特許 5961163 増強された検出特性を有する変異プロテアーゼバイオセンサー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5961163

(24)【登録日】2016年7月1日

(45)【発行日】2016年8月2日

(54)【発明の名称】増強された検出特性を有する変異プロテアーゼバイオセンサー

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160719BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20160719BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20160719BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160719BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20160719BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20160719BHJP

   A01K 67/033 20060101ALI20160719BHJP

   C12Q 1/66 20060101ALI20160719BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A01K67/027

   A01K67/033 501

   C12Q1/66

【請求項の数】24

【全頁数】54

(21)【出願番号】特願2013-510280(P2013-510280)

(86)(22)【出願日】2011年5月11日

(65)【公表番号】特表2013-532958(P2013-532958A)

(43)【公表日】2013年8月22日

(86)【国際出願番号】US2011036110

(87)【国際公開番号】WO2011143339

(87)【国際公開日】20111117

【審査請求日】2014年5月12日

(31)【優先権主張番号】61/333,706

(32)【優先日】2010年5月11日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/470,845

(32)【優先日】2011年4月1日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】593089149

【氏名又は名称】プロメガ コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100092093

【弁理士】

【氏名又は名称】辻居 幸一

(74)【代理人】

【識別番号】100082005

【弁理士】

【氏名又は名称】熊倉 禎男

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100162422

【弁理士】

【氏名又は名称】志村 将

(72)【発明者】

【氏名】ビンコスキ ブロック

(72)【発明者】

【氏名】バトラー ブレイデン

(72)【発明者】

【氏名】エンセル ランス ピー

(72)【発明者】

【氏名】ファン フランク

(72)【発明者】

【氏名】フック ブラッド

(72)【発明者】

【氏名】オットー ポール

(72)【発明者】

【氏名】ヴィドゥギリス ゲディミナス

(72)【発明者】

【氏名】ウィグダル スーザン

(72)【発明者】

【氏名】ジマーマン クリストファー

【審査官】 鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５３２０６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５０９０５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０４９８９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０３０９６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Current Chemical Genomics, 2008, Vol.2, pp.16-28

【文献】 ACS Chemical Biology, 2008, Vol.3, No.6, pp.346-351

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾された円順列変異熱安定性ルシフェラーゼと、非円順列変異の熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端部分に前記非円順列変異の熱安定性ルシフェラーゼのＣ末端部分を連結するリンカーとを含むバイオセンサーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記修飾された円順列変異熱安定性ルシフェラーゼは親の円順列変異熱安定性ルシフェラーゼに比較して修飾されており、前記リンカーは細胞中の標的分子と相互反応できるセンサー領域を含み、前記円順列変異熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＩ４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ及びＬ１９３Ｐに対応する置換の群から選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含むよう修飾されており、ここで前記修飾された円順列変異熱安定性ルシフェラーゼは、ｉ）前記標的分子の存在下での前記親の円順列変異熱安定性ルシフェラーゼ、又はｉｉ）前記標的分子の不在下での前記修飾された円順列変異熱安定性ルシフェラーゼの少なくとも１つに比較して、標的分子とバイオセンサーとの相互反応の後、増強された応答を有し、前記センサー領域が、プロテアーゼ認識部位、キナーゼ認識部位、抗体結合部位、金属結合部位、イオン結合部位、環状ヌクレオチド結合部位又はヌクレオチド結合部位を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記修飾された円順列変異熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置Ｔ５０７Ｉに対応するアミノ酸で置換を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記修飾された円順列変異熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置Ｓ５０３Ｇに対応するアミノ酸で置換を含む、請求項１又は２記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

前記修飾された円順列変異熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置Ｉ４７１Ｔに対応するアミノ酸で置換を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

前記修飾された円順列変異熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置Ｌ１９３Ｐに対応するアミノ酸で置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

前記修飾された円順列変異熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＩ４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ及びＬ１９３Ｐに対応するアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

前記修飾された円順列変異熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＩ４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ及びＴ５０７Ｉに対応するアミノ酸置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

前記修飾された円順列変異熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＳ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ及びＬ１９３Ｐに対応するアミノ酸置換を含む、請求項１〜３及び５のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

前記修飾された円順列変異熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置５、１７、２１、２３、２６、３９、４４、５１、８１、１０１、１０３、１１０、１１４、１１５、１１９、１２３、１２６、１２８、１３３、１３７、１８６、１９１、１９２、１９６、２０８、２１１、２１４、２２６、２２８、２３０、２３３、２６４、２７３、２７５、２８６、２８７、２９４、２９５、２９７、３０２、３０３、３０４、３０６、３０８、３０９、３１３、３２４、３２９、３３１、３４３、３４８、３５３、３６４、３７４、３８５、３８９、４０９、４２０、４２６、４２７、４２８、４３１、４４９、４５６、４６０、４６１、４６５、４６６、４６８、４７３、４８２、４８４、４８５、４８９、４９３、４９４、４９７、５０９、５１０、５１３、５１６、５１７、５２１、５２２、５２３、５２６、５３０、５３３、５３６、５３７、５４２又は５４３、又はそれらの組合せに対応する少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

前記熱安定性ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼの残基２−１２、残基３２−５３、残基７０−８８、残基１０２−１２６、残基１３９−１６５、残基１８３−２０３、残基２２０−２４７、残基２６２−２７３、残基３０３−３１３、残基３５３−４０８、残基４８５−４９５又は残基５３５−５４６に対応する領域で円順列変異されている、請求項１〜９のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】

前記センサー領域がプロテアーゼ認識部位を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

前記プロテアーゼ認識部位が、カスパーゼ３認識部位、カスパーゼ８認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、前立腺血清抗原認識部位、ＳＡＲＳウィルスプロテアーゼ認識部位、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位、グランザイムＢ認識部位、ＭＭＰ認識部位及びライノウィルスプロテアーゼ認識部位から成る群から選択される、請求項１１記載のポリヌクレオチド。

【請求項13】

前記熱安定性ルシフェラーゼが、ルキオラ・クルキアタ（Luciola cruciata）、ルキオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）、ピロコエリア・ミヤコ（Pyrocoelia miyako）、ラムピリス・ノクチルカ（Lampyris noctiluca）、フォツリス・ペンシルバニカ（Photuris pennsylvanica）、フェンゴデス種（Phengodes sp.）、ルキオラ・ミングレリカ（Luciola mingrelica）及びフォチナス・ピラリス（Photinus pyralis）から成る群から選択された種からの野生型ルシフェラーゼから変性されている、請求項１〜１２のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。

【請求項14】

前記熱安定性ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼである、請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。

【請求項15】

前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する、請求項１４記載のポリヌクレオチド。

【請求項16】

前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号４に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、請求項１４記載のポリヌクレオチド。

【請求項17】

前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する、請求項１４記載のポリヌクレオチド。

【請求項18】

前記センサー領域がＤＥＶＤを含む、請求項１２記載のポリヌクレオチド。

【請求項19】

前記リンカーが、ＳＳＤＥＶＤＧＳＳＧ(配列番号52)、ＳＳＧＳＤＥＶＤＧＳＬＳＳＧ(配列番号53)、ＳＤＥＶＤＧＳＬ(配列番号54)又はＤＥＶＤＧ(配列番号55)である、請求項１〜１８のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。

【請求項20】

配列番号６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項21】

請求項１〜２０のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項22】

請求項１〜２０のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、又は請求項２１記載のベクターを含む細胞。

【請求項23】

請求項２２記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。

【請求項24】

請求項１〜２０のいずれか１項記載のポリヌクレオチド又は請求項２１記載のベクターを含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１０年５月１１日に提出された米国特許仮出願第６１／３３３，７０６号及び２０１１年４月１１日に提出された米国特許仮出願第６１／４７０，８４５号に対する優先種を主張し、その個々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列記載書
配列記載書は、単に電子書式で本出願と共に提出され、そして参照により本明細書に組み込まれる。配列記載書テキストファイル「ASFILED_Sequence_WOoo.txt」は、２０１１年５月１１日に作られ、そして１５２，６１４バイトのサイズである。

【0003】

本出願は、生化学アッセイ及び試薬の分野に関する。より特定には、本出願は、修飾されたルシフェラーゼ類及びそれらの使用方法に関する。

【背景技術】

【0004】

ルシフェラーゼは、光の光子の同時解放を伴って、基質（例えば、ルシフェリン又はセレンテラジン）の酸化を触媒する酵素である。ルシフェラーゼは、多くの種、例えば甲虫類節足動物（Coleopteran arthropods）、及び多くの海獣、並びに細菌から単離されて来た。それは容易に検出でき、そしてその活性は高い精度で定量化され得るので、ルシフェラーゼは遺伝子発現及びタンパク質局在化の研究のために広く使用されて来た。その発色団を形成するのに最大３０分を要する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とは異なって、ルシフェラーゼの生成物は、ポリペプチド鎖の合成完結の直後、検出され得る（基質及び酸素がまた存在する場合）。さらに、非後−翻訳修飾が酵素活性のために必要とされ、そして酵素は補欠分子族、結合された補因子又はジスルフィド結合を含まない。ルシフェラーゼは、多くの種及び広範囲の種類の細胞において有用なレポーターである。

【0005】

ルシフェラーゼは、バイオセンシングのためのレポーター分子、すなわちシステムの分子性質を表す分子として特に有用にそれらのルシフェラーゼをする追加の特徴を有する。ほとんどの触媒反応は、ＡＴＰの２種の分子についての加水分解のエネルギー以下、又は約７０ｋＪ／モルを発生する。しかしながら、ルシフェラーゼにより誘引されるルミネッセンスは、より高いエネルギー容量を有する。例えば、ホタルルシフェラーゼにより触媒される反応（５６０ｎｍ）は、２１４ｋＪ／モルのエネルギーを放す。さらに、ルシフェラーゼはまた、化学エネルギーの光子への転換で高く効率的であり、すなわちそれらは高い量子収率を有する。従って、ルシフェラーゼは、検出できるシグナルを生成するために極端に効果的である。

【発明の概要】

【0006】

１つの態様によれば、本発明は、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼ及びリンカーを含むバイオセンサーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。前記リンカーは、熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端部分に熱安定性ルシフェラーゼのＣ末端部分を連結させる。修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは、親の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼに比較して修飾される。リンカーは、細胞中の標的分子と相互反応できるセンサー領域を含む。修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは、標的分子の存在下で、親の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼに比較して、標的分子とバイオセンサーとの相互反応の後、増強された応答を有する。他方では、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは、標的分子の不在下で、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼに比較して、標的分子とバイオセンサーとの相互反応の後、増強された応答を有する。

【0007】

別の態様によれば、本発明は、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼ及びリンカーを含むバイオセンサーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、ここで前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは、配列番号２に対応する位置５、１７、２１、２３、２６、３９、４４、５１、８１、１０１、１０３、１１０、１１４、１１５、１１９、１２３、１２６、１２８、１３３、１３７、１８６、１９１、１９２、１９３、１９６、２０８、２１１、２１４、２２６、２２８、２３０、２３３、２６４、２７３、２７５、２８６、２８７、２９４、２９５、２９７、３０２、３０３、３０４、３０６、３０８、３０９、３１３、３２４、３２９、３３１、３４３、３４８、３５３、３６４、３７４、３８５、３８９、４０９、４２０、４２６、４２７、４２８、４３１、４４９、４５６、４６０、４６１、４６５、４６６、４６８、４７１、４７３、４８２、４８４、４８５、４８９、４９３、４９４、４９７、５０３、５０７、５０９、５１０、５１３、５１６、５１７、５２１、５２２、５２３、５２６、５３０、５３３、５３６、５３７、５４２又は５４３で少なくとも１つのアミノ酸の置換を有する。リンカーは、熱安定性ルシフェラーゼのＣ末端部分を、熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端部分に結合させる。リンカーは、細胞中で標的分子と相互反応できるセンサー領域を有する。修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは、標的分子の存在下で親の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼに比較して、標的分子とバイオセンサーとの相互反応の後、増強された応答を有する。他方では、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは、標的分子の不在下で修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼに比較して、標的分子とバイオセンサーとの相互反応の後、増強された応答を有する。

【0008】

一観点によれば、前記開示は、標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするポリヌクレオチド及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と前記サンプルとを接触させ；そして前記酸プル中のルミネッセンスを検出することを含む、サンプル中の標的分子の存在又は活性の検出方法に関する。

【0009】

一観点によれば、前記開示は、標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と細胞とを接触させ；そして前記細胞中のルミネセンスを検出することを含む、細胞中の標的分子の存在又は活性の検出方法に関する。

【0010】

一観点によれば、前記開示は、前記標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と前記動物とを接触させ；そして前記動物中のルミネッセンスを検出することを含む、動物中の標的分子の存在又は活性の検出方法に関する。

【0011】

一観点によれば、前記開示は、前記標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを、固体支持体上の固定し；前記標的分子を含むサンプルを、前記固定されたバイオセンサーに添加し；前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質を添加し、そしてルミネッセンスを検出することを含む、サンプル中の標的分子の存在又は活性の検出方法に関する。

【0012】

一観点によれば、前記開示は、アポトーシスに関与する分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするポリヌクレオチド及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と前記サンプルとを接触させ；そして前記酸プル中のルミネッセンスを検出することを含む、サンプル中のアポトーシスの検出方法に関する。

【0013】

本発明の他の観は、詳細な説明及び付随する図面の考慮により明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、対応する開始配列ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤにおけるアミノ酸置換Ｉ４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ及びＬ１９３Ｐの位置を示す。

【図2】図２Ａ−Ｂは、ＴＮＦ−α−関連のアポトーシス誘発性リガンド（ＴＲＡＩＬ）処理後の変異体０１：Ａ−０５及びその対応する開始配列ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤについての標準化されたＲＬＵ（図２Ａ）及び２及び１０時間後の発光量比率（fold-induction）（対応）（図２Ｂ）を示す。

【図3】図３Ａ−Ｂは、ＴＲＡＩＬによる処理後、対応する開始配列ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤに比較しての変異体ＦＣ７：２４、ＦＣ７：４３及びＦＣ７：４９についての標準化されたＲＬＵ（図３Ａ）、及び２及び１０時間後の発光量比率（応答）（図３Ｂ）を示す。

【図4】図４は、カスパーゼ３／７バイオセンサー（ＣＢＳ）の性能に対するリンカーの効果を示す。

【図5】図５は、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ８及びＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ８バイオセンサーを用いて、３７℃で時間にわたってのＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性化の運動プロフィールを示す。

【図6】図６は、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ８及びＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ８バイオセンサーを用いて、時間にわたってのＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性化の応答倍率（fold response）を示す。

【図7】図７Ａ−Ｄは、ＦＦ−ＣＰ３５９カスパーゼ８（図７Ａ）、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ８（図７Ｂ）、ＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ８（図７Ｃ）及びＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ３（図７Ｃ） バイオセンサーを用いて、３７℃で時間にわたってのＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性化の運動プロフィールを示す。

【図8】図８は、ＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ３、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ８、ＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ８及びＦＦ−ＣＰ３５９−カスパーゼ８バイオセンサーを用いて、時間にわたってのＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性化の応答倍率を示す。

【図9】図９は、ＣＨＯ細胞において同時発現されるＴＥＶプロテアーゼバイオセンサーＴＥＶを示す。

【図10-1】図１０Ａ−Ｄは、種々の時点でのＴＲＡＩＬによる処理に基づいて、種々の熱安定性バイオセンサーを発現するＤ５４−ＭＧ細胞のルミネッセンス（光子数／秒）（図１０Ａ）、発光量比率（図１０Ｂ）、２，４及び６時間の処理後の基線での平均光子数／秒（図１０Ｃ）及びレポーター発現を示すウェスターンブロット（図１０Ｄ）を示す。

【図10-2】図１０Ａ−Ｄは、種々の時点でのＴＲＡＩＬによる処理に基づいて、種々の熱安定性バイオセンサーを発現するＤ５４−ＭＧ細胞のルミネッセンス（光子数／秒）（図１０Ａ）、発光量比率（図１０Ｂ）、２，４及び６時間の処理後の基線での平均光子数／秒（図１０Ｃ）及びレポーター発現を示すウェスターンブロット（図１０Ｄ）を示す。

【図11】図１１Ａ−Ｃは、８ｍｇ／ｋｇのＴＲＡＩＬにより処理されたＤ５４−ＭＧレポーター異種移植されたヌードマウスのルミネッセンス（光子数／秒）（図１１Ａ）、発光量比率（図１１Ｂ）、及び基線及び６時間の処理後での平均光子数／秒（図１１Ｃ）を示す。

【図12-1】図１２Ａ−Ｄは、ＴＲＡＩＬにより処理されたＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼを安定して発現する頸骨内移植されたＭＤＡ−ＭＢ２３１０１８３３細胞についての前処理値に比較しての標準化されたデータ（図１２Ａ）、あらゆる時点で計算されたＺ因子（図１２Ｂ）、示される時点で取られた代表的図（図１２Ｃ）、及びＴＲＡＩＬにより処理された、試験異種移植された動物の発光量比率（図１２Ｄ）を示す。

【図12-2】図１２Ａ−Ｄは、ＴＲＡＩＬにより処理されたＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼを安定して発現する頸骨内移植されたＭＤＡ−ＭＢ２３１０１８３３細胞についての前処理値に比較しての標準化されたデータ（図１２Ａ）、あらゆる時点で計算されたＺ因子（図１２Ｂ）、示される時点で取られた代表的図（図１２Ｃ）、及びＴＲＡＩＬにより処理された、試験異種移植された動物の発光量比率（図１２Ｄ）を示す。

【図13-1】図１３Ａ−Ｄは、NIH Clinical Collection Biofocus Library（図１３Ａ）及びTimTec Kinase Inhibitor Library（図１３Ｃ）における化合物からの化合物処理（最大）に基づく相対的ルミネッセンス、及びNIH Clinical Collection Biofocus Library（図１３Ｂ）及びTimTec Kinase Inhibitor Library（図１３Ｄ）のために得られたデータのヒートマップを示す。

【図13-2】図１３Ａ−Ｄは、NIH Clinical Collection Biofocus Library（図１３Ａ）及びTimTec Kinase Inhibitor Library（図１３Ｃ）における化合物からの化合物処理（最大）に基づく相対的ルミネッセンス、及びNIH Clinical Collection Biofocus Library（図１３Ｂ）及びTimTec Kinase Inhibitor Library（図１３Ｄ）のために得られたデータのヒートマップを示す。

【図14】図１４は、精製の工程の間、種々の段階でのタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示す。

【図15】図１５は、対照（ＭＭＰ−２センサーからのバックグラウンド）に対する倍増を示す。

【図16】図１６Ａ−Ｂは、Sensolyteアッセイを用いてのＭＭＰ−２タンパク質のルミネッセンス（図１６Ａ）及び発光量比率（図１６Ｂ）を示す。

【図17】図１７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析により検出されるカスパーゼ−３によるＣＢＳ−ＨＴの分裂を示す。

【図18】図１８Ａ−Ｂは、HaloLink樹脂（図１８Ａ）又はマイクロタイタープレート（図１８Ｂ）へのＣＢＳの固定化の例を示す。

【図19】図１９は、無細胞環境下で発現されたプロテアーゼバイオセンサーのルミネッセンスを示す。

【図20】図２０は、Ｅ．コリにおいて発現されたプロテアーゼバイオセンサーのルミネッセンスを示す。

【図21】図２１Ａ−Ｂは、ＣＡ−ＴＡＭによりラベルされたサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２０Ａ）及び精製されたプロテアーゼバイオセンサーのルミネセンス（図２１Ｂ）を示す。

【図22】図２２は、固体支持体に固定されたプロテアーゼバイオセンサーのルミネッセンスを示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明のいずれかの態様を詳細に説明する前、本発明は次の記載に示されるか又は次の図面に示される成分の構成及び配置の詳細へのその適用において制限されるものではないことが理解されるべきである。本発明は他の態様のものであり得、そして実施され得るか又は種々の態様で実施され得る。

【0016】

本発明の方法の次の記載においては、工程段階は、特にことわらない限り、室温（約２２℃）及び大気圧下で実施される。本明細書に引用されるいずれかの数範囲は、下限値〜上限値のすべての値を含むことが特に理解される。例えば、濃度範囲又は有益な効果範囲が１％〜５０％として言及される場合、値、例えば２％−４０％、１０％−３０％又は１％−３％、等が本明細書において明確に列挙されることが意図される。同様に、配列同一性範囲が例えば６０％＜１００％以下として与えられる場合、６５％、７５％、９０％、等が本明細書において明確に列挙されることが意図される。それらは特に意図される唯一の例であり、そして最低値−最高値のすべての可能性ある数値は、本出願に明確に言及されると思われる。

【0017】

用語「熱安定性ルシフェラーゼ（thermostable luciferasc）」とは、対応する野生型ルシフェラーゼに比較して、所定の温度（例えば、２２℃）で増強された安定性を有するルシフェラーゼを言及する。本明細書に開示される典型的な態様に関しては、用語「ＴＬ」は、Ｐｐｅ２の熱安定性変異体を言及するために使用され、ここでＰｐｅ２はフォツリス・ペンシルバニカ（Photuris pennsylvanica）からのルシフェラーゼである。しかしながら、当業者は、いずれの熱安定性ルシフェラーゼでも使用され得、ここでＴＬが言及されることを認識している。例えば、フォチナス・ピラリス（Photinus pyralis）からのルシフェラーゼ、並びにルキオラ・クルキアタ（Luciola cruciata）、ルキオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）、ピロコエリア・ミヤコ（pyrocoelia miyako）、ラムピリス・ノクチルカ（Lampyris noctiluca）、フォツリス・ペンシルバニカ（Photuris pennsylvanica）、フェンゴデスsp.（Phengodes sp.）、ルキオラ・ミングレリカ（Luciola mingrelica）及びフォチナス・ピラリス（photinus pyralis）からのルシフェラーゼが使用され得る（Ye et al, Biochimica et Biophysica Acta, 1339:39-52 (1997)を参照のこと）。

【0018】

用語「CP」とは、円順列を言及する。例えば、「TL−CP」とは、フォツリス・ペンシルバニカからのＰｐｅ２ルシフェラーゼの円順列熱安定性変異体を言及する。用語「ＤＥＶＤ：ＤＤ」とは、リンカー、すなわちＤＥＶＤカスパーゼ３／７認識部位及び３種のアミノ酸、すなわちＤＥＶＤカスパーゼ認識部位のＣ末端側上に存在するＧＳＬを含む円順列ルシフェラーゼのＮ末端を連結するアミノ酸配列を言及する。

【0019】

用語「バイオセンサー（biosensor）」とは、標的分子と相互反応できるセンサー領域を含むアミノ酸配列を言及する。標的分子がセンサー領域と相互反応する場合、システムの分子性質が表される。

【0020】

用語「カスパーゼ−３／７バイオセンサー（Caspase−３／７BioSensor)」及び「ＣＢＳ」とはカスパーゼ−３／７認識部位、すなわち修飾されたＴＬフラグメント間の結合でカスパーゼ−３／７認識部位ＤＥＶＤを有する、円順列フォツリス・ペンシルバニカからのＰｐｅ２ルシフェラーゼの熱安全性変異体を含むバイオセンサーを言及する。例えば、「ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ」とは、配列番号２に比較して、位置３５８での円順列ＣＢＳを言及し、そして円順列熱安定性ルシフェラーゼのＮ−及びＣ末端を連結するＤＥＶＤ：ＤＤリンカーを含む。用語「ＣＢＳ変異体」とは、ＣＢＳに比較して、１又は２以上のアミノ酸置換を有するＣＢＳを言及する。

【0021】

置換された残基を同定するために本出願を通して使用されるアミノ酸番号付けは、フォツリス・ペンシルバニカからの野生型Ｐｐｅ２ルシフェラーゼのポリペプチド配列、すなわち配列番号２、又はフォツリス２・ペンシルバニカポリペプチド配列からのＰｅｐ２ルシフェラーゼの熱安定性変異体、すなわち配列番号４における位置に比較して特定される。さらに、配列番号４で示される他の変異体が使用され得る。

【0022】

用語「標的分子（target molecule）」とは、バイオセンサーと相互反応する興味ある分子、例えばプロテアーゼ、キナーゼ、Ｇ−タンパク質結合受容体、ｃＡＭＰ, ｃＧＭＰ,酵素補因子、イオン（例えば、カルシウムイオン；ｐＨセンサーとして使用するための水素イオン）、抗体、ペプチド、又はシステムの分子性質のバイオセンサーによる表示を引起す糖を言及する。

【0023】

複数の核酸又はポリペプチド配列に関しての用語「同一性（identity）」とは、同じであるか、又はいずれかの数の配列比較アルゴリズムを用いて、又は手動的アライメント及び目視検査により測定されるように、比較窓又は企画された領域にわたっての最大の一致について比較され、そして一列に整列される場合、同じである特定の百分率のアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する複数の配列又は副配列を言及する。比較するための配列の一列整列方法は、当業界おいて良く知られている。

【0024】

用語「細胞（cell）」、「細胞系（cell line）」及び「宿主細胞（host cell）」とは、本明細書において使用される場合、交換可能的に使用され、そしてすべてのそのような名称は、それらの名称の子孫又は可能性ある子孫を包含する。用語「形質転換された細胞」とは、本発明の核酸分子を導入されている細胞（又は導入されている先祖）を言及する。任意には、本発明の核酸分子は、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質又はポリペプチドを生成できる安定してトランスファクトされた細胞系を創造するために、適切な細胞系中に導入され得る。ベクター、細胞及びそのような細胞系を構成するための方法は、当業者において良く知られている。用語「形質転換体（transformants）」又は「形質転換された細胞（transformed cells）」は、トランスファーの数とは関係なく、最初に形質転換された細胞に由来する一次形質転換された細胞を包含する。すべての子孫は、意図した又は偶然のトランスファーのために、ＤＮＡ含有率において正確には同一でない。それにもかかわらず、元の形質転換された細胞についてスクリーンされるのと同じ官能性を有する突然変異子孫は、形質転換体の定義に包含される。

【0025】

用語「非相同（heterologus）」核酸配列又はタンパク質は、本明細書において使用される場合、参照配列に比較して、異なった源を有するか、又は外来性種に起因する配列を言及し、又は同じ種からである場合、それは元の形から実質的に修飾され得る。用語「相同性（homology）」とは、複数配列間の相補性の程度を言及する。部分的相同性又は完全な相同性（すなわち、同一性）が存在し得る。

【0026】

用語「核酸分子（nucleic acid molecule）」、「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」又は「核酸配列（nucleic acid sequence）」とは、本明細書において使用される場合、ポリペプチド又はタンパク質前駆体の生成のために必要なコード配列を含む核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡを言及する。コードされるポリペプチドは、完全な長さのポリペプチド、そのフラグメント（完全な長以下）、又は完全な長さのポリペプチド又はそのフラグメントのいずれかと別のポリペプチドとの融合体（融合ポリペプチドを生成する）であり得る。

【0027】

タンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとは、遺伝子のコード領域を含む核酸配列を意味し、又は言い換えれば、その核酸配列は遺伝子生成物をコードする。コード領域はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ形に存在することができる。ＤＮＡ形で存在する場合、オリゴヌクレオチドは、一本鎖（すなわち、センス鎖）又は二本鎖であり得る。適切な制御要素、例えばエンハンサー／プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナル、等が、必要なら、一次ＲＮＡ転写体の転写及び/又は正しいプロセッシングの適切な開始を可能にするために、遺伝子のコード領域に接近して配置され得る。他の制御又は調節要素は、転写因子結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、及びエンハンサー要素を包含するが、但しそれらだけには限定されない。

【0028】

「親（parental）」とは、本明細書において使用される場合、本発明のさらなる操作により変異体を生成するために使用される開始アミノ酸又はヌクレオチド配列を言及する。例えば、野生型フォツリス・ペンシルバニカＰｐｅ２ルシフェラーゼ（配列番号２）、フォツリス・ペンシルバニカからのＰｐ２ルシフェラーゼの熱安定性変異体、例えば配列番号４、又はフォツリス・ペンシルバニカからのＰｐ２ルシフェラーゼの円順列熱安定性変異体、例えば配列番号６が、本発明に記載される変異体を生成するために出発配列として使用され得る。さらに、配列番号４又は６で示されるそれら以外の他の変異体が親配列として使用され得る。

【0029】

「ペプチド（peptide）」、「タンパク質（protein）」及び「ポリペプチド（polypeptide）」とは、長さ又は後−翻訳修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）にかかわらず、アミノ酸のいずれかの鎖を意味する。本発明の核酸分子はまた、天然に存在するタンパク質又はそのポリペプチドフラグメントの変異体をコードすることができ、それは、誘導される天然に存在する（生来の又は野生型）タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％ 又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、甲虫類ルシフェラーゼは、配列番号２に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％ 又は９９％のアミノ酸同一性を有し；ホタルルシフェラーゼは配列番号２又は４の１つに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％ 又は９９％のアミノ酸配列同一性を有し；又は前記ルシフェラーゼは配列番号６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２又は７４に基づかれる。

【0030】

「純粋（pure）」とは、本明細書において使用される場合、目的の種が存在する有力な種であり（すなわち、モル基準に基づいて、それは組成物におけるいずれかの他の個々の種よりも一層、富んでいる）、そして１つの態様によれば、実質的に精製された画分が組成物であり、ここで目的種は、存在するすべての高分子種の少なくとも５０％（モル基準に基づいて）を含む。一般的に、「実質的に純粋な（substantially pure）」組成物は、組成物に存在するすべての高分子種の約８０％以上、１つの態様によれば、約８５％、約９０％、約９５％又は約９９％以上を含む。１つの態様によれば、目的種は実質的に均質に精製され（組成物中の汚染種は従来の検出方法により検出される）、ここで前記組成物は単一の高分子種から実質的に成る。

【0031】

核酸は異なったタイプの突然変異を含むことが知られている。「置換（substitution）」とは、親配列からの１又は２以上の塩基位置でのヌクレオチドの配列の変更を言及する。突然変異はまた、１又は２以上の塩基の挿入又は欠失を言及し、その結果、核酸配列は親配列（例えば、野生型）とは異なるか、又は交換終止コドンを有する。

【0032】

用語「応答性（responsivity）」とは、標的分子とバイオセンサーとの相互反応による、ルミネセンスの変更、例えば高められた又は低められたルミネッセンスを言及する。

【0033】

「サンプル（sample）」とは、本明細書において使用される場合、細胞、動物、細胞溶解物、又はin vitro転写/翻訳混合物を言及することができる。

【0034】

用語「ベクター（vector）」とは、ＤＮＡのフラグメントが挿入されるか又はクローン化され得、そしてＤＮＡセグメントを細胞中にトランスファーするために使用され得、そして細胞中で複製できる核酸分子を言及する。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウィルス、コスミド及び同様のものに由来することができる。

【0035】

用語「野生型（wild-type）」とは、本明細書において使用される場合、天然に存在する源から単離された遺伝子又は遺伝子生成物の特徴を有する遺伝子又は遺伝子生成物を言及する。前記遺伝子又は遺伝子生成物は、天然に存在するか又は合成性であり得る。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察され、そして従って、遺伝子の野生型として任意に示される遺伝子である。対照的に、用語「変異体（mutant）」又は「変種（variant）」とは、野生型遺伝子又は遺伝子生成物に比較される場合、配列及び/又は機能性質における修飾（すなわち、変更された特性）を示す遺伝子又は遺伝子生成物を言及する。天然に存在する及び合成変異体は単離され、そしてそれらが、野生型遺伝子又は遺伝子生成物に比較される場合、変更された特性を有する事実により同定され得る。

【0036】

ルミネッセンスとは、適切な条件下で、例えば適切な基質、例えばルシフェリンの存在下でルシフェラーゼポリペプチドの光出力を言及する。光出力は、ルシフェリン基質の添加に基づいて開始するルミネセンス反応に基づいての光出力の即時又はほぼ即時の測定（時々、「Ｔ＝０」ルミネセンス又は「フラッシュ（flash）」として言及される）として測定され得る。種々の態様によるルミネッセンス反応が、例えば原核又は真核発現システムンにおける細胞からの溶解物含有溶液において実施される。他の態様によれば、発現はin vitroシステムにおいて発生し、又はルシフェラーゼタンパク質は細胞外培地中に分泌され、後者の場合、溶解物を製造する必要はない。他の態様によれば、ルシフェラーゼは全細胞において又はin vivoで、例えば動物において発現される。いくつかの態様によれば、反応は、適切な材料、例えばルシフェリンを、ルシフェラーゼタンパク質を含む反応チャンバー（例えば、多ウェルプレート、例えば９６ウェルプレートのウェル）中に注入することにより開始される。反応チャンバーは、例えばルミノメーター又は光電子増倍管を用いて、光出力を測定できる読み取り装置に配置され得る。ルシフェラーゼが全細胞又は動物において発現される場合、反応は、ルシフェラーゼ基質、例えばルシフェリンの投与により開始される。全細胞に関して、この投与は細胞培地中へのルシフェラーゼ基質の添加を包含することができる。動物に関しては、ルシフェラーゼ基質の添加は、注入又は経口投与、例えば動物飼料又は水中への基質の含有を包含することができる。光出力又はルミネッセンスはまた、秒、分、時、等の期間、例えば同じ反応チャンバー、細胞又は動物において時間にわたって測定され得る。光出力又はルミネッセンスは、時間にわたっての平均、シグナルの崩壊の半減期、一定時間にわたってのシグナルの合計、又はピーク出力として報告され得る。ルミネッセンスはまた、イメージング、例えばin vivoイメージングを通して検出され得る。

【0037】

増強された応答は、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーが標的分子と相互反応する前及び後、示差活性を含む。ＴＬ−ＣＰバイオセンサーの基本活性は、バイオセンサーが標的分子と相互反応する前、アッセイ時間（０）での活性として定義される。誘発された活性は、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーが標的分子と相互反応された後、ある経過した時間（ｔ）での活性として定義される。活性の応答又は倍増は誘発された活性：基本活性の比率である。

【0038】

増強されたルミネッセンスは、比較して得られる測定値の適切な比較により決定されるような高められた光出力を包含する。本明細書に開示されるように、ＴＬ−ＣＰバイオセンサー配列への１又は２以上の適切なアミノ酸置換が、増強されたルミネッセンスを示すＴＬ−ＣＰバイオセンサーポリペプチドを生成する。親の熱安定性ルシフェラーゼヌクレオチド分子からのヌクレオチド配列の変化は、アミノ酸置換を導くことにより、及び／又はタンパク質発現を増強することにより、増強されたルミネッセンスに寄与することができる。

【0039】

増強されたシグナル安定性は、時間経過下でのシグナルの崩壊の半減期により測定されるように、ルシフェラーゼからのシグナルがいかに長くルミネッセンスを発光し続けるかの上昇性を包含する。

【0040】

増強されたタンパク質安定性は、高められた熱安定性（例えば、高められた濃度での安定性）及び化学安定性（例えば、変性剤、例えば界面活性剤、例えばTriton X-100の存在下での安定性）を包含する。

【0041】

ルシフェラーゼバイオセンサーはこれまで記載されている。例えば、米国特許公開第２００５／０１５３３１０号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。センサー領域は円順列ルシフェラーゼ中にクローン化され、その結果、ルシフェラーゼバイオセンサーが標的分子と相互反応する場合、増強された又は高められたルミネッセンスが、標的分子と接触しなかったルシフェラーゼバイオセンサーに比較して、生成される。他方では、センサー領域は円順列ルシフェラーゼ中にクローン化され、その結果、ルシフェラーゼセンサーが標的分子と相互反応する場合、標的分子と接触しなかったルシフェラーゼバイオセンサーに比較して、低められたルミネッセンスが生成されるか、又はまったく生成されない。センサー領域は、プロテアーゼの活性、環状ヌクレオチド、例えばｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの結合、カルシウムの存在又は濃度、他のイオン又は抗体、１又は２以上のＧ−タンパク質カップリング受容体リガンドの存在又は濃度、ｐＨの変化、ホスファターゼ又はキナーゼ又は他の酵素の活性、興味ある分子、例えばペプチドの結合タンパク質、又は当業者に知られている糖を検出するために有用である。

【0042】

１つの態様によれば、本発明のポリヌクレオチドは、特定の宿主における発現のために最適化される。本明細書において使用される場合、最適化とは、コドン最適化、及び真核細胞における、コーザック及び/又は１又は２以上のイントロンの導入を包含する。従って、核酸分子は、３０％、３５％、４０％又は４５％以上、例えば５０％、５５％、６０％又はそれ以上のコドンで修飾されていないルシフェラーゼをコードする野生型核酸のコドン組成とは異なるコドン組成を有することができる。

【0043】

本発現の１つの態様によれば、異なるコドンは、哺乳類においてより頻繁に使用されるそれらのコドンであり、そして別の態様によれば、異なるコドンは植物においてより頻繁に使用されるそれらのコドンである。特定タイプの哺乳類、例えばヒトは、別のタイプの哺乳類とは異なった組の好ましいコドンを有することができる。同様に、特定タイプの植物は、別のタイプの植物とは異なった組の好ましいコドンを有することができる。本発明の１つの態様によれば、異なるコドンの大部分は、それらの最適化された配列がルシフェラーゼのためのシグナルの強度を高めるので、所望する宿主細胞における好ましいコドンである。哺乳類（例えば、ヒト）及び植物のための好ましいコドンは、公知である（例えば、Wada et al. NAR 18: 2367(1990); Murray et al. NAR 17: 477 (1989)；国際公開第０２／１６９４４号）。

【0044】

１つの態様によれば、対応する野生型ルシフェラーゼは、甲虫類種、例えばルキオラ・クルキアタ、ルキオラ・ラテラリス、ピロコエリア・ミヤコ、ラムピリス・ノクチルカ、フォツリス・ペンシルバニカ、フェンゴデスsp.、ルキオラ・ミングレリカ及びフォチナス・ピラリスからである（Ye et al, Biochimica et Biophysica Acta, 1339:39-52 (1997)を参照のこと）。

【0045】

１つの態様によれば、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーは、ＴＬ間の結合で、アミノ酸ＤＥＶＤを含むカスパーゼ−３認識部位を含む。カスパーゼ−３との相互反応に基づいて、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーは、その認識部位で分裂し、２つのＴＬフラグメントによる、より好ましく、高活性のコンホメーションの形成を可能にする。他の態様によれば、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーは、他のプロテアーゼのための認識部位、例えばカスパーゼ−８認識部位 (ＬＥＴＤＧ;配列番号１５), ＴＥＶプロテアーゼ認識部位 (ＥＮＬＹＦＱＳ; 配列番号１６)又はＭＭＰ−２ 認識部位 (PLGMWSR; 配列番号７５)を含む。

【0046】

修飾されたＴＬ−ＣＰバイオセンサーのアミノ酸配列は、対応する修飾されていないＴＬ−ＣＰバイオセンサー（親）、例えばルシフェラーゼ配列における１又は２以上の置換を有する変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列とは異なる。１つの態様によれば、修飾された熱安定性ルシフェラーゼのルシフェラーゼ配列は、対応する修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼ（親ルシフェラーゼ）のアミノ酸配列に比較して、円順列されており、ここで前記順列は１つの部位（残基）で、又は修飾に対して耐性である領域に存在する。

【0047】

１つの態様によれば、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーは、１又は２以上の別個（単離された）異種アミノ酸配列を有し、それらの少なくとも１つは標的分子と直接的に又は間接的に相互反応し、そして得られるＴＬ−ＣＰバイオセンサーが、標的物との相互反応の前及び/又は後、生物ルミネッセンス活性を有する限り、例えば生物ルミネッセンス活性が、標的分子との相互反応の後、変更される限り、例えば光強度、色彩又は運動プロフィールの変更が存在する限り、修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼのＮ−及び/又はＣ末端を包含する、１つの部位で又は修飾に対して耐性の領域に１又は２以上のアミノ酸の欠失を任意には包含することができる。

【0048】

１つの態様によれば、本発明のＴＬ−ＣＰは、対応する熱安定性ルシフェラーゼ、例えば修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼのアミノ酸配列に比較して、円順列アミノ酸を含み、円順列熱安定性ルシフェラーゼにおいて新規のＮ−及びＣ末端をもたらし、その少なくとも１つは修飾に対して耐性であり、そして標的分子と直接的に又は間接的に相互反応するアミノ酸配列を含むセンサー領域を導入することにより官能性を有するように構築される部位で又は領域に存在する。別の態様によれば、円順列熱安定性ルシフェラーゼは、他の修飾、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのＮ−又はＣ末端内への挿入及び/又はその末端内の欠失、例えば対応する修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼのＮ−及びＣ末端で又は近くでの、例えば対応する修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端の残基１〜約１０又は約３０、又はその間のいずれかの数に対応する残基、及び/又は対応する修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼのＣ末端の最後の残基、ほぼ最後の残基３０、例えば最後の残基１５、又は残基１〜３０の間のいずれかの数に対応する残基の別の挿入及び／又は欠失を包含するが、但しそれらだけには限定されない。

【0049】

１つの態様によれば、熱安定性カブト虫ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、例えば配列番号２又は４の残基、例えば残基７、３７、４７、７５、８３、１０７、１２１、１４４、１６０、１７４、１８８、１９８、２０５、２２５、２３３、２４２、２５５、２６８、３０８、３１６、３５８、３７７、４０３、４３５、４９０又は５４０で、又は残基２−１２; 残基３２−５３、例えば 残基３２−４３又は残基４２−５２; 残基７０−８８、 例えば残基７０−８０又は残基７８−８８; 残基１０２−１２６、 例えば残基１０２−１１２又は残基１１６−１２６; 残基１３９−１６５; 残基 １８３−２０３; 残基２２０−２４７、例えば残基２２８−２３８; 残基２６２−２７３; 残基３０３−３１３; 残基３５３−４０８; 残基４８５−４９５;又は残基５３５−５４６に対応する領域において、円順列され得る。残基番号付けは、修飾されていない（生来の）ホタルルシフェラーゼ配合の番号付けに基づかれる。対応する位置は、例えば配列アライメントプログラムを用いて、ルシフェラーゼ配列を一列整列することにより同定され得る。修飾に対して耐性のルシフェラーゼ中の残基又は領域がルシフェラーゼを円順列のための又は挿入のための部位として使用され得る。

【0050】

１つの態様によれば、本発明は、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼ及びリンカーを含むバイオセンサーをコードするポリヌクレオチドを提供する。１つの態様によれば、熱安定性ルシフェラーゼは、改良された性質、例えば熱安定性（配列番号３及び４）を付与するアミノ酸置換を含むフォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼＰｐｅ２（配列番号１及び２）のバージョンに基づかれる。リンカーは、修飾された熱安定性ルシフェラーゼのＣ末端部分を、修飾された熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端部分に結合させる。リンカーは、細胞において標的分子と相互反応できるセンサー領域を有する。修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに比較して、標的物とバイオセンサーとの相互反応の後、増強された応答を有する。

【0051】

１つの態様によれば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、細胞における標的分子との相互反応の後、増強された応答を有する。修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、位置５、１７、２１、２３、２６、３９、４４、５１、８１、１０１、１０３、１１０、１１４、１１５、１１９、１２３、１２６、１２８、１３３、１３７、１８６、１９１、１９２、１９３、１９６、２０８、２１１、２１４、２２６、２２８、２３０、２３３、２６４、２７３、２７５、２８６、２８７、２９４、２９５、２９７、３０２、３０３、３０４、３０６、３０８、３０９、３１３、３２４、３２９、３３１、３４３、３４８、３５３、３６４、３７４、３８５、３８９、４０９、４２０、４２６、４２７、４２８、４３１、４４９、４５６、４６０、４６１、４６５、４６６、４６８、４７１、４７３、４８２、４８４、４８５、４８９、４９３、４９４、４９７、５０３、５０７、５０９、５１０、５１３、５１６、５１７、５２１、５２２、５２３、５２６、５３０、５３３、５３６、５３７、５４２又は５４３、又はそれらの組合せに対応する少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む。

【0052】

１つの態様によれば、ＴＬ−ＣＰは熱安定性ルシフェラーゼのＮ−及びＣ末端を連結するセンサー領域を含むリンカーを有し、ここで前記センサー領域は、標的分子、例えばプロテアーゼ又はキナーゼと直接的に相互反応する、アミノ酸配列、例えばプロテアーゼ認識部位又はキナーゼ部位を含む。

【0053】

１つの態様によれば、標的分子と相互反応するアミノ酸配列は、少なくとも１つのリンカーを端に有し、例えばペプチドリンカーを端に有し、このリンカーは同じであっても又は異なっていても良く、これは任意には、標的分子との相互反応に基づいて、ルミネッセンス及び/又は応答を改良する。１つの態様によれば、標的分子と相互反応するアミノ酸配列は、Ｎ末端で少なくとも１つのリンカーを端に有し、このリンカーは標的分子との相互反応に基づいて、ルミネッセンス及び/又は応答を改良する。１つの態様によれば、リンカー次の配列の少なくとも１つを有する：

【0054】

ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ(配列番号:23)、

【0055】

ＧＳＳＳＤＳＤＳＳＡＧＳ(配列番号:24)、

【0056】

ＧＳＮＤＳＳＧＧＳＥＧＧ(配列番号:25)、

【0057】

ＧＳＮＧＧＦＤＳＳＥＧＧ(配列番号:26)、

【0058】

ＧＳＩＲＷＳＧＬＳＧＧＤ(配列番号27)、

【0059】

ＧＳＲＧＧＳＶＹＳＥＧＧ(配列番号28)、

【0060】

ＧＳＳＥＧＳＳＤＦＧＧＤ(配列番号29)、

【0061】

ＧＳＩＶＶＳＣＳＳＥＧＧ(配列番号30)、

【0062】

ＧＳＮＷＤＳＧＣＳＲＥＧ(配列番号31)、

【0063】

ＧＳＮＷＤＳＧＣＳＲＥＣ(配列番号32)、

【0064】

ＧＳＳＧＣＴＧＤＡＧＧＳ(配列番号33)、

【0065】

ＧＳＮＷＤＳＧＣＳＲＱＣ(配列番号34)、

【0066】

ＧＳＳ／Ｎ Ｓ／Ｄ／Ｇ Ｄ／Ｓ／Ｇ Ｓ／Ｆ Ｄ／Ｇ Ｓ／Ｇ Ｓ Ａ／Ｅ Ｇ Ｓ／Ｇ(配列番号35)、

【0067】

Ｇ Ｓ Ｉ／Ｒ／Ｓ Ｒ／Ｇ／Ｅ Ｗ／Ｇ Ｓ Ｇ／Ｖ／Ｓ Ｌ／Ｙ／Ｄ Ｓ／Ｆ Ｇ／Ｅ Ｇ Ｄ／Ｇ(配列番号36)、

【0068】

Ｇ Ｓ Ｉ／Ｎ／Ｓ Ｖ／Ｗ／Ｇ Ｖ／Ｄ／Ｃ Ｓ／Ｔ Ｃ／Ｇ Ｓ／Ｃ／Ｄ Ｓ／Ａ Ｅ／Ｒ／Ｇ Ｇ／Ｅ Ｇ／Ｓ(配列番号37)、

【0069】

Ｇ Ｓ Ｉ／Ｓ Ｖ／Ｇ／Ａ Ｖ／Ｇ Ｓ／Ｃ Ｇ／Ｄ Ｇ／Ｄ／Ｓ Ｓ／Ａ Ｇ／Ｅ Ｇ／Ｅ Ｇ／Ｎ(配列番号38)、

【0070】

Ｇ Ｓ Ｉ／Ｎ／Ｓ Ｖ／Ｗ／Ｇ／Ａ Ｖ／Ｄ／Ｃ／Ｇ Ｓ／Ｔ／Ｃ Ｃ／Ｇ Ｓ／Ｃ／Ｄ Ｓ／Ａ Ｅ／Ｒ／Ｇ Ｇ／Ｅ Ｇ／Ｓ(配列番号39)、

【0071】

ＧＳＩＡＧＣＧＤＡＧＥＧ(配列番号40)、

【0072】

ＧＳＮＷＤＳＧＣＳＲＥ(配列番号41)、

【0073】

ＧＳＩＡＧＣＧＤＡＧＥＧ(配列番号42)、

【0074】

ＧＳＮＷＤＳＧＣＳＲＥＧ(配列番号43)、

【0075】

ＮＷＤＳＧＣＳＲＥＧ(配列番号44)、又は

【0076】

ＩＡＧＣＧＤＡＧＥＧ(配列番号45)。

【0077】

「／」の印は、「／」の前又は後のアミノ酸がその位置で使用され得ることを示唆する。本発明のバイオセンサーに使用されるリンカーはアミノ酸配列であり、バイオセンサーにおけるその存在はそのバイオセンサーの活性を実質的に低めず、例えばリンカーを欠く対応するバイオセンサーに比較して、１０倍以上、例えば４倍以下又は２倍以下、活性を低めず、そして／又は本発明のバイオセンサーに使用されるリンカーの存在は、リンカーを欠く対応するバイオセンサー、又はリンカーＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号２３）を有する対応するバイオセンサーに比較して、又は対応する両バイオセンサーに比較して、その標的物との相互反応に対するルミネッセンス又は応答を高める。

【0078】

１つの態様によれば、本発明のペプチドリンカーは、本発明のＮ末端側のセンサー領域に位置し、そして標的分子、例えば検出される分子と直接的に又は間接的に相互反応することができる。１つの態様によれば、本発明のペプチドリンカーは、本発明のバイオセンサーのＣ末端側のペプチド配列に位置する。１つの態様によれば、本発明のペプチドリンカーは、検出される標的分子と直接的に又は間接的に相互反応することができる、Ｎ末端及びＣ末端側のペプチド配列に位置する。

【0079】

１つの態様によれば、標的分子の不在下で、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、対応する親（修飾されていない）の円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性以下であり、例えば修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのルミネッセンス活性は、対応する親（修飾されていない）の円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの約０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、５０％、７０％又はそれ以上（但し、１００％以下）であり、ここで修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性が任意には、検出される。別の態様によれば、標的物の不在下で、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、親（修飾されていない）の円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性と実質的に同じであるか又はそれ以上であり、例えば本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのルミネッセンス活性は、親（修飾されていない）の円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性の約１．５倍、例えば少なくとも２、３又は５倍、又はそれ以上である。標的分子の存在下で、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は検出可能的に変更される。例えば、標的分子の存在下での修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性の検出できる変更は、標的物の不在下での修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性に比較して、少なくとも０．００１％、０．０１％、 ０．１％、１％、１０％又は１００％、及び２倍、４倍、１０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍又はそれ以上までの変更である。修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに存在するが、しかし親（修飾されていない）の円順列ルシフェラーゼバイオセンサーには存在しないセンサー領域と相互反応する標的分子の物理的近接性は、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性を変更し、例えば低め、排除するか又は高める。１つの態様によれば、標的物の存在下での本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのルミネセンスシグナルは、標的分子の存在下での対応する親（修飾されていない）の円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのルミネッセンスシグナルに比較して、高められる。

【0080】

本発明は、円順列バイオセンサーを包含し、このルシフェラーゼ配列は、オリジナル（野生型）のＮ−又はＣ末端、又は両端での残基の欠失、例えばＮ末端での１〜３又はそれ以上の残基及びＣ末端での１〜６又はそれ以上の残基の欠失、及び標的分子と相互反応するか、又は後−翻訳修飾（センサー）により影響されるセンサー領域を含むことができる。修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのルシフェラーゼ配列は、修飾されていない円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのアミノ酸配列と同じであるか、又は実質的に同じである。実質的に同じ配列を有するポリペプチド又はペプチドとは、アミノ酸配列が大部分同じであるが、しかし完全に同じではなく、そしてそれが関連する配列の機能的活性を保持することを意味する。一般的に、２種のアミノ酸配列は、それらが少なくとも８０％同一であり、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上の同一性を有する場合、実質的に同じであるか又は実質的に相同である。

【0081】

１つの態様によれば、修飾は、ヒドロラーゼ、例えばプロテアーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ（例えば、コレステロールエステラーゼ）、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）及び同様のもの（但し、それらだけには限定されない）のための認識部位の導入であり得る。例えば、ヒドロラーゼは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ペプチド結合に作用する酵素（ペプチドヒドロラーゼ）、例えばアミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、ジペプチジル−ペプチダーゼ、トリペプチジル−ペプチダーゼ、ペプチジル−ジペプチダーゼ、セリン型カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、セリン型カルボキシペプチダーゼ、オメガペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、トレオニンエンドペプチダーゼ及び未知の触媒機構のエンドペプチダーゼ。例えば、本発明の修飾された熱安定性カブト虫ルシフェラーゼは、次のものを含むことができる：エンテロキナーゼ切断部位、カスパーゼ切断部位、コロナウィルスプロテアーゼ部位(ＳＴＬＱ−ＳＧＬＲＫＭＡ; 配列番号４６)、キナーゼ部位、ＨＩＶ−１プロテアーゼ部位(それぞれ、ＳＱＮＹ−ＰＩＶＱ又はＫＡＶＲＬ−ＡＥＡＭＳ; 配列番号４７及び配列番号４８)、ＨＣＶプロテアーゼ部位(ＡＥＤＶＶＣＣ−ＳＭＳＹＳ; 配列番号４９) (例えば Lee et al, 2003参照のこと)、ＳＡＲＳ ウィルスプロテアーゼ部位(例えば ＱＴＳＩＴＳＡＶＬＱＳＧＦＲＫＭＡＦＰＳ; 配列番号５０又はＶＲＱＣＳＧＶＴＦＱＧＫＦＫＫＩＶＫＧＴ; 配列番号５１)、グランザイムＢ部位、ライノウィルスプロテアーゼ部位、例えばライノウィルス３Ｃプロテアーゼ部位、プロホルモンコンバーターゼ部位、インターロイキン−１６−転換酵素部位、ＣＭＶアセンブリング部位、リーシュマンジュン部位、Ｂ．アントラシス（B. anthracis）致死因子、ポツリヌス菌神経毒Ｌ鎖プロテアーゼ部位、アミロイド前駆体タンパク質のためのβ−セクレターゼ部位（ＶＫＭ−ＤＡＥＦ；配列番号５６）、前立腺特異的抗原配列、トロンビン部位、レニン及びアンジオテンシン−転換酵素部位、カテプシンＤ部位、マトリックスメタロプロテイナーゼ部位、uPA部位、プラスミン部位、カチオンのための結合部位、例えばカルシウム結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、マルトース結合ドメイン又はビオチン結合ドメイン。別の態様によれば、本発明の修飾された熱安定性カブト虫ルシフェラーゼは、リガンド、例えば抗体又は金属、例えばカルシウムにより認識される配列を含むことができる。

【0082】

本発明はまた、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現し、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする核酸分子を含む発現カセットを含み、そして/又は宿主細胞において本発明の核酸分子を発現できるベクター（例えば、プラスミド、ウィルス又は欠陥性ウィルス粒子）を含む安定細胞系も包含する。１つの態様によれば、発現カセットは、プロモーター、例えば核酸分子に操作可能的に結合される構成又は調節可能プロモーターを含む。１つの態様によれば、宿主細胞、例えば原核細胞又は真核細胞、例えば植物又は脊椎動物細胞、例えば哺乳類細胞、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、羊又は齧歯動物（例えば、ウサギ、ラット、フェレット又はマウス）細胞、及び核酸分子、発現カセット、ベクター、宿主細胞、又は本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを含むキットもまた提供される。

【0083】

例えば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするベクターは、サンプル、例えば細胞、細胞溶解物、in vitro転写／翻訳混合物、又は上清液と共に混合され、そしてサンプル中の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、任意には、１又は２以上の時点で、又は標的物を有さないか又は異なった量の標的物を有する対照サンプルに比較して、検出されるか又は決定される。時間の経過につれて、及び/又は対照、例えば特定量の標的分子を有する細胞に比較して、サンプル中のルミネッセンス活性の変化は、サンプル中の標的分子の存在又は量、又は実験条件に関連する標的分子の量の変化を示唆する。１つの態様によれば、細胞は、プロモーター、例えば調節又は構成プロモーター、及び環状ヌクレオチドと相互反応するセンサー領域を含む本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼをコードする核酸配列を含むベクターと接触される。１つの態様によれば、トランスフェクトされた細胞は、プロモーターが修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの一過性発現を誘発する条件下で培養され、そしてルミネッセンスの存在又は量が測定される。別の態様によれば、標的分子と相互反応するセンサー領域を含む、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、及び標的分子を有すると思われるサンプルが混合され、そしてルミネッセンスの量が決定される。

【0084】

本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、修飾されていない円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞又は動物、例えばマウスにおける種々の条件及び／又は法的分子を測定するか検出するための機能的レポーターとして使用され得ない用途に使用され得る。例えば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするベクター、又は修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが、細胞、動物、細胞溶解物、in vitro転写／翻訳混合物、又は上清液に導入され、そして修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性が、例えば１又は２以上の時点で、及び対応する修飾されていない円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに比較して、検出されるか又は決定される。時間の経過と共に、及び／又は対照、例えばその対応する修飾されていない円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに比較して、細胞、動物、細胞溶解物、in vitro転写／翻訳混合物、又は上清液におけるルミネッセンス活性の変化は、プロテアーゼの存在を示す。例えば、本発明は、重症急性呼吸器症候群に関連するウィルスの検出方法を包含する。前記法方法は、生物学的、例えば生理学的組織又は流体サンプルと、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーとを接触することを包含する。バイオセンサナーは、ウィルスのプロテアーゼのためのアミノ酸認識配列を含む。サンプルの存在下で修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性が変更されるかどうかが検出され、又は決定され、それにより、サンプルがウィルスを含むかどうかを示唆する。

【0085】

１つの観点によれば、本開示は、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基とサンプルとを接触させ、そしてルミネッセンスを測定することを含む、サンプル中の標的分子の存在又は活性の検出方法を提供する。態様によれば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは、標的分子のためのセンサー領域を含む。そのセンサー領域は、プロテアーゼ認識部位、キナーゼ認識部位、抗体結合部位、金属結合部位、イオン結合部位、環状ヌクレオチド結合部位又はヌクレオチド結合部位を含むことができるが、但しそれらだけには限定されない。態様によれば、前記方法は、プロテアーゼ、抗体、金属、イオン、環状ヌクレオチド又はヌクレオチドである標的分子の存在又は活性を検出できる。態様によれば、プロテアーゼは、カスパーゼ３、カスパーゼ８、ＴＥＶプロテアーゼ又はＭＭＰ−２であり得る。態様によれば、サンプルは、細胞、動物、細胞溶解物、又はin vitro転写／翻訳混合物であり得る。対応によれば、前記方法はさらに、標的分子の活性を変更できる（例えば、下げるか、排除するか又は高めることができる）試験化合物を添加することを含む。態様によれば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのための基質は、ルシフェリン又はルシフェリン誘導体であり得る。

【0086】

本発明はまた、興味ある分子の存在の検出方法も提供する。例えば、細胞が、プロモーター、例えば調節プロモーター、及び興味ある分子と相互反応する挿入／センサー領域を含む、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする核酸配列を含むベクターと接触される。１つの態様によれば、トランスフェクトされた細胞は、プロモーターが修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの一過性発現を誘発する条件下で培養され、そして修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの検出できる活性が決定される。別の態様によれば、動物、例えばマウスが、プロモーター、例えば調節プロモーター、及び興味ある分子と相互反応する挿入／センサー領域を含む、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする核酸配列を含むベクター、又は本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現するトランスフェクトされた細胞により接触される。次に、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの検出できる活性が決定される。

【0087】

本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、分子、すなわち興味ある分子と相互反応するアミノ酸配列を含み、又は他方では、その対応する修飾されていない円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに比較して、敏感である。興味ある分子との変更された相互反応又はその相互反応に比較しての一定の条件下での変更された活性又は修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性を有する突然変異誘発された修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする１又は２以上の突然変異誘発されたポリヌクレオチドが選択される。別の態様によれば、本発明は、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンセンサーと分子のライブラリーとを接触させ、そして１又は２以上の分子が修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーにおけるセンサー領域と相互反応するかどうかを検出するか又は決定することを包含する方法を提供する。

【0088】

本発明はまた、サンプルに存在する標的分子又は興味ある分子の量を調節できる剤（「試験」剤）のスクリーニング方法も提供する。「調節（modulation）」とは、生物活性又はプロセスの機能的特性（例えば、酵素活性）を増強するか又は阻害する能力を言及する。そのような増強又は阻害は、特定現象の発生、例えばシグナルトランスダクション経路の活性化に依存することができる。「モジュレーター（modulator）」とは、剤（天然に存在するか又は天然に存在しない）、例えば生物高分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチド又はオリジナル分子）、小分子、生物材料、例えば細菌、植物、菌類又は動物（特に、哺乳類）細胞又は組織から製造された抽出物、又はいずれか他の剤を言及する。モジュレーターは、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイへの包含により、生物学的工程の阻害剤又は活性化因子（例えば、作動薬、部分的作動薬又は拮抗薬）（直接的に又は間接的に）としての有能な活性について評価される。モジュレーターの活性は、知られているか、未知であるか、又は一部知られている。そのようなモジュレーターは、本発明の方法を用いて、スクリーンされ得る。用語「試験剤」又は「試験化合物」とは、推定モジュレーターとして本発明の１又は２以上のスクリーニング方法により試験される剤又は化合物を言及する。通常、種々の予定された濃度、例えば、０．０１μＭ、１．０μＭ、１．０μＭ及び１０．０μＭがスクリーニングのために使用される。対照は、試験剤の不在下でのシグナルの測定、標的物を調節することが知られている剤又は化合物への比較、又は試験剤又は化合物との接触の前、間及び／又は後、サンプル（例えば、細胞、組織又は器官）への比較を包含することができる。

【0089】

１つの態様によれば、前記方法は、プロテアーゼ活性を調節する剤又は化合物についてスクリーニングすることを包含する。例えば、１つの態様によれば、アポトーシスを調節できる剤又は化合物の同定方法が提供される。カスパーゼファミリーのプロテアーゼは、アポトーシスと関連している。従って、前記方法は、カスパーゼファミリーのプロテアーゼと、カスパーゼ活性を調節すると思われる剤又は化合物、及びアスパーゼにより分裂できる分裂部位を有する修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーとを接触させることを包含する。修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、試験剤又は化合物との接触の前及び後、サンプルにおいて検出される。剤との接触の後、活性の上昇はアポトーシスを阻害する剤又は化合物を暗示し、そして下降はアポトーシスを活性化する剤を暗示する。

【0090】

従って、本発明は、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに存在する認識配列の分裂を調節する剤又は化合物を同定し、そしてその活性を検出するのに有用なスクリーニングシステムを提供する。これはプロテアーゼ活性モジュレーターについての急速なスクリーニングを可能にする。本明細書に記載されるスクリーニングシステムの使用は、プロテアーゼ、例えばカスパーゼファミリーのプロテアーゼを調節する（例えば、阻害するか又は活性化する）剤又は化合物を同定するための敏感で且つ急速な手段を提供する。特に、本発明は、センサー領域が興味ある酵素のための切断部位であるアミノ酸配列を含む、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを企画する。従って、興味ある分子がプロテアーゼである場合、挿入体はプロテアーゼのための切断認識配列を含むペプチドを含む。プロテアーゼのための切断認識配列は、タンパク質分解切断の間、プロテアーゼにより認識される特定のアミノ酸配列である。従って、本発明は、サンプルと、プロテアーゼのためのセンサー領域を含む本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーとを接触させ、そしてルシフェラーゼ活性の変化を測定することにより、サンプル中のプロテアーゼの量を決定する方法を提供する。本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、特に、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞又は動物の内部のプロテアーゼの活性をモニターするために使用され得る。

【0091】

本発明のアッセイは、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを切断するプロテアーゼの活性を変更する剤又は化合物を同定するための薬剤をスクリーニングするために使用され得る。１つの態様によれば、アッセイはプロテアーゼをin vitroで含むサンプルに対して実施される。既知量のプロテアーゼを含むサンプルが、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び試験剤と共に混合される。次に、サンプル中のプロテアーゼ活性の量が上記のようにして決定される。試験剤の存在下でのプロテアーゼモル当たりの活性の量が、試験剤の不在下でのプロテアーゼモル当たりの活性と比較される。差異は、試験剤がプロテアーゼの活性を変更することを示唆する。他方では、その変更は、プロテアーゼ活性の上昇であり得、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の低下、又は修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の上昇又は維持に対応するプロテアーゼ活性の低下をもたらす。

【0092】

１つの態様によれば、プロテアーゼ活性を変更する剤の能力が決定される。このアッセイにおいては、細胞がプロテアーゼ活性を調節すると思われる剤又は化合物により条件付けされるか又は接触させられる。培養物中の細胞が溶解され、そしてプロテアーゼ活性が測定される。例えば、既知又は未知量のプロテアーゼを含む溶解された細胞サンプルが、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーと共に混合される。次に、サンプル中のプロテアーゼ活性の量は、対照、又は処理されていないサンプル及び処理された溶解細胞サンプルにおける修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の程度を決定することにより、上記のようにして決定される。活性又は阻害は、サンプル中のμｇ又はｍｇタンパク質当たりに基づいて計算され得る。従って、プロテアーゼ活性の調節は、プロテアーゼ活性の上昇を包含し、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の低下又は修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の上昇又は維持に対応するプロテアーゼ活性の低下をもたらす。典型的には、差異は、標準測定値に対して測定され、絶対量のプロテアーゼ活性が得られる。プロテアーゼの活性又は発現を阻止するか又は妨げる試験剤が、未処理の対照に比較して、処理された細胞における高められた修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性により検出され得る。

【0093】

別の態様によれば、in vivoでプロテアーゼ活性を変更する剤又は化合物の能力が決定される。in vivoアッセイにおいては、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする発現ベクターにより過渡的に又は安定してトランスフェクトされた細胞が異なった量の試験剤又は試験化合物に暴露され、そして細胞中のルシフェラーゼ活性に対する試験剤又は試験化合物の効果が決定され得る。典型的には、その差異は、標準測定値に対して測定され、絶対量のプロテアーゼ活性が得られる。プロテアーゼの活性又は発現を阻害するか又は妨げる試験剤は、未処理の対照に比較して、処理された細胞における高められた修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性により検出され得る。

【0094】

別の態様によれば、動物におけるプロテアーゼ活性を変更する剤又は化合物の能力が決定される。完全な動物アッセイにおいては、動物、例えばマウスが、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンターを発現する細胞により注入され、そしてその動物が異なった量の試験剤又は試験化合物に暴露される。態様によれば、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞が動物に移植され得る。態様によれば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質が動物中に注入される。次に、動物におけるルシフェラーゼ活性に対する試験剤又は試験化合物効果が決定され得る。

【0095】

本開示はまた、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを、固体支持体、例えば粒子、樹脂、カラム、固体表面（例えば、プレート、スライド又はウェル底）に固定する方法も提供する。次に、固定されたバイオセンサーは、興味ある分子の存在又は活性を検出するために使用され得る。態様によれば、精製された形での又は細胞溶解物、例えばＥ．コリ細胞溶解物において発現される、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、固体支持体、例えば樹脂又は固体表面上に固定され、そして興味ある分子が検出される。興味ある分子は、精製された形の分子であり得るか、又は細胞溶解物においても発現され得る。次に修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの検出できる活性が決定される。

【0096】

１つの観点によれば、本開示は、サンプルと、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質とを接触させ、そしてサンプル中のルミネッセンスを検出することを含む、サンプル中のアポトーシスを検出する方法を提供する。態様によれば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、アポトーシスに関与する分子のためのセンサー領域を含む。

【0097】

本発明のアッセイへの使用のための材料及び組成物は、理想的には、キットの調製のために適合される。そのようなキットは、１又は２以上の容器手段、例えばバイアル、管及び同様のものを含むキャリヤー手段を含み、ここで容器手段の個々は、方法に使用されるべき別々の要素の１つを含む。容器の１つは、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー又はポリヌクレオチド（例えば、ベクターの形での）を含む。第２容器は、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのための基質を含む。

【0098】

本発明は、次の非制限実施例により、さらに記載されるであろう。

【実施例】

【0099】

実施例Ｉ：細胞に高められた応答性を有する修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの生成

【0100】

カスパーゼ３BioSensor (CBS)は、カスパーゼ−３認識部位を有する、アミノ酸３５８で円順列された（ＣＰ）、熱安定性フォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼ（ＴＬ）であり、すなわち、ＴＬフラグメント間の結合で、アミノ酸ＤＥＶＤを含むカスパーゼ−３認識部位を含む。開始鋳型として使用される特定のＣＢＳは、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤと呼ばれる。このＣＢＳのアミノ酸配列は、Ｍ / ＴＬ残基３５８−５４４ / ＳＤＥＶＤＧＳＬ / ＴＬ残基 ４−３５４ / V配列番号６)として表される。ＣＰ ＴＬにおけるアミノ酸位置は、非ＣＰ ＴＬ配列のそれらのアミノ酸に相関する（付随する付録に提供される）。カスパーゼ−３による処理に基づいて、ＣＢＳは認識部位で切断され、２種のＴＬフラグメントにより、より好ましく、高い活性のコンホメーションの形成が可能にされる。

【0101】

ＣＢＳの有用性は、カスパーゼ−３による切断の前及び後での示差活性である。ＣＢＳの基本活性は、カスパーゼ−３が認識部位で切断する時間の前、アッセイ時間（０）として定義される。誘発された活性は、ＣＢＳがカスパーゼ−３により切断された後の時間（ｔ）での活性として定義される。活性に関する応答又は倍増は、基本活性に対する誘発された活性の比率である。ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤでの置換を、誤差傾向の変異誘発性ＰＣＲ−基礎システムGeneMorph II（Stratagene; Daugherty, PNAS USA 97(5):2029 (2000)）を用いて、その製造業者の説明書に従って生成し、誘発に対する増強された応答性を有するＣＢＳ変異体を開発した。

【0102】

得られるライブラリーを、Ｅ．コリにおいて発現し、そして組換えカスパーゼ−３による前処理を伴って及びそれを伴わないで、ルシフェラーゼ活性についてスクリーンした（データは示されていない）。最良のシグナル及び応答特性を有するＣＢＳ変異体を、ＴＮＦ−α−関連のアポプトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）処理に対する応答を測定する動力学アッセイにより、ＨＥＫ２９３細胞において評価した（Wiley, S.R. et al, Immunity 3:673 (1995); Niles, A.L. et al, Meth. Mol. Biol. 414: 137 (2008)）。ＴＲＡＩＬは、死受容体の活性化を通してアポトーシスを誘発し、活性カスパーゼ−８を形成し、これはカスパーゼ−３を生成するためにプロカスパーゼ３を活性化する。活性カスパーゼ−３の出現は、ＣＢＳ変異体が切断され、そして活性化されるにつれて、ルミネッセンスの上昇により付随される。手短には、９６−ウェルプレートのウェル当たり１５，０００個の細胞でプレートされたＨＥＫ２９３細胞を、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤにアミノ酸置換を有する種々のＣＢＳ変異体をコードするプラスミドＤＮＡにより、TransIT-LTI (Minis Bio)を用いて過渡的にトランスフェクトした。同じプラスミドはまた、トランスフェクトション制御として作用するウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼの構成的発現のための遺伝子を担持した。細胞を３７℃で２時間、２ｍＭのルシフェリンにより前処理した。細胞を、１μｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬにより処理し、そして３７℃で１０時間アッセイした。ルミネッセンスを経過時間にわたって連続的にモニターした（ルミノメーター：Varioskan Flash (Thermo)１秒の積分時間刻み）。複製ウェルにおける細胞を、ＴＲＡＩＬ添加の時間で、すなわち時間（０）で溶解し、そしてウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。次に、すべてのバイオセンサーデータを、ウミシイタケルシフェラーゼルミネッセンス（Dual-GloAssay System; Promega Corporation）を用いて、トランスフェクション効率のために標準化した。

【0103】

典型的なCBS変異体は、表１に列挙されるそれらの変異体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。表１は、ＴＲＡＩＬ処理に対する改良された応答を示す、クローン名称により識別される、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤの変異体を列挙する。表１に列挙される改良性は、親のＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ ＣＢＳに対して標準化される。「基礎（ＢＡＳＡＬ）」とは、ＴＲＡＩＬ添加での、すなわち時間（０）での標準化されたバイオセンサールミネッセンスを表し、「誘発されたもの（INDUCED）」とは、ＴＲＡＩＬ添加のおよそ１０時間後での標準化されたバイオセンサールミネッセンスを表し、そして「応答（RESPONSE）」とは、発光量比率、すなわち基礎活性に対する誘発された活性の比率を表す。

【0104】

当業界において知られている標準配列決定技法を用いて、個々のクローンにおけるアミノ酸置換を同定した（表１を参照のこと）。アミノ酸位置は、親ＴＬ、例えば変異体＝ＴＬ３５８の位置２でのProに基づかれ；従って、ＤＥＶＤのＮ末端側の残基はＴＬ残基３５８−５４４（Gly）を表し；ＤＥＶＤのＣ末端側の残基は４（Ｌｙｓ）−３５４（Ｇｌｙ）を表す（例については、図１を参照のこと）。個々のアミノ酸配列置換は、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ配列を有さない親ＴＬにおけるアミノ酸位置に対応する位置により示され、それにより、数字上の位置に続く最初の文字は親ＴＬにおけるその対応するアミノ酸を表す。アミノ酸が別のアミノ酸により置換される場合、２番目の文字はアミノ酸置換を表す。アミノ酸が終止コドンにより置換される場合、置換は「ＳＴＯＰ」により示される。
表１：対応するＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤに対するＣＢＳ変異体の応答の改良倍率（fold improvement）の要約

【表1】

【0105】

実施例ＩＩ. 熱安定性ルシフェラーゼカスパーゼ−３バイオセンサーにおける突然変異の特定組合せの評価

【0106】

追加のＣＢＳ変異体を、オリゴ−基準の特定部位の突然変異誘発キットQuik Change (Stratagene; Kunkel, PNAS USA 82(2):488 (1985))を用いて、その製造業者の説明書に従って生成した。最も改良された応答を有する、実施例Ｉからのそれらの変異体、特にクローン１２：Ｂ−１０、０１ ：Ａ−０５、０４：Ｃ−０３、０１ ：Ｅ−１１、１６：Ｄ−１２、０１ ：Ｄ−０２及び ０７：Ｂ−０２に同定されるアミノ酸置換を組合し、そして実施例ＩにおけるようにしてＨＥＫ２９３細胞において評価した。追加のＣＢＳ変異体を生成するために使用されるアミノ酸置換は、配列番号２に対応する、１９３ＬＰ、２９７ＳＩ、３２９ＲＱ、４７１ＩＴ、５０３ＳＧ、５０７ＴＩ、５２３ＫＩ,533VA及び５３６ＱＲであった。典型的なＣＢＳ変異体は、表２に列挙されるそれらの変異体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。表２は、クローン（「新規番号（ＮＥＷ＃）」）、アミノ酸置換を示す、カラムにおいてＸにより示されるクローンに見出されるアミノ酸置換１９３ＬＰ、２９７ＳＩ、３２９ＲＱ、４７１ＩＴ、５０３ＳＧ、５０７ＴＩ、５２３ＫＩ,533VA及び５３６ＱＲ、対応する出発ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤに対する基礎、誘発されたもの、及び応答の改良性を包含する。
表２．対応するＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤに対する特定アミノ酸置換の組合せを有するＣＢＳ変異体の応答の改良性の要約

【表2】

【0107】

試験される置換の組合せの多くは、親ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤバイオセンサー又は表１に開示される変異体に比較して、高められた応答を示した。４種のＣＢＳ変異体、すなわち０１ ：Ａ−０５、ＦＣ７：２４、ＦＣ７：４３及びＦＣ７：４９が特に興味あるものである（図１及び表３を参照のこと）。図１は、親ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ配列におけるそれらの変異体中に組み込まれる、４種のアミノ酸置換Ｉ４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ及びＬ１９３Ｐの位置、及び円順列部位のために修正された位置を示す（また、表３も参照のこと）。図１の上部図は、一次アミノ酸配列の連続番号付けに基づいての置換の位置を表す。図１の下部図は、親ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤに基づいてのコドン名称を示す。ヌクレオチド変化は次の通りである：４７１:ａｔａ＞ａｃａ; ５０３:ａｇｔ＞ｇｇｔ; ５０７: ａｃａ＞ａｔａ; １９３:ｔｔｇ＞ｃｃｇ。
表３．クローン０１:１−０５、ＦＣ７：２４、ＦＣ７：４３ 及び ＦＣ７：４３に見出されるアミノ酸置換の要約

【表3】

【0108】

改良されたＣＢＳ変異体01 :Ａ−０５、ＦＣ７：２４、ＦＣ７：４３及びＦＣ７：４９（それぞれ、「１Ａ５」、「２４」、「４３」、及び「４９」）における肝細胞中のＴＲＡＩＬに対する応答を、１０時間にわたって、図２Ａ−Ｂ及び３Ａ−Ｂにおける親ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ（「ＴＬ−ＣＰ」）と比較した。変異体０１：Ａ−０５は、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤに比較して、それぞれ２及び１０時間のＴＲＡＩＬ処理の後、２倍及び約４．８倍高い応答を有した（図２Ａ及び２Ｂ）。２時間後、変異体ＦＣ７：２４及びＦＣ７：４９は、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ及び変異体４３よりも約２倍高い応答を有した（図３Ａ及び３Ｂ）。１０時間後、変異体ＦＣ７：２４及びＦＣ７：４９はＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤよりも約３．２−３．７倍高い応答を有し（図３Ａ及び３Ｂ）、そして変異体ＦＣ７：４３は約２．２倍高い応答を有した。それらのデータは、ＣＢＳバイオセンサーがそれらの４種のアミノ酸置換４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ及び Ｌ１９３Ｐのうち１又は２以上の置換を組み込むことにより、改良された応答を有するよう生成される得ることを示す。

【0109】

実施例ＩＩＩ

【0110】

異なったリンカー配列、例えばＳＳＤＥＶＤＧＳＳＧ(配列番号５２)、ＳＳＧＳＤＥＶＤＧＳＬＳＳＧ(配列番号５３)、ＳＤＥＶＤＧＳＬ（配列番号５４)又はＤＥＶＤＧ(配列番号５５)を有する追加のＣＢＳ変異体を生成した。ＣＢＳ変異体を、実施例ＩにおけるようにしてＨＥＫ２９３細胞において評価した。典型的なＣＢＳ変異体は、図４に列挙されるそれらの変異体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。次に、すべてのバイオセンターデータを、実施例Ｉにおけるようにして、ウミシイタケルシフェラーゼルミネッセンスを用いて、トランスフェクション効率のために標準化した。図４は、それが含むリンカー配列（「リンカー」）によるクローンを識別し、そしてＴＲＡＩＬ添加、すなわち時間（０）（「基礎（ｔ＝０）」）で、ＴＲＡＩＬ添加後、およそ１０時間で（「誘発されたもの（１０時間）」）、ＲＬＵにおけるルミネッセンス、及び発光量比率、すなわち基礎活性に対する誘発されたもの活性の比率（「応答（１０時間）」）を示す。２種の実験間の共通するリンカーは、番号２(すなわち、ＳＳＧＳＤＥＶＤＧＳＬＳＳＧ)である。数の差異は実験間の典型的な変動である。リンカー＃３は、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤとして言及されるクローンに見出される同じリンカーである。

【0111】

実施例ＩＶ：カスパーゼ−８を検出するためへの熱安定性変異ルシフェラーゼバイオセンサーの評価

【0112】

本発明の熱安定性変異ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞中のカスパーゼ−８活性を検出するために使用され得るかどうかを評価するために、カスパーゼ−８切断部位、ＬＥＴＤＧ（配列番号１５）を含むバイオセンサーを生成した。２種の異なったバイオセンサーＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ−8 及びＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ−8を使用した。対照として、ホタル（フォチナス・ピラリス：Ｐｐｙ）ルシフェラーゼバイオセンサーFF-CP234-カスパーゼ-８(Ｍ／Ｐｐｙ残基２３４−５４４／ＬＥＴＤＧ／Ｐｐｙ 残基４−２３０／Ｖ)、ＦＦ−ＣＰ３５９−カスパーゼ-８(Ｍ／Ｐｐｙ残基 ３５９−５４４／ＬＥＴＤＧ/Ｐｐｙ残基４−３５５／Ｖ)及びＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤを使用した。表４は、前記バイオセンサーの詳細な配列を提供する。
表４

【表4】

【0113】

すべてのバイオセンサーを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。細胞を、９６−ウェル組織培養プレート中に１０，０００／ウェルでプレートした。バイオセンサーＤＮＡを、表４に記載のようにして、細胞中へのトランスフェクションのために調製した。３０の１０μｌ反応を、個々のバイオセンサーについて設定した。TransIT(登録商標)LTI (LTI; Minis)トランスフェクションマスター混合物を、１６５０μｌのＤＭＥＭと４９．５μｌのＬＴＩとを混合することにより調製した。このマスター混合物を室温で１５時間インキュベータした。次に、３００μｌのマスター混合物を個々のバイオセンサーＤＮＡに添加し（３０の反応のために十分な；０．１μｇ／反応）、そして室温で、さらに１５分間インキュベートした（表５）。１０μｌのバイオセンサーＤＮＡ−トランスフェクションマスター混合物溶液を、適切なウェル中の細胞に添加した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ₂下で一晩インキュベートした。
表５

【表5】

【0114】

一晩のインキュベーションの後、培地を細胞から除去し、そして２ｍＭのルシフェラーゼＥＦ（Promegaからログ番号E6551）を含むＣＯ₂非依存性培地(Invitrogenカタログ番号18045088)により置換した。細胞を、Varioskanルミノメーターにおいて２時間、ルシフェリンＥＦにより予備平衡化し、そして２０分ごとにバイオルミネッセンス読み取りを行った。インキュベーションに続き、細胞を、ＣＯ₂非依存性培地＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中、１μｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬにより、又は化合物を含まない対照（培地＋１０％ＦＢＳのみ）により誘発した。細胞を再び５００＋分間、Varioskanルミノメーターにおいて３７℃でインキュベートし、そして２０分ごとにバイオルミネッセンスを読取った。

【0115】

図５−８は、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ８及びＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ８で、バイオセンサーがＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性化を検出できることを示す。図５及び７は、３７℃での時間経過にわたってのＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性化の運動プロフィールを識別する。図６及び８は、経過時間にわたってのＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性化の反応倍率を識別する。活性化の発光量比率を、所定の時点で、ＴＲＡＩＬを有さないサンプルのシグナルによりＴＲＡＩＬを有するサンプルのシグナルを割算することにより計算した。図７及び８は、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤにより測定されるようなＴｒａｉｌによるカスパーゼ３誘発、及びカスパーゼ８誘発を示す。

【0116】

実施例Ｖ：ＴＥＶプロテアーゼ熱安定性変異ルシフェラーゼバイオセンサーの活性化

【0117】

本発明の熱安定性変異ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞中のＴＥＶプロテアーゼ活性を検出できるかどうかを評価するために、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位ＧＳＳ−ＥＮＬＹＦＱＳ−ＳＳＧ（配列番号７８）を含む、ＴＬ−ＣＰ２３３バイオセンサー、すなわちＴＬ−ＣＰ２３３−ＴＥＶを生成した。ＴＬ−ＣＰ２３３−ＴＥＶは、Ｍ／ＴＬ残基 ２３３−５４４/ ＧＳＳ−ＥＮＬＹＦＱＳ−ＳＳＧ ＴＬ残基４−２３３／Ｖ (配列番号61 及び62)として表され得るアミノ酸配列を有する。対照として、ホタル（フォチナス・ピラリス；Ｐｐｙ）ルシフェラーゼバイオセンサーＦＦ−ＣＰ２３５−ＴＥＶ (Ｍ/Ｐｐｙ 残基２３４−５４４/ＧＳＳ−ＥＮＬＹＦＱＳ−ＳＳＧ/Ｐｐｙ残基４−２３３/V; 配列番号６３及び６４)、ＦＦ−ＣＰ２６９−ＴＥＶ(Ｍ/Ｐｐｙ残基２６９−５４４/ＧＳＳ−ＥＮＬＹＦＱＳ−ＳＳＧ/Ｐｐｙ残基４−２６８/V; 配列番号:６５及び６６)及び ＦＦ−ＣＰ３５９−ＴＥＶ (Ｍ/Ｐｐｙ残基３５９−５４４/ＧＳＳ−ＥＮＬＹＦＱＳ−ＳＳＧ /Ｐｐｙ残基４−３５５/V; 配列番号６７及び６８)を使用した。すべてのトランスフェクションのために、ＣＭＶプロモーターから連続的に発現されるＴＥＶプロテアーゼ（Genbank受託番号BFB754）をトランスフェクトした。この構造体は、トランスフェクション効率対照としての使用のためにウミシイタケルシフェラーゼを同時発現する。

【0118】

バイオセンサー及びＴＥＶプロテアーゼ構造体の個々を、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞にトランスフェクトした。細胞を、９６−ウェル組織培養プレート中に、１５，０００個の細胞/ウェルでプレートした。トランスフェクション溶液を、表６に従って調製した。個々のセンサーを、ＴＥＶプロテアーゼ又はキャリヤーベクター（pＦ9ａ−null）のいずれかと共に同時トランスフェクトした。
表６

【表6】

【0119】

細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂下で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーションの後、細胞を培地及び５ｍＭのルシフェリンＥＦにより２時間、平衡化した。次に、バイオルミネッセンスをVarioskanルミノメーターにより３７℃で測定した。結果を、トランスフェクション効率のために対照のウミシイタケに対して評価した。

【0120】

ＴＥＶ認識配列（ＦＦ−ＣＰ２３３−リードスルー；ＦＦ−ＣＰ２３３−ＲＴ）を有さないバイオセンサーを、ＴＥＶプロテアーゼにより活性化せず、そして他のバイオセンサーをＴＥＶプロテアーゼにより活性化した（図９）。

【0121】

実施例ＶＩ：グリオーマ細胞におけるアポトーシスの分子イメージング

【0122】

本発明の熱安定性変異バイオセンサーが細胞における細胞死を検出するために使用され得ることを示すために、熱安定性カスパーゼ３バイオセンサー、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ３ ("２３３";配列番号１７及び１８)、ＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ３ ("３５８Ｖ２";配列番号５及び６)、及び熱安定性変異カスパーゼ３バイオセンサー１Ａ５ ("３５８Ｖ３";配列番号７及び ８)、 24 ("３５８Ｖ４";配列番号９ 及び １０)、４３ ("３５８Ｖ５";配列番号ｌ１及び１２) 及び ４９ ("３５８Ｖ６";配列番号１３及び １４)を、グリオーマ細胞系Ｄ５４−ＭＧにおいて安定して発現し、細胞を、ＴＲＡＩＬにより処理し、そしてバイオルミネッセンス測定し、カスパーゼ３活性を検出した。

【0123】

熱安定性バイオセンサーを安定して発現する細胞を誘導するために、Ｄ５４−ＭＧ細胞をバイオセンサーによりトランスフェクトした。バイオセンサーを、ＰＣＲ増幅により、ネオマイシン耐性遺伝子（Invitrogen）を含むｐＥＦベクター中にサブクローン化し、そしてＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位で多重クローニング部位中に挿入した。トランスフェクションを、３μlのFugene6トランスフェクション試薬（Roche）及び１μｇのプラスミドＤＮＡを用いて、６−ウェル組織培養皿において実施した。細胞を、１０％ＦＢＳ（Gibco）、Ｐｅｎ/Ｓｔｒｅｐグルタミン (１００Ｘ; Gibco) 及び２００μg/mL ゲネシチン(G418)を含むRPMI培地（Gibco）に、４８時間、配置した。単一のクローンを、当業界において周知である標準技法を用いて、トランスフェクションのおよそ１０日後、選択した。手短には、培地を細胞から除き、そして細胞を軽くＰＢＳにより洗浄した。丸形フィルター紙をトリプシンに浸し、そして単一のコロニー上に配置した。結合された細胞を含むフィルター紙を除き、そして２４−ウェル組織培養皿中に配置した。それぞれ個々の細胞を、ルシフェラーゼ抗体（Promega；カタログ番号G7451）及びバイオルミネッセンス（PBSにおいて再構成された１００μg／ｍｌのＤ−ルシフェリンを培地に直接、添加し、そして検出した）を用いて、ウェスターンブロットにより、レポーター発現のための選択の約２−３週後、試験した。類似するバイオルミネッセンス活性（最高の発光量比率）及びレポーター発現（ウェスターンブロットにより決定される）を有するクローンを、細胞死の検出への使用のために選択した。

【0124】

細胞死を検出するために、安定Ｄ５４−ＭＧ細胞を、９６−ウェルアッセイプレート中に、１０，０００個の細胞／ウェルで接種し、そして３７℃、５％ＣＯ₂下で２４時間インキュベートした。一晩のインキュベーションの後、細胞を、２００ｎｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（Promega）により処理した。生存細胞バイオルミネッセンスを、２、４及び６時間で映像化した。光子数を、Envisionルミノメーター（Perkin Elmer）を用いて、前−及び後−ＴＲＡＩＬ処理の異なった時点で数えた。レポーター発現及びＴＲＡＩＬ−誘発されたアポトーシスをさらに、ルシフェラーゼ及びカスパーゼ−３に対して、ウェスターンブロットにより検出した。

【0125】

図１０は、ＴＲＡＩＬによる処理に基づいて、種々の熱安全生／バイオセンサーを安定して発現するＤ５４−ＭＧ細胞は、バイオルミネッセンス活性において１００−２００倍の誘発をもたらしたことを示す。異なったバージョンの熱安定性バイオセンサーを発現するＤ５４−ＭＧ細胞を、処理しないか、又は２００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬにより処理し、そして示される時点で映像化し；光子数／秒を示される時点で記録した（図１０Ａ）。処理されていないか又は２００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬにより処理された、異なったバージョンの熱安定性バイオセンサーを発現するＤ５４−ＭＧ細胞の発光量比率を、基線（時間０時）に対して値（光子／秒）を標準化することにより計算した。（図１０Ｂ）。異なったバイオセンサーバージョンにより達成されるフォールドチェンジ（fold changes）の他に、基線、２、４及び６時間の後処理での平均光子数／秒が図１０Ｃに示される。図１０Ｄは、ルシフェラーゼ及びカスパーゼ−３に対する、レポーター発現及びＴＲＡＩＬ誘発されたアポトーシスの検出をウェルターンブロットにより示す。

【0126】

実施例ＶＩＩ：熱安定性変異バイオセンサーの使用

【0127】

in vivoでの細胞死を検出するためへの熱安定性変異バイオセンサーの使用を示すために、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ３ ("２３３"; 配列番号１７及び１８)、ＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ３ ("３５８Ｖ２";配列番号５及び６)、１Ａ５("３５８Ｖ３"; "３−Ｓ";配列番号７及び８)、４３("３５８Ｖ５"; "５−Ｒ";配列番号１１及び１２)又は４９ ("３５８Ｖ６"; "６−Ａ";配列番号１３及び１４)のいずれかを安定して発現するＤ５４−ＭＧ細胞を、ヌードマウス中に移植した。

【0128】

脇腹に異種移植されたマウスモデルを確立するために、上記に列挙されるバイオセンサー（実施例VIに記載されるような）の１つを安定して発現する２×１０⁶個のＤ５４−ＭＧ細胞をヌードマウスに皮下移植した。８ｍｇ／ｋｇのＴＲＡＩＬによる処理を、腫瘍が電子デシタルカルパス測定によりされる場合、腫瘍が約１００ｍｍ³に達した場合に、開始した。invivoバイオルミネッセンス検出のために、マウスに、２％イソフルラン／空気混合物を用いて麻酔をし、そして単一用量（１５０ｍｇ／ｋｇ）のＤ−ルシフェリンを腹腔内注入した。光子数／秒を、ＩＶＩＳイメージングシステム（Caliper Life Sciences）を用いて、ＴＲＡＩＬ処理の前、及び処理の６時間後（図１１A）、得た。発光量比率（図１１B）を、マウス当たり、全処理値に対して後処理値を標準化することにより計算した。

【0129】

データは、本発明の熱安定性変異バイオセンサーが、ＴＲＡＩＬ処理に基づいて１００倍のバイオルミネッセンス活性化が異種移植マウスモデルに見出される場合、非常に敏感であることを示す。Ｄ５４−ＭＧレポーター異種移植されたヌードマウスを、８ｍｇ／ｋｇのＴＲＡＩＬにより処理した。光子数／秒を前−及び後−処理から得た（図１１）。発光量比率を、マウス当たり、前処理値に対する後処理値を標準化することにより計算した（図１１Ｂ）。図１１Ｃは、異なったバイオセンサーバージョンにより達成されるフォールドチェンジの他に、基線での及び処理後６時間での平均光子数／秒を示す表を示す。

【0130】

実施例ＶＩＩＩ：胸骨転移での細胞死のイメージング

【0131】

動物における細胞死を検出するためへの熱安定性カスパーゼ−３バイオセンサーの使用を示すために、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ−３バイオセンサー（グリオーマ細胞についての実施例ＶIに記載されるようにして誘導された）を安定して発現する１００，０００個のＭＤＡ−ＭＢ２３１／１８３３細胞（「１８３３」；乳癌細胞系）を、ヌードマウスの頸骨中に移植した。腫瘍増殖に続いて、ＭＲＩを取り、そしてＴＲＡＩＬ処理を、腫瘍が５−１５ｍｍ³に達した場合に開始した。

【0132】

in vivoバイオルミネッセンス検出のために、マウスを２％イソフルラン／空気混合物を用いて麻酔し、そして単一用量（１５０ｍｇ／ｋｇ）のＤ−ルシフェリンを腹腔内注入した。光子数／秒が、ＴＲＡＩＬ処理の前及び処理後６時間で、又は図１２Ａ−Ｄに示されるように、ＩＶＩＳイメージングシステム（Caliper Life Sciences）を用いて得られた。発光量比率（図１１Ｂ）を、マウス当たり前処理値に対して後処理地を標準化することにより計算した。

【0133】

図１２Ａにおいては、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ−３を安定して発現する頸骨内移植されたＭＤＡ−ＭＢ２３１／１８３３を、ＴＲＡＩＬ（２００ｎｇ／ｍｌ）により処理し、そして１時間ごとに連続して１０分間、映像化した。発光量比率を、前処理値に対してデータを標準化することにより計算した。図１２Ｂにおいては、Ｚ因子を、あらゆる時点で、Zhang et al (Biomol Screen. 4:67-73. 1999)に記載のようにして計算し、そして０．８２の平均Ｚ因子が高生産性スクリーニングのためのアッセイ適合性を満たした。図２Ｃにおいては、代表的なイメージが、ＭＤＡ−ＭＢ２３１／１８３３細胞を安定して発現する頸骨内移植されたＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ−３から示される時点で、光子／秒により取られた。図１２Ｄにおいては、ＴＲＡＩＬにより処理された、異種移植された試験動物の発光量比率が示された。このデータは、マウスモデルにおいて細胞死を力学的に且つ時間経過にわたってイメージングするための熱安定性バイオセンサーの有用性を強調する。

【0134】

実施例ＩＸ：高生産性スクリーニングでの熱安定性カスパーゼバイオセンサーの有用性

【0135】

高生産性スクリーニング（ＨＴＳ）への熱安定性バイオセンサーの有用性を示すために、実施例VIIIからのＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ−３を安定して発現するＭＤＡ−ＭＢ２３１/１８３３ (「１８３３」)細胞を用いて、NIH Clinical Collection Biofocus and TimTec Kinase Inhibitor librariesにおける化合物をスクリーンした。

【0136】

ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ−３ ＭＤＡ−ＭＢ２３１/１８３３細胞を、９６−ウェルプレートに、１０，０００個の細胞／ウェルで接種した。接種の４８時間後、培地を、１％ GloSensor ｃＡＭＰ 試薬 (Promega;カタログ番号Ｅ１２９０)を含むＣＯ₂非依存性培地に変え、そして１０μＭの最終濃度で化合物と共に０〜２３時間インキュベートした。NIH Clinical Collectionにおける合計４８３の化合物及びTimTec Collectionからの８０のキナーゼインヒビターを試験した。培地及び化合物ライブラリーの添加を、Titertek Multidrop Microplate Dispensor (ThermoFisher Scientific)を用いて実施した。相対的ルミネッセンスを、未処理のウェルに対して化合物処理されたウェルの値を標準化することにより計算した（図１３Ａ及び１３Ｃ）。図１３Ａは、NIH Clinical Collection Biofocus Libraryにおける化合物からの化合物処理（最大）に基づく相対的ルミネッセンスを示す。図１３Ｃは、TimTec Kinase Inhibitor Libraryにおける化合物からの化合物処理（最大）に基づく相対的ルミネッセンスを示す。４以上に達する最大値は有意であると見なされる。ヒートマップを、Bioinformatics Toolbox of Matlab Softwareを用いて生成し、そして時間経過にわたってのバイオセンサーの活性化の相互関係を示す（図１３Ｂ及び１３Ｄ）。Ｚ−因子は、実施例VIIIに記載のようにして計算された。

【0137】

熱安定性バイオセンサーの反復されたイメージング能力のために、種々の薬物に応答してのアポプトーシスの力学が映像化され得る。これは、化学療法抵抗性の１８３３の乳癌細胞系において興味ある死誘発性化合物の同定を可能にした。

【0138】

実施例Ｘ：ＭＭＰ−２センサーの精製

【0139】

マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックスの主要タンパク質成分の分解に関与する亜鉛酵素の相同グループである。５種の主要ＭＭＰがヒトに同定されており、そして結合組織転換及び破壊に関与している。それらは、マトリックス部分を占めるタイプＩ，II及びIIIコラーゲンを加水分解する線維芽細胞型及び好中球型隙間性コラーゲンを包含する。線維芽細胞コラゲナーゼはまた、生来型VII及びＸコラーゲンも加水分解する。ＭＭＰは時々、線維芽細胞型及び好中球型コラーゲンがそれぞれＭＭＰ−１及びＭＭＰ８として示される数字コードにより言及される。７２−ｋＤａのゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）が増殖する線維芽細胞及び腫瘍細胞により生成され、ところが明確な９２−ｋＤａのゼラチナーゼ（ＭＭＰ−９）が好中球、マクロファージ及び一定の形質転換された細胞により生成される。

【0140】

本明細書に使用されるＭＭＰ−２センサー（配列番号６９及び７０）は、１Ａ５変異体バックボーン及びヒトＭＭＰ−２認識部位ＰＬＧＭＷＳＲ（配列番号７２）を含む。さらに、ＭＭＰ−２センサーは、次の２種の精製標識を含む：ＴＥＶプロテアーゼ部位によりセンサー領域から分離されるセンサーのＮ末端上のＧＳＴ標識（精製されたＭＭＰ−２センサーからのＧＳＴ標識の除去のための）及びセンサーのＣ末端上の５ｘ ＨＱ (ＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱ; 配列番号７９)標識。

【0141】

ＭＭＰ−２センサーの精製を、Ｈｉｓ及びＧＳＴ精製を用いて、次の通りに実施した。

【0142】

１．ＭＭＰ−２センサーを含むＥ．コリＫＲＸ細胞（Ｐｒoｍｅｇａ）の培養物２〜５ｍｌを、３７℃で振盪しながら、ＬＢ／アンピシリンにおいて増殖した。

【0143】

２．個々の培養物を、０．０５％ラムノース及び０．０５％グルコースを有する１ＬのＬＢにより１：１００に希釈した。

【0144】

３．２５℃で１８−２０時間インキュベートした。

【0145】

４．細胞を５０００ｇで５分間の遠心分離により収穫し（１Ｌを２−５００ｍｌのアリコートに分ける）、細胞ペーストの重量を計測し、そして−２０℃で一晩、置いた。

【0146】

５．２つの細胞ペーストの１つを、３０ｍｌの溶解緩衝液（８．５ｍＬ/ｇの細胞ペースト; ５０ｍＭのＮａＨ₂Ｐ０₄、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭ のイミダゾール及びＮａＯＨによりｐＨ８．０にする）により再懸濁した。１ｍｇ／ｍｌのリソザイムを添加し、そしてその再懸濁液を、時折転倒しながら、氷上で３０分間インキュベートした。

【0147】

６．溶解溶液を、パワー６．０で２分間（５秒の始動、５秒の停止）、音波処理した。１００μｌのサンプルを、「合計」サンプルとして保存した。

【0148】

７．溶解溶液を、１６，０００ｇで２０分間、回転した。１００μｌのサンプルを、「可溶性」サンプルとして保存した。

【0149】

８．６ｍｌの溶解物当たり１ｍｌの５０％Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Oiagen；溶解緩衝により予備洗浄された）（合計５ｍｌ）を添加し、そして４℃で１時間、混合した。

【0150】

９．サンプルをテーブルトップ遠心分離機上で７００ｒｐｍで２分間、回転した。１００μｍｌのサンプルを、「フロースルー（flowthrough）」サンプルとして保存し、そして上清液を捨てた。

【0151】

１０．樹脂を４０ｍｌの溶解緩衝液により洗浄し、４℃で５分間、混合し、テーブルトップ遠心分離機上で７００ｒｐｍで２分間、回転し、そして上清液を捨てた。

【0152】

１１．次に、樹脂を４０ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭのイミダゾールを含む溶解緩衝液）により洗浄し、テーブルトップ遠心分離機上で７００ｒｐｍで２分間、回転し、そして上清液を捨てた。

【0153】

１２．１０ｍｌの洗浄緩衝液を添加し、そして混合し、そして上清液を空のカラムに添加した。

【0154】

１３．カラムを５０ｍｌの洗浄緩衝液により洗浄し、そして１００μｌの樹脂を除き、そして保存した。

【0155】

１４．センサーを、１０ｍｌの溶出緩衝液（２５０ｍＭのイミダゾールを含む溶解緩衝液）によりカラムから溶出し、そして０．５ｍｌの画分を集め、そしてBradfordアッセイを用いて、直接的にアッセイした。

【0156】

１５．１００μlの樹脂を除き、そして保存し、溶出画分を組合し、そしてその組合された画分を１０ｍｌの溶解緩衝液により希釈した。

【0157】

１６．組合された画分を、ＧＳＴ結合／洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ）において透析した。

【0158】

１７．透析されたタンパク質を、ＧＳＴ結合／洗浄緩衝液により予備洗浄された５ｍｌのグルタチオン−セファロース樹脂スラリー（ＧＥカタログ番号１７−０７５６−０１）に添加し、そして４℃で１時間インキュベートした。

【0159】

１８．樹脂混合物をテーブルトップ遠心分離機上で７００ｒｐｍで２分間、回転し、その１００μｌを「フロースルー」として保存し、そして上清液を捨てた。

【0160】

１９．樹脂を空のカラムに添加し、５０ｍｌのＧＳＴ結合／洗浄緩衝液により洗浄し、そしてその１００μｌを除いた。

【0161】

２０．タンパク質を溶出緩衝液（１０ｍＭの還元されたグルタチオンを含む１×ＰＢＳ緩衝液）により溶出した。０．５ｍｌの画分集め、そしてBradfordアッセイを用いて、直接的にアッセイした。１００μlの樹脂を除き、そして保存した。

【0162】

２１．保存された画分（「合計」、「可溶性」、「フロースルー」（ｈｉｓ）、溶出の前のＨｉｓ樹脂、溶出後のＨｉｓ樹脂、透析後のサンプル、フロースル−（ＧＳＴ）、溶出の前のＧＳＴ樹脂、溶出のＧＳＴ樹脂、及びＧＳＴ画分）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した（図１４）。

【0163】

２２．ＧＳＴ画分を組合し、そして貯蔵緩衝液（５０ｍＭ のＨＥＰＥＳｐＨ７．５、1５０ｍＭ のＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、５０％グリセロール）により透析した。

【0164】

精製されたＭＭＰ−２センサーがＭＭＰ−２を検出できることを示すために、精製されたＭＭＰ−２センサー（１．３ｍｇ／ｍｌ）を、図１５に記載のようにして、緩衝液（５０ｍＭ のＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ のＮａＣｌ、１０ｍＭ のＣａＣｌ₂及び０．０５％Brij35）により希釈した。活性化されたＭＭＰ−２（１０ｎｇ／μｌ；Anaspec）を、図１５に記載のようにして、希釈されたＭＭｐ−２センサーン添加した。最終反応混合物の合計体積は５０μｌであった。この混合物を３７℃で１時間インキュベートした。Bright-Glo アッセイ試薬 (Promega)を、その製造業者の説明書に従って調製し、そしてその５０μlを前記混合物に添加した。ルミネッセンスを、GloMax Multiplusルミノメーター上ですぐに読取った。

【0165】

図１５は、対照（ＭＭＰ−２センサーからのバックグラウンド）に対する倍増を表す。その結果は、本発明のＭＭＰ−２センサーが、０．７５ｎｇほどの少ないタンパク質を検出するために使用され得る。

【0166】

精製されたＭＭＰ−２センサーの感受性をさらに示すために、蛍光発生性SensoLyte 520 ＭＭＰ−２アッセイ (Anaspec)をまた使用し、ＭＭｐ−２タンパク質を検出した。アッセイを、その製造業者の説明書に従って実施した。蛍光を、Ｅｘ４９０ｎｍ／Ｅｍ５２０ｎｍでＴｅｃａｎ蛍光計上で検出した。図１６Ａ−Ｂは、Sensolyteアッセイを用いての１．５ｎｇのＭＭＰ−２タンパク質の検出を報告する。

【0167】

実施例ＸＩ：ＣＢＳの無細胞発現

【0168】

本発明のプロテアーゼバイオセンサーが無細胞環境下で外因性クロロテアーゼにより効果的且つ効率的に切断され得ることを示すために、ＣＢＳ変異体１Ａ４を小麦胚芽抽出物において発現し、そしてカスパーゼ−３を検出するために使用した。

【0169】

ＣＢＳ変異体１Ａ５を、ベクターｐＦＮ１９Ｋ Halo Tag (登録商標) (Promegaカタログ番号Ｇ１８４１)中にクローン化し、ＣＢＳ−Halo Tag (登録商標)融合タンパク質（配列番号７１及び７２）を生成した。２０μl（８μg）のＣＢＳ−ＨＴベクターを、３０μlのＴｎＴ（登録商標）ＳＰ６高−収率小麦胚芽発現システム（Promegaカタログ番号L3261）に添加し、そして２５℃で９０分間インキュベートした。

【0170】

ＣＢＳ−ＨＴカスパーゼ−３切断反応に関しては、１体積の発現反応を等体積のカスパーゼ−３含有Ｅ．コリ溶解物又はＣ（３）溶解緩衝液（０．８× FastBreak (Promegaカタログ番号Ｖ８５７Ａ)、１０ｍＭのＤＴＴ、０．１％ＣＨＡＰＳ、０．８ｍｇ／ｍｌのリソザイム、３Ｕ／μｌのＲＱ１ ＤＮアーゼ（Ｐromegaカタログ番号Ｍ６１０Ａ））のいずれかと共にインキュベートし、そして室温で６０分間インキュベートした。カスパーゼ−３含有Ｅ．コリ溶解物を、組換えカスパーゼ−３を過剰発現するＫＲＸ細胞から調製した。手短には、ＫＲＸ細胞を、ｐＴＳ１ｋ：カスパーゼ−３（Ｔ／Ｓ）により形質転換した。開始培養物（５０ｍｌ、ＬＢブイヨン）を、単一コロニーから接種し、そして振盪しながら（２７５ｒｐｍ）、３７℃で１７−２２時間、増殖した。開始培養物を新鮮な培地により希釈し（１：５０）、そして増殖を、さらに３時間、続けた。次に、インキュベーション温度を２５℃に下げ、そして１５分後、カスパーゼ−３の発現を、ラムノースの添加により開始した（０．２％の最終濃度）。２時間後、細胞を遠心分離により集め、５０ｍｌのＣ（３）溶解緩衝液に再懸濁し、そして周囲温度（すなわち、２２−２４℃）で１０分間インキュベートした。溶解物を、遠心分離（２０，０００ｘｇ、４℃で２０分）により透明にし、そしてカスパーゼ−３源として使用した。

【0171】

カスパーゼ−３によるＣＢＳ−ＨＴの切断を次の異なった手段により検出した：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びルミネッセンス検出。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に関しては、切断反応サンプルを、まず蛍光マーカーＣＡ−ＴＡＭ（クロロアルカン−ＴＡＭＲＡリガンド（Promegaカタログ番号G825A））により標識した。２０μｌのサンプルを、２０μｌのＣＡ−ＴＡＭ（緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％ＩＧＥＰＡＬ）により１：１００に希釈される）に添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。このサンプルに、４０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ充填緩衝液 (１２０ｍＭのＴris 緩衝液 (ｐＨ７．４)、１％ＳＤＳ、２５．２％ グリセロール、１．５ｍＭノブロモフェノールブルー 、 １００ｍＭのＤＴＴ)を添加した。得られる溶液を６５℃で３０分間インキュベートした。その１０μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷した。対照として、０．６０、０．１５及び０．０３ｍｇ／ｍｌのＨＴ：ＧＳＴ（HaloTag(登録商標)-GST (Promegaカタログ番号Ｇ４４９Ａ）融合体をまた、前記ゲル上に負荷した（図１７）。電気泳動の後、ＣＡ−ＴＡＭ標識された種を、蛍光イメージング(ｅｘ:５３２、 Ｅｍ:５８０; 図１７)により検出した。ルミネッセンスによる検出のために、４０μｌの切断反応サンプルを、６０μｌの緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））及び１００μｌのBright−Gloアッセイ試薬に添加した。ルミネッセンスを、前記のようにして検出した（表７）。
表７

【表7】

【0172】

実施例ＸＩＩ：ＣＢＳの固定化

【0173】

無細胞環境下で発現される本発明のプロテアーゼバイオセンサーがら、固体支持体上に固定される場合、活性を維持すること示すために、小麦胚芽抽出物において発現されるＣＢＳ−ＨＴ融合体（実施例XI）を、固体支持体（樹脂及びプレート）に固定し、そしてそれを用いて、カスパーゼ−３を検出した。

【0174】

樹脂への固定化（図１８Ａ）に関しては、Haldink樹脂（２５％スラリー、Promegaカタログ番号G1912）をまず、ＨＴＰＢ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．５)、１５０ ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ及び０．５ｍＭのＥＤＴＡ）により平衡化した。１体積のスラリーからの樹脂を遠心分離機（１０００ｘｇで５分）により集め、そして貯蔵緩衝液を除いた。樹脂ペレットを２体積のＨＴＰＢに再懸濁し、そして混合した。この工程を合計３回のＨＴＰＢ洗浄のために反復した。実施例ＸＩ（無細胞発現反応）からのＣＢＳ−ＨＴ融合体１００μｌを、２５μｌの洗浄された樹脂（ＨＴＰＢ中、５０％スラリー）と共に混合し、そして４℃で混合しながら、一晩インキュベートした。インキュベーションを周囲温度で２時間、続けた。インキュベーションの後、樹脂を洗浄し、未結合ＣＢＳを除いた。樹脂を５０μｌアリコートにわけ、そして個々のアリコートをＨＴＰＢにより３度、洗浄した。最終樹脂ペレットを、５０μｌのＨＴＰＢに再懸濁した。

【0175】

ＣＢＳカスパーゼ−３切断反応に関しては、２０μｌの洗浄された樹脂を、２０μｌのカスパーゼ−３含有Ｅ．コリ溶解物又はＣ（３）溶解緩衝液（実施例ＸＩにおけるような）のいずれかと共に混合し、そして周囲温度で３０分インキュベートした。６０μｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を前記サンプルに添加し、続いて１００μｌのBright-Gloアッセイ試薬を添加した。ルミネッセンスを前記のようにして検出した（表８及び図１９）。
表８

【表8】

【0176】

プレートへの固定化（図１８Ｂ）に関しては、ＣＢＳ−ＨＴ融合タンパク質を固定化するためのHalotag（登録商標）リガンドを含むマイクロタイタープレートを調製した。手短には、アミン−ＰＥＧ２００−ＣｌアルカンHaloTag（等力商標）リガンド（０．２５ｍＭの最終濃度）を含む重炭酸塩緩衝液ｐＨ８．５（１００μl）；ｐｂｉ３９６１及びメトキシ−ＰＥＧ−ＮＨ₂（０．７５ｍＭの最終濃度）を、ＮＨＳマイクロタイタープレートのウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。次に、ウェルを、０．０５％Tween−２０を含むＰＢＳにより３度、洗浄した。洗浄の後、５０ｍＭのエタノールアミンを添加し、そしてプレートを周囲温度で３０分間インキュベートし、そして０．０５％Tween−２０を含むＰＢＳにより再び３度、洗浄した。次にプレートを、個々のウェルにおいて、０．０５％Tween−２０を含むＰＢＳと共に４℃で貯蔵した。アッセイに関しては、ウェルを２００μｌのＨＰＴＢにより３度、洗浄した。５０μｌのＣＢＳ−ＨＴ無細胞発現反応物（実施例ＸＩ）をウェルに添加し、そして４℃で一晩インキュベートした。インキュベーションに続いて、プレートを２００μｌのＰＢＳＩ（０．０５％ＩＧＥＰＡＬを含む１×ＰＢＳ）により３度、洗浄した。１００μｌのカスパーゼ−３を含むＥ．コリ溶解物又はＣ（３）溶解緩衝液（上記に記載される）を添加し、そしてプレートを混合しながら、室温で６０分間インキュベートした。次に、ウェルを１００μｌのＰＢＳＩにより洗浄した。１００μｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び１００μｌのBright-Gloアッセイ試薬を添加し、そしてルミネッセンスを前記のようにして検出した（表９）。
表９

【表9】

【0177】

実施例ＸＩＩＩ：E.コリにおけるＣＢＳ発現

【0178】

本発明のプロテアーゼバイオセンサーがE.コリにおいて発現され、そして機能することができることを示すために、ＣＢＳ変異体１Ａ５をＥ．コリにおいて発現し、そしてそれを用いて、カスパーゼ−３を検出した。

【0179】

ＣＢＳ変異体１Ａ５を、HaloTag（登録商標（ＣＢＳのＣ末端例）及び５ｘＨＱ標識（ＣＢＳのＮ末端側）を含む細菌発現ベクター(ｐＦＮＡ:ＨＱ（５ｘ）:ＣＢＳ：ＨＴ（７）; 配列番号７３及び７４)中にクローン化した。この融合タンパク質を、次の通りにしてＥ．コリにおいて発現した：Ｅ．コリ（ＫＲＸ）ベクターにより形質転換した。開始培養物（５０ｍｌ、ＬＢブイヨン）を、単一コロニーから接種し、そして振盪（２７５ｒｐｍ）しながら、３７℃で１７−２２時間、増殖した。開始培養物を、誘発培地（５００ｍＬ、０．０５％グルコース及び０．０２％ラムノースを含むＬＢブイヨン）中に希釈し（１：５０）、そして増殖を、振盪（２７５ｒｐｍ）しながら、２５℃で、さらに１７−２２時間続けた。培養物を２つの２５０ｍｌアリコートに分け、そして細胞を遠心分離（４℃で２０分間、５，０００ｘｇ）により集めた。１つの細胞ペレットを、溶解緩衝液（２５ｍＬ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．５)、０．２Ｘ FastBreak、２ｍＭのＤＴＴ、０．０５％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのアルギニン、５０ｍＭのグルタミン酸、０．２ｍｇ／ｍＬのリソザイム、ｌＯＵ／ｍＬのＲＱ１ ＤＮアーゼ及びプロテアーゼインヒビター(Beckton/Dickenson カタログ番号５４４７７９)）に再懸濁し、そして氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、サンプルを音波処理した（Misonix Sonicator-3000、合計４分、５秒の開始、５秒の休止、パワー設定５）。粗溶解物を、遠心分離（４℃で２０分間、２０，０００ｘｇ）により透明にし、そして上清液（透明な溶解物）をＣＢＳ源として使用した。カスパーゼ−３切断反応に関しては、２０μｌの透明な溶解物を、カスパーゼ−３を発現するＥ．コリ溶解物（実施例XII）２０μｌと共に混合し、そして室温で３０分間インキュベートした。６０μlのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を添加し、続いて１００μｌのBright-Gloアッセイ試薬を添加した。ルミネッセンスを上記のようにして検出した（図２０）。

【0180】

実施例ＸＩＶ：Ｅ．コリからのＣＢＳの精製

【0181】

Ｅ．コリからの本発明の機能プロテアーゼバイオセンサーを精製する能力を示すために、実施例XIIIにおいて発現されるＣＢＳを、HisLink（Promegaカタログ番号V8821）カラムクロマトグラフィーを用いて、その製造業者の説明書に従って精製した。手短には、２５ｍｌの透明にされた溶解物をＮａＣｌにより０．５Ｍにし（最終濃度）、そして結合緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５)、１０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ）により平衡化された、固定されたHisLink樹脂２ｍｌに適用した。樹脂を、１２ｍｌの結合緩衝液、続いて溶出緩衝液（１００mのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのイミダゾール）により洗浄した。１．７５ｍｌの画分を集めた。

【0182】

ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル分析に関しては、サンプルをＣＡ−ＴＡＭにより標識し、そして前記のようにして分析した（図２１Ａ）。カスパーゼ−３切断反応に関しては、２０μｌの個々のサンプルを、２０μｌのカスパーゼ−３を発現するＥ．コリ溶解物（実施例XII）と共に混合し、そして室温で３０分間インキュベートした。６０μlのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を添加し、続いて１００μｌのBright−Gloアッセイ試薬を添加した。ルミネッセンスを、上記のようにして検出した（表１０及び図２１B）。
表１０

【表10】

【0183】

実施例ＸＶ：Ｅ．コリ発現されたＣＢＳの固定化

【0184】

Ｅ．コリに発現されるプロテアーゼバイオセンサーが、プロテアーゼを検出する能力を維持しながら、固体支持体に固定され得ることを示すために、精製されたＨＱ：ＣＢＳ：ＨＴ(５ｘＨＱ標識:ＣＢＳ: HaloTag)を、HaloLink樹脂及びHaloLinkプレート上に固定し、そしてカスパーゼ−３による活性化についてアッセイした。HaloLink樹脂上への固定化のために、１００μlの精製されたＨＱ：ＣＢＳ：ＨＴを、３０μｌの固定されたHaloLink樹脂（前記のようにＨＴＰＢにより予備平衡化された）に添加し、そして周囲温度で２時間インキュベートした。樹脂を、３００μｌのＨＴＰＢにより３度、洗浄し、そして最終樹脂ペレットを、３００μｌのＨＴＰＢに再懸濁した。５０μｌの洗浄された樹脂を、カスパーゼ−３を含むＥ．コリ溶解物２０μｌ又はＣ（３）溶解緩衝液５０μｌに添加し、そして終止温度で３０分間インキュベートした。１００μｌのBright-Gloアッセイ試薬を添加し、そしてルミネッセンスを前述のようにして検出した（表１１及び図２２）。

【0185】

HaloLinkプレート上への固定化のために、１００μlの精製されたＨＱ：ＣＢＳ：ＨＴを、固定されたHaloTag（登録商標）リガンドを含むマイクロタイタープレートに添加した（実施例XII）。プレートを、混合しながら、室温で２時間インキュベートした。次に、プレートを、１× ＰＢＳＩ（０．０５％ＩＧＥＰＡＬを含む１×ＰＢＳ）により３度、洗浄し、そしてカスパーゼ−３を含むＥ．コリ溶解物（前述のようにして調製された）１００μｌと共に室温で３０分間インキュベートした。１００μｌのBright−Gloアッセイ試薬を添加し、そしてルミネッセンスを前述のようにして検出した（表１１及び図２２）。
表１１

【表11】

【0186】

すべての出版物、特許及び特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書においては、本発明はその一定の態様に関して記載されており、そして多くの詳細が例示目的のために示されて来たが、本発明は追加の態様に影響されやすく、そして本明細書における一定の詳細が、本発明の基本的原理から逸脱することなく、相当に変更され得ることは、当業者に明らかであろう。

【0187】

従って、本発明は、中でも、標的分子に対する増強された応答を有する、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを提供する。本発明の種々の特徴及び利点が次のクレームに示される。
本発明の態様として、例えば以下のものがある。
〔１〕修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼ及び前記熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端部分に前記熱安定性ルシフェラーゼのＣ末端部分を連結するリンカーを含むバイオセンサーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは親の円順列熱安定性ルシフェラーゼに関連して修飾され、前記リンカーは細胞中の標的分子と相互反応できるセンサー領域を含み、ここで前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは、ｉ）前記標的分子の存在下での前記親の円順列熱安定性ルシフェラーゼ、又はｉｉ）前記標的分子の不在下での前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼの少なくとも１つに関し、標的分子とバイオセンサーとの相互反応の後、増強された応答を有する、ポリヌクレオチド。
〔２〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置５０７に対応するアミノ酸で置換を含む、前記〔１〕記載のポリヌクレオチド。
〔３〕前記位置５０７でのアミノ酸がＩである、前記〔２〕記載のポリヌクレオチド。
〔４〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置５０３に対応するアミノ酸で置換を含む、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔５〕前記位置５０３でのアミノ酸がＧである、前記〔４〕記載のポリヌクレオチド。
〔６〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置４７１に対応するアミノ酸で置換を含む、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔７〕前記位置４７１でのアミノ酸がＴである、前記〔６〕記載のポリヌクレオチド。
〔８〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置１９３に対応するアミノ酸で置換を含む、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔９〕前記位置１９３でのアミノ酸がＰである、前記〔８〕記載のポリヌクレオチド。
〔１０〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＩ４７１Ｔ、 Ｓ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ及びＳ１９３Ｐに対応するアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１１〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＩ４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ及びＴ５０７Ｉに対応するアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１２〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＳ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ及びＳ１９３Ｐに対応するアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１３〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＴ５０７Ｉに対応するアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１４〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置５、１７、２１、２３、２６、３９、４４、５１、８１、１０１、１０３、１１０、１１４、１１５、１１９、１２３、１２６、１２８、１３３、１３７、１８６、１９１、１９２、１９３、１９６、２０８、２１１、２１４、２２６、２２８、２３０、２３３、２６４、２７３、２７５、２８６、２８７、２９４、２９５、２９７、３０２、３０３、３０４、３０６、３０８、３０９、３１３、３２４、３２９、３３１、３４３、３４８、３５３、３６４、３７４、３８５、３８９、４０９、４２０、４２６、４２７、４２８、４３１、４４９、４５６、４６０、４６１、４６５、４６６、４６８、４７１、４７３、４８２、４８４、４８５、４８９、４９３、４９４、４９７、５０３、５０７、５０９、５１０、５１３、５１６、５１７、５２１、５２２、５２３、５２６、５３０、５３３、５３６、５３７、５４２又は５４３、又はそれらの組合せに対応する少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１５〕前記熱安定性ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼの残基２−１２、残基３２−５３、残基７０−８８、残基１０２−１２６、残基１３９−１６５、残基１８３−２０３、残基２２０−２４７、残基２６２−２７３、残基３０３−３１３、残基３５３−４０８、残基４８５−４９５又は残基５３５−５４６に対応する領域で円順列される、前記〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１６〕前記バイオセンサーが、プロテアーゼ認識部位、キナーゼ認識部位、抗体結合部位、金属結合部位、イオン結合部位、環状ヌクレオチド結合部位又はヌクレオチド結合部位を含む、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１７〕前記バイオセンサーがプロテアーゼ認識部位を含む、前記〔１〕〜〔１６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１８〕前記プロテアーゼ認識部位が、カスパーゼ３認識部位、カスパーゼ８認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、前立腺血清抗原認識部位、ＳＡＲＳウィルスプロテアーゼ認識部位、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位、グランザイムＢ認識部位、ＭＭＰ認識部位及びライノウィルスプロテアーゼ認識部位から成る群から選択される、前記〔１７〕記載のポリヌクレオチド。
〔１９〕前記熱安定性ルシフェラーゼが、ルキオラ・クルキアタ（Luciola cruciata）、ルキオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）、ピロコエリア・ミヤコ（pyrocoelia miyako）、ラムピリス・ノクチルカ（Lampyris noctiluca）、フォツリス・ペンシルバニカ（Photuris pennsylvanica）、フェンゴデスsp.（Phengodes sp.）、ルキオラ・ミングレリカ（Luciola mingrelica）及びフォチナス・ピラリス（photinus pyralis）から成る群から選択された種からの野生型ルシフェラーゼから変性される、前記〔１〕〜〔１８〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔２０〕前記熱安定性ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼである、前記〔１〕〜〔１９〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔２１〕前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する、前記〔２０〕記載のポリヌクレオチド。
〔２２〕前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号４に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、前記〔２０〕記載のポリヌクレオチド。
〔２３〕前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する、前記〔２０〕記載のポリヌクレオチド。
〔２４〕前記リンカーが前記センサー領域ＤＥＶＤを含む、前記〔１〕〜〔２３〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔２５〕前記リンカーが、ＳＳＤＥＶＤＧＳＳＧ(配列番号52)、ＳＳＧＳＤＥＶＤＧＳＬＳＳＧ(配列番号53)、ＳＤＥＶＤＧＳＬ(配列番号54)又はＤＥＶＤＧ(配列番号55)である、前記〔１〕〜〔２４〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔２６〕配列番号６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔２７〕前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔２８〕前記ポリヌクレオチドがプロモーターに操作可能に結合される、前記〔２７〕記載のポリヌクレオチド。
〔２９〕前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、又は前記〔２７〕又は〔２８〕記載のベクターを含む細胞。
〔３０〕前記〔２９〕記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。
〔３１〕前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチドによりコードされる修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー。
〔３２〕修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの発現を可能にする条件下で前記〔２９〕記載の細胞を増殖することを含む、修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの製造方法。
〔３３〕修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの発現を可能にする条件下で前記〔２７〕又は〔２８〕記載のベクターを細胞中に導入することを含む、修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの製造方法。
〔３４〕前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド又は前記〔２７〕又は〔２８〕記載のベクターを含むキット。
〔３５〕細胞中の標的分子の存在の検出方法であって、
ａ）前記細胞と、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド又は前記〔２７〕又は〔２８〕記載のベクター及び修飾された熱安定性ルシフェラーゼのための基質とを接触させ；そして
ｂ）前記細胞中のルミネッセンスを検出することを含み、この際、前記標的分子が前記修飾された熱安定性ルシフェラーゼと相互反応できる、方法。
〔３６〕細胞中の標的分子の存在の検出方法であって、
ａ）前記細胞と、前記〔３１〕記載の修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び前記修飾された熱安定性ルシフェラーゼのための基質とを接触させ；そして
ｂ）前記細胞中のルミネッセンスを検出することを含み、この際、前記標的分子が前記修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーと相互反応できる、方法。
〔３７〕サンプル中の標的分子の存在又は活性の検出方法であって、
ａ）標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするポリヌクレオチド及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と前記サンプルとを接触させ；そして
ｂ）前記サンプル中のルミネッセンスを検出することを含む方法。
〔３８〕前記サンプルが、細胞、動物、細胞溶解物、又はin vitro転写／翻訳混合物である、前記〔３７〕記載の方法。
〔３９〕前記標的分子がプロテアーゼである、前記〔３５〕〜〔３８〕のいずれか１項記載の方法。
〔４０〕前記プロテアーゼが、カスパーゼ３、カスパーゼ８、ＴＥＶプロテアーゼ又はＭＭＰ−２である、前記〔３９〕記載の方法。
〔４１〕前記標的分子の活性を変更できる試験化合物をさらに添加することを含む、前記〔３５〕〜〔４０〕のいずれか１項記載の方法。
〔４２〕ルミネッセンスがin vivoイメージングにより検出される、前記〔３５〕〜〔４１〕のいずれか１項記載の方法。
〔４３〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞において発現される、前記〔３７〕〜〔４２〕のいずれか１項記載の方法。
〔４４〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞が、動物中に注入されるか又は移植される、前記〔４３〕記載の方法。
〔４５〕細胞中の標的分子の存在又は活性の検出方法であって、
ａ）標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と細胞とを接触させ；そして
ｂ）前記細胞中のルミネセンスを検出することを含む方法。
〔４６〕前記標的分子がプロテアーゼである、前記〔４５〕記載の方法。
〔４７〕前記プロテアーゼが、カスパーゼ３、カスパーゼ８、ＴＥＶプロテアーゼ又はＭＭＰ−２である、前記〔４６〕記載の方法。
〔４８〕前記標的分子の活性を変更できる試験化合物をさらに添加することを含む、前記〔４５〕〜〔４７〕のいずれか１項記載の方法。
〔４９〕動物中の標的分子の存在又は活性の検出方法であって、
ａ）前記標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と前記動物とを接触させ；そして
ｂ）前記動物中のルミネッセンスを検出することを含む方法。
〔５０〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞において発現される、前記〔４９〕記載の方法。
〔５１〕前記細胞が、前記動物中に注入されるか又は移植される、前記〔５０〕記載の方法。
〔５２〕前記ルシフェラーゼのための基質が前記動物中に注入される、前記〔４９〕〜〔５１〕のいずれか１項記載の方法。
〔５３〕前記動物がマウスである、前記〔４９〕〜〔５２〕のいずれか１項記載の方法。
〔５４〕前記標的分子の活性を変更できる試験化合物をさらに添加することを含む、前記〔４９〕〜〔５３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５５〕ルミネッセンスがイメージングにより検出される、前記〔４９〕〜〔５４〕のいずれか１項記載の方法。
〔５６〕サンプル中の標的分子の存在又は活性の検出方法であって、
ａ）前記標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを、固体支持体上の固定し；
ｂ）前記標的分子を含むサンプルを、前記固定されたバイオセンサーに添加し；
ｃ）前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質を添加し、そして
ｄ）ルミネッセンスを検出することを含む方法。
〔５７〕前記固体支持体が、粒子、樹脂、カラム、ウェルボトム、プレート又はスライドである、前記〔５６〕記載の方法。
〔５８〕前記標的分子がプロテアーゼである、前記〔５６〕又は〔５７〕記載の方法。
〔５９〕前記プロテアーゼが、カスパーゼ３、カスパーゼ８、ＴＥＶプロテアーゼ又はＭＭＰ−２である、前記〔５８〕記載の方法。
〔６０〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが、精製されるか、又は細胞溶解物において発現される、前記〔５６〕〜〔５９〕のいずれか１項記載の方法。
〔６１〕前記標的分子が精製されるか、又は細胞溶解物において発現される、前記〔５６〕〜〔６０〕のいずれか１項記載の方法。
〔６２〕サンプル中のアポトーシスの検出方法であって、
ａ）アポトーシスに関与する分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするポリヌクレオチド及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と前記サンプルとを接触させ；そして
ｂ）前記サンプル中のルミネッセンスを検出することを含む方法。
〔６３〕前記サンプルが、細胞、動物、細胞溶解物、又はin vitro転写／翻訳混合物である、前記〔６２〕記載の方法。
〔６４〕前記標的分子がプロテアーゼである、前記〔６２〕又は〔６３〕記載の方法。
〔６５〕前記プロテアーゼが、カスパーゼ３又はカスパーゼ８である、前記〔６４〕記載の方法。
〔６６〕前記標的分子の活性を変更できる試験化合物をさらに添加することを含む、前記〔６２〕〜〔６５〕のいずれか１項記載の方法。
〔６７〕ルミネッセンスがin vivoイメージングにより検出される、前記〔６２〕〜〔６６〕のいずれか１項記載の方法。
〔６８〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞において発現される、前記〔６２〕〜〔６７〕のいずれか１項記載の方法。
〔６９〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞が、動物中に注入されるか又は移植される、前記〔６８〕記載の方法。
〔７０〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチドによりコードされる、前記〔３７〕〜〔６９〕のいずれか１項記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図11】

【図12-1】

【図15】

【図16】

【図18】

【図19】

【図20】

【図22】

【図10-2】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図17】

【図21】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]