特許 5959249 カキ熱水抽出物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5959249

(24)【登録日】2016年7月1日

(45)【発行日】2016年8月2日

(54)【発明の名称】カキ熱水抽出物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/618 20150101AFI20160719BHJP

   A61K 31/70 20060101ALI20160719BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160719BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/618

   A61K31/70

   A61P35/00

【請求項の数】5

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2012-58609(P2012-58609)

(22)【出願日】2012年3月15日

(65)【公開番号】特開2013-189416(P2013-189416A)

(43)【公開日】2013年9月26日

【審査請求日】2014年12月22日

(73)【特許権者】

【識別番号】391007356

【氏名又は名称】備前化成株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100062409

【弁理士】

【氏名又は名称】安村 高明

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】合田 榮一

(72)【発明者】

【氏名】清水 芳雄

(72)【発明者】

【氏名】金田 輝之

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平１０−３３８６４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−１８４９１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日本健康医学会雑誌, 2004, 13(1), p.3-10

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／００−３５／７６８

Ａ２３Ｌ １／２７− １／３０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

カキ熱水抽出物を含む、腫瘍を処置または予防するための組成物であって、該カキ熱水抽出物が、以下の工程：
ａ）生カキを１２５℃、加圧下で２時間熱水抽出する工程、
ｂ）工程（ａ）のカキ熱水抽出物をろ過する工程、
ｃ）工程（ｂ）のろ液を真空濃縮する工程、
ｄ）工程（ｃ）の濃縮物を滅菌する工程、
ｅ）工程（ｄ）の滅菌産物をスプレードライする工程、
ｆ）工程（ｅ）においてスプレードライした産物に、終濃度３０％となるようにエタノールを添加し、可溶性画分を調整する工程、および、
ｇ）工程（ｆ）の可溶性画分に、終濃度５０％となるようにエタノールを添加し、不溶性画分を調製する工程、
を包含する方法によって調製される、分子量が約２０００の過ヨウ素酸ナトリウム感受性物質を有効成分とする、組成物。

【請求項2】

前記腫瘍がメラノーマである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

ＮＫ細胞を活性化するための組成物であって、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記有効成分が糖質である、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記有効成分がペプチド成分ではない、請求項１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腫瘍を処置または予防するための、カキ熱水抽出物を含む組成物に関する。好ましくは、腫瘍はメラノーマである。また、本発明は、ＮＫ細胞を活性化するためのカキ抽出物を含む組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

抗酸化物質画分である低分子ペプチドを主成分とするカキ抽出物が、マウスのミエローマ細胞の増殖阻害能を有することは知られている（非特許文献１）。しかしながら、分子量が約２０００の過ヨウ素酸ナトリウム感受性物質を有効成分とし、ＮＫ細胞活性化能を有するカキ抽出物は、知られていない。また、分子量が約２０００の過ヨウ素酸ナトリウム感受性物質を有効成分とし、メラノーマ細胞に対する抗腫瘍効果を有するカキ抽出物も知られていない。

【0003】

本発明は、新規のカキ抽出物であって、ＮＫ細胞活性化能および抗メラノーマ細胞活性を有するカキ抽出物に関する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開平１０−３３８６４０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、新規のカキ抽出物であって、ＮＫ細胞活性化能および抗メラノーマ細胞活性を有するカキ抽出物を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、従来、抗腫瘍活性が報告されているカキ抽出物の調製法とは異なる方法によって調製されたカキ抽出物が、分子量が約２０００の過ヨウ素酸ナトリウム感受性物質を有効成分とし、そして、予想外にも、ＮＫ細胞活性化能および抗メラノーマ細胞活性を有することを見出し、完成された発明である。本発明は、腫瘍を処置または予防するための薬学的組成物（例えば、経口投与するための薬学的組成物）、薬学的組成物のための有効成分、飲食用組成物、および、飲食用添加物を提供する。

【0007】

本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
カキ熱水抽出物を含む、腫瘍を処置または予防するための組成物であって、該カキ熱水抽出物が、以下の工程：
ａ）生カキを１２５℃、加圧下で２時間熱水抽出する工程、
を包含する方法によって調製される、過ヨウ素酸ナトリウム感受性物質を有効成分とする、組成物。
（項目２）
前記組成物が、さらに、
ｂ）工程（ａ）のカキ熱水抽出物をろ過する工程；および、
ｃ）工程（ｂ）のろ液を真空濃縮する工程、
を包含する方法によって調製される、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物が、さらに、
ｄ）工程（ｃ）の濃縮物を滅菌する工程；および、
ｅ）工程（ｄ）の滅菌産物をスプレードライする工程、
を包含する方法によって調製される、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記組成物が、さらに、
ｆ）工程（ｅ）においてスプレードライした産物に、終濃度３０％となるようにエタノールを添加し、可溶性画分を調製する工程；および、
ｇ）工程（ｆ）の可溶性画分に、終濃度５０％となるようにエタノールを添加し、不溶性画分を調製する工程、
を包含する方法によって調製される、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記腫瘍がメラノーマである、項目１〜４に記載の組成物。
（項目６）
カキ熱水抽出物を含む、ＮＫ細胞を活性化するための組成物であって、該カキ熱水抽出物が、以下の工程：
ａ）生カキを１２５℃、加圧下で２時間熱水抽出する工程、
を包含する方法によって調製される、過ヨウ素酸ナトリウム感受性物質を有効成分とする、組成物。
（項目７）
前記組成物が、さらに、
ｂ）工程（ａ）のカキ熱水抽出物をろ過する工程；および、
ｃ）工程（ｂ）のろ液を真空濃縮する工程、
を包含する方法によって調製される、項目６に記載の組成物。
（項目８）
前記組成物が、さらに、
ｄ）工程（ｃ）の濃縮物を滅菌する工程；および、
ｅ）工程（ｄ）の滅菌産物をスプレードライする工程、
を包含する方法によって調製される、項目７に記載の組成物。
（項目９）
前記組成物が、さらに、
ｆ）工程（ｅ）においてスプレードライした産物に、終濃度３０％となるようにエタノールを添加し、可溶性画分を調製する工程；および、
ｇ）工程（ｆ）の可溶性画分に、終濃度５０％となるようにエタノールを添加し、不溶性画分を調製する工程、
を包含する方法によって調製される、項目８に記載の組成物。

【発明の効果】

【0008】

本発明にしたがって、新規のカキ抽出物であって、ＮＫ細胞活性化能および抗メラノーマ細胞活性を有するカキ抽出物が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、ＮＫ細胞傷害活性に対するＥｔｈａｎｏｌ ５０の腹腔内投与の効果を示す。Ｅｔｈａｎｏｌ ５０（２００ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水（コントロール）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に、３日連続で投与した。最後の投与の２時間後に全脾細胞を調製した。図１は、ＹＡＣ−１細胞（２×１０^４細胞／ウェル）に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性を決定した結果である。データを、平均＋標準誤差（ｎ＝４）として示す。**Ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）コントロールとの比較。

【図2】図２は、腹腔内へのＥｔｈａｎｏｌ ５０投与によって、Ｂ１６腫瘍増殖が阻害された結果を示す。Ｅｔｈａｎｏｌ ５０（２００ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（コントロール）をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの腹腔内に、−３日目から１４日目まで投与した。０日目に、Ｂ１６細胞（５×１０^５細胞）をマウスの皮下に接種した。腫瘍増殖を、１４日目までノギスで測定した。データを、平均±標準誤差（コントロールではｎ＝４、Ｅｔｈａｎｏｌ ５０ではｎ＝３）として示す。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）コントロールとの比較。

【図3】図３は、Ｍｅｔｈ Ａ腫瘍増殖に対するＥｔｈａｎｏｌ ５０投与の効果を示す。Ｅｔｈａｎｏｌ ５０（２００ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（コントロール）をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に、−３日目から１４日目まで投与した。０日目に、Ｍｅｔｈ Ａ細胞（２×１０^６細胞）をマウスの皮下に接種した。腫瘍増殖を、１４日目までノギスで測定した。データを、平均±標準誤差（ｎ＝４）として示す。*Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）コントロールとの比較。

【図4】図４は、Ｅｔｈａｎｏｌ ５０投与による腫瘍重量の阻害効果を示す。Ｅｔｈａｎｏｌ ５０（２００ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（コントロール）をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に、−３日目から１４日目まで投与した。０日目に、Ｍｅｔｈ Ａ細胞（２×１０^６細胞）をマウスの皮下に接種した。腫瘍重量を、１４日目に測定した。データを、平均＋標準誤差（ｎ＝４）として示す。*Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）コントロールとの比較。

【図5】図５は、異なる腫瘍細胞株の細胞増殖をＥｔｈａｎｏｌ ５０画分が阻害した結果を示す。Ｍｅｔｈ Ａ細胞（５×１０^３細胞／ウェル）、ＹＡＣ−１細胞（５×１０^３細胞／ウェル）、ＣＴ−２６細胞（１×１０^３細胞／ウェル）、または、Ｂ１６細胞（１×１０^３細胞／ウェル）に種々の濃度のＥｔｈａｎｏｌ ５０を添加し（０．３７５ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、または、１．５ｍｇ／ｍＬ）、あるいは、Ｅｔｈａｎｏｌ ５０を添加せずに、４８時間培養した。細胞増殖をＭＴＴアッセイによって測定した。データを、３連の実験の平均＋標準偏差として示す。**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１（ダネットのｔ検定）、#Ｐ＜０．０５、##Ｐ＜０．０１（ダネットのＴ３検定）コントロールとの比較。

【図6】図６は、カキ抽出物およびエタノール画分それぞれの、Ｍｅｔｈ Ａ細胞増殖阻害活性を示す。細胞増殖阻害活性の測定には、ＭＴＴアッセイを用いた。ＯＥは、エタノール分画をしていない抽出物を示す。ＯＥ３０ｉは、エタノール終濃度を３０％とした時の不溶性画分を示す。ＯＥ５０ｉは、エタノール終濃度を３０％とした時の可溶性画分にエタノール終濃度を５０％とした時の不溶性画分を示す。ＯＥ５０ｓは、エタノール終濃度を５０％とした時の可溶性画分を示す。Ｍｅｔｈ Ａ細胞（５×１０^３細胞／ウェル）に対して、エタノール分画していないカキ抽出物およびカキ抽出物の種々のエタノール画分を添加し（０ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、または、１．５ｍｇ／ｍＬ）、４８時間培養した。データを、３ウェルの平均＋標準偏差として示す。

【図7】図７は、Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分が、Ｍｅｔｈ Ａ細胞増殖を阻害することを示す。Ｍｅｔｈ Ａ細胞（５×１０^３細胞／ウェル）に対して、種々の量のＥｔｈａｎｏｌ ５０画分を添加し（０ｍｇ／ｍＬ、０．３７５ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、または、１．５ｍｇ／ｍＬ）、２４時間および４８時間培養し、ＭＴＴアッセイを行った。データを、３連の実験の平均＋標準偏差として示す。*Ｐ＜０．０５、***Ｐ＜０．００１、###Ｐ＜０．００１（ダネットのｔ検定）２４時間または４８時間培養のコントロールとの比較。

【図8】図８は、アネキシンＶ発現を指標とする、Ｍｅｔｈ Ａ細胞の早期自発的アポトーシスに対するＥｔｈａｎｏｌ ５０の影響を示す。Ｍｅｔｈ Ａ細胞（１×１０^５細胞／ｍＬ）を、種々の濃度のＥｔｈａｎｏｌ ５０画分（０ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、または、１．５ｍｇ／ｍＬ）ともに、２４時間および４８時間培養した。ＦＩＴＣと結合体化したアネキシンＶとＰＩを用いて染色し、早期アポトーシス細胞の割合（全細胞 対 アネキシンＶ陽性ＰＩ陰性細胞）を決定した。データを、３連の実験の平均＋標準偏差として示す。***Ｐ＜０．００１、および、###Ｐ＜０．００１（ダネットのｔ検定）２４時間または４８時間培養のコントロールとの比較。

【発明を実施するための形態】

【0010】

（カキ抽出物の調製）
代表的には、カキ抽出物は、生カキを１２５℃、加圧下で２時間熱水抽出することによって調製される。生カキ以外に、冷凍および／または乾燥および／または加熱調理したカキを用いてもよい。この抽出の条件は、当業者が適宜変更することが可能であり、例えば、抽出温度として、１０１℃〜１５０℃、好ましくは１１０℃〜１４０℃、より好ましくは１２０℃〜１３０℃、最も好ましくは１２５℃を使用することができる。抽出時の圧力は、特に限定されることは無いが、代表的には、１０６０ｈＰａ〜４９００ｈＰａ、好ましくは１４５０ｈＰａ〜３７００ｈＰａ、より好ましくは２０２０ｈＰａ〜２７５０ｈＰａ、最も好ましくは２３００ｈＰａ〜２４００ｈＰａである。抽出時間は、当業者が適宜決定することができる。代表的には、２時間であるが、これに限定されない。なお、上記の特開平１０−３３８６４０では、８０〜９０℃、大気圧下で２〜３時間抽出を行うことが開示しているが、その結果、活性成分として低分子ペプチドを含む抽出物が得られており、活性成分がペプチドではない本発明の抽出物とは異なる。

【0011】

カキ抽出物の調製においては、上記の高温、加圧条件下での抽出の後、必要に応じて、以下の工程を追加することができる。
・上記カキ熱水抽出物をろ過する工程；
・上記ろ液を濃縮する工程；
・上記濃縮物を滅菌する工程；
・上記滅菌産物をスプレードライする工程；
・上記スプレードライした産物に、終濃度３０％となるようにエタノールを添加し、可溶性画分を調製する工程；および、
・上記のエタノール可溶性画分に、終濃度５０％となるようにエタノールを添加し、不溶性画分を調製する工程。

【0012】

上記ろ過工程では、上記カキ熱水抽出物中の固形成分を除去する任意のろ過手段を使用することができる。

【0013】

上記濃縮には、任意の濃縮工程を用いることができ、例えば、真空濃縮、加熱減圧濃縮、限外ろ過による濃縮などを用いることができるが、これらに限定されない。好ましい濃縮は真空濃縮である。真空濃縮に用いる真空度（圧力）、温度、および、時間は、当業者が適宜決定することができる。

【0014】

上記滅菌工程は、代表的には、ヘリコイド式瞬間滅菌機を用いて、１３５℃１５秒間行われるが、この滅菌方法に限定されない。滅菌産物のスプレードライは、周知の任意の方法によって行うことができる。

【実施例】

【0015】

以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。

【0016】

（実施例１：ＮＫ細胞活性化能を有する新規のカキ抽出物）
（Ａ．実験材料及び方法）
（１．動物）
雌性ＢＡＬＢ／ｃ、および、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスは、日本チャールス・リバー株式会社（横浜）より購入した。雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、日本エスエルシー株式会社（浜松）より購入した。室温は２６℃±１℃に設定し、自由に摂水及び摂食させた。運搬によるストレスからの回復及び環境変化への順応のため、搬入後ＳＰＦ環境下で１週間以上飼育し、馴化後、８〜１２週齢で実験に使用した。

【0017】

（２．細胞）
ＹＡＣ−１細胞（マウスリンパ腫）は、Ｒｉｋｅｎ ＢＲＣ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（つくば市）より入手した。

【0018】

（３．カキ抽出物の調製）
生カキの可食部を、１２５℃、２３６４ｈＰａでの加圧下で２時間熱水抽出した後、ろ過し、真空濃縮機により濃縮、ヘリコイド式瞬間滅菌機による滅菌過程を経て、スプレードライヤーにより乾燥粉末化し、カキ抽出物のパウダーを得た。その主な成分を、表１に示す。

【0019】

【表1】

【0020】

（４．全脾細胞調製）
マウスを頚椎脱臼により犠牲にし、背部より脾臓を摘出して素早く脾細胞浮遊液を調製した。ステンレスメッシュにて組織塊を除去後、ＡＣＫ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ （０．１５Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ_３、０．１ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）で処理して赤血球を除去した。これをＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地中で３回洗浄した後、１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）に懸濁したものを全脾細胞として用いた。

【0021】

（５．磁気ビーズ法を用いたＮＫ細胞の精製）
（５．１．ＮＫ細胞の富化）
Ｍｏｕｓｅ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｅｔ−ＤＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、以下の通りに行った。氷冷したＤＭＥＭ培地（ＦＣＳを含まない）でマウス全脾細胞を２×１０^７細胞／ｍＬに調製し、これにビオチン標識した抗マウスＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２４、Ｌｙ−６Ｇ、Ｌｙ−６Ｃ、ＴＥＲ−１１９／Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ Ｃｅｌｌｓモノクローナル抗体を加え、氷上で１５分間処理した。続いて遠心洗浄を行い、上清を除いた細胞にＢＤ^ＴＭ ＩＭａｇ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｐｌｕｓ−ＤＭを２０×１０^７細胞／ｍＬになるように加え、冷蔵で３０分間インキュベートした。その後、細胞浮遊液をプラスチック製丸底試験管に移し、ＢＤ^ＴＭ ＩＭａｇｎｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を分離し、ネガティブフラクションを、富化したＮＫ細胞とした。

【0022】

（５．２．ＮＫ細胞の精製）
Ｍｏｕｓｅ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｅｔ−ＤＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、以下の通りに行った。氷冷したＤＭＥＭ培地でマウス全脾細胞を２×１０^７細胞／ｍＬに調製し、これにＰＥ標識した抗マウスＣＤ４９ｂ／Ｐａｎ−ＮＫ Ｃｅｌｌｓ モノクローナル抗体を加え、冷蔵で１５分間処理した。次に遠心洗浄を行い、上清を除いた細胞にＢＤ^ＴＭ ＩＭａｇ Ａｎｔｉ−ＰＥ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ２−ＤＭを２０×１０^７細胞／ｍＬになるように加え、冷蔵で３０分間インキュベートした。その後、細胞浮遊液をプラスチック製丸底試験管に移し、ＢＤ^ＴＭ ＩＭａｇｎｅｔを用いて細胞を分離し、ポジティブフラクションを精製ＮＫ細胞とした。

【0023】

（６．細胞培養）
１０％ ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０培地を培養培地として用いた。培養は全て３７℃、５％ ＣＯ_２、９５％ 大気の気相下、加湿環境にて行った。

【0024】

（７．細胞数計数法）
０．０４％ トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）生理食塩水溶液と等容の細胞懸濁液を混合し、カバーグラスを密着させた改良Ｎｅｕｂａｕｅｒ型計数盤にしみ込ませた。顕微鏡下でトリパンブルーによって染色されなかった細胞を生細胞として計数し、細胞生存率を算出した。

【0025】

（８．ＮＫ細胞傷害能の測定）
全脾細胞（１×１０^６細胞／２００μＬ／ウェル）、又は、富化したＮＫ細胞（１×１０^５細胞／２００μＬ／ウェル）、又は、精製ＮＫ細胞（１×１０^５細胞／２００μＬ／ウェル）を２−メルカプトエタノール（５０μＭ）及び試薬と共に、９６穴平底マイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ）を用いて６時間、２４時間もしくは４８時間培養した。培養終了後、培養プレートを遠心洗浄後、１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ １６４０培地を（１００μＬ／ウェル）添加した。炭酸ガスインキュベーター内で加温下、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（和光純薬工業株式会社）を取り込ませたＹＡＣ−１細胞を、全脾細胞には２×１０^４細胞／１００μＬ／ウェル、富化したＮＫ細胞及び精製したＮＫ細胞には１×１０^４細胞／１００μＬ／ウェル添加し、４時間培養した。その後培養プレートを遠心洗浄後、１％−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００−ホウ酸緩衝液を２００μｌ／ウェル添加し３０分間インキュベートして細胞を溶解後、ＹＡＣ−１細胞内の蛍光強度をＦｕｌｕｏｌｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＣＦにて測定した（励起波長：４８５ｎｍ，発光波長：５２７ｎｍ）。

【0026】

【数1】

【0027】

（９．ＭＴＴ法による生細胞数（細胞増殖）の測定）
上記の条件で培養し、培養上清のうち１５０μＬ／ウェルを除去後、新たな培養培地を５０μＬ／ウェルで添加し、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を２５μｌ／ウェル加えて、２時間インキュベートした。その後、ｌｙｓｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２０％ ＳＤＳ／５０％ ＤＭＦ， ｐＨ４．５）を１００μＬ／ウェル添加し、遮光下３７℃で一晩静置し、細胞を溶解後、５７０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。

【0028】

（１０．インビボ投与後のＮＫ細胞傷害能の測定）
上記「３．」で調製したカキ抽出物のパウダーについて、３０％ エタノール可溶性−５０％ エタノール不溶性画分（Ｅｔｈａｎｏｌ ５０）を０．２ｍＬの生理食塩水に溶解したものを３日間連続してマウスの腹腔内に投与した（２００ｍｇ／ｋｇ）。最後の腹腔内投与２時間後に全脾細胞を調製し、前述のように全脾細胞（１×１０^６細胞／１００μＬ／ウェル）とＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを取り込ませたＹＡＣ−１細胞（２×１０^４細胞／１００μＬ／ウェル）を４時間培養することによりＮＫ細胞傷害能を測定した。

【0029】

（１１．Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５によるゲル濾過クロマトグラフィー）
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（Ｍｅｄｉｕｍ）カラム（ＰＤ−１０、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）をＰＢＳで平衡化した。カキ抽出物（４ｍｇ／２ｍＬ）をアプライした後、ＰＢＳで溶出しフラクションを回収した（１ｍＬ／フラクション）。

【0030】

（１２．エタノール分画）
カキ抽出物のＨ_２Ｏ溶液に終濃度３０％となるようにエタノールを添加し、４℃で２４時間静置した。遠心操作（４℃、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）後、上清を別の遠沈管に回収し、終濃度５０％となるようにエタノールを添加し、４℃で２４時間静置した。遠心操作後、上清を別の遠沈管に回収した。その後、各沈殿と最終上清の残渣を凍結乾燥した。

【0031】

（Ｂ．結果）
（１．脾細胞におけるＮＫ活性に及ぼすカキの影響）
カキ熱水抽出物について、マウス全脾細胞のＮＫ活性に及ぼす影響を検討した。マウス全脾細胞をカキ抽出物と共に２４時間培養し、ＮＫ活性を測定した。その結果、ＮＫ活性増強作用が認められた。脾細胞に対する細胞毒性をＭＴＴ法で測定したところ、実験で用いた濃度のカキ抽出物では細胞毒性は見られず、脾細胞はむしろわずかに増加していた。

【0032】

（２．カキ抽出物のＮＫ活性増強作用に及ぼすトリプシン処理の影響）
カキ抽出物中の活性物質の性質を検討するため、３７℃、３０分でトリプシン処理を行いＮＫ活性の変化を調べた。その結果、カキ抽出物のＮＫ活性増強作用はトリプシン処理による影響を全く受けなかった。なお、カキ抽出物中にトリプシンインヒビター活性を持つ物質が含まれている可能性があるため、トリプシンによるアゾカゼインの分解をカキ抽出物がどの程度抑制するかを検討した。その結果、カキ抽出物は０．０１％トリプシンの活性を抑制しなかった。したがって、カキ抽出物中の有効成分がタンパク質成分でないことが示唆された。

【0033】

（３．カキ抽出物中のＮＫ活性増強物質のエタノール分画）
カキ抽出物を３０〜５０％のエタノールで分画し、得られた各フラクションのＮＫ活性増強作用を測定した。その結果、カキ抽出物中の活性物質は３０％エタノール可溶性−５０％エタノール不溶性画分（Ｅｔｈａｎｏｌ ５０）で最も傷害活性が強かった。その作用は濃度依存的であり、１ｍｇ／ｍＬの活性はＮＫ活性化作用をもつことが知られているＩＬ−２（１０ Ｕ／ｍＬ）に匹敵するものであった。また実験で用いた濃度のＥｔｈａｎｏｌ ５０では細胞毒性は見られなかった。以後の実験では主にＥｔｈａｎｏｌ ５０を用いた。

【0034】

（４．カキ抽出物及びＥｔｈａｎｏｌ ５０のＮＫ活性に及ぼす経時的影響）
カキ抽出物及びＥｔｈａｎｏｌ ５０と共に６、２４、４８時間培養後の脾細胞を用いてＮＫ活性を測定した。その結果、カキ抽出物及びＥｔｈａｎｏｌ ５０は共に短時間である６時間のインキュベーションではＮＫ活性をわずかにしか増強しなかったが、２４時間、４８時間では時間の経過につれて活性は増強された。２４時間から４８時間の活性増強の程度はカキ抽出物の方がより顕著であった。なお、同様の結果は、ＬＰＳに対して低感受性であるＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスを用いた実験でも観察されたことから、ＮＫ活性化にエンドトキシンが関与していないことが確認された。また、このＮＫ活性化は、富化ＮＫ細胞を用いた場合でも、精製ＮＫ細胞を用いた場合でも観察されたことから、他の種類の細胞を介することなく、カキ抽出物中の成分が直接ＮＫ細胞に作用した結果であると結論付けられた。

【0035】

（５．Ｅｔｈａｎｏｌ ５０のゲル濾過クロマトグラフィー）
Ｅｔｈａｎｏｌ ５０中のＮＫ活性増強物質の分子量を測定するために、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（分画分子量 多糖：１００〜５０００、ペプチド及び球状タンパク質：１０００〜５０００）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、得られた各フラクションのＮＫ活性を調べた。その結果、Ｎｏ．２〜７でＮＫ活性促進作用が見られ、そのピークはＮｏ．４であった。分子量２５３１のｉｎｓｕｌｉｎ Ａ鎖のピークはＮｏ．３と４の間、分子量１４２３のＢａｃｉｔｒａｃｉｎのピークはＮｏ．４と５の間にあり、したがって、カキ抽出物の活性成分の見かけの分子量は約２０００であると推定された。なお、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度を測定した結果、Ｎｏ．２〜９に吸収が見られた。

【0036】

（６．Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分のＮＫ活性増強作用に及ぼすカルボキシペプチダーゼＹ処理の影響）
Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分中の活性物質の性質を検討するため、２５℃、３０分で０．０５％カルボキシペプチダーゼＹ処理を行いＮＫ活性の変化を調べた。その結果、カキ抽出物のＮＫ活性増強作用はカルボキシペプチダーゼＹ処理による影響を全く受けなかった。一方、ＩＬ−２のＮＫ活性増強作用はカルボキシペプチダーゼＹ処理により失活した。したがって、カキ抽出物中の有効成分はペプチド成分あるいはポリペプチド成分でないことが示唆された。

【0037】

（７．Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分のＮＫ活性促進作用に対する過ヨウ素酸ナトリウム処理の影響）
次にＮＫ細胞活性促進物質が糖質かどうかを検討するため、過ヨウ素酸ナトリウムでＥｔｈａｎｏｌ ５０画分を処理しＮＫ細胞促進活性の変化を調べた。過ヨウ素酸ナトリウムはその酸化作用で糖分子のジオール基間炭素結合を切断し、アルデヒド基にすることで糖分子を切断することが知られている。Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分をＰＢＳに溶解させた過ヨウ素酸ナトリウムで２日間、４℃で処理し、チオ硫酸ナトリウムで還元した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲルろ過クロマトグラフィーを行い不要なイオンを除きＮＫアッセイを行った。なお、コントロール群として、Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分を過ヨウ素酸ナトリウムを含まないＰＢＳで２日間、４℃で処理し、チオ硫酸ナトリウムで還元した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲルろ過クロマトグラフィーを行いＮＫアッセイを行った。その結果、ＮＫ細胞活性促進作用は過ヨウ素酸ナトリウム処理により失活することが認められた。このことは活性物質が糖質であることを示唆している。

【0038】

Ｗａｎｇら（Ｍａｒ．Ｄｒｕｇｓ ８，２５５−２６８（２０１０））は、カキをバチルス属菌由来のプロテアーゼで加水分解して生成したカキペプチドにマウスＮＫ細胞活性化を介する抗腫瘍効果があることを示した。しかしながら、本発明のカキ抽出物とは物性が異なり、それゆえ、本発明とは、異なる成分を含むと考えられる。

【0039】

（８．Ｅｔｈａｎｏｌ ５０のインビボ投与によるＮＫ活性増強）
Ｅｔｈａｎｏｌ ５０はインビトロでＮＫ細胞の細胞傷害性を活性化することがわかったので、続いてインビボ投与におけるＮＫ活性に及ぼす影響を検討した。マウスにＥｔｈａｎｏｌ ５０を３日間連続腹腔内投与し、最後の腹腔内投与２時間後に脾細胞を調製した。全脾細胞をＹＡＣ−１細胞とともに４時間培養し、ＮＫ活性を測定した。その結果、生理食塩水を投与したコントロール群に対してＥｔｈａｎｏｌ ５０投与群のＮＫ活性（細胞傷害能）が有意に増強した（図１）。 上記の実験結果から、本発明の抽出法によって得られたカキ抽出物は、耐熱性であり、かつ、タンパク質、ペプチド成分ではない、分子量約２０００の、新規の活性成分を含む抽出物であることが実証された。本発明のカキ抽出物は、ＮＫ細胞を直接活性化することにより、細胞障害性を増強することが示された。また、インビボにおいても、ＮＫ細胞活性化能が確認された。

【0040】

（実施例２：カキ抽出物の物性および抗腫瘍効果）
（Ａ．実験材料及び方法）
実施例１に加えて、以下の実験材料及び方法を用いた。

【0041】

（１．細胞）
Ｂ１６細胞（マウスメラノーマ）、Ｍｅｔｈ Ａ細胞（マウス線維芽肉腫）及びＣＴ−２６細胞（マウス結腸癌）は、Ｒｉｋｅｎ ＢＲＣ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（つくば市）より入手した。

【0042】

（２．担癌マウスモデルを用いたインビボでの抗腫瘍実験）
ＰＢＳに溶解させたＥｔｈａｎｏｌ ５０画分 （２００ｍｇ／ｋｇ）をＢ１６細胞またはＭｅｔｈ Ａ細胞を播種する３日前から腫瘍播種後１４日目まで連日Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスまたはＢＡＬＢ／ｃマウスにそれぞれ腹腔内投与した。Ｂ１６細胞は背部皮下に５×１０^５細胞／２００μＬ（ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ １６４０培地）で、また、Ｍｅｔｈ Ａ細胞は背部皮下に２×１０^６細胞／２００μＬ（ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ １６４０培地）で播種した。Ｂ１６細胞またはＭｅｔｈ Ａ細胞播種日を０日目とし、コントロール群にはＰＢＳを−３日目から１４日目まで毎日腹腔投与した。背部に腫瘍成長を確認できた日から腫瘍の短径・長径をノギスにて測定した。１４日目にＣ５７ＢＬ／６ＮマウスまたはＢＡＬＢ／ｃマウスを頸椎脱臼にて犠牲にし、腫瘍重量を測定した。評価は群ごとの腫瘍重量、腫瘍体積にて行った。腫瘍体積は短径^２×長径／２で表した。

【0043】

（３．アネキシンＶ陽性細胞測定）
Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のプロトコールに沿って、アネキシンＶ陽性細胞測定を行った。１０×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ をＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ_２Ｏで希釈し、細胞を１×Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。そして１×１０^６細胞／ｍＬの濃度で細胞懸濁液を調製し、ＦＩＴＣ−アネキシンＶを５μＬ添加後１０〜１５分間静置した。その後１×Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで二回洗浄し、ＰＩを５μＬ添加してＦＡＣＳ測定を行った。

【0044】

（Ｂ．結果）
（１．Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分の担癌マウスにおける抗腫瘍効果）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスに同種由来のＢ１６メラノーマ細胞を播種し、担癌マウスモデルを作成してＥｔｈａｎｏｌ ５０画分の抗腫瘍作用を検討した。Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分をあらかじめ（−３日目から）マウスに腹腔内投与して（コントロール群にはＰＢＳを投与）、ＮＫ細胞を活性化させ、その後マウス背部皮下にＢ１６細胞を播種し（０日目）、１４日目までの腫瘍成長を記録した。Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分を−３日目から１４日目まで毎日腹腔内投与した。腫瘍の成長が認められた日から腫瘍の長径と短径をノギスにて測定し、長径×短径^２／２を腫瘍体積として経時的変化を調べた（図２）。またＢ１６腫瘍細胞播種後１４日目にマウスを犠牲にし、腫瘍重量を測定した。その結果Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分の投与により腫瘍体積並びに腫瘍重量の増加が有意に抑制された。また、Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分を同様の期間経口投与（２０００ｍｇ／ｋｇ）した場合は、腫瘍体積並びに腫瘍重量の増加に対してより強い抑制効果が認められた。

【0045】

この結果は、本発明のカキ抽出物が、メラノーマに対しても有効であることを示すものである。Ｊｉｌａｖｅａｎｕら（Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２７，６１４−６２５（２００９））に記載され、また、抗がん剤適正使用のガイドライン（ｈｔｔｐ：／／ｎｖｃ．ｈａｌｓｎｅｔ．ｃｏｍ／ｊｈａｔｔｏｒｉ／ｃａｎｃｅｒ−ｎａｖｉ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ／Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ＿Ｋｏｕｇａｎｚａｉ．ｈｔｍ）にも記載されているように、メラノーマの処置は困難であることが広く認識されているため、メラノーマを処置可能であるという本発明のカキ抽出物の効果は、非常に優れた予想外の効果である。

【0046】

次に、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＭｅｔｈ Ａ細胞を播種し、担癌マウスモデルを作成してカキエキスの抗腫瘍作用を検討した。Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分をあらかじめ（−３日目から）マウスに腹腔内投与を行い（コントロール群にはＰＢＳを投与）、その後マウス背部皮内にＭｅｔｈ Ａ細胞を播種し（０日目）、１４日目までの腫瘍成長を記録した。Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分は−３日目から１４日目まで毎日腹腔投与した。腫瘍の成長が確認できた日から腫瘍の長径と短径をノギスにて測定し、長径×短径^２／２を腫瘍体積として経時的変化を調べた。またＭｅｔｈ Ａ腫瘍細胞播種後１４日目にマウスを犠牲にし、腫瘍重量と脾臓重量を測定した。その結果、Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分の投与により腫瘍体積の成長が抑制され（図３）、１３、１４日目の腫瘍体積に有意な縮小が認められた。またＥｔｈａｎｏｌ ５０画分の投与により１４日目の腫瘍重量の抑制が認められた（図４）。

【0047】

（２．カキ抽出物のインビトロにおける抗腫瘍効果）
Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分の腫瘍細胞に対する直接的な効果を、インビトロの培養細胞を用いて調べた。その結果、Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分はＢ１６細胞の増殖を担癌マウスを用いたインビボの効果とは逆に促進したが、Ｍｅｔｈ Ａ細胞（マウス線維芽肉腫）、ＹＡＣ−１細胞（マウスリンパ腫）、ＣＴ−２６細胞（マウス結腸癌）の増殖を抑制し、なかでも、Ｍｅｔｈ Ａ細胞に対する抑制作用が最も強かった（図５）。

【0048】

このように、Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分がＢ１６細胞の増殖に対してインビトロでは直接抑制せず、むしろ促進したにもかかわらず、担癌マウスを用いたインビボでは抑制効果を示したことは、インビボでは関接的に腫瘍増殖を抑制することが示唆される。Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分がまずＮＫ細胞を活性化し、それを介して抗腫瘍効果を発揮することが考えられる。

【0049】

佐藤友美（弘前大学医学部保健学科検査技術科学専攻卒業論文集 第２巻、２９７−３０２頁、２００６年３月）は、カキエキスがリンパ球を活性化して抗腫瘍作用を示すとする考え方には無理があるように思えると記述しているが、本発明のカキ抽出物は、ＮＫ活性促進作用及び抗腫瘍作用を有する点において特徴的な抽出物である。

【0050】

以下の実験では強い増殖抑制作用を示したＭｅｔｈ Ａ細胞に注目した。まずカキ抽出物のエタノール分画の増殖抑制作用を比較した。ＯＥは、エタノール分画をしていない抽出物を示す。ＯＥ３０ｉは、エタノール終濃度を３０％とした時の不溶性画分を示す。ＯＥ５０ｉは、エタノール終濃度を３０％とした時の可溶性画分にエタノールを添加し終濃度を５０％とした時の不溶性画分を示す。ＯＥ５０ｓは、エタノール終濃度を５０％とした時の可溶性画分を示す。エタノール終濃度を５０％とした時の不溶性画分であるＯＥ５０ｉ（Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分）で最も抗腫瘍作用が強かったが、エタノール終濃度を５０％とした時の可溶性画分であるＯＥ５０ｓでもＯＥ５０ｉには及ばないながらも抗腫瘍活性が認められた（図６）。

【0051】

（３．Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分の経時的抗腫瘍作用）
Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分の腫瘍増殖抑制作用の経時的変化をＭＴＴ法にて評価した。Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分（０、０．７５、１．５ｍｇ／ｍＬ）とＭｅｔｈ Ａ細胞を２４時間および４８時間培養したところ、４８時間培養の方により強い増殖抑制作用が認められた（図７）。同様な増殖抑制作用はトリパンブルー法により測定した生細胞数でも認められたが、Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分の濃度が高くなっても細胞生存率に大きな変化は見られなかった（表２）。

【0052】

【表2】

【0053】

従ってＥｔｈａｎｏｌ ５０画分はＭｅｔｈ Ａ腫瘍細胞を細胞死へ誘導させるのではなく、その細胞増殖能を抑制しているものと考えられる。さらに少ない細胞数のＭｅｔｈ Ａ細胞とＥｔｈａｎｏｌ ５０画分を長時間（４８時間および７２時間）培養すると、さらに強い増殖抑制作用が見られた。

【0054】

（４．Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分のアポトーシス誘導作用）
細胞がアポトーシスを起こし始めると初めに起こる細胞形態変化として、通常細胞膜内側に存在するホスファチジルセリンが細胞表面に表出することが知られている。アネキシンＶはカルシウム依存的にホスファチジルセリンと結合するため、ホスファチジルセリン陽生かつＰＩ陰性細胞を検出することによりアポトーシス初期の細胞を測定することができる。本発明のカキ抽出物による処理を行っても、トリパンブルー法における細胞生存率の測定ではアポトーシスによる死細胞数に変化は認められなかったが、本発明のカキ抽出物は、アポトーシス初期の細胞数に影響する可能性がある。そこでＭｅｔｈ Ａ細胞を、Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分 （０．７５、１．５ｍｇ／ｍＬ）と２４時間および４８時間培養し、Ｍｅｔｈ Ａ細胞表面ホスファチジルセリンをＦＩＴＣ標識したアネキシンＶで染色した後、ＦＡＣＳにて初期アポトーシス細胞の検出を行った（図８）。その結果Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分のＭｅｔｈ Ａに対するアポトーシス誘導作用が濃度依存的に認められ、また、２４時間の培養と比較して４８時間の培養の方が、より強い作用を示した。

【0055】

（５．Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分の抗腫瘍効果に対するプロテイナーゼＫ処理の影響）
Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分中の腫瘍細胞増殖抑制物質がタンパク質かどうかを検討するため、室温で３０分間のプロテイナーゼＫ処理を行い増殖抑制活性の変化を調べた。その結果、Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分の活性はプロテイナーゼＫ処理による影響を受けなかった。このことから腫瘍細胞増殖抑制物質はタンパク質ではないことが示唆された。

【0056】

（６．Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分の抗腫瘍効果に対する過ヨウ素酸ナトリウム処理の影響）
Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分中の腫瘍細胞増殖抑制物質が糖質かどうかを検討するため、過ヨウ素酸ナトリウムでＥｔｈａｎｏｌ ５０画分を処理し増殖抑制活性の変化を調べた。その結果、増殖抑制作用の失活が認められ、このことは増殖抑制成分が糖質であるということを示唆した。

【0057】

（７．Ｅｔｈａｎｏｌ ５０画分のゲル濾過クロマトグラフィー）
腫瘍増殖抑制物質の分子量を測定するために、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ （分画分子量 １５００〜３００００）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行い、得られた各フラクションの抗腫瘍効果をＭｅｔｈ Ａ細胞を用いて検討した。その結果、活性成分の分子量は約２０００であった。

【0058】

最近カキエキス由来のグリコーゲンの抗腫瘍効果が報告されている(熊木奈々（カキエキスの抗腫瘍活性。弘前大学医学部保健学科検査技術科学専攻卒業論文集 第１巻：１２２−１２８（２００５））、佐藤友美（カキエキスにおける抗腫瘍効果の作用機序解析。弘前大学医学部保健学科検査技術科学専攻卒業論文集 第２巻：２９７−３０２（２００６））、および、松田芳和ら（カキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）熱水抽出物の癌細胞増殖抑制作用および抗腫瘍作用の検討。微量栄養素研究 第１５集：１２１−１２７（１９９８））)。しかしながら、これら文献におけるカキエキス由来グリコーゲンは、本発明のカキ抽出物と同様に、活性成分は糖類であるが、これら文献に記載される活性成分の分子量は約４０００ｋＤａと高分子であり、本発明の活性成分とは異なる。したがって、これら文献に記載されるカキ抽出物と本発明のカキ抽出物は、異なる。

【産業上の利用可能性】

【0059】

本発明にしがって、新規のカキ抽出物であって、ＮＫ細胞活性化能および抗メラノーマ細胞活性を有するカキ抽出物が提供される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】