特許 5957531 変異型ＲＮＡポリメラーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5957531

(24)【登録日】2016年6月24日

(45)【発行日】2016年7月27日

(54)【発明の名称】変異型ＲＮＡポリメラーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160714BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20160714BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20160714BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160714BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20160714BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20160714BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20160714BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12N9/12

   C12Q1/68

【請求項の数】15

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2014-533943(P2014-533943)

(86)(22)【出願日】2012年10月8日

(65)【公表番号】特表2014-528730(P2014-528730A)

(43)【公表日】2014年10月30日

(86)【国際出願番号】EP2012069886

(87)【国際公開番号】WO2013050609

(87)【国際公開日】20130411

【審査請求日】2015年8月11日

(31)【優先権主張番号】1159051

(32)【優先日】2011年10月6日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】304043936

【氏名又は名称】ビオメリュー

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ

(73)【特許権者】

【識別番号】509248165

【氏名又は名称】コミサリア ア レネルジ アトミ−ク エ オ エネルジー アルテルナティヴ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】100174001

【弁理士】

【氏名又は名称】結城 仁美

(74)【代理人】

【識別番号】100181272

【弁理士】

【氏名又は名称】神 紘一郎

(72)【発明者】

【氏名】ジャン−クロード ブーラン

(72)【発明者】

【氏名】ジャニー ダッサ

(72)【発明者】

【氏名】フレデリック ドゥカンセル

(72)【発明者】

【氏名】ブルーノ アシュ ミュラー

(72)【発明者】

【氏名】アラン トロエシュ

(72)【発明者】

【氏名】ローラン メスタ

【審査官】 池上 京子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１１３７１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−２１３４９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２１３４９９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

７４４位で、グルタミン（Ｑ）をアルギニン（Ｑ７４４Ｒ）、ロイシン（Ｑ７４４Ｌ）またはプロリン（Ｑ７４４Ｐ）から選択されるアミノ酸により置換し、変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ。

【請求項2】

変異Ｑ７４４Ｒを含む、請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼ。

【請求項3】

変異Ｆ８４９Ｉ、Ｆ８８０ＹおよびＳ４３０Ｐを含む、請求項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼ。

【請求項4】

変異Ｃ５１０Ｒを含む、請求項３に記載のＲＮＡポリメラーゼ。

【請求項5】

変異Ｓ７６７Ｇを含む、請求項３または４に記載のＲＮＡポリメラーゼ。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子。

【請求項7】

請求項６に記載の遺伝子および適切な発現配列を含む発現ベクター。

【請求項8】

請求項７に記載のベクターで形質転換させた、変異型ＲＮＡポリメラーゼを発現することができる細胞。

【請求項9】

核酸の転写増幅反応における請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼの使用。

【請求項10】

前記核酸の転写増幅反応が核酸の等温転写増幅反応である、請求項９に記載の使用。

【請求項11】

−請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼ、
−逆転写酵素活性を有する酵素
を含む、等温転写増幅反応に用いられる酵素の混合物。

【請求項12】

前記逆転写酵素活性を有する酵素がＲＮＡｓｅＨ活性も有する、請求項１１に記載の酵素の混合物。

【請求項13】

配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの混合物。

【請求項14】

第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド対であって、前記オリゴヌクレオチド対が以下のオリゴヌクレオチド対：
−配列番号：３の第１オリゴヌクレオチドおよび配列番号：４の第２オリゴヌクレオチド、
−配列番号：５の第１オリゴヌクレオチドおよび配列番号：６の第２オリゴヌクレオチド、
−配列番号：７の第１オリゴヌクレオチドおよび配列番号：８の第２オリゴヌクレオチド
から選択される、オリゴヌクレオチド対。

【請求項15】

請求項６に記載の遺伝子を得るための、請求項１３に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの混合物、または請求項１４に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド対の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はバクテリオファージＴ７変異型ＲＮＡポリメラーゼ、およびその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＲＮＡの分子がＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡの二本鎖配列から合成される転写現象は基本的な生物学的メカニズムである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、バクテリオファージＴ７のゲノムによりコードされるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼはそれ自体のプロモーター配列について高度な選択性を示す。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは転写のテンプレートとして作用するＤＮＡ鎖のＴ７プロモーターと特異的に結合する。

【0003】

バクテリオファージＴ７の全ヌクレオチド配列は知られ、ファージのＲＮＡポリメラーゼ（配列番号：１６）はＴ７ポリメラーゼの遺伝子１（配列番号：１）によりコードされる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと同様の他のＲＮＡポリメラーゼはバクテリオファージＳＰ６およびＴ３のＲＮＡポリメラーゼである。Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ＲＮＡポリメラーゼと約８０％の相同性を示す。Ｔ７ポリメラーゼの遺伝子１（配列番号：１）はクローン化し、細菌中で発現させ、大量の酵素の生成を可能にした（Ｓｔｕｉｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第ＵＳ４，９５２，４９６号）。Ｔ７ポリメラーゼは９８．６Ｋｄａの分子量を有する８８３のアミノ酸を持つ単量体タンパク質（配列番号：１６参照）である。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは転写を開始するための追加の要素を必要としない。酵素単独でそのプロモーターを認識し、転写を開始し、ＲＮＡ転写体を延長することができる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはとくに効率的であり、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼより５倍速くＲＮＡを合成する。よって、バクテリオファージのポリメラーゼは転写体の生成におけるそれらの選択性および活性のため非常に有用である（Ｌｕｋａｖｓｋｙ ａｎｄ Ｐｕｇｌｉｓｉ，ＲＮＡ，１０：８８９−８９３，２００４）。

【0004】

Ｔ７型バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼの特異的変異体については、とくにＴ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素メカニズムを理解するため、以前に説明されている（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：２９０８−２９１８，１９９７；Ｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，ＪＭＢ ３７１：４９０−５００，２００７）。特許文献国際公開第ＷＯ９１／０５８６６号は、細菌におけるクローン化遺伝子の転写を制御するＴ７バクテリオファージプロモーターを用いる発現のシステムについて記載する。システムは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼについてコードする遺伝子での１つ以上のヌクレオチド欠失の存在により切断されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる。これらの欠失はリーディングフレームのディフェージングを引き起こし、新たな終止コドンを形成する。米国特許第ＵＳ５，３８５，８３４号も、２２２位におけるグルタミン酸のリシンによる置換により特徴づけられる、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの変異体について記載する。この変異体はＴ７プロモーターの認識の変更を示し、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより通常認識されないＴ７プロモーターの配列変動を認識する可能性をもたらす。

【0005】

Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｉｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：９０７３−９０８０，１９９２およびＩｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０：２５１７−２５２４，１９９２）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの変異型プロモーター配列の認識効率を評価するのに用いることができる、２つの適合性プラスミドの使用について記載した。第１プラスミドは大腸菌ｔａｃプロモーターの制御下のＴ７ＲＮＡポリメラーゼからの遺伝子１を有し、第２プラスミドはＴ７プロモーターの制御下のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子についてコードする遺伝子を有する。これら２つのプラスミドを有する大腸菌細胞は、Ｔ７ポリメラーゼがＴ７プロモーターを認識し、第２プラスミドからＣＡＴ遺伝子を転写する場合、ＣＡＭ（クロラムフェニコール）に耐性である。Ｔ７プロモーターまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼの一方または他方が不活性である場合、ＣＡＴ遺伝子は転写されず、大腸菌細胞はＣＡＭに感性となる。Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．は、Ｔ７プロモーターまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ酵素のいずれかにおける特定の変異の効果を研究するためのこの２プラスミドシステムの使用について記載した。

【0006】

ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）を用いるインビトロ転写は、分子生物学において広く用いられる手段となった（Ｂｅｃｋｅｒｔ ａｎｄ Ｍａｓｑｕｉｄａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏ，７０３：２９−４１，２０１１）。第１用途は大量のＲＮＡ転写体を素早く生成するための手段としてのインビトロ転写単独である。第２用途は核酸増幅メカニズムにおけるＲＮＡポリメラーゼの使用である。これらの方法は、例えば、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲおよびＴＭＡである。インビトロ転写はまた、ＰＣＲによる増幅後の追加の線形増幅ステップであるＰＣＲと組み合わせて記載されている（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３５０（７）：９１−９２，１９９１；Ｄｅｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１６３−１７９，２００２；Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｇｈａｅｍｉ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ，２７：２２４−２４５，２００８）。よって、本発明は診断の分野において好適な用途を有する。

【0007】

上に挙げた用途のすべてについて、より高い増幅温度の使用が有利であり、転写反応のキネティクスを向上させることができる。この利点は等温増幅（ＮＡＳＢＡ、３ＳＲおよびＴＭＡ）についてさらにより顕著であり、よって構造型ＲＮＡ標的の増幅効率を向上させる。転写反応キネティクスの向上が重要である用途は、長いＲＮＡ配列（＞５００ヌクレオチド）および多重反応の増幅に関する。

【0008】

よって、欧州特許文献第ＥＰ−Ｂ−１．１３７．７８１号は、Ｔ７型バクテリオファージ由来であり、高温に対する安定性が増加した、６３３位で変異させたＲＮＡポリメラーゼについて記載する。

【0009】

同様に、欧州特許文献第ＥＰ−Ｂ−１．２６１．６９６号は、場合によっては前述の６３３位での変異と組み合わせた、とくに４３０、８４９または８８０位で変異させた熱安定性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼについて記載する。

【0010】

熱安定性の向上は、多くの場合比活性の低減により特徴づけられ、とくに構造における柔軟性の損失によりもたらされる（Ｄａｎｉｅｌ，Ｒ．Ｍ．Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９（１）：７４−７９，１９９６；Ｅｉｊｓｉｎｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２２：２１−３０，２００５）。この文献に記載される熱安定性変異体は、野生型酵素と比較して大きく低減したＲＮＡ転写体合成の比活性を有する。本発明はこの不利点の解決策も提案する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】米国特許第４，９５２，４９６号

【特許文献2】国際公開第９１／０５８６６号

【特許文献3】欧州特許第１，１３７，７８１号

【特許文献4】欧州特許第１，２６１，６９６号

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｌｕｋａｖｓｋｙ ａｎｄ Ｐｕｇｌｉｓｉ，ＲＮＡ，１０：８８９−８９３，２００４

【非特許文献2】Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：２９０８−２９１８，１９９７

【非特許文献3】Ｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，ＪＭＢ ３７１：４９０−５００，２００７

【非特許文献4】Ｉｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：９０７３−９０８０，１９９２

【非特許文献5】Ｉｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０：２５１７−２５２４，１９９２

【非特許文献6】Ｂｅｃｋｅｒｔ ａｎｄ Ｍａｓｑｕｉｄａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏ，７０３：２９−４１，２０１１

【非特許文献7】Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３５０（７）：９１−９２，１９９１

【非特許文献8】Ｄｅｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１６３−１７９，２００２；Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｇｈａｅｍｉ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ，２７：２２４−２４５，２００８

【非特許文献9】Ｄａｎｉｅｌ，Ｒ．Ｍ．Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９（１）：７４−７９，１９９６

【非特許文献10】Ｅｉｊｓｉｎｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２２：２１−３０，２００５

【発明の概要】

【0013】

本発明による好適な変異型ＲＮＡポリメラーゼは、７４４位のグルタミン（Ｑ）がアルギニン（Ｑ７４４Ｒ）、ロイシン（Ｑ７４４Ｌ）またはプロリン（Ｑ７４４Ｐ）から選択されるアミノ酸により置換された、７４４位で変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。こうした変異は一般式Ｑ７４４Ｘにより表すことができ、式中、Ｘはアルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）またはプロリン（Ｐ）から選択されるアミノ酸である。好適には、Ｘはアルギニン（Ｒ）を表し、７４４位のグルタミン（Ｑ）がアルギニンにより置換されることを示す（Ｑ７４４Ｒ）。

【0014】

１つの特定の実施形態では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、変異Ｑ７４４（Ｑ７４４Ｘ）に加え、以下の変異の少なくとも１つを含む：Ｆ８４９Ｉ（８４９位におけるフェニルアラニンのイソロイシンによる置換）、Ｆ８８０（８８０位におけるフェニルアラニンのチロシンによる置換）、Ｓ４３０Ｐ（４３０位におけるセリンのプロリンによる置換）。

【0015】

驚くべきことに、特定の変異は、野生型ＲＮＡポリメラーゼの比活性と比較して増加した比活性を有する。

【0016】

１つの特定の実施形態では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、変異Ｑ７４４Ｘ、好適にはＱ７４４Ｒ、Ｆ８４９Ｉ、Ｆ８８０ＹおよびＳ４３０Ｐを含む。

【0017】

別の特定の実施形態では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、変異Ｑ７４４Ｘ、好適にはＱ７４４Ｒ、Ｆ８４９Ｉ、Ｆ８８０Ｙ、Ｓ４３０ＰおよびＳ７６７Ｇ（７６７位におけるセリンのグリシンによる置換）を含む。

【0018】

別の特定の実施形態では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、変異Ｑ７４４Ｘ、好適にはＱ７４４Ｒ、Ｆ８４９Ｉ、Ｆ８８０Ｙ、Ｓ４３０ＰおよびＣ５１０Ｒ（５１０位におけるシステインのアルギニンによる置換）を含む。

【0019】

別の特定の実施形態では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、変異Ｑ７４４Ｘ、好適にはＱ７４４Ｒ、Ｆ８４９Ｉ、Ｆ８８０Ｙ、Ｓ４３０Ｐ、Ｃ５１０ＲおよびＳ７６７Ｇを含む。

【0020】

これらの変異型ＲＮＡポリメラーゼは従って、増加した熱安定性および非常に良好なレベルの比活性の両方を示す。実際、７４４位における変異は、熱安定化変異の存在により劣化した特定のレベルの活性を向上させる、または回復させることを可能にする。熱安定性の増加に寄与する他の変異はＫ７１３Ｅ、Ｔ７４５Ｋ、Ｋ３９２Ｍである。

【0021】

熱安定化する、および／または比活性を増加させる変異は、ランダム変異誘発により構築されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体のライブラリーから、抑制変異の選択方法の連関および２プラスミドシステムの使用により、当業者に知られる技術に従って分離された（Ｋｏｔｓｕｋａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７８（３），ｐ．７２３−７２７，１９９６．Ｈｉｒａｎｏ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９，ｐ．１３２８５−１３２９４，２０００；Ｉｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，ｐ．９０７３−９０８０，１９９２；Ｉｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０，ｐ．２５１７−２５２４，１９９２）。

【0022】

本発明は、本発明により変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子にも関する。

【0023】

さらに、本発明は、本発明により変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子および適切な発現配列を含む発現ベクターにも関する。

【0024】

遺伝子を発現させるため、遺伝子は、前記遺伝子によりコードされるタンパク質を発現させることを可能にする制御およびプロモーター配列の制御下に置く。これは一般的には、これら制御およびプロモーター配列の下流に発現させる遺伝子をクローン化することにより行われる。これらの配列はその天然形態の遺伝子と結合したプロモーター配列であってもよい。変異体に応じて、これらは非相同性プロモーターであってもよい。非相同性プロモーターの使用の利点は、それらが遺伝子の天然プロモーターを認識しない宿主細胞において遺伝子を発現させる可能性を提供することである。さらに、非相同性プロモーターは、遺伝子の発現をいずれかの所望の瞬間に刺激することができるような、誘導性のプロモーターであってもよい。

【0025】

プロモーター配列は、転写の開始時、ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列である。プロモーター配列は由来する細胞のタイプによって決まる。プロモーター配列は、原核生物、真核生物およびウィルス由来のプロモーターについて表されている。遺伝子組み換えＤＮＡ分子は、例えば、所定のＤＮＡフラグメントを適切な制限酵素で切断し、制御およびプロモーター配列を含有するフラグメントを同じ酵素で切断し、２つのフラグメントを発現させる核酸配列、すなわち本発明によるＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がプロモーター配列により制御されるように結合することにより得ることができる。有用な組み換え体を生成するための多数の方法はＳａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））に記載されている。

【0026】

一般的には、組み換え核酸配列はいわゆるベクター分子においてクローン化される。こうして形成された組み換えベクター分子は、多くの場合適切な宿主細胞において自己複製でき、クローン化核酸配列を細胞中に移動させるのに用いることができる。これはその内部で組み換えベクター分子の複製が行われる細胞であってもよい。これはまた、その内部でベクターのプロモーターおよび制御配列が本発明により変異させたＲＮＡポリメラーゼが発現するように認識される細胞であってもよい。細菌、例えば、Ｐｂｒ３２２、３２５および３２８に用いるためのベクター、各種ｐＵＣベクター、例えばｐＵＣ８、９、１８、１９、特異的発現ベクター：ｐＧＥＭ、ｐＧＥＸ、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、バクテリオファージ；λ−ｇｔＷｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ２８、Ｍ１３由来ファージをベースとするベクター、ＳＶ４０、パピローマウィルス、アデノウィルスまたはポリオーマウィルスをベースとするウィルス配列を含有する真核生物細胞における、発現ベクターを含む、広範囲のベクターが現在知られている（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｓ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｔ．，ｅｄ；Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ（１９８８），Ｌｅｎｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．；１１０：１−２４（１９９０））。変異型ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にする制御およびプロモーター配列により制御される核酸配列を含む組み換え分子のすべては本発明の一部と考えられる。

【0027】

本発明は、本発明により変異させたＲＮＡポリメラーゼについてコードする核酸配列を含む宿主もしくは形質転換細胞、または変異型ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にする制御およびプロモーター配列により制御される変異型ＲＮＡポリメラーゼについてコードする組み換え核酸の分子をさらに含む。

【0028】

よく用いられる発現システムは、細菌、酵母、真菌、昆虫および哺乳類からの細胞の発現システムである。これらのシステムは当業者に周知であり、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０ Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，９４３０３−４６０７，ＵＳＡから市場で容易に入手可能である。

【0029】

宿主細胞は、ｐＢＲ３２２のような細菌をベースとするベクター、ｐＧＥＸのような細菌発現ベクター、またはバクテリオファージと組み合わせた、例えば大腸菌、枯草菌および乳酸菌種の細菌細胞であってもよい。宿主細胞はまた真核生物由来、例えば、酵母の特異的ベクター分子と組み合わせた酵母細胞、またはベクターもしくは組み換えバキュロウィルスと組み合わせた昆虫細胞のような高等真核生物細胞（Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５（１９８８））、例えば、Ｔｉプラスミドもしくは植物ウィルスベクターをベースとするベクターと組み合わせた植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．；Ｃｅｌｌ ３２：１０３３（１９８３））、同様に適切な組み換えベクターもしくはウィルスと組み合わせた、ヒーラー細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）もしくはクランデルフェリン腎細胞のような哺乳類細胞であってもよい。

【0030】

よって、本発明によるＲＮＡポリメラーゼについてコードする遺伝子ならびに適切な発現プロモーターおよび制御配列を含む発現ベクターも、これらで形質転換させた宿主細胞も、本発明の一部である。

【0031】

本発明による変異型ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼが普通にまたは高温で用いられるすべてのプロセスにおいて用途を有する。本発明によるＲＮＡポリメラーゼの使用は、向上した安定性および特異性が得られるという利点を提供する。

【0032】

本発明による変異型ＲＮＡポリメラーゼは、核酸転写による等温増幅のプロセスにおいてとくに有用である。

【0033】

転写による増幅の技術は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターを含むテンプレートからの複数のＲＮＡコピーの転写を含む。これらの方法で、複数のＲＮＡコピーがＲＮＡポリメラーゼにより認識される機能性プロモーターを含むＤＮＡテンプレートから転写される。前記コピーはさらなる量のＤＮＡテンプレートが得られる標的、等として用いられる。これらの方法はＧｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．により国際特許出願第ＷＯ８８／１０３１５号、およびＢｕｒｇ ｅｔ ａｌ．により国際特許出願第ＷＯ８９／１０５０号に記載されている。転写による等温増幅の技術は、Ｄａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．により欧州特許第ＥＰ−Ｂ−０．３２９．８２２号（ＮＡＳＢＡ法に関する）、Ｇｒｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．により欧州特許第ＥＰ−Ｂ−０．３７３．９６０号、およびＫａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．により欧州特許第ＥＰ−Ｂ−０．４０８．２９５号に記載された。転写増幅反応は熱安定性酵素を用いて行うこともできる。転写増幅は一般的には約３７〜４１℃の温度で行われる。これらの熱安定性酵素はより高温（＞４１℃）で反応を行うことを可能にする。こうした熱安定性方法は東洋紡績の名義で出願された欧州特許第ＥＰ−Ｂ−０．６８２．１２１号に記載されている。

【0034】

欧州特許第ＥＰ−Ｂ−０．３２９．８２２号、第ＥＰ−Ｂ−０．３７３．９６０号および第ＥＰ−Ｂ−０．４０８．２９５号に記載される方法は連続等温方法である。これらの方法では、増幅を行うのに４つの酵素活性を要する：ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ（Ｈ）活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性。これらの活性のいくつかは１つの酵素中で組み合わせることができ、従って、一般的には、２つまたは３つの酵素のみが必要となる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素はＲＮＡテンプレートからＤＮＡを合成する酵素である。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡテンプレートからＤＮＡを合成する。転写増幅反応では、ＡＭＶ（トリ骨髄芽球腫ウィルス）またはＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウィルス）逆転写酵素のような逆転写酵素をこれらの活性に用いることができる。これらの酵素は、ＲＮＡおよびＤＮＡ依存性の両方であり、固有のＲＮａｓｅＨ活性も示すＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。さらに、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮａｓｅＨおよび大腸菌のような、転写増幅反応の反応混合物に添加することができる。

【0035】

転写増幅方法で一般的に用いられるＲＮＡポリメラーゼはＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。よって、複数のＲＮＡコピーの転写に用いられるテンプレートに組み入れられるプロモーターはＴ７プロモーターであることが多い。一般的には、プロモーターを含むテンプレートは標的配列を含む核酸を出発材料として作成される。出発材料中に存在する核酸は一般的にはもっと長い配列の一部として標的配列を含有する。追加の核酸配列は標的配列の３’末端および５’末端上に存在していてもよい。増幅反応は、出発材料中に存在するこの核酸、前述の活性および少なくとも１つだが、一般的には２つのオリゴヌクレオチドを併せて提供する適切な酵素を結合することにより刺激してもよい。これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つはプロモーター配列を含んでいなければならない。

【0036】

転写増幅方法は出発材料が一本鎖ＲＮＡである場合とくに有用であるが、一本鎖または二本鎖ＤＮＡも投入材料として用いてもよい。転写増幅方法が標的配列の３’および５’末端上に追加配列を有する一本鎖ＲＮＡ（「プラス」センス）を有する試料について行われる場合、従来技術において記載されるような方法で適切に用いられるオリゴヌクレオチド対は以下で構成される：
−標的配列の３’末端でのハイブリッド形成が可能な（一般的には「プロモーターオリゴヌクレオチド」と称される）第１オリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドはその５’末端と結合したプロモーターの（好適にはＴ７プロモーターの）配列を有する、第１オリゴヌクレオチド（このオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成部分は出発材料として用いられるＲＮＡプラスのそれと反対の極性を有する）、
−標的配列の３’末端で構成される第２オリゴヌクレオチド（「プライマー」）（このオリゴヌクレオチドはＲＮＡプラスと同じ極性を有する）。

【0037】

（適切な活性の酵素すべてとともに）オリゴヌクレオチド対ならびに必要なリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの十分な供給が反応媒体中に一緒に提供され、適切な条件下（すなわち適切な緩衝液条件下、および適切な温度）に十分な時間保たれる場合、連続および等温増幅反応が起こる。

【0038】

本発明の別の目的は、従って、好適には定方向変異誘発により、本発明により変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を得、従って本発明により変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼを最終的に生成するための、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、または配列番号：８の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドの混合物）に関する。

【0039】

好適には、（プライマーとして使用可能な）上記オリゴヌクレオチドは、対（センスオリゴヌクレオチド／アンチセンスオリゴヌクレオチド）で用いられ、本発明は従って、第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド対に関し、前記オリゴヌクレオチド対は以下のオリゴヌクレオチド対から選択される：
−配列番号：３の第１オリゴヌクレオチドおよび配列番号：４の第２オリゴヌクレオチド（変異Ｑ７４４Ｒを生成するのを可能にする）、
−配列番号：５の第１オリゴヌクレオチドおよび配列番号：６の第２オリゴヌクレオチド（変異Ｑ７４４Ｌを生成するのを可能にする）、
−配列番号：７の第１オリゴヌクレオチドおよび配列番号：８の第２オリゴヌクレオチド（変異Ｑ７４４Ｐを生成するのを可能にする）。

【0040】

好適には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの変異体は、例えば直接ｐＭＲ−７ｃａｓ由来ベクター上での定方向変異誘発により、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、または好適には、本発明による少なくとも１つのオリゴヌクレオチド対を用いることにより構築される。

【0041】

有利なことには、これらの変異体を生成するのに用いられる方法はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｒｅｆ．２００５１８）からのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）キットのプロトコルにより記載されたものであり、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦポリメラーゼを用いて行われる。

【0042】

本発明は、本発明により変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を（好適には定方向変異誘発により）得、従って本発明により変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼを最終的に生成するための、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、または好適には、本発明による少なくとも１つのオリゴヌクレオチド対の使用にも関する。

【0043】

本発明によるＲＮＡポリメラーゼは核酸の増幅の他のプロセスとともに用いることもできる。ポリメラーゼ鎖増幅（ＰＣＲ）では、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、とくにＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が組み入れられたプライマーが用いられることがある。これはＰＣＲ反応のＤＮＡ生成物を形成するＲＮＡの転写を可能にする。ここで再度、本発明によるＲＮＡポリメラーゼを用いることもできる。

【0044】

よって、本発明により提案されるようなＲＮＡポリメラーゼを含む転写等温増幅反応に用いるための酵素、逆転写酵素活性を有する１つの酵素およびＲＮａｓｅＨ活性を有する１つの酵素の混合物も、本発明の一部である。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1A】野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる４１℃でのＮＡＳＢＡ増幅ＨＩＶ１ １．２（５ｃｐ ＶＩＨ１−Ｂ／試験；７つの技術的複製物）である。

【図1B】野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる４７℃でのＮＡＳＢＡ増幅ＨＩＶ１ １．２（２０ｃｐ ＶＩＨ１−Ｂ／試験；７つの技術的複製物）である。

【図1C】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＱ３＋Ｑ７４４Ｒを用いる４１℃でのＮＡＳＢＡ増幅ＨＩＶ１ １．２（２０ｃｐ ＶＩＨ１−Ｂ／試験；７つの技術的複製物）である。

【図1D】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＱ３＋Ｑ７４４Ｒを用いる４７℃でのＮＡＳＢＡ増幅ＨＩＶ１ １．２（２０ｃｐ ＶＩＨ１−Ｂ／試験；７つの技術的複製物）である。

【図1E】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＱ３＋Ｑ７４４Ｒ＋Ｃ５１０Ｒを用いる４１℃でのＮＡＳＢＡ増幅ＨＩＶ１ １．２（２０ｃｐ ＶＩＨ１−Ｂ／試験；７つの技術的複製物）である。

【図1F】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＱ３＋Ｑ７４４Ｒ＋Ｃ５１０Ｒを用いる４７℃でのＮＡＳＢＡ増幅ＨＩＶ１ １．２（２０ｃｐ ＶＩＨ１−Ｂ／試験；７つの技術的複製物）である。

【図1G】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＱ３＋Ｑ７４４Ｒ＋Ｓ７６７Ｇを用いる４１℃でのＮＡＳＢＡ増幅ＨＩＶ１ １．２（２０ｃｐ ＶＩＨ１−Ｂ／試験；７つの技術的複製物）である。

【図1H】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＱ３＋Ｑ７４４Ｒ＋Ｓ７６７Ｇを用いる４７℃でのＮＡＳＢＡ増幅ＨＩＶ１ １．２（２０ｃｐ ＶＩＨ１−Ｂ／試験；７つの技術的複製物）である。

【発明を実施するための形態】

【0046】

本発明について以下の実施例によりさらに例示する。

【実施例】

【0047】

（実施例１：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体の生成および精製方法）
１／組み換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼタンパク質の発現のためのプラスミド構築物
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現プラスミドはベクターｐＭＲ−７ｃａｓの誘導体である（Ａｒｎａｕｄ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｇｅｎｅ １９９：１４９−１５６）。

【0048】

対象の組み換えタンパク質についてコードするＤＮＡ配列をｐＭＲ−７ｃａｓ由来の発現ベクター中ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限部位間に導入した。

【0049】

ポリヒスチジン配列（６×Ｈｉｓ）はＴ７ＲＮＡポリメラーゼのＮ末端位に存在し、金属キレート親和性カラム上で精製することを可能する。これはその後組み換えタンパク質精製ステップを促進することを可能にするＮｉ−ＮＴＡゲル上の結合領域である。このペプチドＨＨＨＨＨＨは配列ＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣ（配列番号：２）によりコードされる。

【0050】

ＮＣＢＩエントリー番号ＮＣ００１６０４により表される配列に対応するＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子１の野生型配列は配列番号：１である。

【0051】

２／Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの単一および複合変異体の生成方法
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの変異体を定方向変異誘発により直接ｐＭＲ−７−ｃａｓ由来ベクター上に構築した。

【0052】

単一および複合変異体を生成するのに用いられる方法は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｒｅｆ．２００５１８）からのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）キットのプロトコルにより記載され、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦポリメラーゼを用いて行われる。

【0053】

変異体Ｑ７４４Ｒ、Ｑ７４４Ｐ、Ｃ５１０ＲおよびＳ７６７Ｇを生成するのに用いられるオリゴヌクレオチドは以下である：

【表1】

【0054】

複合変異体は繰り返しまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ配列のフラグメントの置換により得られる。

【0055】

３／Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの組み換えタンパク質の発現：
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの変異体配列を含むプラスミド構築物を、当業者に知られる従来のプロトコルに従って大腸菌細菌（ＢＬ２１株）を形質転換するのに用いられるｐＭＲ−７−ｃａｓ由来の発現ベクター中に挿入する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−１．７４，１９８９，Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊｏｓｅｐｈ，ＥＦ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）。

【0056】

形質転換された細菌はｐＭＲ−７−ｃａｓ由来のベクターが有するアンピシリンに対するそれらの耐性のために選択される。組み換えタンパク質の生成プロトコルを以下に記載する：
１． コロニーを１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１０ｍＬのルリアブロス（ＬＢ）培地に３０℃で１６時間、２２０ｒｐｍで撹拌しながら接種する（前培養）
２． ３．３ｍＬの前培養物を用い、２００ｍＬのＬＢ培地に播種し、６００ｎｍでの最終ＯＤ０．０７〜０．０９を得る。培地を次に３７℃で撹拌（２２０ｒｐｍ）しながら成長させる
３． 培養の６００ｎｍでのＯＤが０．４〜０．６の値に達したら、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ組み換えタンパク質の過剰発現を最終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘発する。培地を次に４時間３７℃で撹拌（２２０ｒｐｍ）する。

【0057】

４／Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体の精製方法
１． ２００ｍＬの大腸菌培養物を遠心分離（２０分、４℃、６０００ｇ）し、得られたバイオマスを１０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁させる
２． 前述の細胞懸濁液を５回の各３０秒の超音波処理サイクルにより溶解する
３． ステップ［２．］からの溶解物を２２０００ｇで２分間、４℃で遠心分離する
４． 前述の浮遊物を金属キレートカラム上での親和性クロマトグラフィーにより精製する。これを行うため、予め周囲温度の同じ溶解緩衝液でバランスをとった１ｍＬのＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｈｉｓ Ｔｒａｐ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｒｅｆ．１７−５２４７）上に堆積させる。カラムを次に１０ｍＬの同じ緩衝液で洗浄する。組み換えタンパク質の溶出物を、５ｍＬの溶出緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ イミダゾール）を適用し、０．５ｍＬの画分を回収することにより得る
５． 組み換えタンパク質の生成レベルおよび純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０％ゲル上での分析およびクマシーブルーでの染色により制御する
６． 精製されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼタンパク質の濃度の測定を、Ｂｒａｄｆｏｒｄにより記載される方法に従い、ＢｉｏＲａｄからのＢｒａｄｆｏｒｄ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（商標）キットを用いて行う（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．１９７６，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ”，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）。組み換えタンパク質濃度を測定するのに用いられる基準はＢＳＡである
７． 組み換えタンパク質を含有する画分を７ｋＤａのＺｅｂａ（商標）脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｒｅｆ．８９８８２）上で脱塩し、保存緩衝液（２０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１Ｍ トレハロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２６８％ ｖ／ｖ トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）中に溶解させる。各精製Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を−８０℃で保存する。

【0058】

（実施例２：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体の比活性の測定）
転写メカニズムの測定方法は従来、新たに形成された転写体への放射活性の組み込みを時間とともにモニタリングすることに基づく（Ｍａｒｔｉｎ Ｃ．Ｔ．ａｎｄ Ｃｏｌｅｍａｎ Ｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６：２６９０−２６９６，１９８７）。この方法には、完全な転写体の生成だけでなく、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの触媒サイクルが不完全である場合不完全な転写体の生成ももたらすＴ７ＲＮＡポリメラーゼ活性を測定する不利点がある（Ｍａｒｔｉｎ Ｃ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：３９６６−３９７４，１９８８）。放射活性を用いない代替方法が開発された。これらはＲＮＡインターカレーターもしくは分子マーカーのような蛍光分子（Ｌｉｕ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３００：４０−４５，２００２）または比色法（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ３０（１０）：２４８５−２４８８，２００９）を用いる。分子マーカーの使用に基づく方法は、完全な転写体の発現を特異的に測定し、小さな不完全転写体の生成をもたらすＴ７ＲＮＡポリメラーゼの不完全サイクルを考慮しないという利点を有する。

【0059】

この実施例では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのいくつかの変異体の比活性は分子マーカーを用いて測定される。測定方法の詳細、および用いられた異なる試薬を以下に示す。

【0060】

【表2】

【0061】

溶液Ｗ：
緩衝液Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを以下の割合に従って混合する：
１０％ 緩衝液Ａ
１．８％ 緩衝液Ｂ
７％ 緩衝液Ｃ
３５．７％ 緩衝液Ｄ
４５．６％ 分子生物学用水。

【0062】

溶液Ｓ（基質混合）：
７０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５
１．３ｍＭ ｄＮＴＰ
２．６ｍＭ ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰおよびｒＵＴＰ
２ｍＭ ｒＧＴＰ
０．６ｍＭ ｒＩＴＰ
６０ｍＭ サッカロース
４０ｍＭ マンニトール
７ｇ／Ｌ デキストランＴ−４０
１６ｍＭ ＭｇＣｌ２
３２０ｍＭ ＫＣｌ
２０ｍＭ ＤＴＴ
３．５Ｍ ＤＭＳＯ
０．１μＭ〜０．３μＭ 分子マーカーＭＢ１
１０ｎＭ〜２０ｎＭ オリゴヌクレオチドＴ７−マイナス
１０ｎＭ〜２０ｎＭ オリゴヌクレオチドＴ７−プラス

【0063】

用いられた配列（配向５’→３’）：

【表3】

【0064】

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ容量活性を測定するためのプロトコルを以下に記載する：
１． １ｍｇ／ｍＬの酵素溶液を得るため、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ酵素を緩衝液Ａ中に希釈する
２． １ｍｇ／ｍＬの酵素溶液５μＬを溶液Ｗ３９μＬ中に希釈する
３． 前述の溶液［２．］５μＬを溶液Ｗ５０μＬ中に希釈する
４． 前述の溶液［３．］２５μＬを溶液Ｓ７５μＬに添加する
５． 前述の溶液［４．］２０μＬを用い、活性を３７℃で３０分間測定する。

【0065】

分子マーカーの連関およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ活性により生成された転写体の蓄積により生成されたＦＡＭ蛍光を、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘからのＥＡＳＹ−Ｑ（商標）蛍光計を用いてモニターする。５〜１０分の蛍光の線形増加は反応速度を計算することを可能にし、既知の容量活性を有する基準Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの使用により酵素の容量活性と直接相関させることができる。基準と変異体との間の速度の比は、未知の容量活性値を得ることを可能にする。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ容量活性は酵素のｋＵ／ｍＬで表され、時間の単位（分）当たりおよび酵素容量の単位（ミリリットル）当たりの分子マーカーにより認識されるＲＮＡ転写体の量に対応する。変異体の比活性（ＳＡ）はｋＵ／ｍｇで表され、酵素タンパク質濃度による容量活性の標準化に対応する。

【0066】

容量活性の計算：
ｐ_ｒ＝参照Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼについて５〜１０分で得られる勾配
ｐ_ｘ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体について５〜１０分で得られる勾配
Ａ_ｒ＝参照Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの容量活性
Ａ_ｘ＝変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの容量活性
Ａ_ｘ＝（Ａ_ｒ^＊ｐ_ｘ）／ｐ_ｒ

【0067】

勾配のグロス値は計算された容量活性の最終値を許容するには０．３〜０．８でなければならない。この範囲外である場合、許容される測定値の範囲内にするため、初期試料を緩衝液１中で希釈しなければならない。

【0068】

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体の３７℃での比活性測定の結果を表４に記載する：

【表4】

Ｔ３は変異Ｓ４３０Ｐ＋Ｆ８８０Ｙ＋Ｆ８４９Ｉを含む三重変異体に対応し（本特許出願内では「Ｔ３」または「Ｑ３」と称され）、Ｑ４は四重変異体Ｔ３＋Ｓ６３３Ｐに対応する。

【0069】

結論
よって、７４４位で変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｑ７４４Ｒ、Ｑ７４４ＰまたはＱ７４４Ｌ）は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの比活性と比較して増加した比活性を有する。変異Ｓ４３０Ｐ＋Ｆ８８０Ｙ＋Ｆ８４９Ｉ（Ｔ３）、Ｓ４３０Ｐ＋Ｆ８８０Ｙ＋Ｆ８４９Ｉ＋Ｃ５１０Ｒ（Ｔ３＋Ｃ５１０Ｒ）、Ｓ４３０Ｐ＋Ｆ８８０Ｙ＋Ｆ８４９Ｉ＋Ｓ７６７Ｇ（Ｔ３＋Ｓ７６７Ｇ）、またはＳ４３０Ｐ＋Ｆ８８０Ｙ＋Ｆ８４９Ｉ＋Ｃ５１０Ｒ＋Ｓ７６７Ｇ（Ｔ３＋Ｃ５１０Ｒ＋Ｓ７６７Ｇ）を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、それらの向上した半減期温度Ｔ_１／２のため増加した熱安定性（表７）だけでなく、表４に示すように低い比活性も示す。変異Ｑ７４４Ｒをさらに含むこれらの同じＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、持続的な熱安定性および非常に良好な比活性の両方を有する。よって、変異Ｑ７４４Ｒは熱安定化変異により変わった比活性の向上、またはその回復を可能にする。

【0070】

（実施例３：異なる温度での１０分の変性後のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体の半減期温度（Ｔ_１／２）の測定）
この実施例では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのいくつかの変異体のＴ_１／２値を測定する。測定方法の詳細、および用いられた異なる試薬を以下に示す。

【0071】

【表5】

【0072】

溶液Ｗ１：
緩衝液Ｂ、ＣおよびＤを以下の割合に従って混合する：
１．８％ 緩衝液Ｂ
７％ 緩衝液Ｃ
３８．６％ 緩衝液Ｄ
５２．６％ 分子生物学用水。

【0073】

溶液Ｗ２：
ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社により製造されるＮｕｃｌｉｓｅｎｓ ＥａｓｙＱ（商標）ＶＩＨ−１ １．２キットからの試薬アキュスフィアを１２０μＬの希釈液（キット番号、２８５０３６）および６０μＬの分子生物学用水中に希釈する。

【0074】

溶液Ｗ３：
１容量の溶液Ｗ１を３容量の溶液Ｗ２に混合する。

【0075】

溶液Ｓ（基質混合）：
７０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５
１．３ｍＭ ｄＮＴＰ
２．６ｍＭ ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰおよびｒＵＴＰ
２ｍＭ ｒＧＴＰ
０．６ｍＭ ｒＩＴＰ
６０ｍＭ サッカロース
４０ｍＭ マンニトール
７ｇ／Ｌ デキストランＴ−４０
１６ｍＭ ＭｇＣｌ２
３２０ｍＭ ＫＣｌ
２０ｍＭ ＤＴＴ
３．５Ｍ ＤＭＳＯ
０．１μＭ〜０．３μＭ 分子マーカーＭＢ１
１０ｎＭ〜２０ｎＭ オリゴヌクレオチドＴ７−マイナス
１０ｎＭ〜２０ｎＭ オリゴヌクレオチドＴ７−プラス

【0076】

用いられた配列（配向５’→３’）：

【表6】

【0077】

１． 評価する酵素を８４ｋＵ／ｍＬの容量活性を有するように希釈する
２． 評価する酵素の３μＬを１９３μＬの溶液３中に希釈する
３． ［２．］の２０μＬを０．２ｍＬチューブに分け入れ、サーモサイクラーにおいて１０分間適温でインキュベートする
４． 酵素の残留活性と関連した５〜１０分の蛍光増加速度を測定するため、プレインキュベートした混合物５μＬを溶液Ｓ２０μＬに添加する
５． 各変異体の残留活性を、プレインキュベートされておらず、以下の計算：
ｐ_Ｎ＝プレインキュベートされていないＴ７ＲＮＡポリメラーゼについて５〜１０分で得られる勾配
ｐ_Ｔ＝異なる温度でプレインキュベートされた変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼについて５〜１０分で得られる勾配
％相対活性＝％（ｐ_Ｔ／ｐ_Ｎ）
による１００％活性に対応する、酵素の画分の割合として表す
６． Ｔ_１／２値は酵素がプレインキュベーションなしのその初期容量活性の５０％のみを有する温度に対応する

【0078】

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体のＴ_１／２測定結果を表７に記載する：

【表7】

【0079】

結論
表７はよって記載された各種Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体の熱安定性に対するＱ７４４Ｒ変異の準中性を示すことを可能にする。この変異が熱安定性変異体に添加される場合、後者のＴ_１／２値は顕著に変わらない。また、Ｃ５１０ＲおよびＳ７６７Ｇの変異の熱安定化効果は、同じＴ３変異体において組み合わされる場合付加的であることに留意されたい。

【0080】

（実施例４：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの向上した変異体でのＮＡＳＢＡ等温増幅）
この実施例では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの向上したクローンを、４１℃の参照温度より高い温度でのそれらの機能性を確認するため、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘからのＮＡＳＢＡ増幅ＶＩＨ１ １．２のフレームワーク内で評価した。測定方法の詳細、および用いられた異なる試薬を以下に示す。

【0081】

【表8】

【0082】

溶液Ｗ１：
緩衝液Ｂ、ＣおよびＤを以下の割合に従って混合する：
１．８％ 緩衝液Ｂ
７％ 緩衝液Ｃ
３８．６％ 緩衝液Ｄ
５２．６％ 分子生物学用水。

【0083】

溶液Ｅ：
溶液Ｗ１１６．４μＬを２５Ｕ／μＬのＡＭＶ−ＲＴ３．１４μＬ、１．２Ｕ／μＬのＲＮＡｓｅＨ０．７９μＬおよび分子生物学用水４．４９μＬと混合する。この溶液を液体窒素中で直接冷凍し、凍結乾燥し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ活性を有さない酵素混合物を含有する球体（酵素球体）を生成する。

【0084】

ＮＡＳＢＡ ＨＩＶ１ １．２増幅試験をＢ型ＶＩＨ１転写体について、前述の溶液Ｅにより置換された酵素球体原料酵素を除いて、製造業者ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘの推奨に従って行う。

【0085】

用いられたプロトコルは以下のとおりであり、ＮＡＳＢＡ増幅反応に対応する：
１． ＨＩＶ１ １．２キット（キット番号、２８５０３６）からの試薬球体を９０μＬの試薬希釈液中に溶解する
２． 溶液Ｅに対応する酵素球体を４０．５μＬの酵素希釈液中に溶解する。この溶液に、容量活性が７０〜１２０ｋＵ／ｍＬである、評価するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体４．５μＬを添加する。
３． ５ｃｐ／反応または２０ｃｐ／反応に対応するＢ型ＨＩＶ転写体５μＬを０．２μＬチューブに入れる。試薬［１．］１５μＬ、および酵素溶液［２．］５μＬを次に添加する。
４． 反応をｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘからのＥＡＳＹＱ（商標）蛍光計において４１℃以上で３０分間行う。

【0086】

図１Ａ〜１Ｈは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）（図１Ａおよび１Ｂ）および各種変異体、試験当たり７つの複製物（図１Ｃ〜１Ｈ）を用いて行われる４１℃（１Ａ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｇ）および４７℃（１Ｂ、１Ｄ、１Ｆ、１Ｈ）での等温増幅を示す。これらの蛍光曲線は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して高温でのＮＡＳＢＡ等温増幅中に熱安定性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いる利点を示す。

【0087】

【表9】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]