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特許5952313ＨＩＶ疾病の進行の予後診断法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5952313

(24)【登録日】2016年6月17日

(45)【発行日】2016年7月13日

(54)【発明の名称】ＨＩＶ疾病の進行の予後診断法

(51)【国際特許分類】

G01N 33/569 20060101AFI20160630BHJP

G01N 33/53 20060101ALI20160630BHJP

G01N 33/543 20060101ALI20160630BHJP

C12Q 1/04 20060101ALI20160630BHJP

C07K 14/16 20060101ALN20160630BHJP

【ＦＩ】

G01N33/569 H

G01N33/53 D

G01N33/53 N

G01N33/543 545A

C12Q1/04ZNA

!C07K14/16

【請求項の数】8

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2013-554964(P2013-554964)

(86)(22)【出願日】2012年2月21日

(65)【公表番号】特表2014-507661(P2014-507661A)

(43)【公表日】2014年3月27日

(86)【国際出願番号】IB2012050787

(87)【国際公開番号】WO2012114272

(87)【国際公開日】20120830

【審査請求日】2015年1月29日

(31)【優先権主張番号】11305187.4

(32)【優先日】2011年2月22日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】513212420

【氏名又は名称】インナヴィルヴァクス

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＡＶＩＲＶＡＸ

(73)【特許権者】

【識別番号】591100596

【氏名又は名称】アンスティチュナショナルドゥラサンテエドゥラルシェルシュメディカル

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人津国

(74)【代理人】

【識別番号】100078662

【弁理士】

【氏名又は名称】津国肇

(74)【代理人】

【識別番号】100131808

【弁理士】

【氏名又は名称】柳橋泰雄

(74)【代理人】

【識別番号】100135873

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤圭子

(74)【代理人】

【識別番号】100116528

【弁理士】

【氏名又は名称】三宅俊男

(74)【代理人】

【識別番号】100122736

【弁理士】

【氏名又は名称】小國泰弘

(74)【代理人】

【識別番号】100122747

【弁理士】

【氏名又は名称】田中洋子

(74)【代理人】

【識別番号】100132540

【弁理士】

【氏名又は名称】生川芳徳

(74)【代理人】

【識別番号】100146031

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田明夫

(74)【代理人】

【識別番号】100181102

【弁理士】

【氏名又は名称】後藤孝明

(72)【発明者】

【氏名】メイエ，ロランス

(72)【発明者】

【氏名】ヴィエイヤール，ヴァンサン

(72)【発明者】

【氏名】ドブレ，パトリス

(72)【発明者】

【氏名】クルゼ，ジョエル

【審査官】三木隆

(56)【参考文献】

【文献】 NGO-GIANG-HUONG NICOLE，HIV TYPE 1-SPECIFIC IGG2 ANTIBODIES: MARKERS OF HELPER T CELL TYPE 1 RESPONSE AND PROGNOSTIC MARKER OF LONG-TERM NONPROGRESSION，AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES，２００１年１０月１０日，V17 N15，P1435-1446

【文献】 VIEILLARD VINCENT，SPECIFIC ADAPTIVE HUMORAL RESPONSE AGAINST A GP41 MOTIF INHIBITS CD4 T-CELL SENSITIVITY TO NK LYSIS DURING HIV-1 INFECTION，AIDS，英国，２００６年９月１日，V20 N14，P1795-1804

【文献】 VIEILLARD VINCENT，NK cytotoxicity against CD4+ T cells during HIV-1 infection: A gp41 peptides induces the expression of an NKp44 ligand，Proc Natl Acad Sci USA，２００５年，Vol.102, No.31，Page.10981-10986

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ３３／５６９

Ｃ１２Ｑ１／０４

Ｇ０１Ｎ３３／５３

Ｇ０１Ｎ３３／５４３

Ｃ０７Ｋ１４／１６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＩＶ−１ウイルスに感染した患者におけるin vitroにおけるＨＩＶ−１疾病の進行の予後診断のマーカーを分析する方法であって、
ａ）前記患者から収集した試料中の配列番号２の３Ｓペプチドに対して指向される抗体のレベルを測定する工程、を含み、
工程ａ）で測定した抗３Ｓ抗体のレベルが、ＨＩＶ−１疾病の進行を示す抗３Ｓ抗体レベルの基準値と比較され、抗３Ｓ抗体のレベルは、ＣＤ４数予後診断マーカー及びウイルス負荷予後診断マーカーとは独立である、前記方法。

【請求項2】

工程ａ）は、配列番号２のペプチドに対して指向される抗体の免疫検出によって行なわれる、請求項１記載の方法。

【請求項3】

工程ａ）は、固相支持体上に固定された配列番号２のペプチドを含むポリペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイによって行なわれる、請求項１記載の方法。

【請求項4】

以下の工程：
１）前記患者から収集した前記試料中のＨＩＶ−１ウイルス負荷を測定する工程を含み、
工程１）で測定したウイルス負荷値が、ＨＩＶ−１疾病の進行を示す基準値と比較されるとしてさらに定義される、請求項１記載の方法。

【請求項5】

工程ａ）が、ＨＩＶ−１感染患者から収集した試料中の少なくとも１つの他のＨＩＶ−１疾病予後診断マーカーを測定することをさらに含み、
工程ａ）で測定した各ＨＩＶ−１疾病予後診断マーカーについて、得られたマーカー値が、前記予後診断マーカーについての基準値と比較される、請求項１記載の方法。

【請求項6】

前記の１つ以上の他のＨＩＶ−１疾病予後診断マーカーが、（ｉ）ＨＩＶウイルス負荷、（ｉｉ）ＣＤ４Ｔ細胞の絶対数、（ｉｉｉ）ＣＤ４Ｔ細胞の比率、および（ｉｖ）ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔリンパ球の比からなる群より選択される、請求項５記載の方法。

【請求項7】

工程ａ）が、
− 上のマーカー（ｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｉｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉ）および（ｉｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉ）および（ｉｉｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｉ）および（ｉｉｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｉｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、および
− 上のマーカー（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル
からなる群より選択されたＨＩＶ−１疾病予後診断マーカーの組合せの測定を含む、請求項６記載の方法。

【請求項8】

ａ）１つ以上の抗レトロウイルス剤を含む薬学的組成物を用いる治療処置を施されたＨＩＶ−１感染患者から収集した試料に対して、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法を実施する工程、および
ｂ）前記ＨＩＶ−１感染患者の治療処置を適切に適合させる必要性を決定する工程
を含む、治療処置の効力をモニタリングするための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＨＩＶ疾病の予後診断の分野に関する。

【0002】

ＨＩＶウイルスによるヒトの感染は、一般的に、血漿試料中の抗ＨＩＶ抗体の免疫検出によって診断される。今日、数多くのＨＩＶＥＬＩＳＡ検査キットが市販されている。一般的に、公知のＨＩＶＥＬＩＳＡ検査キットは、ＨＩＶ抗原の混合物で予めコーティングされたポリスチレン製マイクロウェルのストリップを使用し、前記ＨＩＶ抗原は、組換えＨＩＶ−１ｇｐ４１、ｇｐ１２０およびＨＩＶ−２ｇｐ３６糖タンパク質などの、E. coliで発現される組換えＨＩＶ抗原からなり得る。

【0003】

一旦、ＨＩＶウイルスによる個体の感染が診断されたら、いつ抗レトロウイルス製剤による処置（ＡＲＴ）を開始するかを決定する目的を含めて、ＨＩＶ疾病の進行の経過観察が行なわれる。これは、前記患者に対するＨＩＶ病期分類法を実施することを必要とする。

【0004】

ＨＩＶ疾病病期分類システムおよび分類システムは、臨床医および患者に、臨床管理のための必須な情報を提供する重要なツールである。２つの主要な分類システム、すなわち、それぞれ（ｉ）システム世界保健機関（ＷＨＯ）臨床病期分類システムおよび疾病分類システム、並びに（ｉｉ）米国疾病管理予防センター（ＣＤＣ）分類が現在使用されている。

【0005】

ＨＩＶ／ＡＩＤＳのＷＨＯ臨床病期分類システムおよび疾病分類システムは、主に、臨床事象の発生の決定に基づき、臨床検査結果は必ずしも必要とされない。ＷＨＯ臨床病期分類システムは、資料の限られた国で広く使用されており、そして施設において第一レベルおよび紹介レベルの両方において実用的および有用であることが証明された。

【0006】

ＣＤＣ病期分類システムは、ＣＤ４＋Ｔリンパ球細胞（ＣＤ４）数によって、および特定のＨＩＶ関連容態の存在によって、ＨＩＶ疾病の重度を評価する。ＣＤＣ病期分類システムによると、ＡＩＤＳの定義は、２００個の細胞／μl未満のＣＤ４数、または１４％未満のＣＤ４比率（全てのリンパ球に対して）を有する全てのＨＩＶ感染個体、並びに特定のＨＩＶ関連容態および症状を有するものを含む。従って、ＣＤＣシステムによると、ＣＤ４数は、ＨＩＶの段階および予後を評価するための、並びにＡＩＤＳへの進行および日和見的な病気のリスクをモニタリングするための標準的な臨床検査からなる。ＣＤ４細胞数はまた、医師が症状のある患者における鑑別診断を行ない、そして抗レトロウイルス処置（ＡＲＴ）の開始に関する決定を下し、そして日和見感染のための予防を開始することを手引きする。

【0007】

非処置のＨＩＶ感染では、ＨＩＶ複製は、通常、１日に数十億個の新たなＨＩＶコピーを産生する。血漿中ＨＩＶＲＮＡ（ウイルス負荷）検査は、血漿中のＨＩＶウイルス負荷（burden）を定量する。ウイルス負荷のモニタリングを行なえる地域では、ウイルス負荷は、ＡＲＴを受けている患者における処置応答をモニタリングし、そしてＣＤ４細胞数と共に、ＨＩＶ進行を評価するために使用される標準的なツールである（特に、Mellors et al., 1996, Science, Vol. 272(5265) : 1167-170参照）。

【0008】

ＡＩＤＳは、世界中で３０００万人を超える人々が罹患している大流行の疾病であり、毎年２００万人を超える人々が新たに感染している。現在までに、ＡＩＤＳは依然として致命的な疾病であり、これにより２００９年には２００万人を超える人々が死亡した。

【0009】

複数の明確に異なる治療処置を利用できる必要性または既存のＡＲＴを絶え間なく改良する必要性の他に、医師に、特にＡＲＴを開始する適切な時期を決定させ、そしてケースバイケースで疾病進行プロファイルに対して処置を正しく適応させることを手助けすることを目的とした的確なまたは補完するツールを提供するために、複数の病期分類法または予後診断法が絶えず必要とされている。

【0010】

発明の要約
本発明は、ＨＩＶ−１ウイルスに感染した患者におけるin vitroにおけるＨＩＶ−１疾病の進行の予後診断法に関し、前記方法は、
ａ）前記患者から収集した試料中の３Ｓペプチドに対して指向される抗体のレベルを測定する工程、
ｂ）工程ａ）で測定した抗体のレベルを、ＨＩＶ−１疾病の進行を示す基準値と比較する工程
を含む。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、２００個の細胞／μlを上回るＣＤ４数を有し、そして予め決定された基準値（ここでは、予め決定された基準値すなわち「カットオフ」値は５０である）より上（上の曲線、１番）または下（下の曲線、２番）のそれぞれ抗３Ｓ抗体レベルを有するＨＩＶ−１感染患者の１２０カ月の期間におよぶ生存時間を示したカプランマイヤー曲線を示した図である。横座標：月数で表現した、ＨＩＶ−１感染日後の期間。縦座標：生存分布（１００％＝１単位）。

【図2】図２は、２００個の細胞／mm^３を上回るＣＤ４数を有し、そして予め決定された基準値（ここでは、予め決定された基準値すなわち「カットオフ」値は５０である）より上（上の曲線、１番）または下（下の曲線、２番）のそれぞれ抗３Ｓ抗体レベルを有するＨＩＶ−１感染患者の３６カ月の期間におよぶ生存時間を示したカプランマイヤー曲線を示した図である。横座標：月数で表現した、ＨＩＶ−１感染日後の期間。縦座標：生存分布（１００％＝１単位）。

【図3】図３は、２００個の細胞／mm^３を上回るＣＤ４数を有し、そして予め決定された基準値（ここでは、ウイルス負荷基準値すなわち「カットオフ」値は４ｌｏｇである）より下（上の曲線、１番）または上（下の曲線、２番）のそれぞれウイルス負荷レベルを有するＨＩＶ−１感染患者の３６カ月の期間におよぶ生存期間を示したカプランマイヤー曲線を示した図である。横座標：月数で表現した、ＨＩＶ−１感染日後の期間。縦座標：生存分布（１００％＝１単位）。

【図4】図４は、２００個の細胞／mm^３を上回るＣＤ４数を有し、そして（ｉ）予め決定された基準値を上回る抗３Ｓ抗体（＞５０）および予め決定された基準値よりも低いまたは等しいウイルス負荷（≦４ｌｏｇ）（曲線番号１）、（ｉｉ）予め決定された基準値を上回る抗３Ｓ抗体（＞５０）および予め決定された基準値を上回るウイルス負荷（＞４ｌｏｇ）（曲線番号２）、（ｉｉｉ）予め決定された基準値よりも低いまたは等しい抗３Ｓ抗体（≦５０）および予め決定された基準値よりも低いまたは等しいウイルス負荷（≦４ｌｏｇ）（曲線番号３）、および（ｉｖ）予め決定された基準値よりも低いまたは等しい抗３Ｓ抗体（≦５０）および予め決定された基準値を上回るウイルス負荷（＞４ｌｏｇ）（曲線番号４）のそれぞれの４つのクラスに分類された、患者の３６ヶ月間の期間におよぶ生存時間を示したカプランマイヤー曲線の図を示す。横座標：月数で表現した、ＨＩＶ−１感染日後の期間。縦座標：生存している人々の比（１００％＝１単位）。

【図5】図５は、２００個の細胞／mm^３を上回るＣＤ４数を有し、そして（ｉ）予め決定された基準値を上回る抗３Ｓ抗体（＞５０）および予め決定された基準値よりも低いまたは等しいウイルス負荷（≦４ｌｏｇ）（曲線番号１）、（ｉｉ）予め決定された基準値を上回る抗３Ｓ抗体（＞５０）および予め決定された基準値を上回るウイルス負荷（＞４ｌｏｇ）（曲線番号２）、（ｉｉｉ）予め決定された基準値よりも低いまたは等しい抗３Ｓ抗体（≦５０）および予め決定された基準値よりも低いまたは等しいウイルス負荷（≦４ｌｏｇ）（曲線番号３）、および（ｉｖ）予め決定された基準値よりも低いまたは等しい抗３Ｓ抗体（≦５０）および予め決定された基準値を上回るウイルス負荷（＞４ｌｏｇ）（曲線番号４）のそれぞれの４つのクラスに分類された、患者の１２０ヶ月間の期間におよぶ生存時間を示したカプランマイヤー曲線の図を示す。横座標：月数で表現した、ＨＩＶ−１感染日後の期間。縦座標：生存している人々の比（１００％＝１単位）。

【図6】図６は、２００個の細胞／mm^３を上回るＣＤ４数を有し、そして（ｉ）予め決定された基準値を上回る抗３Ｓ抗体（＞５０）および予め決定された基準値よりも低いまたは等しいウイルス負荷（≦４ｌｏｇ）（曲線番号１）、（ｉｉ）予め決定された基準値を上回る抗３Ｓ抗体（＞５０）および予め決定された基準値を上回るウイルス負荷（＞４ｌｏｇ）（曲線番号２）、（ｉｉｉ）予め決定された基準値よりも低いまたは等しい抗３Ｓ抗体（≦５０）および予め決定された値よりも低いまたは等しいウイルス負荷（≦４ｌｏｇ）（曲線番号３）、および（ｉｖ）予め決定された基準値よりも低いまたは等しい抗３Ｓ抗体（≦５０）および予め決定された値を上回るウイルス負荷（＞４ｌｏｇ）（曲線番号４）のそれぞれの４つのクラスに分類された、ＡＩＤＳを有さない患者の１２０カ月の期間におよぶ生存時間を示したカプランマイヤー曲線の図を示す。横座標：月数で表現した、ＨＩＶ−１感染日後の期間。縦座標：生存している人々の比（１００％＝１単位）。

【0012】

発明の詳細な説明
本発明は、ＨＩＶ−１感染患者におけるＨＩＶ−１疾病の進行状態を示す新規で独立したマーカーを提供する。本発明は、前記の新規で独立したマーカーを使用して、ＨＩＶ−１疾病の進行の予後を決定するための新規な方法を提供する。

【0013】

本発明によると、検査したＨＩＶ−１感染個体からの試料において決定された、特定のＨＩＶ−１由来ペプチド（「３Ｓ−ペプチド」）に対して指向される抗体のレベルは、前記個体のＨＩＶ−１疾病の進行の状態を示すことが判明した。

【0014】

ＨＩＶ−１ウイルスのｇｐ４１糖タンパク質に由来するペプチドからなる前記３Ｓペプチドはそれ自体公知である。３Ｓペプチドは、当技術分野において、ＣＤ４Ｔ細胞においてＮＫｐ４４Ｌタンパク質の膜発現を誘導することが示されている。ＣＤ４Ｔ細胞の表面におけるＮＫｐ４４Ｌ発現は、ＨＩＶ−１−１感染の最中の活性化ＮＫ細胞によるＣＤ４Ｔ細胞の溶解において重要な役割を果たし、そして結果として、３Ｓ−ペプチドに対して指向される特異的抗体は、疾病の経過に影響を及ぼし得ると考えられた（Vieillard et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 102 : 10981-10986参照）。

【0015】

また、当技術分野において、抗３Ｓ抗体は、ＡＬＴと命名された非常に特殊な患者コホートに属する幾人かのＨＩＶ−１感染患者において検出され、前記コホートは、専ら、無症候性の長期生存という稀な表現型を有するＨＩＶ−１感染患者を含む（Vieillard et al., 2006, AIDS, Vol. 20(14) : 1795-1804参照）。Vieillard et al.(2006)は、前記のＡＬＴ患者コホートにおいて、（ｉ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞数の減少と、（ｉｉ）抗３Ｓ抗体レベルの減少との間の相関の存在を示した。Vieillard et al. (2006)はまた、抗３Ｓ抗体の存在が、これらの高度に特異的なＨＩＶ感染個体において、高レベルのＣＤ４^＋Ｔ細胞と相関していたことを示した。

【0016】

Vieillard et al.(2006)は、抗３Ｓ抗体の存在が、ＮＫｐ４４Ｌの発現およびＮＫ溶解に対するＣＤ４の感受性を抑制することで疾病の経過に影響を及ぼし得ると結論付けた。また、Vieillard et al.(2006)は、血清中の抗３Ｓ抗体の存在がＣＤ４細胞数を制御するのに役に立つと述べた。これらの著者らは、ＣＤ４Ｔ細胞全個体群の枯渇が、抗３Ｓ抗体の消失と密接に関連することを観察した。これらの著者らはまた、抗３Ｓ抗体の産生が、おそらく、ＣＤ４Ｔ細胞の進行性の枯渇を減速させることに寄与し得ることを付け加えた。

【0017】

今回、本発明により、抗３Ｓ抗体のレベルは、ＨＩＶ−１感染患者におけるＨＩＶ−１疾病の進行状態の信頼性あるマーカーを構成することが判明した。

【0018】

驚くべきことに、本発明者らは、抗３Ｓ抗体のレベルは、ＨＩＶ−１疾病進行の信頼性のある指標であることを示した。

【0019】

さらに、本明細書において、抗３Ｓ抗体レベルは、マーカーが単独で使用された場合にさえ、ＨＩＶ−１疾病の進行を示すマーカーを構成することが示された。

【0020】

またさらに、本明細書において、抗３Ｓ抗体レベルは、ＣＤ４数予後診断マーカーおよびウイルス負荷予後診断マーカーを含む他の慣用的に使用されるＨＩＶ−１予後診断マーカーとは独立した、ＨＩＶ−１疾病進行マーカーを構成することが示された。

【0021】

本明細書において、本発明による結果は、一般的なＨＩＶ−１感染患者のコホート、すなわちＨＩＶ−１血清陽性個体のコホートから得られ、Vieillard et al.(2006)によって研究されたＡＬＴコホートのような無症候性の長期生存という稀な表現型を有する患者コホートからは得られていないことが明記されている。

【0022】

当然のこととして、無症候性の長期生存個体におけるＨＩＶ感染の進行機序は、一般的なＨＩＶ感染被験者の個体群で見られ得るものとは異なる。これは再度、本明細書において開示された本発明の所見によって完全に説明される。

【0023】

本発明によると、一般的なＨＩＶ−１感染患者の個体群においては、ＡＬＴ患者コホートから得られたVieillard et al.の所見とは対照的に、（ｉ）抗３Ｓ抗体レベルと（ｉｉ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞レベルとの間に相関はないことが判明した。本発明の所見はここでも、当業者が、一般的なＨＩＶ感染被験者の個体群におけるＨＩＶ感染の進行を解明するために、無症候性の長期生存ＨＩＶ感染個体から得られたデータの利点を活用することを期待できないことを示す。

【0024】

さらに、上で示したように、当技術分野において、特殊なＡＬＴ患者コホートにおいては、抗３Ｓ抗体のレベルは、ＣＤ４Ｔ細胞数と強く相関すると考えられた。Vieillard et al.(2006)の以前の結果は、抗３Ｓ抗体レベルとＣＤ４細胞数との間に見られた強い相関のために、（ｉ）ＨＩＶ−１疾病予後診断マーカー、すなわちＣＤ４細胞数と（ｉｉ）ＨＩＶ−１感染患者の生物学的パラメーター、すなわち抗３Ｓ抗体レベルとの間に強い依存性が見られたことを当業者にせいぜい教義しただけであったことが思い出される。当業者はVieillard et al.(2006)の結果を考慮すると仮説的に認めたとしても、ＣＤ４細胞数および抗３Ｓ抗体レベルによって予想通りにもたらされるであろう以前に開示された情報の重複は、当業者に、抗３Ｓ抗体レベルが、ＨＩＶ−１疾病進行の予後診断マーカーを構成し得るという可能性を探索することをやめさせるだろう。

【0025】

特定の局面において、本発明は、ＨＩＶ−１疾病進行の重度の予後診断法を提供し、前記方法は、特に、ＡＩＤＳの経過をモニタリングするために、並びに抗レトロウイルス処置の治療効力をモニタリングするために使用され得る。

【0026】

本発明は、ＨＩＶ−１ウイルスに感染した患者におけるin vitroにおけるＨＩＶ−１疾病の進行の予後診断法に関し、これは
ａ）前記患者から収集した試料中の配列番号２の３Ｓペプチドに対して指向される抗体のレベルを測定する工程、
ｂ）工程ａ）で測定した抗３Ｓ抗体のレベルを、ＨＩＶ−１疾病の進行を示す抗３Ｓ抗体レベルの基準値と比較する工程
を含む。

【0027】

本明細書の実施例に示されているように、一般的なＨＩＶ−１感染個体の個体群において、抗３Ｓ抗体の存在ではなく抗３Ｓ抗体のレベルと、ＨＩＶ−１疾病の進行の予後との間に相関が認められた。

【0028】

本明細書で意味するような「ＨＩＶ−１疾病」は、ウイルス感染事象の時から始まって、個体の死亡日までに（個体の死亡が、ウイルス感染事象の直接的な結果または間接的な結果であるかに関わらず）、ＨＩＶ−１ウイルスに感染した個体の受ける全ての生理学的容態を基本的に包含する。ＨＩＶ−１ウイルスによる個体の感染は、免疫系の効力の減少を進行的に引き起こし、そしてＨＩＶ−１感染個体を日和見感染および腫瘍にかかりやすくする、慢性的な疾病状態を引き起こすことが思い出される。従って、ＨＩＶ−１疾病は、一次感染（または急性感染）の時期、血清転換の時期、無症候性段階の時期、ＨＩＶ−１症候性疾病の初期および中期の段階、並びにＨＩＶ−１疾病の後期の段階（ＡＩＤＳとも呼ばれる）を包含する。

【0029】

本発明によると、配列番号２のペプチドに対して指向される抗３Ｓ抗体は、ペプチド配列ＮＨ_２−ＳＷＳＮＫＳ−ＣＯＯＨ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する基準ポリペプチドに特異的に結合する抗体を包含する。これらの抗体はまとめて本明細書において「抗３Ｓ抗体」と呼ばれる。それはまた、配列番号２の配列に密接に関連したアミノ酸配列を有するペプチドに結合する抗体にも対応し得る。配列番号２に密接に関連した配列を有するペプチドは、配列番号３および配列番号４からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むペプチド（これは１６アミノ酸残基長を有するペプチドを含む）、並びに配列番号３および配列番号４からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むペプチド（例えば、これは（ｉ）配列番号２のペプチドの変異体（１１位のアミノ酸残基セリンが、トレオニン残基によって置換されている）および（ｉｉ）配列番号２のペプチドの変異体（１０位のアミノ酸残基リジンが、アルギニン残基によって置換されている）を含む）を包含する。

【0030】

本明細書において意図したように、３Ｓ−ペプチドに対して指向される抗体は、配列番号２のペプチドに結合する抗体を包含する。

【0031】

本発明によると、抗３Ｓ抗体は、好ましくは、３Ｓペプチドに結合するポリクローナル抗体からなり、そしてこれはＨＩＶ感染個体から収集された試料中に含まれる。

【0032】

好ましくは、３Ｓ−ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドからなる。

【0033】

本明細書において意図するＨＩＶ疾病診断予後マーカーの「レベル」は、試料中、例えばＨＩＶ感染患者から収集した試料中の前記予後診断マーカーの定量値からなる。いくつかの態様において、前記の定量値は、実際に測定された絶対値からなるのではなく、むしろ、使用したアッセイフォーマットで起こるシグナル・ノイズ比を考慮し、そして／またはアッセイごとのＨＩＶ疾病マーカーレベルの測定の再現性を高めるために使用された較正基準値を考慮して得られた最終値からなる。いくつかの態様において、ＨＩＶ疾病予後診断マーカーの「レベル」は、任意単位として表現される。なぜなら、重要なのは同じ種類の任意単位を（ｉ）アッセイごとに、または（ｉｉ）ＨＩＶ感染患者ごとに、または（ｉｉｉ）同じ患者の明確に異なる時点で実施されたアッセイごとに、または（ｉｖ）患者の試料中で測定されたＨＩＶ予後診断マーカーレベルと、予め決定された基準値（これは本明細書においては「カットオフ」値とも呼ばれ得る）とを比較することであるからである。

【0034】

実際に、試料中の抗３Ｓ抗体レベルを表現するためにどのような種類の数値的単位を使用したとしても、測定された数値は、検査した試料中に含まれる抗３Ｓ抗体の量、または最も好ましくは前記試料中の抗３Ｓ抗体の濃度を反映する。

【0035】

また実例として、ＨＩＶウイルス負荷予後診断マーカーは、検査した患者の試料中に含まれるＨＩＶゲノムのコピー数、または代替的には検査した患者の試料中のＨＩＶゲノムコピーの濃度を反映する数値的単位で表現され得る。

【0036】

同様に、他のＨＩＶ予後診断マーカーも数値的単位で表現され得、これはそれぞれ（ｉ）検査した試料中のＣＤ４Ｔ細胞の数または代替的にはその濃度、および（ｉｉ）検査した試料中に存在する全リンパ球細胞の中のＣＤ４Ｔ細胞の比率を反映する。

【0037】

本明細書で意図したように、患者から収集した試料は、抗体を含むと予想されるあらゆる体液、並びに主に血液および血液由来物質を包含する。本発明によると、患者から収集された試料は、全血試料、血清試料および血漿試料を包含する。

【0038】

本明細書の実施例において示したように、本発明のin vitroにおける方法は、ＨＩＶ感染患者における免疫抑制状態の早期発生または遅延発生の可能性を決定することを可能とする。結果として、本発明のin vitroにおけるＨＩＶ疾病の進行の予後診断法は、ＨＩＶ感染患者の臨床パラメーターを追跡するための時間間隔の期間を決定する目的で、そしてその後、抗レトロウイルス治療処置を開始する好機を決定するために実施され得る。

【0039】

また、本明細書の実施例において示されているように、本発明のin vitroにおける方法は、ウイルス感染に因り免疫抑制状態をすでに受けているＨＩＶ感染患者におけるＨＩＶ疾病の進行の予後を決定することを可能とする。別の言葉で言えば、本発明のin vitroにおける方法は、（ｉ）ＨＩＶ疾病の症候性段階に早期に入る可能性が高いＨＩＶ感染免疫抑制患者と、（ｉｉ）ＨＩＶ疾病の症候性段階に早期に入る可能性が低いＨＩＶ感染免疫抑制患者とを識別することを可能とする。

【0040】

また、本明細書の実施例は、本発明のin vitroにおけるＨＩＶ疾病の進行の予後診断法が、（ｉ）長期生存の可能性が高いＨＩＶ感染患者と、（ｉｉ）長期生存の可能性が低いＨＩＶ感染患者とを識別することを可能とすることを示す。

【0041】

前記方法の工程ａ）において、抗３Ｓ抗体のレベルは、当業者には周知の任意の抗体検出法によって測定され得る。従って、抗３Ｓ抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、イムノアフィニティクロマトグラフィー、免疫沈降法などを含むがそれらに限定されない、任意の種類のイムノアッセイによって測定され得る。

【0042】

特定の態様において、抗３Ｓ抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡ法を包含するイムノソルベントアッセイによって測定される。

【0043】

工程ａ）において、抗３Ｓ抗体のレベルは、（ｉ）抗体検出法においてベイトとして使用される３Ｓペプチドと（ｉｉ）検査した患者の試料中に存在する抗３Ｓ抗体との間に形成される複合体によって直接的にまたは間接的に生成される実際のシグナルを指す数値として表現される。

【0044】

抗体検出法、例えばＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイを実施する場合には慣用的であるように、シグナルレベル（すなわち抗３Ｓ抗体レベル）は、任意単位（ＡＵ）として表現される。任意単位は、一般的に、バックグラウンドノイズシグナルを差し引いた後に決定され、後者は、抗３Ｓ抗体が除外されていることが知られる患者の試料（例えば血清試料または血漿試料）と同じ種類の試料から測定される。一般的に、任意単位は、一連の較正標準物質（例えば、一連の試料、各試料は既知量の抗３Ｓ抗体を含む）を使用して、抗体検出法を較正した後に決定される。

【0045】

本発明のin vitroにおけるＨＩＶ疾病予後診断法の工程ｂ）において、工程ａ）で測定される抗３Ｓ抗体のレベルの定量値を、ＨＩＶ疾病の予後を示す予め決定された基準値と比較する。前記の予め決定された基準値は、「ＨＩＶ疾病予後を示す」。なぜなら、それは、（ｉ）前記の基準値を上回る工程ａ）で測定された値に対するＨＩＶ疾病進行の「良好な」予後と、（ｉｉ）前記の基準値を下回る工程ａ）で測定された値に対するＨＩＶ疾病進行の「悪い」予後との識別を可能とするからである。

【0046】

本明細書の実施例において開示されているように、生存時間を含む種々の関連した臨床パラメーターについて追跡された大きなＨＩＶ感染個体コホートから収集された試料において得られた抗３Ｓ抗体レベル値からのカプランマイヤー曲線を実施することによって、本発明者らは、（ｉ）遅延した自発的なＨＩＶ疾病進行および長い生存時間を含む好ましい転帰を有する患者と、（ｉｉ）遅延していない自発的なＨＩＶ疾病進行および短い生存時間を含む不良な転帰を有する患者とを識別することを可能とする抗３Ｓ抗体レベル値を決定した。

【0047】

実例として、本明細書の実施例において開示されたＥＬＩＳＡ検査フォーマットを使用した場合、予め決定された基準値（これはまた「カットオフ」値とも呼ばれ得る）は５０である。従って、実施例において開示されたＥＬＩＳＡ検査フォーマットを使用して、５０未満の抗３Ｓ抗体レベル値が、本発明によるin vitroにおける方法の工程ａ）で測定されたＨＩＶ感染患者から収集された試料は、好ましくない転帰を有する患者として分類される。逆に、５０を超える抗３Ｓ抗体レベル値が本発明によるin vitroにおける方法の工程ａ）で測定されたＨＩＶ感染患者から収集された試料は、好ましい転帰を有する患者として分類される。

【0048】

本発明のin vitroにおけるＨＩＶ疾病予後診断法を実施するために、前記方法の工程ｂ）で比較のために使用される基準値（これはまた「カットオフ」値とも呼ばれ得る）は、以下に記載のように決定され得る。

【0049】

抗３Ｓ抗体予後診断マーカーの基準（「カットオフ」）値は、
ａ）ＨＩＶ感染患者からの試料の収集物を準備する工程；
ｂ）工程ａ）で準備された各患者の試料のために、対応するＨＩＶ感染患者についての実際の臨床転帰に関する情報を準備する工程；
ｃ）抗３Ｓ抗体レベルについての一連の任意の定量値を準備する工程；
ｄ）工程ａ）で準備された収集物に含まれる各患者の試料中の抗３Ｓ抗体のレベルを定量する工程；
ｅ）工程ｂ）で準備された１つの特定の任意定量値に対して前記の患者の試料をそれぞれ以下の２つの群に分類する工程：
（ｉ）前記の一連の定量値に含まれる前記の任意の定量値よりも低い抗３Ｓ抗体レベルについての定量値を示す患者の試料を含む第１群；
（ｉｉ）前記の一連の定量値に含まれる前記の任意の定量値よりも高い抗３Ｓ抗体レベルについての定量値を示す患者の試料を含む第２群；
これにより、前記の特定の定量値に対して２つの群の患者の試料が得られ、各群の患者の試料は別々に列挙される；
ｆ）工程ｄ）で得られた前記の生物学的マーカーについての定量値と、（ｉｉ）工程ｅ）で定義された第１群および第２群に含まれる血清／血漿試料が得られた患者の実際の臨床転帰との間の統計学的有意性を計算する工程；
ｇ）工程ｅ）からｆ）まで種々の任意値を検査する工程、
ｈ）得られた任意の定量値（最も高い統計学的有意性（最も有意）が工程ｇ）で観察された）からなるとして前記の基準値（「カットオフ」値）を設定する工程
を含む方法を実施することによって予め決定され得る。

【0050】

上において開示されているように、前記の方法は、悪い転帰予後と良好な転帰予後とを識別することを可能とする「カットオフ」値の設定を可能とする。

【0051】

本明細書において意図されているように、そして本明細書の実施例において示されているように、（ｉ）悪い転帰予後は、５００個の細胞／mm^３を下回るＣＤ４Ｔ細胞数を有する患者（２００個の細胞／mm^３を下回るＣＤ４Ｔ細胞数を有する患者を含む）について、ＡＩＤＳの臨床症状の発症が、ＨＩＶによる感染時から６〜７２カ月後の期間内に起こる高い確率、並びに、短い生存期間を包含し、一方、（ｉｉ）良好な転帰予後は、５００個の細胞／mm^３を下回るＣＤ４Ｔ細胞数を有する患者（２００個の細胞／mm^３を下回るＣＤ４Ｔ細胞数を有する患者を含む）についての、ＡＩＤＳの臨床症状の発症が、ＨＩＶによる感染時から６〜７２カ月後の期間内に起こる低い確率、並びに、長い生存期間を包含する。

【0052】

上のカットオフ値を決定するための方法の工程ｂ）の特定の好ましい態様において、ＨＩＶ感染患者の実際の臨床転帰に関する前記情報は、（ｉ）ＡＩＤＳを有さない生存期間（ＡＦＳ）および（ｉｉ）５００個のＣＤ４細胞／mm^３を下回るまたは２００個のＣＤ４細胞／mm^３を下回るＣＤ４Ｔ細胞数を有する患者の生存時間（ＴＣＤＢ）からなる群より選択される。

【0053】

本明細書の実施例において示されているように、予後診断マーカーとして抗３Ｓ抗体のレベルを使用した場合に、ＨＩＶ疾病予後診断の正確度は、前記の予後診断マーカーを、それ自体公知である１つ以上のＨＩＶ予後診断マーカー、例えばＨＩＶウイルス負荷と組み合わせることによってさらに改善され得る。

【0054】

実施例において示されているように、抗３Ｓ抗体レベルのＨＩＶ疾病予後診断正確度は、他の公知のＨＩＶ予後診断マーカーの１つ、すなわちウイルス負荷の予後診断正確度よりも有意に高い。しかしながら、実施例はまた、本発明のin vitroにおけるＨＩＶ疾病予後診断法の予後診断正確度は、（ｉ）ウイルス負荷マーカーと（ｉｉ）抗３Ｓ抗体マーカーのレベルとを組み合わせることによって改善され得ることを示す。

【0055】

従って、本発明のin vitroにおけるＨＩＶ疾病予後診断法のいくつかの態様において、前記方法はさらに、
１）前記患者から収集した前記試料中のＨＩＶウイルス負荷を測定する工程、および
２）工程１）で測定したウイルス負荷値を、ＨＩＶ疾病の進行を示す基準値と比較する工程
を含む。

【0056】

上の方法の態様において、ウイルス負荷は、当業者には周知の慣用的な技術のいずれか１つを通して測定され得る。実例として、ウイルス負荷は、Jennings et al. (2005, J Clin Microbiol, Vol. 43(12) : 4950-4956)によって開示された方法を使用することによって測定され得る。実際に、ウイルス負荷定量のための基準値は、抗３Ｓ抗体のレベルの予め決定された基準値（または「カットオフ」値）を計算するために本明細書において記載されたものと同じ方法を使用することによって決定され得る。

【0057】

当業者によって容易に理解され得るように、ウイルス負荷マーカーの予め決定された基準値（または「カットオフ」値）は、使用されるウイルス負荷アッセイフォーマットに依存して変化し得る。

【0058】

実例として、ウイルス負荷マーカーの４ｌｏｇの予め決定された基準値（「カットオフ」値）は、本発明のin vitroにおけるＨＩＶ疾病予後診断法を実施するために実施例において使用されている。

【0059】

任意の特定の理論によって固めたくはないが、本発明者らは、本発明のin vitroにおけるＨＩＶ疾病予後診断法は、抗３Ｓ抗体予後診断マーカーと、１つ以上の他のＨＩＶ疾病予後診断マーカーとを組み合わせることによって実施され得ると考える。前記の１つ以上のＨＩＶ疾病予後診断マーカーは、（ｉ）ＨＩＶウイルス負荷、（ｉｉ）ＣＤ４Ｔ細胞の絶対数および（ｉｉｉ）ＣＤ４＋Ｔリンパ球の比率からなる群より選択され得る。

【0060】

これらの態様によると、in vitroにおけるＨＩＶ疾病の進行の予後診断法は、
ａ）ＨＩＶ感染患者から収集した試料中の抗３Ｓ抗体のレベルおよび少なくとも１つの他のＨＩＶ疾病予後診断マーカーを測定する工程、および
ｂ）工程ａ）で測定した各ＨＩＶ疾病予後診断マーカーについて、得られたマーカー値を、前記予後診断マーカーの基準値と比較する工程
を含み得る。

【0061】

好ましい態様において、前記の１つ以上の他のＨＩＶ疾病予後診断マーカーは、（ｉ）ＨＩＶウイルス負荷、（ｉｉ）ＣＤ４Ｔ細胞の絶対数、（ｉｉｉ）ＣＤ４Ｔ細胞の比率および（ｉｖ）ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔリンパ球の比率からなる群より選択される。これらは、ＨＩＶ疾病予後診断マーカーの以下の組合せ：
− 上のマーカー（ｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｉｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉ）および（ｉｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉ）および（ｉｉｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｉ）および（ｉｉｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｉｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、
− 上のマーカー（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル、および
− 上のマーカー（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）と組み合わせた抗３Ｓ抗体レベル
を含む。

【0062】

工程ａ）で測定した各マーカー値が、それぞれの基準値より上または下であるかどうか（工程ｂ）で比較する）に依存して、ＨＩＶ疾病の進行の「良好な」予後またはＨＩＶ疾病の進行の「悪い」予後が決定される。実際に、（ｉ）予め決定された値を上回る抗３Ｓ抗体値は「良好な」予後として分類され、一方（ｉｉ）予め決定された基準値を上回るウイルス負荷値は「悪い」予後パラメーターとして分類される。

【0063】

実際に、工程ｂ）の結果は、（ｉ）検査した少なくとも１つのＨＩＶ予後診断マーカーについて、工程ａ）で測定したマーカー値が、前記マーカーについて「悪い」予後として分類される（すなわち、マーカーは「低い」と印され得る）状況、および（ｉｉ）検査した少なくとも１つの他のＨＩＶ予後診断マーカーについて、工程ａ）で測定したマーカー値が、前記マーカーについて「良好な」予後として分類される（すなわちマーカーは「高い」と印され得る）状況を包含する。これらの状況において、ＨＩＶ疾病の進行についての予後は、「高い」マーカーおよび「低い」マーカーの数および場合によりそれぞれの統計学的重みを考慮に入れることによって決定される。いくつかの態様において、検査された各マーカーの測定値は、前記の測定されたマーカー値に対して、ＨＩＶ疾病の進行の予後における統計学的有意性のその重みを実体化する数的因子を作用させることによって平衡化される。

【0064】

抗３Ｓ抗体予後診断マーカーを１つ以上の他のＨＩＶ疾病予後診断マーカーと組み合わせる本発明のＨＩＶ疾病の進行の予後診断法の態様において、工程ｂ）は、検査した各ＨＩＶ予後診断マーカーについて工程ａ）で測定した値を数学的に積分し、そして各々の対応する基準値と比較することによって行なわれ、よって得られた複合ＨＩＶ疾病予後診断マーカーの単一の予測値（例えば「悪い」予後または「良好な」予後）が生成される。２つ以上のマーカーの組合せを統合した複合マーカーの生成は、当業者には周知である。

【0065】

実例として、ＨＩＶ疾病進行についての複合予後診断マーカーは、そこに含まれる各々の個々の予後診断マーカーの線形的な組合せから生じ得、ロジスティック回帰分析を使用して、複合予後診断マーカー内の各々の個々の予後診断マーカーのそれぞれの重みを推定し得る。あるいは、適切な数学的モデルを使用して、使用したマーカー組合せの予後値を確立することができる。

【0066】

本発明はさらに、疾病進行の正確な予後指標を提供することによって、ＨＩＶ感染のための治療処置の効力をモニタリングするための方法を提供する。このようなモニタリング法は、（ｉ）可能な治療薬を同定するために、および（ｉｉ）これらの薬物を用いた療法を受けている患者をモニタリングするための両方のために非常に重要である。

【0067】

特に、本発明は、治療処置の効力をモニタリングするための方法を扱い、これは
ａ）必要とするＨＩＶ感染患者に、１つ以上の抗レトロウイルス剤を含む薬学的組成物を投与することによって治療処置を実施する工程、および
ｂ）前記患者から収集した試料に対して本明細書に記載されたin vitroにおけるＨＩＶ疾病の進行の予後診断法を実施する工程、および
ｃ）必要であれば、工程ａ）で実施された治療処置を適切に適応させる工程
を含む。

【0068】

いくつかの態様において、工程ａ）で実施される治療処置は、「良好な」予後、例えば、ＡＩＤＳ段階への進入を伴わない長い生存時間の高い可能性が決定されれば継続される。

【0069】

いくつかの態様において、治療処置は、「悪い」予後、例えばＡＩＤＳ段階への進入を伴わない長い生存時間の低い可能性が決定されれば、適応させる（例えば、より高い用量で投与されるか、または１つ以上の活性成分をより効率的なものと置き換える）。

【0070】

特定の局面において、本発明は、有効量の抗ウイルス剤（または抗ウイルス剤の組合せ）をＨＩＶ感染個体に投与し、そして治療転帰をモニタリングすることを考える。

【0071】

本明細書において以前にすでに明記したように、in vitroにおけるＨＩＶ疾病の進行の予後診断法は、好ましくは、公知の免疫検出法によって実施される。本明細書の実施例は、非常に慣用的な免疫検出法である酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、本発明のin vitroにおけるＨＩＶ予後診断法を実施する態様を説明する。他の免疫検出法と同様に、ＥＬＩＳＡは、非競合的イムノアッセイとしてまたは競合的イムノアッセイとしてのいずれかで実施され得る。

【0072】

非競合的ＥＬＩＳＡでは、標識されていない抗原（例えば３Ｓペプチド）を、マイクロタイタープレートまたはバイオチップの表面などの固相支持体または反応容器に結合させる。

【0073】

その後、生物学的試料（例えばＨＩＶ感染患者から収集された試料）を、反応容器に結合した抗原と合わせ、そして生物学的試料中に存在する抗体（例えば、ＨＩＶ感染患者から収集された試料中に存在する抗３Ｓ抗体）を、固相支持体上に固定された抗原と結合させ、これにより免疫複合体を形成させる。

【0074】

免疫複合体が形成された後、過剰な生物学的試料を除去し、そして容器を洗浄して、非特異的に結合した抗体を除去する。その後、免疫複合体を、適切な酵素標識抗免疫グロブリン（これは「二次抗体」とも呼ばれ得る）と反応させる。二次抗体は、免疫複合体中の抗体（例えば抗３Ｓ抗体）と反応するが、反応容器に結合した他の抗原とは反応しない。ヒト抗体との結合に特異的な二次抗体は当技術分野において周知であり、そしてこれはSigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA)などから市販されている。

【0075】

２回目の洗浄工程後、酵素基質を加える。二次抗体に連結した酵素は、基質を検出可能な産物へと変換する反応を触媒する。過剰な抗原が存在する場合、産物の量は、患者の試料中に存在する抗体（「一次抗体」とも呼ばれる）の量と正比例する。

【0076】

いくつかの態様において、産物は蛍光または発光であり、これは、当技術分野において周知の技術および装置を使用して測定することができる。いくつかの態様において、酵素反応により、酵素基質の発色性産物への変換がなされ、これは分光光度的に測定され得る。

【0077】

二次抗体に連結させることのできる典型的な酵素としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびウレアーゼが挙げられる。

【0078】

ＥＬＩＳＡを実施するために適切な固相支持体としては、有機および無機ポリマー、例えばデキストラン、天然または改質セルロース（modified celluloses）、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミドなどが挙げられる。

【0079】

３Ｓペプチドを使用した抗３Ｓ抗体の免疫検出によって、本発明に記載のin vitroにおけるＨＩＶ疾病の進行の予後診断を実施するために、前記３Ｓペプチドは、（ｉ）化学合成によって、または（ｉｉ）前記３Ｓペプチドをコードする発現カセット（最終的に組換えベクター、すなわち組換えプラスミドに挿入される）で形質転換された例えばE.coli細胞における組換え発現によって得られる。

【0080】

本発明はさらに、以後の実施例によって（いずれにしてもこれに制限されることはない）説明される。

【0081】

実施例
実施例１：ＨＩＶ疾病の進行の予後診断マーカーとしての抗３Ｓ抗体のレベルの同定
Ａ．材料および方法
Ａ．１．患者
１９８８年に開始されたＡＮＲＳＳＥＲＯＣＯ／ＨＥＭＯＣＯコホートには、２１の病院および個人開業医のネットワークから問い合わせられたＨＩＶ感染成人が登録された。研究は倫理委員会によって承認され、そして全ての被験者は、書面によるインフォームドコンセントを提出した。患者は参加時に臨床検査を受け、そしてその後、その臨床状態に応じて３または６カ月毎に診察を受ける。全てのＡＩＤＳ指標疾患がカルテで確認され、そして担当医師によって見直される。経過観察できなかった患者の臨床状態は、国立ＡＩＤＳ登録一覧表（national AIDS register）を用いて照合確認することによって評価される。登録時および６カ月毎の受診時に収集された血清は−１８０℃で保存される。

【0082】

本研究において適格な患者は、既知の血清転換日を有し、感染から２４カ月後以内および１９９６年より前にコホートに含められ、そして登録時から利用可能な凍結保存された血清試料を有していた。ＨＩＶ血清転換は、ＨＩＶ抗体検査陰性から陽性までの２４ヶ月未満の間隔、または不完全なウェスタンブロット、その後の完全なウェスタンブロットによって記述された。感染日は、不完全なウェスタンブロット日−１カ月、または初回症候性感染日−１５日間、または２つの検査の間の中点として定義された(Hubert 2000)。入手可能な凍結血清を有する２４４人の血清転換者がこの分析に含められた。経過観察は、ｃＡＲＴの広範な使用の時代の前の１９９６年に検閲された。感染年の中央値は１９８９年であり、そして感染以後の経過観察時間の中央値は６．５年間であった。

【0083】

Ａ．２．研究プロトコール
本発明者らは、感染から２４カ月後以内のＳＥＲＯＣＯコホートにおける１９９６年以前に登録された２４４人のＨＩＶ−１の非処置の血清転換者を検討した（登録年の中央値は１９８９年）。経過観察は１９９６年に検閲し、経過観察の中央値は６．５年間であった。初期抗３Ｓ抗体レベルは、登録時に凍結血清から測定した。疾病進行のリスクに対する抗３Ｓ抗体の役割を推定するために、感染から２００／mm^３を下回るＣＤ４（９１事象）および臨床的ＡＩＤＳ（８３事象）までの時間を、５０単位／mLを超える抗体を有する患者を、より低いまたは検出不可能なレベルを有する患者と比較して、カプランマイヤー曲線を通して推定した。粗および調整ＲＲを、Ｃｏｘ回帰モデルを通して推定した。

【0084】

Ａ．３．抗３Ｓ抗体レベルの測定
ＥＬＩＳＡアッセイを、平底９６ウェルマイクロプレート上（Maxisorp, Nunc）で実施した。

【0085】

プレートを、ＰＢＳ中２mg/mlの３Ｓペプチドを用いて４℃で一晩１７時間かけてコーティングした。プレートを２回ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、そしてその後、ＰＢＳ／３％脱脂乳中で３７℃で２時間かけて遮断した。

【0086】

検査した血清／血漿を熱で失活させ（５６℃、４５分間）、そしてその後、種々の濃度（１／２０、１／２００および１／２０００）で３連、３７℃で１時間３０分かけて加えた。血清をアッセイバッファー（ＰＢＳ、３％脱脂乳、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０）中で希釈した。

【0087】

ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ中で２回洗浄した後、１／２０００に希釈したビオチン−ＳＰ−コンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）を加え、そして３７℃で１時間かけてインキュベーションした。ビオチンコンジュゲート抗体をアッセイバッファー（ＰＢＳ、３％脱脂乳、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０）中で希釈した。

【0088】

洗浄後、ビオチンを、１／５０００に希釈したExtraAvidinペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma）を使用して３７℃で１時間かけて捕捉した。ExtrAvidinをアッセイバッファー（ＰＢＳ、３％脱脂乳、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０）中で希釈した。最後の洗浄後、基質溶液を用いて発色させ、そして４５０nmにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。

【0089】

プレートを、２回ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ中で、そしてその後２回ＰＢＳ中で洗浄し、そしてＴＭＢ（Sigma）の存在下、室温で暗闇下で３０分間かけて色を顕現させた。

【0090】

化学反応を４ＮＨ_２ＳＯ_４を用いて停止し、そして４５０nmで分析した（Microplate reader, Molecular Devices）。

【0091】

陰性対照は、アッセイバッファーで１／２０に希釈した１０人の非感染ドナーからのヒトＡＢ血清（ＳＡＢ）および血漿を使用した。

【0092】

抗３Ｓ抗体の定量は、１５Ｃ８ｆ２と命名された、精製マウス抗３Ｓモノクローナル抗体の希釈液を含む、較正標準物質を使用した。標準曲線は、このモノクローナル抗体の連続２倍希釈液に相当し、数値は０から２００ng/mlの間であった。モノクローナル抗体はアッセイバッファーで希釈される。

【0093】

検査した試料のＯＤは、標準曲線の線形部分内に報告され、同じシグナルを与える１５Ｃ８Ｆ２モノクローナル抗体の対応する濃度が得られる。

【0094】

任意単位で表現される抗３Ｓ抗体の数値は、検査した試料の希釈係数および容量を考慮することによって決定される。検出限界は、陰性対照について得られた数値によって設定され、そして１０の任意単位の数値に固定される。

【0095】

Ａ．４．他の方法
ＣＤ４リンパ球数は、受診の度にフローサイトメトリーによって決定される。全てのＨＩＶ−１ＲＮＡレベルは保存された血清から遡及的に決定された。

【0096】

３つの参加している大学研究室が逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応を使用した（Amplicor HIV-1モニターアッセイ, Roche Molecular Systems, Neuilly-sur-Seine, 定量閾値４００コピー/mL）。初期の抗３Ｓ抗体レベルを、登録時に凍結血清から測定した（推定感染日からの時間の中央値：９か月間）。

【0097】

Ａ．５統計学的分析
ピアソンカイ二乗検定またはフィッシャー直接検定を使用して、質的変数を比較し：ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定を連続変数のために使用した。

【0098】

ＨＩＶ疾病進行のリスクの予後診断マーカーとしての抗３Ｓ抗体レベルの適格性についてアッセイするために、感染から２００／mm^３を下回るＣＤ４（９１事象）までのおよび臨床的ＡＩＤＳ（８３事象）までの時間を、カプランマイヤー曲線を通して推定した。５０単位／mLを超える抗体を有する患者における無事象生存曲線を、ログランク検定を使用してより低いまたは検出不可能なレベルを有するものと比較した。粗および調整された相対リスク（ＲＲ）を、Ｃｏｘモデルを使用することによって推定した。

【0099】

Ｂ．結果
血清転換者の７２％が、血清転換に近い検出可能な抗３Ｓ抗体を有し（推定感染日からの時間の中央値：９か月）、５３％が５０単位を超えていた。登録時の抗３Ｓ抗体レベルは、ＨＩＶ−ＲＮＡレベルと逆相関したが、以下の表１に示されているように、ＣＤ４数とは全く関連が認められなかった。従って、結果は、抗３Ｓ抗体レベルおよびＣＤ４Ｔ細胞数は、独立したマーカーからなることを示す。

【0100】

【表1】

【0101】

２００／mm^３を下回るＣＤ４への進行は、５０を超える抗３Ｓ抗体を有する患者において有意に遅延したが、効果は一過性であった（抗３Ｓ抗体と時間との間の相互作用項：ｐ＝０．００３）。これらの結果を図１および２に示す。

【0102】

図１および２の結果は、２００のＣＤ４Ｔ細胞／mm^３を下回るＣＤ４Ｔ細胞数に向かう進行のリスクは、参加後最初の１２０カ月間（図１；Ｐログランク＝０．０７；Ｐウィルコクソン＝０．０２）または参加後最初の３６ヶ月間（図２；Ｐログランク＝０．００２；Ｐウィルコクソン＝０．０２）を考慮に入れた場合、５０のカットオフ値を上回る抗３Ｓ抗体レベルを有する患者においては遅延することを示す。図１および２の結果は、抗３Ｓ抗体レベルが、ＨＩＶ疾病の進行についての、特に、２００／mm^３を上回るＣＤ４Ｔ細胞数を有するＨＩＶ感染患者における生存の予後についての実際の予後診断マーカーを構成することを示す。

【0103】

感染後から最初の３年間の間にＣＤ４＜２００／mm^３の相対リスク（ＲＲ）は０．２１であった（［９５％ＣＩ：０．０７〜０．６２］、ｐ＝０．００５）。

【0104】

この生存利点は、基線ウイルス負荷およびＣＤ４、年齢および性別について調整した後も依然として観察された（調整ＲＲ：０．２３［０．０７〜０．７３］、ｐ＝０．０１）。類似の結果が、ＡＩＤＳまでの時間についても観察された。

【0105】

カプランマイヤー曲線は、５０単位／mLを上回る抗体および４ｌｏｇを上回るウイルス負荷を有する患者における生存利点は、４ｌｏｇを超えるウイルス負荷を有する他の患者と比較して、５〜６年後にはもはや持続しなかったことを示す。これらの結果を図４〜６に示す。図３は、ＨＩＶウイルス負荷マーカー単独のＨＩＶ予後値を示す（ｐログランク＝０．００５；Ｐウィルコクソン＝０．００６）。両方のバイオマーカーが、異なる固有の予後値を有し、これらの各々は独立している。

【0106】

図３は、登録後最初の３６カ月間のＨＩＶウイルス負荷のレベルの分析を示し、ウイルス負荷値は、４ｌｏｇのカットオフ値より上または下として分類される。

【0107】

図４は、コンタミ後から３６カ月間の（ｉ）抗３Ｓ抗体レベル（５０のカットオフ値より上（「高い」）または下（「低い」））および（ｉｉ）ＨＩＶウイルス負荷のレベル（４ｌｏｇのカットオフ値より上または下）の複合分析を示す。図４の結果は、ＨＩＶ疾病の進行のより正確な予後が、抗３Ｓ抗体レベルマーカー（５０のカットオフ値を上回る抗３Ｓ抗体レベルを有するＨＩＶ感染患者）をＨＩＶウイルス負荷マーカー（４ｌｏｇのカットオフ値を下回るＨＩＶウイルス負荷値）と組み合わせた場合に決定されることを示す（ｐログランク＝０．００１；Ｐウィルコクソン＝０．００１）。コンタミ後から１２０カ月間の同じ結果を図５に示す（ｐログランク＝０．０００１；ｐウィルコクソン＝０．０００１）。

【0108】

図６は、コンタミ後から１２０ヶ月間、（ｉ）抗３Ｓ抗体レベルおよび（ｉｉ）ＨＩＶウイルス負荷のレベルの複合測定を使用した場合の、ＡＩＤＳに向けての進行のリスクの予後を示す。図６の結果は、ＨＩＶ疾病の進行の高度に正確な予後を示し、それぞれＰログランク＝０．０００５およびＰウィルコクソン＝０．０００３の非常に有意な値を有する。

【0109】

被験者の部分集合は、その抗体を、登録から２４〜３６カ月後に再度測定された。

【0110】

一貫して高い抗体を有する被験者は依然として、５０を下回る抗３Ｓ抗体レベルの減少を経験した被験者と比較して、無病生存利点を有していた。

【0111】

最後に、以下の表２に、抗３Ｓ抗体およびＨＩＶウイルス負荷のレベルは、ＨＩＶ感染患者におけるＨＩＶ疾病の進行についての２つの独立した予後診断マーカーを構成することが示される。

【0112】

【表2】