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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5963208
(24)【登録日】2016年7月8日
(45)【発行日】2016年8月3日
(54)【発明の名称】再生組織足場
(51)【国際特許分類】
A61L 27/00 20060101AFI20160721BHJP
【ＦＩ】
A61L27/00 G
A61L27/00 Z
【請求項の数】24
【全頁数】20
(21)【出願番号】特願2013-524164(P2013-524164)
(86)(22)【出願日】2011年8月9日
(65)【公表番号】特表2013-533093(P2013-533093A)
(43)【公表日】2013年8月22日
(86)【国際出願番号】US2011047041
(87)【国際公開番号】WO2012021490
(87)【国際公開日】20120216
【審査請求日】2014年7月25日
(31)【優先権主張番号】61/372,339
(32)【優先日】2010年8月10日
(33)【優先権主張国】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】504154148
【氏名又は名称】ライフセル コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
(74)【代理人】
【識別番号】110001302
【氏名又は名称】特許業務法人北青山インターナショナル
(72)【発明者】
【氏名】オーエンズ，リック，ティー．
(72)【発明者】
【氏名】エルモ，ラウラ
(72)【発明者】
【氏名】リュー，マイク
(72)【発明者】
【氏名】マオ，ヨン
【審査官】
近藤 政克
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００９−５３６５６７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｌ ２７／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）と；
ポリマーと；
水混和性溶媒と；
を含む組織足場混合物において、
前記粒子状ＡＴＭが、前記ポリマーの中に入っており、
前記混合物を水性媒体と接触させると、前記水混和性溶媒が前記混合物から拡散することができ、前記混合物が前記ポリマーと前記ＡＴＭから組織足場を形成することを可能にすることを特徴とする、組織足場混合物。
ポリマーと；
水混和性溶媒と；
を含む組織足場混合物において、
前記粒子状ＡＴＭが、前記ポリマーの中に入っており、
前記混合物を水性媒体と接触させると、前記水混和性溶媒が前記混合物から拡散することができ、前記混合物が前記ポリマーと前記ＡＴＭから組織足場を形成することを可能にすることを特徴とする、組織足場混合物。
【請求項2】
粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）と；
ポリマーと；
水混和性溶媒と；
を含む組織足場混合物において、
前記粒子状ＡＴＭが、前記ポリマーの中に入っており、
前記混合物を動物に移植すると、前記水混和性溶媒が前記混合物から拡散することができ、前記混合物が前記ポリマーと前記ＡＴＭから組織足場を形成することを可能にすることを特徴とする、組織足場混合物。
ポリマーと；
水混和性溶媒と；
を含む組織足場混合物において、
前記粒子状ＡＴＭが、前記ポリマーの中に入っており、
前記混合物を動物に移植すると、前記水混和性溶媒が前記混合物から拡散することができ、前記混合物が前記ポリマーと前記ＡＴＭから組織足場を形成することを可能にすることを特徴とする、組織足場混合物。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の組織足場混合物において、前記組織足場が安定な三次元形状を有することを特徴とする、組織足場混合物。
【請求項4】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組織足場混合物において、前記組織足場は、動物に移植された場合、前記ポリマー単独の場合より免疫反応または炎症反応が少ないことを特徴とする、組織足場混合物。
【請求項5】
請求項１に記載の組織足場混合物において、前記免疫反応または炎症反応が、存在する炎症細胞の数により測定されることを特徴とする、組織足場混合物。
【請求項6】
粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）と；
ポリマーと；
溶媒と；
を含んでおり、
前記粒子状ＡＴＭが、前記ポリマーの中に入っていることを特徴とするキット。
ポリマーと；
溶媒と；
を含んでおり、
前記粒子状ＡＴＭが、前記ポリマーの中に入っていることを特徴とするキット。
【請求項7】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記溶媒が生体適合性であることを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項8】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記溶媒がジオキサン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、またはジメチルスルホキシドの少なくとも１つ、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項9】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記ポリマーがポリカプロラクトンを含むことを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項10】
請求項９に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記ポリカプロラクトンを溶媒に溶解させる場合、それが前記溶媒中に約５〜３０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項11】
請求項９に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記ポリカプロラクトンを溶媒に溶解させる場合、それが前記溶媒中に約１０〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項12】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記ポリマーがポリ−４−ヒドロキシブチレートを含むことを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項13】
請求項１２に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記ポリ−４−ヒドロキシブチレートを溶媒に溶解させる場合、それが前記溶媒中に約５〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項14】
請求項１２に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記ポリ−４−ヒドロキシブチレートを溶媒に溶解させる場合、それが前記溶媒中に約１０〜３０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項15】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記ポリマーがヒアルロン酸のベンジルエステル誘導体を含むことを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項16】
請求項１５に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記ヒアルロン酸のベンジルエステル誘導体を溶媒に溶解させる場合、それが前記溶媒中に約５〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項17】
請求項１５に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記ヒアルロン酸のベンジルエステル誘導体を溶媒に溶解させ、それが前記溶媒中に約５〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項18】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記粒子状ＡＴＭが均一なサイズの粒子を含むことを特徴とするキットまたは組織足場混合物。
【請求項19】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記粒子状ＡＴＭが真皮ＡＴＭ、軟骨組織マトリックス、骨組織マトリックス、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項20】
請求項１９に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記真皮ＡＴＭがヒト組織マトリックスまたはブタ組織マトリックスであることを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項21】
請求項１９に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記軟骨組織マトリックスがヒト軟骨マトリックスまたはブタ軟骨マトリックスを含むことを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項22】
請求項１９に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記骨組織マトリックスがヒト骨またはブタ骨を含むことを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項23】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記粒子状ＡＴＭが２種類以上の異なる組織からのＡＴＭを含むことを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【請求項24】
請求項２３に記載のキットまたは組織足場混合物において、前記２種類以上の異なる組織が、真皮と軟骨、軟骨と骨、ヒト組織マトリックス、ブタ組織マトリックス、またはヒト組織マトリックスとブタ組織マトリックスを含むことを特徴とする、キットまたは組織足場混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２０１０年８月１０日に出願された、米国仮特許出願第６１／３７２，３３９号明細書の優先権を主張する。
【0002】
本開示は、組織欠損を治療するための組織足場を作製するための方法、混合物、およびキットを含む、組織または器官の欠損または損傷を治療するための方法、混合物、およびキットに関する。
【背景技術】
【0003】
組織を補強するまたは組織欠損を治療するための医療処置および外科処置には、現在、ヒトおよび動物由来材料ならびに合成材料が使用されている。特定の目的には、安定な形状を有する材料が必要とされる。場合によっては、このような材料の送達方法（例えば、外科的処置または注射による）が重要となることがある。さらに、治療を必要とする位置から移動しない材料の能力が必要な場合もある。
【0004】
組織または器官の欠損を治療するための現在の様々な器具および方法には、ある一定の欠点があった。従って、組織または器官の欠損を治療するための改善された器具および方法が必要とされている。
【0005】
特定の実施形態は、粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）と、溶媒に溶解したポリマーを含む溶液とを提供するステップを含む方法（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ方法）を含む。本方法は、溶液を粒子状ＡＴＭと混合して混合物を作製するステップ、および混合物を水性媒体と接触させるステップをさらに含んでもよい。溶媒が混合物から拡散し、組織足場が形成されてもよい。
【0006】
幾つかの実施形態は、粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）と、ポリマーと、水混和性溶媒とを含む、組織足場混合物を含む。混合物を水性媒体と接触させると、水混和性溶媒が混合物から拡散し、ポリマーとＡＴＭから組織足場を形成することが可能になり得る。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図3E】図３Ｅは、実施例１に記載の方法による、Ｐ４ＨＢ、ｐＡＤＭ、およびジオキサンを含む注射用組織足場から作製した４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。
【図4B】図４Ｂは、実施例１に記載の方法による、ＰＣＬ、ｐＡＤＭ、およびジオキサンを含む注射用組織足場から作製した１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。
【図4E】図４Ｅは、実施例１に記載の方法による、Ｐ４ＨＢ、ｐＡＤＭ、およびジオキサンを含む注射用組織足場から作製した１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。
【図5B】図５Ｂは、実施例２に記載の方法による、ＢＨＡ、ｐＡＤＭ、およびＮＭＰを含む注射用組織足場から作製した４週の大腿骨顆部外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本願では、単数形の使用は、特記しない限り、複数形を含む。本願では、「または」の使用は、特記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的ではない。
【0009】
本明細書で使用される節の見出しは、構成を目的とするに過ぎず、記載する内容を限定するものと解釈されるべきではない。以下に限定されるものではないが、特許、特許出願、論文、書籍および条約文書を含む、本願に引用される文献または文献の一部は全て、あらゆる目的でその内容全体が参照により本明細書に明示的に援用される。
【0010】
前述の便益および利点は、一実施形態に関する場合もあれば、幾つかの実施形態に関する場合もあることが分かるであろう。さらに、「１つ」のものに言及する場合、そのようなものの１つ以上に言及していることが分かるであろう。
【0011】
本明細書に記載の方法のステップは、適宜、任意の適切な順番で行われても、または同時に行われてもよい。
【0012】
適宜、本明細書に記載の実施例のいずれかの態様を、記載されている他の実施例のいずれかの態様と組み合わせて、同等のまたは異なる特性を有し、同じまたは異なる問題に対処するさらに他の実施例を形成してもよい。
【0013】
本明細書における好ましい実施形態の説明は単に例として記載されているに過ぎず、当業者により様々な変更がなされ得ることが分かるであろう。本明細書の詳細な説明、実施例およびデータにより、本発明の例示的実施形態の構造および使用を完全に説明する。本発明の様々な実施形態をある程度詳細に、または１つ以上の個々の実施形態を参照して本明細書に記載したが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、開示される実施形態に多くの変更を行うことができる。
【0014】
「無細胞組織マトリックス」（ＡＴＭ）という用語は、本明細書で使用する場合、一般に、細胞および／または細胞成分を実質的に含まない任意の組織マトリックスを指す。皮膚、皮膚の一部（例えば、真皮）、および他の組織（血管、心臓弁、筋膜、軟骨、骨、神経および結合組織など）を使用して、本開示の範囲に入る無細胞マトリックスを作製してもよい（例えば、細胞および／または細胞成分を除去することにより）。無細胞組織マトリックスが細胞および／または細胞成分を実質的に含まないかどうかを判定するために、多くの方法で無細胞組織マトリックスの試験または評価を行うことができる。例えば、処理された組織を光学顕微鏡検査で検査して、細胞（生細胞もしくは死細胞）および／または細胞成分が残存するかどうかを判定することができる。さらに、特定のアッセイを使用して細胞または細胞成分の有無を確認することができる。例えば、ＤＮＡまたは他の核酸のアッセイを使用して、組織マトリックス中に残存する核物質を定量化することができる。一般に、残存するＤＮＡまたは他の核酸がない場合、完全に脱細胞化されている（即ち、細胞および／または細胞成分が除去されている）ことが分かる。最後に、細胞特有の成分（例えば、表面抗原）を同定する他のアッセイを使用して、組織マトリックスが無細胞であるかどうかを判定することができる。
【0015】
本開示の組織足場は、組織再生を支援する生物学的能力を有するＡＴＭを含むことができる。幾つかの実施形態では、組織足場は細胞の侵入（ｉｎｇｒｏｗｔｈ）と分化を支援することができる。例えば、足場は、組織の侵入、整形外科、歯周部への用途、組織再構築、または組織再建に使用することができる。一実施形態では、組織足場は、線維芽細胞様細胞および血管の存在により実証されるように、再生組織反応を生じさせる。
【0016】
様々な実施形態では、本組織足場は、多くの異なる解剖学的部位の治療に使用することができ、幅広い用途に使用することができる。特定の例示的用途としては、吸収性ドレッシング材、皮膚再生（例えば、あらゆる種類の潰瘍および熱傷の治療のため）、神経再生、軟骨再生、結合組織再生または修復、骨再生、創傷／フォームライニング、一体型の包帯ドレッシング材、植皮用支持体／基材、脈管再生、美容外科、金属および／またはポリマーインプラントコーティング（例えば、インプラントの癒合および生体適合性を向上させるため）、ならびに失われた組織の置換術（例えば、外傷、乳房減量術、乳房切除術、腫瘤摘出術、耳下腺摘出術、または腫瘍切除の後など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0017】
本組織足場は、動物に移植されたとき、１種類または複数種類のポリマーを使用して足場を単独で作製した場合と比較して、惹起される免疫反応または炎症反応を低減することができる。多くの方法を使用して宿主内での組織足場の効果を試験することができる。例えば、幾つかの実施形態では、移植された足場に対する免疫反応または炎症反応を測定することにより、宿主内での組織足場の効果を試験することができる。組織学的方法を含む多くの方法で、組織足場に対する免疫反応または炎症反応を測定することができる。例えば、以下に詳述するように、組織学的評価を行うために、外植された足場を染色し顕微鏡下で観察することができる。幾つかの実施形態では、炎症細胞（例えば、白血球）の数を測定することにより、足場に対する免疫反応または炎症反応を実証することができる。以下に詳述するように、足場に対する免疫反応または炎症反応の減弱化を、炎症細胞の数の減少と関連付けることができる。例えば、白血球、マクロファージ、および好中球を識別するように設計された免疫組織学的染色方法により炎症細胞を測定することができる。また、免疫組織学的染色方法を使用して、インターロイキン−１、ＴＮＦ−α、およびＴＧＦ−βを含む、炎症性サイトカインの有無を判定してもよい。
【0018】
様々な実施形態では、本開示の組織足場を使用して、様々な障害のいずれかを治療することができる。組織欠損は、例えば、先天性奇形、外傷、感染、および腫瘍切除を含む多くの原因から生じ得る。組織足場は、筋骨格欠損の治療に、例えば、軟骨再生を支援する関節用移植片として使用することができる。組織足場はまた、任意の軟組織、例えば、身体の他の構造および器官を結合、支持または包囲する組織の欠損の治療に使用することもできる。軟組織は骨以外の任意の組織とすることができる。
【0019】
組織足場は、多くの異なる器官系の軟組織の治療に使用することができる。これらの器官系としては、筋肉系、尿生殖器系、消化器系、外皮系、循環器系、および呼吸器系が挙げられるが、これらに限定されるものではない。組織足場はまた、結合組織（胸壁および腹壁の筋膜、即ち、筋肉、骨および関節を取り囲む特殊な層を含む）の治療に、ならびに泌尿器科、婦人科および消化器科の解剖学的構造の組織脆弱部の修復および補強にも有用となり得る。幾つかの実施形態では、治療の必要がある組織または器官は、皮膚、骨、軟骨、半月板、真皮、心筋、骨膜、動脈、静脈、胃、小腸、大腸、横隔膜、腱、靭帯、神経組織、横紋筋、平滑筋、膀胱、尿道、尿管、および歯肉からなる群から選択することができる。
【0020】
図１は、組織足場の作製ステップを示す。足場は粒子状ＡＴＭを含むことができる（ステップ１００）。幾つかの実施形態では、ＡＴＭは、例えば、真皮、軟骨、骨、脱灰骨、血管、心臓弁、筋膜、または神経結合組織に由来するものであってもよい。粒子状ＡＴＭの作製を以下に詳細に説明する。幾つかの実施形態では、粒子状ＡＴＭは均質なサイズの粒子を含む。粒子状ＡＴＭは真皮ＡＴＭを含んでもよい。幾つかの実施形態では、真皮ＡＴＭはヒト組織マトリックスである。幾つかの実施形態では、真皮ＡＴＭはブタ組織マトリックスである。幾つかの実施形態では、粒子状ＡＴＭは軟骨組織マトリックスであり、これはヒト軟骨に由来するものであってもよい。幾つかの実施形態では、軟骨組織マトリックスはブタ軟骨に由来する。幾つかの実施形態では、粒子状ＡＴＭは骨組織マトリックスを含む。幾つかの実施形態では、骨組織マトリックスはヒトの骨に由来する。幾つかの実施形態では、骨組織マトリックスはブタの骨に由来する。
【0021】
様々な異なる生物学的および力学的特性が付与されるようにＡＴＭを選択することができる。例えば、マトリックスが移植される部位に通常見られる組織の再生が可能となるように細胞の侵入および再構築を可能にするようにＡＴＭを選択することができる。例えば、ＡＴＭは、軟骨上または軟骨の中に移植する場合、過剰な線維化または瘢痕形成が起こることなく軟骨の再生が可能になるように選択されてもよい。さらに、ＡＴＭは、過剰な炎症反応を抑え、元の宿主組織と類似の組織が形成されるように選択されてもよい。幾つかの実施形態では、ＡＴＭはコラーゲン、エラスチン、および脈管チャネルを含む。ＡＴＭの例について以下にさらに詳細に記載する。
【0022】
さらに、組織足場は１種類以上のポリマー材料を含むことができ、それは多くの種類のポリマーから選択することができる。本明細書で使用する場合、ポリマー材料は、合成ポリマーおよび／または天然ポリマーを含むことができる。さらに、ポリマー材料は、個々のポリマーおよび／またはポリマー混合物（コポリマー）を含むことができる。幾つかの実施形態では、ポリマー材料は、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリジオキサン（または他のポリエーテルエステル）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、および／またはポリヒドロキシアルカノエートを含むことができる。例えば、特定の実施形態では、ポリマー材料は、例えば、ポリヒドロキシブチレート（例えば、ポリ−３−ヒドロキシブチレート、ポリ−４−ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ））、ポリヒドロキシバレレート、ポリヒドロキシヘキサノエート、ポリヒドロキシオクタノエート、またはトリメチレンカーボネートなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むことができる。代わりにまたはさらに、ポリマー材料は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）および／またはヒアルロン酸誘導体（例えば、エステル、酸無水物など）、例えば、ヒアルロン酸のベンジルエステル誘導体（ＢＨＡ）などを含むことができる。特定の実施形態では、組織足場中のポリマー材料は、ＡＴＭに構造を提供することができる。構造は、インプラントの癒合性（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、生体適合性、および安定性を向上させることができ、インプラントが治療部位から移動することを防止してもよい。さらに、組織足場中にＡＴＭをポリマーと共に含むと、ポリマーだけを含むインプラントと比較して、免疫反応または炎症反応が減弱または低減することによりポリマーの許容性を向上させることができる。
【0023】
幾つかの実施形態では、好適な溶媒にポリマーを溶解して、ポリマー溶液を形成することができる（ステップ１２０）。本明細書で使用する場合、溶媒は、溶媒混合物を含むことができる。特定の実施形態では、望ましくない反応が起こらないように適切な反応性にするために、溶媒は、使用されるポリマー、および／またはそれが混合される環境もしくは送達元の（ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ）環境に基づいて選択されてもよい。例えば、幾つかの実施形態では、特定のポリマーが可溶な任意の溶媒を使用してもよい。特定の実施形態では、生体適合性且つ水混和性となるように溶媒を選択してもよい。選択される溶媒はまた、低揮発性であってもよい。幾つかの実施形態では、溶媒は、例えば、ジオキサン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、および／またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでもよい。ポリマーを溶媒に溶解することにより、粒子状ＡＴＭとの十分な混合を助け（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅ）、その組み合わせの移植を容易にする（例えば、ある部位に注入、充填することなどにより）適切な粘度の溶液を得てもよい。混合物の粘度が上昇または低下するように、ポリマー濃度を操作してもよい。
【0024】
一例として、幾つかの実施形態では、ＰＣＬをジオキサンおよび／またはＮＭＰに溶解してもよい。特定の実施形態では、ジオキサンおよび／またはＮＭＰに溶解したＰＣＬは、約５〜３０％（ｗ／ｖ）であってもよい。別の実施形態では、ジオキサンおよび／またはＮＭＰに溶解したＰＣＬは、５％、８％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、または３０％（ｗ／ｖ）；５％〜３０％（ｗ／ｖ）；または１０％〜２０％（ｗ／ｖ）、およびその間の任意の値であってもよい。
【0025】
他の実施形態では、Ｐ４ＨＢをジオキサンおよび／またはＮＭＰに溶解することができる。幾つかの実施形態では、ジオキサンおよび／またはＮＭＰに溶解したＰ４ＨＢは、約５〜４０％（ｗ／ｖ）とすることができる。別の実施形態では、ジオキサンおよび／またはＮＭＰに溶解したＰ４ＨＢは、５％、８％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％または４０％（ｗ／ｖ）；５％〜４０％（ｗ／ｖ）；または１０％〜３０％（ｗ／ｖ）、およびその間の任意の値であってもよい。
【0026】
他の実施形態では、ＢＨＡをＤＭＳＯおよび／またはＮＭＰに溶解してもよい。幾つかの実施形態では、ＤＭＳＯおよび／またはＮＭＰに溶解したＢＨＡは、約５〜５０％（ｗ／ｖ）とすることができる。別の実施形態では、ＤＭＳＯおよび／またはＮＭＰに溶解したＢＨＡは、５％、８％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、４０％、または５０％（ｗ／ｖ）；５％〜５０％（ｗ／ｖ）；５％〜４０％（ｗ／ｖ）；１０％〜４０％（ｗ／ｖ）；または１０％〜３０％（ｗ／ｖ）およびその間の任意の値とすることができる。
【0027】
これらの足場材料はそれぞれ、最終製品に異なる特性を付与することにより、ｉｎ ｖｉｖｏ代謝回転／維持、生体力学的特性、および全体的な生物学的反応の調節を可能にすることができる。
【0028】
次いで、ポリマー溶液を粒子状ＡＴＭと混合することができる（ステップ１３０）。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液の容量は、粒子状ＡＴＭと組み合わせたとき、ポリマー全体の最終濃度が２５％（ｗ／ｗ）となるように選択されてもよい。溶液と粒子状ＡＴＭとの混合方法は、組織足場を形成する目的の位置に基づいて選択されてもよい。例えば、幾つかの実施形態では、溶液は、任意の好適な容器内で粒子状ＡＴＭと混合されてもよい。他の実施形態では、溶液と粒子状ＡＴＭは、１つ以上のシリンジ内で混合されてもよい。例えば、粒子状ＡＴＭを第１のシリンジに入れてもよい。所望の容量のポリマー溶液を第２のシリンジに吸入してもよい。次いで、第１のシリンジと第２のシリンジを連結してもよく、材料をシリンジ間を通過させることにより、各シリンジ内の材料を混合してもよい。次いで、得られる最終混合物を１つのシリンジに移してもよい。次いで、混合物の注入を容易にするため、シリンジに針またはカニューレを取り付けてもよい。
【0029】
一実施形態では、組織足場混合物の成分の一部または全部が予備混合されても、または一緒に事前包装されてもよい。例えば、幾つかの実施形態では、既に所望の濃度で溶媒に溶解しているポリマーを、組織足場混合物の作製に提供してもよい。同様に、幾つかの実施形態では、ポリマーを溶媒に溶解した溶液を粒子状ＡＴＭと予備混合し、所望の量、包装し、後で使用するために貯蔵してもよい。従って、最終組織足場混合物は、組織足場を形成する前に、および／または貯蔵、出荷、または販売の前に作製されてもよい。
【0030】
次いで、粒子状ＡＴＭと、ポリマーと、溶媒との最終混合物を水性媒体と接触させ（ステップ１４０）、混合物から溶媒を拡散させて、ポリマーとＡＴＭから組織足場を形成してもよい。幾つかのｉｎ ｖｉｖｏ実施形態では、最終混合物は、組織部位内、組織部位上、または組織部位に近接して配置されてもよい。前述のように、組織足場は、様々な用途に、および多くの異なる解剖学的部位の治療に使用することができる。例えば、幾つかの実施形態では、最終混合物は、軟組織の組織欠損部に入れられてもよい。混合物をｉｎ ｓｉｔｕに配置したとき、溶媒は周囲組織または間質空間に拡散することができる。
【0031】
ｅｘ ｖｉｖｏ実施形態では、最終混合物を、移植する前に、水性媒体と接触させてもよい。例えば、幾つかの実施形態では、最終混合物を、所望の形状を有する成形型に入れてもよい。成形型は、エッペンドルフ管、金属管、注入管、または、組織足場が移植される組織もしくは器官の欠損部の形状の成形型を含んでもよい。このような実施形態では、最終混合物および／または成形型は、混合物からの溶媒の拡散を促進するために、水性媒体に曝露されてもよい。例えば、最終混合物中の溶媒を一部または全部除去するために、最終混合物および／または成形型をすすいでも、洗浄しても、および／または浴に浸漬してもよい。
【0032】
溶媒の拡散後、ＡＴＭとポリマーが均一に分布した組織足場を得てもよい。得られた組織足場は、再生組織粒子がポリマー／合成支持足場に入った構成であってもよい。幾つかの実施形態では、組織足場は、機械的応力がかかっても安定な三次元形状を有してもよい。前述のように、足場材料は、特定の生体力学的特性を有する組織足場が達成されるように選択されてもよい。従って、目的の用途に応じて、組織足場は、硬質、弾性、弾力性、および／または粘弾性であってもよい。幾つかの実施形態では、足場材料は、剛性が標的位置の組織のものに実質的に類似している組織足場を形成するように選択されてもよい。さらに、幾つかの実施形態では、組織足場はまた、標的位置から移動しにくい場合がある。
【0033】
図２は、長骨５００（例えば、大腿骨または上腕骨）の欠損５０５を治療するための、組織足場の移植を例示的に説明する。様々な実施形態では、足場１８０ａは、欠損５０５の位置に移植することができる。幾つかの実施形態では、組織足場１８０ａは、組織足場材料を提供するシリンジ５１５に連結された針またはカニューレ５１０を通して注入することにより移植することができる。
【0034】
無細胞組織マトリックス「無細胞組織マトリックス」（ＡＴＭ）という用語は、本明細書で使用する場合、一般に、細胞および／または細胞成分を実質的に含まない任意の組織マトリックスを指す。皮膚、皮膚の一部（例えば、真皮）、および他の組織（血管、心臓弁、筋膜、軟骨、骨、および神経結合組織など）を使用して、本開示の範囲に入る無細胞マトリックスを作製してもよい。無細胞組織マトリックスが細胞および／または細胞成分を実質的に含まないかどうかを判定するために、多くの方法で無細胞組織マトリックスの試験または評価を行うことができる。例えば、処理された組織を光学顕微鏡検査で検査して、細胞（生細胞もしくは死細胞）および／または細胞成分が残存するかどうかを判定することができる。さらに、特定のアッセイを使用して細胞または細胞成分の有無を確認することができる。例えば、ＤＮＡまたは他の核酸のアッセイを使用して、組織マトリックス中に残存する核物質を定量化することができる。一般に、残存するＤＮＡまたは他の核酸がない場合、完全に脱細胞化されている（即ち、細胞および／または細胞成分が除去されている）ことが分かる。最後に、細胞特有の成分（例えば、表面抗原）を同定する他のアッセイを使用して、組織マトリックスが無細胞であるかどうかを判定することができる。皮膚、皮膚の一部（例えば、真皮）、および他の組織（血管、心臓弁、筋膜、軟骨、骨、および神経結合組織など）を使用して、本開示の範囲に入る無細胞マトリックスを作製してもよい。
【0035】
一般に、ＡＴＭの作製に必要なステップには、提供者（例えば、ヒトの死体または動物供給源）から組織を採取するステップと、生物学的および構造的機能を維持する条件で細胞を除去するステップとが含まれる。例えば、所望の生物学的および構造的機能には、細胞侵入および組織再生を支援する能力、（例えば、手術部位または欠損部を）機械的に支持する能力、および／または、過剰な免疫反応、炎症、線維化および／または瘢痕化を防止する能力が含まれる。特定の実施形態では、本方法は、細胞除去と共にまたはその前に、組織を安定化させ、生化学的および構造的分解が起こらないようにするための化学処理を含む。様々な実施形態では、安定化溶液は、浸透圧性、低酸素性、自己分解性およびタンパク質分解性の分解を抑制および防止し、微生物汚染から保護し、例えば、平滑筋成分（例えば、血管）を含む組織で起こり得る機械的損傷を低減する。安定化溶液は、適切な緩衝液、１種類以上の酸化防止剤、１種類以上の膠質浸透圧剤（ｏｎｃｏｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、１種類以上の抗生物質、１種類以上のプロテアーゼ阻害剤、および／または１種類以上の平滑筋弛緩剤を含有してもよい。
【0036】
次いで、組織を脱細胞化溶液に入れ、ＡＴＭ（例えば、コラーゲンマトリックス）の生物学的および構造的完全性を損なわないように構造的マトリックスから生細胞（例えば、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞）を除去する。ＡＴＭの完全性は、多くの方法で試験することができる。例えば、示差走査熱量測定を使用して、架橋（転移温度の上昇）またはコラーゲンの分解（転移温度の低下）を示す熱的転移温度の変化を確認することができる。さらに、電子顕微鏡検査で正常なコラーゲンパターンの変化を実証することができ、酵素消化アッセイでコラーゲンの損傷を実証することができる。さらに、様々なグリコサミノグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸）の損失は、組織マトリックスの望ましくない変化を示し得る。
【0037】
脱細胞化溶液は、適切な緩衝液、塩、抗生物質、１種類以上の界面活性剤（例えば、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（商標）、デオキシコール酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、架橋を防止する１種類以上の薬剤、１種類以上のプロテアーゼ阻害剤、および／または１種類以上の酵素を含有してもよい。ＡＴＭを作製する好適な方法は、例えば、Ｈ．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｐｏｒｃｉｎｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｒｍａｌ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｔｈａｔ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ Ｓｏｆｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｇａｌａｃｔｏｓｅ−α−（１，３）−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ Ａ，Ｖｏｌ．１５，１−１３（２００９）（以下「Ｘｕ」）に記載されている。特に、Ｘｕの２頁の小見出し「Ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ」の下の段落は、ブタ皮膚からＡＴＭを作製する好適な方法を記載している。
【0038】
脱細胞化プロセスの後、組織サンプルを生理食塩水で十分に洗浄する。幾つかの例示的実施形態では、例えば、異種材料を使用する場合、脱細胞化された組織を終夜、室温でデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）溶液で処理する。幾つかの実施形態では、組織サンプルを、ＤＮアーゼ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２および２０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で作製されたＤＮアーゼ溶液で処理する。任意選択により、抗生物質溶液（例えば、ゲンタマイシン）をＤＮアーゼ溶液に添加してもよい。緩衝液が好適なＤＮアーゼ活性を付与する限り、任意の好適な緩衝液を使用することができる。
【0039】
ＡＴＭは、組織足場のレシピエントと同種の１つ以上の個体から作製されてもよいが、必ずしもこのように作製されるわけではない。従って、例えば、組織足場中のＡＴＭはブタ組織から作製されてもよい。ＡＴＭのレシピエント、およびＡＴＭを作製するための組織または器官のドナーの役割を果たすことができる種としては、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、サル、ヒヒ、またはチンパンジー）、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ラット、またはマウスなどの哺乳類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0040】
ＡＴＭからＧａｌα１−３Ｇａｌβ１−(３)４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒエピトープ（以下「α−ｇａｌエピトープ」）を除去することで、ＡＴＭに対する免疫反応を低下させてもよい。α−ｇａｌエピトープは、霊長類以外の哺乳類や新世界ザル（南米のサル）で、細胞外成分である糖タンパク質などの高分子に発現する。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７７５５（１９８８）。しかし、このエピトープは、旧世界霊長類（アジアやアフリカのサル、および類人猿）やヒトには存在しない。抗ｇａｌ抗体は、ヒトや霊長類では、腸内細菌のα−ｇａｌエピトープ糖鎖構造に対する免疫反応の結果として産生される。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１７３０（１９８８）；Ｒ．Ｍ．Ｈａｍａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１２２３（１９９２）。
【0041】
霊長類以外の哺乳類（例えば、ブタ）は、α−ｇａｌエピトープを産生するため、ＡＴＭをこれらの哺乳類から霊長類に異種移植すると、ＡＴＭ上のこれらのエピトープに霊長類の抗Ｇａｌ抗体が結合するため、免疫活性化が起こることが多い。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １４：４８０（１９９３）；Ｍ．Ｓａｎｄｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１３９１（１９９３）；Ｈ．Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２４：５５９（１９９２）；Ｂ．Ｈ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５００（１９９５）。さらに、異種移植の結果、免疫系の著しい活性化が起こり、多量の高親和性抗ｇａｌ抗体が産生される。従って、幾つかの実施形態では、α−ｇａｌエピトープを産生する動物を組織供給源として使用する場合、細胞から、およびＡＴＭの細胞外成分からα−ｇａｌエピトープを実質的に除去することにより、ならびに細胞α−ｇａｌエピトープの再発現を防止することにより、α−ｇａｌエピトープへの抗ｇａｌ抗体の結合に伴うＡＴＭに対する免疫反応を低下させることができる。
【0042】
α−ｇａｌエピトープを除去するため、組織を生理食塩水で十分に洗浄してＤＮアーゼ溶液を除去した後、組織サンプル中に特定の免疫原性抗原が存在する場合、それを除去するために、組織サンプルに１つ以上の酵素処理を施してもよい。幾つかの実施形態では、組織中にα−ｇａｌエピトープが存在する場合、それを除去するために、組織サンプルをα−ガラクトシダーゼ酵素で処理してもよい。幾つかの実施形態では、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で作製された３００Ｕ／Ｌの濃度のα−ガラクトシダーゼで組織サンプルを処理する。他の実施形態では、採取した組織からα−ｇａｌエピトープを十分除去するために、α−ガラクトシダーゼの濃度を４００Ｕ／Ｌまで増加させる。抗原の十分な除去が達成される限り、任意の好適な酵素濃度および緩衝液を使用することができる。
【0043】
あるいは、組織を酵素で処理するのではなく、１つ以上の抗原性エピトープが欠損するように遺伝子操作された動物を組織供給源として選択してもよい。例えば、末端α−ガラクトース部分が欠損するように遺伝子操作された動物（例えば、ブタ）を組織供給源として選択することができる。適切な動物の説明については、同時係属中の米国特許出願第１０／８９６，５９４号明細書および米国特許第６，１６６，２８８号明細書を参照されたい（これらの開示は、その内容全体が参照により本明細書に援用される）。さらに、α−１，３−ガラクトース部分が減量または欠損しているまたはしていない、無細胞マトリックスを作製するための特定の例示的組織処理方法が、Ｘｕに記載されている。
【0044】
ＡＴＭを形成した後、任意選択により組織適合性生細胞をＡＭＴ中に播種して移植片を作製してもよく、それはさらに宿主により再構築され得る。幾つかの実施形態では、移植前に標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞共培養法により、または移植後にｉｎ ｖｉｖｏ再増殖により組織適合性生細胞をマトリックスに添加してもよい。ｉｎ ｖｉｖｏ再増殖は、ＡＴＭの中に移動するレシピエント自身の細胞で行われても、またはレシピエントから得られた細胞もしくは別のドナーから得られた組織適合性細胞をｉｎ ｓｉｔｕでＡＴＭの中に注入もしくは注射することにより行われてもよい。胚性幹細胞、成人幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）、および／または神経細胞を含む様々な種類の細胞を使用することができる。様々な実施形態では、これらの細胞を移植直前または移植後にＡＴＭの内部に直接付着させることができる。特定の実施形態では、移植されるＡＴＭに細胞を入れ、移植前に培養することができる。幾つかの実施形態では、溶媒が足場から拡散した後、所望の解剖学的部位の組織足場に生細胞を添加してもよい。
【0045】
特定の実施形態では、ＡＴＭは、それぞれヒトおよびブタ無細胞真皮マトリックスである、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）またはＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を含むことができる。このような材料の例は、米国特許第６，９３３，３２６号明細書および米国特許第７，３５８，２８４号明細書に記載されている。
【0046】
粒子状無細胞組織マトリックス以下の手順を使用し、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）、ＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）または他の好適な無細胞組織マトリックスを使用して、粒子状無細胞組織マトリックスを作製することができる。包装から取り出した後、途切れのない「連続」回転刃（ｃｕｔｔｉｎｇ ｗｈｅｅｌ）を備えたＺｉｍｍｅｒ ｍｅｓｈｅｒを使用して、ＡＴＭを細片に切断することができる。得られたＡＴＭの細長片を長さ約１ｃｍ〜約２ｃｍの長さに切断してもよい。
【0047】
ＯＭＮＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ，Ｖａ）から入手可能なＬａｂＴｅｃｋ Ｍａｃｒｏ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒなどの、ホモジナイザーと滅菌したホモジナイザープローブを組み立てて、ホモジナイザータワーに注がれる滅菌液体窒素を使用して極低温に冷却してもよい。ホモジナイザーが極低温に達した後、前述のように予め細片に作製したＡＴＭを、滅菌液体窒素が入っているホモジナイジングタワーに加えることができる。次いで、ホモジナイザーを作動させてＡＴＭの細片を凍結破砕してもよい。凍結破砕ステップの回数と持続時間は、使用するホモジナーザー、ホモジナイジングチャンバのサイズ、ホモジナーザーの運転速度および回数に依存し、当業者は所望の結果が達成されるようにパラメータを単純に変化させることによりそれらを決定することができる。
【0048】
凍結破砕された粒子状ＡＴＭ材料は、ホモジナイザーの生成物を液体窒素と共に、同様に液体窒素温度に冷却された一連の金属篩で篩分けすることにより、粒径選別されてもよい。前述のタイプのホモジナイジングタワー内で篩の組み合わせを使用してもよく、まず過大粒子を排除した後、過小粒子を排除するように粒子を篩分けし、選別する。
【0049】
単離後、滅菌液体窒素が蒸発した後、粒子状ＡＴＭを取り出し、バイアルに入れて凍結乾燥させてもよい。これにより、上記手順中に吸収された可能性のある残留水分を確実に除去することができる。
【0050】
最終生成物は、粒径約１ミクロン〜約９００ミクロン、または粒径約３０ミクロン〜約７５０ミクロンの粉末とすることができる。粒子は、約１５０〜３００ミクロンを平均値として分布する。材料は、通常生理食塩水または他の類似の好適な再水和剤に懸濁することにより容易に再水和される。再水和されたＡＴＭは、通常生理食塩水または薬学的に適合性のある他の任意の好適な担体に再懸濁されてもよい。
【0051】
特定の実施形態では、粒子状ＡＴＭは、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）の注射用の形態であるＣＹＭＥＴＲＡ（登録商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を含むことができる。このような材料の例は、米国特許第７，３５８，２８４号明細書および米国特許第６，９３３，３２６号明細書に記載されている。
【0052】
以下の実施例は、様々な実施形態をさらによく説明するために記載するものであり、決して本開示の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【0053】
実施例１ブタ真皮組織由来粒子状ＡＴＭ（ｐＡＤＭ）を有する再生組織足場の移植の効果を、後述の手順に従い、予備形成されたポリマー単独の移植と比較した。
【0054】
粒子状ＡＴＭから再生組織足場を作製した。ＡＴＭはブタ真皮組織から作製し、凍結乾燥した。乾燥ＡＴＭを約１ｃｍ２片に切断し、凍結粉砕機用バイアルに入れた。次いで、液体窒素で予め冷却したＳＰＥＸ６８００フリーザーミルにバイアルを入れ、凍結破砕プロトコルを実施した。次いで、粒子状ＡＴＭをバイアルから取り出し、乾燥貯蔵条件で維持した。
【0055】
ｐＡＤＭと組み合わせたＰＣＬ、およびｐＡＤＭと組み合わせたＰ４ＨＢをそれぞれ、以下の手順に従い、ジオキサンとＮＭＰのそれぞれに可溶化させた。選択されたポリマーを選択された溶媒に１０％（ｗ／ｖ）の濃度で可溶化させた。次いで、この溶液０．５ｍｌを１ｍｌシリンジに吸入した。ｐＡＤＭ１５０ｍｇを３ｍｌシリンジに添加した。コネクタを１ｍｌシリンジに装着し、注射外筒から空気を全て抜いた。３ｍｌシリンジのプランジャを２ｍｌの目盛りまで引き戻し、シリンジを軽くたたいてｐＡＤＭ粉末を緩めた。次いで、３ｍｌシリンジを１ｍｌシリンジに接続した。１ｍｌシリンジからの溶液を３ｍｌシリンジにゆっくり注入し、ｐＡＤＭを濡らした。ｐＡＤＭが完全に濡れているように見えるまで、３ｍｌシリンジを繰り返し軽くたたいた。材料を１ｍｌシリンジと３ｍｌシリンジとの間で約１０回移してポリマー溶液とｐＡＤＭを均一に混合し、終了時に材料が３ｍｌシリンジ内にあるようにした。１ｍｌシリンジを切り離し、３ｍｌシリンジのプランジャを後退させた。３ｍｌシリンジ軽くたたき、内容物がプランジャに当接するように充填した。プランジャをゆっくり押し下げて、３ｍｌシリンジから空気を全て排出した。次いで、１ｍｌシリンジ再接続し、ポリマー−ｐＡＤＭ混合物を約２分間、２つのシリンジ間を繰り返し往復させた。ポリマー−ｐＡＤＭ混合物を１ｍｌシリンジに移し、送達するために針／カニューレを取り付けた。
【0056】
前述の様々なポリマー−ｐＡＤＭ混合物、ＰＣＬだけを含む構成物、およびＰ４ＨＢだけを含む構成物をそれぞれ、免疫適格ラット（シチロウネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）；ルイスラット（Ｌｅｗｉｓ Ｒａｔ））の背側面の小さい切開を通して皮下位置に移植した。移植の４週後（図３Ａ〜Ｆ）および１２週後（図４Ａ〜Ｆ）に、外植片を回収してＰＢＳで洗浄し、１０％ホルマリンで固定した。固定した組織をパラフィンに包埋し、組織マトリックスサンプルの切片を標準的な手順を使用してヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Ｄ．Ｃ．Ｓｈｅｅｈａｎ ａｎｄ Ｂ．Ｂ．Ｈｒａｐｃｈａｋ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｎ．，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ，Ｂａｔｔｅｌｌｅ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）。
【0057】
次いで、サンプルを顕微鏡で４００倍の倍率（図３Ａ〜Ｆおよび図４Ａ〜Ｆ）で観察した。図３Ａ〜Ｃは、それぞれ、４週間後のＰＣＬ単独、ｐＡＤＭとジオキサン、およびｐＡＤＭとＮＭＰの結果を示す。図３Ｄ〜Ｆは、それぞれ、４週間後のＰ４ＨＢ単独、ｐＡＤＭとジオキサン、およびｐＡＤＭとＮＭＰの結果を示す。同様に、図４Ａ〜Ｃは、それぞれ、１２週間後のＰＣＬ単独、ｐＡＤＭとジオキサン、およびｐＡＤＭとＮＭＰの結果を示す。また、図４Ｄ〜Ｆは、それぞれ、１２週間後のＰ４ＨＢ単独、ｐＡＤＭとジオキサン、およびＡＤＭとＮＭＰの結果を示す。外植体の組織学的分析から、ジオキサンまたはＮＭＰに可溶化させた場合、ＰＣＬとＰ４ＨＢはｐＡＤＭが存在すると、ＰＣＬおよびＰ４ＨＢ単独の外植体と比較して炎症反応が減弱することが分かった。
【0058】
実施例２ウサギの大腿骨顆部への再生組織足場の移植を評価した。実施例１に記載の手順に従って、ＢＨＡ、ｐＡＤＭ、およびＮＭＰを含むインプラントを作製した。ＢＨＡを、ＮＭＰ溶媒中のｐＡＤＭと混合し、ウサギの大腿骨顆部に形成された約３．５×３ｍｍの骨軟骨欠損部に注入した。４週間後にサンプルを取り出し、ヘマトキシリン・エオシンを用いた通常の組織学的染色を使用して、細胞の反応を評価した。サンプルを顕微鏡で２０倍、１００倍、および４００倍の倍率（それぞれ、図５ａ〜ｃ）で観察した。また、組織足場インプラント１８０ｂを示す大腿骨顆部の写真を１２週目に撮影した（図６）。結果から、欠損部位のヒアリン様軟骨の付着により実証されるようにインプラントの持続性と再生組織反応が認められた。
【0059】
本明細書に開示される本発明の詳細な説明および実施を考慮することにより、本発明の他の実施形態が当業者には明らかになるであろう。詳細な説明および実施例は例示に過ぎないものと見なされるべきであり、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲により示されるものとする。