特許 5961191 テクネチウム標識ペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5961191

(24)【登録日】2016年7月1日

(45)【発行日】2016年8月2日

(54)【発明の名称】テクネチウム標識ペプチド

(51)【国際特許分類】

   A61K 51/00 20060101AFI20160719BHJP

【ＦＩ】

   A61K49/02 BZNA

【請求項の数】14

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2013-555887(P2013-555887)

(86)(22)【出願日】2012年3月2日

(65)【公表番号】特表2014-506910(P2014-506910A)

(43)【公表日】2014年3月20日

(86)【国際出願番号】EP2012053614

(87)【国際公開番号】WO2012119937

(87)【国際公開日】20120913

【審査請求日】2015年2月27日

(31)【優先権主張番号】1103696.9

(32)【優先日】2011年3月4日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】61/449,102

(32)【優先日】2011年3月4日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】305040710

【氏名又は名称】ジーイー・ヘルスケア・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100137545

【弁理士】

【氏名又は名称】荒川 聡志

(74)【代理人】

【識別番号】100105588

【弁理士】

【氏名又は名称】小倉 博

(74)【代理人】

【識別番号】100129779

【弁理士】

【氏名又は名称】黒川 俊久

(72)【発明者】

【氏名】アイブソン，ピーター・ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】インドレヴォール，バード

(72)【発明者】

【氏名】ニュートン，ベン

(72)【発明者】

【氏名】バッラ，ラジヴ

(72)【発明者】

【氏名】ヨハネセン，エドウィン・ウィルヘルム

【審査官】 六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５２４５９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２６８５９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４９／００−４９／２２

Ａ６１Ｋ ５１／００−５１／１２

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドのキレーターコンジュゲートの放射性^xＴｃ錯体を含んでなるイメージング剤であって、前記キレーターコンジュゲートが次の式Ｉを有する、イメージング剤。
Ｚ¹−［ｃＭＢＰ］−Ｚ²
（Ｉ）
（式中、
^xＴｃは放射性同位体^94mＴｃ又は^99mＴｃであり、
ｃＭＢＰは次の式ＩＩの１８〜３０量体ｃ−Ｍｅｔ結合環状ペプチドであり、
−（Ａ）_x−Ｑ−（Ａ'）_y−
（ＩＩ）
（式中、
Ｑは次のアミノ酸配列（配列番号１）であり、
−Ｃｙｓ^a−Ｘ¹−Ｃｙｓ^c−Ｘ²−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ³−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ^d−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ^b−Ｔｙｒ−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−
（式中、Ｘ¹はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘ²はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、Ｘ³はＴｈｒ又はＡｒｇであり、Ｘ⁴はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ⁵はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ⁶はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｃｙｓ^a-dの各々はシステイン残基であって、残基ａ及びｂ並びに残基ｃ及びｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）
Ａ及びＡ'の一方はＣｙｓ以外の任意のアミノ酸であって、他方の−（Ａ）_x−基又は−（Ａ'）_y−基は−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドであって、前記リンカーペプチドのＬｙｓ残基のε−アミン基にＺ³基が結合していて、Ｚ³基が^xＴｃと錯形成しており、
ｘ及びｙは独立に０〜１３の値を有する整数であって、［ｘ＋ｙ］＝１〜１３となるように選択される。）
Ｚ¹はｃＭＢＰのＮ末端に結合していて、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^G（式中、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^GはＣ_1-6アルキル基及びＣ_3-10アリール基から選択されるＲ^Gを有するか、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位を含む。）であり、
Ｚ²はｃＭＢＰのＣ末端に結合していて、第一アミドであり、
Ｚ³は次の式（ＩＩＩ）のキレーターであり、

【化1】

（式中、Ｅ¹〜Ｅ⁶は各々独立にＲ'基であり、
各Ｒ'は独立にＨ或いはＣ_1-4アルキル、Ｃ_3-7アルキルアリール、Ｃ_2-7アルコキシアルキル、Ｃ_1-4ヒドロキシアルキル、Ｃ_1-4フルオロアルキル、Ｃ_2-7カルボキシアルキル又はＣ_1-4アミノアルキルであるか、或いは２以上のＲ'基がそれに結合した原子と共に炭素環式又は複素環式の飽和又は不飽和環を形成しており、
Ｌは式−（Ａ”）_m−（式中、各Ａ”は独立に−ＣＲ₂−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ₂ＣＯ₂−、−ＣＯ₂ＣＲ₂−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ₂ＮＲ−、−ＮＲＳＯ₂−、−ＣＲ₂ＯＣＲ₂−、−ＣＲ₂ＳＣＲ₂−、−ＣＲ₂ＮＲＣＲ₂−、Ｃ_4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ_4-8シクロアルキレン基、Ｃ_5-12アリーレン基又はＣ_3-12ヘテロアリーレン基或いは単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_2-4アルケニル、Ｃ_2-4アルキニル、Ｃ_1-4アルコキシアルキル及びＣ_1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜１０の値を有する整数である。）の合成リンカー基である。）

【請求項2】

Ｑが次の配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のイメージング剤。
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ^a−Ｘ¹−Ｃｙｓ^c−Ｘ²−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ³−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ^d−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ^b−Ｔｙｒ−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶（配列番号２）、
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ^a−Ｘ¹−Ｃｙｓ^c−Ｘ²−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ³−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ^d−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ^b−Ｔｙｒ−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（配列番号３）。

【請求項3】

Ｘ³がＡｒｇである、請求項１又は請求項２記載のイメージング剤。

【請求項4】

ｃＭＢＰが次のアミノ酸配列（配列番号７）を有する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のイメージング剤。
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ^a−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ^c−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ^d−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ^b−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ。

【請求項5】

キレーターが次の式ＩＩＩＡを有する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のイメージング剤。

【化2】

（式中、ｑは１〜６の値を有する整数であり、Ａ”は式（ＩＩＩ）に関して定義した通りである。）

【請求項6】

^xＴｃが^99mＴｃである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のイメージング剤。

【請求項7】

請求項１乃至請求項５のいずれか１項で定義された式Ｉのキレーターコンジュゲート。

【請求項8】

請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のイメージング剤の製造方法であって、請求項７記載のキレーターコンジュゲートを適当な溶媒中において請求項１又は請求項６で定義された^xＴｃの供給物と反応させることを含んでなる方法。

【請求項9】

請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のイメージング剤を、哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる放射性医薬組成物。

【請求項10】

請求項９記載の放射性医薬組成物を製造するためのキットであって、請求項７記載のキレーターコンジュゲートを無菌固体形態で含んでいる結果、生体適合性キャリヤー中の放射性^xＴｃ（ここで、^xＴｃは請求項１又は請求項６で定義した通りである。）の無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の放射性医薬組成物を与える、キット。

【請求項11】

ヒト又は動物の身体をイメージングする方法であって、当該方法はＰＥＴ又はＳＰＥＣＴを用いて請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のイメージング剤又は請求項９記載の放射性医薬組成物が分布した前記身体の少なくとも一部の画像を生成する段階を含み、前記イメージング剤又は前記組成物は前記身体に予め投与されている、方法。

【請求項12】

画像がｃ−Ｍｅｔの過剰発現部位又は局在部位のものである、請求項１１記載の方法。

【請求項13】

ｃ−Ｍｅｔの過剰発現部位又は局在部位が癌又は前癌病変である、請求項１２記載の方法。

【請求項14】

薬物又は放射線によるヒト又は動物の身体の治療効果をモニターするために繰り返して実施される、請求項１１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法であって、前記イメージングは前記治療前及び前記治療後に実施され、任意には前記治療中にも実施される、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、インビボでのＳＰＥＣＴ又はＰＥＴイメージングに適した放射性標識ｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドを含んでなるテクネチウムイメージング剤に関する。ｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドは、キレーターコンジュゲートを介して標識される。また、医薬組成物、かかる薬剤及び組成物の製造方法、並びに特に癌の診断で使用するための、かかる組成物を用いたインビボイメージング方法も開示される。

【背景技術】

【0002】

散乱因子（ＳＦ）としても知られる肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、創傷治癒や血管形成のような各種の生理学的過程に関与する増殖因子である。ＨＧＦとその受容体（ｃ−Ｍｅｔ）との高親和性相互作用は、腫瘍の増殖、浸潤及び転移に関与している。

【0003】

Ｋｎｕｄｓｅｎ ｅｔ ａｌは、前立腺癌におけるＨＧＦ及びｃ−Ｍｅｔの役割を、イメージング及び治療に対する可能な関与を含めて総説している［Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，９１，３１−６７（２００４）］。診断及び治療用の標識抗ｍｅｔ抗体は、国際公開第０３／０５７１５５号に記載されている。

【0004】

ｃ−Ｍｅｔは、上皮由来の多くのヒト癌における腫瘍の増殖、浸潤及び転移に関係することが証明されている。ｃ−Ｍｅｔは大抵の癌によって発現され、正常組織に比べて上昇したその発現は肺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、腎臓癌、神経膠腫、黒色腫及び若干の肉腫を含む多くの癌において検出されてきた。結腸直腸癌（ＣＲＣ）では、この疾患の最も早期の新生物発生前病変である異形成の異常陰窩病巣においてｃ−Ｍｅｔの過剰発現が検出されている。頭頸部の扁平上皮細胞癌では、報告によれば、ｃ−Ｍｅｔは原発腫瘍のおよそ８０％で発現又は過剰発現されるという。骨への前立腺癌転移では、ｃ−Ｍｅｔは８０％を超える骨転移で過剰発現されると報告された。

【0005】

正常条件下では、ｃ−Ｍｅｔは上皮細胞上に発現され、間葉由来のＨＧＦによってパラクリン的に活性化される。正常細胞におけるｃ−Ｍｅｔの活性化は一時的なイベントであり、厳しく制御されている。しかし、腫瘍細胞では、ｃ−Ｍｅｔは本質的に活性であり得る。癌では、ｃ−Ｍｅｔの増幅／過剰発現、活性化をもたらすｃ−Ｍｅｔの突然変異（例えば、構造変化）、及び自己分泌シグナリングループの創成による自律増殖調節の獲得によって異常なｃ−Ｍｅｔ亢進が達成されることがある。加えて、ｃ−Ｍｅｔ受容体の不完全なダウンレギュレーションもまた、細胞膜における異常なｃ−Ｍｅｔ発現の一因となる。ｃ−Ｍｅｔの過剰発現はＨＧＦ依存性（自己分泌性／パラクリン性）であるが、突然変異によって引き起こされる構造変化（例えば、細胞外ドメインの喪失）はＨＧＦ非依存性である。

【0006】

国際公開第２００４／０７８７７８号は、ｃ−Ｍｅｔ又はｃ−Ｍｅｔ及びＨＧＦを含む複合体と結合するポリペプチド又は多量体ペプチド構築物を開示している。約１０の異なるペプチド構造クラスが記載されている。国際公開第２００４／０７８７７８号には、インビトロ及びインビボ用途のための検出可能な標識或いは治療用途のための薬物でペプチドを標識できることが開示されている。検出可能な標識は、酵素、蛍光化合物、光学色素、常磁性金属イオン、超音波造影剤又は放射性核種であり得る。国際公開第２００４／０７８７７８号の好ましい標識は放射性又は常磁性であると述べられており、最も好ましくは金属キレーターでキレート化される金属からなる。国際公開第２００４／０７８７７８号には、そこにおける放射性核種は¹⁸Ｆ、¹²⁴Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹²³Ｉ、⁷⁷Ｂｒ、⁷⁶Ｂｒ、^99mＴｃ、⁵¹Ｃｒ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁴⁷Ｓｃ、¹⁶⁷Ｔｍ、¹⁴¹Ｃｅ、¹¹¹Ｉｎ、¹⁶⁸Ｙｂ、¹⁷⁵Ｙｂ、¹⁴⁰Ｌａ、⁹⁰Ｙ、⁸⁸Ｙ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁶⁶Ｈｏ、¹⁶⁵Ｄｙ、¹⁶⁶Ｄｙ、⁶²Ｃｕ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、⁹⁷Ｒｕ、¹⁰³Ｒｕ、¹⁸⁶Ｒｅ、²⁰³Ｐｂ、²¹¹Ｂｉ、²¹²Ｂｉ、^2l3Ｂｉ、^2l4Ｂｉ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁰⁹Ｐｄ、^117mＳｎ、¹⁴⁹Ｐｍ、¹⁶¹Ｔｂ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁹⁸Ａｕ及び¹⁹⁹Ａｕから選択できると述べられている。国際公開第２００４／０７８７７８号（６２頁）には、診断目的のための好ましい放射性核種は⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、^99mＴｃ及び¹¹¹Ｉｎであり、^99mＴｃが特に好ましいと述べられている。

【0007】

国際公開第２００４／０７８７７８号は、実施例１４〜１７において、ｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドの血清滞留時間を増加させる方法として、ヒト血清アルブミンと非共有的に結合する部分とのコンジュゲーション、ＰＥＧとのコンジュゲーション、血清タンパク質との融合、及びマレイミドとのコンジュゲーションを教示している。

【0008】

国際公開第２００９／０１６１８０号は、次の式Ｉのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤を開示している。

【0009】

【化1】

式中、
Ｚ¹はｃＭＢＰのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭ^IGであり、
Ｚ²はｃＭＢＰのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢ^c（式中、Ｂ^cは生体適合性陽イオンである。）又はＭ^IGであり、
ｃＭＢＰは、次のアミノ酸配列（配列番号１）を含む１７〜３０のアミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、
Ｃｙｓ^a−Ｘ¹−Ｃｙｓ^c−Ｘ²−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ³−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ^d−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ^b−Ｔｙｒ−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶
（式中、Ｘ¹はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘ²はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、Ｘ³はＴｈｒ又はＡｒｇであり、Ｘ⁴はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ⁵はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ⁶はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｃｙｓ^a-dの各々はシステイン残基であって、残基ａ及びｂ並びに残基ｃ及びｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）
Ｍ^IGは代謝阻害基であり、
Ｌは合成リンカー基であり、
Ｂｚｐ^Mはベンゾピリリウム色素である。

【0010】

国際公開第２００８／１３９２０７号は、同第２００９／０１６１８０号のものに類似したｃＭｅｔ結合環状ペプチドであって、この場合には特定クラスのシアニン色素で標識されたものを開示している。

【0011】

国際公開第２００９／０１６１８０号及び同第２００８／１３９２０７号の光学イメージング剤は、インビボでｃ−Ｍｅｔの過剰発現部位又は局在部位の画像を得るための光学イメージング、特に結腸直腸癌のイメージングのために有用であると述べられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

国際公開第２００４／０７８７７８号パンフレット

【発明の概要】

【0013】

本発明は、インビボでの陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）又は単光子放出断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングに適した放射性テクネチウム（^99mＴｃ又は^94mＴｃ）標識ｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドを含んでなるイメージング剤組成物に関する。かかるｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドは、ペプチドとジアミンジオキシムリガンドとのキレーターコンジュゲートを介して標識される。かかるコンジュゲートは温和な室温条件下においてテクネチウムで放射性標識され、高い収率及び放射化学純度で所望の放射性金属錯体を与える。^99mＴｃイメージング剤は、市販の^99mＴｃジェネレーターからの［^99mＴｃ］−過テクネチウム酸イオンで再構成される無菌の非放射性キットから容易に製造できる。

【0014】

本イメージング剤は、インビボで良好な標的特異性の腫瘍取込みを示す。加えて、本イメージング剤は前臨床モデルにおいてよく認容されるようにも思われる。

【発明を実施するための形態】

【0015】

第１の態様では、本発明は、ｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドのキレーターコンジュゲートの放射性^xＴｃ錯体を含んでなるイメージング剤であって、前記キレーターコンジュゲートが次の式Ｉを有するイメージング剤を提供する。
Ｚ¹−［ｃＭＢＰ］−Ｚ²
（Ｉ）
式中、
^xＴｃは放射性同位体^94mＴｃ又は^99mＴｃであり、
ｃＭＢＰは次の式ＩＩの１８〜３０量体ｃ−Ｍｅｔ結合環状ペプチドであり、
−（Ａ）_x−Ｑ−（Ａ'）_y−
（ＩＩ）
（式中、
Ｑは次のアミノ酸配列（配列番号１）であり、
−Ｃｙｓ^a−Ｘ¹−Ｃｙｓ^c−Ｘ²−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ³−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ^d−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ^b−Ｔｙｒ−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−
（式中、Ｘ¹はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘ²はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、Ｘ³はＴｈｒ又はＡｒｇであり、Ｘ⁴はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ⁵はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ⁶はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｃｙｓ^a-dの各々はシステイン残基であって、残基ａ及びｂ並びに残基ｃ及びｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）
Ａ及びＡ'は独立にＣｙｓ以外の任意のアミノ酸であるか、或いはＡ及びＡ'の一方はＬｙｓ（ε−Ｚ³）であり、
ｘ及びｙは独立に０〜１３の値を有する整数であって、［ｘ＋ｙ］＝１〜１３となるように選択される。）
Ｚ¹はｃＭＢＰのＮ末端に結合していて、Ｍ^IG又はＺ³であり、
Ｚ²はｃＭＢＰのＣ末端に結合していて、Ｍ^IG又はＺ³であり、
各Ｍ^IGは独立に、ｃＭＢＰペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基である代謝阻害基であり、
Ｚ³は次の式（ＩＩＩ）のキレーターであり、

【0016】

【化2】

（式中、Ｅ¹〜Ｅ⁶は各々独立にＲ'基であり、
各Ｒ'は独立にＨ或いはＣ_1-4アルキル、Ｃ_3-7アルキルアリール、Ｃ_2-7アルコキシアルキル、Ｃ_1-4ヒドロキシアルキル、Ｃ_1-4フルオロアルキル、Ｃ_2-7カルボキシアルキル又はＣ_1-4アミノアルキルであるか、或いは２以上のＲ'基がそれに結合した原子と共に炭素環式又は複素環式の飽和又は不飽和環を形成しており、
Ｌは式−（Ａ）_m−（式中、各Ａは独立に−ＣＲ₂−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ₂ＣＯ₂−、−ＣＯ₂ＣＲ₂−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ₂ＮＲ−、−ＮＲＳＯ₂−、−ＣＲ₂ＯＣＲ₂−、−ＣＲ₂ＳＣＲ₂−、−ＣＲ₂ＮＲＣＲ₂−、Ｃ_4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ_4-8シクロアルキレン基、Ｃ_5-12アリーレン基又はＣ_3-12ヘテロアリーレン基或いは単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_2-4アルケニル、Ｃ_2-4アルキニル、Ｃ_1-4アルコキシアルキル及びＣ_1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜１０の値を有する整数である。）の合成リンカー基である。）
式Ｉのコンジュゲートは１つのＺ³基を含み、前記Ｚ³基は^xＴｃと共に金属錯体を形成することを条件とする。

【0017】

「イメージング剤」という用語は、哺乳動物体をイメージングするのに適した化合物を意味する。好ましくは、哺乳動物はインタクトな哺乳動物生体であり、さらに好ましくはヒト被験体である。通例、イメージング剤は非薬理学的量（即ち、哺乳動物被験体に対して最小の生物学的効果を有するように設計された用量）で投与される。好ましくは、イメージング剤は最小限に侵襲的なやり方（即ち、職業的な医学専門技術の下で実施した場合に哺乳動物被験体に対して実質的な健康リスクのないやり方）で哺乳動物体に投与できる。かかる最小限に侵襲的な投与は、好ましくは、局所又は全身麻酔の必要なしに行われる、前記被験体の末梢静脈への静脈内投与である。

【0018】

本明細書中で使用される「インビボイメージング」という用語は、哺乳動物被験体の内部構造の全部又は一部の画像を非侵襲的に生成する技法をいう。

【0019】

「キレーターコンジュゲート」という用語は、キレーターがｃＭＢＰペプチドに共有結合されていることを意味する。

【0020】

「ｃ−Ｍｅｔ結合環状ペプチド」という用語は、ｃ−Ｍｅｔ（又は単にＭＥＴ）としても知られる肝細胞増殖因子受容体に結合するペプチドを意味する。本発明の好適なかかるペプチドは、式Ｉの１８〜３０アミノ酸の環状ペプチドである。かかるペプチドは、ｃ−Ｍｅｔに対して約２０ｎＭ未満の見掛けＫ_dを有している。前記ペプチドのｃＭＢＰ配列はプロリン残基を含み、かかる残基は主鎖アミド結合のシス／トランス異性化を示し得ることが知られている。本発明のｃＭＢＰペプチドは、任意のかかる異性体を含んでいる。本発明のｃＭＢＰペプチドは、好適には単量体として使用される。即ち、ｃＭＢＰの二量体及びヘテロ二量体は本発明の技術範囲外にある。

【0021】

Ｚ¹基は、ｃＭＢＰの最後のアミノ酸残基のアミン基（即ち、アミノ末端又はＮ末端）を置換する。Ｚ²基は、ｃＭＢＰの最後のアミノ酸残基のカルボニル基（即ち、カルボキシ末端又はＣ末端）を置換する。

【0022】

「代謝阻害基」（Ｍ^IG）という用語は、アミノ末端（Ｚ¹）又はカルボキシ末端（Ｚ²）におけるｃＭＢＰペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基を意味する。本発明のイメージング剤に関しては、Ｍ^IGはＺ³基（即ち、式ＩＩＩのキレーター）を含んでいる。その場合、テクネチウム錯体はｃＭＢＰのＮ末端又はＣ末端に（それぞれＺ¹又はＺ²として）共有結合され、このテクネチウム錯体がｃＭＢＰの代謝を阻止するために役立つ。他のかかるＭ^IG基は当業者にとって公知であり、ペプチドのアミン末端については、好適にはＮ−アシル化基−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^G（式中、アシル基−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^GはＣ_1-6アルキル基及びＣ_3-10アリール基から選択されるＲ^Gを有するか、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位を含む。）から選択される。好ましいかかるＰＥＧ基は、次の式ＩＡ又はＩＢのバイオモディファイアーである。

【0023】

【化3】

式ＩＡは１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸であり、式中のｐは１〜１０の整数である。別法として、式ＩＢのプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造も使用できる。

【0024】

【化4】

式中、ｐは式ＩＡに関して定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数である。式ＩＢ中、ｐは好ましくは１又は２であり、ｑは好ましくは５〜１２である。

【0025】

好ましいかかるアミノ末端Ｍ^IG基は、アセチル、ベンジルオキシカルボニル又はトリフルオロアセチルであり、最も好ましくはアセチルである。

【0026】

「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの（即ち、単一の鏡像異性体）、したがってキラルなものであるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。本明細書中では、アミノ酸に関する通常の三文字略語又は一文字略語が使用される。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。「アミノ酸模倣体」という用語は、アイソスター（即ち、天然化合物の立体構造及び電子構造を模倣するように設計されたもの）である天然アミノ酸の合成類似体を意味する。かかるアイソスターアミノ酸がペプチド中に使用されることは公知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールを包含する［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７（１９８５）を参照されたい］。

【0027】

「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（即ち、１つのアミノ酸のアミンを別のアミノ酸のカルボキシルに連結するアミド結合）によって連結された（上記に定義したような）２以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。

【0028】

Ａ及びＡ'が「Ｃｙｓ以外の任意のアミノ酸」であるとは、Ａ及びＡ'基の追加のアミノ酸が遊離チオール基（特にＣｙｓ残基）を含まないことを意味する。なぜなら、追加のＣｙｓ残基はＱ配列のＣｙｓ^a−Ｃｙｓ^b及びＣｙｓ^c−Ｃｙｓ^dジスルフィド橋とジスルフィド橋スクランブリングを起こす恐れがあり、その結果としてｃ−Ｍｅｔ結合親和性の喪失をもたらすからである。

【0029】

式（Ｉ）中では、Ｚ³基（即ち、式ＩＩＩのキレーター）は好適には下記の位置（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１つに結合している。
（ｉ）ｃＭＢＰのアミン末端にＺ¹基として結合。かかるコンジュゲーションでは、式ＩＩＩのカルボキシ官能化キレーターが使用される。
（ｉｉ）ｃＭＢＰのカルボキシ末端にＺ²基として結合。このようなＣ末端への直接結合は、式ＩＩＩのアミン官能化キレーターを用いて達成できる。したがって、かかるコンジュゲーションについては、キレーターのコンジュゲーションを可能にするための追加のＬｙｓ残基は不要である。加えて、結合したテクネチウム錯体はＭ^IG基として機能し得る。
（ｉｉｉ）Ａ又はＡ'基中に位置するＬｙｓ残基のＬｙｓ（ε）アミン側鎖への結合。

【0030】

ｘが９４ｍである場合、テクネチウム放射性同位体は^94mＴｃであり、これは特にインビボでの陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングに適している。ｘが９９ｍである場合、テクネチウム放射性同位体は^99mＴｃであり、これは特にインビボでの単光子放出断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングのために特に適している。好ましくは、^xＴｃは^99mＴｃである。

【0031】

「キレーターの放射性^xＴｃ錯体」という用語は、キレート化剤の放射性金属錯体を意味する。「放射性金属錯体」という用語は、放射性金属と式（ＩＩＩ）のキレーターとの配位金属錯体であって、前記キレーターが式Ｉのリンカー基（Ｌ）を介してｃＭＢＰペプチドに共有結合しているものを意味する。「キレーター」又は「キレート化剤」という用語はその通常の意味を有し、金属配位後にキレート環を生じるように配列された２以上の金属ドナー原子をいう。式（ＩＩＩ）のキレーターはジアミンジオキシムドナーセットを有している。したがって、本発明の^xＴｃ錯体は次の式（ＩV）を有すると考えられる。

【0032】

【化5】

式中、Ｅ¹〜Ｅ⁶及びＬは式（ＩＩＩ）に関して定義した通りである。

【0033】

「含む」という用語は本願全体を通してその通常の意味を有し、記載された成分は存在していなければならないが、それに加えて他の明記されない化合物又は化学種が存在してもよいことを意味する。「含む」という用語は、好ましい部分集合として、組成物が他の化合物又は化学種の存在なしに記載された成分を有することを意味する「から本質的になる」を包含する。

【0034】

好ましい特徴
本発明の好ましいｃＭＢＰペプチドは、ｃ−Ｍｅｔが結合してｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ複合体の結合に関して（蛍光偏光アッセイ測定に基づいて）約１０ｎＭ未満、最も好ましくは１〜５ｎＭの範囲内のＫ_dを有し、３ｎＭ未満が理想的である。

【0035】

第１の態様のイメージング剤は、好ましくは哺乳動物への投与に適した形態で提供される。「哺乳動物への投与に適した形態で」という語句は、無菌でパイロジェンフリーであり、毒性又は有害効果を生じる化合物を含まず、生体適合性ｐＨ（およそｐＨ６．５〜８．５）及び生理学的に適合性の重量オスモル濃度で製剤化される組成物を意味する。かかる組成物は、インビボで塞栓を生じる危険性を有し得る粒状物質を含まないと共に、生物学的流体（例えば、血液）と接触した際に沈殿が起こらないように製剤化される。かかる組成物はまた、生物学的に適合性の賦形剤のみを含み、好ましくは等張性である。好ましいかかる形態は、第４の態様（下記参照）の放射性医薬組成物である。

【0036】

本発明のイメージング剤は、好適には、両方のｃＭＢＰペプチド末端が通常は異なるＭ^IG基によって保護されている。このようにして両ペプチド末端を保護することは、インビボイメージング用途にとって重要である。さもないと、急速なペプチド代謝の結果としてｃ−Ｍｅｔに対する選択的結合親和性の喪失が予想されるからである。Ｚ¹及びＺ²が共にＭ^IGである場合、好ましくはＺ¹がアセチルであり、Ｚ²が第一アミドである。最も好ましくは、Ｚ¹がアセチルであり、Ｚ²が第一アミドであり、^xＴｃ部分はｃＭＢＰのリシン残基のε−アミン側鎖に結合している。

【0037】

Ｑは、好ましくは次の配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含んでいる。
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ^a−Ｘ¹−Ｃｙｓ^c−Ｘ²−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ³−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ^d−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ^b−Ｔｙｒ−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶（配列番号２）、
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ^a−Ｘ¹−Ｃｙｓ^c−Ｘ²−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ³−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ^d−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ^b−Ｔｙｒ−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（配列番号３）。

【0038】

配列番号１、配列番号２及び配列番号３中では、Ｘ³は好ましくはＡｒｇである。第１の態様のｃＭＢＰペプチドは、好ましくは次のアミノ酸配列（配列番号７）を有している。
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ^a−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ^c−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ^d−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ^b−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ。

【0039】

式（Ｉ）のイメージング剤は、好ましくは、Ａ及びＡ'の一方がＬｙｓ（ε−Ｚ³）であり、ｃＭＢＰがただ１つのかかるＬｙｓ残基を含むように選択される。さらに好ましくは、ただ１つのＬｙｓ（ε−Ｚ³）部分がカルボキシ末端に位置する結果、ｃＭＢＰは次の式ＩＩＡを有する。
−（Ａ）_x−Ｑ−（Ａ'）_z−Ｌｙｓ（ε−Ｚ³）−
（ＩＩＡ）
式中、ｚは０〜１２の値を有する整数であり、［ｘ＋ｚ］＝０〜１２である。

【0040】

式Ｉ及び式ＩＩ中では、−（Ａ）_x−基又は−（Ａ'）_y−基は
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号４）、
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）及び
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（配列番号６）
から選択されるリンカーペプチドを含み、Ｚ³基は前記リンカーペプチドのＬｙｓ残基のε−アミン基に結合している。

【0041】

式（ＩＩＩ）のキレーターは、好ましくは、Ｃ末端（Ｚ²基）に結合されるか、或いはＬｙｓ（ε−Ｚ³）部分として結合される。さらに好ましくは、それはＬｙｓ（ε−Ｚ³）部分として結合され、最も好ましくは、Ｌｙｓ（ε−Ｚ³）部分は上記式（ＩＩＡ）の場合のようにカルボキシ末端に位置している。

【0042】

式（Ｉ）のイメージング剤では、キレーターは好ましくは次の式ＩＩＩＡを有する。

【0043】

【化6】

式中、ｑは１〜６の値を有する整数であり、Ａは式（ＩＩＩ）に関して定義した通りである。

【0044】

式（ＩＩＩＡ）中では、（Ａ）_qは好ましくは−（ＮＨ）（Ａ）_t−（式中、ｔは０〜５の値を有する整数である。）である。

【0045】

第１の態様のイメージング剤は、第３の態様（下記）に記載されるようにして製造できる。

【0046】

第２の態様では、本発明は、第１の態様で定義したような式Ｉのキレーターコンジュゲートを提供する。第２の態様における式（ＩＩ）のｃＭＢＰペプチド及び式（ＩＩＩ）のキレーターの好ましい態様は、第１の態様（上記）に記載した通りである。

【0047】

第２の態様のキレーターコンジュゲートは、二官能性キレートアプローチによって得ることができる。「二官能性キレート」という用語はその通常の意味を有し、ペンダント官能基が共有結合したキレート化剤をいう。かかる官能基は、キレーターをｃＭＢＰペプチドに結合するための反応部位として使用される。二官能性キレートアプローチ及び関連する合成法は、Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａ ｅｔ ａｌ［Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１１０（５），２９０３−２９２０（２０１０）］、Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ ｅｔ ａｌ［Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１０（１１），１１１３−１１３４（２０１０）］及びＢｒｅｃｈｂｉｅｌ ｅｔ ａｌ［Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，５２（２），１６６−１７３（２００８）］によって記載されている。本発明の官能基は、好ましくはアミン、カルボン酸又は活性化エステルであり、さらに好ましくは第一アミン又は活性化エステルである。ペンダントアミン官能基を有する二官能性キレーターは、ペプチドのカルボキシル基にコンジュゲートすることができる。カルボキシル又は活性化エステル官能基を有する二官能性キレーターは、ペプチドのアミン基にコンジュゲートすることができる。

【0048】

「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語は、良好な脱離基であり、したがってアミンのような求核試薬との一層容易な反応を可能にするように設計された関連カルボン酸のエステル誘導体を意味する。好適な活性エステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スルホ−スクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェノール、ペンタフルオロチオフェノール、ｐ−ニトロフェノール、ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＰｙＢＯＰ（即ち、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）である。好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はペンタフルオロフェノールエステル、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。

【0049】

本発明の式ｃＭＢＰのｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドは、
（ｉ）所望のｃＭＢＰペプチドと同じペプチド配列を有し、Ｃｙｓ^a及びＣｙｓ^bが保護されておらず、Ｃｙｓ^c及びＣｙｓ^d残基がチオール保護基を有する線状ペプチドの固相ペプチド合成を行う段階、
（ｉｉ）段階（ｉ）からのペプチドを塩基水溶液で処理することで、Ｃｙｓ^a及びＣｙｓ^bを連結する第１のジスルフィド結合を有する単環式ペプチドを得る段階、並びに
（ｉｉｉ）Ｃｙｓ^c及びＣｙｓ^dのチオール保護基を除去して環化することで、Ｃｙｓ^c及びＣｙｓ^dを連結する第２のジスルフィド結合を形成し、かくして所望の二環式ペプチド生成物Ｚ¹−［ｃＭＢＰ］−Ｚ²を得る段階
を含んでなる製造方法によって得ることができる。

【0050】

「保護基」という用語は、望ましくない化学反応を阻止又は抑制するが、分子の残部を変質させない程度に温和な条件下で問題の官能基から脱離させ得るのに十分な反応性を有するように設計された基を意味する。脱保護後には所望の生成物が得られる。アミン保護基は当業者にとって公知であり、好適にはＢｏｃ（ここでＢｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。）、Ｆｍｏｃ（ここでＦｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルである。）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］及びＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から選択される。好適なチオール保護基は、Ｔｒｔ（トリチル）、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、メトキシベンジル、メチルベンジル及びＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）である。さらに他の保護基の使用は、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，４^th Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ［Ｗｉｌｅｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（２００６）］に記載されている。好ましいアミン保護基はＢｏｃ及びＦｍｏｃであり、最も好ましくはＢｏｃである。好ましいチオール保護基はＴｒｔ及びＡｃｍである。

【0051】

実施例１及び実施例２は一層具体的な詳細を示している。固相ペプチド合成法のさらなる詳細は、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ ａｎｄ Ｅ．Ｇｉｒａｌｄ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。ｃＭＢＰペプチドは不活性雰囲気下で最もよく貯蔵され、フリーザー内に保存される。溶液として使用する場合には、ジスルフィド橋のスクランブリングを生じる恐れがあるので、７より高いｐＨを避けるのが最もよい。

【0052】

好ましい二官能性ジアミンジオキシムキレーターは、次の式を有するキレーター１である。

【0053】

【化7】

式中、橋頭の第一アミン基はＬ（即ち、リンカー基）及び／又はｃＭＢＰペプチドにコンジュゲートされる。

【0054】

式ＩＩＩのジアミンジオキシムキレーターは、適切なジアミンを次のいずれかと反応させることによって製造できる。即ち、
（ｉ）適切なクロロニトロソ誘導体Ｃｌ−Ｃ（Ｅ²Ｅ³）−ＣＨ（ＮＯ）Ｅ¹と反応させるか、
（ｉｉ）式Ｃｌ−Ｃ（Ｅ²Ｅ³）−Ｃ（＝ＮＯＨ）Ｅ¹のα−クロロオキシムと反応させるか、或いは
（ｉｉｉ）式Ｂｒ−Ｃ（Ｅ²Ｅ³）−Ｃ（＝Ｏ）Ｅ¹のα−ブロモケトンと反応させ、続いてヒドロキシルアミンを用いてジアミンジケトン生成物をジアミンジオキシムに転化させる。

【0055】

経路（ｉ）は、Ｓ．Ｊｕｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ［Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２６，３５７６−８２（１９８７）］によって記載されている。クロロニトロソ化合物は、当技術分野で公知の通り、適切なアルケンを塩化ニトロシル（ＮＯＣｌ）で処理して得ることができる。クロロニトロソ化合物の合成に関するさらなる詳細は、Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ［Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２５（５），７４３−７５２（１９９５）］、Ｇｌａｓｅｒ［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６１（３），１０４７−４８（１９９６）］、Ｃｌａｐｐ［Ｊ．Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．，３６（８）１１６９−７０（１９７１）］、Ｓａｉｔｏ［Ｓｈｉｚｅｎ Ｋａｇａｋｕ，４７，４１−４９（１９９５）］及びＳｃｈｕｌｚ［Ｚ．Ｃｈｅｍ．，２１（１１），４０４−４０５（１９８１）］によって示されている。経路（ｉｉｉ）は、Ｎｏｗｏｔｎｉｋ ｅｔ ａｌ［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５０（２９），ｐ．８６１７−８６３２（１９９４）］によって一般的な表現で記載されている。α−クロロオキシムは、対応するα−クロロケトン又はアルデヒド（これらは商業的に入手できる。）のオキシム化によって得ることができる。α−ブロモケトンは商業的に入手できる。

【0056】

本発明の特定のカルボキシ官能化及びアミン官能化キレーター並びにｃＭＢＰペプチドに対するこれらのコンジュゲーションのさらなる詳細は、支援実施例中に示される。

【0057】

第３の態様では、本発明は、第１の態様のイメージング剤の製造方法であって、第１の態様の式Ｉのキレーターコンジュゲートを適当な溶媒中において第１の態様で定義された^xＴｃの供給物と反応させることを含んでなる方法を提供する。

【0058】

第３の態様におけるキレーターコンジュゲート中のｃＭＢＰペプチド及びキレーター並びに^xＴｃの好ましい態様は、第１の態様（上記）に記載した通りである。

【0059】

適当な溶媒は通例水性のものであり、好ましくは第４の態様（下記）で定義されるような生体適合性キャリヤー溶媒である。

【0060】

^99mＴｃは放射性同位体ジェネレーターから商業的に入手でき、それは無菌形態の［^99mＴｃ］−過テクネチウム酸イオンを与える。テクネチウム錯体の製造方法は、当技術分野で公知である［例えば、Ｉ．Ｚｏｌｌｅ（Ｅｄ）Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００７）を参照されたい］。^94mＴｃは、Ｂｉｇｏｔｔ ｅｔ ａｌ［Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ，３３（７），９２３−９３３（２００６）］の方法によって製造し処理することができる。

【0061】

第４の態様では、本発明は、第１の態様のイメージング剤を、哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる放射性医薬組成物を提供する。

【0062】

第４の態様におけるイメージング剤の好ましい態様は、第１の態様に記載した通りである。「哺乳動物への投与に適した形態で」という用語は、上記に定義した通りである。

【0063】

「生体適合性キャリヤー」とは、組成物が生理学的に認容され得るようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳動物体に投与できるようにして）イメージング剤を懸濁又は好ましくは溶解するための流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、生体適合性緩衝剤を含む水性緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。好ましくは、生体適合性キャリヤーはパイロジェンフリー注射用水、等張食塩水又はリン酸緩衝液である。

【0064】

イメージング剤及び生体適合性キャリヤーはそれぞれ、注射器又はカニューレによる溶液の追加及び抜取りを許しながら、無菌保全性及び／又は放射能安全性の維持、さらに任意には不活性ヘッドスペースガス（例えば、窒素又はアルゴン）の維持を可能にする密封容器を含む適当なバイアル又は容器に入れて供給される。好ましいかかる容器は、気密クロージャーを（通例はアルミニウムからなる）オーバーシールと共にクリンプ加工した隔壁密封バイアルである。クロージャーは、無菌保全性を維持しながら皮下注射針による１回又は数回の穿刺に適したもの（例えば、クリンプ加工した隔壁シールクロージャー）である。かかる容器は、（例えば、ヘッドスペースガスの交換又は溶液のガス抜きのために）所望される場合にはクロージャーが真空に耐え得ると共に、酸素又は水蒸気のような外部大気ガスの侵入を許すことなしに減圧のような圧力変化にも耐え得るという追加の利点を有している。

【0065】

好ましい複数用量容器は、複数の患者用量を含む（例えば、容積１０〜３０ｃｍ³の）単一のバルクバイアルからなり、したがって臨床的状況に合わせて製剤の実用寿命中に様々な時間間隔で１回分の患者用量を臨床グレードの注射器中に抜き取ることができる。予備充填注射器は１回分のヒト用量又は「単位用量」を含むように設計され、したがって好ましくは臨床用に適した使い捨て注射器又は他の注射器である。本発明の医薬組成物は、好ましくは１人の患者用に適した用量を有し、上述したような適当な注射器又は容器に入れて供給される。

【0066】

かかる医薬組成物は、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤、フィラー、放射線防護剤、可溶化剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加の任意賦形剤を含むことができる。

【0067】

「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物（例えば、細菌、酵母又はかび）の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、任意には投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。

【0068】

「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳動物への投与のために許容される範囲（およそｐＨ４．０〜１０．５、本発明の薬剤に関して好ましくは６．５〜８．５）内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容される緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容される塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。

【0069】

「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容される増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。

【0070】

「放射線防護剤」という用語は、水の放射線分解から生じる含酸素フリーラジカルのような高反応性フリーラジカルを捕捉することにより、レドックス過程のような分解反応を阻止する化合物を意味する。２種以上の放射線防護剤の組合せも使用できる。本発明の放射線防護剤は、好適には、エタノール、アスコルビン酸、ｐ−アミノ安息香酸（即ち、４−アミノ安息香酸）、ゲンチシン酸（即ち、２，５−ジヒドロキシ安息香酸）及び（適用できる場合には）かかる酸と生体適合性陽イオンとの塩から選択される。「生体適合性陽イオン」（Ｂ^c）という用語は、イオン化して負に帯電した基と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳動物体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。本発明の放射性防護剤は、好ましくはアスコルビン酸又はアスコルビン酸ナトリウムからなっている。

【0071】

「可溶化剤」という用語は、溶媒に対するイメージング剤の溶解性を高める、組成物中に存在する添加剤を意味する。好ましいかかる溶媒は水性媒質であり、したがって可溶化剤は好ましくは水に対する溶解性を高める。好適なかかる可溶化剤には、Ｃ_1-4アルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート、ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）ポリ（オキシエチレン）ブロック共重合体（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標））、シクロデキストリン（例えば、α−、β−又はγ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン或いはヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン）及びレシチンがある。好ましい可溶化剤は、シクロデキストリン、Ｃ_1-4アルコール及びＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）であり、さらに好ましくはシクロデキストリン及びＣ_1-4アルコールである。可溶化剤がアルコールである場合、それは好ましくはエタノール又はプロパノールであり、さらに好ましくはエタノールである。エタノールは潜在的に二重の役割を有している。それは、放射線防護剤としても機能し得るからである。可溶化剤がシクロデキストリンである場合、それは好ましくはγ−シクロデキストリンであり、さらに好ましくはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ）である。シクロデキストリンの濃度は約０．１〜約４０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜約３５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２０〜３０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは２５ｍｇ／ｍｌ付近であり得る。

【0072】

本発明の放射性医薬組成物は、以下のような様々な方法によって製造できる。即ち、
（ｉ）放射性金属錯体形成をクリーンルーム環境内で実施する無菌製造技法、
（ｉｉ）無菌製造を用いずに放射性金属錯体形成を実施した後、最終段階で滅菌［例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理］を行う終末滅菌方法、並びに
（ｉｉｉ）式Ｉのキレーターコンジュゲート及び任意の賦形剤を含む無菌の非放射性キット製剤を所望のテクネチウム放射性金属の供給物と反応させるキット方法。
方法（ｉｉｉ）が好ましく、この方法で使用するためのキットは第５の実施形態（下記）に記載される。

【0073】

好ましくは、イメージング剤組成物は、非標識ｃＭＢＰペプチドが^xＴｃ標識ｃＭＢＰペプチドのモル量の５０倍以下のモル量で前記組成物中に存在するように選択される。したがって、^xＴｃ放射性標識のために使用されるキレーターコンジュゲートの化学的過剰量は^xＴｃに比べて１０００倍も過剰になることがあり、非標識コンジュゲートがインビボでｃ−Ｍｅｔ部位に対して競合することがある。しかし、低い濃度のキレーターコンジュゲートはＲＣＰに影響を及ぼすことがある。即ち、^99mＴｃに関しては、４５ナノモルの化合物１を用いれば＞９０％のＲＣＰが達成できるが、１５〜３０ナノモルを用いた場合には７０〜９５％の範囲内で変動する。過剰の非標識ペプチドはＨＰＬＣ又はＳＰＥによって除去できる。

【0074】

「非標識」という用語は、ｃ−Ｍｅｔ結合環状ペプチドが非放射性であること、即ち^xＴｃ又はその他任意の放射性同位体で放射性標識されていないことを意味する。かかる非標識ペプチドは、主として第２の態様（上記）の非放射性キレーターコンジュゲートを包含する。「非標識」という用語は、⁹⁹Ｔｃで標識されたｃ−Ｍｅｔ結合環状ペプチドを除外する。この場合、前記⁹⁹Ｔｃは前記ｃ−Ｍｅｔ結合環状ペプチドを放射性標識するために使用される^99mＴｃ中に存在し、したがって同じ放射性標識反応の生成物である。好ましくは、非標識ｃ−Ｍｅｔ結合環状ペプチドは、対応する^xＴｃ標識ペプチドのモル量の２０倍未満、さらに好ましくは１０倍未満、最も好ましくは５倍未満のモル量で前記組成物中に存在している。

【0075】

第５の態様では、本発明は、第４の態様の放射性医薬組成物を製造するためのキットであって、第２の態様のキレーターコンジュゲートを無菌固体形態で含んでいる結果、生体適合性キャリヤー中の放射性金属の無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の放射性医薬組成物を与えるキットを提供する。

【0076】

第５の態様におけるキレーターコンジュゲートの好ましい態様は、本発明の第２の態様（上記）に記載した通りである。

【0077】

「キット」という用語は、所望の放射性医薬組成物を製造するために必要な化学薬品を使用説明書と共に含んでなる１以上の非放射性医薬品グレード容器を意味する。キットは、所望の放射性金属で再構成することで、最小限の操作でヒトへの投与に適した溶液を与えるように設計されている。

【0078】

無菌固体形態は、好ましくは凍結乾燥固体である。

【0079】

^99mＴｃに関しては、キットは好ましくは凍結乾燥され、^99mＴｃ放射性同位体ジェネレーターからの無菌の^99mＴｃ−過テクネチウム酸イオン（ＴｃＯ₄^-）で再構成することで、それ以上の操作なしにヒトへの投与に適した溶液を与えるように設計されている。好適なキットは、遊離塩基又は酸性塩形態のキレーターコンジュゲートを、亜ジチオン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ホルムアミジンスルフィン酸、第一スズイオン、Ｆｅ（ＩＩ）又はＣｕ（Ｉ）のような生体適合性還元剤と共に収容した容器（例えば、隔壁密封バイアル）を含んでいる。生体適合性還元剤は、好ましくは塩化第一スズ又は酒石酸第一スズのような第一スズ塩である。別法として、キットは非放射性金属錯体を任意に含み得る。これは、テクネチウムの添加時にトランスメタレーション（即ち、金属交換）を受けて所望の生成物を与える。非放射性キットはさらに、上記に記載したようなトランスキレーター、放射線防護剤、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤又はフィラーのような追加成分を任意に含み得る。

【0080】

第６の態様では、本発明は、ヒト又は動物の身体をイメージングする方法であって、当該方法はＰＥＴ又はＳＰＥＣＴを用いて第１の態様のイメージング剤又は第２の態様の放射性医薬組成物が分布した前記身体の少なくとも一部の画像を生成する段階を含み、前記イメージング剤又は組成物は前記身体に予め投与されている方法を提供する。

【0081】

第６の態様におけるイメージング剤又は組成物の好ましい態様は、本発明のそれぞれ第１及び第４の態様（上記）に記載した通りである。好ましくは、第４の態様の放射性医薬組成物が使用される。

【0082】

好ましくは、哺乳動物はインタクトな哺乳動物生体であり、さらに好ましくはヒト被験体である。好ましくは、イメージング剤は最小限に侵襲的なやり方（即ち、職業的な医学専門技術の下で実施した場合に哺乳動物被験体に対して実質的な健康リスクのないやり方）で哺乳動物体に投与できる。かかる最小限に侵襲的な投与は、好ましくは、局所又は全身麻酔の必要なしに行われる、前記被験体の末梢静脈への静脈内投与である。

【0083】

第６の態様のイメージングは、好ましくはｃ−Ｍｅｔの過剰発現部位又は局在部位のイメージングである。ｃ−Ｍｅｔの過剰発現部位又は局在部位は、好ましくは癌又は前癌病変である。

【0084】

第６の態様のイメージング方法は、任意には薬物又は放射線によるヒト又は動物の身体の治療効果をモニターするために繰り返して実施することができ、前記イメージングは前記治療前及び前記治療後に実施され、任意には前記治療中にも実施される。特に興味深いのは、癌療法の効力の早期モニタリングにより、状態が末期になる前に悪性増殖を確実に制御することである。

【0085】

この態様には、インビボでの哺乳動物体のｃ−Ｍｅｔ過剰発現又は局在部位の診断方法であって、第６の態様のイメージング方法を含んでなる方法も包含される。

【0086】

第７の態様では、本発明は、ヒト又は動物の身体の診断方法における、第１の態様のイメージング剤、第４の態様の放射性医薬組成物又は第５の態様のキットの使用を提供する。

【0087】

第７の態様におけるイメージング剤又は組成物の好ましい態様は、本発明のそれぞれ第１及び第４の態様（上記）に記載した通りである。第７の態様の診断方法は、第６の態様のイメージング方法及びその好ましい態様を含んでいる。

【実施例】

【0088】

下記に詳述する非限定的な実施例によって本発明を例示する。実施例１は、両方の末端に代謝阻害基（Ｚ¹＝Ｚ²＝Ｍ^IG）を有する本発明のｃＭＢＰペプチド（ペプチド１）の合成を示している。実施例２〜４は、本発明の二官能性アミン官能化キレーター（キレーター１）の合成を示している。実施例５は、本発明の二官能性活性エステル官能化キレーター（キレーター１Ａ）の合成を示している。実施例６は、本発明のペプチド（ペプチド１）とキレーター１とのキレーターコンジュゲート（「化合物１」）の合成を示している。実施例７は本発明の^99mＴｃ錯体（^99mＴｃ−化合物１）の製造を示し、錯体形成が室温において高い放射化学収率で効率よく進行することを証明している。実施例８は^99mＴｃ−化合物１の体内分布を示し、テクネチウム錯体が良好な腫瘍：バックグラウンド比と共に有用な腫瘍取込みを示すことを証明している。

【0089】

略語
通常の一文字又は三文字アミノ酸略語が使用される。
％ｉｄ： パーセント注射量
Ａｃ： アセチル
Ａｃｍ： アセトアミドメチル
ＡＣＮ： アセトニトリル
Ｂｏｃ： ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ｔＢｕ： ｔｅｒｔ−ブチル
ＤＣＭ： ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ： Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ： ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ： Ｎ−３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド
Ｆｍｏｃ： ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＡＴＵ： Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ： Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチ
ルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＰＬＣ： 高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＰｙＵ： Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレン
ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＮＨＳ： Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド
ＮＭＭ： Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＰ： １−メチル−２−ピロリジノン
Ｐｂｆ： ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホ
ニル
ＰＢＳ： リン酸緩衝食塩水
ＰｙＢＯＰ： ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘ
キサフルオロホスフェート
ｓ．ｃ．： 皮下に
ｔＢｕ： ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ： テトラヒドロフラン
ＴＩＳ： トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ： トリチル

【0090】

【表1】

【実施例1】

【0091】

実施例１：ペプチド１の合成
段階（ａ）：保護前駆体線状ペプチドの合成
前駆体線状ペプチドは次の構造を有している。
Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂。

【0092】

０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｎｏｖａｇｅｌ樹脂から出発するＦｍｏｃ化学を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３３Ａペプチド合成装置上でペプチジル樹脂Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ψ^Me,Meｐｒｏ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ポリマーをアセンブルした。カップリング段階では、（ＨＢＴＵを用いて）予備活性化した過剰量の１ｍｍｏｌアミノ酸を適用した。Ｇｌｕ−Ｔｈｒプソイドプロリン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ０５−２０−１１２２）を配列中に組み込んだ。樹脂を窒素バブラー装置に移し、無水酢酸（１ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した溶液で６０分間処理した。

【0093】

２．５％のＴＩＳ、２．５％の４−チオクレゾール及び２．５％の水を含むＴＦＡ（１０ｍＬ）中で、側鎖保護基の同時除去及び樹脂からのペプチド切断を２時間３０分にわたって実施した。樹脂を濾過によって取り除き、ＴＦＡを真空中で除去し、残留物にジエチルエーテルを添加した。生じた沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、風乾することで、２６４ｍｇの粗ペプチドを得た。

【0094】

粗ペプチドを分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ₂Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３０分）によって精製することで、純粋なペプチド１の線状前駆体１００ｍｇを得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ₂Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて生成物の特性決定を実施した（ＭＨ₂²⁺計算値：１４６４．６、ＭＨ₂²⁺実測値：１４６５．１）。

【0095】

段階（ｂ）：単環式Ｃｙｓ４−１６ジスルフィド橋の形成
Ｃｙｓ４−１６；Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂。

【0096】

段階（ａ）からの線状前駆体（１００ｍｇ）を５％ＤＭＳＯ／水（２００ｍＬ）に溶解し、アンモニアを用いて溶液をｐＨ６に調整した。反応混合物を５日間撹拌した。次いで、ＴＦＡを用いて溶液をｐＨ２に調整し、大部分の溶媒を真空中での蒸発によって除去した。生成物の精製のため、残留物（４０ｍＬ）を分取ＨＰＬＣカラム上に少しずつ注入した。

【0097】

残留物を分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを１０分間、次いで４０分で０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ₂Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：４４分）によって精製することで、純粋なペプチド１の単環式前駆体７２ｍｇを得た。（異性体Ｐ１乃至Ｐ３の混合物としての）純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ₂Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：５．３７分（Ｐ１）、５．６１分（Ｐ２）、６．０５分（Ｐ３））によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて生成物の特性決定を実施した（ＭＨ₂²⁺計算値：１４６３．６、ＭＨ₂²⁺実測値：１４６４．１（Ｐ１）、１４６４．４（Ｐ２）、１４６４．３（Ｐ３））。

【0098】

段階（ｃ）：第２のＣｙｓ６−１４ジスルフィド橋の形成（ペプチド１）
段階（ｂ）からの単環式前駆体（７２ｍｇ）を窒素ブランケット下で７５％ＡｃＯＨ／水（７２ｍＬ）に溶解した。１Ｍ ＨＣｌ（７．２ｍＬ）及びＡｃＯＨ中の０．０５Ｍ Ｉ₂（４．８ｍＬ）をその順序で添加し、混合物を４５分間撹拌した。１Ｍアスコルビン酸（１ｍＬ）を添加して無色の混合物を得た。大部分の溶媒を真空中で蒸発させ、残留物（１８ｍＬ）を水／０．１％ＴＦＡ（４ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。残留物を分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを１０分間、次いで４０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ₂Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：４３〜５３分）によって精製することで、５２ｍｇの純粋なペプチド１を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ₂Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて生成物の特性決定を実施した（ＭＨ₂²⁺計算値：１３９１．５、ＭＨ₂²⁺実測値：１３９２．５）。

【実施例2】

【0099】

実施例２：１，１，１−トリス（２−アミノエチル）メタンの合成
段階１（ａ）：３−（メトキシカルボニルメチレン）グルタル酸ジメチルエステル
トルエン（６００ｍｌ）中のカルボメトキシメチレントリフェニルホスホラン（１６７ｇ、０．５ｍｏｌ）を３−オキソグルタル酸ジメチル（８７ｇ、０．５ｍｏｌ）で処理し、反応物を窒素雰囲気下において１２０℃の油浴上で１００℃に３６時間加熱した。次いで、反応物を真空中で濃縮し、油状残留物を４０／６０石油エーテル／ジエチルエーテル（１：１、６００ｍｌ）でトリチュレートした。トリフェニルホスフィンオキシドを沈殿させ、上澄み液をデカント／濾過して除去した。真空中で蒸発させた後の残留物を高真空Ｂｐｔ（０．２トルでオーブン温度１８０〜２００℃）下でクーゲルロール蒸留することで、３−（メトキシカルボニルメチレン）グルタル酸ジメチルエステル（８９．０８ｇ、５３％）を得た。
ＮＭＲ ¹Ｈ（ＣＤＣｌ₃）：δ ３．３１（２Ｈ，ｓ，ＣＨ₂），３．７（９Ｈ，ｓ，３ｘＯＣＨ₃），３．８７（２Ｈ，ｓ，ＣＨ₂），５．７９（１Ｈ，ｓ，＝ＣＨ，）ｐｐｍ。
ＮＭＲ ¹³Ｃ（ＣＤＣｌ₃），δ ３６．５６，ＣＨ₃，４８．７，２ｘＣＨ₃，５２．０９及び５２．５（２ｘＣＨ₂）；１２２．３及び１４６．１６ Ｃ＝ＣＨ；１６５．９，１７０．０及び１７０．５ ３ｘＣＯＯ ｐｐｍ。

【0100】

段階１（ｂ）：３−（メトキシカルボニルメチレン）グルタル酸ジメチルエステルの水素化
メタノール（２００ｍｌ）中の３−（メトキシカルボニルメチレン）グルタル酸ジメチルエステル（８９ｇ、２６７ｍｍｏｌ）を、水素ガス雰囲気（３．５バール）下で（木炭上１０％パラジウム：５０％水）（９ｇ）と共に３０時間振盪した。溶液をケイソウ土で濾過し、真空中で濃縮することで、３−（メトキシカルボニルメチル）グルタル酸ジメチルエステルを油状物として得た。収量（８４．９ｇ、９４％）。
ＮＭＲ ¹Ｈ（ＣＤＣｌ₃），δ ２．４８（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，３ｘＣＨ₂），２．７８（１Ｈ，六重線，Ｊ＝８Ｈｚ ＣＨ），３．７（９Ｈ，ｓ，３ｘＣＨ₃）。
ＮＭＲ ¹³Ｃ（ＣＤＣｌ₃），δ ２８．６，ＣＨ；３７．５０，３ｘＣＨ₃；５１．６，３ｘＣＨ₂；１７２．２８，３ｘＣＯＯ。

【0101】

段階１（ｃ）：トリメチルエステルからトリアセテートへの還元及びエステル化
窒素雰囲気下で三ツ口の２Ｌ丸底フラスコ内において、ＴＨＦ（４００ｍｌ）中の水素化リチウムアルミニウム（２０ｇ、５８８ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２００ｍｌ）中のトリス（メチルオキシカルボニルメチル）メタン（４０ｇ、２１２ｍｍｏｌ）で１時間かけて注意深く処理した。激しい発熱反応が起こり、溶媒を激しく還流させた。反応物を９０℃の油浴上で３日間加熱還流した。水素の発生が止まるまで酢酸（１００ｍｌ）を注意深く滴下することで反応物を脱活した。撹拌した反応混合物を、穏やかな還流が生じる程度の速度で無水酢酸溶液（５００ｍｌ）で注意深く処理した。フラスコに蒸留装置を取り付け、撹拌し、次いで９０℃（油浴温度）で加熱してＴＨＦを留去した。追加の無水酢酸（３００ｍｌ）を添加し、反応物を還流配置に戻し、１４０℃の油浴中で５時間撹拌加熱した。反応物を放冷し、濾過した。酸化アルミニウムの沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、合わせた濾液を真空（５ｍｍＨｇ）中５０℃の水浴温度でロータリーエバポレーター上で濃縮して油状物を得た。油状物を酢酸エチル（５００ｍｌ）に溶解し、飽和炭酸カリウム水溶液で洗浄した。酢酸エチル溶液を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中で濃縮して油状物を得た。油状物を高真空下でクーゲルロール蒸留することで、トリス（２−アセトキシエチル）メタン（４５．３ｇ、９５．９％）を油状物として得た。０．１ｍｍＨｇで沸点２２０℃。
ＮＭＲ ¹Ｈ（ＣＤＣｌ₃），δ １．６６（７Ｈ，ｍ，３ｘＣＨ₂，ＣＨ），２．０８（１Ｈ，ｓ，３ｘＣＨ₃）；４．１（６Ｈ，ｔ，３ｘＣＨ₂Ｏ）。
ＮＭＲ ¹³Ｃ（ＣＤＣｌ₃），δ ２０．９，ＣＨ₃；２９．３４，ＣＨ；３２．１７，ＣＨ₂；６２．１５，ＣＨ₂Ｏ；１７１，ＣＯ。

【0102】

段階１（ｄ）：トリアセテートからのアセテート基の除去
メタノール（２００ｍｌ）中のトリス（２−アセトキシエチル）メタン（４５．３ｇ、１６５ｍＭ）及び８８０アンモニア（１００ｍｌ）を８０℃の油浴上２日間で加熱した。反応物を追加の８８０アンモニア（５０ｍｌ）で処理し、油浴中８０℃で２４時間加熱した。追加の８８０アンモニア（５０ｍｌ）を添加し、反応物を８０℃で２４時間加熱した。次いで、反応物を真空中で濃縮し、すべての溶媒を除去して油状物を得た。これを８８０アンモニア（１５０ｍｌ）に溶解し、８０℃で２４時間加熱した。次いで、反応物を真空中で濃縮し、すべての溶媒を除去して油状物を得た。クーゲルロール蒸留によってアセトアミド（沸点１７０〜１８０ ０．２ｍｍ）を得た。アセトアミドを含むバルブをきれいに洗浄し、蒸留を続行した。トリス（２−ヒドロキシエチル）メタン（２２．５３ｇ、９２％）が沸点２２０℃ ０．２ｍｍで留出した。
ＮＭＲ ¹Ｈ（ＣＤＣｌ₃），δ １．４５（６Ｈ，ｑ，３ｘＣＨ₂），２．２（１Ｈ，五重線，ＣＨ）；３．７（６Ｈ，ｔ，３ｘＣＨ₂ＯＨ）；５．５（３Ｈ，ｂｒｓ，３ｘＯＨ）。
ＮＭＲ ¹³Ｃ（ＣＤＣｌ₃），δ ２２．１３，ＣＨ；３３．９５，３ｘＣＨ₂；５７．８，３ｘＣＨ₂ＯＨ。

【0103】

段階１（ｅ）：トリオールからトリス（メタンスルホネート）への転化
ジクロロメタン（５０ｍｌ）中のトリス（２−ヒドロキシエチル）メタン（１０ｇ、０．０６７６ｍｏｌ）の撹拌氷冷溶液に、ジクロロメタン（５０ｍｌ）中の塩化メタンスルホニル（４０ｇ、０．３４９ｍｏｌ）の溶液を温度が１５℃を超えないような速度で窒素下でゆっくり滴下した。次いで、ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解したピリジン（２１．４ｇ、０．２７ｍｏｌ、４当量）を発熱反応で温度が１５℃を超えないような速度で滴下した。反応物を室温で２４時間撹拌し続け、次いで５Ｎ塩酸溶液（８０ｍｌ）で処理し、層を分離した。水性層を追加のジクロロメタン（５０ｍｌ）で抽出し、有機抽出液を合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮することで、過剰の塩化メタンスルホニルで汚染されたトリス［２−（メチルスルホニルオキシ）エチル］メタンを得た。理論収量は２５．８ｇであった。
ＮＭＲ ¹Ｈ（ＣＤＣｌ₃），δ ４．３（６Ｈ，ｔ，２ｘＣＨ₂），３．０（９Ｈ，ｓ，３ｘＣＨ₃），２（１Ｈ，六重線，ＣＨ），１．８５（６Ｈ，ｑ，３ｘＣＨ₂）。

【0104】

段階１（ｆ）：１，１，１−トリス（２−アジドエチル）メタンの製造
窒素下にある乾燥ＤＭＦ（２５０ｍｌ）中の［段階１（ｅ）からの、過剰の塩化メチルスルホニルで汚染された］トリス［２−（メチルスルホニルオキシ）エチル］メタン（２５．８ｇ、６７ｍｍｏｌ、理論量）の撹拌溶液を、アジ化ナトリウム（３０．７ｇ、０．４７モル）で少量ずつ１５分かけて処理した。発熱が観察され、反応物を氷浴上で冷却した。３０分後、反応混合物を５０℃の油浴上で２４時間加熱した。反応物は褐色になった。反応物を放冷し、希炭酸カリウム溶液（２００ｍｌ）で処理し、４０／６０石油エーテル／ジエチルエーテル１０：１（３×１５０ｍｌ）で３回抽出した。有機抽出液を水（２×１５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過した。石油／エーテル溶液にエタノール（２００ｍｌ）を添加してトリアジドを溶液状態に保ち、真空中で２００ｍｌを下回らないように体積を減少させた。エタノール（２００ｍｌ）を添加し、真空中で再濃縮して最後の痕跡量の石油を除去することで、２００ｍｌを下回らない量のエタノール溶液を得た。トリアジドのエタノール溶液を段階１（ｇ）で直接使用した。

【0105】

注意：アジドは潜在的に爆発性であるので、すべての溶媒を除去してはならず、常に希薄溶液状態に保つべきである。

【0106】

０．２ｍｌ未満の溶液を真空中で蒸発させてエタノールを除去し、この小試料に関してＮＭＲを実施した。ＮＭＲ ¹Ｈ（ＣＤＣｌ₃），δ ３．３５（６Ｈ，ｔ，３ｘＣＨ₂），１．８（１Ｈ，七重線，ＣＨ），１．６（６Ｈ，ｑ，３ｘＣＨ₂）。

【0107】

段階１（ｇ）：１，１，１−トリス（２−アミノエチル）メタンの製造
エタノール（２００ｍｌ）中のトリス（２−アジドエチル）メタン（１５．０６ｇ、０．０６７６ｍｏｌ）（前反応からの１００％収率を仮定）を木炭上１０％パラジウム（２ｇ、５０％水）で処理し、１２時間水素化した。反応器を２時間ごとに排気して反応から生じる窒素を除去し、水素を再充填した。ＮＭＲ分析のために試料を採取し、トリアジドからトリアミンへの完全な転化を確認した。

【0108】

警告：未還元のアジドは蒸留で爆発することがある。反応物をセライトパッドで濾過して触媒を除去し、真空中で濃縮することで、トリス（２−アミノエチル）メタンを油状物として得た。これをクーゲルロール蒸留（０．４ｍｍ／Ｈｇで沸点１８０〜２００℃）によってさらに精製して無色の油状物（８．１ｇ、トリオールからの総合収率８２．７％）を得た。
ＮＭＲ ¹Ｈ（ＣＤＣｌ₃），δ ２．７２（６Ｈ，ｔ，３ｘＣＨ₂Ｎ），１．４１（Ｈ，七重線，ＣＨ），１．３９（６Ｈ，ｑ，３ｘＣＨ₂）。
ＮＭＲ ¹³Ｃ（ＣＤＣｌ₃），δ ３９．８（ＣＨ₂ＮＨ₂），３８．２（ＣＨ₂．），３１．０（ＣＨ）。

【実施例3】

【0109】

実施例３：３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタンの製造
２−メチルブト−２−エン（１４７ｍｌ、１．４ｍｏｌ）と亜硝酸イソアミル（１５６ｍｌ、１．１６ｍｏｌ）との混合物を、ドライアイス及びメタノールの浴中で−３０℃に冷却し、オーバヘッド空気撹拌機で激しく撹拌し、温度を−２０℃未満に維持するような速度で濃塩酸（１４０ｍｌ、１．６８ｍｏｌ）を滴下して処理した。かなりの発熱があり、過熱を防ぐために注意を払う必要があるので、これには約１時間を要する。エタノール（１００ｍｌ）を添加して、添加終了時に形成されるスラリーの粘度を低下させ、反応物を−２０〜−１０℃でさらに２時間撹拌して反応を完了させた。沈殿物を真空下での濾過によって回収し、４×３０ｍｌの冷（−２０℃）エタノール及び１００ｍｌの氷冷水で洗浄し、真空中で乾燥することで、３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタンを白色の固体として得た。エタノール濾液及び洗液を合わせ、水（２００ｍｌ）で希釈し、冷却し、−１０℃で１時間放置したところ、３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタンの追加クロップが晶出した。沈殿物を濾過によって回収し、最小量の水で洗浄し、真空中で乾燥することで、総収量（１１５ｇ ０．８５ｍｏｌ、７３％）の３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタン（ＮＭＲによる純度＞９８％）を得た。
ＮＭＲ ¹Ｈ（ＣＤＣｌ₃），異性体の混合物として（異性体１，９０％）１．５ ｄ，（２Ｈ，ＣＨ₃），１．６５ ｄ，（４Ｈ，２ｘＣＨ₃），５．８５，ｑ，及び５．９５，ｑ，共に１Ｈ。（異性体２，１０％），１．７６ ｓ，（６Ｈ，２ｘＣＨ₃），２．０７（３Ｈ，ＣＨ₃）。

【実施例4】

【0110】

実施例４：ビス［Ｎ−（１，１−ジメチル−２−Ｎ−ヒドロキシイミンプロピル）２−アミノエチル］−（２−アミノエチル）メタン（キレーター１）の合成
乾燥エタノール（３０ｍｌ）中のトリス（２−アミノエチル）メタン（４．０４７ｇ、２７．９ｍｍｏｌ）の溶液に、無水炭酸カリウム（７．７ｇ、５５．８ｍｍｏｌ、２当量）を窒素雰囲気下で激しく撹拌しながら室温で添加した。３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタン（７．５６ｇ、５５．８ｍｏｌ、２当量）の溶液を乾燥エタノール（１００ｍｌ）に溶解し、この溶液７５ｍｌを反応混合物にゆっくり滴下した。シリカ上でのＴＬＣ［プレートをジクロロメタン、メタノール、濃（０．８８ｓｇ）アンモニア（１００／３０／５）で展開し、ニンヒドリンを噴霧して加熱することでＴＬＣプレートを発色させた］によって反応を追跡した。モノ−、ジ−及びトリ−アルキル化生成物がその順序で増加するＲＦで認められた。３％アンモニア水中の７．５〜７５％アセトニトリル勾配でＲＰＲ逆相カラムを使用して分析ＨＰＬＣを実施した。反応物を真空中で濃縮してエタノールを除去し、水（１１０ｍｌ）中に再懸濁した。水性スラリーをエーテル（１００ｍｌ）で抽出して一部のトリアルキル化化合物及び親油性不純物を除去し、水層中にモノ及び所望のジアルキル化生成物を残存させた。良好なクロマトグラフィーを保証するため、水溶液を酢酸アンモニウム（２当量、４．３ｇ、５５．８ｍｍｏｌ）で緩衝した。水溶液を４℃で一晩貯蔵した後、自動分取ＨＰＬＣによって精製した。
収量（２．２ｇ、６．４ｍｍｏｌ、２３％）。
質量分析：正イオン１０Ｖコーン電圧１０Ｖ、実測値：３４４、計算値Ｍ＋Ｈ＝３４４。
ＮＭＲ ¹Ｈ（ＣＤＣｌ₃），δ １．２４（６Ｈ，ｓ，２ｘＣＨ₃），１．３（６Ｈ，ｓ，２ｘＣＨ₃），１．２５−１．７５（７Ｈ，ｍ，３ｘＣＨ_2,ＣＨ），（３Ｈ，ｓ，２ｘＣＨ₂），２．５８（４Ｈ，ｍ，ＣＨ₂Ｎ），２．８８（２Ｈ，ｔ ＣＨ₂Ｎ₂），５．０（６Ｈ，ｓ，ＮＨ₂，２ｘＮＨ，２ｘＯＨ）。
ＮＭＲ ¹Ｈ（（ＣＤ₃）₂ＳＯ）δ １．１ ４ｘＣＨ；１．２９，３ｘＣＨ₂；２．１（４Ｈ，ｔ，２ｘＣＨ₂）；
ＮＭＲ ¹³Ｃ（（ＣＤ₃）₂ＳＯ），δ ９．０（４ｘＣＨ₃），２５．８（２ｘＣＨ₃），３１．０ ２ｘＣＨ₂，３４．６ ＣＨ₂，５６．８ ２ｘＣＨ₂Ｎ；１６０．３，Ｃ＝Ｎ。

【0111】

【表2】

各ランについて３ｍｌの水溶液を装填し、１２．５〜１３．５分の時間窓内で収集する。

【実施例5】

【0112】

実施例５：キレーター１−グルタル酸のテトラフルオロチオフェニルエステル（キレーター１Ａ）の合成
ａ）［キレーター１］−グルタル酸中間体の合成

【0113】

【化8】

キレーター１（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、無水グルタル酸（３３ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を撹拌しながら少量ずつ添加した。反応物を２３時間撹拌することで、所望生成物への完全な添加を達成した。ＲＰ−ＨＰＬＣの後、純粋な酸が良好な収率で得られた。

【0114】

ｂ）キレーター１Ａの合成

【0115】

【化9】

ＤＭＦ（２ｍｌ）中の［キレーター１］−グルタル酸（段階ａから、３００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）に、ＨＡＴＵ（２４９ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（１３２μＬ、１．３２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５分間撹拌し、次いでテトラフルオロチオフェノール（０．６６ｍｍｏｌ、１１９ｍｇ）を添加した。溶液を１０分間撹拌し、次いで反応混合物を２０％アセトニトリル／水（８ｍｌ）で希釈し、生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製することで、凍結乾燥後に１１０ｍｇの所望生成物を得た。

【実施例6】

【0116】

実施例６：ペプチド１とキレーター１とのコンジュゲート（化合物１）の合成
キレーター１Ａ（３．８ｍｇ、実施例５）、ペプチド１（３．４ｍｇ）及びｓｙｍ−コリジン（１．６μＬ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、溶液を９０分間撹拌した。反応混合物を水（６ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。

【0117】

粗生成物を分取ＨＰＬＣ（４０分で１０〜２０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ₂Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ）によって精製することで、１．１ｍｇ（２８％）の純粋な化合物１を得た。精製物質を分析ＨＰＬＣ（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ₂Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ２０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、ｔ_R：３．０４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて生成物の特性決定を実施した（実測ｍ／ｚ：１６１１．２、予測ＭＨ₂²⁺：１６１１．２）。

【実施例7】

【0118】

実施例７：化合物１の^99mＴｃ放射性標識
段階（ｉ）：凍結乾燥バイアル
化合物１（４５ｎｍｏｌ）を第１のバイアル（バイアル１）中で凍結乾燥した。下記の処方物を含む凍結乾燥キット（バイアル２）を別途に製造した。

【0119】

【表3】

段階（ｉｉ）：放射性標識
バイアル１を水：エタノール溶液（５０：５０混合物の０．１ｍＬ）で再構成し、バイアルを１０分間超音波処理又は混合した。次いで、得られた化合物１の溶液（０．１ｍＬ）をバイアル２に添加した。次いで、Ｄｒｙｔｅｃ（商標）ジェネレーターからの９９ｍＴｃ−過テクネチウム酸イオン溶出液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、０．９ｍｌ、０．２５〜２．１８ＧＢｑ）をバイアルに添加し、溶液を室温で２０分間放置した後、ＨＰＬＣ分析に付した。ＲＣＰは９３〜９４％であった。

【実施例8】

【0120】

実施例８：腫瘍担持ヌードマウスにおける^99mＴｃ−化合物１の体内分布
ＣＤ−１雄ヌードマウス（約２０ｇ）を個別換気ケージに収容し、飼料及び水に随意にアクセスさせた。１０％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ培地（Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ８４０３）中でＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ．ｎｏ．ＨＴＢ−３８）を増殖させた。０．２５％トリプシンを用いて７０〜８０％コンフルエントで細胞を週２回１：３に分割し、５％ＣＯ₂中３７℃でインキュベートした。軽いガス麻酔（イソフルラン）下で、ファインボア注射針（２５Ｇ）を用いて１００μｌの量のＨＴ−２９細胞懸濁液をマウスの１つの部位（うなじ）に皮下注射した。公称投与量は注射１回当たり１０⁶個の細胞であった。次いで、腫瘍を２０日間増殖させ、或いは（試験に含めるためには）体積が少なくとも２００ｍｍ³に達するまで増殖させた。

【0121】

２０日の増殖期間後、^99mＴｃ−化合物１（０．１ｍｌ、１〜５ＭＢｑ／動物）を静脈内ボーラスとして尾静脈経由で動物に注射した。注射後の様々な時点で動物を安楽死させ、解剖し、下記の器官及び組織を取り出した。注射から１２０分後の結果は次の通りであった。

【0122】

【表4】

注射から１２０分後において体内に保持された放射能の４４％は、腫瘍中に存在していた。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]