【図1】本発明で使用される野生型定常領域のアミノ酸配列。

【図2】重鎖ＣＨ１ドメインの操作。４つのＩｇＧアイソタイプに対するＣＨ１残基、露出率およびｐＩを低下するために加えることが可能な置換の例の一覧。番号付与は、ＥＵインデックスに準拠している。

【図3】軽鎖ＣＫドメインの操作。ＣＫ残基、露出率およびｐＩを低下するために加えることの可能な置換の一覧。番号付与は、ＥＵインデックスに準拠している。

【図4】ｐＩを操作した定常領域ＩｇＧ１−ＣＨ１−ｐＩ（６）およびＣＫ−ｐＩ（６）のアミノ酸配列。

【図5】本発明で使用される野生型抗ＶＥＧＦ ＶＨおよびＶＬ可変領域のアミノ酸配列。

【図6】本発明で使用されるｐＩを操作した抗ＶＥＧＦ抗体ＸＥＮＰ９４９３ ＩｇＧ１−ＣＨ１−ｐＩ（６）−ＣＫ−ｐＩ（６）の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列。

【図7】ＸＥＮＰ９４９３ ＩｇＧ１−ＣＨ１−ｐＩ（６）−ＣＫ−ｐＩ（６）におけるｐＩを低下する変異の位置を示す抗体Ｆａｂドメインの構造。

【図8】高純度を示す、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上のｐＩを操作した抗ＶＥＧＦ変異型の解析。

【図9】高純度を示す、ＳＥＣ上のｐＩを操作した抗ＶＥＧＦ変異型の解析。

【図10】変異型がｐＩを変更したことを示す、ＩＥＦゲル上のｐＩを操作した抗ＶＥＧＦ変異型の解析。

【図11】ＶＥＧＦに結合するベバシズマブおよびｐＩを操作した抗ＶＥＧＦの結合解析（Ｂｉａｃｏｒｅ）。

【図12】高耐温性を示す、ＣＨ１およびＣＫのｐＩを操作した抗ＶＥＧＦのＤＳＣ解析。

【図13】ｈｕＦｃＲｎマウスにおけるベバシズマブ変異型のＰＫ。ｐＩを操作したＣＨ１およびＣＫドメインを有する９４９３変異型は、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長する。

【図14】ｈｕＦｃＲｎマウスにおける４つの別個のｉｎ ｖｉｖｏ研究でのベバシズマブの天然ＩｇＧ１型のＰＫ。ＩｇＧ１半減期の平均は３．２日だった。

【図15】ｈｕＦｃＲｎマウスにおけるベバシズマブの天然ＩｇＧ２型のＰＫ。

【図16】異なる定常鎖を有する抗体変異型の半減期と等電点（ｐＩ）との相関。

【図17】ＩｇＧサブクラスのアミノ酸配列の整列。枠で囲まれている残基は、ＩｇＧ間のアイソタイプの違いを示している。ｐＩの上昇（Ｋ、ＲおよびＨ）またはｐＩの低下（ＤおよびＥ）に寄与する残基は、太字で強調されている。ｐＩの低下またはエピトープの延長を引き起こすように設計された置換は、グレーで示されている。

【図18】ＣＫおよびＣλ軽定常鎖のアミノ酸配列。ｐＩの上昇（Ｋ、ＲおよびＨ）またはｐＩの低下（ＤおよびＥ）に寄与する残基は、太字で強調されている。ｐＩを低下させるために変更が可能な好ましい位置は、グレーで示されている。

【図19】ｐＩを操作した変異型重鎖のアミノ酸配列。

【図20】ｐＩを操作した変異型軽鎖のアミノ酸配列。

【図21】ｈｕＦｃＲｎマウスにおけるｐＩを操作した変異型ベバシズマブ抗体のＰＫ結果。

【図22】ｐＩを操作した改変を、ＦｃＲｎへの結合を増強するＦｃ改変と組み合わせた変異型のＰＫ結果。

【図23】天然のベバシズマブ抗体、ｐＩを減少させた、ｐＩ操作した変異型バージョン、ならびに天然およびヒトＦｃＲｎへの結合を向上するＦｃ改変を取り込んだ、ｐＩを操作したバージョンの半減期と等電点（ｐＩ）の間の相関関係。

【図24】ＩｇＧサブクラスを有する新規アイソタイプＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３のアミノ酸配列の整列。青は、ｐＩ−Ｉｓｏ３と４つの天然のＩｇＧである、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４での残基との一致を表す。枠で囲まれた残基は、ｐＩを減少するためにＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３に組み込まれているＩｇＧアイソタイプの違いを示している。

【図25】ヒンジおよびＦｃ領域でのＩｇＧ１とＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３との違い。

【図26】ＣＨ１領域におけるＩｇＧ１とＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３との違い。

【図27】ＣＫ−ｐＩ（４）変異型のアミノ酸の図。赤は、天然のＣＫ軽定常鎖に比較したリジンからグルタミン酸の電荷置換を表している。

【図28】ｐＩを操作した重定常鎖および軽定常鎖のアミノ酸配列。

【図29】露出率およびＷＴ残基のエネルギーに対照して正規化された、Ｇｌｕへの置換のためのエネルギーの計算値を示す、抗体Ｆｃ領域内の塩基性残基の解析。高い露出率とＧｌｕへの置換に好ましいデルタＥとを有する塩基性残基は、ｐＩを低下するための電荷スワップ変異の標的である。

【図30】抗体ｐＩ上での電荷スワップ変異の効果を示すプロット。ｐＩが低下するにつれて、電荷スワップ１回当たりのｐＩの変化は減少する。

【図31】ｈｕＦｃＲｎマウスにおける、ｐＩを操作したアイソタイプ変異型ベバシズマブ抗体（ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３）およびＮ４３４Ｓ置換との組合せのＰＫ結果。

【図32】ｈｕＦｃＲｎマウスにおける、ｐＩを操作したアイソタイプ変異型ベバシズマブ抗体およびＮ４３４Ｓ置換との組合せのＰＫ結果。

【図33】ｈｕＦｃＲｎマウスにおける、ｐＩを操作したアイソタイプ変異型ベバシズマブ抗体およびＮ４３４Ｓ置換との組合せのＰＫ結果の分散プロット。各点は、研究からのマウス１匹を表す。４２８Ｌ置換は、これらのｐＩ抗体の各々に追加することもできることに注意されるべきである。

【図34】ｐＩを操作した変異型ｐＩと半減期（ｔ１／２）との相関を示すプロット。

【図35】ＣＫおよびＣラムダドメインの構造的整列。

【図36】２０個のアミノ酸の文献ｐＩ。掲載されているｐＩは、遊離アミノ酸として計算されていることに注意されるべきである；タンパク質の文脈における任意の側鎖の実際のｐＩは異なるため、よって、この表は、本発明の目的では、 絶対的な数ではなく、ｐＩの傾向を示す目的で使われる。

【図37】例示的なｐＩを操作した変異型一覧のデータ表