラットフォームに対して必要とされる配列の付着およびいくつかのシーケンシングプラットフォームのためのコロニーの形成を可能にするシーケンシングアダプター）の付加を可能にする。ＮＰＰＦの使用は、例えば全遺伝子を含むサンプルをＮＰＰＦ（またはＮＰＰＦもしくは標的アンプリコン）に減少させるので、解析される（例えば、配列決定される）サンプルの複雑さも簡素化する。ＮＰＰＦ（またはＮＰＰＦにハイブリダイズした標的）の配列決定は、他の配列決定法に必要とされるデータ解析と比べてデータ解析を簡素化し、配列をゲノムとマッチさせ、標準的な配列決定法から得られた複数の配列／遺伝子をデコンボリュート（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）しなければならないのではなく、サンプルに加えられたＮＰＰＦとのマッチを単純にカウントするようにアルゴリズムを単純化させる。いくつかの例において、開示される方法は、以前のｑＮＰＡ法およびｑＮＰＳ法と比べて、得られるシグナルを増加させる（例えば、増幅を行う前にＮＰＰＦ生成物を実質的に希釈せずに、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１２５倍、少なくとも１５０倍または少なくとも２００倍の増加）。

【0021】

１つの例において、本開示は、サンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０または少なくとも１００個の標的核酸分子）を検出するためまたはサンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子の配列を決定するための方法を提供する。いくつかの例において、そのサンプルは、サンプル中の核酸分子を変性させるために、例えば、ＮＰＰＦとサンプル中の標的核酸分子とのその後のハイブリダイゼーションを可能にするために、加熱される。いくつかの例において、そのサンプルは、溶解されたサンプルである。いくつかの例において、そのサンプルは、固定されたサンプル（例えば、パラフィン包埋ホルマリン固定（ＦＦＰＥ）サンプル、ヘマトキシリンおよびエオシン染色組織またはグルタルアルデヒド固定組織）である。例えば、標的核酸分子は、固定され得るか、架橋され得るか、または不溶性であり得る。

【0022】

本方法は、フランキング配列を含む少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）とサンプルを、ＮＰＰＦが標的核酸分子に特異的に結合するのに十分な条件下において接触させる工程を包含し得る。いくつかの例において、開示される方法は、複数のサンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子を同時または同時発生的に配列決定するかまたは検出する。いくつかの例において、開示される方法は、サンプル中の２つ以上の標的核酸分子を配列決定するかまたは検出する（例えば、同時または同時発生的に）。そのような例では、サンプルを複数のＮＰＰＦと接触させる（ここで、各ＮＰＰＦは、特定の標的核酸分子に特異的に結合する）。例えば、１０個の標的核酸分子が存在する場合、サンプルを異なる１０個のＮＰＰＦ（各々がその１０個の標的のうちの１つに特異的である）と接触させ得る。いくつかの例において、少なくとも１０個の異なるＮＰＰＦが、サンプルとインキュベートされる。しかしながら、いくつかの例では、単一の標的核酸分子に特異的な２つ以上のＮＰＰＦ（例えば、２、３、４、５、１０、２０個またはそれ以上）（例えば、標的の異なる領域に特異的なＮＰＰＦの集団、または標的およびそのバリエーション（例えば、変異または多型を有するもの）に結合し得るＮＰＰＦの集団）が使用され得ると認識される。

【0023】

ＮＰＰＦ分子は、５’末端および３’末端、ならびにその中間に標的核酸分子の全部または一部に相補的な配列を含む。これにより、ＮＰＰＦと標的核酸分子との特異的結合またはハイブリダイゼーションが可能になる。例えば、標的核酸分子の領域に相補的なＮＰＰＦの領域は、その標的核酸分子の領域に高特異性で結合するかまたはハイブリダイズする。ＮＰＰＦは、標的核酸配列の全部または一部に相補的であり得る。ＮＰＰＦ分子はさらに、ＮＰＰＦの５’末端および／または３’末端に存在する１つ以上のフランキング配列を含む。したがって、その１つ以上のフランキング配列は、標的核酸分子に相補的な配列に対して５’、３’またはその両方に位置する。各フランキング配列は、いくつかの連続したヌクレオチドを含み、サンプル中に存在する核酸分子に見られない配列（例えば、少なくとも１２個連続したヌクレオチドの配列）を生成する。ＮＰＰＦが、５’末端と３’末端の両方にフランキング配列を含む場合、いくつかの例では、各ＮＰＰＦの配列は、異なり、かつ互いに相補的でない。

【0024】

フランキング配列は、増幅プライマーの少なくとも一部に相補的な普遍的なハイブリダイゼーション配列／増幅配列を提供する。いくつかの例において、フランキング配列は、実験用タグ、シーケンシングアダプターまたはそれらの組み合わせを含み得る（またはその付加を可能にし得る）。例えば、実験用タグは、例えば、表面上への（例えば、その表面上の特定のスポットにおけるまたは特定のビーズへの）ＮＰＰＦの捕捉を可能にする、捕捉プローブに相補的な配列であり得る。いくつかの例において、実験用タグは、ＮＰＰＦを識別する配列（例えば、特定の患者または標的配列に特異的なタグ、例えば、そのようなタグ化されたＮＰＰＦの区別または分類を可能にするもの）であり得る。いくつかの例において、シーケンシングアダプターは、ＮＰＰＦ ＮＰＰＦアンプリコンを特定のシーケンシングプラットフォームとともに使用するのを可能にする配列。

【0025】

ＮＰＰＦは、任意の核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）であり得、非天然塩基を含み得る。いくつかの例において、ＮＰＰＦは、少なくとも３５ヌクレオチド（例えば、４０〜８０または５０〜１５０ヌクレオチド）である。標的核酸分子の領域に相補的なＮＰＰＦの一部は、少なくとも６ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１０、少なくとも２５または少なくとも６０、例えば、６〜６０ヌクレオチド長）であり得る。ＮＰＰＦのフランキング配列は、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチドまたは少なくとも２５ヌクレオチド、例えば、１２〜５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの例において、ＮＰＰＦは、２つのフランキング配列：一方を５’末端に、他方を３’末端に含む。いくつかの例において、５’末端のフランキング配列は、３’末端のフランキング配列と異なる。さらに、ＮＰＰＦが、２つのフランキング配列を含む場合、理想的には、その２つのフランキング配列は、類似の融解温度（Ｔｍ）（例えば、＋／−５℃のＴｍ）を有する。

【0026】

本方法はさらに、フランキング配列に相補的な配列を有する核酸分子（そのような分子は、本明細書中でＣＦＳと称される）とサンプルを、フランキング配列がＣＦＳに特異的に結合するかまたはハイブリダイズするのに十分な条件下において接触させる工程を包含する。当業者は、フランキング配列を保護するために単一のＣＦＳを使用する代わりに、フランキング配列を保護するために複数のＣＦＳが使用され得ることを認識するだろう。これにより、標的核酸分子ならびにＣＦＳに結合したＮＰＰＦ分子が生成され、それにより、少なくとも３個の連続したオリゴヌクレオチド配列（すべての塩基が相補的な塩基とのハイブリダイゼーションに関わっており、ＮＰＰＦおよびＣＦＳの塩基は非天然塩基を含み得る）を含む二本鎖分子が生成される。ＣＦＳは、その対応するフランキング配列にハイブリダイズし、ゆえに、その後の工程におけるヌクレアーゼによる消化から保護する。いくつかの例において、各ＣＦＳは、その対応するフランキング配列と全く同じ長さである。いくつかの例において、ＣＦＳは、その対応するフランキング配列に完全に相補的である。しかしながら、当業者は、５’末端フランキング配列を保護するＣＦＳの３’末端または３’末端フランキング配列を保護するＣＦＳの５’末端が、差異（例えば、これらの各位置に存在する１つのヌクレオチド）を有し得ることを認識するだろう。

【0027】

標的核酸分子ならびにＣＦＳをＮＰＰＦに結合させた後、本方法はさらに、一本鎖（ｓｓ）核酸分子または核酸分子のｓｓ領域に特異的なヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）とサンプルを、相補的な塩基にハイブリダイズしていない核酸塩基を除去するのに十分な条件下において接触させる工程を包含し得る。したがって、例えば、標的核酸分子またはＣＦＳに結合していないＮＰＰＦならびに未結合の標的核酸分子、サンプル中の他のｓｓ核酸分子および未結合のＣＦＳが、分解され得る。これにより、ＣＦＳおよび標的核酸にハイブリダイズした二本鎖付加物として存在するインタクトなＮＰＰＦを含む消化されたサンプルが生成される。いくつかの例において、例えば、ＮＰＰＦがＤＮＡから構成される場合、ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたはそれらの組み合わせを含み得る。

【0028】

いくつかの例において、本方法はさらに、サンプルのｐＨを上昇させ、かつ／または加熱して、例えば、ヌクレアーゼを不活性化させるか、ＮＰＰＦに結合した標的核酸分子およびＣＦＳを除去するか、もしくはそれらの組み合わせを行う工程を包含する。いくつかの例において、本方法は、ＮＰＰＦから標的核酸（例えば、ＤＮＡ）を放出する工程、および次いでさらに、放出された標的を解析する工程（例えば、標的を検出するかまたは配列決定する工程）を包含する。いくつかの例において、標的核酸は、ＤＮＡであり、そのＤＮＡは、その検出または配列決定の前に増幅される。

【0029】

標的核酸分子およびＣＦＳに結合し、ゆえにヌクレアーゼによる処理を乗り越えたＮＰＰＦは、例えば、ＰＣＲ増幅を使用して、増幅され得る。消化されたサンプル中のＮＰＰＦは、１つ以上の増幅プライマーを使用して増幅され、それにより、ＮＰＰＦアンプリコンが生成され得る。少なくとも１つの増幅プライマーは、ＮＰＰＦフランキング配列に相補的な領域を含む。いくつかの例において、ＮＰＰＦは、５’末端と３’末端の両方にフランキング配列を含み、２つの増幅プライマーが使用され、ここで、一方の増幅プライマーは、５’末端フランキング配列に相補的な領域を有し、他方の増幅プライマーは、３’末端フランキング配列に相補的な領域を有する。その増幅プライマーの一方または両方が、増幅中にＮＰＰＦアンプリコンと実験用タグまたはシーケンシングアダプターとの付着を可能にする配列を含み得、一方または両方のプライマーが、ＮＰＰＦアンプリコンの標識を可能にするために標識され得る。いくつかの例において、実験用タグとシーケンシングアダプターの両方が、例えば、ＮＰＰＦアンプリコンの反対端に、付加される。例えば、そのようなプライマーの使用によって、ＮＰＰＦアンプリコンの５’末端もしくは３’末端からまたは３’末端と５’末端の両方から伸長する実験用タグまたは配列タグが生成され、それにより、可能な多重化の程度が高まり得る。実験用タグは、サンプル、被験体または標的核酸配列の識別を可能にするユニークな核酸配列を含み得る。いくつかの例において、増幅プライマーは、基材上へのＮＰＰＦアンプリコンの捕捉を可能にする（例えば、ＮＰＰＦアンプリコン上の捕捉配列に相補的な配列を有する基材上のプローブへのハイブリダイゼーションによって）実験用タグを含む。シーケンシングアダプターは、得られたＮＰＰＦをシーケンシングプラットフォーム上に捕捉することを可能にする核酸配列を含み得る。例えば、増幅プライマーは、いったん配列決定チップ上に捕捉されたら増幅を促進し得る、ポリＡまたはポリＴ配列タグの付着を可能にする配列を含み得る。いくつかの例において、増幅プライマーは、ＮＰＰＦアンプリコンを標識するために使用される。他の例において、一方または両方のフランキング領域が、標識されたプローブを用いるなどして（例えば、増幅なしで）検出可能な標識をＮＰＰＦにハイブリダイズさせるために使用される。

【0030】

次いで、得られたＮＰＰＦ（または標的）アンプリコン（またはその一部、例えば、３’部分）が、配列決定されるかまたは検出されることにより、サンプル中の少なくとも１つの標的核酸分子の配列が決定され得るか、または検出され得る。

【0031】

１つの例において、ＮＰＰＦアンプリコン（またはその一部）は、配列決定される。ＮＰＰＦアンプリコンを配列決定する任意の方法を使用することができ、本開示は、特定の配列決定方法に限定されない。いくつかの例において、使用される配列決定方法は、Ｓｏｌｅｘａ（登録商標）シーケンシング、４５４（登録商標）シーケンシング、鎖停止シーケンシング（ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、色素停止シーケンシング（ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）またはパイロシーケンシングである。いくつかの例において、一分子シーケンシングが使用される。ＮＰＰＦアンプリコンが配列決定されるいくつかの例において、本方法は、得られたＮＰＰＦ配列を参照配列データベースと比較する工程；および同定された各ＮＰＰＦ配列の数を測定する工程も包含する。

【0032】

いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、検出される。そのような例において、本方法は、ＮＰＰＦアンプリコンを表面（例えば、複数の空間的に不連続の領域を有する表面）と接触させる工程を包含し得る。１つの例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、表面上の１つ以上の核酸捕捉分子によって捕捉され、ここで、その表面上の核酸捕捉分子の配列は、ＮＰＰＦアンプリコン上のフランキング配列の少なくとも一部に相補的である。この相補性のおかげで、ＮＰＰＦアンプリコンと表面上の捕捉分子とのハイブリダイゼーションおよび結合が可能になる。そのような捕捉分子は、表面に直接結合体化され得る。ＮＰＰＦアンプリコンは、そのＮＰＰＦアンプリコンが表面上の捕捉分子に特異的に結合するのに十分な条件下において、その表面とともにインキュベートされるかまたは接触される。いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、表面の集団と接触され、ここで、その表面の集団は、表面の部分集団（例えば、ビーズの集団）を含み、表面の各部分集団は、ＮＰＰＦアンプリコン上のフランキング配列の少なくとも一部に相補的な少なくとも１つの核酸捕捉分子を含む。したがって、このおかげで、ＮＰＰＦによって標的化される配列に関係なく、表面上の捕捉分子に相補的な配列を有するすべてのＮＰＰＦの捕捉が可能になる。次いで、結合したＮＰＰＦアンプリコンは、検出され得る。いくつかの例において、この工程は、ＮＰＰＦアンプリコンを（例えば、プライマーを含む混合物から）精製するためまたは濃縮するために使用され、続いて、ＮＰＰＦアンプリコンは、例えば、リバースハイブリダイゼーション（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によって（例えば、温度を上昇させて、捕捉されたＮＰＰＦを融解除去することによるか、またはｐＨおよび温度を変化させることによって）表面から放出され得、そのＮＰＰＦアンプリコンが、解析され得る。

【0033】

別の例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、アンカーおよび二機能性リンカーを使用することによって、表面上に捕捉される。その表面は、複数の領域（各領域は、二機能性リンカーと会合した少なくとも１つのアンカーを含む）を含み得る。その二機能性リンカーは、アンカーに特異的に結合する第１の部分およびＮＰＰＦアンプリコンのうちの１つの少なくとも一部に特異的に結合するかまたはハイブリダイズする第２の部分を含む。ＮＰＰＦアンプリコンは、そのＮＰＰＦアンプリコンが二機能性リンカーの第２の部分に特異的に結合するのに十分な条件下において表面とともにインキュベートされるかまたは接触される。いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、表面の集団と接触され、ここで、その表面の集団は、表面の部分集団（例えば、ビーズの集団）を含み、表面の各部分集団は、二機能性リンカーと会合した少なくとも１つのアンカーを含む。次いで、結合したＮＰＰＦアンプリコンが、検出され得る。

【0034】

さらに、ＮＰＰＦアンプリコンは、検出可能な標識を含むことにより、その検出が可能になり得る。いくつかの例において、そのような標識は、増幅中に導入される。特定の例において、検出可能な標識は、ハプテン、蛍光分子、酵素または放射性同位体である。例えば、ＮＰＰＦアンプリコン上に存在するビオチンは、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼに結合体化されたアビジンまたはストレプトアビジンとＮＰＰＦアンプリコンを接触させることによって、検出され得る。

【0035】

ＩＩ．用語
別段述べられない限り、専門用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における通常の用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓから出版，２０００（ＩＳＢＮ ０１９８７９２７６Ｘ）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓから出版，１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．から出版，１９９５（ＩＳＢＮ ０４７１１８６３４１）；およびＧｅｏｒｇｅ Ｐ．Ｒｅｄｅｉ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３（ＩＳＢＮ：０−４７１−２６８２１−６）に見られ得る。

【0036】

以下の用語および方法の説明は、本開示をより良く説明するためおよび本開示を実施する当業者を導くために提供される。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを指示しない限り、１つまたは１つより多いことを指す。例えば、用語「細胞（ａ ｃｅｌｌ）を含む」は、単一または複数の細胞を含み、句「少なくとも１つの細胞を含む」と等価であると考えられる。用語「または」は、文脈が明らかに別のことを示していない限り、述べられている二者択一のエレメントまたは２つ以上のエレメントの組み合わせのうちの単一エレメントのことを指す。本明細書中で使用されるとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、追加のエレメントを排除することなく、「Ａ、ＢまたはＡおよびＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。

【0037】

本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、以下の特定の用語の説明が提供される：
３’末端：末端残基の３’にヌクレオチドが結合していない、核酸分子の末端。

【0038】

５’末端：末端残基の５’位がヌクレオチドと結合していない、核酸配列の末端。

【0039】

核酸分子を増幅する：核酸分子（例えば、ＮＰＰＦまたはその一部）のコピー数を増加させること。得られた生成物は、増幅産物またはアンプリコンと呼ばれる。インビトロ増幅の例は、サンプル（例えば、ＮＰＰＦを含むサンプル）をオリゴヌクレオチドプライマーの対と、それらのプライマーとサンプル中の核酸分子とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。それらのプライマーは、好適な条件下で伸長され、鋳型から解離され、次いで、再度アニールし、伸長され、解離されることにより、核酸分子のコピー数が増幅する。

【0040】

（核酸の）結合または安定的な結合：十分量の第１の核酸分子が、他方の核酸分子と塩基対を形成するかまたはハイブリダイズする場合、第１の核酸分子（例えば、ＮＰＰＦ）は、別の核酸分子（例えば、標的核酸分子）に結合するかまたは安定的に結合する（例えば、ＮＰＰＦとその相補的な標的核酸配列との結合）。

【0041】

結合は、物理的または機能的な特性によって検出され得る。核酸分子間の結合は、機能的結合アッセイ（例えば、発現および／または活性の減少）と物理的結合アッセイの両方を含む、当業者に公知の任意の手順によって検出され得る。

【0042】

相補的：核酸間で塩基対を形成する（ｆｒｏｍ）能力。オリゴヌクレオチドおよびそれらのアナログは、相補的な塩基間の水素結合（ワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合を含む）によってハイブリダイズする。一般に、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））である窒素塩基からなる。これらの窒素塩基は、ピリミジンとプリンとの間で水素結合を形成し、ピリミジンとプリンとの結合は、「塩基対形成」と称される。より詳細には、Ａは、ＴまたはＵと水素結合し、Ｇは、Ｃと結合する。「相補的」は、異なる核酸間または同じ核酸の２つの異なる領域間において生じる塩基対形成のことを指す。

【0043】

「特異的にハイブリダイズ可能」および「特異的に相補的」は、安定的かつ特異的な結合が、プローブ（例えば、ＮＰＰＦ）またはそのアナログと核酸標的（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的）との間に生じるような十分な程度の相補性を示す用語である。そのプローブまたはアナログは、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的配列に１００％相補的である必要はない。プローブまたはアナログは、特異的結合が望まれる条件下で、例えば、本明細書中に開示される方法において、プローブまたはアナログと非標的配列との非特異的結合が回避されるのに十分な程度の相補性が存在するとき、特異的にハイブリダイズ可能である。

【0044】

〜に十分な条件：所望の活性を可能にする、例えば、２つの核酸分子（例えば、ＮＰＰＦと標的核酸、ＮＰＰＦとＣＦＳまたはＮＰＰＦと二機能性リンカーとの）間の特異的結合またはハイブリダイゼーションを可能にするか、またはヌクレアーゼが未結合の核酸を除去する（または消化する）のを可能にする、任意の環境。

【0045】

接触：直接的な物理的会合の配置；固体と液体の両方の形態におけるものを含む。例えば、接触は、溶液中の核酸プローブ（例えば、ＮＰＰＦ）および生物学的サンプルを用いてインビトロにおいて生じ得る。

【0046】

検出：ある物質（例えば、シグナル、特定のヌクレオチド、アミノ酸、核酸分子および／または生物）が、存在するかまたは存在しないことを判定すること。いくつかの例において、これはさらに、定量も含み得る。例えば、開示される方法を使用することによって、サンプル中の標的核酸分子の検出が可能になる。

【0047】

検出可能な標識：その分子の検出を容易にする別の分子（例えば、核酸分子、例えば、ＮＰＰＦまたは増幅プライマー／プローブ）に直接または間接的に結合体化される化合物または組成物。標識の具体的な非限定的な例としては、蛍光および蛍光発生部分、色素生産性部分、ハプテン、親和性タグならびに放射性同位体が挙げられる。その標識は、直接検出可能（例えば、光学的に検出可能）であり得るか、または間接的に検出可能（例えば、さらに検出可能な１つ以上のさらなる分子との相互作用を介して）であり得る。本明細書中に開示されるプローブの文脈における例示的な標識は、下に記載される。核酸を標識するための方法および様々な目的にとって有用な標識の選択における指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３^ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８７および改訂版を含む）で述べられている。

【0048】

ハイブリダイゼーション：相補的な一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが二重鎖分子（ハイブリダイゼーション複合体とも称される）を形成する能力。核酸ハイブリダイゼーションの手法は、核酸プローブと、標的にするようにデザインされた遺伝子との間でハイブリダイゼーション複合体を形成するために使用され得る。

【0049】

「特異的にハイブリダイズ可能」および「特異的に相補的」は、安定的かつ特異的な結合が、第１の核酸分子（またはそのアナログ）と第２の核酸分子（例えば、核酸標的、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的）との間に生じるような、十分な相補性の程度を示す用語である。その第１および第２の核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるために１００％相補的である必要はない。特異的なハイブリダイゼーションは、本明細書中で「特異的結合」とも称される。

【0050】

特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション方法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化し得る。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（例えば、Ｎａ^＋濃度）は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。特定の程度のストリンジェンシーを達成するためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（ｃｈａｐｔｅｒ ９および１１）に述べられている。

【0051】

ヌクレアーゼ：ホスホジエステル結合を切断する酵素。エンドヌクレアーゼは、ヌクレオチド鎖の中の内部のホスホジエステル結合を切断する酵素である（ヌクレオチド鎖の末端におけるホスホジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼとは対照的に）。エンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼまたは他の部位特異的エンドヌクレアーゼ（配列特異的部位でＤＮＡを切断する）、ＤＮａｓｅ Ｉ、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ Ｕ２、ＲＮａｓｅ ＣＬＢ、小球菌ヌクレアーゼおよび脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼが含まれる。エキソヌクレアーゼには、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩが含まれる。特定の例において、ヌクレアーゼは、一本鎖核酸に特異的である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡまたはリボヌクレアーゼＴ１）。

【0052】

核酸：別段限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で核酸にハイブリダイズする、天然ヌクレオチドのアナログを含む、一本鎖または二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマー。用語「ヌクレオチド」は、糖（例えば、リボース、デオキシリボースまたはそれらの合成アナログ）に連結された塩基（例えば、ピリミジン、プリンまたはそれらの合成アナログ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）におけるようなアミノ酸に連結された塩基を含むモノマーを含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中の１つのモノマーである。ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドにおける塩基の配列のことを指す。

【0053】

標的核酸（例えば、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、その検出、量または配列を測定すること（例えば、定量的または定性的な様式で）が意図されている核酸分子である。１つの例において、標的は、目的の核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡの規定の領域または特定の部分である。標的核酸配列が標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡである例において、そのような標的は、その特定の配列もしくは機能によって；その遺伝子もしくはタンパク質の名称によって；または他の核酸の中からそれをユニークに識別する他の任意の手段によって、定義され得る。

【0054】

いくつかの例において、標的核酸配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の変化は、疾患または状態「に伴う」。つまり、標的核酸配列の検出は、疾患または状態に関してサンプルの状態を推測するために使用され得る。例えば、標的核酸配列は、第１の形態が、疾患または状態が存在しないことに相関し、第２の（または異なる）形態が、疾患または状態が存在することに相関するような、２つ（またはそれ以上）の区別可能な形態で存在し得る。その２つの異なる形態は、ヌクレオチド多型もしくは変異などによって定性的に区別可能であり得、かつ／またはその２つの異なる形態は、サンプル中に存在する標的核酸配列のコピー数などによって定量的に区別可能であり得る。

【0055】

ヌクレオチド：核酸分子の基本単位。ヌクレオチドは、糖部分にエステル結合によって付着された１つ、２つまたは３つのリン酸基を有するペントース単糖に付着された窒素含有塩基を含む。

【0056】

ＤＮＡの主要なヌクレオチドは、デオキシアデノシン５’−三リン酸（ｄＡＴＰまたはＡ）、デオキシグアノシン５’−三リン酸（ｄＧＴＰまたはＧ）、デオキシシチジン５’−三リン酸（ｄＣＴＰまたはＣ）およびデオキシチミジン５’−三リン酸（ｄＴＴＰまたはＴ）である。ＲＮＡの主要なヌクレオチドは、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰまたはＡ）、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰまたはＧ）、シチジン５’−三リン酸（ＣＴＰまたはＣ）およびウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰまたはＵ）である。

【0057】

ヌクレオチドには、例えば、Ｎａｚａｒｅｎｋｏらに対する米国特許第５，８６６，３３６号（参考として本明細書中に援用される）に記載されているような、改変された塩基、改変された糖部分および改変されたリン酸骨格を含むヌクレオチドが含まれる。ロックト（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）に見られるような他の改変を含むヌクレオチドを含む。したがって、本明細書中に開示されるＮＰＰＦ、プライマー、ＣＦＳ、二機能性リンカーおよびアンカーは、天然塩基および非天然塩基を含み得る。

【0058】

その構造上の任意の位置のヌクレオチドを改変するために使用され得る改変された塩基部分の例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ〜６−イソペンテニルアデニン（ｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｉｎｅ）、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、メトキシアミノメチル（ｍｅｔｈｏｘｙａｒｎｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−Ｓ−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシルおよび２，６−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0059】

その構造上の任意の位置のヌクレオチドを改変するために使用され得る改変された糖部分の例としては、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシロースおよびヘキソースまたはリン酸骨格の改変された構成要素（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルもしくはホルムアセタールまたはそれらのアナログ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0060】

プライマー：いくつかの例において、より長い核酸配列の合成を開始するために使用される、９ヌクレオチド長またはそれ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドなどの短い核酸分子。より長いプライマーは、約１０、１２、１５、２０、２５、３０または５０ヌクレオチド長またはそれ以上であり得る。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な核酸鎖にアニールしてプライマーと相補鎖とのハイブリッドを形成し得、次いで、そのプライマーは、ポリメラーゼ酵素によってその相補鎖に沿って伸長する。例えば、ＰＣＲまたは他の核酸増幅方法による、核酸配列の増幅のためのプライマー対が使用され得る。

【0061】

１つの例において、プライマーは、標識を含み、それは、プローブと称され得る。

【0062】

プローブ：標的核酸分子（例えば、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ）とハイブリダイズすることができ、かつその標的にハイブリダイズしたとき、直接または間接的に検出されることが可能である、核酸分子。したがって、プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの標的核酸分子の検出、およびいくつかの例では、定量を可能にする。いくつかの例において、プローブは、検出可能な標識を含む。

【0063】

ヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）：標的ＤＮＡまたはＲＮＡに相補的な配列を有し、かつその標的ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズすることができる、核酸分子。ＮＰＰは、相補的な標的ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸分子を、ヌクレアーゼ（例えば、一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼ）による切断から保護する。フランキング配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）は、５’末端、３’末端またはその両方に１つ以上のフランキング配列をさらに含むＮＰＰであり、ここで、そのフランキング配列は、サンプル中に存在する核酸分子に見られない、かつ増幅プライマーに対する付着点として使用され得る普遍的な増幅配列点を提供し得る、連続したヌクレオチドの配列を含む。１つの例において、フランキング配列は、ＮＰＰＦを基材に捕捉するために使用され、ここで、その基材上の核酸捕捉配列とフランキング配列の少なくとも一部とが互いに相補的であることによって、その基材上へのＮＰＰＦの捕捉が可能になる。

【0064】

サンプル：被験体（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物の被験体）から得られる、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む）、タンパク質またはそれらの組み合わせを含む生物学的検体。例としては、細胞、細胞溶解産物、染色体調製物、末梢血またはその画分、尿、唾液、組織生検材料（例えば、腫瘍生検材料またはリンパ節生検材料）、外科検体、骨髄、羊水穿刺サンプル、細針吸引材料、循環腫瘍細胞および剖検材料が挙げられるが、これらに限定されない。１つの例において、サンプルには、ＲＮＡまたはＤＮＡが含まれる。特定の例において、サンプルは、直接使用されるか（例えば、新鮮または凍結）、または例えば、固定（例えば、ホルマリンを使用する固定）および／もしくはワックスに包埋すること（例えば、ＦＦＰＥ組織サンプル）によって、使用前に操作され得る。

【0065】

配列同一性／類似性：２つ以上の核酸配列間または２つ以上のアミノ酸配列間の同一性／類似性は、それらの配列間の同一性または類似性に関して表現される。配列同一性は、パーセンテージ同一性に関して測定され得る；そのパーセンテージが高いほど、それらの配列はより同一である。

【0066】

比較するために配列をアラインメントする方法は、当該分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７−４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．５：１５１−３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８，１５５−６５，１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７−３１，１９９４に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０は、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な考慮すべき事項を提示している。

【0067】

ＮＣＢＩベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３８Ａ，Ｒｏｏｍ ８Ｎ８０５，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４）を含むいくつかの供給源から、インターネット上で入手可能である。Ｂｌａｓｔｎは、核酸配列を比較するために使用され、ｂｌａｓｔｐは、アミノ酸配列を比較するために使用される。さらなる情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトに見られ得る。

【0068】

いったんアラインメントされると、両方の配列に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在する位置の数を数えることによって、マッチ数が測定される。パーセント配列同一性は、そのマッチ数を、同定された配列に示される配列の長さまたは明確に区切られた長さ（例えば、同定される配列に示される配列からの１００個の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基）で除した後、得られた値に１００を乗じることによって決定される。

【0069】

２つの核酸分子が密接な関係があるという１つの示唆は、その２つの分子がストリンジェントな条件下において互いにハイブリダイズすることである。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、種々の環境パラメータによって異なる。配列に対して変更が行われ得ること、およびプローブが所望のとおり機能する能力にその変更が実質的に影響しないことを当業者が認識するように、本明細書中に開示される核酸プローブは、示される正確な配列に限定されない。例えば、開示されるプローブに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％、例えば、１００％の配列同一性を有する配列が、本明細書中に提供される（例えば、配列番号１〜１６）。当業者は、これらの配列同一性の範囲が、指針のためだけに提供されること；これらの範囲に入らないプローブも使用することができることを認識するだろう。

【0070】

配列決定：枝分かれしていない生体高分子の１次構造（または１次配列）を決定すること。配列決定によって、配列決定される分子、例えば、ポリヌクレオチドの原子レベルの構造の多くを簡潔に要約する配列として公知の、符号による線形の記述がもたらされる。その分子が、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）であるとき、配列決定は、ヌクレオチドレベルでその分子に関する情報を得るために使用され得、次いで、その情報は、その分子自体および／またはそれによってコードされるポリペプチドについての様々な二次情報を解読する際に使用され得る。ＤＮＡの配列決定は、所与のＤＮＡ分子のヌクレオチドの順序を決定するプロセスであり、ＲＮＡの配列決定は、所与のＲＮＡ分子のヌクレオチドの順序を決定するプロセスである。いくつかの例において、核酸分子の配列決定は、間接的に、例えば、標的核酸分子に結合した、フランキング配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）の少なくとも一部の配列を決定することによって、行われる。

【0071】

同時：同じ時点もしくは実質的に同じ時点において生じること、および／または同じサンプルもしくは同じ反応において生じること（例えば、同時発生）。いくつかの例において、事象は、互いの１マイクロ秒〜１２０秒以内（例えば、０．５〜１２０秒以内、１〜６０秒以内または１〜３０秒以内または１〜１０秒以内）に生じる。

【0072】

被験体：ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、獣医学の被験体）などの任意の多細胞脊椎動物。１つの例において、被験体は、腫瘍または感染を有すると判明しているかまたは疑われている。

【0073】

表面（または基材）：不溶性であるか、またはその後の反応によって不溶性にされ得る、任意の固体の支持体または材料。数多くの様々な固体支持体が、当業者に公知であり、それらとしては、ニトロセルロース、反応トレイのウェルの壁、マルチウェルプレート、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、膜および微小粒子（例えば、ラテックス粒子）が挙げられるがこれらに限定されない。検出試薬が到達可能であるのに十分な多孔度および捕捉試薬（例えば、オリゴヌクレオチド）を固定化するのに適した表面親和性を有する任意の好適な多孔性材料も、この用語によって企図される。例えば、ニトロセルロースの多孔性構造は、多種多様の試薬、例えば、捕捉試薬に対して優れた吸収および吸着の品質を有する。ナイロンは、同様の特徴を有し、好適でもある。微孔性構造が有用であり、水和状態においてゲル構造を有する材料も同様に有用である。

【0074】

有用な固体支持体のさらなる例としては、天然の高分子炭水化物およびそれらの合成的に改変された、架橋されたまたは置換された誘導体（例えば、寒天、アガロース、架橋されたアルギン酸、置換されたおよび架橋されたグアーゴム、セルロースエステル、特に、硝酸およびカルボン酸を有するもの、混合されたセルロースエステルおよびセルロースエーテル；窒素を含む天然のポリマー（例えば、タンパク質、および架橋されたまたは改変されたゼラチンを含む誘導体）；天然の炭化水素ポリマー（例えば、ラテックスおよびゴム）；好適に多孔性の構造で調製され得る合成ポリマー（例えば、ビニルポリマー）（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルおよびその部分的に加水分解された誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、上記の重縮合体（ｐｏｌｙｃｏｎｄｅｎｓａｔｅｓ）の共重合体およびターポリマー、例えば、ポリエステル、ポリアミドおよび他のポリマー（例えば、ポリウレタンまたはポリエポキシド）を含む）；多孔性無機材料（例えば、アルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩または炭酸塩（硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルカリ金属およびアルカリ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムのケイ酸塩を含む）；およびアルミニウムまたは酸化ケイ素または水和物（例えば、粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲルまたはガラス（これらの材料は、上記多量体材料とともにフィルターとして使用され得る））；および上記のクラスの混合物または共重合体（例えば、既存の天然ポリマーに対する合成ポリマーの重合を開始する（ｉｎｉｔｉａｌｉｚｉｎｇ）ことによって得られるグラフト共重合体）が挙げられる。

【0075】

本明細書中で述べられる刊行物、特許出願、特許および他の参考文献のすべてが、すべての目的のためにそれらの全体が参考として援用される。本明細書中で述べられるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を伴うすべての配列が、適用可能な規則および／または法律によって容認できる程度まで、２０１１年１２月１５日に提出されたものとして、それらの全体が参考として援用される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が、支配するものとする。

【0076】

本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料が、開示される技術を実施するためまたは試験するために使用され得るが、好適な方法および材料が、下に記載される。それらの材料、方法および例は、単に例証的であって、限定することを目的としていない。

【0077】

ＩＩＩ．核酸分子を検出するかまたは配列決定する方法
サンプル中に存在する核酸分子を検出するおよび／または配列決定する方法が、本明細書中に開示される。いくつかの例において、少なくとも２つの異なる核酸分子が、同じサンプルまたは同じアッセイ（例えば、アッセイプレートまたはアレイの同じウェル）において検出される。いくつかの例において、同じ核酸分子が、少なくとも２つの異なるサンプルまたはアッセイ（例えば、異なる患者由来のサンプル）において検出される。

【0078】

開示される方法は、例えば、国際特許公報ＷＯ９９／０３２６６３；ＷＯ００／０３７６８３；ＷＯ００／０３７６８４；ＷＯ００／０７９００８；ＷＯ０３／００２７５０；およびＷＯ０８／１２１９２７；ならびに米国特許第６，２３２，０６６号、同第６，２３８，８６９号；同第６，４５８，５３３号；および同第７，６５９，０６３号（これらのすべての全体が参照により援用される）に記載されているような定量的ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ｑＮＰＡ）に対する改善を提供する。Ｍａｒｔｅｌら、Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．２００２，１（１−１）：６１−７１；Ｍａｒｔｅｌら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ ａｎｄ Ｉｍａｇｉｎｇ，２００２，３：３５−４３；Ｍａｒｔｅｌら、Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｑ．Ｌｕ ａｎｄ Ｍ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ（２００２）；Ｓｅｌｉｇｍａｎｎ ＰｈａｒｍａｃｏＧｅｎｏｍｉｃｓ，２００３，３：３６−４３；“Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”の中のＭａｒｔｅｌら、“Ａｒｒａｙ Ｆｏｒｍａｔｓ”Ｕ．Ｒ．Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｄ．Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｅｄｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２００５）；Ｓａｗａｄａら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，２０：１５０６−１５１３，２００６；Ｂａｋｉｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，１７：３４７３−３４７９，２００７；Ｋｒｉｓら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４４：１２５６−１２６６，２００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，８７：９７９−９９７，２００７；Ｒｉｍｓｚａら、Ｂｌｏｏｄ，２００８ Ｏｃｔ １５，１１２（８）：３４２５−３４３３；Ｐｅｃｈｈｏｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７：１０３８−１０４２，２００９もまた参照のこと。例えば、開示されるｑＮＰＡ法は、以前のｑＮＰＡ法と比べて高い感度（例えば、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１２５倍、少なくとも１５０倍、少なくとも１７０倍または少なくとも２００倍の検出可能なシグナルの増強）を有する。つまり、少なくとも１０倍または２００倍もの少ないサンプルしか必要でないか、または逆に、現在利用可能な方法の感度より１０倍低いかまたはその感度よりも最大２０倍も低い稀な遺伝子が、開示される方法を用いて検出可能である。その結果として、開示される方法を用いて、非常に少量のＦＦＰＥを提供する細針吸引材料または循環腫瘍細胞（１０、５０または１００個の細胞しか患者から取り出されない場合）などのサンプルタイプを試験することができ、稀な遺伝子を検出することができる。

【0079】

さらに、開示される方法は、例えば、米国特許公開番号ＵＳ−２０１１−０１０４６９３に記載されているような、定量的ヌクレアーゼプロテクション配列決定（ｑＮＰＳ）法に対する改善を提供する。ｑＮＰＳは、ｑＮＰＡを使用してサンプル中に存在する標的核酸分子（架橋されているときでさえ）を安定的な一本鎖核酸標的（ヌクレアーゼ保護プローブ，ＮＰＰ）に変換する配列決定方法であり、その一本鎖核酸標的は、ヌクレアーゼ保護工程を使用すること、ならびに（必要に応じて）塩基による処理によって、保護している標的分子からヌクレアーゼ保護プローブを解離させ、ＲＮＡの場合はＲＮＡ標的を加水分解することによって、捕捉または分離なしに溶液中に回収され得る。次いで、ヌクレアーゼ加水分解の後に残っているＮＰＰの量が、それらのプローブ自体の配列決定を含み得る配列決定によって測定される。本明細書中に開示される改善された方法は、フランキング配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）であるＮＰＰのバリエーションを使用する。そのプローブ上のフランキング配列のおかげで、増幅用の普遍的なプライマー結合部位がもたらされるので、ＮＰＰＦの使用によって、多重化ならびに検出されるかまたは配列決定される標的核酸分子の化学量論の保存が可能になる。そのプライマー結合部位は、普遍的であるので、任意の標的配列に対する任意のＮＰＰＦを増幅するために同じプライマーを使用することができ、ゆえに、多重化および化学量論の保存が可能になる。１つの例において、ＮＰＰＦの両端におけるフランキング配列からの増幅は、以前のｑＮＰＡ法およびｑＮＰＳ法よりも高い予想外の特異性を提供する。インタクトな３’および５’フランキング配列を有するＮＰＰＦは、指数関数的に増幅される；ヌクレアーゼによって切断されたＮＰＰＦは、配列決定されるかまたは検出されるのに十分には増幅されない。対照的に、以前のｑＮＰＡ法を用いて処理されたＮＰＰは、不正確な標的核酸との不十分または不正確なハイブリダイゼーションに起因して、アレイ上への捕捉に関わる配列の末端もしくはアレイ上での検出に関わる配列の末端、またはその両方において部分的切断され得、さらになおも捕捉され得、検出され得ることにより、正確な標的核酸に対する特異性が失われる。これは、開示されるＮＰＰＦプローブを用いたときには生じない。開示される方法は、検出されるかまたは配列決定される核酸分子が、試験サンプル中と同じ相対量の核酸分子を保持するように元の核酸分子の化学量論を保存する（例えば、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下または０．１％以下（例えば、０．００１％〜５％、０．０１％〜５％、０．１％〜５％または０．１％〜１％）のバリエーション）。

【0080】

開示される方法は、実験の多重化（例えば、同じアッセイ内での複数の反応（例えば、同じ反応ウェル内での異なる患者由来の複数のサンプル）および配列分析装置の同じラン／チャネル内で解析される複数の反応）も可能にする。

【0081】

詳細には、以前のｑＮＰＡ法およびｑＮＰＳ法とは対照的に、開示される方法は、改変された核酸保護プローブ（ＮＰＰ）（これは、そのＮＰＰの一方または両方の末端にフランキング配列を含む）を使用する。５’末端および／または３’末端フランキング配列を有するこれらの改変されたＮＰＰは、本明細書中で、フランキング配列を有する核酸保護プローブ（ＮＰＰＦ）と称される。そのフランキング配列は、ＮＰＰＦの一部であるので、ハイブリダイゼーション用および／または増幅用の普遍的なプライマー点として役立つ（かつＮＰＰＦの捕捉またはタグ化を含む他の目的のために使用され得る）一方または両方のフランキング配列が存在することによって、サンプル中の元の核酸の化学量論が保存される。さらに、これは、プライミング部位、タグなどをＮＰＰＦに付加するライゲーション（サンプル中の核酸の化学量論を歪め、ばらつきのさらなる供給源を提供する、人工産物を組み込み得る）の必要性を排除する。ライゲーションの必要性の排除は、化学量論を歪めかつ再現性を低下させる潜在的な人工産物を排除する。

【0082】

図１は、例示的なＮＰＰＦを示している模式図である。少なくとも１つのフランキング配列を有するヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）１００は、標的核酸配列に特異的に結合する（および二機能性リンカーにも特異的に結合し得る）配列を含む領域１０２を含む。その標的核酸配列は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）もしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）またはその両方であり得る。ＮＰＰＦは、１つ以上のフランキング配列１０４および１０６を含む。図１は、５’−フランキング配列１０４と３’−フランキング配列１０６の両方を有するＮＰＰＦ１００を示している。しかしながら、ＮＰＰＦは、いくつかの例において、ただ１つのフランキング配列しか有しない場合がある。

【0083】

図２は、開示される方法を用いて核酸分子を検出するためまたは配列決定するためにＮＰＰＦを使用する例示的な方法の最初の工程を示している模式図である。工程１に示されるように、サンプル破壊緩衝液で処理された（例えば、溶解されたか、または核酸を利用できるように別途処理された）サンプル（例えば、標的核酸を含むと判明しているかまたは疑われるサンプル，２００）を、第１の標的核酸（例えば、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ）に特異的に結合する少なくとも１つのＮＰＰＦを含む、１つ以上のフランキング配列を有する複数のヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）２０２と接触させるかまたはインキュベートする。この反応物は、第２の標的核酸などに特異的に結合する他のＮＰＰＦも含み得る。例えば、この方法は、ユニークな各標的核酸分子に特異的であるようにデザインされた１つ以上の異なるＮＰＰＦを使用し得る。したがって、１００個の遺伝子の測定には、少なくとも１００個の異なるＮＰＰＦの使用が必要である（ここで、１遺伝子あたり少なくとも１つのＮＰＰＦが特異的である（例えば、いくつかの異なるＮＰＰＦ／遺伝子））。したがって、例えば、この方法は、少なくとも２つの異なるＮＰＰＦ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０個、少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個またはなおも少なくとも２００個の異なるＮＰＰＦ（例えば、２〜５００個、２〜１００個、５〜１０個、２〜１０個または２〜２０個の異なるＮＰＰＦ）を使用し得る。しかしながら、いくつかの例において、複数のＮＰＰＦが、単一の標的核酸分子に特異的な２つ以上の（例えば、２、３、４、５、１０、２０、５０個またはそれ以上の）ＮＰＰＦを含み得ることが認識されるだろう。図２における破線バーは、第１の標的に特異的なＮＰＰＦを表しており、灰色の実線バーは、第２の標的に特異的なＮＰＰＦを表している。いくつかの例において、ＮＰＰＦは、ビオチン（Ｂ）などの検出可能な標識を含むが、当業者は、増幅中などの他の工程において標識が付加され得ることを認識するだろう。したがって、図２に示されるビオチンは、任意であり、他の標識を使用することができる。この反応は、ＮＰＰＦ２０２のフランキング配列に特異的な、フランキング配列に相補的な核酸分子（ＣＦＳ）２０４も含む。図２は、ＮＰＰのフランキング配列に特異的なＣＦＳとして、緑色の点線バー２０４を示している。当業者は、そのＣＦＳの配列が、存在するフランキング配列に応じて変化し得ることを認識するだろう。さらに、フランキング領域が保護されるのを確実にするために、２つ以上のＣＦＳが使用され得る（例えば、単一のフランキング配列の異なる領域に結合する少なくとも２つのＣＦＳが使用され得る）。そのＣＦＳは、天然または非天然塩基を含み得る。図２は、ＮＰＰＦの両端にフランキング配列を有するＮＰＰＦを示しているが；当業者は、単一のフランキング配列を使用することができることを認識するだろう。サンプル、ＮＰＰＦおよびＣＦＳを、ＮＰＰＦがそれらのそれぞれの標的核酸分子に特異的に結合するのに十分かつＣＦＳがＮＰＰＦフランキング配列上のその相補的な配列に結合するのに十分な条件下において、インキュベートする。いくつかの例において、ＣＦＳ２０４は、ＮＰＰＦ２０２より過剰に加えられる（例えば、ＮＰＰＦよりも少なくとも５倍多いＣＦＳ（過剰モル濃度）、例えば、ＮＰＰＦよりも少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍多いＣＦＳ）。いくつかの例において、ＮＰＰＦ２０２は、サンプル中の全核酸分子より過剰に加えられる（例えば、サンプル中の全核酸分子よりも少なくとも５０倍多いＮＰＰＦ（過剰モル濃度）、例えば、サンプル中の全核酸分子よりも少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍または少なくとも１０００倍多いＮＰＰＦ）。実験の便宜上、測定される最も豊富な核酸標的について、その核酸標的に対して少なくとも５０倍多い（例えば、少なくとも１００倍過剰の）ＮＰＰＦが存在し得るように、同様の濃度の各ＮＰＰＦが含められることにより、カクテルが調製され得る。使用されるすべてのＮＰＰＦの実際の過剰量および総量は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）が、標的核酸標的にハイブリダイズしないすべてのＮＰＰＦを破壊する能力によってのみ限定される。いくつかの例において、その反応物は、加熱される（例えば、５０℃で一晩インキュベートされる）。

【0084】

図２の工程２に示されるように、結合／ハイブリダイゼーション反応を生じさせた後、一本鎖（ｓｓ）核酸分子に特異的なヌクレアーゼとサンプルを、ｓｓ核酸分子（例えば、未結合の核酸分子（例えば、未結合のＮＰＰＦ、ＣＦＳおよび標的核酸分子または一本鎖のままのそのような分子の一部））を除去する（または消化する）のに十分な条件下において接触させる。図２に示されるように、ｓｓ核酸分子に特異的なヌクレアーゼとサンプルのインキュベーションによって、任意のｓｓ核酸分子が分解され、結合したＮＰＰＦならびにＣＦＳおよび標的核酸分子を含むインタクトな二本鎖核酸分子が残る。例えば、その反応物は、５０℃で１．５時間、Ｓ１ヌクレアーゼとインキュベートされ得る（加水分解は、他の温度でも生じ得、他の時間にわたって行われ得るが、必要とされる時間および温度は、部分的に、ヌクレアーゼの量および加水分解されるのに必要とされる核酸の量、ならびに保護されている二本鎖領域のＴｍに応じ得る）。

【0085】

この反応の後、サンプルは必要に応じて、ハイブリダイズしていない材料を別途除去するかもしくは分離するために、および／または残留酵素を不活性化するかもしくは除去するために（例えば、加熱、フェノール抽出、沈殿、カラム濾過などによって）、処理され得る。例えば、工程３に示されるように、その反応物のｐＨを上げることによって、ヌクレアーゼが不活性化され得、その反応物を加熱することによって、ヌクレアーゼが破壊され得る。さらに、反応物の加熱は、標的核酸（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡ）およびＣＦＳをＮＰＰＦ上の相補的な領域から解離させ得る。これにより、事前に標的核酸分子およびＣＦＳに結合していたインタクトなＮＰＰＦが残る（ここで、そのインタクトなＮＰＰＦは、どれだけのＮＰＰＦが標的にハイブリダイズしていたかに正比例する）。いくつかの例において、ハイブリダイズした標的核酸およびＣＦＳは、例えば、ヌクレアーゼまたは化学的処理によって、分解され得る。あるいは、サンプルは、標的核酸分子の（一本鎖の）ハイブリダイズされる部分、またはＮＰＰＦに対してハイブリダイズした標的核酸分子およびＣＰＳによって形成される二重鎖が残るように処理されることにより、さらに解析され得る（例えば、ＮＰＰＦにハイブリダイズした標的が、配列決定され得る）。１つの例において、ｐＨを約ｐＨ８に上げ、その反応物を、９５℃で１０分間インキュベートし、標的核酸およびＣＦＳが解離する（および標的核酸がＲＮＡである場合、前記標的核酸は加水分解される）。

【0086】

図２の工程４に示されるように、工程２または工程３の後、ＮＰＰＦは、例えば、ＰＣＲを使用して、増幅される。図２は、ＰＣＲプライマーまたはプローブ２０８を矢印として示している。それらのＰＣＲプライマーまたはプローブは、ビオチンなどの標識を含み得、それによって、標識されたアンプリコンが生成される。そのＰＣＲプライマー／プローブ２０８の少なくとも一部は、ＮＰＰＦ２０２のフランキング配列に特異的である。次いで、得られたアンプリコン２１０は、例えば、アレイに結合することによって（図３を参照のこと）または配列決定されることによって（図４を参照のこと）検出され得る。いくつかの例において、プライマー２０８の濃度は、ＣＰＳ２０４より過剰であり、例えば、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも１５０，０００倍、少なくとも２００，０００倍または少なくとも４００，０００倍過剰である。いくつかの例において、その反応物中のプライマー２０８の濃度は、少なくとも２００ｎＭ（例えば、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭまたは少なくとも１０００ｎＭ）であり、その反応物中のＣＰＳ２０４の濃度は、１ｐＭ未満、０．５ｐＭ未満、または０．１ｐＭ未満である。

【0087】

図３の工程５に示されるように、増幅されたＮＰＰＦであるアンプリコン２１０を、複数の空間的に不連続の領域を含む表面２１２と接触させ得る。２つの異なるバージョンが示されている。１つの例（上）において、その表面は、二機能性リンカー２１６と会合した少なくとも１つのアンカー２１４を含む。いくつかの例において、アンプリコン２１０は、表面２１２との接触の前に２×緩衝液に加えられる。二機能性リンカー２１６は、アンカーに特異的に結合する第１の部分および複数のＮＰＰＦアンプリコン２１０のうちの１つに特異的に結合する第２の部分を含む。アンプリコン２１０を表面２１２とともに、複数のＮＰＰＦアンプリコン２１０の各々が二機能性リンカー２１６の第２の部分に特異的に結合するのに十分な条件下においてインキュベートする。図１に示されるように、二機能性リンカーに特異的に結合するＮＰＰＦの領域１０２は、配列として二機能性リンカーに相補的である（かつ標的核酸配列にも相補的である）。二機能性リンカー２１６の第２の部分に結合したＮＰＰＦアンプリコン２１０は、ＮＰＰＦアンプリコン２１０に含められた検出可能な標識を使用して検出され、それにより、サンプル中の標的核酸が検出される。

【0088】

他の例（下）において、表面は、共有結合によってその表面に直接付着され得る少なくとも１つの核酸捕捉分子２２０を含む。いくつかの例において、アンプリコン２１０は、表面２１２との接触の前に２×緩衝液に加えられる。核酸捕捉分子２２０は、複数のＮＰＰＦアンプリコン２１０のうちの１つの少なくとも（ａ ｌｅａｓｔ）一部（例えば、ＮＰＰＦのフランキング配列領域の少なくとも一部（または、例えば、増幅中にフランキング配列に付加される領域））に相補的な配列を含む。アンプリコン２１０を表面２１２とともに、複数のＮＰＰＦアンプリコン２１０の各々が核酸捕捉分子２２０に特異的に結合するのに十分な条件下においてインキュベートする。

【0089】

核酸捕捉分子２２０に結合したＮＰＰＦアンプリコン２１０は、ＮＰＰＦアンプリコン２１０に含められた検出可能な標識を使用して検出され、それによって、サンプル中の標的核酸が検出される。例えば、ＮＰＰＦアンプリコンは、５０℃で一晩、表面とともにインキュベートされることにより、ＮＰＰＦアンプリコンと核酸捕捉分子２２０との結合が可能になり得る。１つの例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、ビオチンで標識される。図３の工程６に示されるように、そのビオチンは、アビジン−ＨＲＰ２１８を使用して（例えば、３７℃で１時間、アビジン−ＨＲＰとともにインキュベートして）検出され得る。図３の工程７に示されるように、過剰の未結合のアビジン−ＨＲＰ２１８を除去し、適切な基質を加え、表面を撮像することにより、結合したＮＰＰＦが検出される。ビオチンが例として示されているが、当業者は、例えば、ＮＰＰＦアンプリコン上のフルオロフォアまたは抗体を検出することによる、他の検出方法を使用することができることを認識するだろう。

【0090】

いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコン２１０が、標識されない場合（例えば、図２の工程４において標識が増幅中に加えられない場合）、ＮＰＰＦアンプリコン２１０は、標識されたプローブの配列に相補的な領域（例えば、フランキング配列またはその一部）を含み得る（ここで、この領域は、二機能性リンカー２１６に相補的でない）。次いで、この相補的なプローブは、図３の工程５に示されるようにそれらを基材に付着する前に、ＮＰＰＦアンプリコン２１０にハイブリダイズされ得る。

【0091】

いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコンを、複数の表面（例えば、ビーズまたは他の粒子の集団）と接触させる。１つの例において、各表面（例えば、混合されたビーズ集団内の各ビーズまたはビーズの部分集団）は、複数のＮＰＰＦアンプリコンの各々が二機能性リンカーの第２の部分に特異的に結合するのに十分な条件下において、アンカーに特異的に結合する第１の部分および複数のＮＰＰＦアンプリコンのうちの１つに特異的に結合する第２の部分を含む二機能性リンカーと会合した少なくとも１つのアンカーを含む。二機能性リンカーの第２の部分に結合したＮＰＰＦアンプリコンは、ＮＰＰＦアンプリコンと会合している検出可能な標識を使用して検出され、それにより、サンプル中の標的核酸分子が検出され得る。別の例において、各表面（例えば、混合されたビーズ集団内の各ビーズまたはビーズの部分集団）は、複数のＮＰＰＦアンプリコンの各々が核酸捕捉分子に特異的に結合するのに十分な条件下において、ＮＰＰＦアンプリコンの少なくとも（ａ ｌｅａｓｔ）一部（例えば、フランキング配列またはその一部）に相補的な配列を有する少なくとも１つの核酸捕捉分子を含む。その核酸捕捉分子に結合したＮＰＰＦアンプリコンは、ＮＰＰＦアンプリコンと会合している検出可能な標識を使用して検出され、それにより、サンプル中の標的核酸分子が検出され得る。

【0092】

図４の工程５に示されるように、増幅されたＮＰＰＦであるアンプリコン２１０は、配列決定され得る。例えば、増幅されたＮＰＰＦのフランキング配列の一方または両方が、配列アダプターを含み得る（またはそれに付加されている）か、またはフランキング配列に相補的かつそれにハイブリダイズするプライマーが、配列決定チップ上の捕捉配列に相補的な配列アダプター配列を含み得、特定のシーケンシングプラットフォームを使用してＮＰＰＦの配列決定を可能にする。いくつかの例において、複数のＮＰＰＦが、並行して、例えば、同時または同時発生的に、配列決定される。したがって、この方法は、複数のＮＰＰＦ配列を配列決定するために使用され得る。

【0093】

図５Ａおよび５Ｂは、上記方法のさらなる要旨を、核酸分子をより詳細にして、提供している模式図である。図５Ａの左のパネルに示されるように、サンプル（例えば、サンプル破壊緩衝液で処理されたサンプル）中の標的核酸４００を、１つ以上のフランキング配列を有する複数のヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）４０２（ここで、各ＮＰＰＦは、特定の標的核酸４００に特異的である）、およびＮＰＰＦの末端のフランキング配列４０４に特異的な、フランキング配列に相補的な核酸分子（ＣＦＳ）４０６と、接触させるかまたはインキュベートする。３つの異なる標的核酸４００が示されている：１コピーの標的１（緑色）、２コピーの標的２（赤色）および３コピーの標的３（青色）。この例は、等量の各ＮＰＰＦ４０２が加えられていることを示している。図５Ａは、ＮＰＰの両端にフランキング配列を有するＮＰＰＦを示しているが；当業者は、単一のフランキング配列を使用することができることを認識するだろう。図５Ａの中央のパネルは、標的核酸４００とＮＰＰＦ４０２とＣＦＳ４０６との間に結合／ハイブリダイゼーション反応を生じさせた後の反応産物を示している。標的核酸４００は、ＮＰＰＦの中央の領域にハイブリダイズし、ＣＦＳ４０６は、３’−および５’−フランキング配列４０４にハイブリダイズする。図５Ａの右のパネルは、一本鎖（ｓｓ）核酸分子に特異的なヌクレアーゼとサンプルを、ｓｓ核酸分子を除去する（または消化する）のに十分な条件下において接触させた後の反応産物を示している。示されているように、ＮＰＰＦにハイブリダイズしなかった標的核酸の領域４０８は消化され、同様に、標的核酸またはＣＦＳに結合しなかったＮＰＰＦ（例えば、４１０）のｓｓ領域も消化される。これにより、結合したＮＰＰＦならびにＣＦＳおよび標的核酸分子を含むインタクトな二本鎖核酸分子（例えば、４１２）、ならびに標的のみにハイブリダイズした（がＣＦＳにはハイブリダイズしなかった）ＮＰＰＦまたはＣＦＳのみにハイブリダイズした（が標的にはハイブリダイズしなかった）ＮＰＰＦの領域（例えば、４１４）が残る。

【0094】

図５Ｂの左のパネルは、二本鎖核酸分子を分離した（例えば、加熱を用いて、およびｐＨを上昇させて）後の反応産物を示している。次いで、乗り越え得られたＮＰＰＦ（これらは、ヌクレアーゼ工程中に保護した標的核酸分子に正比例する）が、増幅され得る。図５Ｂの中央のパネルは、増幅された後の反応産物を示している。図５Ｂの右のパネルは、増幅後、得られたＮＰＰＦアンプリコンが検出され得るかまたは配列決定され得ることを示している（例えば、図２〜４を参照のこと）。

【0095】

いくつかの実施形態において、本方法は、第１の標的（例えば、第１のＲＮＡ）に特異的に結合する少なくとも１つのＮＰＰＦ、および必要に応じて、第２の標的（例えば、第２のＲＮＡ）に特異的に結合する少なくとも１つのＮＰＰＦを含む複数のＮＰＰＦと、被験体由来のサンプル（例えば、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプル）を接触させる工程を包含し得る。いくつかの例において、その複数のＮＰＰＦは、単一の標的核酸分子に特異的な２つ以上の（例えば、２、３、４、５個またはそれ以上の）ＮＰＰＦを含む。例えば、その複数のＮＰＰＦは、少なくとも１つのＮＰＰＦ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００個またはそれ以上）を含み得、ここで、各ＮＰＰＦは、単一の標的核酸分子に特異的に結合する。別のまたはさらなる例において、その複数のＮＰＰＦは、少なくとも２つの異なるＮＰＰＦ集団（例えば、２、３、４、５、１０、２０または５０個の異なるＮＰＰＦ配列）を含み、ここで、各ＮＰＰＦ集団（または配列）は、異なる標的核酸分子に特異的に結合する。

【0096】

いくつかの例において、いくつかのＮＰＰＦは、同じ標的核酸の異なる部分にハイブリダイズし、各標的核酸の異なる部分にハイブリダイズするＮＰＰＦの数は、同じであり得るか、または異なり得る。例えば、低発現の核酸標的は、より高レベルで発現される核酸標的と比べて、それにハイブリダイズするより多いＮＰＰＦを有し得る（例えば、４つのＮＰＰＦが、低発現の核酸標的にハイブリダイズし、１つのＮＰＰＦが、高発現の核酸標的にハイブリダイズする）。いくつかの例において、いくつかの標的核酸に特異的なＮＰＰＦのいくつかは、フランキング配列を有しない場合があり（例えば、ＮＰＰ）、ゆえに、増幅されないかもしくは標識されないか、または接着された適切なアダプターを有しない場合があり、ゆえに、このＮＰＰＦの部分は、検出されないかまたは配列決定されない。フランキング配列を有するＮＰＰＦとフランキング配列を有しないＮＰＰとが約１対５または約１対１０または約１対１００または約１対１，０００であり得るような混合物を使用するとき、測定されるシグナルまたは配列決定されるＮＰＰＦの数は「減少」し得、１０，０００コピーの標的核酸が存在し、１対５という比が使用される場合、フランキング配列を含むすべてのＮＰＰＦが配列決定され得るとき、増幅後、１／５の数のＮＰＰＦしか、配列決定されない。

【0097】

いくつかの例において、上記複数のＮＰＰＦは、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも１００または少なくとも１０００（例えば、２〜５０００、２〜３０００、１０〜１０００、５０〜５００、２５〜３００、５０〜３００、１０〜１００または５０〜１００）個のユニークなＮＰＰＦ配列を含む。その複数のＮＰＰは、１つ以上の標的核酸分子に特異的なＮＰＰＦの任意の組み合わせを含み得る。ＣＦＳとともに、その複数のＮＰＰＦは、それらのＮＰＰＦがそれぞれの標的核酸およびそれぞれのＣＦＳに特異的にハイブリダイズするのに十分な条件下においてサンプルとインキュベートされる。いくつかの例において、ＣＦＳは、ＮＰＰＦより過剰に加えられる（例えば、ＮＰＰＦに対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍モル濃度過剰のＣＦＳ）。いくつかの例において、ＮＰＰＦは、サンプル中の核酸分子よりも過剰に加えられる（例えば、サンプル中の核酸分子に対して少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１０，０００倍または少なくとも１００，０００倍またはそれ以上、モル濃度過剰のＮＰＰＦ）。非常に豊富な核酸標的に対するＮＰＰＦが１，０００倍過剰で存在し、かつ同じ濃度の異なる各ＮＰＰＦが同様である場合、存在量の少ない遺伝子に対して過剰のＮＰＰＦは、より大きい倍数量である可能性があること（例えば、存在量が１，０００倍少ない遺伝子については、存在量の多い核酸標的よりも１，０００倍多い）が認識されるだろう。

【0098】

次いで、ハイブリダイズしたサンプルを、一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と接触させ得る。次いで、乗り越え得られたＮＰＰＦ（これは、ヌクレアーゼ工程中に保護した標的核酸分子に正比例する）が、増幅され得る。例えば、ＮＰＰＦのフランキング配列に相補的な配列を含む増幅プライマーが使用され得る。次いで、得られたＮＰＰＦアンプリコンが、当該分野で公知の方法によって、例えば、それらをアレイもしくは他の基材に結合することによって、検出され得るか、または配列決定され得る。その標的核酸分子は、それらのそれぞれのＮＰＰＦが検出されるかまたは配列決定されると、サンプル中に存在すると識別される。

【0099】

Ａ．例示的なハイブリダイゼーション条件
複数のＮＰＰＦが、標的核酸分子（例えば、被験体由来のサンプル中に存在するＤＮＡおよびＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズするのに十分な条件ならびにフランキング配列に相補的なＣＦＳに特異的にハイブリダイズするのに十分な条件が本明細書中に開示される。例えば、他の物質または分子との非特異的なハイブリダイゼーションを最小限にしつつ、選択されたストリンジェンシーの条件下において、核酸（例えば、ＮＰＰＦ）が別の核酸（例えば、標的ＤＮＡもしくは標的ＲＮＡまたはＣＦＳ）にハイブリダイズするのを可能にし得る特徴（例えば、長さ、塩基組成および相補性の程度）が、本開示に基づいて決定され得る。ＮＰＰＦの特徴は、下記のＩＶ項で詳細に述べられる。代表的には、ＮＰＰＦの領域は、選択されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてある核酸配列がハイブリダイズするのを可能にする、その対応する標的核酸分子と十分に相補的な核酸配列（例えば、図１，１０２）、ならびに選択されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてある領域がハイブリダイズするのを可能にする、その対応するＣＦＳと十分に相補的な領域（例えば、図１，１０４、１０６）を有し得る。例示的なハイブリダイゼーション条件としては、約３７℃またはそれ以上（例えば、約３７℃、４２℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃またはそれ以上）でのハイブリダイゼーションが挙げられる。変動し得るハイブリダイゼーション反応パラメータは、塩濃度、緩衝液、ｐＨ、温度、インキュベーション時間、ホルムアミドなどの変性剤の量およびタイプである。例えば、核酸（例えば、複数のＮＰＰＦ）は、溶解緩衝液などの緩衝液（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｈ_２ＰＯ_４、ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはそれらの組み合わせを含む緩衝液）において、約１０ｐＭ〜約１０ｎＭ（例えば、約３０ｐＭ〜５ｎＭ、約１００ｐＭ〜約１ｎＭ）の範囲の濃度でサンプルに加えられ得る。

【0100】

１つの例において、各ＮＰＰＦは、少なくとも１０ｐＭ（例えば、少なくとも２０ｐＭ、少なくとも３０ｐＭ、少なくとも５０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも１５０ｐＭ、少なくとも２００ｐＭ、少なくとも５００ｐＭ、少なくとも１ｎＭまたは少なくとも１０ｎＭ）の最終濃度でサンプルに加えられる。１つの例において、各ＮＰＰＦは、約３０ｐＭの最終濃度でサンプルに加えられる。別の例において、各ＮＰＰＦは、約１６７ｐＭの最終濃度でサンプルに加えられる。さらなる例において、各ＮＰＰＦは、約１ｎＭの最終濃度でサンプルに加えられる。１つの例において、各ＣＦＳは、プローブの量の少なくとも約６倍（例えば、プローブの量の少なくとも１０倍または少なくとも２０倍（例えば、プローブの量の６〜２０倍））の最終濃度でサンプルに加えられる。１つの例において、各ＣＦＳは、少なくとも１ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭまたは少なくとも２００ｎｍ（例えば、１〜１００、５〜１００または５〜５０ｎＭ）加えられる。例えば、６つのプローブ（各々１６６ｐＭ）が存在する場合、各ＣＦＳは、５〜５０ｎＭで加えられ得る。

【0101】

サンプル中の核酸は、変性されて、ハイブリダイゼーションにとって利用可能な一本鎖にされる（例えば、約９５℃〜約１０５℃において約５〜１５分間）。温度と緩衝液の組成との組み合わせが、一本鎖の標的ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはその両方を形成する限り、種々の変性溶液を使用することによって、この変性温度を改変することができる。次いで、サンプル中の核酸およびＣＦＳは、約１０分〜約７２時間（例えば、少なくとも約１時間〜４８時間、約６時間〜２４時間、約１２時間〜１８時間または一晩）にわたって、約４℃〜約７０℃（例えば、約３７℃〜約６５℃、約４２℃〜約６０℃または約５０℃〜約６０℃）の範囲の温度において、複数のＮＰＰＦにハイブリダイズされる。当然のことながら、そのハイブリダイゼーション条件は、使用される特定のＮＰＰＦおよびＣＦＳに応じて変動し得るが、ＮＰＰＦと標的分子およびＣＦＳとのハイブリダイゼーションを確実にするように設定される。いくつかの例において、複数のＮＰＰＦおよびＣＦＳは、少なくとも約３７℃、少なくとも約４０℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃または少なくとも約７０℃の温度においてサンプルとともにインキュベートされる。１つの例において、複数のＮＰＰＦおよびＣＦＳは、約３７℃、約４２℃または約５０℃においてサンプルとともにインキュベートされる。

【0102】

いくつかの実施形態において、本方法は、核酸の精製を含まない（例えば、核酸の精製は、サンプルをＮＰＰＦと接触させる前に行われず、かつ／または核酸の精製は、サンプルをＮＰＰＦと接触させた後に行われない）。いくつかの例において、サンプルの前処理は、細胞溶解以外、必要ない。いくつかの例において、細胞溶解ならびにサンプルと複数のＮＰＰＦおよびＣＦＳとの接触は、連続的に行われる。他の例において、細胞溶解ならびにサンプルと複数のＮＰＰＦおよびＣＦＳとの接触は、いくつかの非限定的な例では、いかなる介在工程もなしに、同時に行われる。

【0103】

続いて、ＮＰＰＦがＰＣＲ（例えば、普遍的な増幅、またはリアルタイムＰＣＲなどのためのＮＰＰＦ特異的増幅）に供されるとき、溶解、ＮＰＰＦとそれらの標的核酸とのハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ消化および塩基の加水分解のために使用される緩衝液および試薬は、増幅のために使用されるポリメラーゼと適合性であり得る。

【0104】

Ｂ．ヌクレアーゼによる処理
ＮＰＰＦとサンプル中の標的核酸およびＣＦＳとのハイブリダイゼーションの後、サンプルは、ヌクレアーゼ保護手順に供される。標的核酸分子および（使用されるとき）ＣＦＳ（ＮＰＰＦ上に５’と３’の両方のフランキング配列が存在することもしくは一方だけが存在することに応じて、１つまたは２つのＣＦＳ、あるいはフランキング配列が増幅または測定のために必要でない場合は０個のＣＦＳ）にハイブリダイズしたＮＰＰＦは、ヌクレアーゼによって加水分解されず、続いて、増幅され得、次いで、検出され得るかまたは配列決定され得る（またはその両方）。

【0105】

１つ以上のヌクレアーゼによる処理は、すべてのｓｓ核酸分子（ＮＰＰＦにハイブリダイズしていない（したがってＮＰＰＦによって保護されていない）サンプル中のＲＮＡおよびＤＮＡ、標的核酸にハイブリダイズしていないＮＰＰＦ、ならびにＮＰＰＦにハイブリダイズしていないＣＦＳ（使用されているとき）を含む）を破壊するが、ｄｓ核酸分子（例えば、ＣＦＳおよびサンプル中に存在する標的核酸分子にハイブリダイズしたＮＰＰＦ）を破壊しない。例えば、サンプルが、細胞の抽出物または溶解産物を含む場合、望まれない核酸（例えば、非標的ゲノムＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および相補的なＮＰＰＦ配列にハイブリダイズしていない標的核酸分子の一部（例えば、オーバーハング）（これは、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ核酸標的の場合、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）標的配列の大部分を構成する））が、この工程において実質的に破壊され得る。これにより、化学量論的量の標的核酸／ＣＦＳ／ＮＰＰＦ二重鎖が残される。標的分子が、固定から生じる組織に架橋されている場合、そのＮＰＰＦは、架橋を逆転させるかまたは標的核酸をそれが架橋されている組織から別途放出させる必要なく、架橋されている標的分子にハイブリダイズする。

【0106】

不対塩基をもたらす単一ヌクレオチドの差異が切断されないように、またはハイブリダイズしたヌクレアーゼ保護プローブの末端まで不対塩基を切断するヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ）が使用できるように、条件が選択され得る。単一の不対塩基の点においてＮＰＰＦ配列を加水分解する条件および同様にその位置で標的核酸を加水分解する条件も選択され得る。

【0107】

ヌクレアーゼの例としては、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼおよびそれらの組み合わせが挙げられる。ハイブリダイズされた複合体ならびにサンプル中に存在する残りの核酸および非標的核酸配列の性質に応じて、ＤＮＡａｓｅ、膵臓ＲＮＡｓｅ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ Ａ、リボヌクレアーゼＴ１、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ＲＮＡｓｅ ＣＬＢ、ＲＮＡｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮＡｓｅ Ｕ２などを含む任意の種々のヌクレアーゼが使用され得る。当業者は、適切なヌクレアーゼを選択することができる。特定の例において、ヌクレアーゼは、一本鎖（ｓｓ）核酸に特異的であり、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼである。ｓｓ核酸に特異的なヌクレアーゼを使用する１つの利点は、過剰なＮＰＰＦが加水分解される点および化学量論の標的核酸がＮＰＰＦに与えられる点に加えて、そのような一本鎖（「粘着性」）分子が望ましくないバックグラウンドまたは交差反応性をもたらし得るその後の反応工程からそれらが除去される点である。しかしながら、標的核酸が配列決定される場合、適切なシーケンシングアダプターを有するＮＰＰＦだけが配列決定チップにハイブリダイズするので（この時点において、サンプル由来のｓｓ分子は洗浄され得る）、これは必要ないことを当業者は認識するだろう。Ｓ１ヌクレアーゼは、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ（ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ５７６１）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ（ｃａｔ．ｎｏ．１８００１−０１６）；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ（ｃａｔ．ｎｏ．ＥＮ０３２１）およびその他から商業的に入手可能である。これらの酵素に対する反応条件は、当該分野で周知であり、経験的に最適化され得る。

【0108】

いくつかの例において、緩衝液（例えば、酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＺｎＳＯ_４、ＫＡＴＨＯＮまたはそれらの組み合わせを含む緩衝液）に希釈されたＳ１ヌクレアーゼが、ハイブリダイズされたプローブ／サンプル混合物に加えられ、約３７℃〜約６０℃（例えば、約５０℃）において１０〜１２０分間（例えば、１０〜３０分間、３０〜６０分間、６０〜９０分間または１２０分間）インキュベートされることにより、サンプル由来のハイブリダイズしていない核酸およびハイブリダイズしていないＮＰＰＦを消化する。

【0109】

サンプルは必要に応じて、ハイブリダイズしていない材料を別途除去するために、および／または残留酵素を不活性化するためもしくは除去するために（例えば、加熱、フェノール抽出、沈殿、カラム濾過、プロテイナーゼｋの添加、ヌクレアーゼインヒビターの添加、活性のためにヌクレアーゼが要求する二価カチオンのキレート化またはそれらの組み合わせによって）処理され得る。いくつかの例において、サンプルは必要に応じて、標的核酸およびＣＦＳをその相補的なＮＰＰＦから解離させる（例えば、塩基の加水分解および加熱を用いて）ために処理される。いくつかの例において、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の後、ＮＰＰＦにハイブリダイズした標的ＲＮＡ分子は、例えば、塩基におけるＮＰＰＦとの二重鎖を解離させ、次いで、そのＲＮＡをヌクレアーゼまたは化学的／物理的処理（例えば、高温での塩基の加水分解）によって破壊することによって、分解され、それにより、どれだけ標的核酸にハイブリダイズしたかに正比例してＮＰＰＦが残り得る。あるいは、サンプルは、標的核酸のハイブリダイズした（一本鎖）部分またはハイブリダイズした標的核酸およびプローブによって形成された二重鎖を残すように処理されて、さらに解析され得る。

【0110】

いくつかの例において、ヌクレアーゼとのインキュベーションの後、塩基（例えば、ＮａＯＨまたはＫＯＨ）を加えてｐＨを約９〜１２に上げ、サンプルを加熱する（例えば、９５℃に１０分間）。これにより、標的分子／ＣＦＳ／ＮＰＰＦ二量体が解離され、ＮＰＰＦが一本鎖の状態で残り、ＲＮＡの場合は、ＲＮＡ標的分子が加水分解される。この工程はまた、ｐＨを約６超に上昇させることなどによって、ヌクレアーゼを中和し得るかまたは非活性化し得る。

【0111】

いくつかの例において、例えば、酸（例えば、ＨＣｌ）を加えることによって、ｐＨを約７〜約８に調整するように、サンプルが処理される。いくつかの例において、ｐＨは、Ｔｒｉｓ緩衝液中で約７〜約８に上昇される。ｐＨを上昇させることにより、ＤＮＡの脱プリンが妨げられ得、また、多くのｓｓ特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１）が完全に機能するのが妨げられ得る。

【0112】

いくつかの例において、望まれない核酸または他の分子を除去するために、サンプルは、例えば、ゲル精製または他の分離方法によって、増幅前に精製されるかまたは分離される。

【0113】

Ｃ．増幅
試験されるサンプル中にどれだけ標的核酸分子が存在したかに正比例する、得られたＮＰＰＦ分子（またはＮＰＰＦから分離された、得られた標的核酸分子）が、例えば、通例の方法（例えば、ＰＣＲまたは他の形態の酵素的増幅もしくはライゲーションベースの増幅方法）を用いて、増幅され得る。

【0114】

使用され得るインビトロ増幅法の例としては、定量的リアルタイムＰＣＲ、鎖置換増幅（米国特許第５，７４４，３１１号を参照のこと）；転写なし等温増幅（米国特許第６，０３３，８８１号を参照のこと）；修復連鎖反応増幅（ｒｅｐａｉｒ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＷＯ９０／０１０６９を参照のこと）；リガーゼ連鎖反応増幅（ＥＰ−Ａ−３２０３０８を参照のこと）；ギャップフィリングリガーゼ連鎖反応増幅（ｇａｐ ｆｉｌｌｉｎｇ ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（米国特許第５，４２７，９３０号を参照のこと）；リガーゼ検出とＰＣＲの連結法（ｃｏｕｐｌｅｄ ｌｉｇａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ）（米国特許第６，０２７，８８９号を参照のこと）；およびＮＡＳＢＡ^ＴＭＲＮＡ転写なし増幅（米国特許第６，０２５，１３４号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの例において、ライゲーションベースの増幅方法が使用され、ここで、プライマーは、ＮＰＰＦ特異的であり、かつそれらが互いにライゲートされ得るように共に平滑末端にされ（ｂｕｔｔ−ｕｐ）、融解され、次いで、一連のサイクルにわたって新しいプライマーが互いにライゲートされる。ライゲーションは、酵素的であり得るか、または非酵素的であり得る。ＮＰＰＦフランキング配列が、プライマーのハイブリダイゼーションのために使用される場合、増幅は、普遍的であり得る。

【0115】

定量的リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって可能にされる、核酸分子をインビトロにおいて増幅する別の形態である（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）。この５’ヌクレアーゼアッセイは、特異的な増幅産物だけを検出するためのリアルタイム法を提供する。増幅中に、プローブがその標的配列にアニーリングすることにより、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが上流のプライマーからプローブの領域まで伸長させるとき、その酵素の５’ヌクレアーゼ活性によって切断された基質が生成される。この重合への依存のおかげで、標的配列が増幅されている場合にだけ、プローブの切断が生じることが確実になる。蛍光発生プローブを使用することにより、プローブ分解を解析するための、ＰＣＲ後の処理を省くことが可能になる。プローブは、レポーター蛍光色素とクエンチャー色素の両方が付着されたオリゴヌクレオチドである。そのプローブは、インタクトである場合、クエンチャーが近接していることにより、空間を通過するＦｏｅｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によってレポーター色素が放射する蛍光は大幅に減少する。リアルタイムＰＣＲの場合、ＮＰＰＦのサンプルは、別個のウェルまたは反応位置に分けられ得、異なるＮＰＰＦ特異的プライマーセットが、各ウェルまたは反応位置に加えられる。プローブ（各々が、異なる標識を有する）を使用することによって、リアルタイムＰＣＲの多重化が可能になり、単一のウェルまたは反応位置において複数の異なるＮＰＰＦが測定される。

【0116】

ＮＰＰＦの増幅中、実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターは、例えば、プライマーおよび伸長構築物の一部として、例えば、３’もしくは５’末端または両端に、組み込まれ得る。例えば、ＮＰＰＦフランキング配列の全部または一部に相補的な第１の部分を含む増幅プライマーは、所望の実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターに相補的な第２の部分を含み得る。当業者は、実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターの種々の組み合わせが、ＮＰＰＦのいずれかの末端に付加され得ることを認識するだろう。１つの例において、ＮＰＰＦは、３’−ＮＰＰＦフランキング配列の全部または一部に相補的な第１の部分および所望のシーケンシングアダプターに相補的な（またはそれを含む）第２の部分を含む第１の増幅プライマーを使用して増幅され、第２の増幅プライマーは、５’−ＮＰＰＦフランキング配列の全部または一部に相補的な第１の部分および所望の実験タグに相補的な（またはそれを含む）第２の部分を含む。別の例において、ＮＰＰＦは、３’−ＮＰＰＦフランキング配列に相補的な第１の部分ならびに所望のシーケンシングアダプターおよび所望の実験タグに相補的な（またはそれを含む）第２の部分の全部または一部を含む第１の増幅プライマーと、５’−ＮＰＰＦフランキング配列の全部または一部に相補的な第１の部分および所望の実験タグに相補的な（またはそれを含む）第２の部分を含む第２の増幅プライマーとを使用して増幅される。

【0117】

シーケンシングアダプター、実験タグ（基材によるＮＰＰＦの捕捉を可能にするタグを含む）およびＮＰＰＦタグを付加するためにＮＰＰＦ特異的プライマーが使用され得ることが認識されるだろう。ＮＰＰＦのサンプルは、１つ以上の異なるＮＰＰＦ特異的プライマーを含む別個のウェルまたは位置に分離され、増幅され、次いで、別々に配列決定され得るか、または配列決定のために組み合わされ得る（または検出され得る）。

【0118】

増幅は、生成されたＮＰＰＦアンプリコンに検出可能な標識を導入するため（例えば、ＮＰＰＦが最初は標識されていない場合または追加の標識が望まれる場合）または検出もしくはクエンチングを可能にする他の分子を導入するためにも使用され得る。例えば、増幅プライマーは、増幅中にＮＰＰＦに組み込まれる、検出可能な標識、ハプテン（ｈａｐｔａｎ）またはクエンチャーを含み得る。そのような標識、ハプテンまたはクエンチャーは、ＮＰＰＦアンプリコンのいずれかの末端（または両端）またはそれらの間のいずれかの箇所に導入され得る。

【0119】

いくつかの例において、得られたＮＰＰＦアンプリコンは、検出または配列決定の前に浄化される（ｃｌｅａｎｅｄ ｕｐ）。例えば、増幅反応混合物は、当該分野で周知の方法（例えば、ゲル精製、ビオチン／アビジン捕捉および放出、キャピラリー電気泳動）を用いて、検出または配列決定の前に浄化され得る。１つの例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、ビオチン化され（るか、または別のハプテンを含み）、アビジンまたは抗ハプテンでコーティングされたビーズまたは表面上に捕捉され、洗浄され、次いで、検出または配列決定のために放出される。同様に、ＮＰＰＦアンプリコンは、相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）オリゴヌクレオチド（例えば、表面に結合したもの）上に捕捉され、洗浄され、次いで、検出または配列決定のために放出され得る。開示される方法は、ゲノムまたはトランスクリプトームの大部分を排除して、標的核酸分子にハイブリダイズしたＮＰＰＦを残すので、アンプリコンの捕捉は、特に特異的である必要はない。所望であれば、増幅産物を浄化する他の方法を使用することができる。

【0120】

増幅産物は、一本鎖オリゴヌクレオチドを加水分解するヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）を使用する方法によって、増幅の最後の工程の後にも二本鎖のままで浄化され得る（そのヌクレアーゼは、その後、表面へのハイブリダイゼーションなどの次の工程を続ける前に不活性化され得る）。

【0121】

Ｄ．ＮＰＰＦアンプリコンの検出
いくつかの例において、得られたアンプリコンは、任意の好適な手段によって、例えば、ＮＰＰＦアンプリコン上に存在する検出可能な標識に基づいて、検出される。特定の非限定的な例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、ビオチン標識を含む。この例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、そのアンプリコン（例えば、そのＮＰＰＦアンプリコンを含む支持体、例えば、アレイまたはビーズ上のもの）を、アビジン−ＨＲＰ、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰ、またはアルカリホスファターゼなどの別の好適な酵素との結合体とともにインキュベートし、次いで、その支持体を色素生産性、化学発光または蛍光発生の基質と接触させることによって検出され得る。１つの非限定的な例において、その基質は、ＴＭＡ−３（Ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ，ＭＩ）である。さらなる化学発光基質（例えば、ＬｕｍｉＧｌｏ（登録商標）（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）およびＥＣＬ^ＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））が、商業的に入手可能である。その基質によって生成されるシグナルは、例えば、マイクロアレイ撮像装置（例えば、ＯＭＩＸ、ＯＭＩＸ ＨＤ、ＣＡＰＥＬＬＡまたはＳＵＰＥＲＣＡＰＥＬＬＡ撮像装置，ＨＴＧ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）走査装置を使用して、または例えばラテラルフロー（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ）デバイスにおいて視覚的に、検出される。ユウロピウム系ルミネセンス、ならびにエレクトロルミネセンスもしくは光散乱または電気的なもの（例えば、導電率または抵抗）が使用され得る。別の例において、ＮＰＰＦは、Ｃｙ−３またはＣｙ−５などの蛍光標識を含む。ＮＰＰＦアンプリコンは、標準的なマイクロアレイ撮像装置（例えば、Ｔｙｐｈｏｏｎ^ＴＭ撮像装置（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）マイクロアレイ走査装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）走査装置（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、フローサイトメトリー法または蛍光顕微鏡法を使用して検出され得る。当業者は、これらのまたは他の検出可能な標識に適した検出方法および試薬を選択することができる。

【0122】

Ｅ．捕捉分子を使用したＮＰＰＦの検出
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ処理および増幅の後、ＮＰＰＦアンプリコンを含むサンプルを、複数の空間的に不連続の領域（各々が捕捉分子を含む）を含む表面と接触させるか、または複数の表面（各々が捕捉分子を含む）と接触させる。例えば、その表面は、ビーズの集団であり得、ここで、それらのビーズの部分集団の各々が、少なくとも１つの捕捉分子を含む。例えば、第１の部分集団は、少なくとも１つの捕捉分子を含み得、第２の部分集団は、第１のものとは異なる配列を有する少なくとも１つの捕捉分子を含み得るなど。いくつかの例において、その捕捉分子は、二機能性リンカー（「プログラミングリンカー」とも称される）と会合した少なくとも１つのアンカーを含む。あるいは、その捕捉分子は、ＮＰＰＦアンプリコンの少なくとも一部に相補的な配列（例えば、ＮＰＰＦアンプリコンのフランキング領域の全部または一部に相補的な配列）を有する核酸捕捉プローブを含む。

【0123】

捕捉分子が、二機能性リンカーに会合した少なくとも１つのアンカーを含む例において、そのアンカーと二機能性リンカーとは、ハイブリダイゼーション、アニーリング、共有結合または他の結合によって会合される。その二機能性リンカーは、アンカーに特異的に結合する（例えば、それに相補的な）第１の部分、および複数のＮＰＰＦアンプリコンのうちの１つに特異的に結合する（例えば、それに相補的な）第２の部分を含む（例えば、図１に示されているＮＰＰＦ１００の領域１０２の全部または一部に相補的な）。

【0124】

いくつかの実施形態において、開示される方法は、増幅工程の後にＮＰＰＦアンプリコンを捕捉するように使用される二機能性リンカーと会合した表面上（例えば、アレイ上）にアンカーを含む。いくつかの例において、アンカーは、約８〜１５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド（例えば、約８〜１００、１５〜１００、２０〜８０、２５〜７５または２５〜５０、例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ヌクレオチド）である。１つの非限定的な例において、アンカーは、約２５ヌクレオチド長である。いくつかの例において、アンカーは、二機能性リンカーの第１の部分に特異的に結合する第１の部分および表面とアンカーの第１の部分との間のスペーサーとして作用する第２の部分を含む。いくつかの例において、アンカーの第２の部分は、約６〜６０個の炭素原子またはヌクレオチド長（例えば、約６、１２、２４、３０、３６、４２、４８、５４または６０個の炭素原子またはヌクレオチド）である。他の例において、アンカーの第２の部分は、約５〜１００個の炭素原子またはヌクレオチド長（例えば、約１０〜５０、１５〜４０、２０〜３０または約２５個の炭素原子またはヌクレオチド）である。

【0125】

開示される方法のためのアンカーの塩基組成は、アンカーと二機能性リンカーとの対形成の熱力学的安定性が高くなるような組成である。いくつかの例において、アンカーのパーセンテージ塩基組成は、約３０〜４０％のＧ、３０〜４０％のＣ、１０〜２０％のＡおよび１０〜２０％のＴである。いくつかの例において、アンカーにおける隣接頻度（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）が、Ｇ−ＧまたはＣ−Ｃの隣接を最小にすることにより、Ｇ−カルテット形成によって媒介される副反応が減少する。他の例において、非天然塩基すなわちペプチド核酸がアンカーまたは二機能性リンカーに組み込まれることにより、その特性が改変され得る。

【0126】

開示される方法において有用なアンカーをデザインするおよび合成する方法は、例えば、参照により本明細書中に援用されるＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／２４０９８に記載されている。いくつかの例において、実質的に互いに似ていないアンカーセットが、望ましい。似ていないアンカーセットを得るための例示的なアルゴリズムは、以下のとおりである：
１）そのセットのサイズを定義する。いくつかの実施形態において、１６、２４、３６、４８、４９、６４、８１、９６および１００が、有用なサイズを構成する。

【0127】

２）アンカーセットの配列構造全体を定義する。上に記載されたような長さおよび塩基組成を使用して、そのようなパラメータを定義する。一般に、Ｇ塩基とＣ塩基の数は等しく、同様にＡ塩基とＴ塩基の数も等しい。この等しいことから、最終的なセットの立体配置多様性が最適化される。したがって、そのようなセットは、式Ｇ_ｎＣ_ｎＡ_ｍＴ_ｍによって記載され得る。

【0128】

３）ｍおよびｎによって定義されるセット構造の場合、乱数発生器を使用して、ランダムな配列異性体セットを生成する。

【0129】

４）そのランダムな配列セットのエレメント＃１として使用するために、そのセットの１つのメンバーを選択する。

【0130】

５）セットメンバーの間で許容できる最大類似性を定義する。類似性は、ローカルペアワイズ塩基比較に関して定義される。例えば、同一長ｎの２つのオリゴマー鎖を、５’末端と３’末端とが適正に並ぶ（ｉｎ ｒｅｇｉｓｔｅｒ）ようにアラインメントするとき、ミスマッチが無いことは、すべての位置ｌ〜ｎにおいて、その２つの鎖における塩基が同一である状況を指す。完全なミスマッチは、すべての位置ｌ〜ｎにおいて、その２つの鎖における塩基が異なる状況を指す。例えば、有用な最大類似性は、１６ｍｅｒの捕捉プローブである１６のセットにおける、１０またはそれ以上のミスマッチであり得る。

【0131】

６）ランダムな配列セットの第２のメンバーを選択し、エレメント＃１に対するその類似性を測定する。エレメント＃２が、エレメント＃１に対する許容できる最大類似性未満の類似性を有する場合、それは、そのセットに維持され得る。エレメント＃２が、許容できる最大類似性より高い類似性を有する場合、それは棄却され、新しい配列が比較のために選択される。第２のエレメントが決定されるまで、このプロセスを繰り返す。

【0132】

７）連続した様式において、先に選択されたすべてのエレメントに関して非類似性の制約を満たす、ランダムな配列セットのさらなるメンバーを選択する。

【0133】

開示される方法において使用され得る１６個のアンカーセットの１つの非限定的な例を表１に示す。

【0134】

【表1】

他の例において、捕捉分子は、ＮＰＰＦアンプリコンの少なくとも一部に相補的な配列（例えば、ＮＰＰＦアンプリコンのフランキング領域の全部または一部に相補的な配列）を有する少なくとも１つの核酸捕捉プローブを含む。例えば、核酸捕捉プローブは、ＮＰＰＦアンプリコンに相補的な領域を含み得、かつそれに相補的でない領域（例えば、表面へのプローブの付着を可能にする領域）を含んでよい。その核酸捕捉プローブは、表面に直接付着され得る。例えば、核酸捕捉プローブは、表面に対する共有結合のためにアミンを含み得る。いくつかの例において、核酸捕捉プローブは、少なくとも８ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも（ａｔ ｌｅｓｔ）５０または少なくとも１００ヌクレオチド長（例えば、約８〜１００、１５〜１００、２０〜８０、２５〜７５または２５〜５０、例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ヌクレオチド））のオリゴヌクレオチドである。当業者は、核酸捕捉プローブと適切なＮＰＰＦアンプリコンとの間にハイブリダイゼーションが生じ得る限り、ＮＰＰＦアンプリコンの領域に相補的な核酸捕捉プローブの領域が１００％相補的である必要はないことを認識するだろう。いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコンの領域に相補的な核酸捕捉プローブの領域は、少なくとも８ヌクレオチド長（例えば、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも（ａｔ ｌｅｓｔ）５０または少なくとも１００ヌクレオチド長（例えば、約８〜１００、１５〜１００、２０〜８０、２５〜７５または２５〜５０、例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ヌクレオチド長））である。

【0135】

いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコンを含むサンプルは、アレイの表面と接触させる前に変性される（例えば、サンプルを５分間９５℃に加熱し、氷上で急速に冷却することによって）。いくつかの例において、ＮＰＰＦを含むサンプルは、表面と接触させる前に調整される（例えば、塩またはホルムアミドの濃度が調整される）。ＮＰＰＦアンプリコンを含むサンプルは、ＮＰＰＦアンプリコンが捕捉分子に特異的に結合する（例えば、ハイブリダイズする）のに十分な時間にわたって、表面（例えば、アレイまたはビーズ）とともにインキュベートされる。いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコンが捕捉分子にハイブリダイズするのを可能にするような、約３７℃〜約６５℃（例えば、約４５℃〜約６０℃または約５０℃〜約６０℃、例えば、５０℃）における少なくとも１時間（例えば、１〜８時間、１〜３６時間、１２〜２４時間または１６〜２４時間または一晩）にわたる、そのサンプルとその表面とのインキュベーション（「ＮＰＰＦ捕捉」）。例えば、マイクロ流体デバイスもしくはマクロ流体デバイス、ラテラルフローデバイスを使用するか、あるいは拡散を減少させ、アクティブフロー（ａｃｔｉｖｅ ｆｌｏｗ）または混合を使用することによる場合、捕捉時間は、短縮され得る。

【0136】

開示される方法において使用され得る表面（または基材）のいくつかは、商業的供給業者から容易に入手可能である。いくつかの実施形態において、その表面は、９６、３８４または１５３６ウェルマイクロタイタープレート（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒが販売する修飾プレート）である。他の実施形態において、基材には、１つ以上のビーズ（例えば、サイズまたは色によって、例えば、フローサイトメトリーによって、区別され得るビーズの集団）が含まれる。あるいは、ウェルを含み、そしてさらにへこみまたは「くぼみ」を含む表面は、アルミニウムまたは鋼などの物質をミクロ機械加工して型を作製し、次いで、プラスチックまたは類似の材料をその型に微量注入して、構造を形成することによって、形成され得る。あるいは、ガラス、プラスチック、セラミックなどを含む構造が、組み立てられ得る。その分離器は、例えば、全体にわたって一定間隔で配置された穴を有する材料、例えば、シリコーン片であり得、その３つの片が連結されると、各穴が試験ウェルの壁を形成する。サブディバイダー（ｓｕｂｄｉｖｉｄｅｒ）は、スクリーンまたは微細な網目構造の形態で形づくられた、例えば、薄片材料、例えば、シリコーンであり得る。種々の反応物を分離する表面上のディバイダー（ｄｉｖｉｄｅｒ）は、溶液が付着しないコーティングされた表面、またはナノ構造、または単に個別の液滴、またはキャピラリーまたはマイクロ流体チャネルまたは位置でもあり得る。いくつかの例において、底部は、例えば、生化学的アッセイに使用される代表的なマイクロプレートの下部の形状における、平らな材料片（例えば、ガラスまたはプラスチック）である。その底部の上面は、平らであり得るか、または完全な細分を提供するサブディバイダーの形状と整列し得るへこみ、すなわちウェルを各サンプルウェル内に有するように形成され得る。それらの３つの片は、標準的な手順、例えば、シリコンウエハの組立において使用される手順によって、連結され得る。

【0137】

表面に適した材料としては、ガラス、シリカ、金、銀、ゲルもしくはポリマー、ニトロセルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリジン、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）、二フッ化ポリビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｒｏｉｄｅ）、ポリフルオロエチレン−プロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン（ｐｏｌｙｃｈｏｌｏｒｏｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ポリスルホン（ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｒｎｅｓ）、ヒドロキシル化された二軸延伸ポリプロピレン、アミノ化された二軸延伸ポリプロピレン、チオール化された（ｔｈｉｏｌａｔｅｄ）二軸延伸ポリプロピレン、エチレンアクリル酸、エチレン（ｔｈｙｌｅｎｅ）メタクリル酸、およびそれらの共重合体の混合物（米国特許第５，９８５，５６７号を参照のこと）、または炭素を含むナノ材料を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0138】

一般に、表面を形成するために使用され得る材料の好適な特徴としては、支持体の表面が、活性化されると、それにオリゴヌクレオチド（例えば、アンカー）などの生体分子を共有結合的に付着することができるように、表面の活性化に適していること；生体分子の「インサイチュ」合成に適していること；オリゴヌクレオチドまたはタンパク質によって占有されていない支持体上の区域が非特異的結合の影響を受けないように、化学的に不活性であること、または非特異的結合が生じるとき、オリゴヌクレオチドもしくはタンパク質を除去することなく、そのような材料が表面から容易に除去され得ることが挙げられる。それらの表面は、透過性、部分的に透過性または不透過性であり得る。

【0139】

アンカーを配置するための多種多様のアレイ形式が、本開示に従って使用され得る。１つの好適な形式としては、個別のセルの２次元パターン（例えば、６４×６４アレイの４０９６個の正方形）が挙げられる。当業者が認識するように、他のアレイ形式（スロット（長方形）および円形アレイを含むがこれらに限定されない）も、使用するのに等しく適している（米国特許第５，９８１，１８５号を参照のこと）。いくつかの例において、アレイは、マルチウェルプレートである。

【0140】

オリゴヌクレオチドアンカー、二機能性リンカーおよび他の捕捉分子（ならびにＮＰＰＦ、ＣＦＳおよびＰＣＲプローブ／プライマー）は、従来の技術によって（例えば、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて）および／またはそのように合成されたサブフラグメントを共にライゲートすることによって、合成され得る。そのような方法によって確実に合成されるのには長すぎる核酸は、従来の手順を用いる増幅手順によって生成され得る。

【0141】

１つの実施形態において、事前に形成された核酸アンカー（例えば、オリゴヌクレオチドアンカー）またはＮＰＰＦアンプリコンの少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸捕捉プローブ（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）が、種々の従来の手法（フォトリソグラフィックまたはシルクスクリーン化学的付着、インクジェット技術による配置、キャピラリー、スクリーンまたは流路チップ、電極アレイを使用する電気化学的パターニング、ピンもしくはクイルとの接触、または変性の後のベーキングもしくはフィルター上へのＵＶ照射を含む）のいずれかによる試験領域の表面上または表面内部に位置され得る（例えば、Ｒａｖａら（１９９６）．米国特許第５，５４５，５３１号；Ｆｏｄｏｒら（１９９６）．米国特許第５，５１０，２７０号；Ｚａｎｚｕｃｃｈｉら（１９９７）．米国特許第５，６４３，７３８号；Ｂｒｅｎｎａｎ（１９９５）．米国特許第５，４７４，７９６号；ＰＣＴ ＷＯ９２／１００９２；ＰＣＴ ＷＯ９０／１５０７０を参照のこと）。オリゴヌクレオチドアンカーまたはプローブは、試験領域の表面の上に配置され得るか、または例えば、ポリアクリルアミドゲルパッドの場合、アンカーまたはプローブの一部が、そのゲル構造からゲル内およびゲル表面内の水性部分に突出するような様式でその表面内に包埋され得、リンカーまたはＮＰＰＦとの相互作用のために利用可能である。これは、透過性の表面および部分的に透過性の表面（例えば、第１の部分（例えば、二機能性リンカーまたはＮＰＰＦを含む溶液と接触する表面の領域）は透過性であるが第２の部分（例えば、表面から少し離れた部分）は透過性でない表面）に対しては真である。１つの実施形態において、予め形成されたオリゴヌクレオチドアンカーまたはプローブは、５’末端において遊離アミノ基で誘導体化され；緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ８．５および１ｍＭ ＥＤＴＡ）に、日常的に経験的に決定される濃度（例えば、約１μＭ）で溶解し；そしてＰｉｘｕｓナノジェットディスペンサー（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて約１０．４ナノリットルの液滴として、上面が新しい乾燥ＤＮＡ Ｂｉｎｄプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）の上面である試験ウェル内の特定の位置に分配される。オリゴヌクレオチドの付着および蒸発の相対的速度に応じて、調製中のウェル内の湿度を制御する必要がある場合がある。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドアンカーまたはプローブは、従来の方法（例えば、成長中のオリゴヌクレオチド鎖の光活性化脱保護を用いるか（例えば、部位特異的「マスク」の使用とともに））、またはナノジェットディスペンサーを使用して非活性化化合物のナノリットル液滴のパターン化された分配によって、試験領域の表面上で直接合成され得る。単一ヌクレオチドを受け入れるすべての成長中のオリゴヌクレオチドの脱保護を行うことができ、例えば、次いでそのヌクレオチドを表面全域に付加する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドアンカーまたはプローブは、従来の方法を用いてオリゴヌクレオチドの３’末端を介して表面に付着される。

【0142】

Ｆ．代替方法を用いたＮＰＰの検出
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ処理および増幅の後、ＮＰＰＦアンプリコンは、ハイスループットプラットフォームなどの代替方法を用いて検出される。いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、ゲル電気泳動、クロマトグラフィ、質量分析、配列決定、従来のマイクロアレイ解析を用いて検出されるか、ＰＣＲ増幅工程中に検出されるか、またはハイブリッド捕捉によって検出される。いくつかの実施形態において、ＮＰＰＦアンプリコンは、検出可能な標識を含まず、間接的な検出方法が使用される。そのような方法は、当業者に公知であり、それらとしては、本明細書中に記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない。

【0143】

１つの例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、ビーズアレイなどのビーズに基づくアッセイを用いて検出される。ビーズに基づくアッセイの１つの例は、Ｘ−ＭＡＰ（登録商標）ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用する（例えば、ＱＢＥＡＤアッセイ）。いくつかの例において、ＮＰＰは、ビーズと会合したオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション（例えば、約５０℃における約１時間）によってＸ−ＭＡＰ（登録商標）ビーズまたは他のビーズ上に捕捉される。ＮＰＰＦアンプリコンに含められる検出可能な標識は、例えば、フローサイトメトリーによって（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ２００、Ｆｌｅｘｍａｐ３Ｄまたは他の好適な機器を使用して）検出され得る。

【0144】

別の例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、標準的なマイクロアレイを使用して検出される。そのようなアレイの１つの例は、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎマイクロアレイ（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）である。いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、ＮＰＰＦアンプリコンに特異的に結合するオリゴヌクレオチドを備えるアレイにハイブリダイズする。ＮＰＰＦアンプリコンに含められる検出可能な標識が検出され得る。

【0145】

いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、「バーコード」アッセイを用いて検出される。そのようなアッセイの１つの例は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）である。いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、１つ以上の色分けされたタグ（「バーコード」）を含むプローブにハイブリダイズする。その色分けされたタグの検出によって、ＮＰＰＦアンプリコンが識別される。例えば、ＷＯ０７／０７６１２８２；ＷＯ０７／０７６１２９；ＷＯ０７／１３９７６６を参照のこと。

【0146】

Ｆ．アンプリコンの配列決定
いくつかの例において、得られたＮＰＰＦアンプリコンは、例えば、ＮＰＰＦアンプリコン全体またはその一部（例えば、標的核酸分子の識別を可能にするのに十分な量）を配列決定することによって、配列決定される。本開示は、特定の配列決定方法に限定されない。いくつかの例において、複数の異なるＮＰＰＦアンプリコンが、単一の反応において配列決定される。１つの例において、特定の標的配列に対応するようにデザインされ得るＮＰＰＦアンプリコンの実験タグが、配列決定され得る。したがって、ＮＰＰＦアンプリコンの３’末端が、測定される各標的に対してユニークな配列である配列を、末端の２〜２５ヌクレオチド（例えば、末端の２〜５または２〜７、例えば、末端の２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド）に有する場合、これは、標的を識別するために配列決定される必要があるＮＰＰＦアンプリコンのすべてであり、配列決定されたそのような実験タグの数を数えることによって、サンプル中の各標的の量が測定され得る。

【0147】

１つの例において、得られたＮＰＰＦアンプリコン（例えば、ＤＮＡから構成されるもの）は、チェーンターミネーション法を用いて配列決定される。この手法は、改変されたヌクレオチド基質を用いる、ＤＮＡ合成反応の配列特異的な終結を利用する。チェーンターミネーター配列決定法では、ＮＰＰＦアンプリコンの一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって、ＮＰＰＦアンプリコン上の特定の部位において伸長が開始される。そのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼを用いて伸長される。低濃度の鎖停止ヌクレオチド（通常、ジデオキシヌクレオチド）とともに、４種のデオキシヌクレオチド塩基（またはリボヌクレオチド）が、そのプライマーおよびポリメラーゼに含められる。そのポリメラーゼによる鎖停止ヌクレオチドの限定的な組み込みによって、特定のヌクレオチドが使用された位置でだけ終結された一連の関係する核酸フラグメントがもたらされる。次いで、それらのフラグメントを、例えば、スラブポリアクリルアミドゲルまたは粘稠性ポリマーで満たされた細いガラス管（キャピラリー）における電気泳動によって、サイズ分離する。

【0148】

代替方法は、ダイターミネーター配列決定法である。このアプローチを用いることにより、チェーンターミネーション法の場合に必要とされた４つの反応ではなく、単一の反応において完全な配列決定が可能になる。これは、ジデオキシヌクレオチド鎖ターミネーターの各々を、異なる波長で蛍光を発する別個の蛍光色素で標識することによって達成される。

【0149】

別の例では、パイロシーケンシング（例えば、Ｂｉｏｔａｇｅが商業化した方法（ロースループットの配列決定の場合）および４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓが商業化した方法（ハイスループットの配列決定の場合））が使用される。アレイに基づく方法（例えば、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）では、一本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）を、ビーズにアニールさせ、ＥｍＰＣＲによって増幅する。次いで、これらの核酸が結合したビーズを、光ファイバーチップ上のウェルに、ＡＴＰの存在下において光を発生する酵素とともに入れる。遊離ヌクレオチドをこのチップの上に流すと、ヌクレオチドがその相補的な塩基対と接着するときにＡＴＰが生成されるので、光が発生する。１つ（またはそれ以上）のヌクレオチドが付加されることにより、光シグナルを生成する反応が生じ、それを、例えばＣＣＤカメラによって記録する。シグナル強度は、単一のヌクレオチドフローにおいて組み込まれるヌクレオチドの数、例えば、ホモポリマーのストレッチに比例する。

【0150】

別の例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（例えば、ＨｉＳｅｑ）またはＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）、４５４（登録商標）、Ｈｅｌｉｃｏｓ、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）、Ｓｏｌｉｄ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｏａｓｙｓｔｅｍｓ）または任意の数の他の商業的配列決定システムを用いて配列決定される。シーケンシングアダプター（例えば、ＮＰＰＦアンプリコン上に存在する、例えば、ＰＣＲを用いて導入される、ポリＡまたはポリＴテイル）が、捕捉のために使用される。４５４（登録商標）またはＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）による配列決定は、代表的には、ＤＮＡのランダムな断片化によって達成されるライブラリー調製、それに続く、共通のアダプター配列のインビトロライゲーションを含む。開示される方法の場合、配列決定される核酸のランダムな断片化の工程は省くことができ、ＮＰＰＦアンプリコンに存在する実験タグなどのアダプター配列のインビトロライゲーションが、ＮＰＰＦアンプリコンに対して行われ得るが、これらは、フランキング領域およびＰＣＲを使用することによっても組み込まれ得、それにより、ライゲーションの必要が回避される。いったんシーケンシングアダプターによって配列決定チップ／ビーズに捕捉されると、ブリッジ増幅を行うことにより、配列決定のための各プローブのコロニーが形成される。これらの方法では、ＮＰＰＦアンプリコンは、最後には、平面の基材上の単一位置に（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、インサイチュコロニー、ブリッジＰＣＲ）、またはミクロンスケールのビーズの表面に（４５４（登録商標）、エマルジョンＰＣＲ）（それが回収されて整列され得る（エマルジョンＰＣＲ））、空間的にクラスター形成する。その配列決定方法は、酵素によって駆動される生化学反応とイメージングに基づくデータ取得との交互のサイクルを含む。これらのプラットフォームは、合成、すなわち、プライミングされた鋳型の連続的な伸長による配列決定に依存している。酵素的インターロゲーション（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）およびイメージングの継続的な繰り返しを用いることにより、各アレイの特徴に対して、連続したシーケンシングリードが構築される。各サイクル（例えば、ポリメラーゼによって組み込まれる蛍光標識ヌクレオチドの）各サイクル（例えば、ポリメラーゼによって組み込まれる蛍光標識ヌクレオチドの）において全アレイのイメージングによってデータが取得される。２つ以上の配列決定プライマーが、フローセル上に形成されたコロニーにおいて使用され得、それにより、二重末端（ｄｕａｌ−ｅｎｄ）配列決定、またはアンプリコンの１つ以上の他の部分（例えば、バーコードもしくはインデックスタグまたは実験用タグ）の配列決定が可能になる。

【0151】

４５４（登録商標）の場合、配列決定プライマーは、配列決定チップ／ビーズアンプリコン上での増幅後にＮＰＰＦにハイブリダイズする。配列決定は、パイロシーケンシングによって行われる。アンプリコンを有するビーズを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ポリメラーゼおよび一本鎖結合タンパク質とプレインキュベートし、次いで、微細加工アレイのピコリットルスケールのウェルに１ウェルあたり１ビーズで沈着させ、それによって、この生化学反応を、アレイに基づく配列決定に適合性にさせる。パイロシーケンシングに必要な固定化された酵素（ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼ）を有するより小さいビーズも加えられる。この配列決定では、セミオーダー（ｓｅｍｉ−ｏｒｄｅｒｅｄ）アレイの片側が、配列決定試薬を導入するためおよび除去するためのフローセルとして機能する。他方の側は、ＣＣＤに基づくシグナル検出のために光ファイバー束に固着されている。各サイクルでは、単一種の未標識ヌクレオチドが導入される。この導入が組み込みをもたらす配列の場合、ピロホスフェートが放出され、ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼによって特定のアレイ座標に対してＣＣＤによって検出される光のバーストが生成される。複数のサイクルにわたって、検出される組み込み事象のパターンから、個別のビーズによって表される鋳型の配列が明らかになる。

【0152】

ブリッジＰＣＲを使用する方法（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））の場合、増幅される配列の特徴は、ブリッジＰＣＲによって生成される。増幅中に任意の単一鋳型分子から生じるすべてのアンプリコンがアレイ上の単一の物理的位置に固定化され、クラスター形成したままになるように、順方向と逆方向の両方のＰＣＲプライマーを、可撓性リンカーによって固体の基材に繋留する。いくつかの例において、ブリッジＰＣＲは、Ｂｓｔポリメラーゼによる伸長と変性（例えば、ホルムアミドによる変性）との交互のサイクルを使用する。得られた「クラスター」の各々は、約１，０００個のクローナルアンプリコンからなる。数百万個のクラスターが、単一のフローセル上に存在する８つの独立した「レーン」の各々の中の区別可能な位置に増幅され得る（その結果、８つの独立した実験が、同じ機器のランにおいて平行して配列決定され得る）。クラスターが生成された後、アンプリコンは、直線化され、配列決定プライマーは、目的の領域に隣接する普遍的なアダプター配列にハイブリダイズされる。配列インターロゲーションの各サイクルは、改変されたＤＮＡポリメラーゼおよび４種のヌクレオチドの混合物を用いた単一塩基の伸長からなる。これらのヌクレオチドは、３’ヒドロキシル位における化学的に切断可能な部分が、各サイクルにおいて生じる単一塩基だけの組み込みを可能にする点、および４つの蛍光標識のうちの１つ（これも化学的に切断可能である）が、各ヌクレオチドのアイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に対応する点において「可逆性のターミネーター」である。単一塩基の伸長、および４つのチャネルにおけるイメージの取得の後、両方の基の化学的切断が、次のサイクルのために行われる。３６ｂｐまでのリード長が、現在、日常的に行われている。

【0153】

１つの例において、Ｈｅｌｉｃｏｓ（登録商標）またはＰａｃＢｉｏ（登録商標）一分子シーケンシング法が使用される。

【0154】

ＮＰＰＦは、現在開発されているまたは将来開発される任意の配列分析装置における任意の方法による配列決定のためにデザインされ得ることが認識されるだろう。ＮＰＰＦ自体は、使用される配列決定の方法を限定しないし、使用される酵素も限定しない。他の配列決定方法が、開発されているかまたは開発されるだろうし、当業者は、生成されるＮＰＰＦアンプリコン（またはＮＰＰＦにハイブリダイズしたＤＮＡ）が、これらのシステムにおける配列決定に適し得ることを認識し得る。

【0155】

Ｇ．コントロール
いくつかの実施形態において、本方法は、実際の実験ＮＰＰＦと同じ反応条件に供する１つ以上のポジティブおよび／またはネガティブコントロールの使用を包含する。タグ化の使用によって、試験サンプルと同じ配列決定レーンにおける配列決定およびランのために処理されることを除いては、実際の種々のサンプルをコントロールとして使用することが可能になる。標的ＲＮＡを測定するときの細胞数に対するコントロールとしてＤＮＡが測定され得る。

【0156】

いくつかの例において、「ポジティブコントロール」は、変数（例えば、各サンプルに対する溶解された細胞の数、ＤＮＡもしくはＲＮＡの回収率、またはハイブリダイゼーション効率）に対する内部正規化コントロール（例えば、１つ以上の基礎レベルまたは構成的ハウスキーピング遺伝子（例えば、構造遺伝子（例えば、アクチン、チューブリンまたはその他））またはＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写制御因子またはその他）に特異的な１つ以上のＮＰＰＦ、ＣＦＳ、対応するリンカーなど）を含む。いくつかの例において、ポジティブコントロールには、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ペプチジルプロリル（ｐｅｐｔｉｄｙｌｐｒｏｙｌｙｌ）イソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）、大リボソームタンパク質（ＲＰＬＰ０）、リボソームタンパク質Ｌ１９（ＲＰＬ１９）または下で述べられる他のハウスキーピング遺伝子が含まれる。サンプルとは無関係の、アッセイプロセスに対するコントロールのために、他のポジティブコントロールがサンプルに加えられ得る。

【0157】

他の例において、ポジティブコントロールには、サンプル中に存在すると判明しているＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、試験されている種におそらく存在する核酸配列、例えば、ハウスキーピング遺伝子）に特異的なＮＰＰＦが含まれる。例えば、対応するポジティブコントロールＮＰＰＦは、複数の試験ＮＰＰＦとのハイブリダイゼーションの前またはハイブリダイゼーション中にサンプルに加えられ得る。あるいは、ポジティブコントロールＮＰＰＦは、ヌクレアーゼ処理の後にサンプルに加えられる。

【0158】

いくつかの例において、ポジティブコントロールには、サンプル中に存在すると判明している核酸分子（例えば、試験されている種におそらく存在する核酸配列、例えば、ハウスキーピング遺伝子）が含まれる。対応するポジティブコントロール核酸分子（例えば、インビトロで転写された核酸または無関係なサンプルから単離された核酸）が、複数のＮＰＰＦとのハイブリダイゼーションの前またはハイブリダイゼーション中にサンプルに加えられ得る。

【0159】

いくつかの例において、「ネガティブコントロール」は、その相補鎖がサンプル中に存在しないと判明している１つ以上のＮＰＰＦ、ＣＦＳ、対応するリンカーなどを、例えば、ハイブリダイゼーション特異性に対するコントロールとして含む（例えば、試験されている種以外の種由来の核酸配列、例えば、ヒトの核酸が解析されているときは植物の核酸配列（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＡＰ２様エチレン応答性転写因子（ＡＮＴ））、または天然には見られない核酸配列）。

【0160】

いくつかの実施形態において、各ＮＰＰＦアンプリコンからのシグナルは、例えば、サンプル間の細胞性（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）の差異を説明するために、少なくとも１つのハウスキーピング核酸分子のシグナルに対して正規化される。例示的なハウスキーピング遺伝子としては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＳＤＨＡ（コハク酸デヒドロゲナーゼ）、ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ＨＢＳ１Ｌ（ＨＢＳ１様タンパク質）、β−アクチン（ＡＣＴＢ）、β−２ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）およびＡＨＳＰ（アルファヘモグロビン安定化タンパク質）のうちの１つ以上が挙げられる。当業者は、開示される方法におけるシグナルの正規化において使用するためのさらなるハウスキーピング遺伝子（リボソームタンパク質Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、リボソームタンパク質Ｓ２０（ＲＰＳ２０）、リボソームタンパク質Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、リボソームタンパク質Ｌ３７（ＲＰＬ３７）、リボソームタンパク質３８（ＲＰＬ３８）、オルニチンデカルボキシラーゼアンチザイム１（ＯＡＺ１）、ポリメラーゼ（ＲＮＡ）ＩＩ（ＤＮＡ依存性）ポリペプチドＡ、２２０ｋＤａ（ＰＯＬＲ２Ａ）、ｙｅｓ会合タンパク質１（ＹＡＰ１）、エステラーゼＤ（ＥＳＤ）、プロテアソーム（プロソーム（ｐｒｏｓｏｍｅ）、マクロペイン（ｍａｃｒｏｐａｉｎ））２６Ｓサブユニット、ＡＴＰアーゼ、１（ＰＳＭＣ１）、真核生物翻訳開始因子３、サブユニットＡ（ＥＩＦ３Ａ）または１８Ｓ ｒＲＮＡを含むがこれらに限定されない）を選択することができる（例えば、ｄｅ Ｊｏｎｇｅら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２：ｅ８９８，２００７；Ｓａｖｉｏｚｚｉら、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ６：２００，２００６；Ｋｏｕａｄｊｏら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：１２７，２００７を参照のこと；これらの各々は、参照により本明細書中に援用される）。正規化された値は、サンプル間またはアッセイ間で直接比較され得る（例えば、単一アッセイにおける２つの異なるサンプル間、または２つの別個のアッセイにおいて試験された同じサンプル間）。

【0161】

ＩＶ．フランキング配列を有するヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）
開示される方法は、１つ以上の標的核酸分子の検出および／または配列決定を、例えば、同時または同時発生的に、可能にする。標的核酸に基づいて、ＮＰＰＦは、本明細書中に示される基準を当業者の知識と組み合わせて使用して、開示される方法において使用するためにデザインされ得る。いくつかの例において、開示される方法は、特定の標的核酸分子を検出するための１つ以上の適切なＮＰＰＦの生成を含む。ＮＰＰＦは、種々の条件（公知であるかまたは経験的に決定される条件）下においてそのような標的がサンプル中に存在する場合、標的核酸またはその一部に特異的に結合する（またはそれに特異的に結合することができる）。

【0162】

ＮＰＰＦは、特定の各標的核酸配列に対して、その標的核酸配列に特異的な反応において少なくとも１つのＮＰＰＦが存在するように、標的核酸分子に相補的な領域を含む。例えば、検出されるかまたは配列決定される２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なる標的核酸配列が存在する場合、本方法は、それに対応して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なるＮＰＰＦを使用し得る（ここで、各ＮＰＰＦは、特定の標的に対応する）。したがって、いくつかの例において、本方法は、少なくとも２つのＮＰＰＦを使用し、ここで、各ＮＰＰＦは、異なる標的核酸分子に特異的である。しかしながら、いくつかの異なるＮＰＰＦが、特定の標的核酸分子（例えば、単一の標的核酸配列の多くの異なる領域）に対して生成され得ることが認識されるだろう。１つの例において、ＮＰＰＦは、そのトランスクリプトームにおける単一遺伝子だけに見られる配列に相補的な領域を含む。ＮＰＰＦは、標的核酸分子に特異的であるように、および類似のＴｍを有するように（同じ反応において使用される場合）デザインされる。

【0163】

したがって、単一のサンプルを、１つ以上のＮＰＰＦと接触させ得る。ＮＰＰＦのセットは、２つ以上のＮＰＰＦ（各々が、異なる標的および／または同じ標的の異なる部分に特異的である）の集合である。ＮＰＰＦのセットは、少なくとも、最大、またはちょうど、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、５０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００または１０，０００個の異なるＮＰＰＦを含み得る。いくつかの例において、サンプルを、そのようなＮＰＰＦに対する標的より過剰（例えば、１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍または１０^６倍過剰）であるのに十分量のＮＰＰＦと接触させる。いくつかの例において、ＮＰＰＦのセットが使用される場合、そのセットの各ＮＰＰＦは、サンプル中のそれぞれの標的（または標的の一部）に対して過剰に提供され得る。過剰なＮＰＰＦは、特定の標的に結合するＮＰＰＦの量の定量を促進し得る。いくつかの方法の実施形態は、同じＮＰＰＦまたはＮＰＰＦのセットと接触する複数のサンプル（例えば、少なくとも、最大、またはちょうど、１０、２５、５０、７５、１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００または１０，０００個の異なるサンプル）を同時または同時発生的に含む。

【0164】

図１は、標的核酸配列に特異的に結合するかまたはハイブリダイズする配列を含む領域１０２、ならびにそのＮＰＰＦの５’および３’末端におけるフランキング配列１０４、１０６（ここで、そのフランキング配列は、それらの相補的な配列（本明細書中でＣＦＳと称される）に結合するかまたはハイブリダイズする）を有する例示的なＮＰＰＦ１００を示している。ＮＰＰＦ（ならびにそのＮＰＰＦに結合するＣＦＳ）は、天然ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ））または非天然ヌクレオチド（例えば、ロックト核酸（ＬＮＡ，例えば、米国特許第６，７９４，４９９号を参照のこと）、ペプチド核酸（ＰＮＡ））などから構成され得る。ＮＰＰＦは、一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの例において、ＮＰＰＦは、１つ以上の合成塩基または代替塩基（例えば、イノシン）を含む。改変されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、合成または代替ヌクレオチドが、ＮＰＰＦにおいて１つ以上の位置（例えば、１、２、３、４、５個またはそれ以上の位置）において使用され得る。いくつかの例において、ＮＰＰＦにおける１つ以上の改変されたヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドの使用は、改変された核酸を含まない同じ長さおよび組成のＮＰＰＦのＴ_ｍと比べて、ＮＰＰＦのＴ_ｍを上昇させ得る。当業者は、所望のＴ_ｍを有するプローブを得るためにそのような改変されたヌクレオチドを含むプローブをデザインすることができる。１つの例において、ＮＰＰＦは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）などのＤＮＡまたはＲＮＡから構成される。１つの例において、ＮＰＰＦは、アプタマーである。

【0165】

特定の標的またはサンプル（例えば、固定されているかまたは架橋されているサンプル）とともに使用するのに適切なＮＰＰＦのサイズを経験的に決定する方法は、通例の方法である。特定の実施形態において、ＮＰＰＦは、最大５００ヌクレオチド長（例えば、最大４００、最大２５０、最大１００または最大７５ヌクレオチド長（例えば、２０〜５００、２０〜２５０、２５〜２００、２５〜１００、２５〜７５または２５〜５０ヌクレオチド長の範囲を含む））であり得る。１つの非限定的な例において、ＮＰＰＦは、少なくとも３５ヌクレオチド長（例えば、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０もしくは少なくとも２００ヌクレオチド長、例えば、５０〜２００、５０〜１００もしくは７５〜２００、または３６、７２もしくは１００ヌクレオチド長）である。特定のＮＰＰＦの実施形態は、所望の機能性に応じて、より長くてもよいし、より短くてもよい。いくつかの例において、ＮＰＰＦは、固定されているおよび／または架橋されているサンプルに浸透するために、適切なサイズにされる（例えば、十分小さい）。固定されているまたは架橋されているサンプルは、固定または架橋の程度が異なり得る；したがって、通常の当業者は、例えば、既知の濃度の固定された標的を有するサンプルを使用する一連の実験を行い、標的のシグナル強度とＮＰＰＦサイズを比較することによって、特定のサンプル条件またはサンプルタイプに対して適切なＮＰＰＦサイズを決定し得る。ＮＰＰＦの長さが長くなるにつれて、そのような実験では、ある時点において、標的シグナル強度が低下し始めるはずである。いくつかの例において、サンプル（およびゆえに、標的の少なくとも一部）は、固定されているかまたは架橋されており、ＮＰＰＦは、シグナル強度が高いままでありかつＮＰＰＦのサイズに応じて実質的に変動しないように十分に小さい。

【0166】

標的核酸配列に特異的に結合する配列１０２は、検出されるかまたは配列決定される標的核酸配列と、順序通り相補的である。当業者は、配列１０２が、標的核酸全体に相補的である必要はないことを認識するだろう（例えば、標的が、１００，０００ヌクレオチドの遺伝子である場合、配列１０２は、その一部（例えば、特定の標的核酸分子に相補的な、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００またはそれ以上連続したヌクレオチド）であり得る。プローブの特異性は、長さとともに高まる。したがって、例えば、２５個連続したヌクレオチドを含む標的核酸配列に特異的に結合する配列１０２は、たった１５ヌクレオチドの対応する配列よりも高い特異性で、標的配列にアニールする。したがって、本明細書中に開示されるＮＰＰＦは、特定の標的核酸分子に相補的な少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００またはそれ以上連続したヌクレオチド（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡに相補的な約６〜５０、１０〜４０、１０〜６０、１５〜３０、１８〜２３、１９〜２２または２０〜２５個連続したヌクレオチド）を含む標的核酸配列に特異的に結合する配列１０２を有し得る。本開示の方法を実施するために使用されるＮＰＰＦの一部であり得る標的核酸配列に特異的に結合する配列１０２の特定の長さとしては、標的核酸分子に相補的な６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個連続したヌクレオチドが挙げられる。標的核酸分子がｍｉＲＮＡ（またはｓｉＲＮＡ）であるいくつかの例において、標的核酸配列に特異的に結合する配列１０２の長さは、ｍｉＲＮＡ（またはｓｉＲＮＡ）の長さにマッチするために、より短い場合がある（例えば、２０〜３０ヌクレオチド長（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド））。しかしながら、当業者は、標的に特異的に結合する配列１０２が標的核酸分子に１００％相補的である必要はないことを認識するだろう。反応条件、および使用されるヌクレアーゼの対応する選択性に応じて、ヌクレアーゼ消化を起こすために、２つ以上のミスマッチが必要になる場合もある（例えば、少なくとも２つの隣接するミスマッチ）。いくつかの例において、ＮＰＰＦは、１つ以上の位置（例えば、１、２、３、４、５個またはそれ以上の位置）において縮重している（例えば、標的に特異的に結合する配列１０４の特定の位置におけるヌクレオチドの混合物（例えば、２、３または４つのヌクレオチド））。

【0167】

配列１０２は、プログラミングリンカーまたは二機能性リンカーにも特異的に結合する（ここで、二機能性リンカーの領域は、配列１０２に相補的である）。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の後に、少なくとも捕捉分子（例えば、プログラミングリンカーと会合したアンカーまたはＮＰＰＦアンプリコンの一部（例えば、フランキング配列またはその一部）に相補的な配列を含む核酸捕捉プローブ））を含む表面（例えば、複数の空間的に不連続の領域を含む表面）とサンプルを接触させる。図３に示されるように、二機能性リンカー２１６は、アンカー２１４に特異的に結合する（例えば、相補的である）第１の部分、およびＮＰＰＦアンプリコン２１０の領域に特異的に結合する（例えば、相補的である）第２の部分を含む。いくつかの例において、ＮＰＰＦアンプリコンは、二機能性リンカーに相補的な少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個連続したヌクレオチドを有する。

【0168】

フランキング配列１０４、１０６の配列は、増幅プライマーの少なくとも一部に相補的な普遍的な増幅点を提供し得る。したがって、異なる標的核酸分子に特異的なＮＰＰＦを増幅するために同じ増幅プライマーを使用することができるので、フランキング配列は、多重化を可能にする。そのフランキング配列は、標的ゲノムに見られる配列と似ていない。例えば、標的核酸が、ヒトの配列である場合、フランキング配列の配列は、その標的ゲノムに見られる配列と似ていない。これは、ＮＰＰＦとの結合から、標的ゲノムに存在し得る非標的配列の結合を減少させるのを助ける。ゲノムとの類似性について配列を解析する方法は、当該分野で周知である。

【0169】

フランキング配列１０４、１０６は、ＮＰＰＦアンプリコンの捕捉、例えば、基材への捕捉を可能にするためにも使用することができる。例えば、表面（例えば、ある表面に直接結合体化される表面）上に存在する核酸捕捉プローブに相補的な配列を含むフランキング配列を含むＮＰＰＦは、表面へのＮＰＰＦアンプリコンの捕捉または結合を可能にする核酸捕捉プローブにハイブリダイズし得る。したがって、いくつかの例において、フランキング配列は、実験用タグ（例えば、ＮＰＰＦアンプリコンの捕捉を可能にするタグ）を含む（または例えば、増幅中に、そのタグの付加を可能にする）。他の実験用タグ（例えば、ＮＰＰＦまたはＮＰＰＦの集団をユニークに識別するために使用されるタグ）も使用され得ること、およびそのような実験用タグが、ＮＰＰＦの一部であり得るか、または例えば、フランキング配列に相補的であり、かつ得られたアンプリコンに付加されるタグに相補的な配列も含む、プライマーを使用することによって、後で付加され得ることが認識されるだろう。フランキング配列は、例えば、ＮＰＰＦの増幅中の、またはフランキング配列に相補的な標識されたプローブを使用し、そのプローブがＮＰＰＦに結合することを可能にすることによって、ＮＰＰＦの標識も可能にする。いくつかの例において、フランキング配列は、シーケンシングアダプター（ａｄａｐａｔｅｒ）（例えば、いくつかのシーケンシングプラットフォームに必要とされるポリＡまたはポリＴ配列）を含む（または例えば、増幅中に、その付加を可能にする）。

【0170】

ＮＰＰＦが、１つまたは２つのフランキング配列（例えば、５’末端に存在するもの、３’末端に存在するものまたはその両方）を含み得ること、およびフランキング配列が、同じであり得るかまたは異なり得ることが認識されるだろう。図６ＡおよびＢに図示されるように、ＮＰＰＦは、単一のフランキング配列を含み得る。図６Ａおよび６Ｂは、５’末端におけるフランキング配列を示しているが、その代わりに３’末端に存在し得ることも認識されるだろう。図６Ａは、反応物中のＮＰＰＦのすべてが同じフランキング配列Ｆ１を有する例を示している。Ｆ１特異的プライマー（例えば、標識されたプライマー）を用いる増幅は、同じ５’または３’タグ（例えば、シーケンシングアダプターまたは実験用タグ）を各ＮＰＰＦに付加するために使用され得る。例えば、同じシーケンシングアダプターが、すべてのＮＰＰＦに付加され得、同じシーケンシングプラットフォームにおいてＮＰＰＦの配列決定が可能になる。図６Ｂは、反応物中の各ＮＰＰＦ（またはＮＰＰＦの各部分集団）が異なるフランキング配列Ｆ１〜Ｆ３を有する例を示している。例えば、Ｆ１、Ｆ２およびＦ３は、それぞれ、表面上の捕捉核酸プローブ１、２および３に相補的であり得る。これにより、二機能性リンカーの必要はなくなる（例えば、図３の下を参照のこと）。別の例において、Ｔ１−Ｆ１特異的、Ｔ２−Ｆ２特異的およびＴ３−Ｆ３特異的プライマーを用いる増幅は、異なる実験用タグを異なる各ＮＰＰＦ（またはＮＰＰＦの集団）に付加するために使用され得る。

【0171】

図６Ｃ〜６Ｆに図示されているように、ＮＰＰＦは、いくつかの例において、２つのフランキング配列を含み得る（一方はＮＰＰＦの５’末端に存在し、他方は３’末端に存在する）。図６Ｃは、反応物中のＮＰＰＦのすべてが、両端に同じフランキング配列Ｆ１を有する例を示している。図６Ｄは、５’末端におけるフランキング配列のすべてが同じ（例えば、Ｆ１）であり、３’末端におけるフランキング配列のすべてが同じ（例えば、Ｆ（ａ））であるが、５’末端フランキング配列と３’末端フランキング配列とは異なる例を示している。そのような例において、これは、例えば、ＮＰＰＦの一方の末端に同じ実験用タグを含めること、および例えば、ＮＰＰＦの他方の末端に同じシーケンシングアダプターを含めることを可能にする。プライマーハイブリダイゼーションの偏りが存在しないので、各ＮＰＰＦは、同じ忠実度でタグ化されるはずである。図６Ｅは、一方の末端におけるフランキング配列のすべてが同じ（例えば、５’末端においてＦ１）であるが、他方の末端におけるフランキング配列のすべてが互いに異なる（例えば、Ｆ（ａ）、Ｆ（ｂ）およびＦ（ｃ））例を示している。そのような例において、これは、ＮＰＰＦのすべてを捕捉するために単一の捕捉プローブを使用することを可能にする（例えば、Ｆ１に相補的な配列の少なくとも一部を有する捕捉プローブを使用して）。他方の末端におけるフランキング配列Ｆ（ａ）、Ｆ（ｂ）およびＦ（ｃ）は、例えば、各ＮＰＰＦを異なって標識するために使用され得る（例えば、異なる実験タグを使用して）。あるいは、Ｆ（ａ）、Ｆ（ｂ）およびＦ（ｃ）は、それぞれ捕捉プローブ１、２および３に相補的であり得、Ｆ１が、ＮＰＰＦのすべてを同じ方法で標識するために使用され得る。図６Ｆは、フランキング配列のすべてが、それらの位置に関係なく異なる例を示している（例えば、Ｆ（ａ）、Ｆ（ｂ）、Ｆ（ｃ）、Ｆ１、Ｆ２およびＦ３）。この例では、各フランキング配列は、異なる実験タグまたは異なる実験タグと異なるシーケンシングアダプターとの組み合わせに対して使用され得る。

【0172】

したがって、ＮＰＰＦ配列は、１−２−３によって表すことができ、ここで、１および３は、配列２（標的核酸に相補的である）のいずれかの側におけるフランキング配列である。これらの領域の各々は、その方法におけるある時点においてその相補的な配列にハイブリダイズし得る。例えば、Ａは、ＮＰＰＦのフランキング配列１に相補的であり得（例えば、Ａは、配列１に相補的なＣＦＳであり得）、Ｂは、ＮＰＰＦの配列２に相補的であり得（例えば、配列２に相補的な標的配列）、Ｃは、ＮＰＰＦのフランキング配列３に相補的であり得る（例えば、Ｃは、配列３に相補的なＣＦＳであり得る）。これは、標的核酸分子およびＣＦＳと、それらの対応するＮＰＰＦとのハイブリダイゼーション中に生じるものである。例えば：
１−２−３
Ａ−Ｂ−Ｃ
いくつかの例において、実験用タグ（例えば、実験または患者を互いに区別するタグ）およびシーケンシングアダプター（それぞれＤおよびＥで表される）は、例えば、増幅中に、フランキング配列を使用して付加される（増幅プライマーは、フランキング配列に相補的であり、得られるＮＰＰＦアンプリコンに付加されるタグまたはアダプターに相補的な配列を含む）。例えば、そのようなプライマーを用いたＮＰＰＦの増幅は、以下のとおりの配列を生じ得る：Ｅ−１−２−３−ＤまたはＤ−１−２−３−Ｅ。

【0173】

下記の表は、５’−タグ（例えば、実験用タグまたはシーケンシングアダプター（ａｄｐａｔｅｒｓ））、５’−フランキング配列、標的特異的配列、３’−フランキング配列および３’−タグの５つの例示的な組み合わせも示している。これらの５’−タグおよび３’−タグは、増幅中に付加される。５’−フランキング配列および３’−フランキング配列は、元のＮＰＰＦの一部（およびゆえに、フランキング配列自体の一部）である配列である。

【0174】

【表2-1】

特定の例において、各フランキング配列は、他の任意のＮＰＰＦ配列（例えば、配列１０２または他のフランキング配列）またはサンプルの任意の成分に特異的に結合しない。いくつかの例において、２つのフランキング配列が存在する場合、フランキング配列１０４、１０６の各々の配列は、異なる。理想的には、２つの異なるフランキング配列（例えば、同じＮＰＰＦ上の２つの異なるフランキング配列および／またはＮＰＰＦセットにおける他のＮＰＰＦのフランキング配列）が存在する場合、フランキング配列１０４、１０６の各々は、類似の融解温度（Ｔ_ｍ）（例えば、互いの＋／−約１０℃または＋／−５℃、例えば、＋／−４℃、３℃、２℃または１℃のＴ_ｍ）を有する。

【0175】

特定の例において、フランキング配列１０４、１０６は、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０または少なくとも５０ヌクレオチド長、例えば、１２〜５０または１２〜３０ヌクレオチド、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長）であり、ここで、その連続したヌクレオチドは、試験されるサンプル中に存在する核酸分子に見られない。それらのフランキング配列は、フランキング配列に相補的な配列（ＣＦＳ）を有する分子をフランキング配列にハイブリダイズすることによって、ヌクレアーゼによる分解から保護される。

【0176】

ＮＰＰＦ−標的およびＮＰＰＦ−ＣＦＳのハイブリダイゼーションの特異性に影響する因子としては、ＮＰＰＦおよびＣＦＳの長さ、融解温度、自己相補性ならびに反復配列またはユニークでない配列の存在が挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９２（および２０００までの補遺）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９を参照のこと。特定の程度のハイブリダイゼーション（ストリンジェンシー）をもたらす条件は、ハイブリダイゼーション方法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変動し得る。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（例えば、Ｎａ^＋濃度）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定し得る。いくつかの例において、開示される方法において使用されるＮＰＰＦは、少なくとも約３７℃、少なくとも約４２℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、少なくとも約８０℃、例えば、約４２℃〜８０℃（例えば、約３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０℃）のＴ_ｍを有する。１つの非限定的な例において、開示される方法において使用されるＮＰＰＦは、約４２℃のＴ_ｍを有する。プローブのＴ_ｍを計算する方法は、当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１，Ｃｈａｐｔｅｒ １０を参照のこと）。いくつかの例において、特定の反応のためのＮＰＰＦの各々は、サンプル中の複数の標的核酸分子の同時の検出または配列決定を促進するために、同じまたは類似のＴ_ｍ（例えば、互いの＋／−約１０℃、例えば、互いの＋／−１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃または１℃のＴ_ｍ）を有するように選択される。

【0177】

Ａ．フランキング配列
ＮＰＰのフランキング配列の一方または両方（例えば、図１の１０４または１０６）は、普遍的な増幅点を提供する配列を含む。そのような配列は、増幅プライマーの少なくとも一部に相補的である。これにより、プライマーがＮＰＰＦにハイブリダイズすることおよびＮＰＰＦを増幅することが可能になる。フランキング配列は、種々の標的核酸分子に特異的なＮＰＰＦ間で同一であり得るので、これにより、任意の数の異なるＮＰＰＦを増幅するために同じプライマーを使用することが可能になる。例えば、ＮＰＰＦは、５’−フランキング配列および３’−フランキング配列を含み得、ここで、その５’−および３’−フランキング配列は、互いに異なるが、種々の標的に対する複数のＮＰＰＦにとって同じである。したがって、複数のＮＰＰＦが、異なる標的配列に特異的であったとしても、５’−フランキング配列に相補的な配列を含む増幅プライマーと、３’−フランキング配列に相補的な配列を含む増幅プライマーとの両方が、それらのＮＰＰＦを増幅するために、単一の反応において使用され得る。

【0178】

いくつかの例において、フランキング配列は、実験タグ配列および／またはシーケンシングアダプター配列を含まない。いくつかの例において、フランキング配列は、実験タグ配列および／もしくはシーケンシングアダプター配列を含むかまたは実験タグ配列および／もしくはシーケンシングアダプター配列からなる。他の例において、ＮＰＰＦを増幅するために使用されるプライマーは、実験タグ配列および／またはシーケンシングアダプター配列を含み、ゆえに、ＮＰＰＦの増幅中に実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターをＮＰＰＦアンプリコンに組み込むことが可能になる。

【0179】

１つの例において、フランキング配列は、その配列がそれ自体においてループを形成するようにデザインされる。したがって、フランキング配列の１つの領域は、同じフランキング配列の第２の領域に相補的であり、第１の領域と第２の領域とが互いにハイブリダイズすることにより、ループまたはヘアピンが形成される。これにより、第２の領域がヌクレアーゼ工程中に第１の領域を保護し得るので、ＣＦＳが必要でなくなり得る。

【0180】

Ｂ．フランキング配列に結合するプライマー
フランキング配列に特異的に結合するかまたはハイブリダイズする増幅プライマーは、ＰＣＲ増幅などの増幅を開始するために使用され得る。さらに、それらの増幅プライマーは、核酸タグ（例えば、実験タグまたはシーケンシングアダプター）および／または検出可能な標識をＮＰＰＦに導入するために使用され得る。例えば、フランキング配列に相補的な領域を有する増幅プライマーに加えて、その増幅プライマーは、得られるＮＰＰＦアンプリコンに実験タグ、シーケンシングアダプター、検出可能な標識またはそれらの組み合わせを付加する核酸配列を有する第２の領域も含み得る。実験タグまたはシーケンシングアダプターは、ＮＰＰＦの５’および／または３’末端に導入され得る。いくつかの例において、２つ以上の実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターは、例えば、２つ以上の実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターを付加する核酸配列を有する単一のプライマーを使用して、ＮＰＰＦアンプリコンの単一の末端または両端に付加される。例えば、１つのサンプルもしくは配列を別のものと区別するため、または基材によるＮＰＰＦアンプリコンの捕捉を可能にするために、実験タグが使用され得る。配列タグは、特定のシーケンシングプラットフォームによる得られたＮＰＰＦアンプリコンの捕捉を可能にする。

【0181】

検出可能な標識は、５’および／または３’末端を含むＮＰＰＦの任意の点に導入され得る。１つの例において、その標識は、ＮＰＰＦアンプリコンに相補的な標識されたプローブのハイブリダイゼーションによって、ＮＰＰＦアンプリコンに導入される。１つの例において、その標識は、標識されたプライマーを使用することによって、ＮＰＰＦの増幅中にＮＰＰＦアンプリコンに導入され、それにより、標識されたＮＰＰＦアンプリコンが生成される。検出可能な標識は、ＮＰＰＦアンプリコンの検出を可能にする。

【0182】

いくつかの例において、そのようなプライマーは、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０または少なくとも５０ヌクレオチド（例えば、２５ヌクレオチド））である。いくつかの例において、それらのプライマーは、ＮＰＰＦアンプリコンに組み込まれる、ビオチンなどの検出可能な標識を含む（そしてそのようなプライマーは、プローブと称され得る）。

【0183】

Ｃ．実験タグの付加
実験用タグは、生成されたとき、ＮＰＰＦの一部であり得る（例えば、フランキング配列の一部であり得る）。別の例において、実験タグは、後で、例えば、ＮＰＰＦの増幅中に、付加されて、実験用タグを含むＮＰＰＦアンプリコンをもたらす。ＮＰＰＦ上に普遍的なフランキング配列が存在するおかげで、例えば増幅中に、ＮＰＰＦ上に他の配列を導入し得る普遍的なプライマーを使用することが可能になる。

【0184】

実験タグ（例えば、１つのサンプルを別のサンプルと区別するタグ）は、ＮＰＰＦと会合した特定の標的配列を識別するため、または基材によるＮＰＰＦアンプリコンの捕捉を可能にするために使用され得る（ここで、その実験タグは、その基材上の捕捉プローブに相補的であり、それにより、それらの２つのハイブリダイゼーションが可能になる）。１つの例において、実験タグは、ＮＰＰＦまたはＮＰＰＦアンプリコンの５’および／または３’末端の最初の３、５、１０、２０または３０ヌクレオチドである。

【0185】

１つの例において、実験タグは、１つのサンプルを別のサンプルと区別するために使用される。例えば、そのような配列は、検出される特定の配列を特定のサンプル、患者または実験（例えば、特定の反応ウェル、日または反応条件セット）と相関させるバーコードとして機能し得る。これにより、検出されるかまたは配列決定される特定のＮＰＰＦを、例えば、特定の患者またはサンプルまたは実験と関連付けることが可能になる。複数のＮＰＰＦアンプリコンが、タグ化され得、次いで、例えば、単一の配列決定ランまたは検出アレイにおいて、組み合され得るので（例えば、種々の実験または患者から）、そのようなタグを使用することにより、１サンプルあたりのコストを低下させる方法およびサンプル処理量を増加させる方法が提供される。これにより、種々の実験サンプルまたは患者サンプルを同じ機器チャネル内での単一のランに組み合わせることが可能になる。例えば、そのようなタグは、１００または１，０００個の異なる実験を単一のチャネル内での単一のランにおいて配列決定するのを可能にする。例えば、１チャネルあたり１００個のサンプルをプールする場合、８，０００個のサンプルが、８チャネル配列分析装置の単一のランにおいて試験され得る。さらに、本方法が、完了した増幅反応物をゲル精製する工程を包含する（または実際の分離を必要としない精製または浄化の他の方法）場合、検出または配列決定の１ランあたりただ１つのゲル（または浄化もしくは精製の反応もしくはプロセス）が実行される必要があるだけである。次いで、配列決定されるＮＰＰＦアンプリコンは、例えば、実験タグによって、選別され得る。

【0186】

１つの例において、実験タグは、ＮＰＰＦと会合した特定の標的配列を識別するために使用される。ＮＰＰＦ全体の代わりにＮＰＰＦの末端を配列決定することで十分であり得るので、この場合、特定の標的配列に対応する実験用タグを使用することは、必要とされる配列決定の時間を短縮し得るか、またはその配列決定の量を減少させ得る。例えば、そのような実験タグが、ＮＰＰＦアンプリコンの３’末端上に存在する場合、ＮＰＰＦにハイブリダイズした標的配列を識別するために、ＮＰＰＦアンプリコン配列自体の全体を配列決定しなくてよい。その代わり、実験タグを含むＮＰＰＦアンプリコンの３’末端だけを配列決定する必要がある。これは、配列決定するためにより少ない材料しか必要とされないので、配列決定の時間および資源を有意に減少させ得る。

【0187】

１つの例において、実験タグは、ＮＰＰＦの捕捉を可能にするため（例えば、サンプルからのＮＰＰＦまたはＮＰＰＦアンプリコンを濃縮するため）に使用される。例えば、実験タグは、基材表面上の捕捉プローブの少なくとも一部の配列に相補的な配列を有し、それにより、ＮＰＰＦと捕捉プローブとのハイブリダイゼーションが可能になり得る。例えば、増幅後、実験用タグを含むＮＰＰＦアンプリコン（例えば、同じ実験用タグを含むＮＰＰＦアンプリコンの集団）は、実験用タグに相補的な配列を有する複数の捕捉プローブを含む基材（例えば、磁気ビーズ）とサンプルをインキュベートすることによって、他の材料から単離され得る。それらを捕捉した後、ＮＰＰＦアンプリコンは、検出され得るか、もしくは配列決定され得るか、またはさらなる解析のためにその基材から放出され得る。１つの例において、その基材は、磁気ビーズであり、ＮＰＰＦアンプリコンを含むＰＣＲ反応物が、ビーズとともにインキュベートされる。次いで、それらのビーズは磁場に保持されるが、サンプル溶液（望まれない核酸分子および他の材料を含む）は除去される。捕捉されたＮＰＰＦは、リバースハイブリダイゼーションによって（例えば、塩基の添加および加熱によって）より少量に溶出され得る。同様の方法（例えば、固体基材およびフロースルーデバイスを使用することによる方法）が、他のＮＰＰＦおよび他の基材とともに使用され得、それにより、捕捉されたＮＰＰＦが、より少量に溶出されることが認識されるだろう。ハプテンが、増幅中に付加される場合、それは、捕捉のために使用され得る。そのような方法の１つの利点は、ＮＰＰＦまたはＮＰＰＦアンプリコンが、大量のサンプル（例えば、１ｍｌの血漿）から単離され、アッセイのために使用されるより少量（例えば、２０μｌ）に溶出され得る点である。

【0188】

実験用タグは、増幅（例えば、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）増幅または２段階増幅）のためにも使用され得る。

【0189】

特定の例において、実験タグは、少なくとも３ヌクレオチド長（例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０または少なくとも５０ヌクレオチド長、例えば、３〜５０、３〜２０、１２〜５０または１２〜３０ヌクレオチド、例えば、３、５、１０、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長）である。

【0190】

Ｄ．シーケンシングアダプターの付加
シーケンシングアダプターは、生成されたとき、ＮＰＰＦの一部（例えば、フランキング配列の一部）であり得る。別の例において、シーケンシングアダプターは、後で、例えば、ＮＰＰＦの増幅中に、付加されて、シーケンシングアダプターを含むＮＰＰＦアンプリコンをもたらす。ＮＰＰＦ上に普遍的なフランキング配列が存在するおかげで、例えば増幅中に、ＮＰＰＦ上に他の配列を導入し得る普遍的なプライマーを使用することが可能になる。

【0191】

シーケンシングアダプターは、特定のシーケンシングプラットフォームにとって必要な配列をＮＰＰＦアンプリコン（ａｍｐｉｌｃｏｎ）に付加するために使用され得る。例えば、いくつかのシーケンシングプラットフォーム（例えば、４５４およびＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム）は、配列決定される核酸分子が、その５’および／または３’末端に特定の配列（例えば、配列決定される分子を捕捉するための配列）を含むことを要求する。例えば、適切なシーケンシングアダプターは、配列決定チップまたはビーズ上の相補的配列によって認識され、ＮＰＰＦは、シーケンシングアダプターが存在することによって捕捉される。

【0192】

１つの例において、ポリＡ（またはポリＴ）、例えば、少なくとも１０ヌクレオチド長のポリＡまたはポリＴが、ＰＣＲ増幅中にＮＰＰＦに付加される。特定の例において、ポリＡ（またはポリＴ）は、ＮＰＰＦの３’末端に付加される。いくつかの例において、この付加される配列は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）を使用して、その３’末端においてポリアデニル化される。

【0193】

特定の例において、付加される配列決定タグは、少なくとも１２ヌクレオチド（ｎｔ）長（例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０または少なくとも５０ｎｔ長、例えば、１２〜５０または１２〜３０ｎｔ、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ｎｔ長）である。

【0194】

Ｅ．検出可能な標識
いくつかの例において、開示されるＮＰＰＦ、ＰＣＲプライマーまたはその両方が、１つ以上の検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、当該分野で周知である。検出可能な標識は、サンプル中のＮＰＰＦまたはＮＰＰＦアンプリコン（例えば、結合したまたはハイブリダイズしたプローブ）の存在または濃縮を示唆する検出可能なシグナルを生成するために使用され得る分子または材料である。したがって、標識されたＮＰＰＦは、サンプル中の標的核酸配列（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡ）の存在または濃縮の指標を提供する。本開示は、特定の標識の使用に限定されないが、例が提供される。

【0195】

いくつかの例において、標識は、ＮＰＰＦの合成中にＮＰＰＦに組み込まれる。いくつかの例において、標識は、例えば、標識されたプライマーを使用して、増幅中にＮＰＰＦに組み込まれる（したがって、標識されたＮＰＰＦアンプリコンが生成される）。なおも他の例において、ＮＰＰＦは、そのＮＰＰＦ（例えば、ＮＰＰＦアンプリコン）の一部（例えば、ＮＰＰＦのフランキング領域）に相補的、ゆえにそれにハイブリダイズする、標識されたプローブを使用することによって、標識される。

【0196】

いくつかの例において、開示される方法において使用される複数のＮＰＰＦに含まれるＮＰＰＦの各々は、同じ検出可能な標識で標識される。他の例において、少なくとも１つのＮＰＰＦが、複数のＮＰＰ中の少なくとも１つの他のＮＰＰＦとは異なる検出可能な標識で標識される。例えば、複数のＮＰＰＦに含まれる少なくとも１つのＮＰＰＦは、フルオロフォア（例えば、Ｃｙ−３^ＴＭ）で標識され得、複数のＮＰＰに含まれる少なくとも１つのＮＰＰＦは、異なるフルオロフォア（例えば、Ｃｙ−５^ＴＭ）で標識され得る。いくつかの例において、複数のＮＰＰＦは、少なくとも２、３、４、５、６個またはそれ以上の異なる検出可能な標識を含み得る。同様に、本明細書中に提供される方法において使用される増幅プライマーは、同じまたは異なる検出可能な標識で標識され得る。

【0197】

１つ以上の核酸分子（例えば、ＮＰＰＦまたは増幅プライマー）と会合した標識は、直接または間接的に検出され得る。標識は、任意の公知の機序または未だ発見されていない機序（光子（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外周波数、可視周波数および紫外周波数の光子を含む）の吸収、放射および／または散乱を含む）によって検出され得る。検出可能な標識としては、有色、蛍光性、電子発光性、リン光性および発光性の分子および材料、１つの物質を別の物質に変換して検出可能な差異を提供する（例えば、無色の物質を有色の物質に変換するかもしくはその逆によって、または沈殿物を生成するかもしくはサンプル濁度を高めることによって）触媒（例えば、酵素）、ハプテンならびに常磁性および磁性の分子または材料が挙げられる。さらなる検出可能な標識としては、ラマン（光散乱）標識（例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ（登録商標）ｂｉｏｔａｇｓ，Ｏｘｏｎｉｃａ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）が挙げられる。他の例示的な検出可能な標識としては、ジゴキシン、エネルギー転移およびエネルギークエンチング対（例えば、ＦＲＥＴ）の使用、ＩＲならびに吸光度／比色標識が挙げられる。

【0198】

非限定的な例において、ＮＰＰＦまたはプライマーは、ハプテン分子（例えば、ニトロ芳香族化合物（例えば、ジニトロフェニル（ＤＮＰ））、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニンなど）に共有結合的に付着されたｄＮＴＰで標識される。ハプテンおよび他の標識をｄＮＴＰに結合体化するための方法（例えば、標識されたプローブへの組み込みを促進するために）は、当該分野で周知である。手順の例として、例えば、米国特許第５，２５８，５０７号、同第４，７７２，６９１号、同第５，３２８，８２４号および同第４，７１１，９５５号を参照のこと。標識は、ｄＮＴＰに、そのｄＮＴＰ上の任意の位置（例えば、リン酸（例えば、α、βまたはγリン酸）または糖）において直接または間接的に付着され得る。いくつかの例において、標識された核酸分子の検出は、ハプテン−標識ＮＰＰを１次抗ハプテン抗体と接触させることによって達成され得る。１つの例において、１次抗ハプテン抗体（例えば、マウス抗ハプテン抗体）は、酵素で直接標識される。別の例において、酵素に結合体化された二次抗抗体（例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体）が、シグナル増幅のために使用される。他の例において、ハプテンは、ビオチンであり、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））に結合体化されたアビジンまたはストレプトアビジンとハプテン標識ＮＰＰＦを接触させることによって検出される。

【0199】

検出可能な標識のさらなる例としては、蛍光分子（または蛍光色素）が挙げられる。数多くの蛍光色素が当業者に公知であり、それらは、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（以前はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から選択され得る。例えば、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを参照のこと。核酸分子（例えば、ＮＰＰＦ）に付着され得る（例えば、化学的に結合体化され得る）特定のフルオロフォアの例は、Ｎａｚａｒｅｎｋｏらに対する米国特許第５，８６６，３６６号に提供されており、例えば、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジンおよび誘導体（例えば、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート）、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ、クマリンおよび誘導体（例えば、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，Ｃｏｕｍａｒｉｎ１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（Ｃｏｕｍａｒｉｎ １５１））；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ，塩化ダンシル）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体（例えば、エオシンおよびエオシンイソチオシアネート）；エリスロシンおよび誘導体（例えば、エリスロシンＢおよびエリスロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体（例えば、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）；２’，７’−ジフルオロフルオレセイン（ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ（登録商標））；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体（例えば、ピレン、ピレンブチレートおよびスクシンイミジル１−ピレンブチレート）；Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体（例えば、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１およびスルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ））；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸およびテルビウムキレート誘導体である。

【0200】

他の好適なフルオロフォアとしては、およそ６１７ｎｍで放射するチオール反応性ユウロピウムキレート（Ｈｅｙｄｕｋ ａｎｄ Ｈｅｙｄｕｋ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８：２１６−２７，１９９７；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３１５−２２，１９９９）、ならびにＧＦＰ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ^ＴＭ、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミンおよびキサンテン（Ｌｅｅらに対する米国特許第５，８００，９９６号に記載されているような）およびそれらの誘導体が挙げられる。当業者に公知の他のフルオロフォア（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））から入手可能なもの、およびＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）シリーズの色素（例えば、米国特許第５，６９６，１５７号、同第６，１３０，１０１号および同第６，７１６，９７９号に記載されているような）、ＢＯＤＩＰＹシリーズの色素（ジピロメテンボロンジフルオリド色素、例えば、米国特許第４，７７４，３３９号、同第５，１８７，２８８号、同第５，２４８，７８２号、同第５，２７４，１１３号、同第５，３３８，８５４号、同第５，４５１，６６３号および同第５，４３３，８９６号に記載されているような）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（米国特許第５，１３２，４３２号に記載されているスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）およびＭａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（米国特許第５，８３０，９１２号）を含む）も使用され得る。

【0201】

蛍光標識は、上に記載された蛍光色素に加えて、蛍光ナノ粒子（例えば、半導体ナノ結晶、例えば、ＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ^ＴＭ（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ Ｃｏｒｐ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得られる）であり得る；米国特許第６，８１５，０６４号；同第６，６８２，５９６号；および同第６，６４９，１３８号も参照のこと）。半導体ナノ結晶は、サイズ依存性の光学特性および／または電気特性を有する微小粒子である。半導体ナノ結晶が、一次エネルギー源で照射されると、その半導体ナノ結晶において使用されている半導体材料のバンドギャップに対応する周波数のエネルギーの二次放射が生じる。この放射は、特定の波長の有色光または蛍光として検出され得る。種々のスペクトル特性を有する半導体ナノ結晶は、例えば、米国特許第６，６０２，６７１号に記載されている。例えば、Ｂｒｕｃｈｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２０１３−２０１６，１９９８；Ｃｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２０１６−２０１８，１９９８；および米国特許第６，２７４，３２３号に記載されている手法によって、種々の生物学的分子（ｄＮＴＰおよび／または核酸を含む）または基材に結合され得る半導体ナノ結晶。

【0202】

様々な組成の半導体ナノ結晶の形成は、例えば、米国特許第６，９２７，０６９号；同第６，９１４，２５６号；同第６，８５５，２０２号；同第６，７０９，９２９号；同第６，６８９，３３８号；同第６，５００，６２２号；同第６，３０６，７３６号；同第６，２２５，１９８号；同第６，２０７，３９２号；同第６，１１４，０３８号；同第６，０４８，６１６号；同第５，９９０，４７９号；同第５，６９０，８０７号；同第５，５７１，０１８号；同第５，５０５，９２８号；同第５，２６２，３５７号および米国特許公開番号２００３／０１６５９５１、ならびにＰＣＴ公開番号９９／２６２９９（１９９９年５月２７日に公開）に開示されている。異なるスペクトル特性に基づいて識別可能な半導体ナノ結晶の別個の集団が生成され得る。例えば、その組成、サイズまたはサイズおよび組成に基づいて異なる色の光を発する半導体ナノ結晶が生成され得る。例えば、サイズに基づいて種々の波長（５６５ｎｍ、６５５ｎｍ、７０５ｎｍまたは８００ｎｍの発光波長）で発光する、本明細書中に開示されるプローブにおける蛍光標識として好適な、量子ドットが、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手可能である。

【0203】

さらなる標識としては、例えば、放射性同位体（例えば、^３Ｈ）、金属キレート（例えば、放射性または常磁性の金属イオン（Ｇｄ^３＋のような）のＤＯＴＡおよびＤＰＴＡキレート）およびリポソームが挙げられる。

【0204】

核酸分子（例えば、ＮＰＰＦまたは増幅プライマー）とともに使用され得る検出可能な標識には、酵素、例えば、ＨＲＰ、ＡＰ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼまたはβ−ラクタマーゼも含まれる。検出可能な標識が、酵素を含む場合、色素原、蛍光発生化合物または発光性（ｌｕｍｉｎｏｇｅｎｉｃ）化合物が、その酵素と組み合わせて使用されることにより、検出可能なシグナルを発生し得る（数多くのそのような化合物は、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから商業的に入手可能である）。色素生産性化合物の特定の例としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ファストブルー、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＡＰ Ｏｒａｎｇｅ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルーおよびテトラゾリウムバイオレットが挙げられる。

【0205】

あるいは、金属組織検出スキームでは、酵素が使用され得る。金属組織検出方法としては、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）を、水溶性の金属イオンおよびその酵素の酸化還元不活性基質とともに使用することが挙げられる。その基質は、その酵素によって酸化還元活性な物質に変換され、その酸化還元活性な物質は、その金属イオンを還元して、検出可能な沈殿物を形成させる。（例えば、米国特許出願公開番号２００５／０１００９７６、ＰＣＴ公開番号２００５／００３７７７および米国特許出願公開番号２００４／０２６５９２２を参照のこと）。金属組織検出方法は、オキシドレドクターゼ酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）を水溶性金属イオン、酸化剤および還元剤とともに使用して、再度、検出可能な沈殿物を形成する工程も包含する。（例えば、米国特許第６，６７０，１１３号を参照のこと）。

【0206】

いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、ＮＰＰＦまたはプライマーの５’末端または３’末端に付着されるか、または組み込まれる（例えば、ＮＰＰＦまたはプライマーは、末端が標識されたプローブである）。他の例において、検出可能な標識は、ＮＰＰＦまたはプライマーの内部の位置（例えば、ＮＰＰＦもしくはプライマーの５’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくはそれ以上の塩基、またはＮＰＰＦもしくはプライマーの３’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくはそれ以上の塩基）に組み込まれる。

【0207】

１つの例において、ＮＰＰＦのフランキング領域の１つは、アクセプターまたはエミッター（例えば、アクセプターフルオロフォア）を含み、フランキング領域に相補的な増幅プライマーは、逆のもの（例えば、ドナーフルオロフォア）を含む。したがって、プライマー−ＮＰＰＦ二重鎖は、検出可能なシグナルを放射するが、一本鎖プライマーまたは一本鎖ＮＰＰＦは、放射しない。シグナルの出現は、サンプル中のＮＰＰＦの量の尺度であり、標識された過剰なプライマーを増幅された付加物から分離することなく測定され得る。ＦＲＥＴアクセプター−ドナー対の例は、当該分野で公知であり、その例としては、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡおよびＲＯＸとともに使用するためのドナーフルオロフォアとしてのＦＡＭが挙げられ得、３−（ε−カルボキシ−ペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣＹＡ）は、アクセプターフルオロフォアとして使用され得るローダミン誘導体（例えば、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡおよびＲＯＸ）に対するドナーフルオロフォアとして働き得る。Ｇｒａｎｔら（Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１６：２３１−７，２００１）は、本明細書中に開示される方法において使用され得るＦＲＥＴ対の特定の例を提供している。

【0208】

Ｖ．サンプル
サンプルは、１つ以上の標的を含む任意の集合体である（例えば、生物学的サンプルまたは生物学的検体）。そのサンプルは、当業者に周知の方法を用いて回収することができるかまたは得ることができる。開示される方法において有用なサンプルには、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸フラグメント、改変された核酸、合成核酸など）を含む任意の検体が含まれ得る。１つの例において、サンプルは、不安定なＲＮＡを含む。いくつかの例において、検出されるかまたは配列決定される核酸分子は、サンプル中で架橋されているか（例えば、架橋されたＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｖＲＮＡ）、またはサンプル中で可溶性である。いくつかの例において、サンプルは、固定されたサンプル（例えば、標的分子の架橋を引き起こす物質を含むサンプル）である。いくつかの例において、サンプル中の標的核酸は、標的核酸分子の検出または配列決定の前に、抽出されないか、可溶化されないか、またはその両方が行われない。

【0209】

いくつかの例において、開示される方法は、サンプルの解析の前にサンプルを得る工程を包含する。いくつかの例において、開示される方法は、腫瘍を有する被験体を選択する工程、および次いで、いくつかの例において、例えば、被験体または１つ以上の治療の選択に対する診断または予後診断を確定するために、その被験体の腫瘍に基づいて検出する１つ以上の標的ＤＮＡまたはＲＮＡをさらに選択する工程を包含する。いくつかの例において、解析されるサンプル中の核酸分子は、まず、サンプルから単離されるか、抽出されるか、濃縮されるか、またはそれらの組み合わせが行われる。

【0210】

いくつかの例において、サンプル中のＲＮＡは、本明細書中に提供される方法を行う前に逆転写される。しかしながら、標的ＲＮＡ配列が、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ活性によって相補的なプローブ配列に効率的に変換されるとき、開示される方法は、逆転写を必要としない。ＲＮＡ分子は、必ずしもそのＤＮＡ鋳型と同一線形順序に並んでいるわけではないので、時折、ＲＮＡをコードする遺伝子配列ではなくそのＲＮＡ分子を配列決定することが望ましい。そして、一部の生物は、ＲＮＡである（例えば、ＲＮＡウイルス）。

【0211】

いくつかの例において、サンプルは、溶解される。溶解緩衝液は、酵素を不活性化するように、およびＲＮＡの分解を防止するようにデザインされるが、それは、ハイブリダイゼーション希釈緩衝液への限界希釈の後、ヌクレアーゼ活性を可能にし、ストリンジェントな特異性でのハイブリダイゼーションを促進する。希釈緩衝液は、溶解緩衝液および他の緩衝液の阻害活性（例えば、他の酵素（例えば、ポリメラーゼ）に対する阻害活性）を中和するために加えられ得る。あるいは、溶解緩衝液および他の緩衝液の組成は、例えば、ポリメラーゼが許容する組成に変更され得る。

【0212】

いくつかの例において、本方法は、複数のサンプルを同時または同時発生的に解析する工程を包含する。例えば、本方法は、少なくとも２つの異なるサンプル（例えば、種々の患者由来のサンプル）を同時または同時発生的に解析し得る。１つの例において、本方法は、少なくとも２つの異なるサンプル（例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００または少なくとも１０，０００個の異なるサンプル）中の少なくとも２つの異なる標的核酸分子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なる標的）を同時または同時発生的に検出し得るかまたは配列決定し得る。

【0213】

例示的なサンプルとしては、細胞、細胞溶解産物、血液塗抹標本、集細胞遠心調製物（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、細胞学塗抹標本（ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｓｍｅａｒｓ）、体液（例えば、血液およびその画分（例えば、血清および血漿）、唾液、痰、尿、髄液、胃液、汗、精液など）、細胞学的塗抹標本、頬側細胞、組織、細胞もしくは器官の抽出物、組織生検材料（例えば、腫瘍生検材料）、細針吸引材料、パンチ生検材料、循環腫瘍細胞、新鮮組織、凍結組織、固定された組織、固定され、ワックス（例えば、パラフィン）包埋された組織、骨髄、および／または組織切片（例えば、クライオスタット組織切片および／またはパラフィン包埋された組織切片）が挙げられるがこれらに限定されない。生物学的サンプルは、研究室での研究のサンプル（例えば、細胞培養サンプルまたは上清）でもあり得る。

【0214】

被験体からサンプルを得る方法は、当該分野で公知である。例えば、組織または細胞サンプルを得る方法は、通例の方法である。例示的なサンプルは、正常な細胞もしくは組織から得てもよいし、腫瘍性の細胞もしくは組織から得てもよい。新形成は、１つ以上の細胞が、分化喪失、速い成長速度、周囲組織の浸潤、および細胞が転移でき得ることとともに、特徴的な退形成を起こした生物学的状態である。特定の例において、生物学的サンプルは、腫瘍サンプル（例えば、腫瘍性の細胞を含むサンプル）を含む。

【0215】

例示的な腫瘍性の細胞または組織は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、例えば、肺扁平上皮癌種）、乳癌腫（例えば、小葉癌腫および管癌腫）、副腎皮質癌、エナメル上皮腫、膨大部癌、膀胱癌、骨癌、子宮頸癌、胆管腫、直腸結腸癌、子宮体癌、食道癌、胃癌、神経膠腫、顆粒細胞腫（ｇｒａｎｕｌａｒ ｃａｌｌ ｔｕｍｏｒ）、頭頸部癌、肝細胞癌、胞状奇胎、リンパ腫、メラノーマ、中皮腫、ミエローマ、神経芽細胞腫、口腔癌、骨軟骨腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、毛母腫、前立腺癌、腎細胞癌、唾液腺腫瘍、軟部組織腫瘍、スピッツ母斑、扁平上皮細胞癌、奇形癌および甲状腺癌を含む固形腫瘍に含まれ得るかまたはそれらから単離され得る。例示的な腫瘍性の細胞は、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性型および高悪性型）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群および骨髄形成異常を含む血液癌にも含まれ得るかまたはそれらからも単離され得る。

【0216】

例えば、細胞材料を含む腫瘍由来のサンプルは、その腫瘍の全部または一部の外科的切除によって、その腫瘍から細針吸引材料を回収することによって、ならびに当該分野で公知の他の方法によって、得ることができる。いくつかの例において、組織または細胞サンプルは、基材に適用され、１つ以上の標的ＤＮＡまたはＲＮＡが存在するかを判定するために解析される。開示される方法において有用な固体支持体は、生物学的サンプルを有することだけが必要であり、必要に応じて、サンプル中の成分（例えば、タンパク質および／または核酸配列）の好都合な検出を可能にする。例示的な支持体としては、顕微鏡用スライド（例えば、ガラスの顕微鏡用スライドまたはプラスチックの顕微鏡用スライド）、カバーガラス（例えば、ガラスのカバーガラスまたはプラスチックのカバーガラス）、組織培養皿、マルチウェルプレート、膜（例えば、ニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ））またはＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭチップが挙げられる。

【0217】

開示される方法は、高感度かつ特異的であり、限られた数の細胞しか含まないサンプル中の標的核酸分子の検出を可能にする。少数の細胞（例えば、２５０，０００個未満の細胞（例えば、１００，０００個未満、５０，０００個未満、１０，０００個未満、１，０００個未満、５００個未満、２００個未満、１００個未満の細胞または１０個未満の細胞））を含むサンプルとしては、ＦＦＰＥサンプル、細針吸引材料（例えば、肺、前立腺、リンパ、乳房または肝臓からのもの）、パンチ生検材料、針生検材料、小集団の（例えば、ＦＡＣＳ）選別された細胞もしくは循環腫瘍細胞、肺吸引材料、少数のレーザー捕捉されたかもしくは肉眼解剖された（ｍａｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ）細胞もしくは循環腫瘍細胞、エキソソームおよび他の細胞内粒子、または体液（例えば、血漿、血清、髄液、唾液および乳房吸引材料）が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、わずか１０００個の細胞（例えば、１０００個またはそれ以上の細胞、例えば、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、５０，０００個またはそれ以上の細胞を含むサンプル）において標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡが検出され得る。いくつかの例において、約１０００〜１００，０００個の細胞、例えば、約１０００〜５０，０００、１０００〜１５，０００、１０００〜１０，０００、１０００〜５０００、３０００〜５０，０００、６０００〜３０，０００または１０，０００〜５０，０００個の細胞において標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡの発現が検出され得る。いくつかの例において、約１００〜２５０，０００個の細胞、例えば、約１００〜１００，０００、１００〜５０，０００、１００〜１０，０００、１００〜５０００、１００〜５００、１００〜２００または１００〜１５０個の細胞において標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡの発現が検出され得る。他の例において、約１〜１０００個の細胞（例えば、約１〜５００個の細胞、約１〜２５０個の細胞、約１〜１００個の細胞、約１〜５０個の細胞、約１〜２５個の細胞または約１個の細胞）において標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡの発現が検出され得る。

【0218】

サンプルは、サンプルと標的特異的試薬（例えば、ＮＰＰＦ）との接触の前に（またはその接触と同時発生的に）、当業者に公知のいくつかの方法で処理され得る。１つの比較的単純な処理は、サンプルを緩衝液、例えば、溶解緩衝液に懸濁することである（それにより、そのサンプルのすべての成分が単一溶液中に保存される）。標的を検出するための多くの従来の方法は、標的が標的特異的試薬に到達できるようにするために、より複雑なサンプル処理（例えば、複数の工程および／または様々なタイプの特殊機器が関わるもの）を必要とする。例えば、ある特定の検出方法は、サンプルからの標的（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の部分的または完全な単離（例えば、抽出）を必要とする。標的（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、サンプル中の他の非標的生物学的成分から精製されるとき、単離されているかまたは抽出されている。精製は、サンプル中に見られる１つ以上の外来性成分からの標的の分離のことを指す。例えば、対の標的特異的プライマーを用いたｍＲＮＡのＰＣＲに基づく検出の前に、全または可溶性ｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡを含む）が、サンプル中の細胞タンパク質および他の核酸から分離されることが多い。混合された検体またはサンプルから単離されるか、抽出されるかまたは精製される成分は、代表的には、未精製または未抽出のサンプルと比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９８％または実に少なくとも９９％濃縮される。

【0219】

サンプルからの生物学的成分の単離は、時間のかかるものであり、例えば、分解および／または単離のために使用されるプロセスの不良な効率もしくは不完全さによる、単離されている成分の喪失のリスクを負うものである。さらに、いくつかのサンプル（例えば、固定された組織）を用いるとき、標的（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ））は、悪名高いことに、高忠実度で単離することは困難である（例えば、新鮮または凍結組織と比べて）。なぜなら、標的の少なくともいくらかの割合が、固定されたサンプル中の他の成分に架橋されており、ゆえに、容易に単離できないかまたは可溶化できず、可溶性画分と不溶性画分とが分離される際に失われる可能性があると考えられているからである。したがって、いくつかの例において、標的核酸を検出する方法は、サンプルを１つ以上のＮＰＰＦと接触させる前に、サンプルからの標的の精製、抽出もしくは単離を必要としないかもしくはそれらを含まず、かつ／またはサンプルを標的特異的試薬と接触させる前に、サンプルの全成分を保持する溶液、例えば、溶解緩衝液にサンプルを懸濁することだけを含む。

【0220】

いくつかの例において、サンプル中の細胞は、水溶液において（例えば、溶解緩衝液を使用して）溶解されるか、または透過処理される。その水溶液または溶解緩衝液としては、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）および１つ以上のカオトロピック剤（例えば、ホルムアミド、グアニジニウムＨＣｌ、グアニジニウムイソチオシアネートまたは尿素）を含む。その溶液は、緩衝剤（例えば、ＳＳＣ）も含み得る。いくつかの例において、溶解緩衝液は、約１５％〜２５％のホルムアミド（ｖ／ｖ）、約０．０１％〜０．１％のＳＤＳおよび約０．５〜６×ＳＳＣ（例えば、約３×ＳＳＣ）を含む。その緩衝液は、必要に応じて、ｔＲＮＡ（例えば、約０．００１〜約２．０ｍｇ／ｍｌ）またはリボヌクレアーゼ；ＤＮＡａｓｅ；プロテイナーゼＫ；タンパク質、マトリックス、炭水化物、脂質もしくは１種類のオリゴヌクレオチドを分解する酵素（例えば、コラゲナーゼまたはリパーゼ）、またはそれらの組み合わせを含み得る。溶解緩衝液は、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬も含み得る。特定の例において、溶解緩衝液は、２０％ホルムアミド、３×ＳＳＣ（７９．５％）、０．０５％ＳＤＳ、１μｇ／ｍｌのｔＲＮＡおよび１ｍｇ／ｍｌのフェノールレッドを含む。細胞を溶解するためまたは透過処理するのに、十分な時間（例えば、約１分〜約６０分、例えば、約５分〜約２０分または約１０分）にわたって、十分な温度（例えば、約２２℃〜約１１０℃、例えば、約８０℃〜約１０５℃、約３７℃〜約１０５℃または約９０℃〜約１００℃）において、細胞を上記水溶液中でインキュベートする（必要に応じて、蒸発を防ぐためまたはパラフィンに対するシンク（ｓｉｎｋ）として働くためにオイルで重層する）。いくつかの例において、溶解は、約９５℃で行われる。いくつかの例において、溶解工程は、サンプルを約９５℃で約５〜１５分間インキュベートして、サンプル中のゲノムＤＮＡではなくＲＮＡを変性させる工程を包含する。他の例において、溶解工程は、サンプルを約１０５℃で約５〜１５分間インキュベートして、サンプル中のＲＮＡとゲノムＤＮＡの両方を変性させる工程を包含する。１つの例において、プロテイナーゼＫは、溶解緩衝液とともに含められる。

【0221】

いくつかの例において、粗細胞溶解物は、さらなる精製なしに直接使用される。それらの細胞は、開示されるＮＰＰＦの１つ以上の存在下または非存在下において溶解され得る。それらの細胞が、プローブの非存在下において溶解される場合、続いてその粗溶解産物に１つ以上のプローブが加えられ得る。他の例において、接触前の溶解産物を１つ以上のＮＰＰＦと接触する前に細胞溶解産物から核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が単離される。

【0222】

他の例において、組織サンプルは、組織を媒質中で固定し、包埋することによって調製されるか、または細胞懸濁液は、例えば、固体支持体（例えば、スライドガラス）上に細胞を塗抹するかまたは遠心することによって、その固体支持体上に単層として調製される。さらなる例において、新鮮凍結（例えば、固定されていない）組織または組織切片が、本明細書中に開示される方法において使用され得る。特定の例において、ＦＦＰＥ組織切片が、開示される方法において使用される。

【0223】

いくつかの例において、包埋媒質が使用される。包埋媒質は、将来の解析のために組織および／または細胞を保存するのを助けるために、それらが包埋される不活性な材料である。包埋は、組織サンプルを薄切片にスライスするのも可能にする。包埋媒質としては、パラフィン、セロイジン、ＯＣＴ^ＴＭ化合物、寒天、プラスチックまたはアクリル樹脂が挙げられる。多くの包埋媒質は、疎水性である；ゆえに、その不活性な材料は、主に親水性の試薬を使用する解析の前に除去される必要があり得る。脱パラフィンまたは脱ろうという用語は、生物学的サンプルからの任意のタイプの包埋媒質の部分的または完全な除去のことを指すために本明細書中で広く使用される。例えば、パラフィン包埋された組織切片は、有機溶媒（例えば、トルエン、キシレン、リモネンまたは他の好適な溶媒）に通すことによって、脱ろうされる。他の例において、パラフィン包埋された組織切片は、直接（例えば、脱ろう工程なしで）使用される。

【0224】

組織は、灌流を含む任意の好適なプロセスまたは固定液に浸すことによって固定され得る。固定液は、架橋剤（例えば、アルデヒド類、例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド、ならびに非アルデヒド架橋剤）、酸化剤（例えば、金属イオンおよび金属錯体、例えば、四酸化オスミウムおよびクロム酸）、タンパク質変性剤（例えば、酢酸、メタノールおよびエタノール）、不明な機序の固定液（例えば、塩化第二水銀、アセトンおよびピクリン酸）、組み合わせ試薬（例えば、カルノア固定液、メタカルン（ｍｅｔｈａｃａｒｎ）、ブアン液、Ｂ５固定液、Ｒｏｓｓｍａｎ液およびＧｅｎｄｒｅ液）、マイクロ波および様々な固定液（例えば、排除体積固定（ｅｘｃｌｕｄｅｄ ｖｏｌｕｍｅ ｆｉｘａｔｉｏｎ）および蒸気固定）として分類され得る。添加物（例えば、緩衝剤、界面活性剤、タンニン酸、フェノール、金属塩（例えば、塩化亜鉛、硫酸亜鉛およびリチウム塩）およびランタン）もまた固定液に含められ得る。

【0225】

組織または細胞サンプルを調製する際に最もよく使用される固定液は、一般にホルマリン溶液の形態のホルムアルデヒドである（緩衝液中の４％ホルムアルデヒド、１０％緩衝ホルマリンと称される）。１つの例において、固定液は、１０％中性緩衝ホルマリンであり、ゆえに、いくつかの例において、サンプルは、ホルマリン固定されている。

【0226】

いくつかの例において、サンプルは、環境サンプル（例えば、土壌、大気もしくは水サンプル、または表面から得られる（例えば、拭き取ることによって）サンプル）、または例えば、存在し得る病原体を検出するための、食品サンプル（例えば、野菜、果物、乳製品または食肉を含むサンプル）である。

【0227】

ＶＩ．標的核酸
標的核酸分子は、検出可能な、または目的の、または開示される方法による検出に有用な、核酸分子である。真核生物、原核生物、ウイルス、真菌、細菌または他の生物学的生物に由来するかに関係なく、標的には、一本鎖、二本鎖または他の多重鎖の核酸分子（例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノム、ミトコンドリアまたは合成）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、長い非コード（ｎｃ）ＲＮＡ、生物学的に存在するアンチセンスＲＮＡ、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）または低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）））が含まれる。ゲノムＤＮＡ標的は、ゲノムの１つまたはいくつかの部分（例えば、コード領域（例えば、遺伝子またはエキソン）、非コード領域（既知の生物学的機能を有するか未知の生物学的機能を有するかは関係なく、例えば、エンハンサー、プロモーター、制御領域、テロメアまたは「ナンセンス」ＤＮＡ））を含み得る。いくつかの実施形態において、標的は、天然に存在し得るかまたは別途誘導され得る変異（例えば、化学的にまたは放射線照射によって誘導される変異）（例えば、生殖細胞系列変異または体細胞変異）を含み得るか、またはその結果であり得る。そのような変異は、ゲノム再編成（例えば、転座、挿入、欠失または逆位）、単一ヌクレオチド変異および／またはゲノム増幅を含み得る（またはそれらに起因し得る）。いくつかの実施形態において、標的は、１つ以上の改変されたまたは合成のモノマー単位（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、メチル化された核酸、翻訳後修飾されたアミノ酸、架橋された核酸または架橋されたアミノ酸）を含み得る。

【0228】

ＮＰＰＦが特異的に結合し得る標的核酸分子の一部も、再度、文脈が指示するとき、「標的」と称される場合があるが、より詳細には、標的部分、相補的領域（ＣＲ）、標的部位、保護された標的領域もしくは保護された部位または類似物と称される場合がある。その相補的領域に特異的に結合したＮＰＰＦは、複合体を形成し、その複合体は、全体としておよび／もしくはサンプルとして標的と組み込まれたままであり得るか、または全体としておよび／もしくはサンプルとして標的から分離され得る（または分離され得るかまたは分離されるようになり得る）。いくつかの実施形態において、ＮＰＰＦ／ＣＲ複合体は、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼの作用によって、全体としておよび／またはサンプルとして標的から分離される（または解離されるようになる）。

【0229】

すべてのタイプの標的核酸分子が、開示される方法を用いて解析され得る。１つの例において、標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）である。別の例において、標的は、デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ）（ＤＮＡ）分子、例えば、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）、ウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、ｃＤＮＡまたはトランスフェクトされたＤＮＡである。特定の例において、標的は、アンチセンスヌクレオチドである。いくつかの例において、細胞または組織の全トランスクリプトームが、開示される方法を用いて解析され得る。１つの例において、標的核酸分子は、例えば、サンプル中に約１００，０００回未満、約１０，０００回未満、約５，０００回未満、約１００回未満、１０回未満または１回だけしか現れない稀な核酸分子（例えば、サンプル中に１〜１０，０００、１〜５，０００、１〜１００または１〜１０回しか現れない核酸分子）である。

【0230】

複数の標的が、同じサンプルもしくはアッセイにおいて、または複数のサンプルもしくはアッセイであっても、例えば、同時または同時発生的に、検出され得るかまたは配列決定され得る。同様に、単一の標的が、複数のサンプルにおいて、例えば、同時または同時発生的に、検出され得るかまたは配列決定され得る。１つの例において、標的核酸分子は、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡである。したがって、そのような例では、本方法は、そのｍｉＲＮＡに特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦおよびそのｍＲＮＡに特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦの使用を含み得る。１つの例において、標的核酸分子は、２つの異なるＤＮＡ分子である。したがって、そのような例では、本方法は、第１の標的ＤＮＡに特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦおよび第２の標的ＤＮＡに特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦの使用を含み得る。１つの例において、標的核酸分子は、２つの異なるＲＮＡ分子である。したがって、そのような例では、本方法は、第１の標的ＲＮＡに特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦおよび第２の標的ＲＮＡに特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦの使用を含み得る。

【0231】

いくつかの例において、開示される方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）または単一ヌクレオチドバリアント（ｓＮＰＶ）、スプライスジャンクション、メチル化されたＤＮＡ、遺伝子融合または他の変異、タンパク質に結合したＤＮＡまたはＲＮＡ、およびｃＤＮＡ、ならびに発現レベル（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡの発現、例えば、ｃＤＮＡ発現、ｍＲＮＡ発現、ｍｉＲＮＡ発現、ｒＲＮＡ発現、ｓｉＲＮＡ発現またはｔＲＮＡ発現）の検出または配列決定を可能にする。ヌクレアーゼ保護プローブがハイブリダイズするようにデザインされ得る任意の核酸分子は、標的核酸分子自体が配列決定される必要がなかったとしても、そしていくつかの例においては破壊されていたとしても、開示される方法によって定量され得、識別され得る。

【0232】

１つの例において、標的サンプルを処理する際に、メチル化された塩基が、ＮＰＰＦ中の塩基に相補的な異なる塩基に変換されるように、メチル化が生じているかまたは生じていない部位に塩基ミスマッチを含むＮＰＰＦを使用することによって、ＤＮＡのメチル化が検出される。

【0233】

当業者は、標的が、天然塩基もしくは非天然塩基またはそれらの組み合わせを含み得ることを認識するだろう。

【0234】

特定の非限定的な例において、新生物（例えば、癌）に関連する標的核酸（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡ）が選択される。数多くの染色体異常（転座および他の再編成、重複または欠失を含む）または変異が、腫瘍性の細胞、特に癌細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞白血病、リンパ腫、乳癌、結腸癌、神経の癌など）において同定されている。

【0235】

いくつかの例において、標的核酸分子には、ＧＡＰＤＨ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２０４６）、ＰＰＩＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２１１３０）、ＲＰＬＰ０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１００２またはＮＭ＿０５３２７５）、ＲＰＬ１９（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００９８１）、ＺＥＢ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３０７５１）、Ｚｅｂ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１７１６５３またはＮＭ＿０１４７９５）、ＣＤＨ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４３６０）、ＣＤＨ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７６６４）、ＶＩＭ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３８０）、ＡＣＴＡ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１４１９４５またはＮＭ＿００１６１３）、ＣＴＮＮＢ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１９０４、ＮＭ＿００１０９８２０９またはＮＭ＿００１０９８２１０）、ＫＲＴ８（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２２７３）、ＳＮＡＩ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５９８５）、ＳＮＡＩ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３０６８）、ＴＷＩＳＴ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４７４）、ＣＤ４４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６１０、ＮＭ＿００１００１３８９、ＮＭ＿００１００３９０、ＮＭ＿００１２０２５５５、ＮＭ＿００１００１３９１、ＮＭ＿００１２０２５５６、ＮＭ＿００１００１３９２、ＮＭ＿００１２０２５５７）、ＣＤ２４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３２３０）、ＦＮ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿２１２４７４、ＮＭ＿２１２４７６、ＮＭ＿２１２４７８、ＮＭ＿００２０２６、ＮＭ＿２１２４８２、ＮＭ＿０５４０３４）、ＩＬ６（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６００）、ＭＹＣ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２４６７）、ＶＥＧＦＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０２５３６６、ＮＭ＿００１１７１６２３、ＮＭ＿００３３７６、ＮＭ＿００１１７１６２４、ＮＭ＿００１２０４３８４、ＮＭ＿００１２０４３８５、ＮＭ＿００１０２５３６７、ＮＭ＿００１１７１６２５、ＮＭ＿００１０２５３６８、ＮＭ＿００１１７１６２６、ＮＭ＿００１０３３７５６、ＮＭ＿００１１７１６２７、ＮＭ＿００１０２５３７０、ＮＭ＿００１１７１６２８、ＮＭ＿００１１７１６２２、ＮＭ＿００１１７１６３０）、ＨＩＦ１Ａ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１５３０、ＮＭ＿１８１０５４）、ＥＰＡＳ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１４３０）、ＥＳＲ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０４０２７６、ＮＭ＿００１０４０２７５、ＮＭ＿００１２１４９０２、ＮＭ＿００１４３７、ＮＭ＿００１２１４９０３）、ＰＲＫＣＥ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５４００）、ＥＺＨ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２０３２４８、ＮＭ＿１５２９９８、ＮＭ＿００１２０３２４７、ＮＭ＿００４４５６、ＮＭ＿００１２０３２４９）、ＤＡＢ２ＩＰ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２５５２、ＮＭ＿１３８７０９）、Ｂ２Ｍ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４０４８）およびＳＤＨＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４１６８）が含まれる。

【0236】

いくつかの例において、標的ｍｉＲＮＡには、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５（ＭＩＲ２０５，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９６２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４（ＭＩＲ３２４，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９８９６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ（ＭＩＲ３０１Ａ，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９８４２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ（ＭＩＲ１０６Ｂ，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９８３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７７（ＭＩＲ８７７，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０３０６１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９（ＭＩＲ３３９，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９８９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（ＭＩＲ１０Ｂ，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９６０９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５（ＭＩＲ１８５，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９７０６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ（ＭＩＲ２７Ｂ，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９６６５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９２（ＭＩＲ４９２，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０３０１７１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ（ＭＩＲ１４６Ａ，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９７０１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ（ＭＩＲ２００Ａ，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９８３４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９８３３、ＮＲ＿０２９５９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ（ＭＩＲ２９Ｃ，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９８３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１（ＭＩＲ１９１，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２９６９０）またはｈｓａ−ｍｉＲ−６５５（ＭＩＲ６５５，例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０３０３９１）が含まれる。

【0237】

１つの例において、標的は、病原体核酸（例えば、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ）である。例示的な病原体としては、ウイルス、細菌、真菌および原生動物が挙げられるが、これらに限定されない。１つの例において、標的は、ウイルスＲＮＡである。ウイルスには、プラス鎖ＲＮＡウイルスおよびマイナス鎖ＲＮＡウイルスが含まれる。例示的なプラス鎖ＲＮＡウイルスとしては、ピコルナウイルス（例えば、Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｉｄａｅ［例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）］）、Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルスおよびポリオウイルス）；Ｒｈｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ（ライノウイルス））；Ｈｅｐａｔａｖｉｒｉｄａｅ（Ａ型肝炎ウイルス）；トガウイルス（その例としては風疹；アルファウイルス（例えば、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス）が挙げられる）；フラビウイルス（その例としては、デングウイルス、西ナイルウイルスおよび日本脳炎ウイルスが挙げられる）；およびコロナウイルス（その例としては、ＳＡＲＳコロナウイルス、例えば、Ｕｒｂａｎｉ株が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なマイナス鎖ＲＮＡウイルスとしては、オルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｙｏｖｉｒｕｓｅｓ）（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびパラミクソウイルス（その例としては、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスが挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの例において、標的は、ＤＮＡウイルス（例えば、ヘルペスウイルス（例えば、水痘・帯状疱疹ウイルス、例えば、Ｏｋａ株；サイトメガロウイルス；ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）タイプ１および２）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルスタイプ１およびアデノウイルスタイプ４１）、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）およびパルボウイルス（例えば、パルボウイルスＢ１９））由来のウイルスＤＮＡである。別の例において、標的は、レトロウイルス核酸（例えば、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）、例えば、サブタイプＣ，ＨＩＶ−２由来の核酸；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；およびトリ肉腫ウイルス）である。１つの例において、標的核酸は、細菌の核酸である。１つの例において、細菌の核酸は、グラム陰性菌（例えば、大腸菌（Ｋ−１２およびＯ１５７：Ｈ７）、志賀赤痢菌およびコレラ菌）由来の核酸である。別の例において、細菌の核酸は、グラム陽性菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓおよびｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）由来の核酸である。１つの例において、標的核酸は、原生動物、線形動物（ｎｅｍｏｔｏｄｅｓ）または真菌由来の核酸である。例示的な原生動物としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、ＮａｅｇｌｅｒｉａおよびＴｏｘｏｐｌａｓｍａが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な真菌としては、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓおよびＢｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。

【0238】

当業者は、本明細書中に開示される方法を使用して検出され得るさらなる標的ＤＮＡもしくはＲＮＡおよび／またはさらなる標的ｍｉＲＮＡを識別し得る。

【0239】

ＶＩＩ．アッセイのアウトプット
いくつかの実施形態において、開示される方法は、サンプル中の１つ以上の標的核酸分子の存在または量を測定する工程を包含する。他のまたはさらなる実施形態において、開示される方法は、サンプル中の１つ以上の標的核酸分子の配列を決定する工程（検出された配列の定量を含み得る）を包含する。それらの方法の結果は、試験結果についての情報を提供する感知可能なアウトプットとして、ユーザー（例えば、科学者、臨床医もしくは他の医療従事者、研究室の職員または患者）に提供され得る。いくつかの例において、そのアウトプットは、紙のアウトプット（例えば、筆記のまたは印刷されたアウトプット）、スクリーン上の表示、図画によるアウトプット（例えば、グラフ、チャートまたは他の線図）または可聴式のアウトプットであり得る。１つの例において、アウトプットは、サンプル中の検出された（または検出されなかった）標的核酸分子の存在または量（例えば、正規化された量）の定性的または定量的な指標を含む表またはグラフである。他の例において、アウトプットは、基材上に存在するシグナルのマップまたはイメージ（例えば、アレイからの蛍光のデジタル画像）である。他の例において、実施形態、アウトプットは、サンプル中の１つ以上の標的核酸分子の配列（例えば（ｓｕｃｈ ａ）、標的分子における特定の変異の存在を示す（ｉｎｄｉｃｔｉｎｇ）レポート）である。

【0240】

いくつかの例において、アウトプットは、サンプル中の標的核酸分子の量などの数値である。さらなる例において、アウトプットは、グラフ表示、例えば、サンプル中の標的核酸分子の値（例えば、量または相対量）を検量線上に示すグラフである。さらなる例において、アウトプットは、グラフ表示、例えば、サンプル中の標的核酸分子の配列を示すグラフ（例えばそれは、変異が存在する位置を示し得る）である。いくつかの例において、アウトプットは、例えば、物理的、可聴式または電子的手段を介して（例えば、メール、電話、ファクシミリ通信、電子メールまたは電子的診療記録への通信によって）アウトプットを提供することによって、ユーザーと通信される。

【0241】

アウトプットは、定量的情報（例えば、特定の標的核酸分子の量、またはコントロールのサンプルもしくは値と比較したときの特定の標的核酸分子の量）を提供し得るか、または定性的情報（例えば、特定の標的核酸分子の存在または非存在の判定）を提供し得る。さらなる例において、アウトプットは、サンプル中の標的核酸分子の相対量に関する定性的情報（例えば、コントロールと比べて増加もしくは減少の識別またはコントロールと比べて変化がないこと）を提供し得る。

【0242】

本明細書中で述べられるように、ＮＰＰＦアンプリコンは、例えば、特定の患者、サンプル、実験または標的配列を識別するために使用され得る１つ以上の実験タグを含み得る。そのようなタグを使用することにより、検出されるかまたは配列決定されるＮＰＰＦアンプリコンを「選別する」ことまたは計数することさえ可能になり、ゆえに、複数の異なるサンプル（例えば、種々の患者由来の）、複数の異なる標的（例えば、少なくとも２つの異なる核酸標的）またはそれらの組み合わせの解析が単一反応において可能になる。１つの例において、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＢｏｗｔｉｅソフトウェアが、そのような解析のために使用され得る。

【0243】

１つの例において、ＮＰＰＦは、異なる各標的核酸分子にとってユニークな実験タグを含む。そのようなタグを使用することにより、ＮＰＰＦ全体を配列決定することなく、単にこのタグを配列決定するかまたは検出することにより、そのＮＰＰＦを特定の核酸標的に対応するＮＰＰＦと識別することが可能になる。さらに、複数の核酸標的が解析される場合、各標的にとってユニークな実験タグを使用することにより、検出されるかまたは配列決定される各実験タグが選別され得、所望であれば計数され得るので、解析が単純化される。ＮＰＰＦアンプリコンは、サンプル中の標的に化学量論的に比例するので、これにより、サンプル中に存在した標的核酸の定量が可能になる。例えば、サンプル中の複数の標的核酸が、検出されるかまたは配列決定される場合、本方法は、単に実験用タグを検出するかまたは配列決定し、次いで、選別することによって、各標的配列および検出されたかまたは配列決定されたコピー数を示す表またはグラフの作成を可能にする。

【0244】

別の例において、ＮＰＰＦは、異なる各サンプルにとってユニークな実験タグ（例えば、各患者サンプルに対するユニークなタグ）を含む。そのようなタグを使用することにより、検出された特定のＮＰＰＦアンプリコンと特定のサンプルとを関連づけることが可能になる。したがって、複数のサンプルが、同じ反応（例えば、同じウェルまたは同じ配列決定反応）において解析される場合、検出されるかまたは配列決定される各ＮＰＰＦが、特定のサンプルと関連づけられ得るので、各サンプルにとってユニークな実験タグを使用することにより、その解析が単純化される。例えば、サンプル中の標的核酸が、検出されるかまたは配列決定される場合、本方法は、各サンプルに対する解析結果を示す表またはグラフの作成を可能にする。

【0245】

当業者は、各ＮＰＰＦアンプリコンが、複数の実験タグ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の実験タグ）（例えば、標的配列を代表するタグおよびサンプルを代表する別のタグ）を含み得ることを認識するだろう。いったん各タグが検出されるかまたは配列決定されると、適切なソフトウェアを使用することによって、任意の所望の形式（例えば、グラフまたは表）においてデータが選別され得る。例えば、これにより、複数のサンプル中の複数の標的配列の解析が同時または同時発生的に可能になる。

【0246】

いくつかの例において、検出されるかまたは配列決定されるＮＰＰＦアンプリコンは、各標的核酸配列に対する公知の配列の参照データベースと比較される。いくつかの例において、そのような比較は、ＳＮＰなどの変異の検出を可能にする。いくつかの例において、そのような比較は、参照ＮＰＰＦの存在量と、ＳＮＰを含むと判明した領域におけるＮＰＰＦプローブの存在量との比較を可能にする。

【0247】

本開示はさらに、以下の非限定的な実施例によって例証される。

【実施例】

【0248】

実施例１
複数のＮＰＰＦの同時配列決定
この実施例では、ＮＰＰＦを作製するためおよび配列決定するために使用される方法を説明する。

【0249】

７つの異なるＮＰＰＦを作製した。各ＮＰＰＦは、６２℃というＴｍ中央値を有する２５ヌクレオチド長の特定の標的核酸分子に特異的な領域、ならびに両端にフランキング配列を含んだ。５’−フランキング配列と３’−フランキング配列とは異なっていたが、それらは、その７つの異なるＮＰＰＦの各々に対して同じだった。５’−フランキング配列は、６１℃のＴｍを有する２５ヌクレオチドであり、３’フランキング配列は、６３℃のＴｍを有する２５ヌクレオチドだった。

【0250】

その７つの異なるＮＰＰＦを、既知の比（１：１．５：２：４：５）でプールし、以下のとおりＰＣＲ増幅した。それらのＮＰＰＦをＰＣＲプライマーとインキュベートした。１つのプライマーは、５’−フランキング配列に相補的な配列を含み、第２のプライマーは、３’−フランキング配列に相補的な配列を含んだ。第２のプライマーは、得られたアンプリコンに６ヌクレオチドの実験タグを組み込むことを可能にする配列も含み、その結果、このプライマーを用いて増幅される各ＮＰＰＦは、同じ６ヌクレオチドの実験タグを有した。いくつかのそのような反応を、各々異なるタグを用いて行った。第１のプライマーは、４９塩基長だった。これらの塩基のうちの２０個は、５’−フランキング配列と同一だった。これらの２０塩基は、５４℃のＴｍを有し、プライマー全体の全体としてのＴｍは、７０℃だった。３’−フランキング配列に相補的な第２のプライマーは、全体で約７０℃のＴｍを有する５７ヌクレオチドだった。第２のプライマーの最初の１９ヌクレオチドは、３’−フランキング領域にまさに相補的であり、５４℃のＴｍを有した。

【0251】

８つの別個のＰＣＲ反応を行ったところ、相違を識別できた。得られたアンプリコンを、ゲル精製または標準的なカラムに基づく精製（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡＱｕｉｃｋスピンカラム）を使用して浄化した。次いで、ＮＰＰＦおよび実験用タグを含むアンプリコンを、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定した。配列決定された各アンプリコンを、実験タグ配列（各タグは、７つのＮＰＰＦのうちの１つの反復プールを代表するものだった）に基づいて選別した。各実験タグ群の中で、７つのタグの各々に対して識別されたアンプリコンの数を数えた。

【0252】

１億２８００万個のアンプリコンを配列決定し、そのうち１億１０００万個（８７％）が、完全に配列決定された実験タグをもたらした。それらのアンプリコンを、Ｂｏｗｔｉｅを使用して、予想される配列と比較したところ、約８０％の完全一致（ｐｒｅｆｅｃｔ−ｍａｔｃｈ）配列が得られた。これは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムにとって、その公開されているエラーおよび品質規格に基づくと良好な完全一致配列のパーセンテージである。図５は、ＰＣＲの前にプールされたＮＰＰＦの元の比に対応する７つのユニークなＮＰＰＦの各々に対して検出されたアンプリコンの数を示している。それらのプローブ（その各々が、増幅中に付加された異なる実験用タグを有した）を８つの別個の実験において測定した。これらはすべて、配列分析装置の単一チャネルにプールされ、配列決定された。エラーバーは、その８つの実験の再現性（１ＳＤ）を示している。

【0253】

図５に示されたデータの再プロットである図６は、各プローブに対する８つの個別の実験結果、平均値（エラーバーなし，同じ平均値が、図５ではエラーバーを伴って示された）および期待値（サンプルに添加されたＮＰＰＦの量に基づく）を示している。７つのＮＰＰＦの各々に対して観察された比は、期待される比（ＰＣＲ反応に加えられたＮＰＰＦの元の量に基づく）と一致した。

【0254】

実施例２
複数のＮＰＰＦの同時検出
この実施例では、ＮＰＰＦを作製し、アレイを用いて検出するために使用される方法および行われた増幅の程度の定量を説明する。

【0255】

３つの異なるＮＰＰＦを作製した（１つは、ヒトＢＡＸ遺伝子に相補的な配列を含み、１つは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子に相補的な配列を含み、１つは、ＥＭＬ４に相補的な配列を含む）。したがって、各ＮＰＰＦは、特定の標的核酸分子に特異的な領域、ならびに両端にフランキング配列を含んだ。各ＮＰＰＦの５’末端は、ビオチン標識を有した。それらのＮＰＰＦは、６３℃〜６５℃のＴｍを有する２５ヌクレオチドだった。５’−フランキング配列と３’−フランキング配列とは異なっていたが、それらは、７つの異なるＮＰＰＦの各々に対して同じだった。５’−フランキング配列は、６１℃のＴｍを有する２５ヌクレオチドであり、３’−フランキング配列は、６３℃のＴｍを有する２５ヌクレオチドだった。

【0256】

１つの実験において、未増幅のＮＰＰＦを、ｑＮＰＡに従ってアレイにハイブリダイズした。そのアレイは、二機能性リンカーに結合したアンカープローブを含んだ。その二機能性リンカーの一方の半分は、そのアンカーに相補的であり、他方の半分は、ＮＰＰＦの遺伝子特異的部分に相補的である。したがって、そのリンカーは、アンカーとＮＰＰＦとの間に架橋を形成する。３つの異なるＮＰＰＦを、既知の比でプールし、目的の標的配列を含む合成ＲＮＡにハイブリダイズさせ、加えて、ＮＰＰＦ上のフランキング領域に相補的なＣＦＳにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしなかったＲＮＡ、ＮＰＰＦおよびＣＦＳのＳ１媒介性消化の後、その反応物を分割した。１つの画分を、ＮＰＰＦが適切な二機能性リンカーに結合するのを可能にする条件下でアレイとインキュベートした。ＮＰＰＦとアレイとの結合を、蛍光ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ）−フィコエリトリンを使用して、ＮＰＰＦ上に存在するビオチン標識によって検出した。

【0257】

別の実験において、プールされた反応物の別の画分を、アレイへのハイブリダイゼーションの前にＰＣＲ増幅し、その産物を、アレイへのハイブリダイゼーションの前に１：１０または１：１００希釈した。ＰＣＲ増幅のために、ＮＰＰＦを含む反応物をＰＣＲプライマーとインキュベートした。１つのプライマーは、５’−フランキング配列と同一の配列を含み（かつビオチン標識を含み）、第２のプライマーは、３’−フランキング配列に相補的な配列を含んだ。５’−フランキング配列に相補的な第１のプライマーは、２２ヌクレオチドであり、５９℃のＴｍを有し、３’−フランキング配列に相補的な第２のプライマーは、２２ヌクレオチドであり、５６℃のＴｍを有した。同じフランキング配列を有する（が異なる標的特異的領域を有する）ＮＰＰＦを使用する利点は、それらのフランキング配列が、普遍的なＰＣＲプライマーの使用を可能にして、複数の異なるＮＰＰＦ配列を増幅するために、ただ１つの５’−プライマー配列およびただ１つの３’−プライマー配列が必要であるだけである点である。次いで、ＮＰＰＦアンプリコンを、１：１０または１：１００希釈し、上に記載されたようにアレイにハイブリダイズさせ、検出した。

【0258】

図７に示されるように、ハイブリダイゼーション捕捉の前にＰＣＲ増幅を使用することにより、感度が少なくとも１５０倍高まる（ＰＣＲ工程の後のアンプリコンの希釈を考慮して）。

【0259】

実施例３
ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを測定するようにデザインされた複数のＮＰＰＦの同時配列決定
この実施例では、ＮＰＰＦを作製するためおよび配列決定するために使用される方法を説明する。

【0260】

２つのＮＰＰＦセットを作製した。第１のセットでは、４６個の異なるＮＰＰＦを作製した。各ＮＰＰＦは、５６℃というＴｍ中央値を有する２５ヌクレオチド長の特定の標的核酸分子に特異的な領域、ならびに両端にフランキング配列を含んだ。第２のセットについては、１３個の異なるＮＰＰＦを作製した。各ＮＰＰＦは、５１℃というＴｍ中央値を有する１８〜２５ヌクレオチド長の特定のｍｉＲＮＡ標的核酸分子に特異的な領域、ならびに両端にフランキング配列を含んだ。

【0261】

標的に関係なく、すべてのＮＰＰＦについて、５’−フランキング配列と３’−フランキング配列とは異なっていたが、それらは、異なるＮＰＰＦの各々に対して同じだった。５’−フランキング配列（５’−ＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ３’；配列番号１７）は、６１℃のＴｍを有する２５ヌクレオチドであり、３’−フランキング配列（５’ＧＡＴＣＧＴＣＧＧＡＣＴＧＴＡＧＡＡＣＴＣＴＧＡＡ３’；配列番号１８）は、６３℃のＴｍを有する２５ヌクレオチドだった。

【0262】

これらのＮＰＰＦをプローブとして使用して、２つの細胞株由来の溶解産物において異なる濃度でｑＮＰＡを行った。図１０は、ｑＮＰＡ反応、投入材料として使用されたサンプル、および配列決定の前に付加された実験タグを示している。各細胞濃度について３つ組で反応を行った。いくつかの実験タグは、配列分析装置のソフトウェアによって認識されず、ゆえに、それらの実験タグでタグ化された反応物は、この解析において考慮されなかった。種々のＮＰＰＦをプールし、細胞溶解産物のＲＮＡ、ならびにＮＰＰＦ上のフランキング領域に相補的なＣＦＳにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションを、セット１の４６個のＮＰＰＦに対しては５０℃において行ったが、セット２の１３個のＮＰＰＦに対しては３７℃で行った。温度の差異は、より短い長さのｍｉＲＮＡ ＮＰＰＦおよびそれに対応するより低いＴｍを考慮するものである。

【0263】

ハイブリダイズしていないＲＮＡ、ＮＰＰＦおよびＣＦＳのＳ１媒介性消化の後、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０を加えることによってその反応物を中和し、２０分間９５℃に加熱することによってＳ１ヌクレアーゼを不活性化した。次いで、得られた各反応物（サンプル中の元の転写物の代表としてＮＰＰＦを含む）をＰＣＲプライマーとインキュベートした。１つのプライマーは、５’−フランキング配列に相補的な配列を含み、第２のプライマーは、３’−フランキング配列に相補的な配列を含んだ。第２のプライマーは、得られたアンプリコンに６ヌクレオチドの実験タグを組み込むことを可能にする配列も含み、その結果、このプライマーを使用して増幅される各ＮＰＰＦは、同じ６ヌクレオチドの実験タグを有した。

【0264】

第１のプライマー（５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＴＣＣＧＡＣＧＡＴＣ３’；配列番号１９）は、４９塩基長だった。これらの塩基のうちの２０個が、５’−フランキング配列と同一だった。これらの２０塩基は、５４℃のＴｍを有し、プライマー全体の全体としてのＴｍは、７０℃だった。３’−フランキング配列に相補的な第２のプライマー（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴｎｎｎｎｎｎＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴ３’；配列番号２０）は、全体で約７０℃のＴｍを有する５７ヌクレオチドだった。第２のプライマーの最初の１９ヌクレオチドは、３’−フランキング領域にまさに相補的であり、５４℃のＴｍを有した。上記の「ｎｎｎｎｎｎ」で記された６塩基は、以下の表２における２４個の配列のうちの１つだった。得られた配列を右欄に示し、その配列番号を括弧内に示す。

【0265】

【表2-2】

各３つ組の反応物を、別個のＰＣＲ反応において増幅し、それらは、別個の実験用タグを有したことから、相違を識別することができた（図１０を参照のこと）。得られたアンプリコンを、ゲル精製または標準的なカラムに基づく精製（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡＱｕｉｃｋスピンカラム）を使用して浄化した。次いで、ＮＰＰＦおよび実験用タグを含むアンプリコンを、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定した。実験用タグは、いくつかの箇所に配置され得るが、この実施例では、そのタグは、インデックスリード（ｉｎｄｅｘ−ｒｅａｄ）配列決定プライマーに相補的な領域のすぐ下流のアンプリコンの３’末端に配置された。したがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定を２つの工程において行った（その配列の最初の読み取りに続く、第２の配列決定プライマーを使用した実験用タグの第２の読み取り）。この様式において２つの配列決定プライマーを使用することは、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームにおいてサンプルを多重化するための１つの標準的な方法である。

【0266】

配列決定された各アンプリコンを、第１に実験タグ（バーコード）に基づいて選別し、次いで、各実験タグ群の中で、種々のタグの各々に対して識別されたアンプリコンの数を数えた。それらのアンプリコンを、Ｂｏｗｔｉｅを使用して、予想される配列と比較した。

【0267】

図１１は、４６個のｍＲＮＡ ＮＰＰＦを使用した、ＴＨＰ１細胞に対する３つ組のｑＮＰＡ反応の結果を示している。優れた再現性が反復間に観察され、ＣＶは低い。このグラフは、ＰＣＲの前にプールされたＮＰＰＦの元の比に対応する４６個のユニークなＮＰＰＦの各々に対して検出されたアンプリコンの数を表している。エラーバーは、平均値からの１標準偏差を表している。これらのプローブは、３つの別個の実験において測定され、その実験の各々は、異なる実験用タグを増幅中に付加させた。これらをすべて配列分析装置の単一チャネルにプールし、配列決定した。エラーバーは、３つの実験の再現性（１ＳＤ）を示している。

【0268】

図１２Ａおよび１２Ｂは、４点ＴＨＰ１細胞滴定において行われた反応からの４６個のｍＲＮＡ ＮＰＰＦのうちの１２個について得られたプロット数を示している。示されているデータは、最低（Ａ）および最高（Ｂ）の存在量のＮＰＰＦを表しており、配列決定を用いて入手可能な大きな検出範囲を証明している。そのデータは、高存在量と低存在量の両方のプローブに対するｑＮＰＳ反応の線形性も証明している（サンプル中の対応するＲＮＡの高発現および低発現を表している）。

【0269】

図１３は、３点ＨｅｐＧ２細胞滴定（５，０００個の細胞〜５，００００個の細胞）において行われた反応の１３個のｍｉＲＮＡ ＮＰＰＦのうちの５つに対する結果をプロットしている。これらの５つは、同様のレベルを有し、同じプロット上にはっきりと見ることができたので、これらを選択した。そのプロットは、ｍｉＲＮＡが、開示される方法を使用して細胞溶解産物において検出可能であり、試験されたサンプルサイズに対して良好な線形性を示すことを証明している。

【0270】

実施例４
配列決定およびアレイ上へのＮＰＰＦの捕捉を使用してｍＲＮＡを測定するようにデザインされた複数のＮＰＰＦの検出
この実施例では、ＮＰＰＦを作製し、配列決定するために使用される方法を説明する。

【0271】

９つの異なるＮＰＰＦを作製した。各ＮＰＰＦは、５７℃というＴｍ中央値を有する２５ヌクレオチド長の特定の標的核酸分子に特異的な領域、ならびに両端にフランキング配列を含んだ。５’−フランキング配列と３’−フランキング配列とは異なっていたが、それらは、異なるＮＰＰＦの各々に対して同じだった。５’−フランキング配列（５’−ＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ−３’；配列番号１７）は、６１℃のＴｍを有する２５ヌクレオチドであり、３’−フランキング配列（５’ＧＡＴＣＧＴＣＧＧＡＣＴＧＴＡＧＡＡＣＴＣＴＧＡＡ−３’；配列番号１８）は、６３℃のＴｍを有する２５ヌクレオチドだった。各ＮＰＰＦの５’フランキング配列にビオチン標識を含めた。

【0272】

ｑＮＰＡ溶解緩衝液中の合成ＲＮＡ（インビトロで転写されたＲＮＡ）の希釈物を含むサンプルにおいてｑＮＰＡを行った。各サンプル濃度について３つ組で反応を行った。種々のＮＰＰＦを、各々１６６ｐＭでプールし、上に記載されたサンプル、ならびにＮＰＰＦ上のフランキング領域に相補的なＣＦＳにハイブリダイズさせた。ＣＦＳを、１０倍のモル比で反応物に含めた（１．６ｎＭの各ＣＦＳ）。３０μｌという総反応体積において、５０℃で少なくとも１６時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの後、２０μｌのＳ１反応緩衝液をその反応物に加えた。この緩衝液は、１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．０、２５０ｍＭ ＫＣｌ、２２．５ｎＭ ＺｎＳＯ４および２５ＵのＳ１ヌクレアーゼを含む。Ｓ１反応を、５０℃において９０分間進めた。ハイブリダイズしていないＲＮＡ、ＮＰＰＦおよびＣＦＳのＳ１媒介性消化の後、１．５μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０を加えることによって、その反応物を中和し、２０分間９５℃に加熱することによって、Ｓ１ヌクレアーゼを不活性化した。得られた各反応物は、サンプル中の元の転写物の代表としてＮＰＰＦを含んだ。この時点において、反応物を２つの部分に分割した。

【0273】

一方の部分の増幅されないＮＰＰＦを、ｑＮＰＡ後にアレイにハイブリダイズさせた。そのアレイは、二機能性リンカーに結合したアンカープローブを含んでいた。その二機能性リンカーの一方の半分は、そのアンカーに相補的であり、他方の半分は、ＮＰＰＦの遺伝子特異的部分に相補的である。したがって、そのリンカーは、アンカーとＮＰＰＦとの間に架橋を形成する。その反応物をアレイハイブリダイゼーションに使用される条件に調整するために、上記反応からのＮＰＰＦに塩置換緩衝液を補充し（塩置換緩衝液は、３．２２５Ｍ ＮａＣｌ；６７．５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０；３×ＳＳＣ；５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５である）、５０℃で１６時間、アレイとインキュベートした。ＮＰＰＦとアレイとの結合を、蛍光ストレプトアビジン−フィコエリトリンを使用して、ＮＰＰＦ上に存在するビオチン標識によって検出した。

【0274】

上記反応物の他方の部分を、配列決定のために調製した。その反応物を、まずＰＣＲプライマーとインキュベートした。１つのプライマーは、５’−フランキング配列に相補的な配列を含み、第２のプライマーは、３’−フランキング配列に相補的な配列を含んだ。第２のプライマーは、得られたアンプリコンに６ヌクレオチドの実験タグを組み込むことを可能にする配列も含み、その結果、このプライマーを使用して増幅される各ＮＰＰＦは、同じ６ヌクレオチドの実験タグを有した。

【0275】

第１のプライマーは、４９塩基長だった。これらの塩基のうちの２０個が、５’−フランキング配列と同一だった。これらの２０塩基は、５４℃のＴｍを有し、プライマー全体の全体としてのＴｍは、７０℃だった。３’−フランキング配列に相補的な第２のプライマーは、全体で約７０℃のＴｍを有する５７ヌクレオチドだった。第２のプライマーの最初の１９ヌクレオチドは、３’−フランキング領域にまさに相補的であり、５４℃の５Ｔｍを有した。

【0276】

各３つ組の反応物を、別個のタグを用いて別個のＰＣＲ反応において増幅したところ、相違を識別できた。得られたアンプリコンを、ゲル精製または標準的なカラムに基づく精製（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡＱｕｉｃｋスピンカラム）を使用して浄化した。次いで、ＮＰＰＦおよび実験用タグを含むアンプリコンを、実施例３に記載されたように実験タグを配列決定する第２のインデックスリード法を使用するＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定した。

【0277】

ＰＣＲ反応を、配列決定の結果に対するサイクル数の影響を測定するように設定した。簡潔には、各３つ組の反応物を３つの別個のＰＣＲ反応において増幅した（各反応では別個のタグを用いた）ところ、相違を識別できた。これらの３つのＰＣＲ反応を、１０、１２または１５サイクルのＰＣＲで行い、得られたアンプリコンを、ゲル精製または標準的なカラムに基づく精製（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡＱｕｉｃｋスピンカラム）を使用して浄化した。次いで、ＮＰＰＦおよび実験用タグを含むアンプリコンを、実施例３に記載されたように実験タグを配列決定する第２のインデックスリード法を使用するＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定した。

【0278】

配列決定された各アンプリコンを、第１に実験タグ（バーコード）に基づいて選別し、次いで、各実験タグ群の中で、種々のタグの各々に対して識別されたアンプリコンの数を数えた。それらのアンプリコンを、Ｂｏｗｔｉｅを使用して、予想される配列と比較した。

【0279】

図１４は、少ないＰＣＲサイクル数（１０、１２および１５）が、配列決定の結果に過度に影響しないことを示している。この棒グラフは、配列決定後に各ＮＰＰＦに対して生成されたカウントを示している。サイクル数、および元のサンプル中の投入材料の量が示されている。異なるサイクルおよび投入レベルの比較を可能にするために、データを正規化した。これらのサイクルのいずれもが開示される方法とともに使用され得ることが明らかであるが、１５ＰＣＲサイクルの後のサンプル中の材料の増加は、配列決定ライブラリーのその後の浄化をより容易にした。１５を超えるサイクルでは、アンプリコンの所望のサイズよりも大きいおよび小さい偽産物が生成される。したがって、いくつかの例において、開示される方法は、１０〜１５ＰＣＲサイクル（例えば、１０、１１、１２、１３、１４または１５サイクル）を使用する。

【0280】

図１５Ａおよび１５Ｂは、分割後の同じ３つ組のｑＮＰＡ反応の結果を示している。アレイへのハイブリダイゼーションによって（図１５Ａ）または配列決定されたＮＰＰＦを数えることによって（図１５Ｂ）、ＮＰＰＦを検出した。示されているバーは、３つ組の平均であり、エラーバーは、平均値からの１標準偏差を表している。

【0281】

開示される本発明の原理が適用され得る多くの可能性のある実施形態に鑑みて、例証された実施形態は、本開示の単なる例であって、本開示の範囲を限定すると見なされるべきでないと認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。ゆえに、本発明者らは、これらの請求項の範囲および精神内に入るすべてを本発明者の発明と主張する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]