特許 5956916 抗炎症剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5956916

(24)【登録日】2016年6月24日

(45)【発行日】2016年7月27日

(54)【発明の名称】抗炎症剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/12 20060101AFI20160714BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20160714BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160714BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/12

   A61P29/00

   A61P43/00 105

【請求項の数】6

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2012-255386(P2012-255386)

(22)【出願日】2012年11月21日

(65)【公開番号】特開2014-101329(P2014-101329A)

(43)【公開日】2014年6月5日

【審査請求日】2015年9月29日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】桑野 哲矢

(72)【発明者】

【氏名】渡邊 学

(72)【発明者】

【氏名】村瀬 孝利

【審査官】 山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−１２０７２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−１０６０１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−１０６０１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−２８２６３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−１０６０１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Organic Chemistry，１９６１年，Vol.26，p2561-2563

【文献】 Chemical Research in Toxicology，２００８年，Vol.21，p1484-1494

【文献】 Biological and Pharmaceutical Bulletin，２００７年，Vol.30, No.8，p1450-1455

【文献】 Archives of Pharmacal Research，２０１１年，Vol.34, No.3，p437-442

【文献】 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，２００９年，Vol.19，p1650-1653

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記一般式で示されるメトキシカルコンを有効成分とする抗炎症剤。

【化1】

（上式中、Ｒ¹、Ｒ²は各々水素原子又はメチル基を表す。）

【請求項2】

メトキシカルコンが、４’−ヒドロキシ−３，４，２’，６’−テトラメトキシカルコン、又は４’，６’−ジヒドロキシ−３，４，２’−トリメトキシカルコンである請求項１に記載の抗炎症剤。

【請求項3】

下記一般式で示されるメトキシカルコンを有効成分とする炎症性サイトカイン発現抑制剤。

【化2】

（上式中、Ｒ¹、Ｒ²は各々水素原子又はメチル基を表す。）

【請求項4】

メトキシカルコンが、４’−ヒドロキシ−３，４，２’，６’−テトラメトキシカルコン、又は４’，６’−ジヒドロキシ−３，４，２’−トリメトキシカルコンである請求項３に記載の炎症性サイトカイン発現抑制剤。

【請求項5】

下記一般式で示されるメトキシカルコンを有効成分とするプロスタグランジン産生抑制剤。

【化3】

（上式中、Ｒ¹、Ｒ²は各々水素原子又はメチル基を表す。）

【請求項6】

メトキシカルコンが、４’−ヒドロキシ−３，４，２’，６’−テトラメトキシカルコン、又は４’，６’−ジヒドロキシ−３，４，２’−トリメトキシカルコンである請求項５に記載のプロスタグランジン産生抑制剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は炎症性サイトカイン発現、プロスタグランジン産生を抑制し、抗炎症作用を有する薬剤に関する。

【背景技術】

【0002】

病原菌などの侵入時は、ＩＬ−１βやＴＮＦαなどの炎症性サイトカインが産生され、プロスタグランジンＥ₂（ＰＧＥ₂）などの炎症性メディエーターを誘導し、血管透過性の亢進や白血球の浸潤により、病原菌の増殖が抑制される。このように適正な炎症反応は生体防御に重要な働きを示す一方で、過剰な炎症反応は、自己組織の損傷をもたらし、発熱、腫脹、赤味、痛みを増悪させる。

【0003】

炎症性サイトカインの産生を抑制する薬剤としてステロイド系抗炎症剤が知られているが、この薬剤は高い抗炎症作用を有する一方、免疫機能低下、日和見感染、副腎機能低下などの副作用がある。そのためステロイド系抗炎症剤は長期間の使用ができないという欠点がある。また、非ステロイド系抗炎症剤は緩和な抗炎症作用を示す場合が多く、全ての炎症について十分な効果を示すとは限らない。そこで、副作用が少なく、抗炎症作用に優れた素材の開発が求められている。

【0004】

一方、カルコンは果物や野菜、お茶などに含まれる天然成分であり、カルコン及びそのメチル置換体の中には抗バクテリア性、抗菌性、抗腫瘍性、抗炎症性などを有する化合物が知られている（特許文献１〜４、非特許文献１）。
しかしながら、カルコンにおいて３，４−ジメトキシカルコンに、炎症性サイトカイン発現抑制及びプロスタグランジン産生抑制をし、抗炎症作用があることは、これまで知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００８−１２０７２０号公報

【特許文献2】国際公開第２００７／０５２３３０号

【特許文献3】特開２００７−１８９８号公報

【特許文献4】特表２００３−５２８８４２号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】European Journal of Medicinal Chemistry 42 (2007) 125-137

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、炎症性サイトカイン発現抑制作用及びプロスタグランジン産生抑制作用が十分に強く、抗炎症剤として有用な新規な抗炎症剤を提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、下記一般式（１）で示されるメトキシカルコンが、プロスタグランジン産生抑制及び炎症性サイトカイン発現抑制作用、更には紫外線誘導の炎症性サイトカイン発現抑制作用を有し、抗炎症剤として有用であることを見出した。

【0009】

すなわち本発明は、以下の１）〜３）に係るものである。
１）下記一般式（１）で示されるメトキシカルコンを有効成分とする抗炎症剤。
２）下記一般式（１）で示されるメトキシカルコンを有効成分とする炎症性サイトカイン発現抑制剤。
３）下記一般式（１）で示されるメトキシカルコンを有効成分とするプロスタグランジン産生抑制剤。

【0010】

【化1】

（上式中、Ｒ¹、Ｒ²は各々水素原子又はメチル基を表す。）

【発明の効果】

【0011】

本発明の抗炎症剤、炎症性サイトカイン発現抑制剤及びプロスタグランジン産生抑制剤は、ＴＮＦαなどの炎症性サイトカイン発現、及びＩＬ−１β誘導ＰＧＥ₂等のプロスタグランジン産生を抑制することができる。その結果、例えば皮膚への紫外線暴露によって生じる、紅斑、浮腫などの皮膚炎、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾癬など各種皮膚炎症の抑制に有効である。また、本発明の抗炎症剤、炎症性サイトカイン発現抑制剤及びプロスタグランジン産生抑制剤は、皮膚炎に限らず、気管支炎、喘息、アレルギー性鼻炎、通風、腎炎、大腸炎、関節炎、歯周病、花粉症、自己免疫疾患、肥満に伴う慢性炎症などの予防及び治療に広く用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ＩＬ−１β誘導プロスタグランジン産生抑制を測定した結果を示す図である。

【図2】ＩＬ−１β誘導炎症性サイトカイン発現抑制を測定した結果を示す図である。

【図3】ＵＶＢ誘導炎症性サイトカイン発現抑制を測定した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本明細書において、「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわちヒトを手術、治療又は診断する方法を含まない概念である。

【0014】

本発明の抗炎症剤、炎症性サイトカイン発現抑制剤又はプロスタグランジン産生抑制剤の有効成分は、上記一般式（１）で表されるメトキシカルコン（以下、単に「メトキシカルコン」とも称する）である。一般式（１）中のＲ¹、Ｒ²は各々水素原子又はメチル基を表し、好ましくは下記に示すように、Ｒ¹、Ｒ²がメチル基である４’−ヒドロキシ−３，４，２’，６’−テトラメトキシカルコン（式（２）、Ｒ¹がメチル基、Ｒ²が水素原子である４’，６’−ジヒドロキシ−３，４，２’−トリメトキシカルコン（式（３）、Ｒ¹、Ｒ²が水素原子である２’，４’，６’−トリヒドロキシ−３，４−ジメトキシカルコン式（４）が挙げられる。好ましくは、４’−ヒドロキシ−３，４，２’，６’’−テトラメトキシカルコン、及び４’，６’−ジヒドロキシ−３，４，２’−トリメトキシカルコンである。これらの化合物は１種単独又は２種以上の化合物を用いてもよい。

【0015】

【化2】

【0016】

【化3】

【0017】

【化4】

【0018】

本発明で用いられる上記メトキシカルコンは、特に限定されないが、例えば食品添加物等で知られるメチルヘスペリジンの糖部を酸加水分解したものを精製、又はアセトフェノン類とベンズアルデヒド類のアルドール縮合反応等の製法で得ることができる（崎浴、日本化學雑誌、１９５８、７９（６）、７３６−７４０参照）。

【0019】

後記実施例に示す通りメトキシカルコンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価系において、ＩＬ−１β誘導ＰＧＥ₂産生抑制作用、及びＴＮＦαなどの炎症性サイトカイン発現抑制作用を有する。特に４’−ヒドロキシ−３，４，２’，６’−テトラメトキシカルコン、及び４’，６’−ジヒドロキシ−３，４，２’−トリメトキシカルコンは、強いＩＬ−１β誘導ＰＧＥ₂産生抑制作用、及び炎症性サイトカイン発現作用を有する。

【0020】

ここでプロスタグランジンＥ₂（ＰＧＥ₂）は、その産生を介して、ブラジキニンの発痛作用や血管透過性亢進作用、及びブラジキニンやヒスタミンによる炎症性滲出を増強する。よって、プロスタグランジンＥ₂の産生の抑制や、ＴＮＦαなどの炎症性サイトカインの作用を抑えることで、炎症反応を抑制することができる。

【0021】

従って、上記メトキシカルコンは、各種炎症の抑制、例えば紫外線暴露によって誘発される皮膚の炎症を抑制するための医薬品、医薬部外品、化粧品、サプリメント、食品又は飼料として、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤として有用である。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。

【0022】

すなわち、上記メトキシカルコンは、抗炎症剤、プロスタグランジン産生抑制剤、又は炎症性サイトカイン産生抑制剤として使用することができ、更にこれらの剤を製造するために使用することができる。

【0023】

上記医薬品（医薬部外品又はサプリメントも含む）の剤型は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、静脈内注射剤、筋肉注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤、湿布剤、バップ剤、軟膏、ローション、クリーム、チンキ剤、リニメント剤、懸濁液、ローション、バップ、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル又はオイル剤、口腔用製剤（歯磨剤、液状歯磨剤、洗口液、歯肉マッサージクリーム、口腔用軟膏、うがい用錠剤、トローチ、のど飴等）等のいずれかでもよい。医薬品、医薬部外品、或いはサプリメントとして用いる場合の投与形態としては、例えば経口投与非経口投与、又は局所投与などいずれの経路によっても使用することができる。炎症標的部位は皮膚、大腸、関節、口腔、その他各種臓器いずれであってもよい。

【0024】

このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、上記メトキシカルコンを単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤、浸透圧調整剤、流動性促進剤、吸収助剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定化剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、湿潤剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、固着剤、香料、被膜剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
また、当該製剤には既知の薬効成分を適宜配合することもできる。斯かる成分としては、例えば、ビタミンＣ、Ｅなどビタミン類、アミノ酸やペプチド及びその誘導体、核酸及びその誘導体、糖類及びその誘導体、その他、カロチノイド、大豆イソフラボン、カテキン類、クロロゲン酸等の抗酸化剤等が挙げられる。

【0025】

上記製剤における、メトキシカルコンの含有量は、製剤全質量において、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上である。そして、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは６０質量％以下である。好ましくは０．００１〜９０質量％、より好ましくは０．０１〜６０質量％である。

【0026】

上記メトキシカルコンを医薬品として、或いは医薬品に配合して使用する場合の投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、メトキシカルコンとして好ましくは０．００１ｇ以上、特に好ましくは０．０１ｇ以上である。そして好ましくは１０ｇ以下、特に好ましくは３ｇ以下である。好ましくは０．００１〜１０ｇ、特に好ましくは０．００１〜１００ｇである。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。

【0027】

上記メトキシカルコンを医薬部外品や化粧品として用いる場合は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料等の態様とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の医薬部外品や化粧料は、上記メトキシカルコンを単独で、又は、その効果に影響を与えない範囲で、医薬部外品、皮膚化粧料、洗浄料等に配合されうる各種成分、薬効成分等を配合して調整することができる。例えば各種油剤、樹脂、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、ｐＨ調整剤、色素、粉体、香料、可溶化剤、洗浄剤、植物抽出物、ヒアルロン酸ナトリウム等の保湿成分、皮膚老化防止剤、美白剤等を適宜組み合わせることにより調製することができる。

【0028】

上記製剤における、全量中のメトキシカルコンの含有量は、通常好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上、更に好ましくは０．０１質量％以上である。そして好ましくは２０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下、更に好ましくは５質量％以下である。また好ましくは０．０００１〜２０質量％、より好ましくは０．００１〜１０質量％、更に好ましくは０．０１〜５質量％である。

【0029】

上記メトキシカルコンを含む各種食品には、一般飲食品のほか、例えば、紫外線によって生じる、皮膚の紅斑や浮腫、しわやたるみの形成、しみやそばかすの形成、皮膚の弾力性の低下、等の皮膚のダメージを軽減又は抑制するといった抗炎症に伴う効果をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した美容食品、病者用食品、栄養機能食品又は特定保健用食品等の機能性食品が包含される。

【0030】

食品の形態は、固形、半固形又は液状であり得る。食品の例としては、パン類、麺類、クッキー等の菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、でんぷん加工製品、加工肉製品、その他加工食品、コーヒー飲料等の飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等、及びそれらの原料が挙げられる。また、上記の経口投与製剤と同様、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。

【0031】

斯かる食品は、メトキシカルコンの他、他の飲食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤、固着剤、分散剤、湿潤剤等を適宜組み合わせて配合し、調製することができる。

【0032】

また、各種ビタミン類、アミノ酸やペプチド及びその誘導体、核酸及びその誘導体、糖類及びその誘導体、その他、カロチノイド、大豆イソフラボン、カテキン類、クロロゲン酸等の抗酸化成分等も適宜配合することができる。
飲食品中におけるメトキシカルコンの含有量は、その使用形態により異なるが、通常好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。そして好ましくは５０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。また好ましくは０．０００１〜５０質量％であり、より好ましくは０．００１〜１０質量％である。

【0033】

飼料としては、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等の飼料等が挙げられ、上記食品と同様の形態に調製できる。

【0034】

当該食品又は飼料中における上記メトキシカルコンの含有量は、一般的に好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。そして、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。好ましくは０．０００１〜１０質量％、より好ましくは０．００１〜質量％である。

【0035】

上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞上記一般式（１）で示されるメトキシカルコンを有効成分とする抗炎症剤。
＜２＞上記一般式（１）で示されるメトキシカルコンを有効成分とする炎症性サイトカイン産生抑制剤。
＜３＞上記一般式（１）で示されるメトキシカルコンを有効成分とするプロスタグランジン産生抑制剤。
＜４＞紫外線暴露により誘発される炎症を軽減又は抑制する＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の剤。
＜５＞抗炎症剤を製造するための、上記一般式（１）で示されるメトキシカルコンの使用。
＜６＞炎症性サイトカイン産生抑制剤を製造するための、上記一般式（１）で示されるメトキシカルコンの使用。
＜７＞プロスタグランジン産生抑制剤を製造するための、上記一般式（１）で示されるメトキシカルコンの使用。
＜８＞抗炎症に使用するための、上記一般式（１）で示されるメトキシカルコン。
＜９＞炎症性サイトカイン産生抑制に使用するための、上記一般式（１）で示されるメトキシカルコン。
＜１０＞プロスタグランジン産生抑制に使用するための、上記一般式（１）で示されるメトキシカルコン。
＜１１＞非治療的使用である、＜８＞〜＜１０＞のいずれかに記載の使用。
＜１２＞上記一般式（１）で示されるメトキシカルコンを、ヒト若しくは動物に投与する抗炎症方法。
＜１３＞上記一般式（１）で示されるメトキシカルコンを、ヒト若しくは動物に投与する炎症性サイトカイン産生抑制方法。
＜１４＞上記一般式（１）で示されるメトキシカルコンを、ヒト若しくは動物に投与するプロスタグランジン産生抑制方法。
＜１５＞紫外線暴露により誘発される炎症を軽減又は抑制する＜１２＞〜＜１４＞のいずれかに記載の方法。
＜１６＞非治療的方法である、＜１２＞〜＜１５＞のいずれかに記載の方法。

【実施例】

【0036】

実施例１
〔メトキシカルコンの調製〕
上記製法（崎浴、日本化學雑誌、１９５８、７９（６）、７３６−７４０参照）を用いて、各メトキシカルコンを作成した。

【0037】

（ｉ）４’−ヒドロキシ−３，４，２’，６’−テトラメトキシカルコン及び４’，６’−ジヒドロキシ−３，４，２’−トリメトキシカルコンの調製
メチルヘスペリジン（食品添加物グレード）（商品名等アルプス薬品工業社製）５．０ｇを５０％ＥｔＯＨ２５０ｍＬに溶解させ、濃塩酸１５ｍＬを加え、１６時間、加熱還流した。冷却後、水酸化ナトリウム水溶液で中和した。エバポレーターでエタノールを留去後、酢酸エチルで抽出し、洗浄、乾燥、ろ過、濃縮を経て、粗生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル−メタノール）で分画した。更に、目的の画分を再結晶し、４’−ヒドロキシ−３，４，２’，６’−テトラメトキシカルコン（メトキシカルコン１）１５６ｍｇ、及び４’，６’−ジヒドロキシ−３，４，２’−トリメトキシカルコン（メトキシカルコン２）１１２ｍｇを単離した。

【0038】

（ｉｉ）２’，４’，６’−トリヒドロキシ−３，４−ジメトキシカルコンの調製
２’，４’，６’−トリヒドロキシアセトフェノン・一水和物２．０ｇをＴＨＦ５０ｍＬに溶解させ、０℃に冷却した。そこにジイソプロピルエチルアミン１９ｍＬ及びクロロメチルメチルエーテル３．３ｍＬを加え、室温で９．５時間攪拌した。再び冷却後、水を加え、有機層を酢酸エチルで抽出し、洗浄、ろ過、濃縮を経て、粗生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、２’−ヒドロキシ−４’，６’−ビスメトキシメトキシアセトフェノン１．７ｇを得た。
上記で得た２’−ヒドロキシ−４’，６’−ビスメトキシメトキシアセトフェノン１．１ｇをメタノール２０ｍＬで溶解させ、それにベラトルアルデヒド７２８ｍｇ及び水酸化カリウム２．９ｇを２ｍＬの水に溶かしたものを加え、室温で５５時間攪拌した。その後塩酸で中和し、酢酸エチルで抽出、洗浄、乾燥し、粗生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、６’−ヒドロキシ−３，４−ジメトキシ−２’，４’−ビスメトキシメトキシカルコン１．１ｇを得た。
この６’−ヒドロキシ−３，４−ジメトキシ−２’，４’−ビスメトキシメトキシカルコン１．１ｇをメタノール６０ｍＬに溶解させ、１Ｍ塩酸３０ｍＬを加え、５０分間、加熱還流した。冷却後、水を加えて希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を洗浄、乾燥させ、粗生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、２’，４’，６’−トリヒドロキシ−３，４−ジメトキシカルコン（メトキシカルコン３）５８５ｍｇを得た。

【0039】

試験例１：ＩＬ−１β誘導プロスタグランジン産生抑制効果
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（ＫＵＲＡＢＯ）を１２ｗｅｌｌプレートに播種し、サブコンフルエントになったところで増殖因子を含まない（−）培地に換え、翌日に実験を行った。当該培地を、サンプルの最終濃度が２０μＭになるように調製した（−）培地に交換し、１６時間前処理を行った。その後、ＩＬ−１βを最終濃度が１ｎｇ／ｍＬになるように添加し、２４時間後に細胞上清を回収した。細胞上清中に含まれるＰＧＥ₂量をＰＧＥ₂ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ）にて定量した。その結果を図１に示す。コントロールとしては、ＤＭＳＯを用いた。

【0040】

図１の結果より、ＩＬ−１β刺激によりＰＧＥ₂産生が誘導されるが、メトキシカルコン処理によりその抑制が認められた。特にメトキシカルコン１及びメトキシカルコン２がＰＧＥ₂産生抑制作用を強く示した。

【0041】

試験例２：ＩＬ−１β誘導炎症性サイトカイン発現抑制効果
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（ＫＵＲＡＢＯ）を１２ｗｅｌｌプレートに播種し、サブコンフルエントになったところで増殖因子を含まない（−）培地に換え、翌日に実験を行った。当該培地を、サンプルの最終濃度が２０μＭになるように調製した（−）培地に交換し、１６時間前処理を行った。その後、ＩＬ−１βを最終濃度が１ｎｇ／ｍＬになるように添加し、４時間後に細胞を回収した。その細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡ抽出を行い、細胞抽出ＲＮＡ５００μｇをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりｃＤＮＡを合成し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２０ｎｇ相当量をｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲに供し、ＩＬ−１β誘導炎症性サイトカイン発現抑制を測定した。その結果を図２に示す。なお、目的の遺伝子を特異的に検出するＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プローブはＩＬ１Ｂ （Ｈｓ０１５５５４１０＿ｍ１）、ＴＮＦ（Ｈｓ００１７４１２８＿ｍ１）を用いた。目的遺伝子発現量は内部標準遺伝子ＲＰＬＰ０（Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１）の発現量で補正した。解析には７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。コントロールとしては、ＤＭＳＯを用いた。

【0042】

図２の結果より、ＩＬ−１β刺激によりＩＬ−１β、ＴＮＦαの発現亢進が認められ、メトキシカルコン１及びメトキシカルコン２の処理によってその発現が強く抑制された。

【0043】

試験例３：ＵＶＢ誘導炎症性サイトカイン発現抑制効果
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（ＫＵＲＡＢＯ）を１２ｗｅｌｌプレートに播種し、サブコンフルエントになったところで増殖因子を含まない（−）培地に換え、翌日に実験を行った。当該培地を、サンプルの最終濃度が２０μＭになるように調製した（−）培地に交換し、１６時間前処理を行った。培地をＰＢＳに置き換え、ＵＶＢ（２０ｍＪ；１ｍＷ／ｃｍ²の線量で２０秒間）を照射、再度検体を含む培地に交換し、８時間後に細胞を回収した。細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡ抽出を行い、細胞抽出ＲＮＡ５００μｇをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりｃＤＮＡ合成し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２０ｎｇ相当量をｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲに供し、ＵＶＢ誘導炎症性サイトカイン発現抑制を測定した。その結果を図３に示す。なお、目的の遺伝子を特異的に検出するＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プローブはＩＬ１Ｂ（Ｈｓ０１５５５４１０＿ｍ１）、ＴＮＦ（Ｈｓ００１７４１２８＿ｍ１）を用いた。目的遺伝子発現量は内部標準遺伝子ＡＣＴＢ（Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１）の発現量で補正した。解析には７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。コントロールとしては、ＤＭＳＯを用いた。

【0044】

図３の結果より、ＵＶＢ刺激によりＩＬ−１β、ＴＮＦαの発現亢進が認められ、メトキシカルコン１及びメトキシカルコン２処理によってその発現が抑制された。このことからメトキシカルコン１及びメトキシカルコン２は特に強い抗炎症作用を有すると明らかとなった。

【0045】

実施例２
処方例１：錠剤の調製
下記成分を混合し、常法に従って直径９ｍｍ、重量２００ｍｇの錠剤を調製できる。

【0046】

【表1】

【0047】

処方例２：カプセル剤の調製
下記成分を混合し、常法に従ってカプセル剤を調製できる。

【0048】

【表2】

【0049】

処方例３：顆粒剤の調製
下記成分を混合し、常法に従って顆粒剤を調製できる。

【0050】

【表3】

【0051】

処方例４：クリームの調製
下記成分を混合し、常法に従ってクリームを調製できる。

【0052】

【表4】

【0053】

処方例５：軟膏の調製
下記成分を混合し、常法に従って軟膏を調製できる。

【0054】

【表5】

【図1】

【図2】

【図3】