特許 5954877 負荷率の改善が可能な抗癌剤送達ビヒクル

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5954877

(24)【登録日】2016年6月24日

(45)【発行日】2016年7月20日

(54)【発明の名称】負荷率の改善が可能な抗癌剤送達ビヒクル

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/353 20060101AFI20160707BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20160707BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160707BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20160707BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160707BHJP

   A61K 31/336 20060101ALI20160707BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20160707BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20160707BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160707BHJP

   A61K 33/24 20060101ALI20160707BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20160707BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/353

   A61K47/48

   A61P35/00

   A61K45/00

   A61K39/395

   A61K31/336

   A61K31/704

   A61K31/7105

   A61K48/00

   A61K33/24

   A61K31/337

【請求項の数】19

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2012-557010(P2012-557010)

(86)(22)【出願日】2011年3月11日

(65)【公表番号】特表2013-522189(P2013-522189A)

(43)【公表日】2013年6月13日

(86)【国際出願番号】SG2011000100

(87)【国際公開番号】WO2011112156

(87)【国際公開日】20110915

【審査請求日】2014年3月10日

(31)【優先権主張番号】61/312,885

(32)【優先日】2010年3月11日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】503231882

【氏名又は名称】エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100148596

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 和弘

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(74)【代理人】

【識別番号】100165526

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 寛

(72)【発明者】

【氏名】栗沢 元一

(72)【発明者】

【氏名】リャン， クン

(72)【発明者】

【氏名】タン， スシ

(72)【発明者】

【氏名】チャン， ジュ ウ

(72)【発明者】

【氏名】イン， ジャッキー ワイ．

【審査官】 山中 隆幸

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０５４８１３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／１２４０００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５３４３０９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／４８

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つのフラボノイドと、前記フラボノイドと反応しコンジュゲートを形成するための遊離官能基を有するポリマーを含有する送達剤のコンジュゲートであって、
前記官能基が、遊離アミン基若しくはアミン基への転換が可能な官能基、又は、遊離スクシンイミド基若しくはスクシンイミド基への転換が可能な官能基であり、
前記フラボノイドが、コンジュゲーションの前に単量体形態又は二量体形態で存在し、コンジュゲーションの後に前記単量体形態又は二量体形態を維持する、コンジュゲート。

【請求項2】

２つのフラボノイドを含み、第１のフラボノイドが、第２のフラボノイドとの会合を受けない、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項3】

フラボノイドが、カテキンベースのフラボノイドである、請求項１又は２に記載のコンジュゲート。

【請求項4】

フラボノイドが、（−）−エピカテキン、（−）−エピガロカテキン、（＋）−カテキン、（−）−没食子酸エピカテキン、又は（−）−没食子酸エピガロカテキンである、請求項３に記載のコンジュゲート。

【請求項5】

フラボノイドが、（−）−没食子酸エピガロカテキンである、請求項４に記載のコンジュゲート。

【請求項6】

ポリマーが、シクロトリホスファゼンコアフェノキシメチル（メチルヒドラゾノ）デンドリマー、チオホスホリルコアフェノキシメチル（メチルヒドラゾノ）デンドリマー、アミン末端ポリ（エチレングリコール）、又はスクシンイミド末端ポリ（エチレングリコール）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項7】

送達剤が、フラボノイドのＡ環のＣ６位及び／又はＣ８位においてコンジュゲートされている、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項8】

ポリエチレングリコール及び（−）−没食子酸エピガロカテキン（ＰＥＧ−ＥＧＣＧ）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項9】

遊離官能基を有するポリマーを含有する送達剤を、少なくとも１つのフラボノイドにコンジュゲートする方法であって、前記方法が、前記遊離官能基を有するポリマーを前記フラボノイドと反応させるステップを含み、
前記官能基が、遊離アミン基若しくはアミン基への転換が可能な官能基、又は、遊離スクシンイミド基若しくはスクシンイミド基への転換が可能な官能基であり、
前記フラボノイドが、コンジュゲーションの前に単量体形態又は二量体形態で存在し、コンジュゲーションの後に前記単量体形態又は二量体形態を維持する、方法。

【請求項10】

送達剤を２つのフラボノイドと反応させるステップを含み、第１のフラボノイドが、第２のフラボノイドとの会合を受けない、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

フラボノイドが、カテキンベースのフラボノイドである、請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項12】

フラボノイドが、（−）−エピカテキン、（−）−エピガロカテキン、（＋）−カテキン、（−）−没食子酸エピカテキン、又は（−）−没食子酸エピガロカテキンである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

フラボノイドが、（−）−没食子酸エピガロカテキンである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

ポリマーが、シクロトリホスファゼンコアフェノキシメチル（メチルヒドラゾノ）デンドリマー、チオホスホリルコアフェノキシメチル（メチルヒドラゾノ）デンドリマー、アミン末端ポリ（エチレングリコール）、又はスクシンイミド末端ポリ（エチレングリコール）である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

送達剤が、フラボノイドのＡ環のＣ６位及び／又はＣ８位においてコンジュゲートされている、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

フラボノイドが（−）−没食子酸エピガロカテキンであり、ポリマーがポリ（エチレングリコール）である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

抗癌剤送達ビヒクルを形成する方法であって、遊離官能基を有するポリマーを少なくとも１つのフラボノイドにコンジュゲートするステップを含み、
前記官能基が、遊離アミン基若しくはアミン基への転換が可能な官能基、又は、遊離スクシンイミド基若しくはスクシンイミド基への転換が可能な官能基であり、
前記フラボノイドが、コンジュゲーションの前に単量体形態又は二量体形態で存在し、コンジュゲーションの後に前記単量体形態又は二量体形態を維持する、方法。

【請求項18】

抗癌剤送達ビヒクルに抗癌剤を負荷するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

抗癌剤が、疎水性相互作用及び／又はΠ−Πスタッキング相互作用を介して抗癌剤送達ビヒクルに負荷される、請求項１７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の分野】

【0001】

本発明は一般に、負荷率の改善が可能な抗癌剤送達ビヒクルに関する。

【発明の背景】

【0002】

本発明の背景についての以下の議論は、本発明の理解を容易にすることを意図する。しかし、この議論は、言及されるいかなる材料も、本出願の優先日に、任意の管轄内で公刊されていたか、知られていたか、又は一般的な共通の知識の一部であったことの承認又は容認ではないことを理解されたい。

【0003】

新規の薬物送達系の設計及び開発において、例えば、ポリマーミセルは、腫瘍組織を標的とする抗癌薬の薬物送達ビヒクルとして用いられるそれらの潜在的可能性のために、大きな注目を集めてきた。略述すると、ミセルとは、液体のコロイド中に分散させた両親媒性分子又は界面活性分子の凝集物である。両親媒性／界面活性分子の各々は、親水性の「ヘッド」端部及び疎水性の「テール」端部を有する。ミセルのテールは、炭化水素基を包含することが可能であり、ミセルのヘッドは、荷電基（アニオン性基又はカチオン性基）又は極性基を包含しうる。水性の液体など、極性溶媒では典型的に、親水性のヘッド端部が外側に延びて周囲の溶媒と接触し、ミセルの中心部に疎水性のテール端部を封鎖し、これにより、疎水性のコアを形成する、通常のミセルをミセル分子の凝集物が形成する。水性の環境では一般に、両親媒性のブロックコポリマーがセルフアセンブリーすることから、ポリマーミセルが形成される。ポリマーミセルは、腫瘍血管の漏出性から結果として生じる血管透過性滞留性亢進（ＥＰＲ）効果のために、腫瘍部位における抗癌薬の蓄積の増強（すなわち、薬物負荷率の増強）が可能となることが知られている（Ｈ．Ｍａｅｄａ、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．２００１、４１、１８９〜２０７）。加えて、ミセルの外側の親水性殻は、タンパク質の付着を防止し、細網内皮系（ＲＥＳ）によるミセルの取り込みを低減し、これにより、体内でのミセルの血中循環を延長する（Ａ．Ｌａｖａｓａｎｉｆａｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００２、５４、１６９〜１９０）。

【0004】

過去２０年間にわたり、多くの研究グループが、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」と略記する）と疎水性ポリマーとの両親媒性ブロックコポリマー、例えば、ポリ（α，β−アスパラギン酸）ブロックコポリマー（「ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）」と略記する）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）ブロックコポリマー（「ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）」と略記する）、及びポリ（Ｌ−リシン）−スクシナートなどを含むポリマーミセルを開発してきた（Ｎ．Ｎｉｓｈｉｙａｍａら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９９、１５、３７７〜３８３、Ｎ．Ｎｉｓｈｉｙａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００３、１４、４４９〜４５７、及びＡ．Ａ．Ｂｏｇｄａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９６、７、１４４〜１４９）。ドキソルビシン、シスプラチン、及びタンパク質などの抗癌薬をミセルコア内に封入する異なる方法が開発されている（Ｈ．Ｍ．Ａｌｉａｂａｄｉ、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２００６、３、１３９〜１６２）。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏにおける研究は、ポリマーミセル内に封入された薬物が、遊離薬物自体より効果的に腫瘍組織内に蓄積されるため、これらのミセルが、より高度な抗腫瘍有効性を有することを裏付けている（Ｎ．Ｎｉｓｈｉｙａｍａ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３、６３、８９７７〜８９８３）。しかし、これらのポリマーミセル系において一般的な１つの問題は、このようなミセルにおける薬物負荷率が、しばしば、極めて低いことである。言い換えれば、薬物だけでポリマーミセルを占める重量比率は低い。

【0005】

上記の議論は、ポリマーミセルに重点を置いているが、マトリックスによる送達系及び薬物標的化系など、他の薬物送達系もまた、有効な薬物送達には薬物負荷率が低いという類似の問題に直面している。

【0006】

したがって、上述の問題のうちの１つを克服するか、又は少なくとも軽減する抗癌剤送達ビヒクルを提供することが望ましい。

【発明の概要】

【0007】

本文書の全体において、逆のことが別段に示されるのでない限り、「含む」、「からなる」などの用語は、非網羅的であるものとして、又は言い換えれば、「が含まれるがこれらに限定されない」を意味するものとしてみなされるべきである。

【0008】

本発明の第１の態様によれば、化学的部分と少なくとも１つのフラボノイドとを含有する送達剤のコンジュゲートであって、前記フラボノイドが、コンジュゲーションの前に単量体形態又は二量体形態で存在し、コンジュゲーションの後に単量体形態又は二量体形態を維持するコンジュゲートが提供される。

【0009】

コンジュゲートは、２つ以上のフラボノイドを含み、各々のフラボノイドが、他のフラボノイドとの会合を受けないことが有利である。言い換えれば、フラボノイドは、互いに対して化学的に不活性であり、コンジュゲーション時にオリゴマーを形成しない。フラボノイドは、同一の場合もあり、異なる場合もある。

【0010】

フラボノイドは、カテキンベースのフラボノイドであるであることが好ましい。フラボノイドは、（−）−エピカテキン、（−）−エピガロカテキン、（＋）−カテキン、（−）−没食子酸エピカテキン、又は（−）−没食子酸エピガロカテキンであるであることがより好ましい。フラボノイドは、（−）−没食子酸エピガロカテキンであることがより好ましい。フラボノイドは、カルボキシル末端基、アミン末端基、スクシンイミド末端基、又は化学的部分とのコンジュゲート形成に適する他の任意の基を含有しうる。

【0011】

化学的部分は、ポリマーであることが好ましい。化学的部分は、遊離アルデヒド基又はアルデヒド基への転換が可能な官能基を有するポリマー、遊離カルボキシル基又はカルボキシル基への転換が可能な官能基を有するポリマー、遊離アミン基又はアミン基への転換が可能な官能基を有するポリマー、遊離スクシンイミド基又はスクシンイミド基への転換が可能な官能基を有するポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択される化学的部分でありうる。ポリマーは、アルデヒド末端ポリ（エチレングリコール）、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタールコンジュゲート、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸−チラミン、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタールコンジュゲート−チラミン、シクロトリホスファゼンコアフェノキシメチル（メチルヒドラゾノ）デンドリマー、チオホスホリルコアフェノキシメチル（メチルヒドラゾノ）デンドリマー、カルボキシル末端ポリ（エチレングリコール）、アミン末端ポリ（エチレングリコール）、又はスクシンイミド末端ポリ（エチレングリコール）であることがより好ましい。ポリマーは、アルデヒド末端ポリ（エチレングリコール）であることがより好ましい。

【0012】

送達剤は、フラボノイドのＡ環のＣ６位及び／又はＣ８位においてコンジュゲートされていることが好ましい。Ｃ６位及びＣ８位が最も好ましいが、フラボノイドの他のコンジュゲーション位置（例えば、他の環における）もまた可能であることは、当業者に明らかであろう。

【0013】

本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様のコンジュゲートを含む送達ビヒクルが提供される。

【0014】

本発明の第３の態様によれば、抗癌剤と本発明の第１の態様のコンジュゲートとを含む抗癌剤送達ビヒクルが提供される。

【0015】

一実施形態では、抗癌剤が、タンパク質、核酸、低分子、薬物、ペプチド、抗体、ホルモン、酵素、増殖因子、サイトカイン、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、抗生物質、化学療法剤、又は血管新生阻害剤でありうる。

【0016】

別の実施形態では、抗癌剤が、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ＴＮＰ４７０、ドキソルビシン、シスプラチン、パクリタキセル、ダウノルビシン、又はこれらの混合物でありうる。

【0017】

本発明の第４の態様によれば、本発明の第３の態様の抗癌剤送達ビヒクルを含む医薬組成物が提供される。

【0018】

上記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことが有利である。

【0019】

本発明の第５の態様によれば、抗癌剤を、例えば、対象における細胞に送達するための、本発明の第３の態様の抗癌剤送達ビヒクルの使用が提供される。

【0020】

対象は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物でありうる。一実施形態では、対象がヒトである。

【0021】

別の実施形態では、抗癌剤送達ビヒクルが、注射、手術による植込み、又は局所投与のために製剤される。

【0022】

本発明の第６の態様によれば、化学的部分を含有する送達剤を、少なくとも１つのフラボノイドにコンジュゲートする方法であって、方法が、送達剤をフラボノイドと反応させるステップを含み、フラボノイドが、コンジュゲーションの前に単量体形態又は二量体形態で存在し、コンジュゲーションの後に単量体形態又は二量体形態を維持する、方法が提供される。

【0023】

本発明の第７の態様によれば、抗癌剤を細胞に送達する方法が提供される。

【0024】

一実施形態では、細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏである。

【0025】

別の実施形態では、細胞がｉｎ ｖｉｖｏであり、方法が、抗癌剤送達ビヒクルを、抗癌治療を必要とする対象に投与するステップを含む。

【0026】

対象は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物でありうる。一実施形態では、対象がヒトである。

【0027】

好ましくは、抗癌剤送達ビヒクルを投与するステップが、注射するサブステップ、手術により植え込むサブステップ、又は局所適用するサブステップを含む。

【0028】

以下の図面では、例示のみを目的として本発明の実施形態がスキームされる。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】ドキソルビシンを負荷したエチレングリコール／（−）−没食子酸エピガロカテキン（ＰＥＧ−ＥＧＣＧ）コンジュゲートのセルフアセンブリーを例示するスキームである。

【図2】ＰＥＧ−ＥＧＣＧの初期濃度を変化させるときの、ドキソルビシンを負荷したＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートの形成を示す図である。各ボトル試料の下方における数字は、ｍｇ／ｍｌ単位によるＰＥＧ−ＥＧＣＧの初期濃度を表す。

【図3】（ａ）ＰＥＧ及び（ｂ）ＰＥＧ−ＥＧＣＧそれぞれのエレクトロスプレーイオン化飛行時間質量分析スペクトルを示す図である。

【図4】シスプラチン及び／又はハーセプチンを負荷したＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートのセルフアセンブリーを示すスキームである

【図5】ハーセプチンを負荷したＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートを伴う、無胸腺Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ（ｎ−６）に対する、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＨＥＲ２を過剰発現させたヒト乳癌細胞（ＢＴ−４７４細胞）異種移植片を示す図である。

【図6】ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした２４時間後において、核染色であるＤＡＰＩ（青色）で対比染色した、Ｃｙ３で標識した陰性対照ｓｉＲＮＡ（赤色）についての共焦点顕微鏡法画像である。ｓｉＲＮＡ濃度は、５０ｎＭとした。重ね合せ画像は、ｓｉＲＮＡが局在化したのは細胞質中に限られ、核内には局在化しなかったことを示す。（Ａ）ＰＥＧ−ＥＧＣＧなし、（Ｂ）１．５μｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＥＧＣＧ、（Ｃ）３．０μｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＥＧＣＧ、（Ｄ）６．０μｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＥＧＣＧ、及び（Ｅ）ＰＥＧ単独。

【図7】ＰＥＧ−ＥＧＣＧを用いる、ｐＧＬ３ ＤＮＡトランスフェクト細胞への、２００ｎＭのｓｉＲＮＡの送達を示す図である。ホタルルシフェラーゼ活性対レニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性の比は、ｐＧＬ３ ＤＮＡだけをトランスフェクトした細胞集団に対して標準化した。対照は、ｓｉＲＮＡ単独で治療したｐＧＬ３ ＤＮＡトランスフェクト細胞を指す。ｓｉＰＯＲＴ（商標）とは、陽性対照として用いた、ポリアミンベースのトランスフェクション剤である。ルシフェラーゼ活性は、培地を交換せずに、トランスフェクションの４８時間後に測定した。データは、３回の実験の平均である。Ｓ．Ｄ．を示す。

【図8】ＧＦＰ−２２ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした４８時間後における、ＧＦＰの下方制御についての蛍光観察を示す図である。右側の顕微鏡画像は、左側の対照の顕微鏡画像と比較した、ＧＦＰの下方制御を示す。ｓｉＰＯＲＴ（商標）とは、陽性対照として用いた、ポリアミンベースのトランスフェクション剤である。（Ａ）ｓｉＲＮＡのトランスフェクションなし、（Ｂ）ｓｉＰＯＲＴ（商標）＋ＧＦＰ−２２ ｓｉＲＮＡ、（Ｃ）ＰＥＧ−ＥＧＣＧ＋対照ｓｉＲＮＡ、（Ｄ）ＰＥＧ−ＥＧＣＧ＋ＧＦＰ−２２ ｓｉＲＮＡ。図８Ｅ及びＦは、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした４８時間後における細胞のフローサイトメトリー解析を示す。１０００〜１２００回の細胞イベントをカウントした。（Ｅ）ＰＥＧ−ＥＧＣＧ＋対照ｓｉＲＮＡ、（Ｆ）ＰＥＧ−ＥＧＣＧ＋ＧＦＰ−２２ ｓｉＲＮＡ。

【詳細な説明】

【0030】

本発明は一般に、薬物負荷率の改善が可能な抗癌剤送達ビヒクルに関する。

【0031】

本発明者らは、以前の試みにおいて、抗癌剤送達ビヒクル及び送達法を開発した。国際公開第２００６／１２４０００号では、遊離アルデヒドと、フラボノイドと、を含有する送達剤のコンジュゲートであって、送達剤が、フラボノイドのＡ環のＣ６位及び／又はＣ８位においてコンジュゲートされているコンジュゲートを提供した。国際公開第２００９／０５４８１３号パンフレットでは、抗癌剤と、遊離アルデヒド及びフラボノイドを含有する送達剤のコンジュゲートとを含む送達ビヒクルであって、送達剤が、フラボノイドのＡ環のＣ６位及び／又はＣ８位においてコンジュゲートされている送達ビヒクルを提供した。国際公開第２００６／１２４０００号及び国際公開第２００９／０５４８１３号のいずれの内容も、参照により本明細書に組み込まれている。

【0032】

驚くべきことに、本発明者らは、化学的部分及び少なくとも１つのフラボノイドを含有する送達ビヒクルと、生体活性の抗癌剤との組合せが、単剤で用いられた場合の送達ビヒクル及び生体活性の抗癌剤の各々を組み合わせた効果を上回る相乗作用的抗癌効果を及ぼすことを見出した。したがって、抗癌剤を負荷したこのような送達ビヒクルは、送達ビヒクルのフラボノイド部分の抗癌活性と、抗癌剤の抗癌効果との相乗効果を利用して抗癌剤を細胞に送達する効果的な方法を提供する。相乗効果、及び、したがって、抗癌剤の負荷率の増大は、化学的部分とのコンジュゲーション後においても元の単量体形態又は二量体形態を維持するフラボノイドによると考えられる。

【0033】

本発明の一態様によれば、化学的部分と少なくとも１つのフラボノイドとを含有する送達剤のコンジュゲートであって、フラボノイドが、コンジュゲーションの前に単量体形態又は二量体形態で存在し、コンジュゲーションの後に単量体形態又は二量体形態を維持して、フラボノイドと、抗癌薬などの他の化学的実体との疎水性相互作用及び／又はΠ−Πスタッキング相互作用を可能とし、形成される単量体又は二量体のコンジュゲートによる薬物負荷率の増大を可能とするコンジュゲートが提供される。

【0034】

コンジュゲートは、２つ以上のフラボノイドを含み、各々のフラボノイドが、他のフラボノイドとの会合を受けないことが有利である。言い換えれば、フラボノイドは、互いに対して化学的に不活性であり、コンジュゲーション時にオリゴマーを形成しない。フラボノイドは、同一の場合もあり、異なる場合もある。

【0035】

フラボノイドは、コアのフェニルベンジルピロン構造に由来する分子の一般的なクラスに由来する任意のフラボノイドとすることができ、これには、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラバン−３−オール、カテキン、アントシアニジン、及びカルコンが含まれる。具体的な実施形態では、フラボノイドが、カテキン又はカテキンベースのフラボノイドである。カテキン又はカテキンベースのフラボノイドとは、カテキン（又はフラバン−３−オール誘導体）として一般的に知られているクラスに属する任意のフラボノイドであり、カテキンと、エピカテキン、エピガロカテキン、カテキン、没食子酸エピカテキン、及び没食子酸エピガロカテキンを含めたカテキン誘導体とを包含し、これには、カテキン又はカテキンベースのフラボノイドのすべての可能な立体異性体が含まれる。

【0036】

具体的な実施形態では、カテキンベースのフラボノイドが、（−）−エピカテキン、（−）−エピガロカテキン、（＋）−カテキン、（−）−没食子酸エピカテキン、又は（−）−没食子酸エピガロカテキンである。（−）−没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）は、おそらく、トリヒドロキシＢ環及びこのフラボノイドのＣ３位における没食子酸エステル部分のために、カテキンベースのフラボノイドのうちで活性が最も高いと考えられる。加えて、ＥＧＣＧは、その高度な活性のために、そして、例えば、ＰＥＧ（後続の節中で論じる）とのコンジュゲーションを介してコンジュゲートを形成するように特に選択され、結果として得られるＰＥＧ−ＥＧＣＧコ
ンジュゲートは、代謝又は分解がより緩徐であり、体内の半減期を延長することが可能である、安定的な組成物を形成する。さらに、ＥＧＣＧ部分は、薬物分子と共に、疎水性相互作用、π−πスタッキング相互作用、又は他の物理的結合若しくは化学的結合などの相互作用を形成することが可能であり、これにより、薬物分子を、送達ビヒクルの内部コア内に封入するか、又は閉じ込めることが可能である。

【0037】

特定の実施形態では、フラボノイドが、カルボキシル末端基、アミン末端基、スクシンイミド末端基、又は化学的部分とのコンジュゲート形成に適する他の任意の基を含有するＥＧＣＧでありうる。

【0038】

送達剤は、遊離アルデヒド基又はアルデヒド基への転換が可能な官能基を有するポリマー、遊離カルボキシル基又はカルボキシル基への転換が可能な官能基を有するポリマー、遊離アミン基又はアミン基への転換が可能な官能基を有するポリマー、遊離スクシンイミド基又はスクシンイミド基への転換が可能な官能基を有するポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択される化学的部分を含有することが好ましい。特定の実施形態では、ポリマーが、アミン末端ＥＧＣＧと反応してコンジュゲートを形成しうる、カルボキシル末端ポリ（エチレングリコール）又はスクシンイミド末端ポリ（エチレングリコール）である。代替的な実施形態では、ポリマーが、カルボキシル末端ＥＧＣＧ又はスクシンイミド末端ＥＧＣＧと反応してコンジュゲートを形成しうる、アミン末端ポリ（エチレングリコール）である。

【0039】

送達剤は、送達ビヒクル内へと形成することが可能であり、これにより、フラボノイドの生物学的特性又は薬理学的特性を損なわずに、コンジュゲートしたフラボノイドを、送達ビヒクル内へと組み込むことが可能となる。送達剤はまた、生体適合性でもあるべきであり、一部の実施形態では、生体分解性でありうる。

【0040】

以下の議論は、フラボノイドがカテキンベースのフラボノイドであり、送達剤が、アルデヒド末端ポリマーである実施形態を指す。しかし、アルデヒドを含有する化学基とフラボノイドとのアルデヒド縮合反応は、送達剤に対する以下の酸処理を含め、上記で説明した官能基を有する任意の送達剤を、任意のフラボノイドとコンジュゲートするのに適用可能である。

【0041】

したがって、この反応は、遊離アルデヒド基又は遊離アルデヒド基への転換が可能な基を含有するポリマーを、例えば、酸の存在下において、カテキンベースのフラボノイドとコンジュゲートすることを伴いうる。

【0042】

カテキンベースのフラボノイドは、その単量体形態又は二量体形態で用いることができ、コンジュゲーションが、結果として、フラボノイドオリゴマーの形成をもたらさないように、コンジュゲーション時において、フラボノイドの単量体形態又は二量体形態を保持することが重要である。上記で言及した通り、ポリマーのフラボノイドとのコンジュゲーションは、結果として、フラボノイドの生物学的特性又は薬理学的特性の増強をもたらす。

【0043】

ポリマーは、カテキンベースのフラボノイドとのコンジュゲーションの前に遊離アルデヒド基を有するか、又は、酸の存在下においてアルデヒド基へと転換される基、例えばアセタール基、を有する、任意のポリマーでありうる。さらに、ポリマーは、非毒性であり、生体適合性であり、薬理学的使用に適するべきであることが理解されるであろう。ポリマーはまた、他の所望の特性も有しうる。例えば、ポリマーは、免疫原性が低く、例えば、体内の特定の部位において、カテキンベースのフラボノイド及び抗癌剤を制御放出するための組成物に望ましい生物学的適用に応じて、生体分解性の場合もあり、非生体分解性の場合もある。

【0044】

ポリマーは、その具体的な特徴、及び特定の種類の送達ビヒクルを形成するその能力に基づき選択することができる。例えば、ポリマーは、アルデヒド末端ポリ（エチレングリコール）でありうる。代替的に、ポリマーは、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタールコンジュゲート、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸−チラミン、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタールコンジュゲート−チラミン、シクロトリホスファゼンコアフェノキシメチル（メチルヒドラゾノ）デンドリマー、又はチオホスホリルコアフェノキシメチル（メチルヒドラゾノ）デンドリマー、でもありうる。ポリマーはまた、遊離アルデヒド基、又は酸の存在下においてアルデヒドへの転換が可能な基を含有するように修飾された、任意の生物学的ポリマーでもあり、例えば、アルデヒドで修飾されたタンパク質、ペプチド、多糖、又は核酸でもありうる。具体的な一実施形態では、ポリマーが、アルデヒド末端ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＣＨＯ）である。ＰＥＧは、薬理学的成分として広く用いられているポリマーであり、親水性で、非毒性で、非免疫原性で、生体適合性である良好な特徴を保有し、生体分解性が低いため、コンジュゲートを形成するのに特に選択される。

【0045】

ポリマーにおける遊離アルデヒド基は、ポリマーが、フラボノイド構造のＡ環のＣ６位又はＣ８位の一方又は両方と制御された形でコンジュゲートされることを可能とし、これにより、フラボノイド構造、特に、フラボノイドのＢ環及びＣ環の破壊を阻止し、これにより、フラボノイドの有益な生物学的特性及び薬理学的特性を保存する。Ｃ６位及びＣ８位が最も好ましいが、フラボノイドの他のコンジュゲーション位置（例えば、他の環における）もまた可能であることは、当業者に明らかであろう。

【0046】

ポリマーのアルデヒド基を、カテキンベースのフラボノイドのＡ環のＣ６位及び／又はＣ８位と反応させることにより、ポリマーをカテキンベースのフラボノイドにコンジュゲートする。

【0047】

ポリマーのアルデヒド基の、カテキンベースのフラボノイドとの縮合反応に対する酸触媒を用いてコンジュゲートを合成する場合もあり、アルデヒド基を、カテキンベースのフラボノイドと縮合させる前に、酸を用いてポリマーにおける官能基を遊離アルデヒドへと転換してコンジュゲートを合成する場合もある。

【0048】

ポリマーとカテキンベースのフラボノイドとをコンジュゲートするには、ポリマー及びカテキンベースのフラボノイドを、適切な溶媒中で個別に溶解させることができる。遊離アルデヒドを伴うポリマーは、例えば、酸の存在下において、カテキンベースのフラボノイドを含有する溶液へと、滴下添加により添加する。反応は、完遂させることができる。コンジュゲーション反応の後、反応しなかった過剰なポリマー又はカテキンベースのフラボノイドを、例えば、透析又は分子篩法により、コンジュゲートした組成物から除去することができる。

【0049】

ポリマーを、フラボノイドのＡ環のＣ６位及び／又はＣ８位においてコンジュゲートした、遊離アルデヒドを含有するポリマーと、カテキンベースのフラボノイドとのコンジュゲートもまた意図される。

【0050】

ポリマーのコンジュゲーションはまた、カテキンベースのフラボノイドを、多様な組成物又はビヒクルへと組み込むことも可能とする。遊離アルデヒド基を含有する具体的なポリマーを、ポリマーの物理的特性に基づいて選択することにより、フラボノイドを、多様な異なる種類のビヒクルへと組み込むことが可能であり、別の状況において、高濃度のフラボノイドを、体内の多様な標的領域へと送達することが可能となる。

【0051】

したがって、上記で説明した反応から結果として得られるコンジュゲートを、このコンジュゲートのポリマー部分の性質に応じて、送達ビヒクルへと形成することができる。送達ビヒクルを用いて、その性質に応じて、体内の具体的な標的部位を含め、体内にカテキンベースのフラボノイドを送達することができる。

【0052】

コンジュゲート、送達ビヒクル、抗癌剤送達ビヒクル、又はこれらのうちのいずれかを含む医薬組成物は、ナノメートル寸法であり、この場合、化学的部分及び少なくとも１つのフラボノイドが、ナノメートル寸法である。

【0053】

抗癌剤は、細胞傷害性効果、アポトーシス効果、抗有糸分裂効果、抗血管新生効果、又は転移阻害効果などの抗腫瘍効果を含め、細胞に対して抗癌効果を及ぼす任意の薬剤でありうる。抗癌効果は、腫瘍細胞増殖の阻害若しくは低減、発癌性の阻害若しくは低減、腫瘍細胞の殺滅、又は腫瘍細胞を含めた細胞の発癌特性若しくは腫瘍形成特性の阻害若しくは低減を包含することを意図する。

【0054】

抗癌剤は、タンパク質、核酸、低分子、又は薬物を包含する。タンパク質である抗癌剤は、ペプチド、抗体、ホルモン、酵素、増殖因子、又はサイトカインでありうる。核酸である抗癌剤は、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、ｓｉＲＮＡの場合もあり、抗癌生成物をコードする遺伝子を含む場合もある。抗癌剤の範囲内にはまた、化学療法剤又は血管新生阻害剤も包含される。抗癌剤は、腫瘍細胞の表面マーカーを指向する、モノクローナル抗体を含めた抗体、免疫制御性ペプチド、サイトカイン、又は増殖因子でありうる。抗癌剤は、ハーセプチン（トラスツズマブ）、フマジリンの類似体であるＴＮＰ４７０（Ｎ−（２−クロロアセチル）カルバミン酸（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２−オキシラニル］−１−オキサスピロ［２．５］オクト−６−イルエステル）、ドキソルビシン、シスプラチン、パクリタキセル、ダウノルビシン、又はこれらの混合物でありうる。

【0055】

抗癌剤には、チロシンキナーゼ阻害剤、又はシスプラチン、白金、カルボプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、ビノレルビン、トポテカン、若しくはイリノテカンが含まれうる。アポトーシスを誘導する酵素には、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、又はＦａｓＬが含まれうる。核酸による抗癌剤には、プラスミドＤＮＡ（治療用タンパク質をコードする）又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれうる。ＯＤＮとは、短い一本鎖ＤＮＡであり、転写されるｍＲＮＡと相補的であり（センス鎖）、したがって、このｍＲＮＡに結合し、このｍＲＮＡが、細胞内部でタンパク質へと翻訳されることを阻止する。代替的に、ＯＤＮを、プレｍＲＮＡのスプライシング部位に結合するように標的化し、ｍＲＮＡのエクソン端を修飾するように指向させることもできる。これに対し、ｓｉＲＮＡとは、短い二本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡであり、細胞内に侵入すると、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）としてもまた知られている、エンドリボヌクレアーゼを含有する複合体へとアセンブリーされる。次いで、これらのｓｉＲＮＡ分子は、ＲＩＳＣの内部で巻き戻され、細胞におけるそのｍＲＮＡ標的鎖を認識及びスプライシングし、これにより、標的タンパク質の発現を下方制御するように活性化された複合体となる。同様に、アポトーシスを誘導することが可能なマイクロＲＮＡは、特定のマイクロＲＮＡにより誘発することができる。マイクロＲＮＡには、ＭｉＲ−１５、ＭｉＲ−１６、ＭｉＲ−９９ａ／ｌｅｔ７ｃ／ＭｉＲ−１２５ｂ２、又は他の適切なアポトーシス促進性マイクロＲＮＡが含まれうる。

【0056】

本送達ビヒクルへと組み込まれている間、抗癌剤の生物学的活性は、一時的に、部分的又は完全に遮蔽され、送達ビヒクル内でアセンブリーされている間、抗癌剤のアベイラビリティーも低下するが、これは、送達ビヒクル内に含有されている間、抗癌剤が抗癌活性を及ぼすか、又は他の分子と生体活性的な形で相互作用することが不可能であり、また、他の分子の活性から保護されてもいることを意味する。送達ビヒクルから抗癌剤が放出されると、抗癌剤の生物学的特性のアベイラビリティーが再度もたらされ、細胞へと送達されると、抗癌剤は、抗癌効果を及ぼすことが可能である。

【0057】

一実施形態では、抗癌剤が、コンジュゲート又は送達剤へと負荷される。抗癌剤は、フラボノイドとの疎水性相互作用及び／又はΠ−Πスタッキング相互作用を介して、コンジュゲート又は抗癌剤送達ビヒクルに負荷又は封入することができる。

【0058】

本発明の送達剤への抗癌剤の薬物負荷率は、送達剤における他の既知の薬物負荷率より高いことが好ましい。例で説明される通り、薬物負荷率が、送達ビヒクルにおける抗癌剤の重量百分率として定義されるのに対し、薬物負荷効率は、当初導入された遊離抗癌剤と比較した、封入抗癌剤の重量百分率として定義される。薬物負荷率は、報告された薬物負荷率の範囲の１．５〜５倍でありうる。薬物負荷率は、報告された薬物負荷率の範囲の１．７５〜４．２５倍であることが好ましい。薬物負荷率がそれほど十分に確立されていない抗体及びｓｉＲＮＡの場合において、本発明者らは、ポリペプチド及び核酸が、送達剤への負荷に成功することが可能であるだけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおける送達にも成功しうることを実証した。

【0059】

薬物対コンジュゲート比は、６：１〜１：６の範囲でありうる。具体的な実施形態によるドキソルビシン対ＰＥＧ／ＥＧＣＧ比は、６：１、４：１、２：１、１：１、及び１：２の比で成功した。抗癌剤が、フラボノイドとの相互作用を形成しうる限りにおいて、抗癌剤の量は、コンジュゲートの量より多い。

【実施例】

【0060】

緑茶の主要な成分である（−）−没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）は、多くの生物学的効果及び薬理学的効果を示す。以下の例では、酸触媒によるアルデヒドを介する縮合反応を用いて、ポリ（エチレングリコール）のＥＧＣＧとのコンジュゲートを合成した。

【0061】

実施例１：ドキソルビシン及びＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートを含む送達ビヒクルの形成
一実施形態では、薬物分子をドキソルビシン（「Ｄｏｘ」と略記する）とする。図１は、Ｄｏｘを負荷したＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートのセルフアセンブリーによる送達ビヒクルの形成を例示するスキームを示す。この実施形態では、送達ビヒクルが、ミセルの形態である。この送達ビヒクルは、水性環境において、ＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートがミセルへとセルフアセンブリーすることに基づき、これは、ＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートのＰＥＧ鎖が親水性であることから生じる。ＥＧＣＧ部分の多環構造とＤｏｘの多環構造との類似により、ＥＧＣＧ部分が、疎水性相互作用及びπ−πスタッキング相互作用を介してＤｏｘを封入するように設計する。単純な混合及び透析により、Ｄｏｘを送達ビヒクル内に封入することに成功した。本送達ビヒクルが、当技術分野において知られる他の送達ビヒクル系（例えば、ポリマーミセル系）と比較して、例外的に高いＤｏｘ負荷率を示すことが判明して有利である。動的光散乱（ＤＬＳ）測定はまた、送達ビヒクルの大きさが、ＥＰＲ効果を介する腫瘍のパッシブターゲティングに理想的であることも示した。

【0062】

この例では、有機溶媒であるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解させたＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートとＤｏｘとの混合物を、蒸留水に対して透析することにより、送達ビヒクルを調製した。異なる濃度のＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲート（それぞれ、０、０．５、１、３、６、１２、２４ｍｇ／ｍｌ）を用いて、１２ｍｇ／ｍｌで濃度を固定したＤｏｘを封入した。透析時には、有機溶媒が水で段階的に置換されることにより、送達ビヒクルのセルフアセンブリー及びアセンブリーされた構造へのＤｏｘの封入が誘発された。図２に示す通り、０、０．５、及び１ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＥＧＣＧ濃度を用いたところ、透析時に沈殿物が得られたことから、送達ビヒクルの形成が有効でないことが示された。これに対し、ＰＥＧ−ＥＧＣＧの濃度を３、６、１２、及び２４ｍｇ／ｍｌとしたところ、均一な溶液が達成されたことから、送達ビヒクルへのＤｏｘ封入の成功が裏付けられた。この例は、Ｄｏｘ／ＰＥＧ−ＥＧＣＧ送達ビヒクルが効果的にセルフアセンブリーされるには、Ｄｏｘ対ＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートの適切な比を注意深く選択すべきであることを示す。

【0063】

実験
材料：アルデヒド末端ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＣＨＯ、分子量：５０００）は、日油株式会社（日本）から購入した。ＥＧＣＧは、栗田工業株式会社（日本）から購入した。塩酸ドキソルビシン（Ｄｏｘ・ＨＣｌ）は、Ｂｏｒｙｕｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｋｏｒｅａから購入した。

【0064】

ＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートの合成：アルデヒド末端ＰＥＧ（０．３５ｇ）と、ＥＧＣＧ（０．６５ｇ）とを、酢酸、水、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の混合物中で個別に溶解させた。窒素雰囲気下、２０℃（ｐＨ２）で、４８時間にわたり、ＰＥＧ−ＣＨＯ溶液を滴下によって添加することで、反応を開始させた。結果として得られる生成物を透析し（分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）＝３５００）、凍結乾燥させて、ＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートをもたらした。

【0065】

送達ビヒクルの合成：１ｍｌのＤＭＦ中に、Ｄｏｘ・ＨＣｌ（１２ｍｇ、２１μｍｏｌ）を溶解させた。次いで、この溶液に、トリエチルアミン（２９μｌ、２１０μｍｏｌ）を添加し、この塩酸塩を中和した。次に、この溶液に、ＤＭＦ中に異なる濃度で溶解させたＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲート（１ｍｌ）を添加し、結果として得られる混合物を、２０分間にわたりボルテックスした。次いで、各試料溶液を、ＭＷＣＯを３５００Ｄａとする透析チューブへと移した。このチューブを、１２時間ごとに水を替えながら２日間にわたり、蒸留水に対して透析した。試料溶液を凍結乾燥させて、固体のミセルを得た。

【0066】

薬物負荷率の決定：乾燥させた試料をＤＭＦ中で溶解させた後、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｕ２８１０ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用いて、４８０ｎｍにおいて、試料溶液の吸光度を測定した。各試料におけるＤｏｘの量は、Ｄｏｘの基準物質と比較することにより推定した。薬物負荷率は、送達ビヒクル内のＤｏｘ量と、乾燥させた送達ビヒクル試料の重量とから計算した。

【0067】

送達ビヒクルサイズの決定：Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ９０Ｐｌｕｓ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いるＤＬＳにより、送達ビヒクル試料のサイズを決定した。蒸留水を用いて各試料溶液を調製し、１０μｇ／ｍｌのＤｏｘをもたらしてから、２５℃でＤＬＳ測定を実施した。

【0068】

結果：送達ビヒクルの特徴
実施例１の送達ビヒクルの特徴を、以下の表１にまとめる。薬物負荷率が、送達ビヒクルにおけるＤｏｘの重量百分率として定義されるのに対し、薬物負荷効率は、当初導入された遊離Ｄｏｘと比較した、封入Ｄｏｘの重量百分率として定義される。ＰＥＧ−ＥＧＣＧの初期濃度を３ｍｇ／ｍｌ及び６ｍｇ／ｍｌとする試料は、それぞれ、８５重量％及び６８重量％という、例外的に高い薬物負荷率を示した。達成された最高のＤｏｘ負荷率は（８５重量％）は、他の研究グループ（Ｈ．Ｍ．Ａｌｉａｂａｄｉら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２００６、３、１３９〜１６２）により開発されたブロックコポリマーによる送達ビヒクルにおける平均のＤｏｘ負荷率（１０〜２０重量％）の４倍超に対応した。特定の機構に限定されるものではないが、このように高い薬物負荷率はおそらく、ＥＧＣＧ部分とＤｏｘとの強力な疎水性相互作用及び／又はπ−πスタッキング相互作用によるものであり、おそらくこのために、ＥＧＣＧ部分は、報告された他のＰＥＧブロックコポリマーの疎水性鎖よりはるかに小さいが、セルフアセンブリー工程におけるＤｏｘの封入が増強されるのであろう。

【0069】

送達ビヒクルのサイズは、７８．５〜１９２．４ｎｍの範囲であった（表１を参照されたい）。薬物負荷率が増大するにつれてサイズも増大したが、ＰＥＧ−ＥＧＣＧの初期濃度が増大するにつれてサイズは減少した。ＥＧＣＧ部分は、Ｄｏｘの封入において重要な役割を果たしたので、サイズの増大は、封入効率と相関しているはずである。したがって、サイズだけでなく、任意の標的化薬物送達系に重要な側面である、薬物放出プロファイル及び送達ビヒクルの安定性もまた、導入されるＰＥＧ−ＥＧＣＧの初期濃度により制御することができるであろう。送達ビヒクルのナノメートル寸法（２００ｎｍ未満）は、ＥＰＲ効果を介して腫瘍組織を標的化する能力を付与した。同時に、このナノメートル寸法は、送達ビヒクルのオプソニン化及び腎によるクリアランスを回避する一助となったので、血中における貯留時間の延長を可能とした。

【0070】

【表1】

【0071】

（ａ）ＰＥＧ及び（ｂ）ＰＥＧ−ＥＧＣＧそれぞれのエレクトロスプレーイオン化飛行時間質量分析スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を、図３に示す。２つのピーククラスター間におけるｍ／ｚ差は、＋５の電荷を考慮し、各ピーク間における０．２ｍ／ｚの差から計算される、ＰＥＧ及びＰＥＧ−ＥＧＣＧ両方についてのＰＥＧ反復単位＝４４（例えば、（１０３７．２６−１０２８．４３）×５＝４４．１５）として観察された。しかし、ＰＥＧ−ＥＧＣＧのピークは、ＰＥＧのピークと比較して、ＥＧＣＧ ２つ分の分子量だけ（例えば、（１２１１．０９−１０２８．６５）×５＝９１２．３６）高値側へシフトしたことから、ＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートが、ＰＥＧ鎖の一方の端部に結合した、２つのＥＧＣＧ反復単位を含むこと、すなわち、各ＥＧＣＧ反復単位が、コンジュゲーション後においても単量体を維持し、ＥＧＣＧオリゴマーは形成されないことが裏付けられた。この実施形態では、化学的部分（ＰＥＧ）の一方の端部に２つの単量体フラボノイド（ＥＧＣＧ）がコンジュゲートされていることが示されたが、化学的部分の一方の端部に３つの単量体フラボノイドがコンジュゲートされていること、又は化学的部分の一方の端部に１又は複数の二量体フラボノイドがコンジュゲートされていることなど、他のコンジュゲート構成もまた意図されることを了解及び理解されたい。

【0072】

実施例２：シスプラチン及びＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートを含む送達ビヒクルの形成
別の実施形態では、薬物分子をシスプラチンとする。図４は、シスプラチンを負荷したＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートのセルフアセンブリーによる送達ビヒクルの形成を例示するスキームを示す。この実施形態では、送達ビヒクルが、キレート錯体の形態でありうる。シスプラチンとＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートとの相互作用はおそらく、ＥＧＣＧのＯＨ部分による、Ｐｔ（白金）のキレート化による。このキレート錯体は、ＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートが、中央のシスプラチンの周囲にクラスター化し、これにより、クラスター内にシスプラチンを閉じ込めるキレート化の結果として形成される。

【0073】

本例では、（ｉ）水、又は（ｉｉ）有機溶媒であるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解させたＰＥＧ−ＥＧＣＧとシスプラチンとの混合物を、蒸留水に対して透析することにより、シスプラチン／ＰＥＧ−ＥＧＣＧ錯体を調製した。異なる濃度のＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲート（１．２、２．４、６、及び／又は１２ｍｇ／ｍｌ）を、１．２ｍｇ／ｍｌで濃度を固定したシスプラチンに対して用いた。透析時には、ＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートが、中央のシスプラチンの周囲にクラスター化し、クラスター内にシスプラチンを閉じ込める。

【0074】

実験
材料：アルデヒド末端ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＣＨＯ、分子量：５０００）は、日油株式会社（日本）から購入した。ＥＧＣＧは、栗田工業株式会社（日本）から購入した。シスプラチン［ｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）、ＣＤＤＰ］は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐｔｅ．Ｌｔｄ．、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅから購入した。

【0075】

ＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートの合成：ＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートは、実施例１で説明した通りに合成した。代替的に、ポリマーを、カルボキシル末端ポリ（エチレングリコール）とすることもでき、これを、アミン末端ＥＧＣＧと反応させて、コンジュゲートを形成することもできるが、この合成は、当業者に明らかである。

【0076】

送達ビヒクルの合成：１ｍｌの水又はＤＭＦ中に、ＣＤＤＰ（１．２ｍｇ、４μｍｏｌ）を溶解させた。次いで、この溶液に、水又はＤＭＦ中に異なる濃度で溶解させたＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲート（１ｍｌ）を添加し、結果として得られる混合物を、２０分間にわたりボルテックスした。次いで、各試料溶液を、ＭＷＣＯを１０００Ｄａとする透析チューブへと移した。このチューブを、１２時間ごとに水を替えながら２日間にわたり、蒸留水に対して透析した。次いで、送達ビヒクルを回収した。

【0077】

薬物負荷率の決定：Ｈｉｔａｃｈｉ Ｕ２８１０ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用いて、２８０ｎｍにおいて、ＰＥＧ−ＥＧＣＧ含量について、試料溶液の吸光度を測定した。各試料におけるシスプラチンの量は、ＰｅｌｋｉｎＥｌｍｅｒ ＳＣＩＥＸ ＩＣＰ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ Ｅｌａｎ ＤＲＣ ＩＩにより測定した。薬物負荷効率は、送達ビヒクル内に閉じ込められたシスプラチン量と、系に当初添加したシスプラチン量とから計算した。薬物負荷率は、送達ビヒクル中のシスプラチン量と、送達ビヒクルの重量とから計算した。

【0078】

送達ビヒクルサイズの決定：決定のプロトコールは、実施例１で説明したプロトコールと同じである。

【0079】

結果
（ｉ）水中、及び（ｉｉ）ＤＭＦ中に溶解させたシスプラチンを伴うＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートの特徴を、それぞれ、表２及び表３にまとめる。薬物負荷率が、送達ビヒクルにおけるシスプラチンの重量百分率として定義されるのに対し、薬物負荷効率は、当初導入された遊離シスプラチンと比較した、閉じ込められたシスプラチンの重量百分率として定義される。ＰＥＧ−ＥＧＣＧ濃度を増大させたとき、試料は、薬物負荷効率の増大傾向を示した。

【0080】

動的光散乱（ＤＬＳ）による測定はまた、送達ビヒクルの大きさが、１５３〜１９４ｎｍの範囲であることも示した（表２及び表３を参照されたい）が、これは、ＥＰＲ効果を介する腫瘍のパッシブターゲティングに理想的である。送達ビヒクルのナノメートル寸法（２００ｎｍ未満）は、ＥＰＲ効果を介して腫瘍組織を標的化する能力を付与した。同時に、このナノメートル寸法は、送達ビヒクルのオプソニン化及び腎によるクリアランスを回避する一助となったので、血中における貯留時間の延長を可能とした。

【0081】

【表2】

【0082】

【表3】

【0083】

実施例３：ハーセプチン及びＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートを含む送達ビヒクルを用いる試験結果
本発明者らはまた、上記の実施例２で概括した合成経路に従い、ＰＥＧ−ＥＧＣＧコンジュゲートにハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから購入した）を封入することにも成功した。図５に示す通り、コンジュゲートは、ＢＴ−４７４ ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現させた乳癌の異種移植片に対する抗癌効果の増強を示した。

【0084】

結果
ｉｎ ｖｉｖｏにおける送達ビヒクルの抗癌効果：無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウス（５〜６週齢）を、Ｈａｒｌａｎ、ＵＫから購入し、すべての動物実験を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）による手順及びガイドラインを順守して実施した。右脇腹にＢＴ−４７４細胞（１２０μｌのマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中に１×１０^７個）を注射する１日前、各マウスに、１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を皮下（ｓ．ｃ．）挿入した。説明される通りに（Ｗ．Ｐ．ＭｃＧｕｉｒｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９６、３４４（１）、１２６８）、長さｌ及び幅ｗを測定し、容量（Ｖ＝ｌｗ^２／２）を計算することで、腫瘍容量Ｖ（ｍｍ^３）を決定した。腫瘍が２５０ｍｍ^３の平均サイズを達成したら、実験治療及び対照治療を実施した。マウスを異なる群（ｎ＝６）に無作為化してから、各治療を開始した。用いるハーセプチンは２．５ｍｇ／ｋｇとし、用いるＰＥＧ−ＥＧＣＧは１００μＭとした。治療は、毎週２回ずつ投与した。１６日後、動物には、ビヒクル（ＰＢＳ）（黒丸）、ＰＥＧ−ＥＧＣＧ（黒三角）、ハーセプチン（黒四角）、（ハーセプチン＋ＰＥＧ−ＥＧＣＧ）ミセル（黒逆三角）を注射した。結果は、平均±標準偏差として報告した。

【0085】

ＢＴ−４７４ ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現させた乳癌の異種移植片に対する抗癌効果の増強は、腫瘍部位における送達ビヒクルの蓄積により、このため、ハーセプチンだけで治療した動物群と比較して腫瘍サイズを顕著に減少させることが可能であった。送達ビヒクル内にハーセプチンを封入する機構は、実施例１において意図した機構と同様でありうる、すなわち、ＥＧＣＧ部分は、プロリン残基とＥＧＣＧ部分との間の疎水性相互作用及びπ−πスタッキング相互作用を介して、ハーセプチンを封入する。

【0086】

結論として述べると、本送達ビヒクルは、前出の節で言及した、各種のブロックコポリマーを含む従来の薬物送達ビヒクル（ポリマーミセル担体）が直面していた、低薬物負荷率の難題を克服する。長い疎水性ポリマー鎖を用いる既存の先行技術による送達ビヒクルとは異なり、本送達ビヒクルは、ＥＧＣＧ部分を介する強力な薬物相互作用をもたらして、高薬物負荷率を達成する。本送達ビヒクルによる封入能又は閉じ込め能の増強はまた、それらの構造を改変することなく、他の抗癌薬に拡張することができ、したがって、これは、ハーセプチン及びドキソルビシン、又はパクリタキセル及びダウノルビシンなど、複数の抗癌剤を共送達するための潜在的な系となる。

【0087】

本送達ビヒクルを癌治療において用いるのに特に適したものとする、それらの独自の特性には、（ｉ）それらのナノメートル寸法が、１０〜２００ｎｍであること、（ｉｉ）水における可溶性の増大を付与するそれらの両親媒性構造、及び（ｉｉｉ）その内部コアに抗癌剤を封入するか又は閉じ込めるそれらの能力が含まれる。薬物負荷率の高い送達ビヒクルの設計は、効率的な癌治療を達成するのに重要である。また、送達ビヒクルの用量は低減しうるので、このような送達ビヒクルであれば、潜在的な非特異的薬物送達により引き起こされる副作用を最小化することも期待される。さらに、担体の抗癌薬負荷率が高ければ、注射の頻度が低下し、これにより、患者の服薬遵守が改善され、患者に対して引き起こされる外傷が軽減される。本送達ビヒクルは、このような独自の特性を提供するように設計されている。

【0088】

実施例４：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｓｉＲＮＡ送達及び細胞内局在化の画像化
細胞を、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（商標）８ウェルチャンバーカバーガラス（Ｎｕｎｃ、ＵＳＡ）内に、カバーガラス１枚当たり１×１０^４個の密度で播種した。播種の２日後、培養培地を除去し、チャンバーカバーガラスにＰＥＧ−ＥＧＣＧ／ｓｉＲＮＡトランスフェクション複合体を添加した。濃度を変化させながらＰＥＧ−ＥＧＣＧを、５０ｎＭのＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｃｙ（商標）３−Ｌａｂｅｌｅｄ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＃１ ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、ＵＳＡ）へと添加することにより、上記で説明した複合体を調製した。インキュベーションの、それぞれ、１、４、及び２４時間後、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＤＰＢＳ）により細胞を洗浄し、室温で２０分間にわたり、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。続いて、ＤＰＢＳにより洗浄した後、細胞を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニリン（ＤＡＰＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で染色してから、共焦点顕微鏡法により検討した。２つのレーザー［ＤＡＰＩには、励起最大波長＝３４５ｎｍ、発光最大波長＝４５８ｎｍ、Ｃｙ３には、励起最大波長＝５４７ｎｍ、発光最大波長＝５６３ｎｍ］を用いるＯｌｙｍｐｕｓ ｌｘ７１レーザー走査顕微鏡を用いて、共焦点レーザー走査顕微鏡法を実施した。画像は、ＦＬＵＯＶＩＥＷソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を用いて収集した。

【0089】

共焦点顕微鏡法によるｓｉＲＮＡ局在化の観察
ｓｉＲＮＡ担体としてのＰＥＧ−ＥＧＣＧの能力を評価する前に、ｓｉＲＮＡを細胞内に送達するＰＥＧ−ＥＧＣＧの能力を調べた。異なるｓｉＲＮＡ対ＰＥＧ−ＥＧＣＧ比がｓｉＲＮＡの取り込みに対して及ぼす影響を、５０ｎＭのｓｉＲＮＡに対して異なる濃度のＰＥＧ−ＥＧＣＧを用いて検討した。トランスフェクションの１、４、及び２４時間後において、共焦点顕微鏡法により、Ｃｙ３で標識した陰性対照ｓｉＲＮＡの内部化をモニタリングし、ＰＥＧ−ＥＧＣＧを用いるｓｉＲＮＡのトランスフェクションに最適な時間を決定した。Ｃｙ３で標識したｓｉＲＮＡと関連する赤色の蛍光シグナルが検出されたのは、トランスフェクションの２４時間後における細胞集団だけであった。

【0090】

共焦点顕微鏡画像（図６）は、ＰＥＧ−ＥＧＣＧが、ｓｉＲＮＡを細胞に送達しうることを示した。さらに、ＤＡＰＩで染色した核の画像とＣｙ−３で標識したｓｉＲＮＡの画像とを重ね合せることにより認められる通り、画像は、ｓｉＲＮＡの細胞質における部分的局在化を明らかにする。ｓｉＲＮＡを、担体としてのＰＥＧ−ＥＧＣＧなしで送達したところ（図６Ａ）、蛍光は観察されなかったことから、ｓｉＲＮＡ単独では、細胞に侵入できないことが裏付けられた。同様に、ＰＥＧ単独を用いてｓｉＲＮＡを複合体化させたところ（図６Ｅ）、蛍光は検出されなかったことから、ＰＥＧ−ＥＧＣＧ／ｓｉＲＮＡ複合体をトランスフェクトした細胞において観察される赤色の蛍光は、ＰＥＧポリマーによるものではないことが示された。

【0091】

実施例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＥＧ−ＥＧＣＧと共に送達されたｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシング
ｓｉＲＮＡによるｉｎ ｖｉｔｒｏにおける遺伝子サイレンシング：Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）
ＯＤＭ１誘導体により細胞質内に送達されたｓｉＲＮＡが、機能的であったかどうかを決定するため、本発明者らは、Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）レポーター遺伝子系を用いた。このアッセイでは２つのレポーター酵素であるホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼを同時に発現させ、同じ細胞試料から、それらの活性を逐次測定した。ｐＧＬ３ルシフェラーゼｓｉＲＮＡの配列は、ホタルルシフェラーゼと完全に及び唯一相補的である。したがって、レニラルシフェラーゼの発現が、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより影響されるべきではない。このため、レニラルシフェラーゼは、二重の目的に用いられる。第１に、レニラルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼの活性を標準化するのに用いうる、トランスフェクション対照である。第２に、レニラルシフェラーゼの活性をモニタリングして、ｓｉＲＮＡ／ＰＥＧ−ＥＧＣＧ複合体の任意の非特異的作用を検出することができる。

【0092】

ｐＧＬ３プラスミドベクター及びｐＧＬ４．７３プラスミドベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）をトランスフェクトした４時間後に、様々な濃度のＰＥＧ−ＥＧＣＧ／ｓｉＲＮＡ複合体（上記の通りに調製した）を、９６ウェルプレートに播種した細胞に添加した。ｐＧＬ３ルシフェラーゼのｓｉＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）及びＡｌｌｓｔａｒｓ陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）により、トランスフェクションを実施した。４８時間後、トランスフェクション培地を除去し、ＤＰＢＳで細胞をすすいだ。５０μｌのパッシブ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）中で細胞を溶解させ、室温で１５分間にわたり、オービタルシェーカー（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に取り付けた。製造元のプロトコールに従い、遺伝子の発現を測定するのに用いられる、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩ（ＬＡＲＩＩ）及びＳｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を調製し、細胞溶解物に添加した。Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクション効率は、レニラルシフェラーゼ活性に対するホタルルシフェラーゼ活性の比（相対光単位（ＲＬＵ）で表される）として評価した。このアッセイではまた、２００ｎＭ、５０ｎＭ、及び１０ｎＭのｓｉＲＮＡがルシフェラーゼ活性に対して及ぼす影響も調べた。

【0093】

いずれのルシフェラーゼの比も、それぞれ、ホタル及びレニラの相対光単位として表した（ＲＬＵ１／ＲＬＵ２）。両方のルシフェラーゼをトランスフェクトしたが、ｓｉＲＮＡはトランスフェクトしていない細胞集団において得られる比を用いて、多様なｓｉＲＮＡトランスフェクション条件から得られる比を標準化した。機能的ｓｉＲＮＡは、ホタルルシフェラーゼタンパク質のレベルを低下させ、結果として、その活性を低下させると予測させる。活性の低下は、レニラルシフェラーゼ活性に対するホタルルシフェラーゼ活性の標準化比の低下に置き換えられる。この標準化は、トランスフェクション効率又は細胞生存率の差違により引き起こされる、実験のばらつきを最小化し、これにより、実験データのより信頼できる解釈を可能とする。

【0094】

２つのプラスミドＤＮＡのトランスフェクション効率を検討し、それらの比を最適化するため、細胞に、１：１０〜１：４００の範囲の、レニラルシフェラーゼＤＮＡ対ホタルルシフェラーゼＤＮＡの比でトランスフェクトした。実際、レニラルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼを駆動するのに用いられる２つのプロモーター（それぞれ、ＳＶ４０によるプロモーター及びサイトメガロウイルスによるプロモーター）は、互いに影響を及ぼし合うことが可能であったと報告されている。ホタルルシフェラーゼの量は、一定に維持した。それらの活性を測定し、相対比として表した。

【0095】

ＰＥＧ−ＥＧＣＧを用いて、２００ｎＭのＬｕｃｉ ｓｉＲＮＡを複合体化させたところ、ＰＥＧ−ＥＧＣＧの濃度を５〜１００μｇ／ｍｌとしたとき、０．５５〜０．６２の範囲の標準化ルシフェラーゼ活性比の低下（図７）が観察された。最も目立った低下は、ＰＥＧ−ＥＧＣＧを１００μｇ／ｍｌとしたときに観察された。Ｌｕｃｉ ｓｉＲＮＡと混合したとき、ＰＥＧ担体単独では、ルシフェラーゼ活性の下方制御が誘導されなかったことは、共焦点顕微鏡法から得られた結果と符合し、これより、ＰＥＧ自体は、機能的ｓｉＲＮＡを細胞内に送達することが不可能であったことが示される。

【0096】

蛍光顕微鏡法を用いた遺伝子サイレンシングの解析
ＰＥＧ−ＥＧＣＧにより細胞内に送達されたｓｉＲＮＡの機能性及び効率を迅速に評価するため、細胞に、緑色蛍光タンパク質をコードするｐＥＧＦＰ−１プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。４時間後、市販のトランスフェクション剤であるｓｉＰＯＲＴ（商標）又はＰＥＧ−ＥＧＣＧとのＧＦＰ−２２ ｓｉＲＮＡ複合体又は対照のｓｉＲＮＡ複合体を、ＨＣＴ１１６細胞に添加した。蛍光顕微鏡法は、ＧＦＰ発現細胞の迅速な視覚化を可能とした。ＧＦＰ−２２ ｓｉＲＮＡによるＧＦＰの下方制御は、緑色蛍光を発光する細胞の数の減少のほか、それらの強度の低下にも置き換えられた。ＧＦＰ−２２ ｓｉＲＮＡは、ＧＦＰ ｍＲＮＡの配列における２１ｂｐと相補的である。図８Ａ〜Ｄは、ＧＦＰ−２２ ｓｉＲＮＡをｓｉＰＯＲＴ（商標）により送達したときの陽性の下方制御を示した。この研究では、画像を、陽性対照として用いた。

【0097】

上記で説明した複合体を用いた４時間後において、ｐＥＧＦＰ−１プラスミドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）をトランスフェクトした細胞に、ＧＦＰ−２２ ｓｉＲＮＡ及びＡｌｌｓｔａｒｓ陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）をトランスフェクトした。４８時間後において、Ｏｌｙｍｐｕｓ ｌｘ７１蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を用いて、蛍光画像を撮像した。画像は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ−Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、ＵＳＡ）を用いて収集した。

【0098】

フローサイトメトリーを用いる遺伝子サイレンシングの確認
蛍光顕微鏡により観察されるＧＦＰの下方制御を定量化するため、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、ＰＥＧ−ＥＧＣＧ／ｓｉＲＮＡ複合体をトランスフェクトした細胞についてのフローサイトメトリーによる解析を実施した。

【0099】

ｐＥＧＦＰ−１プラスミドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を既にトランスフェクトした細胞にＧＦＰ−２２ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした４８時間後に、トランスフェクション培地を除去し、ウェル１個当たり５０ｕｌずつのアキュターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）酵素細胞解離培地（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ａｕｓｔｒｉａ）を添加した。細胞を５分間にわたりインキュベートし、細胞を解離させた後、ウェル１個当たり１５０ｕｌずつのＤＰＢＳを添加し、ウェルの内容物を１．５ｍｌの試験管に移し、３０００ｒｐｍで３分間にわたりスピンダウンした。上清を除去し、細胞を、１ｍｌ当たり２．５×１０^６個の密度で、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）製の細胞蛍光緩衝液中に再懸濁させた。次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）Ｋｉｔに備えられている試薬を用い、製造元のプロトコールに従い、細胞チップに試料を負荷し、調製した。Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を用いて、フローサイトメトリー解析を実施し、試料１例当たり約１０００〜１２００回の細胞イベントをカウントした。

【0100】

本発明者らは、ＰＥＧ−ＥＧＣＧ＋対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞のうちの６５．５％が、高蛍光領域にあることを見出した（図８Ｅ）。ＰＥＧ−ＥＧＣＧ＋ＧＦＰ−２２ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞では、高蛍光を示す細胞の数が、４６．４％へと減少した（図８Ｆ）。したがって、ＧＦＰ−２２ ｓｉＲＮＡを、ＰＥＧ−ＥＧＣＧを介して送達した場合、ＧＦＰ発現の低下は、約１９．１％であった。高蛍光強度領域から低蛍光強度領域への細胞イベントのシフトは、ヒストグラムから観察することができる。

【0101】

前出の発明を、例示及び実例を目的とし、１つ又は複数の実施形態に関して、理解を明確にする目的で、ある程度詳細に説明してきたが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲で説明される本発明の精神又は範囲から逸脱しない限りにおいて、本発明にある変化、変更、及び改変をもたらしうることが、当業者には容易に明らかである。さらに、個別の実施形態について論じているが、本発明は、これらの実施形態の組合せを包含しうる。

【関連出願の相互参照】

【0102】

本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年３月１１日に出願された、米国特許仮出願第６１／３１２，８８５号の利益を主張する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】