特許 5953312 タンパク質性プロテアーゼインヒビター並びにこれを含有するタンパク質溶液及び洗剤組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5953312

(24)【登録日】2016年6月17日

(45)【発行日】2016年7月20日

(54)【発明の名称】タンパク質性プロテアーゼインヒビター並びにこれを含有するタンパク質溶液及び洗剤組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/81 20060101AFI20160707BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160707BHJP

   C12N 9/99 20060101ALI20160707BHJP

   C11D 3/386 20060101ALI20160707BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/81ZNA

   C12N15/00 A

   C12N9/99

   C11D3/386

【請求項の数】3

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2013-538534(P2013-538534)

(86)(22)【出願日】2012年10月5日

(86)【国際出願番号】JP2012076043

(87)【国際公開番号】WO2013054774

(87)【国際公開日】20130418

【審査請求日】2014年4月7日

(31)【優先権主張番号】特願2011-224880(P2011-224880)

(32)【優先日】2011年10月12日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2012-6811(P2012-6811)

(32)【優先日】2012年1月17日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2012-183932(P2012-183932)

(32)【優先日】2012年8月23日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000002288

【氏名又は名称】三洋化成工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】特許業務法人 安富国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】草野 美紀

(72)【発明者】

【氏名】柳原 芳充

【審査官】 高山 敏充

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第９３／０２０１７５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０２／０１８５８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００４−５００００７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０００−５０６３９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０５−５０７２８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 POERIO E. et al.，Primary structure and reactive site of a novel wheat proteinase inhibitor of subtilisin and chymotry，Biol. Chem.，２００３年，vol.384，p.295-304

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２〜５、１０、１１、１４〜２３、２５、３１及び３４〜３６のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビター。

【請求項2】

請求項１に記載のタンパク質性プロテアーゼインヒビター、プロテアーゼ（Ｄ）及び溶剤（Ｅ）を含むタンパク質溶液。

【請求項3】

請求項１に記載のタンパク質性プロテアーゼインヒビター、プロテアーゼ（Ｄ）、溶剤（Ｅ）及び界面活性剤（Ｆ）を含む洗剤組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質性プロテアーゼインヒビター並びにこれを含有するタンパク質溶液及び洗剤組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中に広く存在が知られている。その応用分野としては、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化及び水産加工等）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤及び消炎剤等があり、多くの分野で盛んに利用されている。
しかしながら、プロテアーゼは、プロテアーゼ自身や他のタンパク質を加水分解してしまい、プロテアーゼ自身や他のタンパク質の活性が経時的に著しく低下するという問題がある。
そこで、プロテアーゼ自身や他のタンパク質の加水分解を抑えるために、プロテアーゼ活性を阻害するプロテアーゼインヒビターの研究が行われている。プロテアーゼインヒビターとしては、例えば、ストレプトマイセス属由来のストレプトマイセススブチリシンインヒビター（ＳＳＩ）（非特許文献１）や、オオムギ由来のキモトリプシンインヒビター２（非特許文献２）などが知られている。
しかしながら、これらの既知の天然に存在するプロテアーゼインヒビターは、阻害活性が強すぎるものが多く、プロテアーゼ溶液を使用時に希釈しても活性が回復しないという問題がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７２，３６，ｐ１６０−１６３

【非特許文献2】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８３，１６８，ｐ４４５−４４７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、適度な阻害活性を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターを提供することを目的とする。具体的には、プロテアーゼ活性を抑制することができ、さらに回復することができるタンパク質性プロテアーゼインヒビターを提供することを目的とする。また、このタンパク質性プロテアーゼインヒビターを含むタンパク質溶液であって、長期保存後もプロテアーゼ活性を保持しているタンパク質水溶液を提供することを目的とする。また、このタンパク質性プロテアーゼインヒビターを含む洗剤組成物であって、長期保存後も洗浄性を保持している洗剤組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、配列番号１のタンパク質性プロテアーゼインヒビター（ＢＣ）のアミノ酸配列（Ａ）の１〜８個のアミノ酸を変更前のアミノ酸とは別のアミノ酸と置換したアミノ酸配列（Ｙ）又は前記アミノ酸配列（Ｙ）と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（Ｙ’）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであって、下記（１）〜（８）のうち少なくとも１つの条件を満たすタンパク質性プロテアーゼインヒビター；このタンパク質性プロテアーゼインヒビター、プロテアーゼ（Ｄ）及び溶剤（Ｅ）を含むタンパク質溶液；このタンパク質性プロテアーゼインヒビター、プロテアーゼ（Ｄ）、溶剤（Ｅ）及び界面活性剤（Ｆ）を含む洗剤組成物である。
（１）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の１２位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ１）である
（２）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の３８位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ２）である
（３）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の４８位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ３）である
（４）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の５０位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ４）である
（５）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の５１位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ５）である
（６）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の５２位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ６）である
（７）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の５３位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ７）である
（８）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の７０位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ８）である
（Ｘ１）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＧｌｕ以外のアミノ酸
（Ｘ２）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＶａｌ及びＩｌｅ以外のアミノ酸
（Ｘ３）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＭｅｔ以外のアミノ酸
（Ｘ４）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＴｙｒ以外のアミノ酸
（Ｘ５）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸
（Ｘ６）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＩｌｅ以外のアミノ酸
（Ｘ７）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＡｓｐ以外のアミノ酸
（Ｘ８）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸
（Ｘ０）：Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ

【発明の効果】

【0006】

本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターは、プロテアーゼの活性を抑制することができ、水等で希釈した際にプロテアーゼの活性を回復することができる。
また、本発明のタンパク質溶液は、長期保存の後でも、プロテアーゼの活性を保持することができる。
また、本発明の洗剤組成物は、長期保存の後でも、良好な洗浄性を保持することができる。

【発明を実施するための形態】

【0007】

本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターは、配列番号１のタンパク質性プロテアーゼインヒビター（ＢＣ）のアミノ酸配列（Ａ）の１〜８個のアミノ酸を変更前のアミノ酸とは別のアミノ酸と置換したアミノ酸配列（Ｙ）又は前記アミノ酸配列（Ｙ）と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（Ｙ’）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであって、下記（１）〜（８）のうち少なくとも１つの条件を満たすタンパク質性プロテアーゼインヒビターである。
（１）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の１２位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ１）である
（２）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の３８位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ２）である
（３）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の４８位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ３）である
（４）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の５０位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ４）である
（５）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の５１位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ５）である
（６）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の５２位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ６）である
（７）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の５３位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ７）である
（８）前記アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）において、前記アミノ酸配列（Ａ）の７０位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ８）である
（Ｘ１）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＧｌｕ以外のアミノ酸
（Ｘ２）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＶａｌ及びＩｌｅ以外のアミノ酸
（Ｘ３）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＭｅｔ以外のアミノ酸
（Ｘ４）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＴｙｒ以外のアミノ酸
（Ｘ５）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸
（Ｘ６）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＩｌｅ以外のアミノ酸
（Ｘ７）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＡｓｐ以外のアミノ酸
（Ｘ８）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸
（Ｘ０）：Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ

【0008】

本発明において、タンパク質性プロテアーゼインヒビター（ＢＣ）は、配列番号１のアミノ酸配列（Ａ）で表され、プロテアーゼ活性を阻害する能力を有するタンパク質である。タンパク質性プロテアーゼインヒビター（ＢＣ）は、コムギ由来スブチリシン／キモトリプシンインヒビターである。

【0009】

本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターは、配列番号１のタンパク質性プロテアーゼインヒビター（ＢＣ）のアミノ酸配列（Ａ）の１〜８個のアミノ酸を変更前のアミノ酸とは別のアミノ酸と置換したアミノ酸配列（Ｙ）又は前記アミノ酸配列（Ｙ）と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（Ｙ’）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであって、上記（１）〜（８）のうち少なくとも１つの条件を満たすタンパク質性プロテアーゼインヒビターである。
上記（１）の条件において、アミノ酸配列（Ａ）の１２位に相当する位置とは、アミノ酸配列（Ａ）の１２位そのもの又は後述する相同性解析プログラムによりアミノ酸配列（Ａ）の１２位に相当すると判断された位置が含まれる。また、（Ｘ１）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＧｌｕ以外のアミノ酸であるが、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｓｐ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＬｙｓであり、特に好ましくはＡｌａ、Ａｓｐ又はＬｙｓである。
上記（２）の条件において、アミノ酸配列（Ａ）の３８位に相当する位置とは、アミノ酸配列（Ａ）の３８位そのもの又は後述する相同性解析プログラムによりアミノ酸配列（Ａ）の３８位に相当すると判断された位置が含まれる。また、（Ｘ２）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＶａｌ及びＩｌｅ以外のアミノ酸であるが、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＴｒｐが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ又はＬｅｕであり、特に好ましくはＡｌａである。
上記（３）の条件において、アミノ酸配列（Ａ）の４８位に相当する位置とは、アミノ酸配列（Ａ）の４８位そのもの又は後述する相同性解析プログラムによりアミノ酸配列（Ａ）の４８位に相当すると判断された位置が含まれる。また、（Ｘ３）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＭｅｔ以外のアミノ酸であるが、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ又はＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ又はＶａｌであり、特に好ましくはＡｌａ又はＧｌｙである。
上記（４）の条件において、アミノ酸配列（Ａ）の５０位に相当する位置とは、アミノ酸配列（Ａ）の５０位そのもの又は後述する相同性解析プログラムによりアミノ酸配列（Ａ）の５０位に相当すると判断された位置が含まれる。また、（Ｘ４）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＴｙｒ以外のアミノ酸であるが、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｐｈｅ又はＬｅｕである。
上記（５）の条件において、アミノ酸配列（Ａ）の５１位に相当する位置とは、アミノ酸配列（Ａ）の５１位そのもの又は後述する相同性解析プログラムによりアミノ酸配列（Ａ）の５１位に相当すると判断された位置が含まれる。また、（Ｘ５）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸であるが、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ又はＨｉｓである。
上記（６）の条件において、アミノ酸配列（Ａ）の５２位に相当する位置とは、アミノ酸配列（Ａ）の５２位そのもの又は相同性解析プログラムによりアミノ酸配列（Ａ）の５２位に相当すると判断された位置が含まれる。また、（Ｘ６）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＩｌｅ以外のアミノ酸であるが、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｖａｌ又はＧｌｎであり、特に好ましくはＡｌａ又はＶａｌである。
上記（７）の条件において、アミノ酸配列（Ａ）の５３位に相当する位置とは、アミノ酸配列（Ａ）の５３位そのもの又は後述する相同性解析プログラムによりアミノ酸配列（Ａ）の５３位に相当すると判断された位置が含まれる。また、（Ｘ７）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＡｓｐ以外のアミノ酸であるが、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＧｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ又はＧｌｎであり、特に好ましくはＧｌｕ又はＡｌａである。
上記（８）の条件において、アミノ酸配列（Ａ）の７０位に相当する位置とは、アミノ酸配列（Ａ）の７０位そのもの又は後述する相同性解析プログラムによりアミノ酸配列（Ａ）の７０位に相当すると判断された位置が含まれる。また、（Ｘ８）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸であるが、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ又はＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ又はＬｅｕであり、特に好ましくはＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ又はＬｙｓである。
本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターは、上記のように、配列番号１のアミノ酸配列の１〜８個のアミノ酸を変更前のアミノ酸とは別のアミノ酸と置換することにより、プロテアーゼ活性を適度に抑制でき、希釈時に回復できるプロテアーゼインヒビターとすることができる。
また、本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターは、プロテアーゼ活性を適度に抑制できるので、プロテアーゼの加水分解を抑えることができ、プロテアーゼ活性の持続性が高い。
なお、本発明において、「プロテアーゼ活性の持続性」とは、希釈時のプロテアーゼ活性について、一定期間保管した後に測定したプロテアーゼ活性と、保管する直前に測定したプロテアーゼ活性との差が小さく、プロテアーゼ活性の比（％）｛（一定期間保管した後のプロテアーゼ活性）／（保管する直前に測定したプロテアーゼ活性）×１００｝が１００％に近くなり、一定のプロテアーゼ活性を示すことを意味する。

【0010】

本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターは、アミノ酸配列（Ａ）の１〜８個のアミノ酸を変更前のアミノ酸とは別のアミノ酸と置換したアミノ酸配列（Ｙ）又はアミノ酸配列（Ｙ）と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（Ｙ’）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであるが、アミノ酸配列（Ｙ）及び（Ｙ’）中におけるアミノ酸の置換数は、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜５個が好ましく、さらに好ましくは１〜３個である。

【0011】

本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターは、アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）を少なくとも１つ有すればよく、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から１〜４個が好ましい。

【0012】

本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターは、アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであり、アミノ酸配列（Ｙ）又は（Ｙ’）のみからなるものでもよく、アミノ酸配列（Ｙ）及び（Ｙ’）のＣ末端及び／又はＮ末端にアミノ酸配列（Ｚ）を１個又は複数個有しているものでもよく、これらが繰り返された配列でもよい。
アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸１個又はアミノ酸が２個以上結合したペプチド配列である。
アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個である。
本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターがアミノ酸配列（Ｚ）を有する場合、アミノ酸配列（Ｚ）の個数は、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜１００個が好ましい。

【0013】

また、本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターを構成するアミノ酸配列中のアミノ酸配列（Ｙ）及び（Ｙ’）以外のアミノ酸の数は、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個である。

【0014】

本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターには、アミノ酸配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ）及びアミノ酸配列（Ｙ’）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｃ）が含まれる。
タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ）はアミノ酸配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであり、具体的には、配列番号２〜２９及び３７〜３９のタンパク質性プロテアーゼインヒビター等が挙げられる。
（Ｂ）として、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、配列番号２〜２９及び３７〜３９のものが好ましく、さらに好ましくは配列番号２〜１１及び１４〜２９のものであり、特に好ましくは配列番号３、４、１０、１１、１４〜１９、２２、２３及び２５のものである。また、プロテアーゼの持続性の観点から、配列番号２〜４、１０〜２３及び２５のものが好ましく、さらに好ましくは配列番号４、１２、１４、１５、１８、１９、２２、２３及び２５のものである。

【0015】

（Ｂ）には天然物から抽出したタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ−１）及び遺伝子組み換え技術を活用して生産したタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ−２）が含まれる。

【0016】

天然物から抽出したタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ−１）には、上記アミノ酸配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであって、天然物（例えば、植物や動物の細胞、細胞外組織、種子、微生物の菌体内及び菌体外分泌物等）から抽出したタンパク質性プロテアーゼインヒビターが含まれる。
抽出方法としては、細胞壁や細胞膜の破砕、遠心分離、硫安分画、クロマトグラフィー及び透析などの一般的なタンパク質を天然物から分離する工程が含まれる。
（Ｂ−１）のアミノ酸配列は、ペプチドマッピング法等の一般的な方法によって決定することができる。
また、天然物から抽出したタンパク質が、（Ｂ−１）に該当するかどうかは、ペプチドマッピング法等の一般的な方法によって抽出タンパク質のアミノ酸配列を決定し、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供する相同性解析プログラム「ＢＬＡＳＴ」の、ｂｌａｓｔｐアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて相同部分を検索することにより決定できる。

【0017】

宿主生産したタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ−２）としては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている遺伝子組み換え法により組み換えた遺伝子を用いて、適当な宿主に形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得たものが含まれる。具体的には、アミノ酸配列が配列番号１であるタンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝子配列をクローニングし、クローニングした遺伝子配列の一部を上記（１）〜（８）のうち少なくとも１つの条件を満たすアミノ酸配列をコードする遺伝子に置換（以下、「変異」ともいう）して得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主に形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。

【0018】

遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばｃＤＮＡライブラリ法及び人工合成遺伝子を用いる方法等が挙げられる。遺伝子変異手段としては、一般的に行われている部位特異的変異の方法でよく、具体的には、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー社）等を用いた方法が挙げられる。

【0019】

上記変異遺伝子を用いて（Ｂ−２）を生産する方法は、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記変異遺伝子を組込んだ組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、組み換えベクターを含む形質転換体を得る。得られた形質転換体を培養し、当該培養液から（Ｂ−２）を採取すればよい。

【0020】

本発明において組換えベクターは、適当なベクターに上記変異遺伝子を挿入することによって得ることができる。
ベクターは種々のものが公知であり、市販品も多く存在する。当業者であれば、宿主の種類に応じて適切なベクターを容易に選択することができる。ベクターの具体例としては、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣシリーズ等が挙げられる。
組換えベクターの調製方法自体は周知の常法である。適当なベクターに変異遺伝子を挿入し、宿主を形質転換する具体的な方法としては、エレクトロポレーション法及びカルシウム法等が挙げられる。

【0021】

本発明において宿主としては、動物細胞、微生物及び植物細胞等が挙げられる。
動物細胞としては、特に限定されないが、昆虫細胞、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞及びＣＨＯ細胞等が挙げられる。
昆虫細胞としては、特に限定されないが、Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等が挙げられる。
微生物としては、特に限定されないが、細菌及び酵母等が挙げられる。
細菌としては、真正細菌及び古細菌が含まれる。
真正細菌には、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が含まれる。グラム陰性細菌としては、エシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）等が挙げられる。グラム陽性菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ビフィドバクテリウム属 (Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属)、ラクトコッカス属(Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属)、エンテロコッカス属 (Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属)、ペディオコッカス属(Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属)、リューコノストック属 (Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属)及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）等が挙げられる。
植物細胞としては、特に限定されないが、ＢＹ−２細胞等が挙げられる。

【0022】

本発明において、宿主としては、クローニングの容易さの観点から、微生物が好ましく、さらに好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）及びブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）であり、特に好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）及びブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）である。

【0023】

培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。

【0024】

本発明において、培養液から（Ｂ−２）を採取及び精製する方法としては、常法に準じて行うことができる。例えば、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが、さらに公知の方法により結晶化や造粒化することができる。

【0025】

本発明において、（Ｃ）は、アミノ酸配列（Ｙ）と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（Ｙ’）を有するものである。アミノ酸配列（Ｙ）とアミノ酸配列（Ｙ’）との相同性は、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、９０％以上の相同性を有することが好ましく、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有することであり、最も好ましくは９７％以上の相同性を有することである。
アミノ酸配列の相同性は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供する相同性解析プログラム「ＢＬＡＳＴ」の、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いて解析する（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）。
アミノ酸配列（Ｙ）と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（Ｙ’）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｃ）として、具体的には、配列番号３０〜３６のタンパク質性プロテアーゼインヒビターが挙げられる。
（Ｃ）として、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、配列番号３０〜３２及び３４〜３６のタンパク質性プロテアーゼインヒビターが好ましい。また、（Ｃ）として、プロテアーゼ活性の持続性の観点から、配列番号３１及び３３〜３６のタンパク質性プロテアーゼインヒビターが好ましい。

【0026】

（Ｃ）には、天然物から抽出したタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｃ−１）及び宿主生産したタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｃ−２）が含まれる。

【0027】

天然物から抽出したタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｃ−１）には、（Ｂ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（Ｙ’）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであって、上記（１）〜（８）のうち少なくとも１つの条件を満たし、天然物（例えば、植物や動物の細胞、細胞外組織、種子、微生物の菌体内及び菌体外分泌物等）から抽出したものが含まれる。
抽出方法としては、細胞壁や細胞膜の破砕、遠心分離、硫安分画、クロマトグラフィー及び透析などの一般的なタンパク質を天然物から分離する工程が含まれる。
（Ｃ−１）のアミノ酸配列は、ペプチドマッピング法等の一般的な方法によって決定することができる。
また、天然物から抽出したタンパク質が、（Ｃ−１）に該当するかどうかは、ペプチドマッピング法等の一般的な方法によって抽出タンパク質のアミノ酸配列を決定し、ＤＮＡデータバンクジャパンの提供する配列比較プログラム「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いて（Ｂ）に相当する配列部分を検索し、さらに（Ｂ）に相当する配列部分と（Ｂ）との相同性をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供する相同性解析プログラム「ＢＬＡＳＴ」の、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いて解析することで、相同性が８０％以上であるかを確認することができる（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）。

【0028】

宿主生産したタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｃ−２）としては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている遺伝子組み換え法によって組み換えた遺伝子を用いて、適当な宿主に形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得たものが含まれる。
具体的には、（Ｂ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列又は上記（１）〜（８）の条件で指定している部位以外のアミノ酸配列が（Ｂ）と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子配列をクローニングし、クローニングした遺伝子配列の一部を上記（１）〜（８）のうち少なくとも１つの条件を満たすアミノ酸配列をコードする遺伝子に置換して得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主に形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。

【0029】

遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばｃＤＮＡライブラリ法及び人工合成遺伝子を用いる方法等が挙げられる。遺伝子変異手段としては、一般的に行われている部位特異的変異の方法でよく、具体的には、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー社）等を用いた方法が挙げられる。

【0030】

上記変異遺伝子を用いて（Ｃ−２）を生産する方法は、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記変異遺伝子を組込んだ組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、組み換えベクターを含む形質転換体を得る。得られた形質転換体を培養し、当該培養液から（Ｃ−２）を採取すればよい。

【0031】

本発明において組換えベクターは、適当なベクターに上記変異遺伝子を挿入することによって得ることができる。ベクターの具体例としては、上記（Ｂ−２）と同様である。
また、宿主としては、上記（Ｂ−２）と同様のものが好ましい。

【0032】

培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。

【0033】

本発明において、培養液から（Ｃ−２）を採取及び精製する方法としては、常法に準じて行うことができる。例えば、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。

【0034】

本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ）及び（Ｃ）は、公知のプロテアーゼインヒビターと同様に使用できる。
また、本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ）及び（Ｃ）は、プロテアーゼの活性を抑制することができ、希釈した際に効率よくプロテアーゼの活性を回復することができるので、プロテアーゼ保存用添加剤及び衣料用洗浄剤用添加剤をはじめ、食器用洗剤、繊維処理剤及び食品加工剤の添加剤として有用である。

【0035】

本発明のタンパク質溶液は、上記タンパク質性プロテアーゼインヒビター、プロテアーゼ（Ｄ）及び溶剤（Ｅ）を含む溶液である。
本発明のタンパク質溶液において、タンパク質性プロテアーゼインヒビターは、上記（Ｂ）及び／又は（Ｃ）である。
タンパク質溶液中のタンパク質性プロテアーゼインヒビターの含有量は、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点からタンパク質溶液の重量に対し、０．０００００１〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００００５〜３０重量％、特に好ましくは０．０００１〜２０重量％である。

【0036】

プロテアーゼ（Ｄ）としては、一般的にプロテアーゼとして知られているものが使用でき、低温（０〜５０℃）にプロテアーゼ活性の至適温度を有する低温至適プロテアーゼと高温（５０℃を超える）に至適温度を有する高温至適プロテアーゼが含まれる。（Ｄ）としては、活性の有効性の観点から、セリンプロテアーゼが好ましく、さらに好ましくはスブチリシンである。市販されているものとしては、例えばノボザイムズ社製のアルカラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、ＰＴＮ、及びジェネンコア社のピュラフェクト、ピュラフェクト ＯＸＰ等が挙げられる。
タンパク質溶液中のプロテアーゼ（Ｄ）の含有量は、タンパク質の分解性の観点からタンパク質溶液の重量に対し、０．００１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜５重量％、特に好ましくは０．０１〜２重量％である。

【0037】

タンパク質溶液中のタンパク質性プロテアーゼインヒビターとプロテアーゼ（Ｄ）とのモル比（タンパク質性プロテアーゼインヒビター／（Ｄ））は、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜１０００が好ましく、さらに好ましくは１〜１００である。

【0038】

溶剤（Ｅ）としては、水及び親水性溶剤（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール及びプロピレングリコール等）並びにこれらの混合物等が挙げられる。また、水としては、特に限定されるものではなく、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中にｐＨ調整剤を含むバッファー水溶液等が挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。
タンパク質溶液中の溶剤（Ｅ）の含有量は、プロテアーゼ及びタンパク質性プロテアーゼインヒビターの安定性の観点からタンパク質溶液の重量に対し、４０〜９９．９９８９９９９重量％が好ましく、さらに好ましくは６５〜９９．９９４９５重量％、特に好ましくは７８〜９９．９８９９重量％である。

【0039】

本発明のタンパク質溶液には、タンパク質性プロテアーゼインヒビター、プロテアーゼ（Ｄ）及び溶剤（Ｅ）以外に、界面活性剤（Ｆ）、塩（Ｇ）、糖（Ｈ）、アミノ酸（Ｉ）、脂肪酸（Ｑ）、油脂（Ｎ）、その他の低分子有機化合物（Ｊ）及びプロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）を含有することができる。

【0040】

界面活性剤（Ｆ）としては、後述する洗剤組成物の必須成分である界面活性剤（Ｆ）と同様のものが挙げられ、好ましいものも同様である。

【0041】

塩（Ｇ）として、無機塩（塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム及び硫酸アンモニウム等）及び有機塩（ギ酸ナトリウム等）が挙げられる。

【0042】

糖（Ｈ）として、トレハロース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、マルトース、フルクトース、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等が挙げられる。

【0043】

アミノ酸（Ｉ）として、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン及びそれらの塩等が挙げられる。

【0044】

脂肪酸（Ｑ）として、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸等が挙げられる。

【0045】

油脂（Ｎ）としては、上記脂肪酸（Ｑ）のモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドが挙げられる。

【0046】

その他の低分子有機化合物（Ｊ）としては、酢酸ベンジル、メチルサリチル酸、ベンジルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、ケイ皮酸、カフェ酸、カテキン類、アスコルビン酸及びカロテノイド等が挙げられる。

【0047】

プロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）としては、特に限定するものではないが、プロテアーゼ以外の酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチド等が挙げられ、具体的には、セルラーゼ、血清アルブミン、コラーゲン、カゼイン、ゼラチン及びシルクペプチド等が挙げられる。

【0048】

本発明のタンパク質溶液に含まれる界面活性剤（Ｆ）の含有量は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液の重量に対し０〜９０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜８５重量％、特に好ましくは０〜８０重量％である。
本発明のタンパク質溶液に含まれる塩（Ｇ）の含有量は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液の重量に対し０〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜５重量％、特に好ましくは０〜３重量％である。
本発明のタンパク質溶液に含まれる糖（Ｈ）の含有量は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液の重量に対し０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜２０重量％である。
本発明のタンパク質溶液に含まれるアミノ酸（Ｉ）の含有量は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液の重量に対し０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜２０重量％である。
本発明のタンパク質溶液に含まれるその他の低分子有機化合物（Ｊ）の含有量は、タンパク質の安定性の観点から、タンパク質溶液の重量に対し重量％０〜５０が好ましく、さらに好ましくは重量％０〜３０、特に好ましくは重量％０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液に含まれる脂肪酸（Ｑ）の含有量は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液の重量に対し０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜２０重量％である。
本発明のタンパク質溶液に含まれる油脂（Ｎ）の含有量は、タンパク質の安定性の観点から、タンパク質溶液の重量に対し０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜２０重量％である。
本発明のタンパク質溶液に含まれるプロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）の含有量は、タンパク質の安定性の観点から、タンパク質溶液の重量に対し０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜２０重量％である。

【0049】

本発明のタンパク質溶液のプロテアーゼ活性がどの程度であるかを示す残存活性は、プロテアーゼ活性の適度な抑制の観点から、１０％以下であることが好ましい。
残存活性は、下記によって求められる。
＜残存活性の測定方法＞
一定量のプロテアーゼ（Ｄ）、一定量のタンパク質性プロテアーゼインヒビター及び一定量の溶剤（Ｅ）を含む上記タンパク質溶液と、基質溶液（例えばカゼイン、アゾカゼイン又はベンゾイルアルギニンエチルエステル等を含む水溶液）とを混合した溶液（ｉ）を作製する。
溶液（ｉ）の温度は、２０〜７０℃の範囲内で、プロテアーゼ（Ｄ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、測定の間一定に保つことができればいい。
溶液（ｉ）中の基質のモル濃度は、ミカエリス定数Ｋ_ｍの３分の１倍〜２倍であり、且つ、溶液（ｉ）中のプロテアーゼ（Ｄ）のモル濃度の５〜１００，０００倍の濃度であればいい。ミカエリス定数は、基質とプロテアーゼとの反応におけるミカエリス定数であり、Ａｇａｒｗａｌらによって報告された方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９７８，Ｖｏｌ．５１，Ｐ４８３−４９１に記載の方法）で酵素反応初速度の基質濃度依存性を求めることによって求められる。
溶液（ｉ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、基質がプロテアーゼに分解されて生成した生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａ_λを経時的に測定する。測定時の温度は、溶液（ｉ）を作製したときの温度と同温度である。溶液（ｉ）を作製直後の吸光度Ａ_λ０及び溶液（ｉ）を作製からｈ時間後の吸光度Ａ_λｈを測定し、吸光度の変化ΔＡ_λ（ΔＡ_λ＝Ａ_λｈ−Ａ_λ０）を求める。測定時間は酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化するのが見られれば良い。吸光度の変化ΔＡ_λを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｖ_１）を求める。
また、上記タンパク質溶液において、タンパク質性プロテアーゼインヒビターを同重量の溶剤（Ｅ）で置き換えて作製したタンパク質溶液を用いて、基質溶液と混合して、上記溶液（ｉ）と同様の条件で溶液（ｉｉ）を作製する。
溶液（ｉｉ）についても同様に吸光度の変化ΔＡ_λを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｖ_０）を求め、下記数式（１）にあてはめて、残存活性を算出する。
残存活性（％）＝ｖ_１／ｖ_０×１００（１）

【0050】

本発明の洗剤組成物は、タンパク質性プロテアーゼインヒビター、プロテアーゼ（Ｄ）、溶剤（Ｅ）及び界面活性剤（Ｆ）を含有する洗剤組成物である。上記タンパク質性プロテアーゼインヒビターを含有することにより、長期保存の後でも、良好な洗浄性を保持することができる。

【0051】

本発明の洗剤組成物において、タンパク質性プロテアーゼインヒビターは、上記（Ｂ）及び（Ｃ）である。また、洗剤組成物中に含む際に好ましいタンパク質性プロテアーゼインヒビターは、上記（Ｂ）及び（Ｃ）として好ましいものと同じである。
洗剤組成物中のタンパク質性プロテアーゼインヒビターの含有量は、プロテアーゼ活性の適度な抑制及び希釈時のプロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から洗剤組成物の重量に対し、０．０００００１〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００００５〜２０重量％、特に好ましくは０．０００１〜１０重量％である。この範囲で含有することで、保存時に効率よくプロテアーゼの活性を抑制することができ、また、洗浄時に効率よく洗浄性を向上することができる。

【0052】

プロテアーゼ（Ｄ）としては、上記タンパク質溶液に使用するプロテアーゼと同様、一般的にプロテアーゼとして知られているものが使用でき、セリンプロテアーゼが好ましく、さらに好ましくはスブチリシンである。市販されているものとしては、例えばノボザイムズ社製のアルカラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、ＰＴＮ、及びジェネンコア社のピュラフェクト、ピュラフェクト ＯＸＰ等が挙げられる。
洗剤組成物中のプロテアーゼ（Ｄ）の含有量は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し、０．００１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜３重量％、特に好ましくは０．０１〜１重量％である。

【0053】

洗剤組成物中のタンパク質性プロテアーゼインヒビターとプロテアーゼ（Ｄ）とのモル比（タンパク質性プロテアーゼインヒビター／プロテアーゼ（Ｄ））は、洗浄性の観点から、１〜１０００が好ましく、さらに好ましくは１〜１００である。

【0054】

溶剤（Ｅ）としては、上記タンパク質溶液に使用する溶剤（Ｅ）と同様、水及び親水性溶剤（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール及びプロピレングリコール等）及びこれらの混合物等が挙げられる。また、水としては、特に限定されるものではなく、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中に、ｐＨ調整剤を含むバッファー水溶液等が挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。
洗剤組成物中の溶剤（Ｅ）の含有量は、プロテアーゼ及びタンパク質性プロテアーゼインヒビターの安定性の観点から洗剤組成物の重量に対し、１〜９５重量％が好ましく、さらに好ましくは１７〜９０重量％、特に好ましくは２９〜８０重量％である。

【0055】

界面活性剤（Ｆ）はノニオン性界面活性剤（Ｆ−１）、アニオン性界面活性剤（Ｆ−２）、カチオン性界面活性剤（Ｆ−３）及び両性界面活性剤（Ｆ−４）が挙げられる。

【0056】

ノニオン性界面活性剤（Ｆ−１）としては、アルキレンオキサイド付加型ノニオン性界面活性剤（Ｆ−１−１）及び多価アルコール型ノニオン界面活性剤（Ｆ−１−２）等が挙げられる。

【0057】

（Ｆ−１−１）としては、脂肪族アルコール（炭素数８〜２４）アルキレン（炭素数２〜４、好ましいのは２）オキサイド付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜１００）、アルキル（炭素数１〜１８）フェノールエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）付加物（付加モル数１〜１００）、高級アミン（炭素数８〜２４）アルキレン（炭素数２〜４、好ましいのは２）オキサイド付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜１００）、脂肪酸（炭素数８〜２４）ＥＯ付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜１００）、ポリプロピレングリコール（分子量２００〜４０００）ＥＯ付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜１００）、ポリオキシエチレン（重合度＝３〜３０）アルキル（炭素数６〜２０）アリルエーテル並びにソルビタンモノラウレートＥＯ付加物（活性水素１個あたりの付加モル数１〜１００）及びソルビタンモノオレートＥＯ付加物（活性水素１個あたりの付加モル数１〜１００）等の多価（２〜８価又はそれ以上）アルコール（炭素数２〜３０）の脂肪酸（炭素数８〜２４）エステルＥＯ付加物（活性水素１個あたりの付加モル数１〜１００）等が挙げられる。

【0058】

（Ｆ−１−２）としては、グリセリンモノステアレート、グリセリンモノオレート、ソルビタンモノラウレート及びソルビタンモノオレート等の多価（２〜８価又はそれ以上）アルコール（炭素数２〜３０）の脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル並びにラウリン酸モノエタノールアミド及びラウリン酸ジエタノールアミド等の脂肪酸アルカノールアミド等が挙げられる。

【0059】

アニオン性界面活性剤（Ｆ−２）としては、炭素数８〜２４のアルキルエーテルカルボン酸又はその塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンエーテルカルボン酸又はその塩［（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルスルホコハク酸２ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩［ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸ナトリウム及びラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸−トリエタノールアミン塩等］、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド硫酸スルホン酸ナトリウム、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩［ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキルリン酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンリン酸エステル塩［ラウリルリン酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム等］、脂肪酸塩［ラウリン酸ナトリウム及びラウリン酸トリエタノールアミン等］、アシル化アミノ酸塩［ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシントリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸トリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム及びラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム等］等が挙げられる。

【0060】

カチオン性界面活性剤（Ｆ−３）としては、第４級アンモニウム塩型［塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム及びエチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム等］及びアミン塩型［ステアリン酸ジエチルアミノエチルアミド乳酸塩、ジラウリルアミン塩酸塩及びオレイルアミン乳酸塩等］等が挙げられる。

【0061】

両性界面活性剤（Ｆ−４）としては、ベタイン型両性界面活性剤［ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルヒドロキシスルホベタイン及びラウロイルアミドエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルベタインヒドロキシプロピルリン酸ナトリウム等］並びにアミノ酸型両性界面活性剤［β−ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等］等が挙げられる。

【0062】

（Ｆ）としては、１種又は２種以上が使用できる。２種以上を使用する場合、その組み合わせとしては、例えばノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤と両性界面活性剤との組み合わせ等が挙げられる。

【0063】

（Ｆ）として、洗浄性の観点から、ノニオン性界面活性剤単独での使用、及びノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤との組み合わせでの使用が好ましい。
ノニオン性界面活性剤（Ｆ−１）としては、洗浄性の観点から、脂肪族アルコール（炭素数８〜２４）ＥＯ付加物（付加モル数１〜１００）が好ましく、さらに好ましくは脂肪族アルコール（炭素数１２〜１８）ＥＯ付加物（付加モル数４〜２０）、次にさらに好ましくは脂肪族アルコール（炭素数１２〜１５）ＥＯ付加物（付加モル数８〜１２）、特に好ましくはオレイルアルコールＥＯ１１モル付加物である。
アニオン性界面活性剤（Ｆ−２）としては、洗浄性の観点から、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩、脂肪酸塩、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩が好ましく、さらに好ましくは、炭素数１２〜１６のアルキルフェニルスルホン酸塩及び炭素数８〜１６の脂肪酸塩、次にさらに好ましくは、ドデシルベンゼンスルホン酸モノエタノールアミン塩及びラウリン酸ナトリウムである。

【0064】

洗剤組成物に含まれる界面活性剤（Ｆ）の含有量は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し、１〜７０重量％が好ましく、さらに好ましくは５〜６０重量％、特に好ましくは１０〜６０重量％である。

【0065】

洗剤組成物には、必要により、公知のその他の成分、例えば特開２００４−２７１８１号公報に記載のビルダー、キレート剤、消泡剤、蛍光増白剤、漂白剤、柔軟剤、除菌剤、香料及び着色剤等を含有してもよい。

【0066】

ビルダーとしては、ポリカルボン酸塩（アクリル酸塩ホモポリマー及びマレイン酸塩ホモポリマー等）、多価カルボン酸塩（クエン酸及びリンゴ酸等）、及びアルカリビルダー（苛性ソーダ、ソーダ灰、アンモニア、トリエタノールアミン、トリポリリン酸ソーダ及びケイ酸ソーダ等）等が挙げられる。キレート剤としては、ＥＤＴＡ及びＮＴＡ等が挙げられる。消泡剤としては、シリコーン系消泡剤、ポリオキシアルキレン系消泡剤及び鉱物油系消泡剤等が挙げられる。

【0067】

その他の成分のうち、ビルダー及びキレート剤の含有率は、洗剤組成物、ビルダー及びキレート剤の全重量に基づいて、好ましくは１０重量％以下であり、更に好ましくは５重量％以下である。
蛍光増白剤、漂白剤、柔軟剤、除菌剤、香料、着色剤及び消泡剤の含有率は、洗剤組成物、蛍光増白剤、漂白剤、柔軟剤、除菌剤、香料、着色剤及び消泡剤の全重量に基づいて、好ましくは５重量％以下であり、更に好ましくは２重量％以下である。

【0068】

洗剤組成物には、上記以外に、必要により、塩（Ｇ）、糖（Ｈ）、アミノ酸（Ｉ）、脂肪酸（Ｑ）、油脂（Ｎ）、その他の低分子有機化合物（Ｊ）及びプロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）を含有することができる。

【0069】

塩（Ｇ）、糖（Ｈ）、アミノ酸（Ｉ）、その他の低分子有機化合物（Ｊ）、脂肪酸（Ｑ）、油脂（Ｎ）及びプロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）としては、タンパク質溶液に含有することができるものとして挙げたものと同様のものが挙げられる。

【0070】

本発明の洗剤組成物に含まれる塩（Ｇ）の含有量は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜５重量％、特に好ましくは０〜３重量％である。
本発明の洗剤組成物に含まれる糖（Ｈ）の含有量は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜２０重量％である。
本発明の洗剤組成物に含まれるアミノ酸（Ｉ）の含有量は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜２０重量％である。
本発明の洗剤組成物に含まれるその他の低分子有機化合物（Ｊ）の含有量は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に対し０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜２０重量％である。
本発明の洗剤組成物に含まれる脂肪酸（Ｑ）の含有量は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜２０重量％である。
本発明の洗剤組成物に含まれる油脂（Ｎ）の含有量は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に対し０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜２０重量％である。
本発明の洗剤組成物に含まれるプロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）の含有量は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に対し０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜２０重量％である。

【0071】

本発明の洗剤組成物は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）撹拌機及び加熱冷却装置を備えた混合槽に、界面活性剤（Ｆ）と溶剤（Ｅ）及びその他の成分を投入順序に特に制限なく投入し、２０〜５０℃で均一になるまで撹拌する。
（２）タンパク質性プロテアーゼインヒビターを添加し、２０〜５０℃で３０分〜２時間攪拌する。
（３）プロテアーゼ（Ｄ）を加えてさらに２０〜５０℃で均一になるまで攪拌する。

【0072】

上記洗剤組成物は、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤及びコンタクトレンズ用洗浄剤等に使用できる。

【0073】

洗剤組成物の使用方法は、従来の洗剤組成物の使用方法と同じでよく、特に限定されるものではない。衣料用洗浄剤としての使用方法の１例を下記に示す。
（１）洗濯物が入った洗濯機に水道水を張り、洗剤組成物を２５℃で添加し、軽く撹拌して溶解させる。
（２）洗濯機で洗濯物を洗浄する。
（３）洗濯機から液を抜き、水道水で１〜２回すすぐ。
（４）適宜脱水をかける。

【実施例】

【0074】

以下の実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【0075】

＜製造例１＞
配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１０６）（５‘末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号１のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１）を作製した。このプラスミドと１２位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換するための変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）を用い、以下の条件でプラスミド（Ｐ１）に変異導入を行った。即ち、プラスミド（Ｐ１）を０．５μＬ（１０ｎｇ）、１０μＭの変異導入用プライマー各０．７５μＬ（７．５ｐｇ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液２．５μＬ（タカラバイオ社製）、２ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）混液２μＬ（タカラバイオ社製）、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ０．２５μＬ（タカラバイオ社製）及び脱イオン水１７μＬを混合した後、ＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（タカラバイオ社製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９８℃１０秒間、５０℃１０秒間、６８℃６．５分間を３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製後（５０μＬ）、６μＬの１０倍濃度のＤｐｎＩ用緩衝液及び３μＬの制限酵素ＤｐｎＩ（タカラバイオ社製）を加え、３７℃で１時間、テンプレートを分解した。得られた制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを大腸菌ＤＨ５αへの形質転換に供した。即ち、制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを１００μＬのＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５α コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添加し、氷上で３０分間保存した後、４２℃で９０秒間加熱した。ここＳＯＣ培地（ＴＯＹＯＢＯ社製）９００μＬを添加し、３７℃で１時間静置培養した。培養液のうち１００μＬをＬＢ／アンピシリンプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。現れたコロニーをＬＢ培地１ｍＬで１２時間培養したのち、Ｑｕａｎｔｕｍｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に供し、配列番号２のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２）を精製した（１００μＬ）。得られたプラスミドは、ＤＮＡシークエンス解析サービス（マクロジェンジャパン社）に解析を依頼し、変異が導入されたことを確認した。

【0076】

＜製造例２＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号４４、４５）を用い、同様の方法で配列番号１の１２位のグルタミン酸をアラニンに置換した配列番号３のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ３）を得た。

【0077】

＜製造例３＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号４６、４７）を用い、同様の方法で配列番号１の３８位のバリンをアラニンに置換した配列番号４のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ４）を得た。

【0078】

＜製造例４＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号４８、４９）を用い、同様の方法で配列番号１の３８位のバリンをロイシンに置換した配列番号５のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ５）を得た。

【0079】

＜製造例５＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号５０、５１）を用い、同様の方法で配列番号１の３８位のバリンをイソロイシンに置換した配列番号６のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ６）を得た。

【0080】

＜製造例６＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号５２、５３）を用い、同様の方法で配列番号１の４８位のメチオニンをアラニンに置換した配列番号７のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ７）を得た。

【0081】

＜製造例７＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号５４、５５）を用い、同様の方法で配列番号１の４８位のメチオニンをグリシンに置換した配列番号８のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ８）を得た。

【0082】

＜製造例８＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号５６、５７）を用い、同様の方法で配列番号１の５０位のチロシンをアラニンに置換した配列番号９のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ９）を得た。

【0083】

＜製造例９＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号５８、５９）を用い、同様の方法で配列番号１の５０位のチロシンをロイシンに置換した配列番号１０のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１０）を得た。

【0084】

＜製造例１０＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号６０、６１）を用い、同様の方法で配列番号１の５０位のチロシンをフェニルアラニンに置換した配列番号１１のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１１）を得た。

【0085】

＜製造例１１＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号６２、６３）を用い、同様の方法で配列番号１の５１位のアルギニンをアラニンに置換した配列番号１２のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１２）を得た。

【0086】

＜製造例１２＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号６４、６５）を用い、同様の方法で配列番号１の５１位のアルギニンをリシンに置換した配列番号１３のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１３）を得た。

【0087】

＜製造例１３＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号６６、６７）を用い、同様の方法で配列番号１の５１位のアルギニンをヒスチジンに置換した配列番号１４のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１４）を得た。

【0088】

＜製造例１４＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号６８、６９）を用い、同様の方法で配列番号１の５２位のイソロイシンをアラニンに置換した配列番号１５のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１５）を得た。

【0089】

＜製造例１５＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号７０、７１）を用い、同様の方法で配列番号１の５２位のイソロイシンをバリンに置換した配列番号１６のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１６）を得た。

【0090】

＜製造例１６＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号７２、７３）を用い、同様の方法で配列番号１の５３位のアスパラギン酸をグルタミン酸に置換した配列番号１７のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１７）を得た。

【0091】

＜製造例１７＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号７４、７５）を用い、同様の方法で配列番号１の５３位のアスパラギン酸をアラニンに置換した配列番号１８のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１８）を得た。

【0092】

＜製造例１８＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号７６、７７）を用い、同様の方法で配列番号１の７０位のアルギニンをアラニンに置換した配列番号１９のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１９）を得た。

【0093】

＜製造例１９＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号７８、７９）を用い、同様の方法で配列番号１の７０位のアルギニンをグリシンに置換した配列番号２０のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２０）を得た。

【0094】

＜製造例２０＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号８０、８１）を用い、同様の方法で配列番号１の７０位のアルギニンをリシンに置換した配列番号２１のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２１）を得た。

【0095】

＜製造例２１＞
製造例３で得たプラスミド（Ｐ４）（３８位のバリンをアラニンに置換）と５１位のアルギニンと５２位のイソロイシンをそれぞれアラニンに置換するための変異導入用プライマー（配列番号８２、８３）を用い、以下の条件でプラスミド（Ｐ４）に変異導入を行った。即ち、プラスミド（Ｐ４）を０．５μＬ（１０ｎｇ）、１０μＭの変異導入用プライマー各０．７５μＬ（７．５ｐｇ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液２．５μＬ（タカラバイオ社製）、２ｍＭ デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）混液２μＬ（タカラバイオ社製）、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ０．２５μＬ（タカラバイオ社製）及び脱イオン水１７μＬを混合した後、ＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（タカラバイオ社製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９８℃１０秒間、５０℃１０秒間、６８℃６．５分間を３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製後（５０μＬ）、６μＬの１０倍濃度のＤｐｎＩ用緩衝液及び３μＬの制限酵素ＤｐｎＩ（タカラバイオ社製）を加え、３７℃で１時間、テンプレートを分解した。
得られた制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを大腸菌ＤＨ５αへの形質転換に供した。即ち、制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを１００μＬのＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５α コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添加し、氷上で３０分間保存した後、４２℃で９０秒間加熱した。ここＳＯＣ培地（ＴＯＹＯＢＯ社製）９００μＬを添加し、３７℃で１時間静置培養した。培養液のうち１００μＬをＬＢ／アンピシリンプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。現れたコロニーをＬＢ培地１ｍＬで１２時間培養したのち、Ｑｕａｎｔｕｍｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に供し、配列番号２２のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２２）を精製した（１００μＬ）。得られたプラスミドは、ＤＮＡシークエンス解析サービス（マクロジェンジャパン社製）に解析を依頼し、変異が導入されたことを確認した。

【0096】

＜製造例２２＞
製造例２１において、変異導入用プライマー（配列番号８２、８３）を変異導入用プライマー（配列番号８４、８５）に代えて、同様の方法で配列番号１の３８位のバリン、５２位のイソロイシンおよび５３位のアスパラギン酸をいずれもアラニンに置換した配列番号２３のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２３）を得た。

【0097】

＜製造例２３＞
製造例２１において、「製造例３で得たプラスミド（Ｐ４）」に代えて「製造例７で得たプラスミド（Ｐ８）」を用いて、「変異導入用プライマー（配列番号８２、８３）」に代えて「変異導入用プライマー（配列番号７６、７７）」を用いて、同様の方法で配列番号１の４８位のメチオニンをグリシンに、７０位のアルギニンをアラニンに置換した配列番号２４のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２４）を得た。

【0098】

＜製造例２４＞
製造例２３において、「プラスミド（Ｐ８）」に代えて「プラスミド（Ｐ４）」を用いて、同様の方法で配列番号１の３８位のバリンおよび７０位のアルギニンをアラニンに置換した配列番号２５のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２５）を得た。

【0099】

＜製造例２５＞
配列番号２６のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１０７）（５‘末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号１の１２位のグルタミン酸をアスパラギン酸に、３８位のバリン、４８位のメチオニン、５０位のチロシン、５１位のアルギニン、５２位のイソロイシン、５３位のアスパラギン酸及び７０位のアルギニンをアラニンに置換した配列番号２６のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２６）を作製した。

【0100】

＜製造例２６＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号８６、８７）を用い、同様の方法で配列番号１の１２位のグルタミン酸をリシンに置換した配列番号２７のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２７）を得た。

【0101】

＜製造例２７＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号８８、８９）を用い、同様の方法で配列番号１の５０位のチロシンをグリシンに置換した配列番号２８のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２８）を得た。

【0102】

＜製造例２８＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号４２、４３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号９０、９１）を用い、同様の方法で配列番号１の７０位のアルギニンをアスパラギンに置換した配列番号２９のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２９）を得た。

【0103】

＜製造例２９＞
配列番号４１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１０８）（５‘末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号４１のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ４１）を作製した。このプラスミドと２４位のグルタミン酸をアラニンに置換するための変異導入用プライマー（配列番号９２、９３）を用い、以下の条件でプラスミド（Ｐ４１）に変異導入を行った。即ち、プラスミド（Ｐ４１）を０．５μＬ（１０ｎｇ）、１０μＭの変異導入用プライマー各０．７５μＬ（７．５ｐｇ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液２．５μＬ（タカラバイオ製）、２ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）混液２μＬ（タカラバイオ製）、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ０．２５μＬ（タカラバイオ製）及び脱イオン水１７μＬを混合した後、ＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（タカラバイオ製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９８℃１０秒間、５０℃１０秒間、６８℃６．５分間を３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）で精製後（５０μＬ）、６μＬの１０倍濃度のＤｐｎＩ用緩衝液及び３μＬの制限酵素ＤｐｎＩ（タカラバイオ製）を加え、３７℃で１時間、テンプレートを分解した。得られた制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを大腸菌ＤＨ５αへの形質転換に供した。即ち、制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを１００μＬのＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５α コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製）に添加し、氷上で３０分間保存した後、４２℃で９０秒間加熱した。ここＳＯＣ培地（ＴＯＹＯＢＯ製）９００μＬを添加し、３７℃で１時間静置培養した。培養液のうち１００μＬをＬＢ／アンピシリンプレートに塗布し、３７度で一晩培養した。現れたコロニーをＬＢ培地１ｍＬで１２時間培養したのち、Ｑｕａｎｔｕｍｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に供し、アミノ酸配列（Ａ）の１２位に相当する２４位の位置のアミノ酸がアラニンであり、（Ｂ）である配列番号３と９０％の相同性を有する配列番号３０のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ３０）を精製した（１００μＬ）。得られたプラスミドは、ＤＮＡシークエンス解析サービス（マクロジェンジャパン社）に解析を依頼し、変異が導入されたことを確認した。

【0104】

＜製造例３０＞
製造例２９の変異導入用プライマー（配列番号９２、９３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号９４、９５）を用い、同様の方法で配列番号４１の５０位（配列番号１の３８位に相当）のイソロイシンをアラニンに置換した、（Ｂ）である配列番号４と９０％の相同性を有する配列番号３１のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ３１）を得た。

【0105】

＜製造例３１＞
製造例２９の変異導入用プライマー（配列番号９２、９３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号９６、９７）を用い、同様の方法で配列番号４１の６２位（配列番号１の５０位に相当）のチロシンをアラニンに置換した、（Ｂ）である配列番号９と９０％の相同性を有する配列番号３２のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ３２）を得た。

【0106】

＜製造例３２＞
製造例２９の変異導入用プライマー（配列番号９２、９３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号９８、９９）を用い、同様の方法で配列番号４１の６３位（配列番号１の５１位に相当）のアルギニンをアラニンに置換した、（Ｂ）である配列番号１２と９０％の相同性を有する配列番号３３のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ３３）を得た。

【0107】

＜製造例３３＞
製造例２９の変異導入用プライマー（配列番号９２、９３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号１００、１０１）を用い、同様の方法で配列番号４１の６４位（配列番号１の５２位に相当）のイソロイシンをアラニンに置換した、（Ｂ）である配列番号１５と９０％の相同性を有する配列番号３４のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ３４）を得た。

【0108】

＜製造例３４＞
製造例２９の変異導入用プライマー（配列番号９２、９３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号１０２、１０３）を用い、同様の方法で配列番号４１の６５位（配列番号１の５３位に相当）のアスパラギン酸をアラニンに置換した、（Ｂ）である配列番号１８と９０％の相同性を有する配列番号３５のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ３５）を得た。

【0109】

＜製造例３５＞
製造例２９の変異導入用プライマー（配列番号９２、９３）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号１０４、１０５）を用い、同様の方法で配列番号４１の８２位（配列番号１の７０位に相当）のアルギニンをアラニンに置換した、（Ｂ）である配列番号１９と９０％の相同性を有する配列番号３６のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ３６）を得た。

【0110】

【表1】

【0111】

なお、配列番号２〜２８において配列番号１のアミノ酸配列中の置換されたアミノ酸の位置、又は配列番号２９〜３６において配列番号４１のアミノ酸配列中の置換されたアミノ酸の位置に相当する配列番号１のアミノ酸配列中の位置と、置換後のアミノ酸の種類を表１に示す。

【0112】

＜製造例３６＞
配列番号４０のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１０９）（５’末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号４０のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ４０）を作製した。

【0113】

＜製造例３７＞
配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（５’末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号１のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１）を作製した。

【0114】

＜製造例３８＞
配列番号４１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１０８）（５‘末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号１との相同性が９７％である配列番号４１のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ４１）を作製した。なお、配列番号４１のアミノ酸配列において、配列番号１の１２位、３８位、４８位、５０位、５１位、５２位、５３位及び７０位に相当する部位は、それぞれ２４位（配列番号１の１２位に相当）がグルタミン酸、５０位（配列番号１の３８位に相当）がイソロイシン、６０位（配列番号１の４８位に相当）がメチオニン、６２位（配列番号１の５０位に相当）がチロシン、６３位（配列番号１の５１位に相当）がアルギニン、６４位（配列番号１の５２位に相当）がイソロイシン、６５位（配列番号１の５３位に相当）がアスパラギン酸、８２位（配列番号１の７０位に相当）がアルギニンである。

【0115】

＜実施例１〜３４＞
製造例１〜４及び６〜３５で得られたタンパク質性プロテアーゼインヒビター発現プラスミド（Ｐ２）〜（Ｐ５）及び（Ｐ７）〜（Ｐ３６）をそれぞれ大腸菌Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に同様の方法で形質転換した。得られたタンパク質性プロテアーゼインヒビター発現株をＬＢ培養液（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ含有）１ｍＬに植菌して３０℃で１２時間培養を行い、終夜培養液を作製し、０．５ｍｌをＬＢ培養液（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ含有）５ｍｌに植菌して３０℃３時間振とう培養を行い７種類の前培養液を作製した。７種類の前培養液をそれぞれ５０ｍＬの培養液｛水５０ｍＬ中のそれぞれの成分の含有量は、酵母エキス（日本製薬社製）１．２ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）０．６ｇ、リン酸２カリウム０．４７ｇ、リン酸１カリウム０．１１ｇ、硫酸アンモニウム０．３５ｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物０．６６ｇ、クエン酸ナトリウム２水和物０．０２ｇ、グリセロール０．２ｇ、ラクトアルブミン水解物１．５ｇ、消泡剤（信越シリコーン社製、「ＫＭ−７０」）０．３ｇ、１ｍＭ 硫酸マグネシウム、微量金属溶液（塩化カルシウム１８．９μｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）５００μｇ、硫酸亜鉛７水和物９．０μｇ、硫酸銅５．１μｇ、塩化マンガン４水和物６．７μｇ、塩化コバルト４．９μｇ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム２００μｇ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン｝に植菌し微生物培養装置（エイブル社製、製品名「ＢｉｏＪｒ．８」）を用いてｐＨ６．８、３０℃を維持したまま培養を行った。培養開始後１Ｍ ＩＰＴＧ溶液を０．１５ｍＬを加えた。培養開始１４時間後から、グリセリン／タンパク質溶液（５０％ グリセリン、５０ｇ／Ｌ ラクトアルブミン水解物、３３ｇ／Ｌ 消泡剤（信越シリコーン社製、「ＫＭ−７０」）、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン）の滴下を開始した。培養開始後、４８時間目に培養液（Ｋ−１）〜（Ｋ−３４）を回収した。
得られた培養液（Ｋ−１）〜（Ｋ−３４）をＨｉｓ-ｔａｇ精製用担体（ＧＥヘルスケア社製 Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）で分離し、タンパク質性プロテアーゼインヒビター溶液（Ｌ−１）〜（Ｌ−３４）を得た。（Ｌ−１）〜（Ｌ−３４）中のタンパク質性プロテアーゼインヒビターの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、全て１ｇ／Ｌであった。

【0116】

＜比較例１〜４＞
実施例１において、「プラスミド（Ｐ２）」に代えて「プラスミド（Ｐ１）、（Ｐ４０）、（Ｐ４１）及び（Ｐ６）」をそれぞれ用いる以外は同様にして、タンパク質性プロテアーゼインヒビター溶液（Ｌ’−１）〜（Ｌ’−４）を得た。（Ｌ’−１）〜（Ｌ’−４）中のタンパク質性プロテアーゼインヒビターの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、全て１ｇ／Ｌであった。
プラスミド（Ｐ４０）及びプラスミド（Ｐ４１）を用いて得たタンパク質性プロテアーゼインヒビターについて、相同性解析プログラム「ＢＬＡＳＴ」の、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いて相同性を計算したところ、タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ）である配列番号２５との相同性が、それぞれ６５％、８９％であった。

【0117】

＜実施例３５〜６８＞
実施例１〜３４で得られたタンパク質性プロテアーゼインヒビター溶液（Ｌ−１）〜（Ｌ−３４）３５０μＬと０．０１重量％アルカラーゼ溶液（品名「アルカラーゼ２．５Ｌ」、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌと１ｍＭ ＣａＣｌ_２との緩衝液（ｐＨ８、２５℃）で希釈、ノボザイムズ社製）３５０μＬとを混合してタンパク質溶液（Ｓ−１）〜（Ｓ−３４）を作製し、２０分間４０℃で静置した。

【0118】

＜比較例５〜８＞
比較例１〜４で得られたタンパク質性プロテアーゼインヒビター溶液（Ｌ’−１）〜（Ｌ’−４）３５０μＬと０．０１重量％アルカラーゼ溶液（品名「アルカラーゼ２．５Ｌ」、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌと１ｍＭ ＣａＣｌ_２との緩衝液（ｐＨ８、２５℃）で希釈、ノボザイムズ社製）３５０μＬを混合してタンパク質溶液（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−４）を作製し、２０分間４０℃で静置した。

【0119】

【表2】

【0120】

＜実施例３５〜６８及び比較例５〜８で得られたタンパク質溶液を用いて作製したタンパク質溶液の作製直後におけるプロテアーゼの残存活性の測定＞
・タンパク質溶液（Ｓ）の活性の測定
実施例３５〜６８及び比較例５〜８で得たタンパク質溶液について、作製後直ちにタンパク質溶液（Ｓ−１）〜（Ｓ−３４）、（Ｓ’−１）及び（Ｓ’−４）をそれぞれ７００μＬに、５０ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌと１ｍＭ ＣａＣｌ_２との緩衝液（ｐＨ８、２５℃）で溶解、ナカライテスク社製）をそれぞれ７０μＬ添加して溶液（ｉ）を作製し、酵素反応を開始した。溶液（ｉ）を作製直後及び３分ごとに３回、反応溶液のうち１５０μＬを取り出し、１５％トリクロロ酢酸溶液２００μＬと混合した。１５，０００×ｇの条件で５分間遠心し、上清に０．１Ｍ ＮａＯＨを４００μＬ加え、分光光度計を用い４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。溶液（ｉ）を作製直後の吸光度をＡ_λ０及び溶液（ｉ）を作製からｈ時間後の吸光度をＡ_λｈとし、吸光度の変化ΔＡ_λ（ΔＡ_λ＝Ａ_λｈ−Ａ_λ０）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｖ_１）を求めた。
・ブランクのタンパク質溶液の活性の測定
次に、タンパク質性プロテアーゼインヒビターを含まない溶液を作成し、上記と同様に吸光度を測定し、直線の傾き（係数ｖ_１）を求めた。
０．０１重量％アルカラーゼ溶液（品名「アルカラーゼ２．５Ｌ」、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌと１ｍＭ ＣａＣｌ_２との緩衝液（ｐＨ８、２５℃）で希釈、ノボザイムズ社製）３５０μＬに緩衝液｛０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌと１ｍＭ ＣａＣｌ_２との緩衝液（ｐＨ８、２５℃）｝３５０μＬを混合したタンパク質溶液（Ｔ−１）を作製し、２０分間４０℃で静置した。
上記「タンパク質溶液（Ｓ）の活性の測定」において、「タンパク質溶液（Ｓ−１）」に代えて「タンパク質溶液（Ｔ−１）」を用いる以外は同様にして溶液（ｉｉ）を作製し、吸光度を測定し、吸光度の変化ΔＡ_λ（ΔＡ_λ＝Ａ_λｈ−Ａ_λ０）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｖ_０）を求めた。
下記数式（１）から、タンパク質溶液（Ｓ−１）〜（Ｓ−３４）及び（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−４）のプロテアーゼの残存活性を求めた結果を表２に示す。
残存活性（％）＝ｖ_１／ｖ_０×１００（１）

【0121】

＜作製直後における希釈時のプロテアーゼの活性測定＞
実施例３５〜６８及び比較例５〜８で得たタンパク質溶液について、作製後直ちにタンパク質溶液（Ｓ−１）〜（Ｓ−）及び（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−４）をそれぞれ１０μＬ、９９９０μＬの緩衝液｛０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌと１ｍＭ ＣａＣｌ_２との緩衝液（ｐＨ８、２５℃）｝で希釈し、タンパク質希釈溶液（Ｕ−１）〜（Ｕ−３４）及び（Ｕ’−１）〜（Ｕ’−４）とした。
上記「タンパク質溶液（Ｓ）の活性の測定」において、「タンパク質溶液（Ｓ−１）〜（Ｓ−３４）及び（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−４）」に代えて「タンパク質希釈溶液（Ｕ−１）〜（Ｕ−３４）及び（Ｕ’−１）〜（Ｕ’−４）」を用いて、「３分ごとに３回」に代えて「３０分ごとに３回」とする以外は同様にして、作製直後における希釈時のプロテアーゼ活性を求めた。結果を表２に示す。

【0122】

＜２５℃３ヶ月保管後におけるプロテアーゼの残存活性の測定＞
実施例３５〜６８及び比較例５〜８で得たタンパク質溶液（Ｓ−１）〜（Ｓ−３４）及び（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−４）を２５℃で３ヶ月保管した。
上記「作製直後におけるプロテアーゼの残存活性の測定」において、「作製後直ちにタンパク質溶液」に代えて、「２５℃で３ヶ月保管したタンパク質溶液」とする以外は同様にして、２５℃３ヶ月保管後のプロテアーゼの残存活性を測定した。結果を表２に示す。

【0123】

＜２５℃３ヶ月保管後の希釈時のプロテアーゼの活性測定＞
上記「作製直後における希釈時のプロテアーゼの活性測定」において、「作製後直ちにタンパク質溶液」に代えて、「２５℃で３ヶ月保管したタンパク質溶液」を用いる以外は同様にして、実施例３５〜６８及び比較例５〜８で得たタンパク質溶液（Ｓ−１）〜（Ｓ−３４）及び（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−４）を２５℃で３ヶ月保管後の希釈時のプロテアーゼの活性を求めた。結果を表２に示す。

【0124】

＜プロテアーゼ活性の持続性＞
タンパク質溶液作製直後のプロテアーゼ活性と２５℃で３ヶ月保管後のプロテアーゼ活性との比をプロテアーゼ活性の持続性として、以下の式にて算出した。
プロテアーゼ活性の持続性（％）＝（２５℃で３ヶ月保管後のプロテアーゼ活性）／（作製直後のプロテアーゼ活性）×１００

【0125】

表２の評価結果から、配列番号１又は６のタンパク質性プロテアーゼインヒビターを含む比較例５及び８のタンパク質溶液は、作製直後の残存活性が０％であるものの、希釈時のプロテアーゼ活性が１０％と低く、プロテアーゼ活性を抑制できるものの、回復できないことが分かる。また、アミノ酸配列（Ａ）との相同性が９７％であり、本発明の条件（１）〜（８）を満たさない配列番号４１のタンパク質性プロテアーゼインヒビターを含む比較例７のタンパク質溶液も、希釈時のプロテアーゼ活性が８％と低く、プロテアーゼ活性を回復できないことが分かる。
また、本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターとの相同性が６５％であるタンパク質性プロテアーゼインヒビターを含む比較例６のタンパク質溶液は、プロテアーゼ活性の持続性が２％と低く、３ヶ月保管後にプロテアーゼ活性が低下することが分かる。
一方、本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターを含む実施例３５〜６８のタンパク質溶液は、本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターとの相同性が６５％である配列番号４０のタンパク質性プロテアーゼインヒビターを含む比較例６のタンパク質溶液と比較して、残存活性が低く、同濃度添加することで効率よくプロテアーゼ活性を抑制することができることが分かる。また、作製直後の実施例３５〜６８のタンパク質溶液において、希釈時のプロテアーゼ活性が１８％以上であることから、希釈することにより、抑制したプロテアーゼ活性を効率よく回復できることが分かる。
さらに、本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターを含む実施例３５〜６８のタンパク質溶液は、２５℃で３ヶ月保管後のプロテアーゼ活性が５％以上と高く、プロテアーゼ活性の持続性も６〜９８％であり、３ヶ月保管後もプロテアーゼ活性を維持していることが分かる。

【0126】

＜実施例６９〜１０２＞
表３〜表５に記載された割合で、タンパク質性プロテアーゼインヒビター溶液（Ｌ−１）〜（Ｌ−３４）、プロテアーゼ（Ｄ）、界面活性剤（Ｆ）、プロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）、キレート剤及び溶剤（Ｅ）を２５℃で配合し、実施例６９〜１０２の洗剤組成物を得た。

【0127】

＜比較例９〜１２＞
表５に記載された割合で、タンパク質性プロテアーゼインヒビター溶液（Ｌ’−１）〜（Ｌ’−４）、プロテアーゼ（Ｄ）、界面活性剤（Ｆ）、プロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）、キレート剤及び溶剤（Ｅ）を２５℃で配合し、比較例９〜１２の洗剤組成物を得た。

【0128】

【表3】

【0129】

【表4】

【0130】

【表5】

【0131】

なお、表３〜表５中、各成分の割合は、重量部で示した。また、表３〜表５中のプロテアーゼ（Ｄ）は下記のものを使用した。
アルカラーゼ水溶液（ＳＤＳ−ＰＡＧＥよりアルカラーゼ含量は０．１ｇ／ｍＬと推定）：ノボザイムズ社製、商品名「アルカラーゼ２．５Ｌ」
また、表３〜５中のプロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）は下記のものを使用した。
セルラーゼ水溶液（ＳＤＳ−ＰＡＧＥよりセルラーゼ含量は０．０１ｇ／ｍＬと推定）：ノボザイムズ社製、商品名「エンドラーゼ」

【0132】

実施例６９〜１０２及び比較例９〜１２で作製した洗剤組成物を用いて下記の洗浄性試験をおこなった。

【0133】

＜洗浄性試験＞
＜配合直後の洗浄除去率＞
実施例６９〜１０２及び比較例９〜１２で得た洗剤組成物について、洗剤組成物の作製後直ちに洗剤組成物０．８ｇを水９９９．２ｇに溶解させ溶液を得た。この溶液に、湿式人工汚染布（４ｃｍ×４ｃｍ）５枚を投入し、ターゴトメーター（大栄化学社製）を用いて以下の条件にて洗浄及びすすぎをした後、布を取り出し、ギヤーオーブン（ＴＡＢＡＩ社製、ＧＰＳ−２２２）を用いて７０℃で６０分間乾燥し、試験布を得た。ついで、多光源分光測色計（スガ試験機社製）を使用して、この試験布の５４０ｎｍの反射率を、試験布１枚ごとに表裏２個所ずつ計４個所（試験布５枚で合計２０個所）測定し、この平均値を求め、以下の式にて洗浄除去率（％）を算出した。結果を表３〜表５に記載した。
（洗浄条件）
時間：１０分、温度：２５℃、回転速度：１２０ｒｐｍ
（すすぎ条件）
時間：１分、温度：２５℃、回転速度：１２０ｒｐｍ
（洗浄除去率）
洗浄除去率（％）＝｛（Ｒ_Ｗ−Ｒ_Ｓ）／（Ｒ_Ｉ−Ｒ_Ｓ）｝×１００
なお、Ｒ_Ｉは清浄布の反射率、Ｒ_Ｗは洗浄布の反射率、Ｒ_Ｓは汚染布の反射率を示す。
また、使用した湿式人工汚染布は、表６の汚垢組成を有する財団法人洗濯科学協会製の湿式人工汚染布（５４０ｎｍにおける反射率が４０±５％）である。

【0134】

【表6】

【0135】

＜２５℃３ヶ月保管後の洗浄除去率＞
実施例６９〜１０２及び比較例９〜１２で得た洗剤組成物について、上記＜配合直後の洗浄除去率＞において、作製直後の洗剤組成物の代わりに、洗剤組成物の作製後２５℃で３ヶ月保管した後の洗剤組成物を用いる以外は同様に洗浄性試験をおこない、洗浄除去率を算出した。結果を表３〜表５に記載した。

【0136】

＜洗浄性の持続性＞
配合直後の洗浄除去率と２５℃で３ヶ月保管後の洗浄除去率との比を洗浄性の持続性として、以下の式にて算出した。
洗浄性の持続性（％）＝（２５℃で３ヶ月保管後の洗浄除去率）／（配合直後の洗浄除去率）×１００

【0137】

表３〜表５の評価結果から、本発明の洗剤組成物は、洗浄性の持続性が高く、長期的に洗浄性を保つことができることがわかる。

【産業上の利用可能性】

【0138】

本発明のタンパク質性プロテアーゼインヒビターは、プロテアーゼの活性を効率よく、長期的に阻害できるので、医薬品、食品、洗剤及び生化学の分野において有効に使用することができる。また、本発明のタンパク質溶液は、プロテアーゼ活性が充分に抑制されているので、長期間プロテアーゼ活性を持続でき、医薬品、食品、洗剤及び生化学の分野において有効に使用することができる。たとえば、タンパク医薬品液体製剤、酵素液体製剤、工業用酵素水溶液、液体洗剤、飲料、診断薬用の測定試薬、タンパク質の標準液等に使用できる。本発明の洗剤組成物は、プロテアーゼ活性が充分抑制されているので、長期間洗浄性を持続でき、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤及びコンタクトレンズ用洗浄剤として使用でき、特に衣料用液体洗剤に使用できる。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]