特許 5955337 苦丁茶冬青の葉の抽出方法、総サポニンおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5955337

(24)【登録日】2016年6月24日

(45)【発行日】2016年7月20日

(54)【発明の名称】苦丁茶冬青の葉の抽出方法、総サポニンおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/185 20060101AFI20160707BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20160707BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20160707BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/185

   A61P3/06

   A61P9/10 101

【請求項の数】7

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2013-550742(P2013-550742)

(86)(22)【出願日】2011年12月21日

(65)【公表番号】特表2014-504607(P2014-504607A)

(43)【公表日】2014年2月24日

(86)【国際出願番号】CN2011084377

(87)【国際公開番号】WO2012100612

(87)【国際公開日】20120802

【審査請求日】2014年2月25日

(31)【優先権主張番号】201110026026.X

(32)【優先日】2011年1月24日

(33)【優先権主張国】CN

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】513187900

【氏名又は名称】北京大学

【氏名又は名称原語表記】ＰＥＫＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100098394

【弁理士】

【氏名又は名称】山川 茂樹

(74)【代理人】

【識別番号】100153006

【弁理士】

【氏名又は名称】小池 勇三

(74)【代理人】

【識別番号】100064621

【弁理士】

【氏名又は名称】山川 政樹

(72)【発明者】

【氏名】トゥ，ペンフェイ

(72)【発明者】

【氏名】ザン，トンメイ

(72)【発明者】

【氏名】ゼン，ジアオ

(72)【発明者】

【氏名】ジアン，ヨン

(72)【発明者】

【氏名】ゾウ，ハイヤン

(72)【発明者】

【氏名】タン，リ

(72)【発明者】

【氏名】マ，ジゾン

【審査官】 鈴木 理文

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０１３６１７６６（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１５２１１７５（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特開２００１−１０３９２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−００７４５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０１７７５０６１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国新薬雑誌，２００９年，Vol.18 No.5，pp.429-433

【文献】 日本食生活学会誌，２００７年，Vol.18 No.1，pp.25-31

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／１８５

Ａ６１Ｐ ３／０６

Ａ６１Ｐ ９／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

苦丁茶冬青の葉の抽出方法であって、この方法は、
（１）苦丁茶冬青の葉を５０〜７０％エタノール水溶液での還流抽出に付し、抽出液を得るステップ；
（２）該抽出液を濾過し、該抽出液からエタノールを除去するステップ；
（３）ステップ（２）で得られた溶液を多孔質樹脂カラムに吸着させ、該樹脂カラムから、Ｈ2Ｏ、ｐＨ９〜１１の１０〜３０％アルカリ性エタノール水溶液、１０〜３０％エタノール水溶液および５０〜７０％エタノール水溶液で順次溶出させるステップ；
（４）５０〜７０％エタノール水溶液の溶出液を回収し、濃縮し、乾燥させ、苦丁茶冬青の葉の抽出物を得るステップ
とから成る方法。

【請求項2】

ステップ（１）でのエタノール水溶液の濃度は、５５〜６５％、最も好ましくは６０％であり；ステップ（３）でのエタノール水溶液の濃度は、５５〜６５％、最も好ましくは６０％である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（１）において、抽出は１〜８回、好ましくは２〜４回行われ、各還流抽出の時間は０．５〜５時間、好ましくは０．５〜２時間である、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

ステップ（２）において、エタノールを除去する方法は減圧下であり；ステップ（４）において、濃縮する方法は減圧下であり、乾燥させる方法は真空乾燥である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ステップ（３）において、多孔質樹脂カラムの直径と長さの比は１：３〜１０、好ましくは、１：４〜７、最も好ましくは１：６であり、多孔質樹脂と苦丁茶冬青の葉の重量比は５〜１５：１、好ましくは６〜１０：１である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ステップ（３）において、アルカリ性エタノール水溶液のｐＨは１０である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

ステップ（２）で分離されたエタノールおよび／またはステップ（４）で分離されたエタノールは回収され、ステップ（１）での還流抽出に再び使用されることをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、苦丁茶冬青(Ilex kudingcha C. J. Tseng)の葉の抽出方法、およびこの方法で抽出された、苦丁茶冬青の葉の総サポニン、ならびにその使用に関する。具体的には、本発明は、苦丁茶冬青の葉から総サポニンを抽出するための方法に関し、この方法により抽出された総サポニンは、コレステロールおよび血中脂質の低下ならびにアテローム性動脈硬化抑制のために使用することができる。

【背景技術】

【0002】

高脂血症は高コレステロールおよび高トリグリセリドを含むが、高コレステロールの有害性は高トリグリセリドの有害性よりもはるかに大きい。高脂血症に関しては、高脂血症の治療に最も効果的な手段は薬物による脂質低下療法である。現在のところ、トリグリセリドを低下させるには多くの効果的な薬物が存在しているが、コレステロールを低下させるための薬物は主にスタチン類である。これらのスタチン系薬剤は、高コレステロール血症誘発性アテローム性動脈硬化症の抑制を主に目的としており、これらの薬剤の作用機構は肝臓コレステロール合成の阻害である。しかしながら、スタチンの長期使用により、肝臓や筋肉は明らかに有害な影響を受け、トランスアミナーゼの増加も起こり、少ないながら横紋筋融解症や急性腎不全に苦しむ患者もいる。数世代の薬物構造改変を経たものの、スタチンの毒性と副作用の問題はまだ解決していない。

【0003】

苦丁茶(Kudingcha)は伝統的な民間飲料であり、健康茶として千年近く飲み続けられており、体重減少、血中脂質および血圧の低下、ならびに解熱および解毒などの効用がある。市場には様々な苦丁茶が存在するが、調査によれば、苦丁茶は２２種類の異なる植物の葉から作られている。しかし、どの種類の苦丁茶が血中脂質および血圧の低下により良好な効果を示すのかは分かっておらず、その結果、消費者が費やす金額は非常に高額になるが、脂質低下効果はわずかであり、効果がない場合すらある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

近年に至って、本発明の発明者らは、系統的比較研究の後に、モチノキ(Ilex)属の植物である苦丁茶冬青の葉にのみ、血中脂質低下およびアテローム性動脈硬化抑制についての特有の効果があることを見出した。これに関しては、有効成分はサポニンであり、苦丁茶冬青のサポニンのアグリコンは他の苦丁茶品種のものとはかなり異なる。有効成分および薬理学的効果についての系統的研究の後に、本発明者らは、苦丁茶冬青のサポニンは、コレステロールの低下およびアテローム性動脈硬化抑制に対して重要な効果を有し、その効果はスタチン系薬剤の効果と等しいが、苦丁茶冬青のサポニンの機構はスタチン系薬剤のものとは全く異なることを見出した。加えて、そのようなサポニンは、トリグリセリド低下、耐酸化性、腎臓保護および血液レオロジー改善などの効用も有する。作用機構についての研究により、苦丁茶冬青のサポニンによる脂質低下の機構は、腸管および肝臓でのアシル補酵素Ａコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）の活性の阻害を通じたものであり、その結果として、コレステロールの腸管吸収は抑制され得るということが示されている。しかしながら、従来の抽出方法により抽出された苦丁茶冬青の抽出物ではサポニンの含量よりもイソクロロゲン酸の含量がずっと高い。さらに、本発明者らは、イソクロロゲン酸は血中脂質を増加させ得ることも見出した。

【0005】

よって、本発明の１つの目的は、苦丁茶冬青の葉の抽出方法を提供することである。その方法は、総サポニンと総イソクロロゲン酸を分離することができるため、高含量のサポニンを含有する抽出物と高含量の総イソクロロゲン酸を含有する抽出物それぞれを得るこ
とができる。本発明のもう１つの目的は、本発明の方法を用いることにより抽出された苦丁茶冬青の葉の総サポニンを提供することである。その抽出物は８０％を超えるサポニンを含み、血中脂質低下、アテローム性動脈硬化抑制ならびに肝臓および腎臓の保護のために使用することができる。本発明の第３の目的は、コレステロールおよび血中脂質の低下ならびにアテローム性動脈硬化抑制のための薬物の調製における上記総サポニンの使用を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上に記載した本発明の目的のために、本発明は下の技術的解決法を提供する。

【0007】

本発明は苦丁茶冬青の葉の抽出方法を提供し、その方法は、以下のステップ：（１）苦丁茶冬青の葉を５０〜７０％エタノール水溶液での還流抽出に付し、抽出液を得るステップ；（２）該抽出液を濾過し、該抽出液からエタノールを除去するステップ；（３）ステップ（２）で得られた溶液を多孔質樹脂カラムに吸着させ、該樹脂カラムから、Ｈ₂Ｏ、１０〜３０％アルカリ性エタノール水溶液（ｐＨ９〜１１）、１０〜３０％エタノール水溶液および５０〜７０％エタノール水溶液で順次溶出させるステップ；（４）５０〜７０％エタノール水溶液の溶出液を回収し、濃縮し、乾燥させ、苦丁茶冬青の葉の抽出物を得るステップを含む。

【0008】

本発明の抽出方法では、ステップ（１）でのエタノール水溶液の濃度は、好ましくは５５〜６５％、最も好ましくは６０％であってよく；ステップ（３）でのエタノール水溶液の濃度は、好ましくは５５〜６５％、最も好ましくは６０％であってよい。本発明において、エタノール水溶液の濃度とは、エタノール水溶液中のエタノールの体積百分率を意味する。

【0009】

本発明の抽出方法では、ステップ（１）での還流抽出の操作は当業者には公知であり、該操作でのエタノール水溶液の量は原料の量に応じて決定することができる。例えば、エタノール水溶液と原料の重量比は、２〜２０：１、好ましくは５〜１５：１であってよい。抽出回数は、１〜８回、好ましくは２〜４回であってよく；各還流抽出の時間は、０．５〜５時間、好ましくは０．５〜２時間であってよい。各還流抽出の時間は同じであっても異なっていてもよく、各還流抽出用のエタノール水溶液の濃度も同じであっても異なっていてもよく、各還流抽出用のエタノール水溶液の量も同じであっても異なっていてもよい。例えば、本発明の好ましい実施形態では、最初に、１時間の還流に原料重量の１０倍量の６０％エタノールを使用し；濾過後、該材料を原料重量の８倍量の６０％エタノールで１時間還流し；次に、濾過後、原料重量の８倍量の６０％エタノールで１時間還流し、３回の還流抽出により得られた濾液を合わせる。

【0010】

本発明の抽出方法では、ステップ（２）でのエタノールの除去方法およびステップ（４）の溶出液(eluent)の濃縮方法は当業者には公知である。例えば、それらの２つの方法はどちらの場合も減圧下での濃縮であってよい。ステップ（４）での乾燥方法は、好ましくは、真空乾燥である。エタノールの量を節約するために、本発明の方法に、ステップ（２）で分離されたエタノールおよび／またはステップ（４）で分離されたエタノールを回収し、ステップ（１）での還流抽出に再使用することをさらに含めてもよい。

【0011】

本発明の抽出方法では、ステップ（３）で使用される多孔質樹脂カラムは、当技術分野で一般的に使用されている樹脂カラムである。本発明において好ましいのは、Ｄ１０１、ＨＰＤ１００、ＨＰＤ４００Ａ、ＡＢ−８およびＮＫＡなどのスチレン系多孔質吸着樹脂である。多孔質樹脂カラムの直径と長さの比は、１：３〜１０、好ましくは１：４〜７、最も好ましくは１：６であってよい。該樹脂と苦丁茶冬青の葉の重量比は、５〜１５：１、好ましくは６〜１０：１、最も好ましくは７：１であってよい。

【0012】

好ましくは、高力価の総サポニン抽出物を得るために、ステップ（３）での溶出プロセスに、糖類が検出されなくなるまでカラム体積の４〜１０倍量の水で樹脂カラムから溶出させ、次に、カラム体積の５〜１０倍量の１０〜３０％アルカリ性エタノール水溶液（ｐＨ９〜１１）で該樹脂カラムから溶出させること；さらに、カラム体積の２〜５倍量の１０〜３０％エタノール水溶液で該樹脂カラムから溶出させること；最後に、カラム体積の３〜６倍量の５０〜７０％エタノール水溶液で該樹脂カラムから溶出させることを含めてもよい。例えば、本発明の好ましい実施形態では、ステップ（３）は、ステップ（２）で得られた溶液をＨＰＤ４００Ａ多孔質樹脂カラム（該樹脂カラムの直径と長さの比は１：４であり、該樹脂と薬草の重量比は７：１である）に３０分間静的吸着させ、上のプロセスを３回繰り返すこと；吸着後、糖類が検出されなくなるまで水で該樹脂カラムから溶出させ、次に、カラム体積の８倍量の２５％アルカリ性エタノール水溶液（ｐＨ＝１０）で該樹脂カラムから溶出させること；さらに、該樹脂カラムが中性になるまでカラム体積の３倍量の２５％中性エタノール水溶液で該樹脂カラムから溶出させること；最後に、カラム体積の４倍量の６０％エタノール水溶液で該樹脂カラムから溶出させること；６０％エタノール水溶液の溶出液(eluent)を回収し、濃縮し、乾燥させ、苦丁茶冬青の葉の総サポニンの抽出物を得ることを含む。

【0013】

本発明の抽出方法では、ステップ（３）でのアルカリ性エタノール水溶液のｐＨは、最も好ましくは１０である。

【0014】

本発明の方法は、ステップ（５）：１０〜３０％アルカリ性エタノール水溶液（ｐＨ９〜１１）の溶出液と１０〜３０％エタノール水溶液の溶出液を合わせ、合わせた溶液のｐＨをｐＨ２〜３に調整し、その後、該溶液を濃縮し、乾燥させ、総イソクロロゲン酸を得るステップをさらに含んでよい。

【0015】

本発明はまた、上記方法を用いることにより抽出された、苦丁茶冬青の葉の総サポニンも提供する。これに関しては、総サポニンの含量は８０％を上回り得る。本発明の総サポニンは、血中脂質を低下させることができ、アテローム性動脈硬化症を抑制することができ、肝臓および腎臓に対する保護作用もある。

【0016】

本発明はまた、コレステロールおよび血中脂質の低下ならびにアテローム性動脈硬化症の抑制のための薬物の調製における、上記方法を用いることにより抽出された、苦丁茶冬青の葉の総サポニンの使用も提供する。苦丁茶冬青の葉の総サポニンは、単独で使用することができ、または効力を高め、スタチン系薬剤の毒作用および副作用を減少させるためにスタチン系薬剤と組み合わせて使用することもできる。

【0017】

本発明はまた、本発明において提供される、苦丁茶冬青の葉の総サポニンを用いることによるコレステロールおよび血中脂質の低下ならびにアテローム性動脈硬化抑制のための方法も提供する。

【0018】

本発明により提供される、苦丁茶冬青の葉の総サポニンは、コレステロールの低下およびアテローム性動脈硬化抑制に対して著しい効果を有し、その効果はスタチン系薬剤の効果と等しいが、苦丁茶冬青のサポニンの機構はスタチン系薬剤のものとは全く異なる。加えて、本発明における総サポニンの抽出物は、トリグリセリド低下、耐酸化性、腎臓保護および血液レオロジー改善などの効用も有する。作用機構についての研究により、苦丁茶冬青の葉のサポニンによる血中脂質低下の機構は次の通りであることが示された：苦丁茶冬青の葉のサポニンは、腸管および肝臓でのアシル補酵素Ａコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）の活性を阻害することができ、その結果として、腸管でのコレ
ステロールの吸収は抑制され得る。

【0019】

以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態を詳細に記載する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、実施例１で調製したサンプルＡ１の高速液体クロマトグラムである。

【図2】図２は、比較例１で調製したサンプルＣ１の高速液体クロマトグラムである。

【図3】図３は、比較例２で調製したサンプルＣ２の高速液体クロマトグラムである。

【図4】図４は、比較例３で調製したサンプルＣ３の高速液体クロマトグラムである。

【図5】図５は、ＡｐｏＥ−／−マウス血漿中の総コレステロールレベルに対する、苦丁茶冬青の総サポニンの効果を示す。

【図6】図６は、ＡｐｏＥ−／−マウス血漿中のＭＤＡレベルに対する、苦丁茶冬青の総サポニンの効果を示す。

【図7】図７は、アテローム性動脈硬化症に対する、苦丁茶冬青の総サポニンの効果を示す。

【図8】図８は、糞便における総コレステロール含量に対する、苦丁茶冬青の総サポニンの効果を示す。

【図9】図９は、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＡＣＡＴ２ ｍＲＮＡの発現に対する、苦丁茶冬青の総サポニンの効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

具体的な実施形態と合わせて本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施形態は単に本発明を例示するために用いるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施形態に記載している様々な百分率濃度のエタノールは、対応する体積百分率濃度のエタノール水溶液を意味することに留意されたい。

【0022】

実施例１
本実施例を用いることにより、本発明において提供される、苦丁茶冬青の葉の抽出方法を説明する。

【0023】

抽出：苦丁茶冬青の医療用材料０．５ｋｇを秤量し、次に、６０％エタノール５Ｌを用いて０．５時間、６０％エタノール４Ｌを用いて１時間それぞれ還流抽出を行い、濾過後に濾液を合わせた。

【0024】

エタノールの除去：抽出した濾液を、アルコールがなくなるまで減圧下で濃縮して、エタノールを回収した。その際、濃縮した溶液の相対密度は１．０６〜１．０８であった（室温）。

【0025】

吸着：濃縮した溶液をＨＰＤ４００Ａ多孔質樹脂カラムに適用し、溶離剤を樹脂カラムに再度３回流し込んだ。その際、樹脂カラムには樹脂５ｋｇを充填し、樹脂カラムの直径と長さの比は１：４である。流し込みを行ったカラムは３０分間静置した。

【0026】

不純物の洗浄：糖類が検出されなくなるまでカラム体積の４倍量の脱イオン水で樹脂カラムから溶出させ、次に、カラム体積の８倍量の２０％アルカリ性エタノール（ＮａＯＨ、ｐＨ＝１０）で溶出させ、さらに、中性になるまでカラム体積の３倍量の２０％エタノールで溶出させた。

【0027】

溶出：樹脂に吸着した抽出物をカラム体積の６倍量の６０％エタノールでさらに溶出させた。

【0028】

濃縮および乾燥：溶出液を減圧下で濃縮してエタノールを回収し、その後、真空乾燥させた。乾燥させた固体を粉砕し、１００メッシュのスクリーンで選別し、苦丁茶冬青の葉の抽出物６５．３５ｇを得た。この抽出物をＡ１と示し、抽出収率は１３．０７％であった。

【0029】

実施例２
本実施例を用いることにより、本発明において提供される、苦丁茶冬青の葉の抽出方法を説明する。

【0030】

抽出：苦丁茶冬青の医療用材料０．５ｋｇを秤量し、次に、６５％エタノール４Ｌを用いて２時間、６０％エタノール３Ｌを用いて１時間、５０％エタノール３Ｌを用いて０．５時間それぞれ還流抽出を順次行い、濾過後に濾液を合わせた。

【0031】

エタノールの除去：抽出した濾液を、アルコールがなくなるまで減圧下で濃縮して、エタノールを回収した。その際、濃縮した溶液の相対密度は１．０６〜１．０８であった（室温）。

【0032】

吸着：濃縮した溶液をＡＢ−８多孔質樹脂カラムに付した。その際、樹脂カラムには樹脂３．５ｋｇを充填し、樹脂カラムの直径と長さの比は１：８である。

【0033】

不純物の洗浄：糖類が検出されなくなるまでカラム体積の８倍量の脱イオン水で樹脂カラムから溶出させ、次に、カラム体積の１０倍量の３０％アルカリ性エタノール（ＮａＯＨ、ｐＨ＝１０．５）で溶出させ、さらに、中性になるまでカラム体積の４倍量の３０％エタノールで溶出させた。

【0034】

溶出：樹脂に吸着した抽出物をカラム体積の３倍量の６５％エタノールでさらに溶出させた。

【0035】

濃縮および乾燥：溶出液を減圧下で濃縮し、その後、真空乾燥させ、乾燥させた固体を粉砕し、１００メッシュのスクリーンで選別し、苦丁茶冬青の葉の抽出物５０．３１ｇを得た。この抽出物をＡ２と示し、抽出収率は１０．０６％であった。

【0036】

比較例１
本比較例を用いることにより、不純物洗浄ステップでの溶出を水のみ用いて行った、苦丁茶冬青の葉の抽出方法を説明する。

【0037】

抽出、エタノール除去および吸着のプロセスは、実施例１と同じ方法を用いることにより行った。

【0038】

不純物の洗浄：糖類が検出されなくなるまでカラム体積の４倍量の脱イオン水で樹脂カラムから溶出させた。

【0039】

溶出：樹脂に吸着した抽出物をカラム体積の４倍量の６０％エタノールでさらに溶出させた。

【0040】

濃縮および乾燥：溶出液を減圧下で濃縮し、その後、真空乾燥させ、乾燥させた固体を
粉砕し、１００メッシュのスクリーンで選別し、苦丁茶冬青の葉の抽出物１５０ｇを得た。この抽出物をＣ１と示し、抽出収率は３０．００％であった。

【0041】

比較例２
本比較例を用いることにより、不純物洗浄ステップでの溶出を水とエタノールのみ用いて行った、苦丁茶冬青の葉の抽出方法を説明する。

【0042】

抽出、エタノール除去および吸着のプロセスは、実施例１と同じ方法により行った。

【0043】

不純物の洗浄：糖類が検出されなくなるまでカラム体積の４倍量の脱イオン水で樹脂カラムから溶出させ、次に、カラム体積の５倍量の１０％エタノールで溶出させた。

【0044】

溶出：樹脂に吸着した抽出物をカラム体積の４倍量の６０％エタノールでさらに溶出させた。

【0045】

濃縮および乾燥：溶出液を減圧下で濃縮し、その後、真空乾燥させ、乾燥させた固体を粉砕し、１００メッシュのスクリーンで選別し、苦丁茶冬青の葉の抽出物１１０．２３ｇを得た。この抽出物をＣ２と示し、抽出収率は２２．０５％であった。

【0046】

比較例３
本比較例を用いることにより、不純物洗浄ステップでの溶出を水とエタノールのみ用いて行った、苦丁茶冬青の葉の抽出方法を説明する。

【0047】

抽出、エタノール除去および吸着のプロセスは、実施例１と同じ方法により行った。

【0048】

不純物の洗浄：糖類が検出されなくなるまでカラム体積の４倍量の脱イオン水で樹脂カラムから溶出させ、次に、カラム体積の１１倍量の２０％エタノールで溶出させた。

【0049】

溶出：樹脂に吸着した抽出物をカラム体積の４倍量の６０％エタノールでさらに溶出させた。

【0050】

濃縮および乾燥：溶出液(eluent)を減圧下で濃縮し、その後、真空乾燥させ、乾燥させた固体を粉砕し、１００メッシュのスクリーンで選別し、苦丁茶冬青の葉の抽出物１０２．８ｇを得た。この抽出物をＣ３と示し、抽出収率は２０．５６％であった。

【0051】

成分の測定
１．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定
クロマトグラフィーカラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）；
流速：０．８ｍｌ／分；
検出波長：２２６ｎｍ；
カラム温度：３０℃；
移動相：アセトニトリル−０．１％リン酸溶液、勾配溶出；
溶出条件を表１に示す：

【0052】

【表1】

【0053】

図１は、実施例１で調製したサンプルＡ１のクロマトグラムであり、図２は、比較例１で調製したサンプルＣ１のクロマトグラムであり、図３は、比較例２で調製したサンプルＣ２のクロマトグラムであり、図４は、比較例３で調製したサンプルＣ３のクロマトグラムである。図１〜図４において、スペクトルピークＫｃ、ＫａおよびＫｄはそれぞれ、苦丁茶冬青の３つの主要なサポニン［イレクジノシドＣ（ＫＤＣ−Ｃ）、イレクジノシドＡ（ＫＤＣ−Ａ）およびイレクジノシドＤ（ＫＤＣ−Ｄ）］を示しており；スペクトルピークＩａ、ＩｂおよびＩｃはそれぞれ、３つのイソクロロゲン酸成分（イソクロロゲン酸Ｂ、イソクロロゲン酸Ａおよびイソクロロゲン酸Ｃ）を示している。

【0054】

実施例１および実施例２で調製したサンプルＡ１およびＡ２、ならびに比較例１、比較例２および比較例３で調製したサンプルＣ１、Ｃ２およびＣ３についてのＨＰＬＣ検出結果を表２に挙げた。

【0055】

【表2】

【0056】

図１〜図４の結果と表２のデータの比較により、水および／または低濃度のエタノールを用いた場合にはイソクロロゲン酸(isocholrogenic acids)成分は除去されないが、一方、溶出を行うために低濃度のアルカリ性エタノールを用いた場合にはイソクロロゲン酸(isocholrogenic acids)成分は除去され、結果として、高純度の総サポニンを含有する苦丁茶冬青抽出物を得ることができることが分かる。

【0057】

２．ＵＶ吸収による総サポニンの測定
抽出物約１０ｍｇを正確に秤量し（合計３バッチ）、次に、２５ｍｌメスフラスコに入れ、メタノールで定容に希釈し、その後、０．８ｍｌ溶液を正確に計量し、１０ｍｌガラス製共栓試験管に移し、水浴中８０℃で蒸発乾固させ、３バッチのサンプルを得た。イレクジノシドＡ（０．５３５ｍｇ／ｍｌ）を標準溶液として用い、０．１ｍＬ、０．２ｍＬ
および０．４ｍＬの標準溶液それぞれを１０ｍｌガラス製共栓試験管に移し、水浴中８０℃で蒸発乾固させた。

【0058】

バニリン０．１ｇを秤量し、１０ｍｌガラス製共栓試験管に入れ、そのガラス製試験管に氷酢酸２ｍｌを加え、次に、バニリンが溶解したらそのガラス製試験管に過塩素酸８ｍｌを加え、その後、混合物を振盪し、その結果として、金色発色物質を得た。

【0059】

その後、発色物質１ｍｌを、乾燥サンプルの入ったガラス製試験管と標準サンプルの入ったガラス製試験管それぞれに入れた。それらのガラス製試験管を水浴中６０℃で１５分間加熱したらすぐに冷却し、次に、上記ガラス製試験管に氷酢酸５ｍｌを加え、その後、混合物を振盪した後ＵＶ吸収値を５３８ｎｍで検出した。

【0060】

実施例１および実施例２で調製したサンプルＡ１およびＡ２、ならびに比較例１、比較例２および比較例３で調製したサンプルＣ１、Ｃ２およびＣ３についての総サポニン含量の測定結果を表３に挙げる。

【0061】

【表3】

【0062】

表３に示したデータを比較することにより、サンプルＡ１およびＡ２の総サポニン含量は、サンプルＣ１、Ｃ２およびＣ３の総サポニン含量よりも著しく高いことが分かる。これにより、総サポニン含量は不純物を除去することによって大幅に増加し得ることが示される。しかしながら、ＵＶ法による含量測定に一部誤りがあることが分かった。例えば、ＵＶ法により測定したサンプルＣ２およびＣ３中の総サポニン含量は高いが、ＨＰＬＣ検出によりサンプルＣ２およびＣ３中にまだ多量のイソクロロゲン酸が存在することが分かった。これは、氷酢酸−バニリン比色定量は特異度が低く、グリコシドに類似した多くの化合物が全て上記呈色反応を示し、その結果、測定結果が不正確なものとなることが理由である。

【0063】

有効性試験
実施例１で調製した、苦丁茶冬青の葉の抽出物の治療効果を検証するために、次の実験を行った。

【0064】

ＡｐｏＥ−／−マウスを体重により無作為に４群に分けた。
（１）陰性対照群（ＣＧ）：この群のマウスには通常の食餌を７週間与え、生理食塩水を胃内投与した。
（２）高脂肪対照群（ＨＧ）：この群のマウスには０．２％コレステロールを含有する高脂肪食を７週間与え、同時に毎日生理食塩水を胃内投与した。
（３）アトルバスタチン（Ａｔｏｒ）治療群（ＡＧ）：この群のマウスには高脂肪食を１週間与え、その後、毎日６週間アトルバスタチン（５０ｍｇ／ｋｇ／日）を胃内投与し
、同時に連続して高脂肪食を与えた。
（４）苦丁茶冬青総サポニン治療群（ＳＧ）：治療過程はＡＧの場合と同様であるが、ＳＧとＡＧとでは、苦丁茶冬青の総サポニンの用量が３００ｍｇ／ｋｇ／日であるという点のみ異なる。

【0065】

１．血漿中の総コレステロール（ＴＣ）レベルに対する、苦丁茶冬青の葉の総サポニンの効果
ＡｐｏＥ−／−マウス血漿中の総コレステロール（ＴＣ）レベルに対する、苦丁茶冬青の葉の総サポニンの効果を図５に示している。ＡｐｏＥ−／−マウスに高脂肪食を１週間与えた後、血漿中のＴＣレベルは３００〜４００ｍｇ／ｄＬから約８００ｍｇ／ｄＬまで上昇し、その結果、高コレステロール血症が生じ、その後、マウスに薬物を胃内投与した。結果は、ＨＧのマウスと比べ、全ての投与群でマウスの血漿ＴＣレベルが低下していることを示した。ＡＧ群およびＳＧ群のマウスの血漿ＴＣレベルは双方３０％〜３５％低下しており、それら２群の有効性は実質的に同じであり、有意差はない。薬物の有効性は６週間持続し、安定に保たれた。

【0066】

２．血漿マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）レベルに対する、苦丁茶冬青の葉の総サポニンの効果
図６に示されるように、ＡｐｏＥ−／−マウスの血漿ＭＤＡレベルは苦丁茶冬青の葉の総サポニンの影響を受けた。マウスに毎日高脂肪食を与えたため、６週間投与後のＨＧ群のマウスの血漿ＭＤＡレベルは、投与前のマウスのレベルの約５倍を超えていた。ＨＧ群のマウスと比べて、ＡＧ群およびＳＧ群のマウスでの血漿ＭＤＡレベルの上昇は投与２週目（Ｗ２）以降に大幅に抑制され、有効性は投与終了まで保たれた。ＡＧ群のマウスの血漿ＭＤＡレベルは投与４週目（Ｗ４）以降に上昇し始め、投与６週目（Ｗ６）に１６．５ｎｍｏｌ／Ｌに達し、この値は、投与前のマウスのレベルよりほぼ１．５倍高い値であった。しかしながら、ＳＧ群のマウスの血漿ＭＤＡレベルは投与開始から実験終了までほとんど上昇しなかった。上記結果は、アトルバスタチンと苦丁茶冬青の葉のサポニンは双方とも血漿脂質の酸化を抑制することができることを示しているが、ＳＧ群のマウスの血漿ＭＤＡレベルの上昇は投与５週目（Ｗ５）以降も苦丁茶冬青の葉の総サポニンによってＡＧ群のマウスよりはるかに効果的に抑制され、それら２群の間での有効性の差は有意であった。

【0067】

３．動脈硬化症に対する、苦丁茶冬青の葉の総サポニンの効果
ＡｐｏＥ−／−マウス大動脈流出路の動脈硬化部位に対する、苦丁茶冬青の葉の総サポニンの効果を図７に示している。ＣＧ群とＨＧ群との間に有意差があり（ｐ＜０．０５）、そのモデルは成功したことが示される。また、ＳＧ群およびＨＧ群との間と、ＡＧ群とＨＧ群との間にも有意差があり（ｐ＜０．０１）、アトルバスタチンと苦丁茶冬青の葉の総サポニンは双方とも大動脈流出路のアテローム斑形成を有意に抑制することができ、抑制率が約４０％に達することが示される。

【0068】

４．糞便中の総コレステロール含量に対する、苦丁茶冬青の葉の総サポニンの効果
苦丁茶冬青の葉の総サポニンによる血漿コレステロール低下についての考えられる機構を調査するために、ＡｐｏＥ−／−マウス糞便中の総コレステロール含量を測定し、マウスにおけるコレステロール吸収に対する薬物の効果を判定した。図８に示されるように、ＳＧ群とＣＧ群との間に有意差があり（^#Ｐ＜０．０５）、ＳＧ群とＨＧ群との間にも有意差がある（^*Ｐ＜０．０５）。結果は、マウスにおけるコレステロールの排泄は、マウスに高コレステロール食を与えた後に７５％増加し、それはＣＧ群のマウスの場合と有意に異なることを示している。ＳＧを投与したマウスの糞便中へのコレステロールの排泄は
ＨＧ群のマウスと比べて約４０％増加し、これら２群の間での差は有意であった。

【0069】

５．Ｃａｃｏ−２細胞における肝臓ＡＣＡＴ２ ｍＲＮＡの発現に対する、苦丁茶冬青の葉の総サポニンの効果
これまでの調査は、苦丁茶冬青の葉の総サポニンはコレステロールの排泄を増加させ、小腸でのＴＣ含量を低下させることができることを示したため、関連遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを検出した。結果によれば、ＡＣＡＴ２のｍＲＮＡの発現レベルは苦丁茶冬青の葉の総サポニンの影響を受けることが示され、その結果は図９に示している。図９では、ＴＳは苦丁茶冬青の総サポニンを表し、Ａｔｏｒはアトルバスタチンを表している。ＣＧとの比較では有意差がある（^#ｐ＜０．０５）。結果から、１０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの総サポニンそれぞれによりＡＣＡＴ２のｍＲＮＡ発現は５０％低下したことが認められ、それはＣＧ群の場合と有意に異なる。しかしながら、苦丁茶冬青の総サポニンは他のスクリーニングされた遺伝子の発現に対して全く効果がなかった。この調査によれば、苦丁茶冬青の葉の総サポニンによる血中脂質低下の機構は、苦丁茶冬青の葉の総サポニンが腸管および肝臓でのＡＣＡＴの活性を阻害し、その結果として、腸管でのコレステロールの吸収が抑制され得ることにより、血中脂質を低下させ得るという機構であり得ることが示される。

【0070】

有効性検出の結果から、本発明により調製された、苦丁茶冬青の葉の抽出物は、コレステロールおよび血中脂質の低下ならびにアテローム性動脈硬化症の抑制に対して重要な効果を有し、スタチン系薬剤と類似した効果を有することが分かる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】