特許 5962739 免疫誘導剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5962739

(24)【登録日】2016年7月8日

(45)【発行日】2016年8月3日

(54)【発明の名称】免疫誘導剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20160721BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20160721BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20160721BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20160721BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160721BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/00 HZNA

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61K48/00

   A61K45/00

   A61K37/66

   A61K37/02

   A61K35/76

   A61P43/00 121

   A61P37/04

   C07K14/47

   !C12N15/00 A

【請求項の数】9

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2014-225626(P2014-225626)

(22)【出願日】2014年11月5日

(62)【分割の表示】特願2009-546597(P2009-546597)の分割

【原出願日】2009年8月5日

(65)【公開番号】特開2015-61847(P2015-61847A)

(43)【公開日】2015年4月2日

【審査請求日】2014年12月4日

(31)【優先権主張番号】特願2008-202065(P2008-202065)

(32)【優先日】2008年8月5日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003159

【氏名又は名称】東レ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(72)【発明者】

【氏名】岡野 文義

(72)【発明者】

【氏名】清水 まさき

(72)【発明者】

【氏名】齋藤 孝則

【審査官】 小森 潔

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第０２／０８３０７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０８８５８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５０００３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０１９０６４０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 GenBank databases, NCBI. ACCESSION No.BC001731，２００７年 ９月１１日，[online]，[平成２７年１０月２３日検索]，インターネット，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/12804616

【文献】 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９年，Ｖｏｌ．５９，Ｎｏ．２，ｐ４３１−４３５

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有することを特徴とする、動物の癌（大腸癌を除く）を治療及び／又は予防するための免疫誘導剤。
（ａ） 配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ） 前記（ａ）のポリペプチドと９５％以上の配列同一性を有するポリペプチド
（ｃ） 前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド

【請求項2】

前記（ｂ）のポリペプチドが、前記（ａ）のポリペプチドと９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドである、請求項１記載の免疫誘導剤。

【請求項3】

１又は複数の前記ポリペプチドを有効成分として含有する、請求項１又は２に記載の免疫誘導剤。

【請求項4】

前記癌が、乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、又は食道癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。

【請求項5】

前記動物がヒト、イヌ又はネコである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。

【請求項6】

免疫増強剤をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。

【請求項7】

前記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣおよびその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ並びにＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも１つのアジュバント又はサイトカインである請求項６記載の免疫誘導剤。

【請求項8】

請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する免疫誘導剤と抗原提示細胞をインビトロで接触させ、それによって、前記ポリペプチドの一部とＨＬＡ分子との複合体を含む抗原提示細胞を製造する工程を含む、前記複合体を含む抗原提示細胞を含む、癌（大腸癌を除く）の治療及び／又は予防剤の製造方法。

【請求項9】

請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する免疫誘導剤と抗原提示細胞をインビトロで接触させ、それによって、前記ポリペプチドの一部とＨＬＡ分子との複合体を含む抗原提示細胞を得る工程、ならびに、前記工程により得られる抗原提示細胞を、Ｔ細胞とインビトロで接触させ、それによって、前記ポリペプチドに特異的なＴ細胞を製造する工程を含む、細胞障害性Ｔ細胞を含む、癌（大腸癌を除く）の治療及び／又は予防剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規な免疫誘導剤に関する。

【背景技術】

【0002】

癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩によって癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原類、癌抗原をコードする遺伝子類などが同定されており、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている（非特許文献１）。

【0003】

免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド、ポリペプチド又はタンパクは、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが必要とされる。１９９１年、ベルギー国Ｌｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献２）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）法が報告され（非特許文献３及び特許文献１）、この方法により、いくつかの癌抗原が単離されている（非特許文献４〜９）。さらに、その一部をターゲットにして癌免疫療法の臨床試験が開始されている。

【0004】

一方、ヒトと同様、イヌやネコにも乳腺癌、白血病、リンパ腫など多数の腫瘍が知られており、イヌやネコの疾病統計でも上位にランクされている。しかしながらイヌやネコの癌に対する有効な治療薬、予防薬および診断薬は現在のところ存在しない。大部分のイヌやネコの腫瘍は、進行して腫瘤が大きくなってから飼い主が気付くケースがほとんどで、来院して外科的手術により切除したり、人体薬（抗癌剤など）を投与しても、すでに手遅れで処置後まもなく死亡することが多い。このような現状の中で、イヌやネコに有効な癌の治療薬、予防薬および診断薬が入手可能になれば、イヌやネコの癌に対する用途が開かれると期待される。

【0005】

Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＣＡＰＲＩＮ−１）は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現し、また細胞内でＲＮＡと細胞内ストレス顆粒を形成してｍＲＮＡの輸送、翻訳の制御に関与することなどが知られている細胞内タンパク質である。一方で、ＣＡＰＲＩＮ−１には色々な別名が存在しており、その一例としてＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １やＭｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ １ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｍ１１Ｓ１）などがあり、あたかも本タンパク質が細胞膜タンパク質であることが知られていたかのような名称がある。これらの別名は、元々、ＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列がＧＰＩ結合領域を有し、大腸由来細胞株に発現する膜タンパク質であるとする報告（非特許文献１０）に由来するが、後にこの報告でのＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列は誤りであり、現在ＧｅｎＢａｎｋ等に登録されているＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列が１塩基欠損することによりフレームシフトが起きることでＣ末端から８０アミノ酸が欠損し、その結果生じるａｒｔｉｆａｃｔ（７４アミノ酸）が前報告でのＧＰＩ結合部分であり、さらに５’側にも遺伝子配列のエラーがあり、Ｎ末端から５３アミノ酸が欠損していることが証明されている（非特許文献１１）。また、現在ＧｅｎＢａｎｋ等に登録されているＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列がコードするタンパク質は細胞膜タンパク質ではないことも報告されている（非特許文献１１）。

【0006】

なお、ＣＡＰＲＩＮ−１が細胞膜タンパク質であるとする非特許文献１０の報告に基づき、特許文献２及び３には、Ｍ１１Ｓ１の名称で、ＣＡＰＲＩＮ−１が細胞膜タンパク質の１つとして癌治療などのターゲットとなりうることが記載されている（実施例には記載は一切ない）。しかし、非特許文献１１の報告の通り、特許文献２の出願当時から現在まで、ＣＡＰＲＩＮ−１は細胞表面には発現していないものであることが通説になっており、ＣＡＰＲＩＮ−１が細胞膜タンパク質であるという誤った情報のみに基づく特許文献２及び３の内容は、当業者の技術常識として理解されるべきものではないことは明らかである。さらに、ＣＡＰＲＩＮ−１が乳癌などの癌細胞で、正常細胞に比べて高発現するという報告はない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国特許第５６９８３９６号

【特許文献2】ＵＳ２００８／００７５７２２

【特許文献3】ＷＯ２００５／１００９９８

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】秋吉毅，「癌と化学療法」、１９９７年、第２４巻、ｐ５５１−５１９（癌と化学療法社、日本）

【非特許文献2】Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５４：１６４３−１６４７（１９９１）

【非特許文献3】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２：１１８１０−１１８１３（１９９５）

【非特許文献4】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７２：９６５−９７１（１９９７）

【非特許文献5】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：１０３４−１０４１（１９９８）

【非特許文献6】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２９：６５２−６５８（１９９８）

【非特許文献7】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１４：７０３−７０８（１９９９）

【非特許文献8】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６：４７６６−４７７２（１９９６）

【非特許文献9】Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ６：３３−３９， １９９７

【非特許文献10】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０：２０７１７−２０７２３， １９９５

【非特許文献11】Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７２：２３８９−２４００， ２００４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規なポリペプチドを見出し、該ポリペプチドの免疫誘導剤としての用途を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、鋭意研究の結果、イヌの精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと乳癌患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、そのｃＤＮＡを基にして配列番号６、８、１０、１２、１４で示されるアミノ酸配列を有するイヌＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドを作製した。また、取得した遺伝子のヒト相同性遺伝子を基にして、配列番号２及び４で示されるアミノ酸配列を有するヒトＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドを作製した。さらに、これらＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドが乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、食道癌又は大腸癌に特異的に発現していることを見出した。さらにまた、これらＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドを生体に投与することによって、生体内にＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドに対する免疫細胞を誘導することができること、およびＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子を発現する生体内の腫瘍を退縮させることができることを見出した。また、それらＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドに対する抗体が、ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子を発現する癌細胞を障害し生体内で抗腫瘍効果を誘導することを見出した。以上のことにより、本発明を完成させるに至った。

【0011】

したがって、本発明は、以下の特徴を有する。

【0012】

（１） 以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。
（ａ） 配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ） 上記（ａ）のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｃ） 上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド

【0013】

（２） 上記（ｂ）のポリペプチドが、前記（ａ）のポリペプチドと９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドである、上記（１）の免疫誘導剤。

【0014】

（３） 上記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである、上記（１）の免疫誘導剤。

【0015】

（４） 上記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、上記（３）の免疫誘導剤。

【0016】

（５） 上記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号２〜３０のうち配列番号６および配列番号１８を除く偶数の配列番号に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号（ａａ）４１−４００又はアミノ酸残基番号（ａａ）５０３−５６４の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである上記（３）の免疫誘導剤。

【0017】

（６） 上記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号４３〜７６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列表の配列番号４３〜７６のいずれかに示されるアミノ酸配列を部分配列として含み、アミノ酸残基数が８〜１２であるポリペプチドである、上記（５）の免疫誘導剤。

【0018】

（７） １又は複数の上記ポリペプチドを有効成分として含有する、上記（１）〜（６）のいずれかの免疫誘導剤。

【0019】

（８） 上記ポリペプチドが抗原提示細胞の処理剤である、上記（７）の免疫誘導剤。

【0020】

（９） 動物の癌の治療用及び／又は予防用である、上記（１）〜（７）のいずれかの免疫誘導剤。

【0021】

（１０） 上記癌が、乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、食道癌又は大腸癌である、上記（９）の免疫誘導剤。

【0022】

（１１） 上記動物がヒト、イヌ又はネコである、上記（９）の免疫誘導剤。

【0023】

（１２） 免疫増強剤をさらに含む、上記（１）〜（１１）のいずれかの免疫誘導剤。

【0024】

（１３） 上記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣおよびその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ並びにＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも１つのアジュバントまたはサイトカインである、上記（１２）の免疫誘導剤。

【0025】

（１４） 上記免疫誘導活性を有するポリペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞。

【0026】

（１５） 上記免疫誘導活性を有するポリペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞。

【0027】

（１６） 以下の（ａ）ないし（ｃ）のポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを個体に投与することを含む、免疫誘導方法。
（ａ）配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド

【発明の効果】

【0028】

本発明により、癌の治療及び／又は予防等に有用な新規な免疫誘導剤が提供される。後述の実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチドを担癌動物に投与すると、該担癌動物の体内において免疫細胞を誘導することができ、さらに、既に生じている癌を縮小もしくは退縮させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】ＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドをコードする遺伝子の、正常組織および腫瘍細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクをコードする遺伝子の発現パターン、参照番号２；ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。

【図2】図２中、横軸の参照番号３〜３１は、それぞれ配列番号４３〜７１のペプチドをパルスしたＴ２細胞からの刺激によるＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生能を示す。参照番号３２は、配列番号７７の陰性コントロールのペプチド（本発明の範囲外の配列であるペプチド）についての結果を示す。

【図3】図３中、横軸の参照番号３３〜３７は、それぞれ配列番号７２〜７６のペプチドをパルスしたＪＴＫ−ＬＣＬ細胞からの刺激によるＨＬＡ−Ａ２４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生能を示す。参照番号３８は、配列番号７７の陰性コントロールについての結果を示す。

【図4】図４中、横軸の参照番号３９〜６７は、それぞれ配列番号４３〜７１のペプチドを用いて刺激したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞のＵ−８７ＭＧ細胞に対する細胞障害活性を示す。参照番号６８は陰性コントロールのペプチド（配列番号７７）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。

【図5】図５中、横軸の参照番号６９〜７３は、それぞれ配列番号７２〜７６のペプチドを用いて刺激したＨＬＡ−Ａ２４陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞のＪＴＫ−ＬＣＬ細胞に対する細胞障害活性を示す。参照番号７４は陰性コントロールのペプチド（配列番号７７）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

＜ポリペプチド＞
本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるポリペプチドとしては、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチド類から選択される１もしくは複数のポリペプチドが挙げられる。

【0031】

（ａ） 配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上のアミノ酸からなり、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド
（ｂ） 上記（ａ）のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有する、かつ７個以上のアミノ酸からなる、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド
（ｃ） 上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含む、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド
本明細書において使用される「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長タンパク質も包含され、本発明では配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号の全長からなるタンパク質も包含される。

【0032】

なお、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号（すなわち、配列番号２，４，６・・２８，３０）のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ、配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号（すなわち、配列番号１，３，５・・２７，２９）に示されている。

【0033】

本明細書において使用される「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基が特定の順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号２に示されるＭｅｔ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ ・・（中略）・・ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｓｎのアミノ酸配列を持つ、７０９アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号２のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。この場合、「有する」という用語は、「からなる」という表現で置き換えてもよい。

【0034】

本明細書で使用される「免疫誘導活性」とは、生体内でインターフェロン、インターロイキン等のサイトカインを分泌する免疫細胞を誘導する能力を意味する。

【0035】

上記ポリペプチドが免疫誘導活性を有するか否かは、例えば公知のエリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ等を用いて確認することができる。具体的には、例えば下記実施例に記載されるように、免疫誘導活性を評価すべきポリペプチドを投与した生体から末梢血単核球等の細胞を得て、該細胞を該ポリペプチドと共存培養し、該細胞からのＩＦＮ−γ、インターロイキン（ＩＬ）などのサイトカイン及び／又はケモカインの産生量を、特異抗体を用いて測定することにより、該細胞中の免疫細胞数を測定することができるので、これにより免疫誘導活性を評価することができる。

【0036】

あるいは、後述の実施例に記載されるように、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のアミノ酸配列を基に作製した組換えポリペプチドを担癌動物に投与すると、その免疫誘導活性により腫瘍を退縮させることもできる。よって、上記免疫誘導活性は、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のポリペプチドを発現する癌細胞の増殖を抑制する又は癌組織（腫瘍）を縮小若しくは消滅させる能力（以下、「抗腫瘍活性」という）として評価することもできる。ポリペプチドの抗腫瘍活性は、例えば下記実施例に具体的に記載されるように、実際に該ポリペプチドを担癌生体に投与して腫瘍が縮小等されるか否かを調べることよって確認することができる。

【0037】

あるいは、該ポリペプチドで刺激したＴ細胞（すなわち、該ポリペプチドを提示する抗原提示細胞と接触させたＴ細胞）が、生体外で腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによって、ポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。Ｔ細胞と抗原提示細胞との接触は、後述するように、両者を液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。細胞障害活性の測定は、例えばＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：ｐ３１７，１９９４に記載された^５１Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法により行なうことができる。ポリペプチドを癌の治療及び／又は予防用途に用いる場合には、特に限定されないが、抗腫瘍活性を指標として免疫誘導活性を評価することが好ましい。

【0038】

本発明が開示する配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号にそれぞれ示されるアミノ酸配列は、イヌの正常精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーとイヌの乳癌患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチド、および該ポリペプチドのヒト、ウシ、ウマ、マウス、ニワトリ相同因子（ホモログ）として単離された、ＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドのアミノ酸配列である（後述の実施例１参照）。

【0039】

上記（ａ）のポリペプチドは、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上、好ましくは連続する８、９又は１０個以上のアミノ酸からなる、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチドである。特に好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で示されるアミノ酸配列を有する。なお、この分野で公知の通り、約７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性を発揮できる。従って、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のアミノ酸配列中の連続する７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば、抗原性及び免疫原性を発揮できる。従って、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のアミノ酸配列中の連続する７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば、免疫誘導活性を有し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。ただし、生体中で抗原物質に対して生産される抗体がポリクローナル抗体であることに鑑みれば、アミノ酸残基の数が多い方が、抗原物質上の種々の部位を認識する、より多くの種類の抗体を誘導できるので、ひいては免疫誘導活性を高めることができると考えられる。従って、免疫誘導活性を高めるために、アミノ酸残基の数を好ましくは３０以上、もしくは５０以上、さらに好ましくは１００以上、もしくは１５０以上、さらに好ましくは２００以上、さらに好ましくは２５０以上としてもよい。

【0040】

また、癌抗原ポリペプチドを投与することによる免疫誘導の原理として、ポリペプチドが抗原提示細胞に取り込まれ、その後該細胞内でペプチダーゼによる分解を受けてより小さな断片（以下、エピトープともいう）となり、該細胞の表面上に提示され、それを細胞障害性Ｔ細胞等が認識し、その抗原を提示している細胞を選択的に殺していくということが知られている。抗原提示細胞の表面上に提示されるポリペプチドのサイズは比較的小さく、アミノ酸数で７〜３０程度である。従って、抗原提示細胞上に提示させるという観点からは、上記（ａ）のポリペプチドとしては、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で示されるアミノ酸配列中の連続する７〜３０程度、好ましくは８〜３０もしくは９〜３０程度のアミノ酸からなるものであれば十分である。これら比較的小さなサイズのポリペプチドは、抗原提示細胞内に取り込まれることなく、直接抗原提示細胞上の細胞表面に提示される場合もある。

【0041】

また、抗原提示細胞に取り込まれたポリペプチドは、該細胞内のペプチダーゼによりランダムな位置で切断を受けて、種々のポリペプチド断片が生じ、これらのポリペプチド断片が抗原提示細胞表面上に提示されるので、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号の全長領域のように大きなサイズのポリペプチドを投与すれば、抗原提示細胞内での分解によって、抗原提示細胞を介する免疫誘導に有効なポリペプチド断片が必然的に生じる。従って、抗原提示細胞を介する免疫誘導にとっても、サイズの大きなポリペプチドを好ましく用いることができ、アミノ酸数を３０以上、さらに好ましくは１００以上、さらに好ましくは２００以上、さらに好ましくは２５０以上としてもよい。

【0042】

さらに、本発明のポリペプチドは、ＨＬＡの各型の結合モチーフを有するエピトープとなるペプチドを検索しうる照合媒体、例えばＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ （ＢＩＭＡＳ）のＨＬＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ （ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によって照合し、エピトープとなりうるペプチドをスクリーニングすることができる。具体的には、配列番号２〜３０のうち配列番号６および配列番号１８を除く偶数の配列番号に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号（ａａ）４１−４００又はアミノ酸残基番号（ａａ）５０３−５６４の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドが好ましく、さらに配列番号２のポリペプチドにおいては、配列番号４３〜７６で示されるポリペプチドがより好ましい。

【0043】

上記（ｂ）のポリペプチドは、上記（ａ）のポリペプチドのうちの少数の（好ましくは、１個もしくは数個の）アミノ酸残基が置換し、欠失し、付加し、及び／又は挿入されたポリペプチドであって、元の配列と８０％以上、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の配列同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個もしくは数個の）アミノ酸残基が置換、欠失、付加又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性又は免疫原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、上記（ｂ）のポリペプチドも免疫誘導活性を発揮し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。また、上記（ｂ）のポリペプチドは、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で示されるアミノ酸配列のうち、１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたポリペプチドであることも好ましい。本明細書中の「数個」とは、２〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、さらに好ましくは２〜４の整数を表す。

【0044】

本明細書中、アミノ酸配列又は塩基配列に関する「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列（又は塩基配列）のアミノ酸残基（又は塩基）ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列（又は塩基配列）を整列させ、一致したアミノ酸残基数（又は一致した塩基数）を全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で除したものを百分率（％）で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる（Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８７：２２６４−２２６８， １９９３； Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５：３３８９−３４０２， １９９７）。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数（又は全塩基数）は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基（又は塩基）として数えた残基数（又は塩基数）となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数（又は全塩基数）が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で、一致したアミノ酸残基数（又は塩基数）を除して算出される。

【0045】

アミノ酸残基の置換において、好ましい置換は保存的アミノ酸置換である。天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｖａｌ， Ｌｅｕ， Ａｌａ， Ｍｅｔ， Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｔｈｒ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒ Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ， Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ， Ｌｙｓ， Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ， Ｔｙｒ， Ｔｒｐ， Ｈｉｓ）のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換、すなわち保存的置換、であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、本発明の上記（ａ）のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなる。しかしながら、本発明では、上記改変体は、未改変体と同等もしはほとんど同等の免疫誘導活性を付与する限り、非保存的置換を有していてもよい。

【0046】

上記（ｃ）のポリペプチドは、上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。すなわち、上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの一端又は両端に他のアミノ酸又はポリペプチドが付加されたものであって、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドも、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。

【0047】

上記のポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ―ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる（日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、東京化学同人（日本）、１９８１年）。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第３版， Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓなど）を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。

【0048】

上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡは、ヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡであれば、上記鋳型としてイヌ染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを使用することで同様に調製できる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑ ポリメラーゼなど）及びＭｇ^２＋含有ＰＣＲバッファーを用いて９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。ＰＣＲの手法、条件等については、例えばＡｕｓｕｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第３版， Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（特に第１５章）に記載されている。また、本明細書中の配列表の配列番号１〜３０に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒト、イヌ、ウシなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、上記（ａ）のポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記の（ｂ）のポリペプチドや（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができるので、そのようなポリヌクレオチドも、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に合成することができる。

【0049】

上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ １、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0050】

宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子、等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。

【0051】

宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば（Ｈｉｓ）_６〜（Ｈｉｓ）_１０）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。

【0052】

発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、等の周知の方法を用いることができる。

【0053】

宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0054】

以上の方法によって得られるポリペプチドには、上述した通り、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＨｉｓタグとの融合タンパク質などが例示できる。このような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、上記の（ｃ）のポリペプチドとして本発明の範囲に含まれる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、免疫誘導活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。

【0055】

＜免疫誘導剤＞
後述の実施例に具体的に記載される通り、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチドを担癌生体に投与すると、既に生じている腫瘍を退縮させることができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療及び／又は予防剤として用いることができる。

【0056】

本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。

【0057】

この場合、対象となる癌としては、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のアミノ酸配列又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子を発現している癌であり、好ましくは、乳癌、脳腫瘍、白血病、肺癌、リンパ腫、肥満細胞腫、食道癌及び大腸癌である。これらの特定の癌には、例えば、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、慢性型リンパ球性白血病、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫などが包含されるが、これらに限定されない。

【0058】

また、対象となる動物は、哺乳動物であり、例えば霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、特にヒト、イヌおよびネコが好ましい。

【0059】

本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。癌の治療目的で該免疫誘導剤を用いる場合には、抗癌作用を高めるため、後述の実施例に記載するように、治療対象となる腫瘍の近傍の所属リンパ節に投与することもできる。投与量は、免疫誘導するのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよいし、また、動物の体重、性別（雄又は雌）、症状などに応じて変化させうる。癌の治療及び／又は予防に有効な量は、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象動物に対し１日当りの有効量として０．０００１μｇ〜１０００μｇ、好ましくは０．００１μｇ〜１０００μｇであり、１回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。下記実施例に具体的に示されるとおり、本発明の免疫誘導剤は、既に形成されている腫瘍を退縮させることができる。従って、発生初期の少数の癌細胞にも抗癌作用を発揮し得るので、癌の発症前や癌の治療後に用いれば、癌の発症や再発を防止することができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療と予防の双方に有用である。

【0060】

本発明の免疫誘導剤は、ポリペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。添加剤の具体例としては、生理緩衝液のような希釈剤；砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等のような賦形剤；シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等のような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等の滑沢剤等が挙げられるが、これらに限定されない。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。

【0061】

本発明の免疫誘導剤は、生体内での免疫学的応答を強化することができる免疫増強剤と組み合わせて用いることができる。免疫増強剤は、本発明の免疫誘導剤に含まれていてもよいし、別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与してもよい。

【0062】

ここで、患者は、動物、特に哺乳動物であり、好ましくはヒト、イヌ及びネコである。

【0063】

上記免疫増強剤としては、例えばアジュバントを挙げることができる。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、抗癌作用を高めることができる。従って、特に、本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防に用いる場合、免疫誘導剤は、有効成分たる上記ポリペプチドに加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。多数の種類のアジュバントが当業界で周知であり、いずれのアジュバントでも用いることができる。アジュバントの具体例としては、ＭＰＬ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）、サルモネラ属のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒｅ ５９５リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）、Ｑｕｉｌｌｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−Ｌ１（Ｓｏら， Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ， １９９７， ７：１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；アルム（ａｌｕｍ）；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｒｅｉｇら， Ｎａｔｕｒｅ， １９９５， ３７４：５４６−５４９）；ポリＩＣ及びその誘導体（ポリＩＣＬＣ等）ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。なかでも、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体並びにＣｐＧオリゴヌクレオチドが好ましい。上記アジュバントとポリペプチドの混合比は、典型的には約１：１０〜１０：１，好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：１である。ただし、アジュバントは上記例示に限定されず、当業界で公知の上記以外のアジュバントも本発明の免疫誘導剤を投与する際に用いられ得る（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ著， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、１９８６年）。ポリペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。

【0064】

また、上記免疫増強剤としては、上記アジュバント以外にも、対象の免疫応答を刺激する因子を用いることもできる。例えば、リンパ球や抗原提示細胞を刺激する特性を有する各種サイトカインを免疫増強剤として本発明の免疫誘導剤と組み合わせて用いることができる。そのような免疫学的応答を増強可能な多数のサイトカインが当業者に公知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγおよびＦｌｔ３リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。このような因子も上記免疫増強剤として用いることができ、本発明の免疫誘導剤に含ませて又は別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与することができる。

【0065】

＜抗原提示細胞＞
さらにまた、上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、上記した（ａ）ないし（ｃ）のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理剤として利用し得る。ここで、抗原提示細胞としては、樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージが例示され、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＭＨＣクラスＩ分子が同定されており、周知である。ヒトにおけるＭＨＣ分子はＨＬＡと呼ぶ。ＨＬＡクラスＩ分子としては、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃを挙げることができ、より具体的には、ＨＬＡ−Ａ１， ＨＬＡ−Ａ０２０１， ＨＬＡ−Ａ０２０４， ＨＬＡ−Ａ０２０５， ＨＬＡ−Ａ０２０６， ＨＬＡ−Ａ０２０７， ＨＬＡ−Ａ１１， ＨＬＡ−Ａ２４， ＨＬＡ−Ａ３１， ＨＬＡ−Ａ６８０１， ＨＬＡ−Ｂ７， ＨＬＡ−Ｂ８， ＨＬＡ−Ｂ２７０５， ＨＬＡ−Ｂ３７， ＨＬＡ−Ｃｗ０４０１， ＨＬＡ−Ｃｗ０６０２などを挙げることができる。

【0066】

ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とＩＬ−３（あるいはＩＬ−４）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。

【0067】

この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ程度が好ましく、さらに好ましくは２０〜５００ｎｇ／ｍＬ程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である３７℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、５％ ＣＯ_２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常３日〜２週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。

【0068】

上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させる方法自体は、周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、１μｇ／ｍｌないし１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは５μｇ／ｍｌないし２０μｇ／ｍｌ程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常、１０^３細胞／ｍｌから１０^７細胞／ｍｌ程度、好ましくは５×１０^４細胞／ｍｌから５×１０^６細胞／ｍｌ程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。

【0069】

上記したポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のＭＨＣ分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ポリペプチドを提示し、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。

【0070】

上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１〜１：１００程度、好ましくは１：５〜１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００〜１０００万細胞／ｍｌ程度、好ましくは１００００〜１００万細胞／ｍｌ程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日〜３週間、好ましくは４日〜２週間程度である。また、共存培養は、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７及びＩＬ−１２のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、ＩＬ−２及びＩＬ−７の濃度は、通常、５Ｕ／ｍｌから２０Ｕ／ｍｌ程度、ＩＬ−６の濃度は通常、５００Ｕ／ｍｌから２０００Ｕ／ｍｌ程度、ＩＬ−１２の濃度は通常、５ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌ程度であるが、これらに限定されるものではない。ここで、「Ｕ」は活性単位を表す。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。

【0071】

上記の共存培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞を調製することができる。

【0072】

下記実施例に記載される通り、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のポリペプチドをコードする遺伝子は、乳癌細胞、白血病細胞およびリンパ腫細胞に特異的に発現している。従って、これらの癌種においては、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のポリペプチドが正常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。癌細胞内に存在するポリペプチドの一部が癌細胞表面上のＭＨＣ分子に提示され、上記のようにして調製した細胞障害性Ｔ細胞が生体内に投与されると、これを目印として細胞障害性Ｔ細胞が癌細胞を障害することができる。また、上記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害することができる。すなわち、上記ポリペプチドを用いて調製された上記細胞障害性Ｔ細胞や上記抗原提示細胞もまた、本発明の免疫誘導剤と同様に、癌の治療及び／又は予防剤として有用である。

【0073】

上記した単離抗原提示細胞や単離Ｔ細胞を生体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように上記（ａ）ないし（ｃ）のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。

【0074】

抗原提示細胞又は単離Ｔ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常１個〜１０兆個、好ましくは１００万個〜１０億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。

【0075】

＜遺伝子ワクチン＞
また、上記（ａ）ないし（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ、ポリペプチドを投与するのと同等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記した（ａ）ないし（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。このような、抗原ポリペプチドを発現可能な組換えベクターは、遺伝子ワクチンとも呼ばれる。

【0076】

遺伝子ワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。

【0077】

遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で０．１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ程度である。

【0078】

ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み、これを対象動物に感染させる方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。

【0079】

その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。

【0080】

本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ方法、および対象動物からある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ方法がある（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５（日本）、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８（日本）、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号（日本）、およびこれらの引用文献等）。ｉｎ ｖｉｖｏ方法がより好ましい。

【0081】

ｉｎ ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。

【0082】

なお、本発明において、「配列番号１に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、「配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。

【実施例】

【0083】

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の具体例に制限されないものとする。
実施例１：ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの取得
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
健常な犬の精巣組織から酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム法（Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ ＲＮＡを精製した。

【0084】

この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ， ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ， ＺＡＰ−ｃＤＮＡ ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは７．７３×１０^５ｐｆｕ／ｍｌであった。

【0085】

（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
上記作製したイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２２１０クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’）に感染させ、４２℃、３〜４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ Ｅｘｔｒａ： ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導および発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２〜３時間反応させた。

【0086】

上記患犬血清としては、乳癌の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１−ＢＬｕｅ ＭＲＦ’）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次いで０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ_３ ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ−カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液、反応させ、大腸菌およびファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。

【0087】

かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｄｏｇ ＩｇＧ−ｈ＋Ｉ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：ＢＥＴＨＹＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、室温１時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌＳＯ_４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％ ゼラチン ｐＨ７．５）５００μｌに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する３０９４０個のファージクローンをスクリーニングして、５個の陽性クローンを単離した。

【0088】

（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
上記方法により単離した５個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’）を吸光度ＯＤ_６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液２５０μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５〜３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ_６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μｌをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。

【0089】

精製したプラスミドは、配列番号３１に記載のＴ３プライマーと配列番号３２に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号５，７，９，１１，１３に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列（配列番号６，８，１０，１２，１４）を用いて、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を行い既知遺伝子との相同性検索を行った結果、得られた５個の遺伝子全てがＣＡＰＲＩＮ−１をコードする遺伝子であることが判明した。５個の遺伝子間の配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において塩基配列１００％、アミノ酸配列９９％であった。この遺伝子のヒト相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９８％であった。ヒト相同因子の塩基配列を配列番号１，３に、アミノ酸配列を配列番号２，４に示す。また、取得したイヌ遺伝子のウシ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９７％であった。ウシ相同因子の塩基配列を配列番号１５に、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウシ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９３〜９７％であった。また、取得したイヌ遺伝子のウマ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９３％、アミノ酸配列９７％であった。ウマ相同因子の塩基配列を配列番号１７に、アミノ酸配列を配列番号１８に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウマ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９３％、アミノ酸配列９６％であった。また、取得したイヌ遺伝子のマウス相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８７〜８９％、アミノ酸配列９５〜９７％であった。マウス相同因子の塩基配列を配列番号１９，２１，２３，２５，２７に、アミノ酸配列を配列番号２０，２２，２４，２６，２８に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とマウス相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８９〜９１％、アミノ酸配列９５〜９６％であった。また、取得したイヌ遺伝子のニワトリ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８２％、アミノ酸配列８７％であった。ニワトリ相同因子の塩基配列を配列番号２９に、アミノ酸配列を配列番号３０に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とニワトリ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８１〜８２％、アミノ酸配列８６％であった。

【0090】

（４）各組織での遺伝子発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌおよびヒトの正常組織および各種細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０〜１００ｍｇおよび各細胞株５〜１０×１０^６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（配列番号３３および３４に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／３０秒のサイクルを３０回繰り返して行った。なお、上記遺伝子特異的プライマーは、配列番号５の塩基配列（イヌＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子）中の２０６番〜６３２番および配列番号１の塩基配列（ヒトＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子）中の６９８番〜１１２４番塩基の領域を増幅するものであった。比較対照のため、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（配列番号３５および３６に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、健常なイヌ組織では精巣に強い発現が見られ、一方イヌ乳癌および腺癌組織で発現が見られた。さらに、取得した遺伝子のヒト相同因子の発現を併せて確認したところ、イヌＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子と同様、正常組織で発現が確認できたのは精巣のみだったが、癌細胞では乳癌、脳腫瘍、白血病、肺癌、食道癌細胞株など、多種類の癌細胞株で発現が検出され、特に多くの乳癌細胞株で発現が確認された。この結果から、ＣＡＰＲＩＮ−１は精巣以外の正常組織では発現が見られず、一方、多くの癌細胞で発現しており、特に乳癌細胞株に発現していることが確認された。

【0091】

なお、図１中、縦軸の参照番号１は、上記で同定した遺伝子の発現パターンを、参照番号２は、比較対照であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。

【0092】

（５）免疫組織化学染色
（５）−１ マウスおよびイヌ正常組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌）およびイヌ（ビーグル犬、雌）をエーテル麻酔下およびケタミン／イソフルラン麻酔下で放血させ、開腹後、各臓器（胃、肝臓、眼球、胸腺、筋肉、骨髄、子宮、小腸、食道、心臓、腎臓、唾液腺、大腸、乳腺、脳、肺、皮膚、副腎、卵巣、膵臓、脾臓、膀胱）をそれぞれＰＢＳの入った１０ｃｍディッシュに移した。ＰＢＳ中で各臓器を切り開き、４％ ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で一晩還流固定した。還流液を捨て、ＰＢＳで各臓器の組織表面をすすぎ、１０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液を５０ｍｌ容の遠心チューブに入れ、その中に各組織を入れて４℃で２時間ローターを用いて振とうした。２０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液に入れ替え、４℃で組織が沈むまで静置後、３０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液に入れ替え、４℃で組織が沈むまで静置した。組織を取り出し、必要な部分を手術用メスで切りだした。次に、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ社製）をかけて組織表面になじませた後、クライオモルドに組織を配置した。ドライアイスの上にクライオモルドをおいて急速凍結させた後、クライオスタット（ＬＥＩＣＡ社製）を用いて１０〜２０μｍに薄切し、スライドガラスごとヘアードライアーで３０分間風乾し、薄切組織がのったスライドガラス作製した。次にＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）を満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮ（ＤＡＫＯ社製）で囲んだ後、ブロッキング液として、マウス組織はＭＯＭマウスＩｇブロッキング試薬（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）を、イヌ組織は１０％牛胎児血清を含むＰＢＳ−Ｔ溶液をそれぞれのせ、モイストチャンバー上で室温で１時間静置した。次に参考例１で作製した癌細胞表面に反応する、配列番号７８の重鎖可変領域と配列番号７９の軽鎖可変領域を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体をブロッキング液で１０μｇ／ｍｌに調製した溶液をのせ、モイストチャンバー内で４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ブロッキング液で２５０倍に希釈したＭＯＭビオチン標識抗ＩｇＧ抗体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）をのせ、モイストチャンバー内で室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、アビジン−ビオチンＡＢＣ試薬（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）をのせ、モイストチャンバー内に室温で５分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＢ１０ｍｇ＋３０％Ｈ_２Ｏ_２ １０μｌ／０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍｌ）をのせ、モイストチャンバー内に室温で３０分間静置した。蒸留水でリンスし、ヘマトキシリン試薬（ＤＡＫＯ社製）を載せて室温で１分間静置後、蒸留水でリンスした。７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、キシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は、唾液腺、腎臓、結腸、胃の各組織において細胞内で僅かに発現が認められたが、細胞表面での発現は認められず、また、その他の臓器由来の組織では全く発現が認められなかった。

【0093】

（５）−２ イヌ乳癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
病理診断で悪性乳癌と診断されたイヌの凍結された乳癌組織１０８検体を用いて、上述と同様の方法で凍結切片スライド作製および配列番号７８の重鎖可変領域と配列番号７９の軽鎖可変領域を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は１０８検体中１００検体（９２．５％）で発現が確認され、特に異型度の高い癌細胞表面に強く発現していた。

【0094】

（５）−３ ヒト乳癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト乳癌組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の乳癌組織１８８検体を用いて、免疫組織化学染色を行った。ヒト乳癌組織アレイを６０℃で３時間処理後、キシレンを満たした染色瓶に入れて５分ごとにキシレンを入れ替える操作を３回行った。次にキシレンの代わりにエタノールおよびＰＢＳ−Ｔで同様の操作を行った。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を満たした染色瓶にヒト乳癌組織アレイを入れ、１２５℃で５分間処理後、室温で４０分以上静置した。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮで囲み、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）を適量滴下した。室温で５分間静置後、ＰＢＳ−Ｔを満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。ブロッキング液として、１０％ ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液をのせ、モイストチャンバー内で室温で１時間静置した。次に参考例１で作製した癌細胞表面に反応する、配列番号７８の重鎖可変領域と配列番号７９の軽鎖可変領域を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を、５％ ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液で１０μｇ／ｍｌに調製した溶液をのせ、モイストチャンバー内で４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＤＡＫＯ社製）適量滴下し、モイストチャンバー内に室温で３０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＫＯ社製）をのせ、室温で１０分程度静置した後、発色液を捨て、ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、蒸留水でリンスし、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、キシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は全乳癌組織１８８検体の内、１３８検体（７３％）で強い発現が認められた。

【0095】

（５）−４ ヒト悪性脳腫瘍におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト悪性脳腫瘍組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の悪性脳腫瘍組織２４７検体を用いて、上述（５）−３と同様の方法で配列番号７８の重鎖可変領域と配列番号７９の軽鎖可変領域を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は全悪性脳腫瘍組織２４７検体の内、２２７検体（９２％）で強い発現が認められた。

【0096】

（５）−５ ヒト乳癌転移リンパ節におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト乳癌転移リンパ節組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の乳癌転移リンパ節組織１５０検体を用いて、上述（５）−３と同様の方法で配列番号７８の重鎖可変領域と配列番号７９の軽鎖可変領域を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は全乳癌転移リンパ節組織１５０検体の内、１３６検体（９０％）で強い発現が認められた。すなわち、乳癌から転移した癌組織においてもＣＡＰＲＩＮ−１は強く発現することが判った。

【0097】

参考例１：ＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体の作製
実施例２で調製した配列番号２に示される、抗原タンパク質（ヒトＣＡＰＲＩＮ−１）１００μｇを等量のＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（シグマ社製）と混合し、これをマウス１匹当たりの抗原溶液とした。抗原溶液を６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内に投与後、１週間毎にさらに３回投与を行った。最後の免疫から３日後に摘出した脾臓を滅菌した２枚のスライドガラスに挟んで擦り潰し、ＰＢＳ（−）（日水社製）を用いて洗浄し１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去する操作を３回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣより購入）とを１０：１の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌとＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）８００μｌを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて５分間静置して細胞融合を行った。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、ギブコ社製のＨＡＴ溶液を２％当量加えた１５％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＨＡＴ選択培地）１５０ｍｌで細胞を懸濁し、９６穴プレート（ヌンク社製）の１ウェル当たり１００μｌずつ、プレート１５枚に播種した。７日間、３７℃、５％ ＣＯ_２の条件で培養することで、脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。

【0098】

作製したハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ−１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液（シグマ社製）を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５−３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを複数個選抜した。

【0099】

選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ−１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％ ＢＳＡ溶液を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５−３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに反応性を示すモノクローナル抗体を産生する複数のハイブリドーマ株を得、ハイブリドーマの培養上清をプロテインＧ担体を用いて精製し、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに結合するモノクローナル抗体１５０個を得た。
次にそれらモノクローナル抗体の内、ＣＡＰＲＩＮ−１が発現する乳癌細胞の細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、１０^６個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖを１．５ｍｌ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの上清１００μｌを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、抗体の代わりに培地を添加したものをコントロールとした。その結果、コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、乳癌細胞の細胞表面に反応するモノクローナル抗体１１個を選抜した。これらの内１つのモノクローナル抗体の重鎖可変領域の配列を配列番号：７８に、軽鎖可変領域の配列を配列番号：７９に示す。

【0100】

実施例２：イヌおよびヒト新規癌抗原タンパクの作製
（１）組換えタンパク質の作製
実施例１で取得した配列番号５の遺伝子を基に、以下の方法にて組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で得られたファージミド溶液より調製し配列解析に供したベクターを１μｌ、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号３７および３８に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃／１０秒、６８℃／１．５分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号６のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。

【0101】

精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＮｄｅＩ、ＫｐｎＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。

【0102】

また、配列番号７の遺伝子を基に、以下の方法にてイヌ相同遺伝子の組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織もしくは細胞ｃＤＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μｌ、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号３９および４０に記載）を各０．４μＭ， ０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ （ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃／１０秒、６８℃／２．５分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号８のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。

【0103】

精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＮｄｅＩ、ＫｐｎＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。

【0104】

また、配列番号１の遺伝子を基に、以下の方法にてヒト相同遺伝子の組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織・細胞ｃＤＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μｌ、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号４１および４２に記載）を各０．４μＭ， ０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ （ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃／１０秒、６８℃／２．５分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号２のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。

【0105】

精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＳａｃＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。

【0106】

（２）組換えタンパク質の精製
上記で得られた、配列番号１，５，７の遺伝子を発現するそれぞれの組換え大腸菌を３０μｇ／ｍＬカナマイシン含有ＬＢ培地にて６００ｎｍでの吸光度が０．７付近になるまで３７℃で培養後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド終濃度が１ｍＭとなるよう添加し、３７℃で４時間培養した。その後４８００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。この菌体ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、さらに４８００ｒｐｍで１０分間遠心し菌体の洗浄を行った。

【0107】

この菌体をリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、氷上にて超音波破砕を行った。大腸菌超音波破砕液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。

【0108】

可溶性画分を、定法に従って調整したニッケルキレートカラム（担体：Ｃｈｅｌａｔｅｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標） Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ社）、カラム容量５ｍＬ、平衡化緩衝液５０ｍＭ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加した。未吸着画分をカラム容量の１０倍量の５０ｍＭ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）と２０ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄操作を行った後、直ちに、１００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて６ベッド溶出した。クマシー染色によって目的タンパク質の溶出を確認した１００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）溶出画分を強陰イオン交換カラム（担体：Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標） Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ社）、カラム容量５ｍＬ、平衡化緩衝液としての２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加した。未吸着画分をカラム容量の１０倍量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と２００ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄操作を行った後、直ちに、４００ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて５ベッド溶出を行い、配列番号２、６、８に示されるアミノ酸配列を有する各タンパク質の精製画分を得、以降これら精製画分を投与試験用の材料とした。

【0109】

上記方法によって得られた各精製標品のうち、２００μｌを１ｍｌの反応用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２ｍＭ ＣａＣｌ_２ ｐＨ７．４）に分注を行った後、エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）２μｌ添加した後、室温にて一晩静置・反応を行い、Ｈｉｓタグを切断し、Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて添付プロトコールに従って精製を行った。次に、上記方法によって得られた精製標品１．２ｍｌを、限外ろ過ＮＡＮＯＳＥＰ １０Ｋ ＯＭＥＧＡ（ＰＡＬＬ社製）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬社製）置換した後、ＨＴタフリンアクロディスク０．２２μｍ（ＰＡＬＬ社製）にて無菌ろ過を行い、これを以下の実験に用いた。

【0110】

実施例３：組換えタンパク質の担癌患犬に対する投与試験
（１）抗腫瘍評価
表皮に腫瘤を持つ担癌患犬（乳癌）に対して、上記で精製した組換えタンパクの抗腫瘍効果の評価を行った。

【0111】

上記の通り精製した配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する組換えポリペプチド１００μｇ（０．５ｍｌ）に等量の不完全フロイントアジュバント（和光純薬社製）を混合して癌治療剤を調製した。これを初回投与、３日後および７日後に腫瘍近傍の所属リンパ節に計３回投与を行った。その結果、癌治療剤投与時点で、大きさが約８６ｍｍ^３であった腫瘤が、癌治療剤初回投与から１０日後には５５ｍｍ^３に、２０日後には３０ｍｍ^３に、３０日後には２０ｍｍ^３まで縮小した。

【0112】

また、別の乳腺癌の患犬に対して、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する組換えポリペプチド（０．５ｍｌ）に、０．５ｍｌの不完全フロイントアジュバントを混合したものを上記と同様にして計３回投与した。また同時にイヌインターロイキン１２を１００μｇずつ皮下投与した。その結果、癌治療剤投与時点で、大きさが約１２３ｍｍ^３であった腫瘤が、癌治療剤初回投与から４５日後には完全に退縮した。

【0113】

さらに、別の乳腺癌の患犬に対して、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する組換えポリペプチド（０．５ｍｌ）に、０．５ｍｌの不完全フロイントアジュバントを混合したものを同様にして計３回投与した。また同時にイヌインターロイキン１２を１００μｇずつ皮下投与した。その結果、癌治療剤投与時点で、大きさが約９６ｍｍ^３であった腫瘤が、癌治療剤初回投与から２７日後には完全に退縮した。

【0114】

（２）免疫誘導能評価
上記（１）での投与試験で配列番号６、配列番号２および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する各組換えポリペプチドを投与した各患犬の血液を、投与前並びに初回投与から１０日後及び３０日後の各時点で採取し、常法に従って末梢血単核球を分離し、それを用いたＩＦＮγのエリスポットアッセイ法により、投与した各組換えタンパクについて免疫誘導能の評価を行った。

【0115】

ミリポア社製の９６穴プレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＩＰ， ＭＡＩＰＳ４５１０）に７０％エタノールを１００μｌ／穴ずつ添加し、５分間静置し吸引除去後、滅菌水で洗浄し、２００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（ｐＨ８．２）を３００μｌ／穴添加し５分間静置後、吸引除去しプレートを洗浄した。次に２００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅに添加した抗イヌインターフェロンγモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社製、ｃｌｏｎｅ１４２５２９， ＭＡＢ７８１）を０．５μｇ／穴ずつ添加し、３７℃で一晩インキュベートし、一次抗体を固相化した。一次抗体を吸引除去後、ブロッキング溶液（１％ ＢＳＡ−５％スクロース−２００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（ｐＨ８．２））を３００μｌ／穴ずつ添加し４℃にて一晩インキュベートしてプレートをブロッキングした。ブロッキング溶液を吸引除去後、１０％ 牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を３００μｌ／穴ずつ添加して５分間静置し培地を吸引除去した。その後、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地に懸濁した各々のイヌ末梢血単核球を５×１０^５細胞／穴ずつプレートに添加し、これにそれぞれの投与に用いたイヌ由来ポリペプチドもしくはヒト由来ポリペプチドを１０μｌ／穴ずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２４時間培養することにより、末梢血単核球中に存在し得る免疫細胞からインターフェロンγを産生させた。培養後、培地を除去し、洗浄液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−２００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（ｐＨ８．２））を用いてウェルを６回洗浄した。上記ブロッキング溶液にて１０００倍に希釈したラビット抗イヌポリクローナル抗体をそれぞれのウェルに１００μｌずつ添加し４℃にて一晩インキュベートした。上記洗浄液で３回ウェルを洗浄した後、上記ブロッキング溶液にて１０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ラビット抗体をそれぞれのウェルに１００μｌずつ添加し、３７℃で２時間反応させた。上記洗浄液で３回ウェルを洗浄した後、コニカイムノステイン（コニカ社製）にて発色させ、ウェルを水洗して反応を停止させた。反応停止後、メンブレンを乾燥させ、ＫＳエリスポット（カールツァイツ社製）を用いて出現したスポット数をカウントした。その結果、ポリペプチド投与前の各患犬の末梢血単核球ではスポットが検出されなかった。一方、ポリペプチドを投与後には、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する組換えポリペプチドを投与した患犬では、投与１０日後および３０日後の末梢血単核球でそれぞれ１３個、８２個のスポットが検出され、また、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する組換えポリペプチドを投与した患犬では、投与１０日後および３０日後の末梢血単核球でそれぞれ５３個、１８９個のスポットが検出され、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する組換えポリペプチドを投与した患犬では、投与１０日後および３０日後の末梢血単核球でそれぞれ３２個、１１７個のスポットが検出された。

【0116】

以上の結果から、投与患犬において、投与した組換えタンパクに特異的に反応してインターフェロンγを産生する免疫細胞が誘導されていることが確認され、これらの免疫細胞を中心とした免疫反応により、上記（１）に示す抗腫瘍効果が発揮されたことが示された。

【0117】

実施例４：ＤＮＡワクチンによる抗腫瘍効果
配列番号１９の遺伝子を基に、以下の方法にて組換えプラスミドを作製した。ＰＣＲは、ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子が発現していることが確認されたマウス大腸癌細胞株ＣＴ２６（ＡＴＣＣより購入）から実施例１（４）と同様にして抽出したｃＤＮＡを１μｌ、２種類のプライマー（配列番号８０および８１に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼとなるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、９８℃／１０秒、５５℃／１５秒、７２℃／４分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号２０のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約２１００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。

【0118】

精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収後シークエンス解析を行い、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致したプラスミド得た。それをＥｃｏＲＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＥｃｏＲＩ制限酵素で処理した哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に常法に従って挿入した。

【0119】

上記で作製したプラスミドＤＮＡ１００μｇに５０μｇの金粒子（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）、１００μｌのスペルミジン（ＳＩＧＭＡ社製）および１００μｌの１Ｍ ＣａＣｌ_２を添加し、ボルテックスによって攪拌し１０分間室温で静置した（以後金−ＤＮＡ粒子と記載する）。 ３０００ｒｐｍで１分遠心した後、上清を捨て１００％エタノールで３回洗浄した。金−ＤＮＡ粒子に１００％エタノール６ｍｌを加えボルテックスによって十分に攪拌した後、金− ＤＮＡ粒子を、Ｔｅｆｚｅｌ Ｔｕｂｉｎｇ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）に流し込み、壁面に沈殿させた。金−ＤＮＡ粒子が付着したＴｅｆｚｅｌ Ｔｕｂｉｎｇ のエタノールを風乾し、遺伝子銃に適した長さにカットした。

【0120】

２０匹のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の背部皮下に、１匹あたり、１０^６個のＣＴ２６細胞を移植し、腫瘍が直径７ｍｍ程度の大きさになるまで成長させた。その後、上記で作製したチューブを遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔に経皮投与を行い（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）、抗腫瘍効果を評価した。

【0121】

その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子が挿入されていない空のプラスミドを投与されたコントロールのマウス（１０匹）は、いずれも腫瘍は大きく増大し、腫瘍移植後６３日目には１０匹すべてが死亡した。一方、ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子が挿入されたプラスミドを投与されたマウス（１０匹）は、いずれも腫瘍移植後２５日までに腫瘍が完全に退縮し、コントロールのマウスがすべて死亡した腫瘍移植後６３日目には、すべてのマウスが生存していた。

【0122】

実施例５：ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導
（１）ＨＬＡ−Ａ０２０１とＨＬＡ−Ａ２４に結合するペプチドモチーフの予測
ヒトＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドのアミノ酸配列の情報をＧｅｎＢａｎｋから得た。ＨＬＡ−Ａ０２０１とＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ予測のため、公知のＢＩＭＡＳソフト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／で利用可能）を用いたコンピューター予測プログラムを用いてヒトＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を解析し、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子に結合可能と予想される配列番号４３から配列番号７１に示すペプチド２９種類と、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合可能と予想される配列番号７２から配列番号７６に示す５種類を選択した。

【0123】

（２）ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導
ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性の健常人から末梢血を分離し、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（ＯｒｇａｎｏｎｐＴｅｋｎｉｋａ， Ｄｕｒｈａｍ， ＮＣ）に重層して１，５００ｒｐｍで室温で２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（またはそれ以上）洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｌｇｉｅｓ社製）２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）中に３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。

【0124】

付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養した。６日後にＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ， Ｇｅｎｚｙｍｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。

【0125】

調製した樹状細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、上記（１）にて選択したＨＬＡ−Ａ０２０１分子に結合可能と予想される配列番号４３から配列番号７１に示すペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Ｎａｂｉ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ， Ｇｅｎｚｙｍｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０^５細胞ずつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０^６細胞添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ペプチドで処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Ｎａｂｉ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）、ＩＬ−７（１０Ｕ／ｍｌ， Ｇｅｎｚｙｍｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）およびＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ， Ｇｅｎｚｙｍｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し（細胞密度：１×１０^５細胞／ｍｌ）、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０^５細胞ずつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４〜６回繰返した後刺激されたＴ細胞を回収し，フローサイトメトリーによりＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。

【0126】

ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合可能と予想される配列番号７２から配列番号７６に示すペプチドについても、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の健常人の末梢血から誘導した樹状細胞とＴ細胞集団を用いて上記と同様の方法にて、ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を試みた。

【0127】

なお、陰性コントロールとして、本発明の範囲外の配列であるペプチド（配列番号７７）を使用した。

【0128】

実施例６：細胞障害性Ｔ細胞抗原エピトープの決定
（１）ＩＦＮ−γ産生能
実施例５（２）にて誘導したＴ細胞の内、増殖が見られたＴ細胞それぞれについて、ペプチドエピトープに対する特異性を調べるために、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子に結合可能と予想される各ペプチドをパルスした、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子を発現するＴ２細胞（Ｓａｌｔｅｒ ＲＤ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２１：２３５−２４６（１９８５）、ＡＴＣＣより購入）（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中各ペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養）５×１０^４個に対して、５×１０^３個のＴ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていないＴ２細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号４３から配列番号７１のペプチドをパルスしたＴ２細胞を用いた穴の培養上清において、ＩＦＮ−γ産生が確認された（図２）。この結果から、上記ペプチドは特異的にＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。

【0129】

上記と同様に、実施例５（２）にて配列番号７２から配列番号７６のペプチドを用いて誘導したペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞について、ペプチドエピトープに対する特異性を調べるために、ペプチドをパルスした、ＨＬＡ−Ａ２４分子を発現するＪＴＫ−ＬＣＬ細胞（理化学研究所より購入）に対する、Ｔ細胞のＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていないＪＴＫ−ＬＣＬ細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号７２から配列番号７６のペプチドをパルスしたＪＴＫ−ＬＣＬ細胞を用いた穴の培養上清において、ＩＦＮ−γ産生が確認された（図３）。この結果から、配列番号７２から配列番号７６のペプチドは、特異的にＨＬＡ−Ａ２４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。

【0130】

（２）細胞障害性評価
次に、本発明で用いられる配列番号４３から配列番号７１のペプチドが、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性でヒトＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドを発現する腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ０２０１分子上に提示されるものであるか、また本ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ０２０１陽性でヒトＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドを発現する腫瘍細胞を障害することができるかを検討した。ヒトＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドの発現が確認されているヒトグリオーマ細胞株、Ｕ−８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣより購入）を１０^６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ウシ胎児血清（キブコ社製、以下ＦＢＳという）を含むＲＰＭＩ培地（キブコ社製）で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０^３個ずつ添加し、さらにこれに後１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で懸濁された５×１０^４個の各ペプチドで刺激されたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のペプチドエピトープ反応性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定することによって、各ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を算出した。その結果、本ペプチドで刺激されたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞がＵ−８７ＭＧ細胞に対する細胞障害活性を有することが判明した（図４）。一方、陰性コントロールのペプチド（配列番号７７）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞は、細胞障害活性を示さなかった。従って、本発明で用いられる各ペプチド（配列番号４３から配列番号７１）は、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性でヒトＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドを発現する腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ０２０１分子上に提示されるものであり、さらに本ペプチドは、このような腫瘍細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。

【0131】

次に、配列番号７２から配列番号７６のペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性でヒトＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドを発現する腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ２４分子上に提示されるものであるか、また本ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ２４陽性でヒトＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドを発現する腫瘍細胞を障害することができるかを上記と同様に検討した。ＨＬＡ−Ａ２４陽性でヒトＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドを発現するＪＴＫ−ＬＣＬ細胞にクロミウム５１を取り込ませ、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のペプチドエピトープ反応性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して培養したときの、障害を受けた細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定した結果、配列番号７２から配列番号７６のペプチドで刺激されたＨＬＡ−Ａ２４陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞がＪＴＫ−ＬＣＬ細胞に対する細胞障害活性を有することが判明した（図５）。従って、配列番号７２から配列番号７６は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性でヒトＣＡＰＲＩＮ−１ポリペプチドを発現する細胞上のＨＬＡ−Ａ２４分子上に提示されるものであり、さらに本ペプチドは、このような細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。陰性コントロールのペプチド（配列番号７７）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞は、細胞障害性を示さなかった。

【0132】

なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明で用いられる各ペプチドで刺激誘導されたＣＤ８陽性Ｔ細胞５×１０^４個とクロミウム５１を取り込ませた１０^３個のＵ−８７ＭＧ細胞あるいはＪＴＫ−ＬＣＬ細胞とを混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式^＊により算出したＣＤ８陽性Ｔ細胞のＵ−８７ＭＧ細胞あるいはＪＴＫ−ＬＣＬ細胞（標的細胞という）に対する細胞障害活性を示した結果である。

【0133】

^＊式：細胞障害活性（％）＝ＣＤ８陽性Ｔ細胞を加えた際のＵ−８７ＭＧ細胞あるいはＪＴＫ−ＬＣＬ細胞からのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００。

【産業上の利用可能性】

【0134】

本発明は、癌の治療および予防のために産業上有用である。

【0135】

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−２０２０６５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。また、本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

【配列表フリーテキスト】

【0136】

配列番号３１：Ｔ３プライマー
配列番号３２：Ｔ７プライマー
配列番号３３〜３４：プライマー
配列番号３５〜３６：ＧＡＰＤＨプライマー
配列番号３７〜４２、８０〜８１：プライマー

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]