特許 5954727 自己免疫疾患治療に用いる新規抗原としての炭酸脱水酵素Ｉ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5954727

(24)【登録日】2016年6月24日

(45)【発行日】2016年7月20日

(54)【発明の名称】自己免疫疾患治療に用いる新規抗原としての炭酸脱水酵素Ｉ

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/51 20060101AFI20160707BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20160707BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20160707BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20160707BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20160707BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160707BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20160707BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20160707BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20160707BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160707BHJP

【ＦＩ】

   A61K37/56

   A61K39/00 H

   A61K35/17

   A61P37/06

   A61P1/04

   A61P43/00 107

   A61P29/00

   C12N5/0783

   C12N5/0784

   !C12N15/00 AZNA

【請求項の数】21

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2011-537118(P2011-537118)

(86)(22)【出願日】2010年10月7日

(86)【国際出願番号】JP2010006018

(87)【国際公開番号】WO2011048766

(87)【国際公開日】20110428

【審査請求日】2013年10月3日

(31)【優先権主張番号】特願2009-242491(P2009-242491)

(32)【優先日】2009年10月21日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504147254

【氏名又は名称】国立大学法人愛媛大学

(74)【代理人】

【識別番号】100110973

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100120293

【弁理士】

【氏名又は名称】中谷 智子

(72)【発明者】

【氏名】村上 英広

(72)【発明者】

【氏名】山西 浩文

(72)【発明者】

【氏名】恩地 森一

【審査官】 井上 明子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−０２０４５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−２９８１８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Experimental Medicine，１９９８年，Vol.187, No.6，p.855-864

【文献】 European Journal of Immunology，２００１年，Vol.31, No.1，p.23-31

【文献】 Gastroenterology，２００７年，Vol.132, No.7，p.2359-2370

【文献】 膵臓，２００７年，Vol.22, No.5，p.534-546

【文献】 東北医学雑誌，１９９７年，Vol.109, No.1，p.49-52

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００ − ３９／４４

Ａ６１Ｋ ３８／５１

Ａ６１Ｋ ３５／１７

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

自己免疫疾患の治療又は予防において使用するための炭酸脱水酵素Ｉを有効成分として含有する医薬組成物。

【請求項2】

自己免疫疾患の治療又は予防が、寛容原性抗原提示細胞に基づく細胞治療である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記炭酸脱水酵素Ｉが前記寛容原性抗原提示細胞をパルスするために使用されることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、請求項２又は請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

自己免疫疾患の治療又は予防において使用するための炭酸脱水酵素Ｉに特異的な寛容原性抗原提示細胞を有効成分として含有する医薬組成物。

【請求項7】

前記寛容原性抗原提示細胞が炭酸脱水酵素Ｉでパルスされていることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、請求項６又は請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

自己免疫疾患の治療又は予防において使用するための炭酸脱水酵素Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬組成物。

【請求項10】

自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、請求項６〜請求項９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

炭酸脱水酵素Ｉに特異的な寛容原性抗原提示細胞の調製に使用するための炭酸脱水酵素Ｉを含有する組成物。

【請求項12】

寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

炭酸脱水酵素Ｉを使用することを特徴とする炭酸脱水酵素Ｉに特異的な寛容原性抗原提示細胞の製造方法。

【請求項14】

寛容原性抗原提示細胞を調製するステップ、及び、
炭酸脱水酵素Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップを備える、請求項１３に記載の製造方法。

【請求項15】

寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、請求項１３又は請求項１４に記載の製造方法。

【請求項16】

炭酸脱水酵素Ｉを使用することを特徴とする炭酸脱水酵素Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞の製造方法。

【請求項17】

寛容原性抗原提示細胞及びナイーブＴ細胞を調製するステップ、
炭酸脱水酵素Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、
パルスした寛容原性抗原提示細胞とナイーブＴ細胞を接触させるステップを備える、請求項１６に記載の製造方法。

【請求項18】

寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、請求項１６又は請求項１７に記載の製造方法。

【請求項19】

炭酸脱水酵素Ｉに特異的な寛容原性抗原提示細胞。

【請求項20】

寛容原性抗原提示細胞が制御性樹状細胞である請求項１９に記載の細胞。

【請求項21】

炭酸脱水酵素Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞を利用した自己免疫疾患の治療方法に関する。

【背景技術】

【0002】

クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、腸管における免疫機構の破綻により特徴づけられる疾患である。詳細な病因等は未だ明らかとされていないが、共生細菌、様々な微生物生産物、及び食品に対する過剰な自然免疫及び獲得免疫反応が原因の一つではないかと想定されている（非特許文献１〜３参照）。

【0003】

微小環境における免疫調節は、局所のホメオスタシスを維持するために定常的に微調整される必要がある。このような調整は、部位（例えば消化管環境）に特異的であり、微生物への慢性的な曝露により誘導されると考えられている。樹状細胞は、この調節を制御する上で重大な役割を担っている（非特許文献４参照）。樹状細胞は、最も強力でかつ効果的な抗原提示細胞であり、初期免疫反応の誘導に重要である。また、樹状細胞は免疫寛容の形成にも重要な役割を果たしている。樹状細胞が、中枢及び末梢リンパ系器官における抗原特異的な免疫寛容をｉｎ ｓｉｔｕで誘導していることが報告されている（非特許文献５参照）。免疫寛容のメカニズムは完全には解明されていないが、樹状細胞がＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞をＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に分化させることにより、末梢においてＴ細胞による免疫寛容を誘導することが報告されている（非特許文献６参照）。

【0004】

樹状細胞の免疫寛容原性の選択的な増強は、樹状細胞の成熟を薬理的に阻害し得られた未熟樹状細胞、又は免疫抑制分子を発現する遺伝子組換樹状細胞を用いることにより行われてきた（非特許文献７参照）。また、マウスモデルを用いた研究により、自己免疫、アレルギー、移植における拒絶反応等の幅広い疾患において、いくつかのタイプの寛容原性又は制御性樹状細胞が抗原特異的に病態を改善することが報告されている（非特許文献６及び８〜１１参照）。

【0005】

盲腸細菌抗原（Ｃｅｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａl ａｎｔｉｇｅｎ：以下、「ＣＢＡ」という）は、炎症性腸疾患の病態への関与が想定されている物質の一つである。重症複合型免疫不全症モデルマウスに、ＣＢＡ反応性のインターロイキン（ＩＬ）−１７産生ＣＤ４^＋Ｔ細胞を移植することで、重症腸炎を発症することが報告されている（非特許文献１２〜１４参照）。ＣＢＡは幾つかのタンパク質から構成されていると予想されるが、いずれのタンパク質が炎症性腸疾患における特異抗原であるか解析した報告はない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ＴＴら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０７：１９２０−５

【非特許文献2】Ｓａｒｔｏｒ ＲＢ．ら（２００８）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３４：５７７−９４

【非特許文献3】Ｂａｕｍｇａｒｔ ＤＣら（２００７）Ｌａｎｃｅｔ，３６９：１６２７−４０

【非特許文献4】Ｂｅｌｋａｉｄ Ｙら（２００８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２６：３６２−７１

【非特許文献5】Ｓｔｅｎｍａｎ ＲＭら（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：６８５−７１１

【非特許文献6】Ｆｕｊｉｔａ Ｓら（２００７）Ｂｌｏｏｄ，１１０：３７９３−８０３

【非特許文献7】Ｈａｃｋｓｔｅｉｎ Ｈら（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：２４−３４

【非特許文献8】Ｍｅｎｇｅｓ Ｍら（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９５：１５−２１

【非特許文献9】Ｔｏｒｉｓｕ Ｍら（２００８）Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，４３：１００−７

【非特許文献10】Ｆｕｊｉｔａ Ｓら（２００８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２１：９５−１０４ ｅ７

【非特許文献11】Ｓａｔｏ Ｋら（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１８：３６７−７９

【非特許文献12】Ｃｏｎｇ Ｙら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：８５５−６４

【非特許文献13】Ａｌｓｏｎ ＣＯら（２００７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３２：２３５９−７０

【非特許文献14】Ｂｒｉｍｎｅｓ Ｊら（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１：２３−３１

【発明の概要】

【0007】

現在の治療戦略では効果的に炎症性腸疾患を治療することができず、新規のより優れた治療方法が求められている。
本発明者らは、マウスモデルにおいて炭酸脱水酵素Ｉ（Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｉ：ＣＡ Ｉ）、及びＣＡ Ｉによりパルスした制御性樹状細胞が抗原特異的に炎症性腸疾患に対する治療効果を示すことを見出し、本発明を完成させた。具体的には、ＣＢＡを二次元ディファレンスゲル電気泳動（２Ｄ−ＤＩＧＥ）及び飛行時間型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）により分析し、ＣＢＡの主要タンパク質がＣＡ Ｉであることを確認した。また、確認されたＣＡ Ｉを用いて制御性樹状細胞をパルスしたところ、大腸炎モデルマウスにおいて抗原特異的な腸炎抑制作用を誘導することを見出した。更に、ＣＡ Ｉを直接投与することによっても、大腸炎モデルマウスにおいて抗原特異的な腸炎抑制作用が誘導されることを見出した。

【0008】

よって、本発明は抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞を利用した自己免疫疾患の治療方法に関し、特には、ＣＡ Ｉを抗原として利用し、抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞を産生させることを特徴とする自己免疫疾患（特には、炎症性腸疾患）の治療方法に関する。

【0009】

より具体的には、本発明は、以下の発明に関する。
（１） 自己免疫疾患の治療又は予防において使用するためのＣＡ Ｉを有効成分として含有する医薬組成物。
（２） 自己免疫疾患の治療又は予防が、寛容原性抗原提示細胞に基づく細胞治療である、（１）に記載の医薬組成物。
（３） 寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（２）に記載の医薬組成物。
（４） 自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（５） 自己免疫疾患の治療又は予防において使用するためのＣＡ Ｉに特異的な寛容原性抗原提示細胞を有効成分として含有する医薬組成物。
（６） 寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（５）に記載の医薬組成物。
（７） 自己免疫疾患の治療又は予防において使用するためのＣＡ Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬組成物。
（８） 自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、（５）〜（７）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（９） 抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞の調製に使用するためのＣＡ Ｉを含有する組成物。
（１０） 寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（９）に記載の組成物。
（１１） ＣＡ Ｉを使用することを特徴とする、患者における免疫寛容の誘導方法。
（１２） 寛容原性抗原提示細胞に基づくことを特徴とする、（１１）に記載の方法。
（１３） 寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（１２）に記載の方法。
（１４） ＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップを備える、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５） 患者から寛容原性抗原提示細胞を採取するステップ、
ＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、及び、
パルスした寛容原性抗原提示細胞を患者に投与するステップを備える、（１１）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法。
（１６） 患者にＣＡ Ｉを投与するステップを備える、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１７） ＣＡ Ｉを使用することを特徴とする自己免疫疾患の治療又は予防方法。
（１８） 治療又は予防が、寛容原性抗原提示細胞に基づくことを特徴とする、（１７）に記載の治療又は予防方法。
（１９） 寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（１７）又は（１８）に記載の治療又は予防方法。
（２０） ＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップを備える、（１７）〜（１９）のいずれか１項に記載の自己免疫疾患の治療又は予防方法。
（２１） 患者から寛容原性抗原提示細胞を採取するステップ、
ＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、及び、
パルスした寛容原性抗原提示細胞を患者に投与するステップを備える、（１７）〜（２０）のいずれか１項に記載の治療又は予防方法。
（２２） 患者にＣＡ Ｉを投与するステップを備える、（１７）〜（１９）のいずれか１項に記載の方法。
（２３） 自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、（１７）〜（２２）のいずれか１項に記載の治療又は予防方法。
（２４） ＣＡ Ｉを使用することを特徴とする抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞の製造方法。
（２５） 寛容原性抗原提示細胞を調製するステップ、及び、
ＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップを備える、（２４）に記載の製造方法。
（２６） 寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（２４）又は（２５）に記載の製造方法。
（２７） 抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞が、免疫寛容の誘導又は自己免疫疾患の治療又は予防に使用するための抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞である、（２４）〜（２６）のいずれか１項に記載の製造方法。
（２８） 自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、（２７）に記載の製造方法。
（２９） ＣＡ Ｉを使用することを特徴とする抗原特異的な制御性Ｔ細胞の製造方法。
（３０） 寛容原性抗原提示細胞及びナイーブＴ細胞を調製するステップ、
ＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、
パルスした寛容原性抗原提示細胞とナイーブＴ細胞を接触させるステップを備える、（２９）に記載の製造方法。
（３１） 寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（２９）又は（３０）に記載の製造方法。
（３２） 抗原特異的な制御性Ｔ細胞が、免疫寛容の誘導又は自己免疫疾患の治療又は予防に使用するための抗原特異的な制御性Ｔ細胞である、（２９）〜（３１）のいずれか１項に記載の製造方法。
（３３） 自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、（３２）に記載の製造方法。
（３４） ＣＡ Ｉに特異的な免疫原性抗原提示細胞。
（３５） 免疫原性抗原提示細胞が制御性樹状細胞である（３４）に記載の細胞。
（３６） ＣＡ Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞。

【0010】

本明細書において、「細胞治療」とは、細胞の投与を特徴とする疾患の治療方法を意味する。細胞は、投与を受ける患者から得た細胞であってもよいし、異なる個体から得た細胞であってもよい。本発明においては、好ましくは投与を受ける患者から得た細胞を使用する。一般的には、細胞治療は、細胞を採取及び分離するステップ、細胞を処理するステップ、及び、処理した細胞を患者に投与するステップを含む。また、細胞治療は、細胞を増殖させるステップを含んでいてもよい。また、「寛容原性抗原提示細胞に基づく細胞治療」とは、寛容原性抗原提示細胞の投与を特徴とする疾患の治療方法を意味する。

【0011】

「炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡ Ｉ）」は、一般的には、細胞質に存在し、二酸化炭素の水和反応を可逆的に触媒する金属酵素である。本明細書において、「ＣＡ Ｉ」は、完全長のＣＡ Ｉである必要はなく、ＣＡ Ｉに特異的な免疫原性抗原提示細胞を誘導することが可能であればその部分ペプチドをも含むものである。また、本明細書におけるＣＡ Ｉ（その部分ペプチドを含む。以下同じ。）は、ＣＡ Ｉに特異的な免疫原性抗原提示細胞を誘導することが可能である限り、そのアミノ酸配列の一部（例えば、数個）が、置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたものであってもよい。又は、本明細書におけるＣＡ Ｉは、ＣＡ Ｉに特異的な免疫原性抗原提示細胞を誘導することが可能である限り、ＣＡ Ｉのアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７５％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は、９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。あるいは、本明細書におけるＣＡ Ｉは、ＣＡ Ｉに特異的な免疫原性抗原提示細胞を誘導することが可能である限り、ＣＡ Ｉの遺伝子配列とストリンジェントな条件下（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））でハイブリダイズする遺伝子配列によりコードされたタンパク質であってもよい。ＣＡ Ｉは、免疫寛容能を高めるため、適宜修飾されていてもよい。また、ＣＡ Ｉは、免疫寛容能を高める物質、又は免疫寛容能を有する他の物質等との融合タンパク質であってもよい。好ましくは、ＣＡ Ｉは、前記本明細書におけるＣＡ Ｉに含まれるタンパク質又はペプチドのうち、該タンパク質又はペプチドにより誘導された免疫原性抗原提示細胞が免疫寛容を誘導し、自己免疫疾患（好ましくは炎症性腸炎）の治療又は予防効果を奏するタンパク質又はペプチドである。

【0012】

「寛容原性抗原提示細胞」とは、免疫寛容を誘導する抗原提示細胞のことである。寛容原性抗原提示細胞は、治療の対象となる患者由来の細胞であってもよいし、患者以外の由来の細胞であってもよいが、好ましくは患者由来の細胞である。寛容原性抗原提示細胞としては、例えば、制御性樹状細胞を挙げることができる。「制御性樹状細胞」は、寛容原性樹状細胞と呼ばれることもある、免疫寛容にかかわる樹状細胞のサブセットであれば特に限定されない。制御性樹状細胞は、インターロイキン１０等のサイトカインの産生を通じて免疫抑制を引き起こす作用を有する樹状細胞、制御性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞）を生成させる作用を有する樹状細胞、及び／又はＴ細胞の機能を制御する作用を有する樹状細胞を含む。例として、制御性樹状細胞としては、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６等の共刺激分子を細胞表面に発現していない樹状細胞、及び、ＣＣＲ９を細胞表面に発現している樹状細胞（Ｈａｄｅｉｂａ、Ｈら（２００８）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９（１１）：１２５３−６０）、ｍｉＲ−１５５を細胞表面に発現している樹状細胞（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，ＡＷら（２００９）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７（１）：４８−５９）、ＣＤ２００ｒｅｃｅｐｔｏｒ３を表面に発現している樹状細胞（Ｓａｔｏ，Ｋら（２００９）Ｂｌｏｏｄ．，１１７３：４７８０−９）を挙げることができる。

【0013】

「制御性Ｔ細胞」とは、組織障害を起こし得るＴ細胞の活性を抑制する働きのあるＴ細胞のことである。制御性Ｔ細胞は、治療の対象となる患者由来の細胞であってもよいし、患者以外の由来の細胞であってもよいが、好ましくは患者由来の細胞である。好ましくは、制御性Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ４及びＣＤ２５分子を細胞表面に発現しているＴ細胞である。

【0014】

「ナイーブＴ細胞」とは、特異抗原と接触していないＴ細胞のことであり、好ましくは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ナイーブＴ細胞である。

【0015】

「免疫寛容」とは、免疫反応レベルの減少、免疫反応の発生又は進行の遅れ、及び／又は免疫反応によるリスクの減少を意味する。抗原特異的な免疫寛容とは、他の抗原と比較してある抗原に対して特に免疫寛容が起きることをいう。

【0016】

本明細書において、「自己免疫疾患」とは、自己抗原に対して免疫応答が起こることにより発症する疾患を意味する。本発明において、自己免疫疾患は炎症性腸疾患を含む。「炎症性腸疾患」は、慢性の持続性の腸炎を特徴とする疾患であり、潰瘍性大腸炎及びクローン病等を含む。

【発明の効果】

【0017】

本発明のＣＡ Ｉを抗原として利用する細胞治療は、これまで治療が困難であった自己免疫疾患、特には炎症性腸疾患の症状を改善することから、自己免疫疾患の治療又は予防方法として有用である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】成熟樹状細胞及び制御性樹状細胞の細胞表面分子の発現をフローサイトメトリーで分析した結果を示すドットプロット図である。図中、「Ｍａｔｕｒｅ ＤＣｓ」は成熟樹状細胞を示し、「Ｒｅｇ−ＤＣｓ」は制御性樹状細胞を示す。それぞれの左側の３つのデータにおいて、縦軸は、ＣＤ１１ｃの発現レベルを示し、横軸は、左から順に、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の発現レベルを示す。一番右の図において、縦軸は、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅの発現レベルを示し、横軸はＨ−２Ｋ^ｄの発現レベルを示す。

【図2】成熟樹状細胞及び制御性樹状細胞を、ポリイノシンＰｏｌｙ：Ｉ−Ｃ、超高純度ＬＰＳ、Ｒ８４８、又はＣｐＧ−ＯＤＮで２４時間刺激した後の培養上清におけるＩＬ−６及びＩＬ−１０の産生をサイトメトリックビーズアレイ法（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）により測定した結果を示すグラフである。エラーバーは標準偏差（以下、「ＳＤ」という）を示す。図中、縦軸はそれぞれのサイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は測定したサイトカインを示す。星印は、成熟樹状細胞の結果と比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。

【図3】Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、成熟樹状細胞又は制御性樹状細胞を用いてＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を誘導し、フローサイトメトリーで測定した結果をドットプロットで表わしたグラフである。一番左の図は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を制御性樹状細胞で刺激した場合のアイソタイプコントロールＩｇＧ及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はアイソタイプコントロールＩｇＧの発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。「Ｍａｔｕｒｅ ＤＣ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を成熟樹状細胞で刺激した場合のＦｏｘｐ３及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はＦｏｘｐ３の発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。「Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＤＣ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を制御性樹状細胞で刺激した場合のＦｏｘｐ３及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はＦｏｘｐ３の発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。

【図4】図３のフローサイトメトリーの結果から、生成したＴ細胞サブセットの割合を計算した結果を示す図である。図中、縦軸は割合を示す。横軸において、「ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｃｅｌｌ」は、生成したＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞数の割合を示し、「ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋／ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｃｅｌｌ」は、生成したＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞における、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞の割合を示す。エラーバーは、ＳＤを示す。星印は、成熟樹状細胞の結果と比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。

【図5】ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞により誘導したマウス大腸炎モデルを用いた実験の結果を示す図である。（図５Ａ）体重変化（％）の時間経過を示すグラフである。図中、縦軸は体重変化（％）を示し、横軸は、細胞移植後の経過日数を示す。図中、三角は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植していないマウスを示し；白丸は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し；黒丸は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、抗原をパルスしていない制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；白四角は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＫＬＨでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；黒四角は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。エラーバーは、ＳＤを示す。（図５Ｂ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移植より２８日後の大腸の肉眼的所見を示す写真である。写真中、上から順に、「ＳＣＩＤ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植していないマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔｃｅｌｌｓ＋ＰＢＳ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ−ＤＣ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、抗原をパルスしていない制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ−ＤＣ_ＫＬＨ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＫＬＨでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ−ＤＣ_ＣＢＡ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。右下の棒は１０ｍｍを示す。（図５Ｃ）図５Ｂの大腸の長さを測定した結果を示すグラフである。図中、縦軸は、大腸の長さ（ｃｍ）を示し、横軸は大腸の長さの測定に用いたマウスを示す。エラーバーは、ＳＤを示す。（図５Ｄ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移植より２８日後の大腸をヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した結果示す写真である。図中、上の写真は４０倍に拡大した写真を、下の写真は２００倍に拡大した写真を示す。図中、左の写真は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスの大腸組織を示し、右の写真は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスの大腸組織を示す。（図５Ｅ）組織学的スコアを計算した結果を示すグラフである。図中、縦軸は組織学的スコアを示し、横軸は組織学的スコアの測定に用いたマウスを示す。グラフ中の水平線は、中央値を示す。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。

【図6】ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞により誘導したマウス大腸炎モデルの大腸における炎症性サイトカインの発現を測定した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、横軸において、ＰＢＳは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し、Ｒｅｇ−ＤＣ_ＣＢＡは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。（図６Ａ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植４週間後に大腸におけるサイトカインｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各サイトカインｍＲＮＡの発現量を示す。（図６Ｂ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植４週間後に採取した大腸細胞をｅｘ ｖｉｖｏで３日間培養した培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ、サイトメトリックビーズアレイ法（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で測定した結果を示すグラフである。図中、縦軸は各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。

【図7】ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞により誘導したマウス大腸炎モデルの腸間膜リンパ球（以下、「ＭＬＮ」という）における転写因子及び炎症性サイトカインの発現を測定した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、横軸において、ＰＢＳは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し、Ｒｅｇ−ＤＣ_ＣＢＡは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。（図７Ａ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植４週間後にＭＬＮにおける転写因子ｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各転写因子ｍＲＮＡの発現量を示す。（図７Ｂ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植４週間後にＭＬＮにおけるサイトカインｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各サイトカインｍＲＮＡの発現量を示す。（図７Ｃ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植４週間後に採取したＭＬＮを２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン存在下で７２時間培養した培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ、サイトメトリックビーズアレイ法（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で測定した結果を示すグラフである。図中、縦軸は各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。

【図8】ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞再構成マウスに対して、ＰＢＳ又はＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の誘導について測定した結果を示す図である。（図８Ａ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植から１週間後に採取したＭＬＮをフローサイトメトリーで測定した結果をドットプロットで表わした図である。一番左の図は、ＢＡＬＢ／Ｃの脾細胞のアイソタイプコントロールＩｇＧ及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はアイソタイプコントロールＩｇＧの発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。「ＰＢＳ」は、ＰＢＳを投与した場合のＦｏｘｐ３及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はＦｏｘｐ３の発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。「Ｒｅｇ−ＤＣ_ＣＢＡ」は、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与した場合のＦｏｘｐ３及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はＦｏｘｐ３の発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。（図８Ｂ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植から１、３及び５週間後に採取したＭＬＮにおけるＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。図中、白丸印は、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し、白三角印は、ＰＢＳを投与したマウスを示す。縦軸は、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の割合（％）を示し、横軸は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植からの経過期間（週）を示す。（図８Ｃ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植から７日後に採取したＭＬＮをフローサイトメトリーで測定した結果をドットプロットで表わした図である。一番左の図は、ＢＡＬＢ／Ｃの脾細胞のアイソタイプコントロールＩｇＧ及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はアイソタイプコントロールＩｇＧの発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。「ＰＢＳ」は、ＰＢＳを投与した場合のＩＬ−１０及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はＩＬ−１０の発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。「Ｒｅｇ−ＤＣ_ＣＢＡ」は、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与した場合のＩＬ−１０及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はＩＬ−１０の発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。（図８Ｄ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植から２、４、７及び１４日後に採取したＭＬＮにおけるＩＬ−１０^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。図中、白丸印は、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し、白三角印は、ＰＢＳを投与したマウスを示す。縦軸は、ＩＬ−１０^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の割合（％）を示し、横軸は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植からの経過期間（日）を示す。

【図9】ＣＢＡの２次元電気泳動ゲルをディープパープルで染色した結果を示す写真である。スポットは、表１に記載の番号に従ってラベルした。図中右の数値はマーカーの分子量（ｋＤａ）を示す。また、図上部の数値は、等電点電気泳動のｐＨを示す。

【図10】マウス大腸組織におけるＣＡ Ｉ発現を免疫組織化学染色により検出した結果を示す写真である。図中、上の写真は４０倍に拡大した写真を、下の写真は２００倍に拡大した写真を示す。写真中、左から順に、「ＳＣＩＤ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植していないマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔｃｅｌｌｓ＋ＰＢＳ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ−ＤＣ_ＣＢＡ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。

【図11】ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞により誘導したマウス大腸炎モデルにＣＡ Ｉでパルスした制御性樹状細胞を投与した結果を示す図である。図１１Ｂ及び１１Ｃの横軸において、「ＳＣＩＤ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植していないマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔｃｅｌｌｓ＋ＰＢＳ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ−ＤＣ_ＣＢＡ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ−ＤＣ_{ＣＡ１−ｃｏｎｔｒｏｌ}」は、ＣＡ Ｉの遺伝子配列を組み込んでいないｅｍｐｔｙ ｐｌａｓｍｉｄでＣＡ Ｉと同様にセルフリータンパク質合成システムに従って作成したものをＣＡ Ｉ−ｃｏｎｔｒｏｌとしこれによりパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ−ＤＣ_ＣＡ１」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＣＡ Ｉでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。また、図１１Ｄ〜図１１Ｇの横軸において、「ＰＢＳ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し；「Ｒｅｇ−ＤＣ_ＣＡ１」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＣＡ Ｉでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。（図１１Ａ）体重変化（％）の時間経過を示すグラフである。図中、縦軸は体重変化（％）を示し、横軸は、細胞移植後の経過日数を示す。図中、三角は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植していないマウスを示し；白丸は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し；黒四角は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；ひし形は、ＣＡ Ｉの遺伝子配列を組み込んでいないｅｍｐｔｙ ｐｌａｓｍｉｄでＣＡ Ｉと同様にセルフリータンパク質合成システムに従って作成したものをＣＡ Ｉ−ｃｏｎｔｒｏｌとしこれでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；黒ひし形は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植し、ＣＡ Ｉでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。エラーバーは、ＳＤを示す。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。（図１１Ｂ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植から２８日後の大腸の長さを測定した結果を示すグラフである。図中、縦軸は、大腸の長さ（ｃｍ）を示し、横軸は大腸の長さの測定に用いたマウスを示す。エラーバーは、ＳＤを示す。二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。（図１１Ｃ）組織学的スコアを計算した結果を示すグラフである。図中、縦軸は組織学的スコアを示し、横軸は組織学的スコアの測定に用いたマウスを示す。グラフ中の水平線は、中央値を示し、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。（図１１Ｄ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植４週間後に大腸における炎症性サイトカインｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各サイトカインｍＲＮＡの発現量を示す。図中、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。（図１１Ｅ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植４週間後にＭＬＮにおける転写因子及び炎症性サイトカインのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各転写因子ｍＲＮＡ及び各サイトカインｍＲＮＡの発現量を示す。図中、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。（図１１Ｆ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植４週間後に採取した大腸をｅｘ ｖｉｖｏで３日間培養した培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸は各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。図中、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。（図１１Ｇ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植４週間後に採取したＭＬＮを２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン存在下で７２時間培養した培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ、サイトメトリックビーズアレイ法（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で測定した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸は各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。

【図12A】ＰＢＳ、ｍＣＡ１−ｃｏｎｔｒｏｌ、又はｍＣＡ１を投与した後、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移入し腸炎を誘導したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移入腸炎モデルマウスの結果を示す図である（図１２Ｂ〜図１２Ｇも同様）。体重変化（％）の時間経過を示すグラフである。図中、縦軸は体重変化（％）を示し、横軸は、細胞移植後の経過日数を示す。図中、三角は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植していないＳＣＩＤマウス（ｎ＝６）を示し；白丸は、ＰＢＳを投与後、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植したＳＣＩＤマウス（ｎ＝７）を示し；四角は、ＣＡ Ｉの遺伝子配列を組み込んでいないｅｍｐｔｙ ｐｌａｓｍｉｄで合成したタンパク質（ｍＣＡ１−ｃｏｎｔｒｏｌ）を投与した後、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植したＳＣＩＤマウス（ｎ＝７）を示し；黒四角は、ｍＣＡ１を投与した後、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植したＳＣＩＤマウス（ｎ＝７）を示す。エラーバーは、ＳＤを示す。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。

【図12B】ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植した２８日後の大腸の長さを測定した結果を示すグラフである。図中、縦軸は、大腸の長さ（ｃｍ）を示し、横軸は大腸の長さの測定に用いたマウスを示す。横軸において、「ＳＣＩＤ」は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植していないマウスを示し；「ＰＢＳ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻→ＳＣＩＤ」は、ＰＢＳを投与後、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植したマウスを示し；「ＣＡ１−ｃｏｎｔｒｏｌ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻→ＳＣＩＤ」は、ＣＡ Ｉの遺伝子配列を組み込んでいないｅｍｐｔｙ ｐｌａｓｍｉｄで合成したタンパク質（ｍＣＡ１−ｃｏｎｔｒｏｌ）を投与後、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植したマウスを示し；「ＣＡ１＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻」は、ｍＣＡ１を投与後、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植したマウスを示す（図１２Ｃにおいても同様）。エラーバーは、ＳＤを示す。それぞれの群において、６〜７匹のマウスを用いた。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。

【図12C】ＰＢＳ、ｍＣＡ１−ｃｏｎｔｒｏｌ、又はｍＣＡ１を投与したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移入腸炎モデルマウスから得た大腸の組織学的スコアの結果を示すグラフである。図中、縦軸は組織学的スコアを示し、横軸は組織学的スコアの測定に用いたマウスを示す。グラフ中の水平線は、中央値を示す。それぞれの群において、６〜７匹のマウスを用いた。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。

【図12D】ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植４週間後に、大腸における炎症性サイトカインｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。グラフは、５匹のマウスの平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各サイトカインｍＲＮＡの発現量を示す。横軸において、「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻＋ＰＢＳ」は、ＰＢＳを投与後、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻＋ＣＡ１」は、ＣＡ Ｉを投与後、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植したマウスを示す（図１２Ｅ〜図１２Ｇにおいても同様）。図中、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。

【図12E】ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植４週間後にＭＬＮにおける転写因子及び炎症性サイトカインのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。グラフは、５匹のマウスの平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各転写因子ｍＲＮＡ及び各サイトカインｍＲＮＡの発現量を示す。図中、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。

【図12F】大腸をｅｘ ｖｉｖｏで３日間培養した培養上清中に分泌されたＩＬ−６，ＭＣＰ−１，ＴＮＦα、及びＩＬ−１７の濃度をサイトメトリックビーズアレイ法（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸は各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。それぞれの群において、５〜７匹のマウスを用いた。図中、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。

【図12G】ＭＬＮ（１×１０^６細胞）を２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン存在下で７２時間培養した培養上清中に分泌されたＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ−１７の濃度を、サイトメトリックビーズアレイ法（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｔｅｍｓ）で測定した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸は各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。それぞれの群において、５〜７匹のマウスを用いた。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

ＣＡ Ｉは、当業者に周知の遺伝子配列情報（例えば、マウスＣＡ Ｉの遺伝子配列を配列番号１に、ヒトＣＡ Ｉの遺伝子配列を配列番号３に示す）から適宜プライマーを設計し、発現ベクターを作製して、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより得ることができる。または、ＣＡ Ｉは、小麦胚芽リボソームＲＮＡを用いたセルフリータンパク質合成システムに従って調製することができる（Ｍａｄｉｎ Ｋら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：５５９−６４）。
また、ＣＡ ＩとしてＣＡ Ｉの部分ペプチドを使用する場合には、アミノ酸合成に用いられる当業者周知の方法を用いて製造することができる。例えば、ＣＡ Ｉの部分ペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはＢｏｃ法等を用いて化学合成により作製できることができ、または、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。このようなペプチド合成機としては、例えば、ＰＳＳＭ−８（島津製作所）；モデル４３３Ａペプチドシンセサイザ（アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｉｎｃ．））；ＡＣＴ３９６Ａｐｅｘ（アドバンストケムテック社（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｉｎｃ．））等が挙げられる。
ＣＡ Ｉ（その部分ペプチドを含む）への変異の挿入は、部位特異的変異導入法等、当業者周知の方法を用いて行うことができる。

【0020】

本発明の「ＣＡ Ｉを使用することを特徴とする、患者における免疫寛容の誘導方法」は、患者にＣＡ Ｉを直接投与することを含む免疫寛容の誘導方法、及び、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて寛容原性抗原提示細胞をＣＡ Ｉでパルスすることを含む免疫寛容の誘導方法を含む。

【0021】

また、本発明の「ＣＡ Ｉを使用することを特徴とする自己免疫疾患の治療又は予防方法」は、患者にＣＡ Ｉを直接投与することを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法、及び、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法を含む。

【0022】

本発明において、ＣＡ Ｉ又はＣＡ Ｉを有効成分として含有する医薬組成物を患者に直接投与する場合、投与部位としては、経口投与、鼻腔内投与、気道内投与、皮下投与、血管内（静脈内）投与等を挙げることができ、好ましくは経口投与である。また、製剤としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤、粉霧剤等を挙げることができる。また、投与方法は、所望の治療効果又は予防効果が得られる方法であれば特に限定はなく、好ましくは、経口投与する。また、投与は、一時的に行われてもよいし、持続的又は断続的に行われてもよい。例えば、投与頻度として、例えば、単回投与、１週間に１〜４回投与の他、１か月〜３か月毎に１回などの間歇的投与も選択できる。投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。投与量は、例えば、抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞若しくは抗原特異的な制御性Ｔ細胞の産生の程度、又は自己免疫疾患の治療効果若しくは予防効果を指標として決定することができる。例えば、１回の抗原の投与量は、０．０１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、０．１ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであり、更に好ましくは、０．５ｎｇ〜１００μｇ／ｋｇであり、最も好ましくは、１ｎｇ〜１０μｇ／ｋｇである。また、ＣＡ Ｉは、シクロスポリン、タクロリムス等の免疫抑制剤等の他の薬剤と共に投与されてもよく、例えば、ＣＡ Ｉと該他の薬剤は、同時に又は時間をおいて別々に投与されてもよい。

【0023】

前記において、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む免疫寛容の誘導方法は、例えば、以下のステップにより行うことができる：
寛容原性抗原提示細胞を調製するステップ、
ＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、及び、
パルスした寛容原性抗原提示細胞を、免疫寛容を誘導する患者に投与するステップ。

【0024】

好ましくは、本発明のｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む免疫寛容の誘導方法は、例えば、以下のステップにより行うことができる。
患者由来の制御性樹状細胞を調製するステップ、
ＣＡ Ｉで制御性樹状細胞をパルスするステップ、及び、
パルスした制御性樹状細胞を、免疫寛容を誘導する患者に投与するステップ。

【0025】

ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法は、例えば、以下のステップにより行うことができる：
寛容原性抗原提示細胞を調製するステップ、
ＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、及び、
パルスした寛容原性抗原提示細胞を自己免疫疾患の患者に投与するステップ。

【0026】

好ましくは、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法は、以下のステップにより行うことができる：
患者由来の制御性樹状細胞を調製するステップ、
ＣＡ Ｉで制御性樹状細胞をパルスするステップ、及び、
パルスした制御性樹状細胞を自己免疫疾患の患者に投与するステップ。

【0027】

寛容原性抗原提示細胞である制御性樹状細胞は、例えば、患者の骨髄細胞を採取し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、及びヒト形質転換成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）の存在下で８日間培養し、超高純度ＬＰＳの存在下で２４時間刺激することにより調製することができる。または、末梢血を採取し、当業者周知の方法で単核球画分を分離、採取し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、及びヒト形質転換成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）の存在下で８日間培養し、超高純度ＬＰＳの存在下で２４時間刺激することにより調製することができる。また、調製した制御性樹状細胞は、共刺激分子を発現している樹状細胞を除去することにより純度を高めることができる。

【0028】

ＣＡ Ｉによる寛容原性抗原提示細胞のパルスは、ＣＡ Ｉの存在下で寛容原性抗原提示細胞を培養することにより行うことができる。

【0029】

パルスした寛容原性抗原提示細胞の患者への投与は、免疫細胞を利用した細胞治療方法として当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、細胞は、血管内（静脈内）に投与される。また、投与は、一時的に行われてもよいし、持続的又は断続的に行われてもよい。例えば、投与頻度として、好ましくは、単回投与、１週間に１〜４回投与であり、より好ましくは、単回または１週間に１回投与である。また、１か月〜３か月毎に１回などの間歇的投与も選択できる。投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。投与量は、例えば、免疫寛容の程度、患者の血中における抗原特異的な制御性樹状細胞及び／又は制御性Ｔ細胞の数、あるいは自己免疫疾患の治療効果若しくは予防効果を指標として決定することができる。例えば、１回の細胞の投与量は、１×１０^６細胞〜１×１０^１０細胞であり、より好ましくは、１×１０^７細胞〜１×１０^９細胞であり、更に好ましくは、５×１０^７細胞〜５×１０^８細胞であり、最も好ましくは、１×１０^８細胞である。また、パルスした寛容原性抗原提示細胞は、シクロスポリン、タクロリムス等の免疫抑制剤等の他の薬剤と共に投与されてもよく、例えば、ＣＡ Ｉと該他の薬剤は、同時に又は時間をおいて別々に投与されてもよい。

【0030】

また、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む免疫寛容の誘導方法、及び、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法は、更に、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、ＣＡ Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞を誘導するステップを含んでいてもよい。

【0031】

例えば、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む免疫寛容の誘導方法は、以下のステップにより行うことができる：
寛容原性抗原提示細胞及びナイーブＴ細胞を調製するステップ、
ＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、
パルスした寛容原性抗原提示細胞とナイーブＴ細胞を接触させて制御性Ｔ細胞を誘導するステップ、及び、
誘導した制御性Ｔ細胞を、免疫寛容を誘導する患者に投与するステップ。

【0032】

好ましくは、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む免疫寛容の誘導方法は、例えば、以下のステップにより行うことができる：
患者由来の制御性樹状細胞及びナイーブＴ細胞を調製するステップ、
ＣＡ Ｉで制御性樹状細胞をパルスするステップ、
パルスした制御性樹状細胞とナイーブＴ細胞を接触させて制御性Ｔ細胞を誘導するステップ及び、
誘導した制御性Ｔ細胞を、免疫寛容を誘導する患者に投与するステップ。

【0033】

また、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法は、以下のステップにより行うことができる：
寛容原性抗原提示細胞及びナイーブＴ細胞を調製するステップ、
ＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、
パルスした寛容原性抗原提示細胞とナイーブＴ細胞を接触させて制御性Ｔ細胞を誘導するステップ、及び、
誘導した制御性Ｔ細胞を自己免疫疾患の患者に投与するステップ。

【0034】

また、好ましくは、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法は、以下のステップにより行うことができる：
患者由来の制御性樹状細胞及びナイーブＴ細胞を調製するステップ、
ＣＡ Ｉで制御性樹状細胞をパルスするステップ、
パルスした制御性樹状細胞とナイーブＴ細胞を接触させて制御性Ｔ細胞を誘導するステップ、及び、
誘導した制御性Ｔ細胞を自己免疫疾患の患者に投与するステップ。

【0035】

以上において、ナイーブＴ細胞は、末梢血または、脾臓細胞から、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞単離キット及びＡｕｔｏＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社）を用いて、製造者のマニュアルに従って単離することができる。ナイーブＴ細胞の純度は、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）ラベル抗ＣＤ４モノクローナル抗体及びフィコエリトリン（ＰＥ）ラベル抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を用いたＦＡＣＳ分析により確認することができる。

【0036】

パルスした制御性樹状細胞による制御性Ｔ細胞の誘導は、例えば、１ｍＬのＲＰＭＩ培地中、５×１０^６個のナイーブＴ細胞を、５×１０^５個の制御性樹状細胞と共に７日間培養することで得ることができる。

【0037】

誘導した制御性Ｔ細胞の患者への投与は、上記パルスした寛容原性抗原提示細胞の患者への投与と同様に行うことができる。

【0038】

本発明の「自己免疫疾患の治療又は予防において使用するためのＣＡ Ｉを有効成分として含有する医薬組成物」は、免疫寛容を誘導する目的で患者に直接投与されるものであってもよいし、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞を調製するために使用されるものであってもよい。また、抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞を調製するために使用される場合、調製された寛容原性抗原提示細胞又は当該抗原提示細胞により刺激された制御性Ｔ細胞は前記方法に従って患者に投与される。

【0039】

「自己免疫疾患の治療又は予防において使用するためのＣＡ Ｉに特異的な寛容原性抗原提示細胞を有効成分として含有する医薬組成物」は、免疫寛容を誘導する目的で患者に直接投与されるものであってもよいし、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原特異的な制御性Ｔ細胞を調製するために使用されるものであってもよい。ＣＡ Ｉに特異的な寛容原性抗原提示細胞は、前記方法に従って、寛容原性抗原提示細胞を調製し、ＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることにより得ることができる。調製された寛容原性抗原提示細胞又は当該抗原提示細胞により刺激された制御性Ｔ細胞は前記方法に従って患者に投与される。

【0040】

「自己免疫疾患の治療又は予防において使用するためのＣＡ Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬組成物」は、免疫寛容を誘導する目的で患者に直接投与されるものである。ＣＡ Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞は、前記方法に従って、寛容原性抗原提示細胞及びナイーブＴ細胞を採取し、ＣＡ Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスし、パルスした寛容原性抗原提示細胞とナイーブＴ細胞を接触させることにより得ることができる。調製された制御性Ｔ細胞は前記方法に従って患者に投与される。

【0041】

本発明において、ＣＡ Ｉを含有する組成物は、ＣＡ Ｉ以外に、適宜、安定剤等の添加物（例えば、「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」ＡＰｈＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社参照）を含んでいてもよい。また、シクロスポリン、タクロリムス等の免疫抑制剤等の他の薬剤を更に含んでいてもよい。また、本発明において、寛容原性抗原提示細胞又は制御性Ｔ細胞を含有する組成物は、寛容原性抗原提示細胞又は制御性Ｔ細胞以外に、適宜、細胞治療に適した添加材を含有していてもよい。

【0042】

以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本願は日本国特許出願２００９−２４２４９１の優先権を主張して出願されたものであり、当該日本国特許出願２００９−２４２４９１に記載の内容はその全てが参照によりそのまま本願に組み込まれる。

【0043】

（統計解析）
全ての個別の実験において、データは平均値±ＳＤで示した。データは、スチューデントのｔ−テスト又はマンホイットニーのＵテストにより分析した。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意であるとした。統計計算は、ＳｔａｔＶｉｅｗ バージョン５．０統計プログラムを用いて行った。

【0044】

（実施例１）樹状細胞マーカーの検出
（１）マウス
以下の全ての実験において、特定病原体未感染条件下で交配したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス及びＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）メスマウスを使用した（日本クレア株式会社、東京、日本）。全てのマウスは８〜１２週令であり、２２℃、湿度５５％、１２時間昼／夜のリズムで、通常の実験動物飼料を与えて維持管理を行った。全ての動物は、グッドラボラトリープラクティスガイドラインに従って飼育した。本研究は、愛媛大学動物実験委員会の承認を得て行われた。

【0045】

（２）樹状細胞の調製
成熟樹状細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た２×１０^６個の骨髄細胞を２０ｎｇ／ｍＬのマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（和光純薬株式会社、大阪、日本）存在下で８日間培養した後、１μｇ／ｍＬの超高純度ＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）の存在下で２４時間刺激して調製した。
制御性樹状細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た２×１０^６個の骨髄細胞を、２０ｎｇ／ｍＬのマウスＧＭ−ＣＳＦ（和光純薬株式会社）、マウスインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）（和光純薬株式会社）及びヒト形質転換成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）（和光純薬株式会社）の存在下で８日間培養し、１μｇ／ｍＬの超高純度ＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）の存在下で２４時間刺激することにより調製した。制御性樹状細胞は、その後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ラベル抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（クローン３／２３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、抗ＣＤ８０モノクローナル抗体（クローン１６−１０ＡＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、抗ＣＤ８６モノクローナル抗体（クローンＧＬ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて４℃で３０分間染色した。抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュグラッドバッハ、ドイツ）により細胞をラベルした後、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社）を用いて、ＣＤ４０^＋ＣＤ８０^＋ＣＤ８６^＋細胞（調製した全細胞の約２０％）を排除し、共刺激分子を発現している樹状細胞を除去した。

【0046】

（３）樹状細胞マーカーの検出
樹状細胞は、洗浄後、１％ＦＢＳ、０．２％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳに再懸濁させた。精製ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）でＦｃレセプターをブロッキングした後、樹状細胞を、ＦＩＴＣラベル抗ＣＤ１１ｃモノクローナル抗体（クローンＨＬ３、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、抗ＣＤ８０モノクローナル抗体、抗ＣＤ８６モノクローナル抗体、及び抗ＣＤ４０モノクローナル抗体、並びに、ＰＥラベル抗Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅモノクローナル抗体（クローン２Ｇ９、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、及び抗Ｈ−２Ｋ^ｄモノクローナル抗体（クローンＡＭＳ−３２．１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて４℃の暗室で３０分間染色した。アイソタイプ適合のモノクローナル抗体をコントロールとして使用した。蛍光染色は、フローサイトメトリーにより分析した。

【0047】

（４）結果
結果を図１に示す。骨髄由来の成熟樹状細胞は、高レベルのＭＨＣ分子（Ｈ−２ｋｄ及びＩ−Ａ／Ｉ−Ｅ）、ＣＤ１１ｃ、及び共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６）を発現していた。対照的に制御性樹状細胞は、中程度のＭＨＣ分子と非常に低いレベルのＣＤ１１ｃ及び共刺激分子を発現していた。

【0048】

（実施例２）Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体リガンド刺激により発現するサイトカインの比較
実施例１と同様に調整した２×１０^５個の樹状細胞を、１μｇ／ｍＬのポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）、１μｇ／ｍＬの超高純度ＬＰＳ、１μｇ／ｍＬのＲ８４８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）、又はシトシンホスホロチオラートグアニンオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ：配列番号５）の存在下、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２−メルカプトエタノール、ペニシリン、及びストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ−１６４０培地）中、Ｕ底９６穴プレートで２４時間培養した。培養上清中のＩＬ−１０及びＩＬ−６をサイトメトリックビーズアレイキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて、製造者のマニュアルに従って測定した。

【0049】

結果を図２に示す。Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体リガンドで刺激することにより、制御性樹状細胞は、成熟樹状細胞と比較して顕著に低レベルのＩＬ−６を産生し、高レベルのＩＬ−１０を産生していた。

【0050】

（実施例３）Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける樹状細胞によるＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞の誘導
Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞は、様々な免疫反応の調節において中心的な役割を果たしていることが明らかとなってきている（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ＪＤら（２００５）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：３３１−７；Ｖｉｇｎａｌｉ ＤＡら（２００８）Ｎａｔ．Ｒｅｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：５２３−３２；Ｈｏｒｉ Ｓら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９：１０５７−６１）。制御性樹状細胞及び免疫寛容原性樹状細胞は、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞を誘導し、マウス及びヒトにおける寛容誘導において働くことが報告されている（Ｆｕｊｉｔａ Ｓら（２００７）Ｂｌｏｏｄ，１１０：３７９３−８０３；Ｔｏｒｉｓｕ Ｍら（２００８）Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，４３：１００−７；Ｄｕｍｉｔｒｉｕ ＩＥら（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８２：２７９５−８０７）。そこで、制御性樹状細胞がＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞を誘導するか否かを調べた。

【0051】

（１）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の精製
ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞から、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞単離キット及びＡｕｔｏＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社）を用いて、製造者のマニュアルに従って単離した。ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）ラベル抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）及びフィコエリトリン（ＰＥ）ラベル抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（ミルテニーバイオテク社）を用いたＦＡＣＳ分析により純度が９８％以上であることを確認した。

【0052】

（２）Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の誘導
３５×１０ｍｍスタイル細胞培養皿（コーニング社、ホースヘッズ、ニューヨーク、米国）を用いて、１ｍＬのＲＰＭＩ培地中、５×１０^６個のＢＡＬＢ／ｃマウスから単離したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を、５×１０^５個のＢＡＬＢ／ｃマウスから単離した成熟樹状細胞又は制御性樹状細胞と共に７日間培養した。培養後、ＰＥラベル抗Ｆｏｘｐ３モノクローナル抗体（クローンＦＪＫ−１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）ラベル抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（クローンＰＣ６１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、及びＰｅｒＰＣラベル抗ＣＤ４モノクローナル抗体（クローンＲＭ４−５、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて、製造者のマニュアルに従って細胞を染色した。蛍光染色は、ＦｌｏＪｏソフトウェアを用いたフローサイトメトリーにより分析した。

【0053】

（３）結果
結果を図３及び図４に示す。成熟樹状細胞及び制御性樹状細胞のいずれも同数のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を生成させていた。しかし、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞は制御性樹状細胞により誘導されるのに対し、成熟樹状細胞では誘導されなかった。

【0054】

（実施例４）ＣＢＡパルス制御性樹状細胞による大腸炎の治療
制御性樹状細胞の投与が大腸炎に対して治療効果をもたらすか否かを以下の方法により調べた。
（１）ＣＢＡの調製
ＣＢＡは、以前報告された方法（Ｃｏｎｇ Ｙら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：８５５−６４）に従って調製した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させ、盲腸を摘出した。５個の盲腸を開き、１．０ｍｍシリカセファロース（Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｃ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、ソロン、オハイオ州、米国）を含む１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加えた。５分間攪拌後、４℃、５０００ｇで５分間遠心してシリカセファロースと未溶解の細胞を除去した。続いて、上清を４℃、１８，０００ｇで３０分間遠心し、溶解物をポアサイズ０．２μｍのシリンジフィルタに通して滅菌した。溶解物のタンパク質濃度はＤＣプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を用いて測定した。

【0055】

（２）ＣＢＡ又はＫＬＨパルス制御性樹状細胞の調製
実施例１と同様の方法により調製した制御性樹状細胞を５０μｇ／ｍＬのＣＢＡ、又は５０μｇ／ｍＬのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）で２４時間パルスし、それぞれＣＢＡパルス樹状細胞（Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡ）又はＫＬＨパルス樹状細胞（Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＫＬＨ）を生成させた。

【0056】

（３）腸炎モデルの作成及び樹状細胞による治療
腸炎モデルは、以前報告された方法に従って作成した（Ｋｊｅｌｌｅｖ Ｓら（２００６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、６：１３４１−５４）。ＢＡＬＢ／ｃマウスから得たＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を、３×１０^５細胞／０．２ｍＬ／マウスとなるようにＰＢＳで調整し、腹腔内投与によりＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスに移植した。移植日を０日目とした。ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植していないマウスをＣｏｎｔｒｏｌ群とした（ｎ＝６）。０日目にＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞と共に、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た、制御性樹状細胞（ｎ＝７）、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＫＬＨ（ｎ＝６）、又は、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡ（ｎ＝８）を、それぞれ１×１０^６細胞／０．２ｍＬ／マウスとなるようにＰＢＳで調整し、腹腔内投与した。樹状細胞の代わりに０．２ｍＬのＰＢＳを投与したマウスをＰＢＳ群とした（ｎ＝１０）。マウスの体重を毎週測定した。細胞移植の４週間後に安楽死させたマウスから採取した大腸の長さを測定した。

【0057】

（４）大腸炎の組織学的評価
大腸は、細胞移植の４週間後に安楽死させたマウスから採取した。横行結腸を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。組織薄片をＨ＆Ｅ又は過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。組織切片中の炎症の程度は、報告されている方法に従って評価した（Ｋｊｅｌｌｅｖ Ｓら（２００６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、６：１３４１−５４）。組織像は、以下に従ってスコア付けした：１）炎症の重症度：０ 無し；１ 軽度のリンパ球浸潤；２ 中等度のリンパ球浸潤、又は局所の陰窩変性；３ 重度の炎症、又は複数個所の陰窩変性、及び／又はびらん；２）炎症の程度：０ 無し；１ 粘膜；２ 粘膜下層；３ 貫壁性；３）粘液量：０ 通常；１ 微量の粘液減少；２ 中等度の粘液減少、又は局所的な粘液欠如；３ 重度の粘液減少；４ 完全な粘液欠如；及び、４）上皮細胞増殖の程度：０ 無し；１ 細胞数又は陰窩長の穏やかな増加；２ 中等度又は局所の顕著な増加；３ 顕著な増加−切片の全ての部分における。組織学的スコアは、４つの個別のパラメータの総和として計算した。

【0058】

（５）結果
結果を図５及び図６に示す。移植４週間後、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡで治療したマウスの体重が有意に増加していた（Ｐ＜０．０１）（図５Ａ）。移植４週間後の肉眼的所見では、ＰＢＳを投与されたマウスでは大腸壁は厚くかつ大腸の長さは短くなっていた。一方、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して、制御性樹状細胞、又はＲｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与されたマウスにおいては、大腸の長さが有意に長かった（Ｐ＜０．０１）（図５Ｂ、図５Ｃ）。組織学的所見では、大腸炎は重度の上皮の過剰増殖、粘液減少、炎症細胞浸潤、陰窩変性、杯細胞数の減少、及びびらんにより特徴づけられる。樹状細胞を投与されていないＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスでは、重度の上皮の過剰増殖、粘液減少、炎症細胞浸潤、陰窩変性及び杯細胞数の減少が認められ、重症の大腸炎を発症していた。抗原をパルスしていない制御性樹状細胞又はＲｅｇ−ＤＣｓ_ＫＬＨを投与されたマウスにおいても、ＰＢＳを投与されたマウスと類似した大腸の組織学的変化を示していた。対照的に、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡによる治療は、これらの組織的変化は軽度であり、炎症細胞浸潤を顕著に減少させ、杯細胞の減少は軽度であった（図５Ｄ）。
組織学的スコアは、炎症の重症度、炎症細胞浸潤の程度、粘液量、及び上皮増殖の程度に基づき決定した。組織学的スコアは、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与されたマウスにおいて有意に低下していた（図５Ｅ）。制御性樹状細胞で治療したマウスは、中等度の体重減少と軽度の大腸長の短縮を示したが、組織学的所見では、制御性樹状細胞で治療したマウスにおいても中等度から重度の大腸炎を発症していた。

【0059】

（実施例５）腸炎モデルの大腸における炎症性サイトカイン発現
（１）炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現測定
実施例４と同様にして作製したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植した、それぞれ４匹のＲｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡ投与マウス及びＰＢＳ投与マウスの横行結腸をＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（キアゲン社、東京、日本）を用いてホモジナイズした。全ＲＮＡは、ＲＮＡｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｍｉｎｉキット（キアゲン社）により抽出した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社、フォスター市、カリフォルニア州、米国）を使用して、１０μｇのＲＮＡから生成した。腸炎マウスから得た大腸のＩＬ−１０、ＩＬ−６、及びＩＬ−１７ＡのｍＲＮＡの発現を、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現をコントロールとして、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。相対的発現量は以前報告された方法に従って計算した（Ｔｏｋｕｍｏｔｏ Ｙら（２００７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：１１２０−７）。

【0060】

（２）Ｅｘ Ｖｉｖｏ培養大腸の炎症性サイトカイン産生量の測定
横行結腸より１ｃｍ切片を採取し、便を除去し、滅菌されたＰＢＳで３回洗浄した。大腸切片をＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ＦＣＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２−メルカプトエタノール、ペニシリン、及びストレプトマイシン）に加え、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。培養３日後に上清を回収した。培養上清中のＩＬ−１７、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）、サイトメトリックビーズアレイキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて測定した。

【0061】

サイトカインｍＲＮＡ発現解析の結果、Ｒｅｇ−Ｄｃｓ_ＣＢＡを投与されたマウスの大腸において、ＩＬ−６及びＩＬ−１７Ａの発現が減少し、ＩＬ−１０の発現が上昇していた（図６Ａ）。大腸の培養上清を解析したところ、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与したマウスの大腸において、炎症性サイトカインであるＩＬ−１７及びＴＮＦ−αの産生はＰＢＳを投与されたマウスと比べ有意に低かったが（Ｐ＜０．０５）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６及びＩＬ−１０については有意な差は見られなかった（図６Ｂ）。

【0062】

（実施例６）腸炎モデルの腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞における転写因子及び炎症性サイトカイン発現
Ｒｅｇ−Ｄｃｓ_ＣＢＡによる腸炎抑制のメカニズムを解明するため、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞における転写因子及びサイトカインを測定した。
（１）転写因子のｍＲＮＡ発現測定
実施例４と同様にして作製したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植した、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与されたマウス及びＰＢＳを投与されたマウスより採取したＭＬＮをＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（キアゲン社）を用いてホモジナイズした。全ＲＮＡは、ＲＮＡｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｍｉｎｉキット（キアゲン社）により抽出した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を使用して、１０μｇのＲＮＡから生成した。腸炎マウスから採取したＭＬＮのＦｏｘｐ３、及びレチノイン酸関連オーファン受容体ガンマｔ（ＲＯＲγＴ）のｍＲＮＡの発現は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現をコントロールとして、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。相対的発現量は以前報告された方法に従って計算した（Ｔｏｋｕｍｏｔｏ Ｙら（２００７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：１１２０−７）。

【0063】

（２）炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現測定
実施例４と同様にして作製したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植した、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与したマウス及びＰＢＳを投与したマウスから採取したＭＬＮをＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（キアゲン社）を用いてホモジナイズした。全ＲＮＡは、ＲＮＡｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｍｉｎｉキット（キアゲン社）により抽出した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を使用して、１０μｇのＲＮＡから生成させた。大腸炎マウスから採取したＭＬＮのＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＴＧＦ−βのｍＲＮＡの発現は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現をコントロールとして、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。相対的発現量は以前報告された方法に従って計算した（Ｔｏｋｕｍｏｔｏ Ｙら（２００７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：１１２０−７）。

【0064】

（３）ＥＬＩＳＡによる炎症性サイトカイン産生量の測定
実施例４と同様にして作製したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植した、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡ投与したマウス及びＰＢＳを投与したマウスから得た１×１０^６個のＭＬＮ細胞を、２５ｎｇ／ｍＬのホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ）（シグマケミカル社）及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（シグマケミカル社）の存在下、７２時間培養した。培養上清中のＩＬ−６、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、及び単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）をサイトメトリックビーズアレイキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて、製造者のマニュアルに従って測定した。また、上清中のＩＬ−１７をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて測定した。

【0065】

（４）結果
結果を図７に示す。Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与したマウスはＰＢＳを投与したマウスと比較して、ＭＬＮにおけるＦｏｘｐ３の発現が有意に上昇していた（Ｐ＜０．０５）（図７Ａ）。ＲＯＲγＴｍＲＮＡの発現は、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与したマウスにおいて、ＰＢＳを投与したマウスと比較して有意に低下していた（Ｐ＜０．０５）（図７Ａ）。また、ＭＬＮ中のＩＬ−１０及びＴＧＦ−βのｍＲＮＡの発現は、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与したマウスにおいて、ＰＢＳを投与したマウスと比較して有意に高かった（Ｐ＜０．０５）（図７Ｂ）。ＭＬＮにおけるＩＬ−６及びＩＬ−１７Ａの発現は、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡ投与したマウスとＰＢＳ投与したマウスの間で有意な差は見られなかった（図７Ｂ）。しかし、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与したマウスのＭＬＮ細胞のＩＬ−６産生は、ＰＢＳを投与したマウスのＭＬＮ細胞と比較して有意に低かった（図７Ｃ）。更に、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡの投与は、腸炎マウスのＭＬＮからのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＭＣＰ−１の産生を有意に減少させた（Ｐ＜０.０１）（図７Ｃ）。

【0066】

（実施例７）Ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡによるＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞及びＩＬ−１０産生ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の誘導
Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡがｉｎ ｖｉｖｏの末梢において、Ｆｏｘｐ３⁻ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞からＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞及びＩＬ−１０産生ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を誘導することができるかを調べるため以下の方法によりＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞及びＩＬ−１０産生ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の数を測定した。

【0067】

（１）マウス及びＭＬＮの調製
実施例４と同様にして作製したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を移植した、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡ投与マウス及びＰＢＳ投与マウスより、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植から１、３及び５週間後にＭＬＮを採取し、２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（シグマケミカル社）及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（シグマケミカル社）の存在下、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で７２時間培養した。

【0068】

（２）Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞測定
ＭＬＮにおけるＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞の割合を調べるため、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植から１、３及び５週間後にＭＬＮを採取し、２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（シグマケミカル社）及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（シグマケミカル社）の存在下、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中、Ｕ底９６穴プレートで７２時間培養した。その後、ＰＥラベル抗Ｆｏｘｐ３モノクローナル抗体、ＡＰＣラベル抗ＣＤ２５モノクローナル抗体、及びＰｅｒＣＰラベル抗ＣＤ４モノクローナル抗体を用いて、製造者の推奨する方法に従って、培養細胞を染色した。蛍光染色は、フローサイトメトリーにより分析した。

【0069】

（３）ＩＬ−１０産生ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞測定
ＭＬＮにおけるＩＬ−１０産生ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の割合を調べるため、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植から２、４、７及び１４日後にＭＬＮを採取し、２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（シグマケミカル社）及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（シグマケミカル社）の存在下、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中、Ｕ底９６穴プレートで２４時間培養した。最後の３時間はＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を添加した。その後、細胞をＰｅｒＣＰラベル抗ＣＤ４モノクローナル抗体及びＡＰＣラベル抗ＣＤ２５モノクローナル抗体と共に室温、暗室で１５分間静置し、ＦＩＸ＆ＰＥＲＭキット（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）を用いて、固定化し、透過処理した。細胞は、ＰＥラベルラット抗マウスＩＬ−１０モノクローナル抗体（クローンＪＥＳ５−１６Ｅ３、Ｄ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて、室温で２０分間染色した。蛍光染色は、フローサイトメトリーにより分析した。

【0070】

（４）結果
結果を図８に示す。フローサイトメトリーの結果から、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移植から７日後において、ＭＬＮにおけるＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞及びＩＬ−１０産生ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の割合は、ＰＢＳを投与されたマウスと比較してＲｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与されたマウスにおいて有意に高いことが示された。

【0071】

（実施例８）ＣＢＡのプロテオーム解析
（１）ＣＢＡの調製
ＣＢＡは、実施例４に記載の方法に従って調製した。
（２）２Ｄゲル電気泳動及びイメージング
等電点電気泳動前に、ＣＢＡサンプルに対して２−Ｄクリーンアップキット（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）を使用した。得られたペレットを溶解緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、及びＰｌｕｓＯｎｅプロテアーゼインヒビターミックス）に再懸濁させた。膨潤緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、０．５％ ＩＰＧ緩衝液 ｐＨ３−１０、及び１％ＤＴＴ）にサンプルを溶解させ、２０℃で１０時間、ｐＨ３−１０、２４ｃｍのＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）中に膨潤させた。等電点電気泳動は、ＩＰＧｐｈｏｒ ＩＩを用いて、２０℃で、トータルで４５ｋＶｈ行った。その後、ＩＰＧゲルを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００２％ブロモフェノールブルー、０．５％ＤＴＴで１５分間平衡化させた。その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００２％ブロモフェノールブルー、４．５％ヨードアセトアミド含有緩衝液中で１５分間アルキル化させた。その後すぐストリップを１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライし、ＥｔｔａｎＤＡＬＴｓｉｘ電気泳動システム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）中、２Ｗ、３０℃の条件で１６時間泳動した。ゲル染色は、Ｄｅｅｐ Ｐｕｒｐｌｅ Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、一般的なプロトコールに従って行った。染色後、Ｅｔｔａｎ ＤＩＧＥ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いてゲルをスキャンし、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ ２Ｄ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて画像を分析した。スポットはその相対体積を基準として定量した（全てのゲルスポット総体積で割ったスポット体積）。

【0072】

（３）マススペクトル
タンパク質スポットをゲルから切り出し、洗浄後、ブタ由来のトリプシンプロテアーゼによりゲル内で消化した。トリプシンペプチドは、超音波処理により抽出した。ナノＬＣ−ＡｃｃｕＳｐｏｔ（島津製作所、京都、日本）を用いて、ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩのサンプルの調製、並びにμＦＯＣＵＳ ＭＡＬＤＩプレート（島津製作所）上へのスポッティングを行った。タンデム型ＴＯＦ／ＴＯＦマススペクトルは、Ａｘｉｍａ−ＴＯＦ^２マススペクトルメータ（島津製作所）を用いて行った。タンパク質は、ＭＡＳＣＯＴ ＭＳ／ＭＳイオンサーチエンジン（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ロンドン、イギリス）及び国立生物工学情報センタータンパク質データベースを用いて同定した。
（４）結果
結果を図９に示す。３回個別の実験において全て同様の結果が得られた。２Ｄ ＤＩＧＥイメージによるプロテオーム解析の結果から、スポットマップ上に１４個のメインスポットが示された（図９Ａ）。これらのスポットをゲルから切り出し、マススペクトルにかけデータベースで照会した結果を表１に示す。プロテオーム解析の結果、マウスＣＡ ＩがＣＢＡの主要なタンパク質抗原であることが明らかとなった。

【0073】

【表1】

【0074】

（実施例９）大腸におけるＣＡ Ｉ発現
ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を投与していないＳＣＩＤマウス、実施例４に記載の方法に準じてＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞により腸炎を発症したＳＣＩＤマウス、及び、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞及び、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与したＳＣＩＤマウスの大腸におけるＣＡ Ｉ発現を免疫組織化学染色により調べた。
（１）免疫組織化学染色
大腸の５μｍの凍結組織切片をアセトンで固定した。１％過酸化水素を含むメタノールで２０分間処理後、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで１０分間処理することにより内因性ペルオキシダーゼ活性を不活化させた。内因性アビジン／ビオチンブロッキングキット（株式会社ニチレイ、東京、日本）で不活化した切片をウサギ血清（株式会社ニチレイ）で前処理し、１：５０希釈ビオチン化ヤギ抗ヒトＣＡ Ｉ抗体（ロックランド社、フィラデルフィア、ペンシルバニア、米国）の存在下４℃で一晩静置した。その後、切片を西洋ワサビ融合ストレプトアビジン（株式会社ニチレイ）で処理し、シンプルステインＤＡＢ溶液（株式会社ニチレイ）と共に静置した。最後に、切片をヘマトキシリンで対比染色し、乾燥させ、標本とした。

【0075】

（２）結果
結果を図１０に示す。ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞のみ投与されたＳＣＩＤマウスの大腸では、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を投与されていないＳＣＩＤマウス又はＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞及びＲｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与されたＳＣＩＤマウスの大腸と比較して、ＣＡ Ｉ発現が顕著に減少していた。

【0076】

（実施例１０）ＣＡ Ｉパルス制御性樹状細胞による大腸炎治療効果
ＣＡ Ｉでパルスした制御性樹状細胞がＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移入炎症性腸疾患モデルマウスの腸炎を改善するか否かを調べるため、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞投与マウスにＣＡ Ｉでパルスした制御性樹状細胞を投与し、その効果を調べた。
（１）マウスＣＡ Ｉの調製
マウスＣＡ Ｉは、ＬＰＳ混入のリスクが無いため、小麦胚芽リボソームＲＮＡを用いたセルフリータンパク質合成システムに従って調製した（Ｍａｄｉｎ Ｋら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：５５９−６４）。発現プラスミド（ｐＥＵ−ｍＣＡ１−Ｈｉｓ）は、以下の手順に従って調製した。マウスＣＡ１遺伝子は、各０．３μＭの以下のプライマーｍＣＡ１Ｆ及びｍＣＡ１Ｒを用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２キット（東洋紡株式会社、大阪、日本）により増幅させた。
ｍＣＡ１Ｆ：５’−ＡＡＴＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＧ−３’（配列番号６）
ｍＣＡ１Ｒ：５’−ＴＧＣＴＧＧＡＣＴＡＧＴＡＡＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＴＴＣ−３’（配列番号７）
ＣＡ Ｉは、Ｒｏｂｏｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（登録商標） ＤＴ（株式会社セルフリーサイエンス、松山、日本）を用いて、製造者のプロトコールに従って以前報告されている通りに合成した（Ｓａｗａｓａｋｉ Ｔら（２００２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５１４：１０２−５）。合成したＨｉｓ融合ＣＡ Ｉは、Ｎｉセファロースハイパフォーマンス（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて精製した。ＡｃＴＥＶ（登録商標）プロテアーゼ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて融合タンパク質からＨｉｓタグを除去し、Ｍｉｎｉ Ｄｉａｌｙｓｉｓキット（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いてＰＢＳに対して透析した。
また、ＣＡ Ｉの遺伝子配列を組み込んでいないｅｍｐｔｙ ｐｌａｓｍｉｄを用いて上記ＣＡ Ｉの調製と同様にセルフリータンパク質合成システムに従って作成したものをＣＡ Ｉ−ｃｏｎｔｒｏｌとした。

【0077】

（２）制御性樹状細胞の調製とパルス
制御性樹状細胞は、実施例１に記載の方法に準じて調製した。調製した制御性樹状細胞を６μｇ／ｍＬのＣＡ Ｉ又はＣＡ Ｉ−ｃｏｎｔｒｏｌで２４時間パルスし、それぞれ、ＣＡ Ｉパルス制御性樹状細胞（Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡ１）又はＣＡ Ｉ−ｃｏｎｔｒｏｌパルス制御性樹状細胞（Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡ１−ｃｏｎｔｒｏｌ}）を生成した。

【0078】

（３）腸炎モデルの作成及び樹状細胞による治療
腸炎モデルは、実施例４に記載の方法に従って作成した。ＢＡＬＢ／ｃマウスから得たＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を、３×１０^５細胞／マウス腹腔内投与しＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスに移植した。移植日を０日目とした。ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を投与されていないＣ．Ｂ−１７マウスをＣｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝５）とした。０日目にＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞と共に、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡ（ｎ＝７）、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡ１−ｃｏｎｔｒｏｌ}（ｎ＝８）、又はＲｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡ１（ｎ＝１０）を、それぞれ１×１０^６細胞／マウスとなるように、腹腔内投与した。樹状細胞の代わりにＰＢＳを投与したマウスをＰＢＳ群（ｎ＝１３）とした。マウスの体重を毎週測定した。細胞移植の４週間後に安楽死させたマウスから採取した大腸の長さを測定した。

【0079】

（４）大腸炎の組織学的評価
大腸は、細胞移植の４週間後に安楽死させたマウスから採取した。横行結腸を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。組織薄片をＨ＆Ｅ又はＰＡＳで染色した。組織切片中の炎症の程度は、実施例４に記載の方法に従って評価した。

【0080】

（５）大腸における炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現測定
大腸のＩＬ−１７、ＩＬ−１０、及びＴＧＦ−βのｍＲＮＡの発現を、実施例５に記載の方法に従って測定した。

【0081】

（６）ＭＬＮにおける転写因子及び炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現
ＭＬＮのＩＬ−１７、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、Ｆｏｘｐ３、及びＲＯＲγＴのｍＲＮＡの発現は実施例６に記載の方法に従って測定した。

【0082】

（７）Ｅｘ Ｖｉｖｏ培養大腸の炎症性サイトカイン産生量の測定
大腸培養上清中のＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γは、実施例５に記載の方法に従って測定した。

【0083】

（８）ＭＬＮ細胞の炎症性サイトカイン産生量の測定
ＭＬＮ細胞の培養上清中のＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、及びＭＣＰ−１は、実施例６に記載の方法に従って測定した。

【0084】

（９）結果を図１１に示す。移植の４週間後、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡ１を投与されたマウスの体重は、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して有意に増加していた（Ｐ＝０．００６）（図１１Ａ）。移植４週間後の肉眼的所見では、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡ１を投与されたマウスの大腸長は有意に長かった（Ｐ＜０．０００１）（図１１Ｂ）。組織学的スコアでは、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡ１を投与されたマウスでは、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して有意に低いスコアを示した（図１１Ｃ）。
ｍＲＮＡ発現測定の結果、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡ１を投与されたマウスの大腸及びＭＬＮにおいて、ＩＬ−１７Ａの発現は減少しており、一方でＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの発現は上昇していた（Ｐ＜０．０５）（図１１Ｄ、図１１Ｅ）。また、ＭＬＮにおいて、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡ１を投与されたマウスは、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して、Ｆｏｘｐ３の発現が有意に上昇していた（Ｐ＜０．０５）（図１１Ｅ）。ＲＯＲγＴｍＲＮＡの発現は、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡ１を投与されたマウスにおいて、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して低下していた（Ｐ＜０．０５）（図１１Ｅ）。
大腸の培養上清を解析したところ、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡ１を投与されたマウスの大腸において、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生がＰＢＳを投与されたマウスと比べて有意に低かった（Ｐ＜０．０５）（図１１Ｆ）。また、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡ１を投与することで、腸炎マウスのＭＬＮ細胞のＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、及びＭＣＰ−１の産生は顕著に減少した（Ｐ＜０.０１）（図１１Ｇ）。

【0085】

（実施例１１）
（１）マウスＣＡ Ｉの調製
マウスＣＡ ＩのｃＤＮＡ（以下、ｍＣＡ１という）を以下のプライマーを用いて増幅させた。
フォワード：ＡＴＧＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＧＧＧＡ（配列番号８）
リバース ：ＣＣＴＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧ（配列番号９）
増幅させたＤＮＡは、ＰｓｈＡＩ及びＢａｍＨＩサイトでプラスミドｐＥＴ４５ｂ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ社，ダルムシュタット，ドイツ）に挿入し、Ｎ末端に６個のＨｉｓからなるタグを有するｍＣＡ１を発現するｐＥＴ−ｍＣＡ１−Ｈｉｓ６コンストラクトを構築した。構築したコンストラクトは、サイクルシークエンス法により確認した。Ｈｉｓ−ＣＡ１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、金属（Ｎｉ２＋）アフィニティクロマトグラフィにより精製後、ＰＢＳ中で透析することによりイミダゾールを除去した。ＥｎｄＴｒａｐ（登録商標）ｒｅｄカラム（Ｈｙｇｌｏｓ ＧｍｂＨ、レーゲンスブルク、ドイツ）を用いてエンドトキシンを除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ゲルをＤｅｅｐ Ｐｕｒｐｌｅ Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で染色した。ゲルイメージをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析し、タンパク質の純度を計算した。空のプラスミドｐＥＴ４５ｂを用いてｍＣＡ１と同様に調節したコントロールタンパク質をＣＡＩ−ｃｏｎｔｒｏｌとした。

【0086】

（２）抗原及び投与レジメン
ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移入腸炎モデルにおいて、ｍＣＡ１の経口投与が腸炎を改善するか否かを評価するため、過去の報告（Ｆａｒｉａ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ ２００３：２０：１３５−４５）に従い、Ｃ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤマウス（日本クレア株式会社）に飲料水として０．６％ｍＣＡ１溶液を５日間（第−７日目から第−２日目まで）連日投与した。個別にケージに入れたマウスは、４．５±０．５ｍＬ／日のｍＣＡ１溶液を摂取し、一群のマウスの平均消費量は５．０±０．５ｍＬ／日であった。一日当りのｍＣＡ１投与量の合計は、平均消費量（５ｍＬ/日）を基礎として計算した。ＰＢＳ中のｍＣＡ１を含むボトルはコンタミネーションを避けるため一日に二回交換した。連続的摂取は５日間継続した。コントロール群はＰＢＳ、又は、ＣＡＩ−ｃｏｎｔｒｏｌを５日間投与した。ｍＣＡ１経口投与７日後（第０日目）に、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞（３×１０^５細胞／マウス）をSCIDマウスに腹腔内投与した。

【0087】

（３）評価
マウスの体重測定、マウスから採取した大腸の長さの測定、大腸炎の組織学的評価、大腸における炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現測定、ＭＬＮにおける転写因子及び炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現、Ｅｘ Ｖｉｖｏで培養した大腸の炎症性サイトカイン産生量の測定、並びに、ＭＬＮ細胞の炎症性サイトカイン産生量の測定を、実施例１０と同様に行った。

【0088】

（４）結果
ＣＡ Ｉの経口投与はＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移入炎症性腸疾患モデルマウスの腸炎を改善した。移植の４週間後、ｍＣＡ１を投与したマウスの体重は、ＰＢＳを投与したマウスと比較して有意に増加していた（Ｐ＜０．０５）（図１２Ａ）。また、移植の４週間後の肉眼的観察において、ＰＢＳを投与したマウスと比較して、ｍＣＡ１を投与したマウスの大腸長は有意に長かった（Ｐ＜０．００１）（図１２Ｂ）。組織学的スコアでは、ｍＣＡ１を投与したマウスは、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して有意に低いスコアを示した（Ｐ＜０．０５）（図１２Ｃ）。
また、炎症性腸疾患モデルマウスの大腸におけるＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現は、ＰＢＳを投与したマウスと比較して、ｍＣＡ１を投与したマウスにおいて有意に上昇していた（Ｐ＜０．０５）（図１２Ｄ）。ＭＬＮにおけるＩＬ−１７及びＲＯＲγＴｍＲＮＡの発現は、ＰＢＳを投与したマウスと比較して、ｍＣＡ１を投与したマウスにおいて、有意に低下していた（Ｐ＜０．０５）（図１２Ｅ）。
ＰＢＳ又はｍＣＡ１を投与した炎症性腸疾患モデルマウスから採取した大腸切片及びＭＬＮからのサイトカイン産生を測定した結果、大腸におけるＩＬ−６とＭＣＰ−１の産生は、ＰＢＳで処理したマウスと比較して、ｍＣＡ１を投与したマウスにおいて有意に低下していた（Ｐ＜０．０５）（図１２Ｆ）。加えて、ｍＣＡ１経口投与は、ＭＬＮによるＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＭＣＰ−１、及びＴＮＦαの産生を著しく低下させ、ＩＦＮγの産生を上昇させた（Ｐ＜０．０５）（図１２Ｇ）。

【0089】

以上の結果から、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞がＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移入腸炎の進行を抑制すること、ＣＢＡの主要な抗原であるＣＡ Ｉが制御性樹状細胞による大腸炎発症抑制に重要な役割を果たすこと、ＣＡ Ｉでパルスした制御性樹状細胞が、ＭＬＮにおいて、Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を誘導し、Ｔ−ヘルパー１７細胞を減少させること、及び、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞がｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞及びＩＬ−１０産生ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を誘導することが示された。また、本実験の結果はＲｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡによる治療が、腸炎の臨床的及び病理組織学的な重症度を改善させることを示している。また、ＫＬＨではなくＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞のみが腸炎を抑制した。更に、ＣＢＡの主要タンパク質がＣＡ Ｉであることが示された。これらの結果から、制御性樹状細胞は、抗原特異的に腸炎を抑制しており、ＣＢＡ及びその主要抗原であるＣＡ Ｉが炎症性腸疾患の主要な標的であることが示された。また、本実験において、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移入腸炎で顕著に減少したＣＡ Ｉの発現は、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＢＡを投与することにより維持された。また、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡ１は、このマウスの腸炎モデルにおいて腸炎抑制効果を示した。これらの結果から、ＣＡ Ｉが炎症性腸疾患における特異的な抗原であることが示された。更に、本実験において、ＣＡ Ｉの経口投与は、前記の炎症性腸疾患モデルマウスにおいて腸炎抑制効果を示した。これらの結果から、ＣＡ Ｉが炎症性腸疾患における特異的な抗原であることが示された。
これらの結果から、ＣＡ Ｉでパルスした制御性樹状細胞はＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞及びＴｈ１７細胞のバランスをコントロールすることで、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移入腸炎の進展を抑制することが明らかとなった。ＣＡ Ｉでパルスした制御性樹状細胞による細胞療法が炎症性腸疾患に対して新しい治療法となることが示唆された。また、ＣＡ Ｉが炎症性腸疾患の治療薬又は予防薬となることが示唆された。

【図2】

【図4】

【図6】

【図7】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図12F】

【図12G】

【図1】

【図3】

【図5】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]