特許 5963699 Ｂ型肝炎ウイルスを検出するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5963699

(24)【登録日】2016年7月8日

(45)【発行日】2016年8月3日

(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎ウイルスを検出するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20160721BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160721BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20160721BHJP

   G01N 33/576 20060101ALI20160721BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   C12N15/00 AZNA

   G01N33/50 P

   G01N33/576 B

【請求項の数】21

【全頁数】63

(21)【出願番号】特願2013-51438(P2013-51438)

(22)【出願日】2013年3月14日

(62)【分割の表示】特願2010-214048(P2010-214048)の分割

【原出願日】2003年6月13日

(65)【公開番号】特開2013-143952(P2013-143952A)

(43)【公開日】2013年7月25日

【審査請求日】2013年3月14日

(31)【優先権主張番号】60/389,393

(32)【優先日】2002年6月14日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】500169900

【氏名又は名称】ジェン−プローブ・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】リネン，ジェフリー・エム

(72)【発明者】

【氏名】コルク，ダニエル・ピー

(72)【発明者】

【氏名】ドクター，ジャネール・エム

(72)【発明者】

【氏名】ゲットマン，ダモン・ケイ

(72)【発明者】

【氏名】吉村 忠司

(72)【発明者】

【氏名】ホ−シン−ロイ，マーサ・ケイ

(72)【発明者】

【氏名】ポールナー，レインホールド・ビー

(72)【発明者】

【氏名】ストリングフェロー，レズリー・エイ

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０００−３５０５９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第１９９８／０５０５８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表平０８−５１０１２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００１／００７６６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００１／０７７３１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表平１１−５０６６１３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＢＶの存在について献血、血漿または血液製剤をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
ａ．試験試料を、
（ｉ）標的にハイブリダイズする配列と、ＲＮＡポリメラーゼのための５’プロモーター配列とを含む増幅オリゴマーであって、該標的にハイブリダイズする配列は、配列番号２５または配列番号２８からなる、増幅オリゴマー；および
（ｉｉ）配列番号１５からなる標的にハイブリダイズする配列、を含む増幅オリゴマー
と接触させる工程；
ｂ．該試験試料中に存在する任意のＨＢＶ核酸を等温ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応において増幅し、ＨＢＶ単位複製配列を生成する工程；ならびに
ｃ．該ＨＢＶ単位複製配列を検出する工程
を包含し、ここで、該試験試料中のＨＢＶの存在の検出が、該血液製剤または該献血がＨＢＶ核酸を含むことを示し、そして、該方法は、少なくとも２００コピー／反応混合物１ｍｌ程度の低い濃度においてＨＢＶ核酸を検出することができる、方法。

【請求項2】

生物学的試料中の１以上の他の成分からＨＢＶ核酸を分離するための分離工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記分離工程が、ＨＢＶ配列に相補的な第一の配列を含み、かつ、固体支持体への固定のための第二の配列を含む標的捕捉オリゴマーを用いて行われる、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ａ（ｉ）の増幅オリゴマーがデオキシリボ核酸残基からなるか、または、前記ａ（ｉｉ）の増幅オリゴマーがデオキシリボ核酸からなるか、または、これらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記等温ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅がリアルタイム増幅である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

工程ｂおよびｃが同時に行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記ａ（ｉ）の増幅オリゴマーが、配列番号４２または配列番号４５を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

工程ｃが検出プローブオリゴマーを用いて行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記検出プローブオリゴマーが、化学発光化合物、蛍光化合物、消光剤化合物またはこれらの組み合わせで標識される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記試験試料が、２人以上の血液ドナーによって提供された血液のプールに由来するか、または、２人以上のドナーによって提供された血漿のプールに由来する、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記等温ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応が、ＨＢＶ核酸に加えて、ＨＩＶ−１核酸、ＨＣＶ核酸、または、ＨＩＶ−１核酸とＨＣＶ核酸を増幅するマルチプレックス核酸増幅反応である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記検出工程が、ＨＢＶ遺伝子型Ｇの単位複製配列の検出を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記試験試料がさらに、ＨＩＶ−１核酸、ＨＣＶ核酸またはその両方の存在について試験される、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

ＨＢＶ核酸を増幅および検出するためのオリゴヌクレオチドの組成物であって、該組成物は、２００コピー／反応混合物１ｍｌ程度の低い濃度で試験試料中に存在するＨＢＶ核酸からＨＢＶ単位複製配列を生成するように構成された、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含み、ここで：
（ａ）第一の増幅オリゴマーは、標的にハイブリダイズする配列と、ＲＮＡポリメラーゼのための５’プロモーター配列とを含み、該標的にハイブリダイズする配列は、配列番号２５または配列番号２８からなり；そして
（ｂ）第二の増幅オリゴマーは、配列番号１５からなる標的にハイブリダイズする配列を含む、
組成物。

【請求項15】

（ａ）の前記増幅オリゴマーが、配列番号４２または配列番号４５を含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

ＨＢＶ単位複製配列に相補的な、検出可能に標識されたプローブをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項17】

前記検出可能に標識されたプローブが蛍光標識を含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記検出可能に標識されたプローブが分子ビーコンである、請求項１６に記載の組成物。

【請求項19】

ＨＢＶ核酸の検出のためのキットの成分として提供される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項20】

ＨＢＶの存在について献血試料または血漿試料をスクリーニングするためのキットの成分として提供される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項21】

ＨＩＶ−１核酸、ＨＣＶ核酸またはその両方の増幅および／または検出のための成分をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、米国仮出願第６０／３８９，３９３号、２００２年６月１４日出願の優先権を請求する。この先行出願の全開示は、本明細書に援用される。

【0002】

発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｉ型ヒト免疫不全ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルスのいずれかまたはすべての核酸を検出するための診断アッセイに関する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による感染は世界中で起こり、そして急性および慢性両方のウイルス肝炎の重要な原因である。ＨＢＶは、４２ｎｍのウイルス粒子サイズを有する部分的二本鎖環状ＤＮＡウイルスである。この粒子には、外層リポタンパク質コートおよびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が含まれる。ＨＢｓＡｇは、ウイルス粒子結合型として、または２２ｎｍの球状粒子および管状粒子に凝集する未結合（ｆｒｅｅ）非感染性タンパク質として、血液中を循環する。ＨＢＶの伝染は、主に、血液および／または性的接触を通じて仲介される。このウイルスのインキュベーション期間は、１８０日と同程度に長い範囲である（Ｇｉｔｌｉｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：１５００（１９９７））。

【0004】

ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶ感染２〜１２週後に検出可能であり、ＨＢＶ感染の最初の血清学的マーカーである。このマーカーの存在は、しばしば、肝臓生化学の症状または異常より６〜８週間先行する。ウイルス粒子内に含有されるＢ型肝炎コア抗原に特異的な抗体は、通常、ＨＢｓＡｇの検出２週間後に現れ、そして急性肝炎開始６ヶ月後まで検出可能なままである（Ｇｉｔｌｉｎ、上記）。

【0005】

輸血からの肝炎ウイルス伝染のリスクは、輸血後肝炎（ＰＴＨ）が１９４０年に最初に認識されて以来、劇的に減少した。例えば、１９７０年、ＮＩＨの科学者らは、心臓切開手術を受け、そして商業的血液ドナーまたは志願血液ドナーから血液を得た患者において、黄疸性肝炎および無黄疸性肝炎の発生率を決定する、前向き研究の結果を報告した。黄疸性肝炎および無黄疸性肝炎は、商業的血液レシピエントの５１％で発展したが、志願ドナーからの血液を得た患者ではまったく発展しなかった。

【0006】

１９７０年、ＮＩＨ会議で、「オーストラリア」抗原（現在、Ｂ型肝炎表面抗原として知られる）が感染性病原体、おそらく肝炎ウイルスの一部であることもまた、明らかになった。わずか２、３年後、商業的血液およびＨＢｓＡｇ陽性ドナーを同時に排除すると、ＰＴＨの発生率が、前の割合の約７％に減少した（Ｔｏｂｌｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：１４８７（１９９７））。これらの方策は、献血供給の安全性を劇的に改善した。

【0007】

さらに近年、核酸試験が始められてアッセイ感度が増加し、それによって、献血供給のより高いレベルの安全性が確実になってきている。ＨＢＶを検出するためのアッセイおよび試薬が、例えば米国特許第５，７８０，２１９号および第４，５６２，１５９号；並びに公表国際特許出願第ＷＯ９４／０８０３２号および第ＷＯ９５／０２６９０号に先に開示されてきている。

【発明の概要】

【0008】

本発明の概要
本発明の第一の側面は、捕捉オリゴヌクレオチド組成物であって、１００ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号６８の２０の隣接ヌクレオチドまたは配列番号６９の２５の隣接ヌクレオチドいずれかであるＨＢＶ相補配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、前記組成物に関する。さらに、該ポリヌクレオチドは固体支持体に固定されている。本発明の１つの態様において、固体支持体は常磁性粒子である。別の態様において、該ポリヌクレオチドは、第一のホモポリマー配列をさらに含み、該固体支持体は第二のホモポリマー配列に共有結合した常磁性粒子であり、そして該ポリヌクレオチドは、第一のホモポリマー配列および第二のホモポリマー配列間の相補的塩基対形成によって、該固体支持体に固定されている。さらに別の態様において、該ポリヌクレオチドの該ＨＢＶ相補配列は、配列番号７０〜７６のいずれかである。より好ましくは、該ポリヌクレオチドの該ＨＢＶ相補配列は配列番号７３である。さらに別の態様において、該ポリヌクレオチドの該ＨＢＶ相補配列は、配列番号７７〜８７のいずれかである。より好ましくは、該ポリヌクレオチドの該ＨＢＶ相補配列は、配列番号８０または８７である。

【0009】

本発明の第二の側面は、ＨＢＶ標的核酸を検出するためのキットに関する。この例では、発明されたキットは、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドであって、長さ１００ヌクレオチドまでであり、そして配列番号６８の少なくとも２０の隣接ヌクレオチドのＨＢＶ相補配列または配列番号６９の少なくとも２５の隣接ヌクレオチドの配列を含む、前記捕捉オリゴヌクレオチドを含む。この捕捉オリゴヌクレオチドは固体支持体に固定されている。該キットはさらに、下流ＨＢＶ相補配列、および場合によって、ＨＢＶ核酸に相補的でない第一鎖プライマー上流配列を含む、少なくとも１つの第一鎖プライマーを含む。第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、配列番号２の中に含有される２０〜５０の隣接塩基からなり、ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物並びにヌクレオチド類似体（ａｎａｌｏｇ）の存在が可能である。さらに、該キットは、下流ＨＢＶ相補配列、および場合によって、ＨＢＶ核酸に相補的でない第二鎖プライマー上流配列を含む、少なくとも１つの第二鎖プライマーを含む。該第二鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、配列番号４の配列の中に含有される２０〜５４の隣接塩基からなり、ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物並びにヌクレオチド類似体の存在が可能である。本発明の１つの態様において、少なくとも１つの第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、配列番号２２〜２８のいずれであることも可能である。より具体的には、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号７３、配列番号８０および配列番号８７のいずれかである。より一般的には、そして該キットに含有されるプライマーに関して、ＨＢＶ核酸に相補的でない、該第一鎖プライマー上流配列は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列であることも可能である。別の態様において、少なくとも１つの第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は配列番号２２〜２８いずれであることも可能である。さらに別の態様において、少なくとも１つの第二鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、配列番号５〜１５のいずれかである。少なくとも１つの第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列が配列番号２２〜２８のいずれかである場合、少なくとも１つの第二鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、好ましくは配列番号５〜１５である。別の態様において、少なくとも１つの第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列が配列番号２２〜２８のいずれかである場合、少なくとも１つの第二鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、好ましくは配列番号５〜１５のいずれかである。異なる態様にしたがって、発明されたキットには、発明された第一鎖プライマーおよび第二鎖プライマーを用いた増幅反応で生じる単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出可能標識プローブがさらに含まれる。好ましいプローブは、２３ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号９５またはその相補体の配列に含有される少なくとも１７の隣接ヌクレオチドの配列を有し、ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物並びにヌクレオチド類似体の存在が可能である。より好ましくは、検出可能標識プローブは、配列番号５０〜６６のいずれかである。別の態様において、該第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列が配列番号２２〜２８のいずれかであり、そして該第二鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列が配列番号５〜１５のいずれかである場合、配列番号５０〜６６のいずれかである配列を有する、少なくとも１つの検出可能標識プローブがさらに含まれる。発明されたキットが、発明された第一鎖プライマーおよび第二鎖プライマーを用いた増幅反応で生じる単位複製配列にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出可能標識プローブを含む場合、該プローブは、ヌクレオチドの標的相補ループ配列を含む分子ビーコンであることも可能である。ヌクレオチドのこの標的相補ループ配列は、好ましくは、配列番号１２６の配列の中に含有される１２〜２０の隣接ヌクレオチドの配列である。より好ましくは、ヌクレオチドの該標的相補ループ配列は、配列番号１２７〜１３３のいずれかである。一般的に言って、発明されたキットの少なくとも１つの第二鎖プライマーは、２つの第二鎖プライマーを含むことも可能である。この場合、少なくとも１つの第一鎖プライマーは、好ましくは、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２６および配列番号２７のいずれかである。一般的に言って、発明されたキットの少なくとも１つの第一鎖プライマーは、２つの第一鎖プライマーを含むことも可能であり、そして少なくとも１つの第二鎖プライマーは、２つの第二鎖プライマーを含むことも可能である。このキットの非常に好ましい態様において、ＲＮＡを含んでなるＨＢＶ偽標的がさらに含まれる。

【0010】

本発明の第三の側面はまた、生物学的試料中に存在しうるＨＢＶ標的核酸を増幅するためのキットにも関する。このキットは、下流ＨＢＶ相補配列、および場合によって、ＨＢＶ核酸に相補的でない第一鎖プライマー上流配列を含む、第一鎖プライマーを含む。該第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、配列番号２の中に含有される２０〜５０の隣接塩基からなり、ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物並びにヌクレオチド類似体の存在が可能である。該キットはまた、下流ＨＢＶ相補配列、および場合によって、ＨＢＶ核酸に相補的でない第二鎖プライマー上流配列を含む、第二鎖プライマーも含有する。第二鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、配列番号４の配列の中に含有される２０〜５４の隣接塩基からなり、ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物並びにヌクレオチド類似体の存在が可能である。本発明の特定の態様において、第一鎖プライマー上流配列は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列である。特定の他の態様において、該第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、配列番号２の中に含有される２０〜２４の隣接塩基からなる。より好ましい態様において、該第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、配列番号２２〜２８のいずれかであり、あるいはさらにより好ましくは、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２６または配列番号２７のいずれかである。本発明の特定の特別の態様において、該第二鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、配列番号５〜１５のいずれかであり、あるいはさらにより好ましくは、配列番号１１または配列番号１５のいずれかである。別の態様にしたがって、該第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列が、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２６または配列番号２７のいずれかであるならば、該第二鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、好ましくは、配列番号５〜１５のいずれかである。この場合、該第二鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、好ましくは、配列番号１１および配列番号１５のいずれかである。本発明の非常に好ましい態様において、該キットは、該第一鎖プライマーおよび該第二鎖プライマーを用いて行った増幅反応で生じるＨＢＶ単位複製配列にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出可能標識プローブをさらに含む。さらにより非常に好ましい態様において、該検出可能標識プローブは、配列番号５０またはその相補体、配列番号５７またはその相補体、あるいは配列番号５５またはその相補体の配列を含む。別の態様において、該検出可能標識プローブは、ヌクレオチドの標的相補ループ配列を含む分子ビーコンである。ヌクレオチドのこの標的相補ループ配列は、典型的には、配列番号１２６またはその相補体の配列に含有される１２〜２０の隣接ヌクレオチドの配列からなり、ヌクレオチド類似体並びにＲＮＡに均等な塩基およびＤＮＡに均等な塩基の存在が可能である。異なる態様において、該キットは、さらなる第一鎖プライマーを含む。好ましい態様において、該キットがさらなる第一鎖プライマーを含む場合、該第二鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、配列番号１１または配列番号１５の配列を有する。さらなる異なる態様において、該キットは、さらなる第二鎖プライマーをさらに含む。例えば、該キットがさらなる第二鎖プライマーを含む場合、該第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列は、好ましくは配列番号２２、配列番号２３、配列番号２６または配列番号２７のいずれかである。さらなる異なる態様において、該キットは、さらなる第一鎖プライマーおよびさらなる第二鎖プライマー両方をさらに含む。この態様は、該第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列が配列番号２２を含み、さらなる第一鎖プライマーが配列番号２３を含み、該第二鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列が配列番号１５を含み、そしてさらなる第二鎖プライマーが配列番号１１を含むキットに例示される。このキットの非常に好ましい態様において、ＲＮＡで作成されているＨＢＶ偽標的がさらに含まれる。別の態様において、該キットがさらなる第一鎖プライマーおよびさらなる第二鎖プライマー両方をさらに含む場合、該第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列が配列番号２３を含むことも可能であり、さらなる第一鎖プライマーが配列番号２６を含むことも可能であり、該第二鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列が配列番号１５を含むことも可能であり、そしてさらなる第二鎖プライマーが配列番号１１を含むことも可能である。別の態様において、該キットがさらなる第一鎖プライマーおよびさらなる第二鎖プライマー両方をさらに含む場合、該第一鎖プライマーの該下流ＨＢＶ相補配列が配列番号２４を含むことも可能であり、さらなる第一鎖プライマーが配列番号１７を含むことも可能であり、該第二鎖プライマーが配列番号１５を含むことも可能であり、そしてさらなる第二鎖プライマーが配列番号５を含むことも可能である。別の態様において、該キットがさらなる第一鎖プライマーおよびさらなる第二鎖プライマー両方をさらに含む場合、該第一鎖プライマーが配列番号２４を含むことも可能であり、さらなる第一鎖プライマーが配列番号２０を含むことも可能であり、該第二鎖プライマーが配列番号１５を含むことも可能であり、そしてさらなる第二鎖プライマーが配列番号５を含むことも可能である。一般的に言って、本発明にしたがったキットは、ＨＩＶ−１標的核酸を増幅するためのプライマー、およびＨＣＶ標的核酸を増幅するためのプライマーのいずれかまたは両方をさらに含むことも可能である。
本発明はまた、以下の項目を提供する：
（項目１）
ＨＢＶ核酸を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）ＨＢＶ核酸を含むと疑われる試料を、（ｉ）長さ１００ヌクレオチドまでのポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが配列番号６８の２０の隣接ヌクレオチドおよび配列番号６９の２５の隣接ヌクレオチドからなる群より選択されるＨＢＶ相補配列を含んでなるポリヌクレオチド、および（ｉｉ）固体支持体を含んでなる捕捉オリゴヌクレオチド組成物と接触させる工程と；
（ｂ）ＨＢＶ相補配列を含む前記ポリヌクレオチド、前記ＨＢＶ核酸、および前記固体支持体の間に捕捉複合体を形成するための条件を提供する工程と；
（ｃ）前記捕捉複合体を、前記試料の１以上の成分から除去する工程と；
（ｄ）前記ＨＢＶ核酸を、少なくとも２種類の増幅オリゴマーを含むプライマーの組み合わせと接触させる工程と；
（ｅ）前記ＨＢＶ核酸の増幅のための条件を提供する工程と；および
（ｆ）検出反応を提供する工程であって、ここで陽性検出結果が前記試料中のＨＢＶ核酸の存在を表示する、工程。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、ここで前記固体支持体が常磁性粒子である、方法。
（項目３）
項目１に記載の方法であって、ここで前記ポリヌクレオチドがさらに第一のホモポリマー配列を含み、ここで前記固体支持体は第二のホモポリマー配列に共有結合した常磁性粒子であり、そしてここで前記ポリヌクレオチドは、前記第一のホモポリマー配列および前記第二のホモポリマー配列間の相補的塩基対形成によって、前記捕捉複合体中の前記固体支持体に固定されている、方法。
（項目４）
項目１に記載の方法であって、ここで前記ポリヌクレオチドの前記ＨＢＶ相補配列が、配列番号７０〜配列番号８７からなる群より選択される、方法。
（項目５）
項目１に記載の方法であって、ここで前記ポリヌクレオチドの前記ＨＢＶ相補配列が、配列番号７３、配列番号８０、および配列番号８７からなる群より選択される、方法。
（項目６）
項目１に記載の方法であって、ここで前記プライマーの組み合わせが表６からのプライマーの組み合わせであり、ここで前記プロモーター・プライマーのＨＢＶ相補配列が、その５’端でＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と連結している、方法。
（項目７）
項目６に記載の方法であって、ここで前記プライマーの組み合わせが少なくとも７０％の陽性検出を示す表６からのプライマーの組み合わせである、方法。
（項目８）
項目１に記載の方法であって、ここで前記検出反応が表５から選択される検出プローブを用いる、方法。
（項目９）
項目１に記載の方法であって、ここで工程（ｄ）から（ｆ）が表６に示されるプライマーおよび検出プローブの組み合わせを使用し、ここで前記プロモーター・プライマーの前記ＨＢＶ相補配列がその５’端でＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と連結している、方法。
（項目１０）
項目９に記載の方法であって、ここで表６からの前記プライマーおよび検出プローブの組み合わせが、少なくとも７０％の陽性検出を示すものである、方法。
（項目１１）
項目１に記載の方法であって、ここで前記捕捉工程、増幅工程、および検出工程が表７中のオリゴマーの組み合わせを用いて実施される、方法。
（項目１２）
項目１１に記載の方法であって、ここで表７中の前記オリゴマーの組み合わせが、少なくとも５０％の陽性検出を示すものである、方法。
（項目１３）
項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法であって、ここで前記試料が血液試料である、方法。
（項目１４）
ＨＢＶ核酸を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）ＨＢＶ核酸を含むと疑われる試料を少なくとも２種類の増幅オリゴマーを含むプライマーの組み合わせと接触させる工程と；
（ｂ）前記ＨＢＶ核酸を増幅するための条件を提供する工程と；および
（ｃ）検出反応を提供する工程であって、ここで陽性検出結果が前記試料中のＨＢＶ核酸の存在を表示する工程。
（項目１５）
項目１４に記載の方法であって、ここで前記プライマーの組み合わせが表６からのプライマーの組み合わせであり、ここで前記プロモーター・プライマーの前記ＨＢＶ相補配列がその５’端でＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と連結している、方法。
（項目１６）
項目１５に記載の方法であって、ここで前記プライマーの組み合わせが、少なくとも７０％の陽性検出を示す表６からのプライマーの組み合わせである、方法。
（項目１７）
項目１４に記載の方法であって、ここで前記検出反応が表５から選択される検出プローブを用いる、方法。
（項目１８）
項目１４に記載の方法であって、ここで工程（ａ）から工程（ｃ）が表６に示されるプライマーおよび検出プローブの組み合わせを用い、ここで前記プロモーター・プライマーの前記ＨＢＶ相補配列がその５’端でＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と連結している、方法。
（項目１９）
項目１８に記載の方法であって、ここで表６からの前記プライマーおよび検出プローブの組み合わせが、少なくとも７０％の陽性検出を示すものである、方法。
（項目２０）
項目１４に記載の方法であって、配列番号７０〜配列番号８７からなる群より選択されるＨＢＶ相補配列と連結した第一のホモポリマー配列を含む少なくとも１種類の捕捉オリゴヌクレオチドを用いて、前記試料から前記ＨＢＶ核酸を捕捉する工程をさらに含む、方法。
（項目２１）
項目２０に記載の方法であって、ここで前記捕捉工程が捕捉複合体を形成し、ここで前記複合体がＨＢＶ核酸、捕捉オリゴヌクレオチド、および第二のホモポリマー配列に共有結合した固体支持体を含み、ここで前記捕捉オリゴヌクレオチドが、前記第一のホモポリマー配列および前記第二のホモポリマー配列間の相補的塩基対形成によって、前記捕捉複合体中の前記固体支持体に固定されている、方法。
（項目２２）
項目２０に記載の方法であって、ここで前記ポリヌクレオチドの前記ＨＢＶ相補配列が、配列番号７０〜配列番号８７からなる群より選択される、方法。
（項目２３）
項目２０に記載の方法であって、ここで前記ポリヌクレオチドの前記ＨＢＶ相補配列が、配列番号７３、配列番号８０、および配列番号８７からなる群より選択される、方法。
（項目２４）
項目２０に記載の方法であって、ここで前記捕捉工程、増幅工程、および検出工程が、表７中のオリゴマーの組み合わせを用いて実施される、方法。
（項目２５）
項目２４に記載の方法であって、ここで表７からの前記オリゴマーの組み合わせが、少なくとも５０％の陽性検出を示すものである、方法。
（項目２６）
項目１４−２５のいずれか一項に記載の方法であって、ここで前記試料が血液試料である、方法。
（項目２７）
ＨＢＶ核酸および少なくとも１種類の他の核酸を検出するためのマルチプレックス増幅方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）項目１〜１２または１４〜２５のいずれか一項に記載の方法によって、試料中のＨＢＶ核酸の存在または非存在を検出する工程；および
（ｂ）ＨＩＶ核酸；ＨＣＶ核酸；ならびにＨＩＶ核酸およびＨＣＶ核酸からなる群より選択される核酸の存在または非存在を、前記試料中で検出する工程。
（項目２８）
増幅および検出反応における使用のためのオリゴヌクレオチドの組み合わせであって、ここで前記オリゴヌクレオチドの組み合わせが、表６からなる群より選択される、組み合わせ。
（項目２９）
項目２８のオリゴヌクレオチドの組み合わせであって、ここでプロモーター・プライマーＨＢＶ相補配列がＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と連結している、組み合わせ。
（項目３０）
増幅および検出反応における使用のためのオリゴヌクレオチドの組み合わせであって、ここで前記オリゴヌクレオチドの組み合わせが、表７からなる群より選択される、組み合わせ。

【0011】

定義
以下の用語は、本明細書に明らかに逆に言及しない限り、本開示の目的のため、以下の意味を有する。

【0012】

本明細書において、「生物学的試料」は、ヒトから得た、組織またはポリヌクレオチド含有材料いずれかである。本発明にしたがった生物学的試料には、末梢血、血漿、血清、骨髄、リンパ節を含む生検試料、呼吸組織または滲出物、胃腸組織、子宮頚スワブ試料、精液または他の体液、組織または材料が含まれる。生物学的試料を処理して、組織または細胞構造を破壊し、それによって、酵素、緩衝剤、塩、界面活性剤等を含有可能な溶液中に、細胞内構成要素を遊離させることも可能である。

【0013】

本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡいずれかと共に、合成ヌクレオチド類似体または他の分子いずれかであって、配列中に存在することも可能であり、そして相補配列を有する第二の分子と該ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げないものを意味する。該用語は、天然存在ヌクレオチドの類似体を含有するポリマーも含み、そして特に、リボースの２’位にメトキシ基（ＯＭｅ）を有する類似体を含む。

【0014】

本明細書において、「検出可能標識」は、検出可能であるか、または検出可能反応を導くことが可能である、化学種である。本発明にしたがった検出可能標識は、直接または間接的にポリヌクレオチドプローブに連結することも可能であり、そして放射性同位体、酵素、ハプテン、色素または検出可能な色を与える粒子（例えばラテックスビーズまたは金属粒子）などの発色団、発光化合物（例えば生物発光部分、燐光部分または化学発光部分）および蛍光化合物を含む。

【0015】

「均質検出可能標識」は、プローブ上の標識が標的配列にハイブリダイズしているかどうかを測定することによって、均質な方式で検出可能な標識を指す。すなわち、均質検出可能標識は、標識または標識プローブの非ハイブリダイズ型からハイブリダイズ型を物理的に除去することなく、検出可能である。これらの標識は、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；およびＮｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号に詳細に記載されている。均質アッセイで用いるのが好ましい標識には、化学発光化合物（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；およびＡｒｎｏｌｄ，Ｊｒ．ら、米国特許第５，６３９，６０４号を参照されたい）が含まれる。好ましい化学発光標識はアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば標準的ＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥ）である。

【0016】

本明細書において、「増幅」は、標的核酸配列、その相補体または断片の多コピーを得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法を指す。
「標的核酸」または「標的」によって、標的核酸配列を含有する核酸を意味する。

【0017】

「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」または「標的領域」によって、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含んでなる特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列、およびそれに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。

【0018】

「転写関連増幅」によって、ＲＮＡポリメラーゼを用い、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する核酸増幅のいかなる種類も意味する。「転写仲介増幅」（ＴＭＡ）と呼ばれる転写関連増幅法の一例は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター−テンプレート相補オリゴヌクレオチドを使用し、そして場合によって、１以上の類似オリゴヌクレオチドを含むことが可能である。多様なＴＭＡが、Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号；Ｋａｃｉａｎら、ＰＣＴ第ＷＯ９３／２２４６１号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ第ＷＯ８８／０１３０２号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ第ＷＯ８８／１０３１５号；Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号；Ｕｒｄｅａら、米国特許第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＰＣＴ第ＷＯ９４／０３４７２号；およびＲｙｄｅｒら、ＰＣＴ第ＷＯ９５／０３４３０号に詳細に開示されるように、当該技術分野に周知である。Ｋａｃｉａｎらの方法が、本明細書に開示する種類の核酸増幅法を行うのに好ましい。

【0019】

本明細書において、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも２、一般的には約５〜約１００の間の化学サブユニットのポリマー鎖であり、各サブユニットは、ヌクレオチド塩基部分、糖部分、および直鎖空間立体配置でサブユニットを連結する連結部分を含んでなる。一般的なヌクレオチド塩基部分は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）であるが、水素結合することが可能な、他のまれなヌクレオチド塩基、または修飾されたヌクレオチド塩基が当業者に周知である。オリゴヌクレオチドは、場合によって、糖部分、塩基部分、および主鎖構成要素のいずれかの類似体を含むことも可能である。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、約１０〜約６０残基のサイズ範囲に属する。オリゴヌクレオチドは、天然存在供給源から精製することが可能であるが、好ましくは、多様な周知の酵素的方法または化学的方法のいずれかを用いて合成する。

【0020】

本明細書において、「プローブ」は、核酸、好ましくは増幅した核酸の標的配列に、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、特異的にハイブリダイズして、検出可能ハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドである。プローブは、プローブの端（単数または複数）に付着していることも可能であるし、または内部にあることも可能である、検出可能部分を含有可能である。標的ポリヌクレオチドと組み合わせるプローブのヌクレオチドは、検出可能部分がプローブの配列に関して内部である場合にそうである可能性があるように、厳密に隣接していなくてもよい。検出は、直接（すなわち標的配列または増幅した核酸に直接ハイブリダイズするプローブから生じる）であっても、または間接的（すなわちプローブを標的配列または増幅した核酸に連結する中間分子構造にハイブリダイズするプローブから生じる）であってもよい。プローブの「標的」は、一般的に、標準的水素結合（すなわち塩基対形成）を用い、プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、増幅した核酸配列内に含有される配列を指す。プローブは、標的特異的配列、およびプローブの三次元コンホメーションに寄与する他の配列（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号に記載されるようなもの）を含んでなることが可能である。「十分に相補的な」配列は、プローブの標的特異的配列に完全に相補的でなくても、標的配列へのプローブオリゴヌクレオチドの安定なハイブリダイゼーションを可能にする。

【0021】

本明細書において、「増幅プライマー」は、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、そして核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドである。増幅プライマー、またはより簡単に「プライマー」は、場合によって修飾したオリゴヌクレオチドであって、テンプレート核酸にハイブリダイズ可能であり、そしてＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長可能な３’端を有する、前記オリゴヌクレオチドであることも可能である。

【0022】

「実質的に相同」、「実質的に対応している」または「実質的に対応する」によって、対象のオリゴヌクレオチドが、参照塩基配列に存在する少なくとも１０の隣接塩基領域に、少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％相同、より好ましくは少なくとも９０％相同、そして最も好ましくは１００％相同である、少なくとも１０の隣接塩基領域を含有する塩基配列を有することを意味する（ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物は除く）。当業者は、非特異的ハイブリダイゼーションの許容し得ないレベルを妨げる一方、多様な割合の相同性で、標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、ハイブリダイゼーションアッセイ条件に対して行いうる修飾を、容易に認識するであろう。類似性の度合いは、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することによって決定され、そして２つの配列間に存在しうる他の構造的相違が、相補塩基との水素結合を妨げない限り、こうした構造的相違を考慮に入れない。２つの配列間の相同性の度合いはまた、比較している、少なくとも１０の隣接塩基の各組に存在する塩基ミスマッチ数に関して表すことも可能であり、これは０〜２塩基相違の範囲であることも可能である。

【0023】

「実質的に相補的」によって、対象のオリゴヌクレオチドが、標的核酸配列に存在する少なくとも１０の隣接塩基領域に、少なくとも７０％相補的、好ましくは少なくとも８０％相補的、より好ましくは少なくとも９０％相補的、そして最も好ましくは１００％相補的である、少なくとも１０の隣接塩基領域を含有する塩基配列を有することを意味する（ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物は除く）。（当業者は、非特異的ハイブリダイゼーションの許容し得ないレベルを妨げる一方、多様な割合の相補性で、標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、ハイブリダイゼーションアッセイ条件に対して行いうる修飾を、容易に認識するであろう。）相補性の度合いは、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することによって決定され、そして２つの配列間に存在しうる他の構造的相違が相補塩基との水素結合を妨げない限り、こうした構造的相違を考慮に入れない。２つの配列間の相補性の度合いはまた、比較している、少なくとも１０の隣接塩基の各組に存在する塩基ミスマッチ数に関して表すことも可能であり、これは０〜２塩基ミスマッチの範囲であることも可能である。

【0024】

「十分に相補的」によって、一連の相補塩基間の水素結合によって、別の塩基配列にハイブリダイズすることが可能な隣接核酸塩基配列を意味する。相補塩基配列は、標準的塩基対形成（例えばＧ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ塩基対形成）を用いて、オリゴヌクレオチドの塩基配列の各位で相補的であることも可能であるし、または標準的水素結合を用いると相補的ではない１以上の残基（無塩基性（ａｂａｓｉｃ）「ヌクレオチド」を含む）を含有するが、全体の相補塩基配列が、適切なハイブリダイゼーション条件において、別の塩基配列と特異的にハイブリダイズ可能であるものであることも可能である。隣接塩基は、オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズすることが意図される配列に、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約１００％相補的である。当業者には、適切なハイブリダイゼーション条件が周知であり、該条件は、塩基配列組成に基づいて容易に予測可能であるし、または日常的な試験を用いることによって、実験的に決定可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８９）§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１および１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７を参照されたい）。

【0025】

「捕捉オリゴヌクレオチド」によって、塩基対ハイブリダイゼーションにより、標的配列および固定化オリゴヌクレオチドを特異的に連結するための手段を提供する、少なくとも１つの核酸オリゴヌクレオチドを意味する。捕捉オリゴヌクレオチドは、好ましくは、２つの結合領域：標的配列結合領域および固定化プローブ結合領域を、通常、同一のオリゴヌクレオチド上に隣接して含むが、１以上のリンカーにより共に連結される、２つの異なるオリゴヌクレオチド上に存在する、標的配列結合領域および固定化プローブ結合領域を含むことも可能である。例えば、固定化プローブ結合領域が第一のオリゴヌクレオチド上に存在し、標的配列結合領域が第二のオリゴヌクレオチド上に存在することが可能であり、そして２つの異なるオリゴヌクレオチドが、第一および第二のオリゴヌクレオチドの配列に特異的にハイブリダイズする配列を含有する第三のオリゴヌクレオチドであるリンカーとの水素結合によって、連結される。

【0026】

「固定化プローブ」または「固定化核酸」によって、固定された支持体に捕捉オリゴヌクレオチドを直接または間接的に連結する核酸を意味する。固定化プローブは、試料中の非結合成分からの、結合した標的配列の分離を促進する、固体支持体に連結されたオリゴヌクレオチドである。

【0027】

「分離」または「精製」によって、生物学的試料の１以上の構成要素を、該試料の１以上の他の構成要素から除去することを意味する。試料構成要素には、タンパク質、炭水化物、脂質および標識プローブなどの成分もまた含む可能性がある、一般的に水性溶液相中の核酸が含まれる。好ましくは、分離工程または精製工程は、試料に存在する他の試料構成要素を、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９５％除去する。

【0028】

「ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物」または「ＲＮＡに均等な塩基およびＤＮＡに均等な塩基」によって、同一の相補塩基対ハイブリダイゼーション特性を有する、ＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子を意味する。ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物は、異なる糖部分（すなわち、リボース対デオキシリボース）を有し、そしてＲＮＡにはウラシル、そしてＤＮＡにはチミンが存在する点が異なる可能性がある。ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物の間の相違は、均等物が、特定の配列に対し、同じ度合いの相補性を有するため、相同性の相違に寄与しない。

【0029】

「本質的にからなる」によって、本発明の基本的なそして新規の特性を実質的に変化させない、さらなる構成要素（単数または複数）、組成物（単数または複数）または方法工程（単数または複数）が、本発明の組成物またはキットまたは方法に含まれていることも可能であることを意味する。こうした特性には、生物学的試料、例えば全血または血漿において、ＨＢＶ核酸の約１００コピーのコピー数で、ＨＢＶ核酸を選択的に検出する能力が含まれる。本発明の基本的なそして新規の特性に実質的な影響を有する、いかなる構成要素（単数または複数）、組成物（単数または複数）、または方法工程（単数または複数）も、この用語の外に属するであろう。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】ＨＢＶ核酸（太い水平線に示されるもの）内の標的領域を検出するのに使用可能な多様なポリヌクレオチドを例示する概略図である。標的領域に対する以下の核酸の位置を示す：「捕捉オリゴヌクレオチド」は、増幅前に標的核酸にハイブリダイズし、そして該核酸を捕捉するのに用いる核酸を指し、「Ｔ」は、相補配列を有する固定化オリゴヌクレオチド（示していない）にハイブリダイズするのに用いるテール配列を指す；「非Ｔ７プライマー」および「Ｔ７プロモーター−プライマー」は、ＴＭＡを行うのに用いる２つの増幅プライマーを示し、「Ｐ」は、Ｔ７プロモーター−プライマーのプロモーター配列を示し；そして「プローブ」は、増幅した核酸を検出するのに用いるプローブを指す。

【図2】図２は、広い範囲の標準物質量に渡る、インプット・テンプレート量およびハイブリダイゼーションシグナル強度間の線形の関係を強調する、定量的ＨＢＶ標準物質曲線を示す線グラフである。

【図3】図３は、リアルタイム核酸増幅反応へのＨＢＶ標準インプットの量（ｘ軸）およびバックグラウンド閾値を越えて測定された蛍光シグナルの発生時間（ｙ軸）に関する線グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0031】

発明の詳細な説明
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）および／またはヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）および／またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の核酸を選択的に検出するための組成物、方法およびキットに関する。本明細書に開示する組成物は、ヒト血液、血清、血漿、あるいはウイルス核酸の存在に関して試験しようとする他の体液または組織などの生物学的試料において、これらの核酸を増幅し、そして検出するのに有用である。本明細書に開示する増幅プライマーの多くは、マルチプレックス増幅反応の構成要素として好適に使用可能であり、該反応においては、プライマーおよび付属ポリヌクレオチドの複雑な一団から、いくつかの単位複製配列種が生じうる。例えば、関連しないウイルスのポリヌクレオチドを増幅可能なマルチプレックス増幅反応に、これらの反応のアッセイ感度を実質的に危うくすることなく、最も非常に好ましい、本明細書に開示するＨＢＶ特異的プライマーを使用可能である。

【0032】

本明細書に開示するプローブ、プライマーおよび方法を、診断適用において、あるいは献血および血液製剤、または感染性粒子を含有しうる他の組織をスクリーニングするために、使用可能である。さらに、生物学的試料において、核酸増幅技術を使用してＨＢＶ核酸のコピー数を測定する定量的アッセイを開示する。この定量的アッセイは、抗ウイルス療法を受けている患者において、ウイルス負荷を監視するための重要なツールに相当する。

【0033】

序論および概説
本発明は、生物学的試料においてＨＢＶ核酸を検出するための組成物（核酸捕捉オリゴヌクレオチド、増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ）、方法およびキットを含む。こうした使用に適したオリゴヌクレオチド配列を設計するため、類似の配列を有する領域をマッチングし、そして次いで、配列を比較することによって、サブタイプを含む既知のＨＢＶ ＤＮＡ配列をまず並列して、診断アッセイの試薬として働きうるウイルスゲノムの候補領域を同定した。これらの比較に基づいて、図１に図式的に示す捕捉オリゴヌクレオチド、プライマーおよびプローブを用い、ＨＢＶゲノムの「Ｓ遺伝子／ｐｏｌ遺伝子」領域を検出用に選択した。比較した配列間で、比較的少ない変異体を含有する配列部分を、捕捉、増幅、および増幅した配列の検出に使用するのに適した合成オリゴヌクレオチドを設計するための出発点として選択した。オリゴヌクレオチドを設計する際の他の考慮には、配列の相対ＧＣ含量（約３０％〜約５５％の範囲）、および予測される二次構造（例えば分子内ハイブリッドを形成するヘアピンターン）が配列内に相対的に欠如していることが含まれた。

【0034】

これらの解析に基づき、以下に示す、捕捉オリゴヌクレオチド、増幅プライマーおよびプローブ配列を設計した。一般レベルの技術を有する当業者は、Ｔ７プロモーター配列を伴うまたは伴わない、ＨＢＶに特異的なプライマー配列が、以下に記載する、プライマーに基づく多様なｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法で、プライマーとして使用可能であることを理解するであろう。さらに、本明細書に開示するハイブリダイゼーションプローブが増幅プライマーとして使用可能であり、そして本明細書に開示する増幅プライマーがハイブリダイゼーションプローブとして使用可能であることもまた、意図する。さらに、本明細書に開示するハイブリダイゼーションプローブが捕捉オリゴヌクレオチドとして使用可能であり、そして本明細書に開示する捕捉オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブとして使用可能であることも意図する。さらに、本明細書に開示する増幅プライマーが捕捉オリゴヌクレオチドとして使用可能であり、そして本明細書に開示する捕捉オリゴヌクレオチドが増幅プライマーとして使用可能であることも意図する。

【0035】

有用な増幅法
本発明と組み合わせて有用な増幅法には：転写仲介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、並びに自己複製ポリヌクレオチド分子およびＭＤＶ−１ ＲＮＡおよびＱ−ベータ酵素のような複製酵素を用いる増幅法が含まれる。これらの多様な増幅技術を実施する方法は、それぞれ、米国特許第５，３９９，４９１号、公開欧州特許出願ＥＰ ０ ５２５ ８８２、米国特許第４，９６５，１８８号、米国特許第５，４５５，１６６号、米国特許第５，４７２，８４０号およびＬｉｚａｒｄｉら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７（１９８８）に見出すことが可能である。核酸増幅反応をどのように行うかを記載する、これらの文書の開示は、本明細書に援用される。

【0036】

本発明の非常に好ましい態様において、ＴＭＡプロトコルを用いて、ＨＢＶ核酸配列を増幅する。このプロトコルにしたがって、ＤＮＡポリメラーゼ活性を提供する逆転写酵素はまた、内因性ＲＮアーゼＨ活性も所持する。この方法に用いるプライマーの１つは、増幅しようとする標的核酸の一方の鎖に相補的な配列の上流に位置するプロモーター配列を含有する。増幅の第一の工程において、プロモーター−プライマーは、定義される部位で、ＨＢＶ標的ＤＮＡにハイブリダイズする。逆転写酵素は、プロモーター−プライマーの３’端からの伸長によって、標的ＤＮＡの相補ＤＮＡコピーを生成する。相対する鎖のプライマーが新たに合成されたＤＮＡ鎖と相互作用した後、逆転写酵素によって、ＤＮＡの第二鎖がプライマー端から合成され、それによって二本鎖ＤＮＡ分子が生成される。ＲＮＡポリメラーゼは、この二本鎖ＤＮＡテンプレート中のプロモーター配列を認識し、そして転写を開始する。新たに合成されたＲＮＡ単位複製配列は各々、ＴＭＡ法に再進入し、そして新たな複製周期のテンプレートとして働き、それによって、ＲＮＡ単位複製配列の指数的拡大を導く。ＤＮＡテンプレートは各々、１００〜１０００コピーのＲＮＡ単位複製配列を作成可能であるため、この拡大の結果、１時間未満で、１００億の単位複製配列を生じることも可能である。方法全体が自己触媒性であり、そして一定の温度で行われる。

【0037】

プライマーの構造的特徴
上に示すように、「プライマー」は、テンプレート核酸にハイブリダイズ可能であり、そしてＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長可能な３’端を有する、場合によって修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。プライマーの５’領域は、標的核酸に非相補性であることも可能である。５’非相補領域がプロモーター配列を含む場合、これを「プロモーター−プライマー」と称する。当業者は、プライマーとして作用することが可能ないかなるオリゴヌクレオチド（すなわち標的配列に特異的にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長可能な３’端を有するオリゴヌクレオチド）も、５’プロモーター配列を含むよう修飾可能であり、そしてしたがってプロモーター−プライマーとして機能可能であると認識するであろう。同様に、いかなるプロモーター−プライマーもプロモーター配列の除去によって、またはプロモーター配列を含まない合成によって、修飾可能であり、そしてそれでもプライマーとして機能可能である。

【0038】

プライマーのヌクレオチド塩基部分は、修飾塩基部分が、Ｇ、Ａ、Ｃ、ＴまたはＵと非共有結合を形成する能力を保持し、そして少なくとも１つの修飾ヌクレオチド塩基部分を含んでなるオリゴヌクレオチドが、一本鎖核酸とハイブリダイズするのを立体的に妨げられない限り、（例えばプロピン基の付加によって）修飾可能である。有用なプローブの化学組成と関連して以下に示すように、本発明にしたがったプライマーの窒素性塩基は、慣用的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その既知の類似体（例えばイノシンまたは「Ｉ」；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５−３６，Ａｄａｍｓら監修，第１１版，１９９２を参照されたい）、プリン塩基類またはピリミジン塩基類の既知の誘導体（例えば、Ｎ^４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン類およびデアザ−またはアザ−ピリミジン類、５位または６位に置換基を有するピリミジン塩基類、２位、６位または８位に改変された置換基または置換置換基を有するプリン塩基類、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ^６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、およびＯ^４−アルキル−ピリミジン類（Ｃｏｏｋ、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ９３／１３１２１号を参照されたい））、および主鎖がポリマーの１以上の残基に関し、窒素性塩基を含まない、「無塩基性」残基（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい）であることも可能である。プライマー主鎖を構成する一般的な糖部分は、リボースおよびデオキシリボースを含むが、２’−Ｏ−メチルリボース（ＯＭｅ）、ハロゲン化糖、および他の修飾糖もまた、使用可能である。通常、プライマー主鎖の連結基は、リン含有部分であり、最も一般的にはホスホジエステル連結であるが、他の連結、例えばホスホロチオエート類、メチルホスホネート類、および「ペプチド核酸類」（ＰＮＡ）に見られるペプチド様連結などのリン非含有連結もまた、本明細書に開示するアッセイでの使用に意図される。

【0039】

有用なプローブ標識系および検出可能部分
特異的核酸ハイブリダイゼーションを監視するのに使用可能な、本質的にいかなる標識系および検出系を、本発明と組み合わせて使用することも可能である。有用な標識のコレクションに含まれるのは、放射標識、酵素、ハプテン、連結されたオリゴヌクレオチド、化学発光分子および電気検出法に受け入れられる酸化還元活性部分である。好ましい化学発光分子には、Ａｒｎｏｌｄらによって、米国特許第５，２８３，１７４号に開示される、均質保護アッセイと関連して使用するための種類のアクリジニウムエステル、およびＷｏｏｄｈｅａｄらによって、米国特許第５，６５６，２０７号に開示される、単一反応中で、多数の標的を定量化するアッセイと関連して使用するための種類のアクリジニウムエステルが含まれる。これらの特許文書に含有される開示は、本明細書に援用される。好ましい電気標識および検出アプローチは、米国特許第５，５９１，５７８号および第５，７７０，３６９号、並びに公開国際特許出願第ＷＯ９８／５７１５８号に開示され、これらの開示は、本明細書に援用される。本発明において、標識として有用な酸化還元活性部分には、Ｃｄ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｐｄ、Ｚｎ、ＦｅおよびＲｕなどの遷移金属が含まれる。

【0040】

本発明にしたがった、プローブ用の特に好ましい検出可能標識は、均質アッセイ系（すなわち混合物中で、結合した標識プローブが、非結合標識プローブに比較して、検出可能な変化、例えば安定性または差別的分解を示す系）で検出可能である。均質アッセイで用いるのが好ましい標識は、化学発光化合物（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；またはＡｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号に記載されるようなもの）である。特に好ましい化学発光標識には、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば標準的ＡＥまたはその誘導体、例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥが含まれる。

【0041】

いくつかの適用において、検出前にまず、ハイブリダイズしていないプローブの除去を必要とすることなく、試験試料におけるプローブ：標的二重鎖の検出を容易にするため、プローブが少なくともある程度の自己相補性を示すことが望ましい。たとえば、「分子トーチ」と呼ばれる構造は、連結領域によってつながれ、そしてあらかじめ決定されたハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、自己相補性を持つ別個の領域を含むよう、設計される（「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」を生み出す）。変性条件に曝露されると、分子トーチの２つの相補領域（完全にまたは部分的に相補的であることも可能）が融解し、あらかじめ決定されたハイブリダイゼーションアッセイ条件を回復すると、標的結合ドメインが、標的配列にハイブリダイズするのに利用可能であるようにしておく。分子トーチは、標的結合ドメインが、標的閉鎖ドメインよりも、標的配列へのハイブリダイゼーションを支持するように設計される。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸にハイブリダイズした時と対照的に、分子トーチが自己ハイブリダイズした時に、異なるシグナルを生じ、このシグナルによって、会合する検出可能標識を有するハイブリダイズしていないプローブの存在下で、試験試料中のプローブ：標的二重鎖の検出を可能にするように配置された、相互作用する標識（例えば発光剤／消光剤）を含む。分子トーチは、国際公報第ＷＯ００／０１８５０号に完全に記載され、該公報の開示は本明細書に援用される。

【0042】

本発明と組み合わせて使用可能な自己相補的ハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、一般的に「分子ビーコン」と呼ばれる構造である。分子ビーコンは、標的相補配列を有する核酸分子、標的核酸配列の非存在下で、プローブを閉じたコンホメーションに保持する親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが閉じたコンホメーションにあるときに相互作用する標識対を有する核酸分子を含んでなる。標的核酸および標的相補配列のハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離し、それによって、プローブを開いたコンホメーションにシフトする。開いたコンホメーションへのシフトは、例えば蛍光体および消光剤であることも可能な標識対の相互作用が減少することによって、検出可能である。分子ビーコンは、米国特許第５，９２５，５１７号に記載され、該特許の開示は本明細書に援用される。本明細書に開示したプローブ配列の１つのいずれかの端に、蛍光体を含んでなる第一の核酸アームおよび消光剤部分を含んでなる第二の核酸アームを付加することによって、ＨＢＶ特異的核酸配列を検出するのに有用な分子ビーコンを生成することも可能である。この配置で、本明細書に開示するＨＢＶ特異的プローブ配列は、生じた分子ビーコンの標的相補「ループ」部分として働く。

【0043】

分子ビーコンは、好ましくは、検出可能標識の相互作用対で標識される。標識の相互作用対のメンバーとして好ましい検出可能標識の例は、ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴエネルギー移動機構によって、互いに相互作用する。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、熱エネルギーへの変換を伴わず、そしてドナーおよびアクセプターが力学的に衝突することなく、原子間距離よりかなり大きい距離に渡る、発色団間の共鳴相互作用によって、分子または分子系において、吸収部位から利用部位へのエネルギーの量子の無放射伝達を伴う。「ドナー」は、まずエネルギーを吸収する部分であり、そして「アクセプター」は、続いてエネルギーが移動される部分である。ＦＲＥＴに加えて、少なくとも３つの他の「非ＦＲＥＴ」エネルギー移動プロセスがあり、これによって、励起エネルギーがドナー分子からアクセプター分子に移動可能である。

【0044】

ＦＲＥＴ機構によるとしてもまたは非ＦＲＥＴ機構によるとしても、１つの標識により放出されたエネルギーが、第二の標識に受け取られるかまたは吸収されることが可能であるのに十分に近くに、２つの標識が保持される場合、２つの標識は、互いに「エネルギー移動関係」にあるという。例えば、分子ビーコンがステム二重鎖の形成によって閉じた状態に維持され、そしてプローブの１つのアームに付着した蛍光体からの蛍光放出が、相対するアーム上の消光剤部分によって消光される場合がそうである。

【0045】

発明された分子ビーコンの非常に好ましい標識部分には、蛍光体および蛍光消光特性を有する第二の部分（すなわち「消光剤」）が含まれる。この態様において、特徴的なシグナルは、特定の波長の蛍光である可能性があるが、あるいは可視光シグナルであることも可能である。蛍光が関与する場合、放出変化は、好ましくはＦＲＥＴ、または放射エネルギー移動のためであるか、あるいは非ＦＲＥＴ様式である。閉じた状態で相互作用標識対を有する分子ビーコンが、適切な周波数の光によって刺激される場合、蛍光シグナルは第一のレベルで生じ、非常に低い可能性もある。この同じプローブが開いた状態にあり、そして適切な周波数の光によって刺激される場合、蛍光体および消光剤部分は互いに十分に分離されており、これらの間のエネルギー移動は、実質的に排除される。この条件下では、消光剤部分は、蛍光体部分からの蛍光を消光することが不能である。蛍光体が適切な波長の光エネルギーに刺激される場合、第一のレベルより高い、第二のレベルの蛍光シグナルが生成されるであろう。２つのレベルの蛍光の間の相異は検出可能であり、そして測定可能である。この方式で蛍光体および消光剤部分を用いると、分子ビーコンは、「開いた」コンホメーションにおいてのみ、「オン」であり、そして容易に検出可能なシグナルを発することによって、プローブが標的に結合していることを示す。プローブのコンホメーション状態は、標識部分間の相互作用を制御することによって、プローブから生じるシグナルを改変する。

【0046】

本発明と関連させて使用することも可能なドナー／アクセプター標識対の例には、非ＦＲＥＴ対からＦＲＥＴを区別しようとしなければ、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオジン／ＤＡＢＣＹＬ、エリスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が含まれる。一般の当業者は、ドナー色素およびアクセプター色素が異なる場合、アクセプターの感作された蛍光の出現によって、またはドナー蛍光の消光によって、エネルギー移動を検出可能であることを理解するであろう。ドナー種およびアクセプター種が同一である場合、生じた蛍光偏光によって、エネルギーを検出可能である。ＤＡＢＣＹＬおよびＱＳＹ７色素などの非蛍光アクセプターは、好適なことに、直接（すなわち非感作）アクセプター励起から生じるバックグラウンド蛍光の潜在的な問題を排除する。ドナー−アクセプター対の１つのメンバーとして使用可能な、好ましい蛍光体部分には、フルオレセイン、ＲＯＸ、およびＣＹ色素（例えばＣＹ５）が含まれる。ドナー−アクセプター対の別のメンバーとして使用可能な非常に好ましい消光剤部分には、ＤＡＢＣＹＬおよびＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ナバト）から入手可能なＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ部分が含まれる。

【0047】

合成技術、および標識を核酸に結合し、そして標識を検出する方法は、当該技術分野に周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８９），第１０章；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号；Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号、およびＢｅｃｋｅｒら、欧州特許出願第０ ７４７ ７０６号を参照されたい）。

【0048】

プローブの化学的組成
本発明にしたがったプローブは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド類似体を含んでなり、そしてそれに共有結合した検出可能標識を所持することも可能である。プローブのヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は、窒素性複素環塩基、または塩基類似体を含んでなり、ここで、ヌクレオシドは、例えばホスホジエステル結合によって共に連結されて、ポリヌクレオチドを形成する。したがって、プローブは、慣用的なリボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含んでなることも可能であるが、これらの分子の化学的類似体もまた、含んでなることも可能である。プローブの「主鎖」は、当該技術分野に知られる多様な連結で構成可能であり、該連結には、１以上の糖−ホスホジエステル連結、ペプチド核酸結合（ときに、Ｈｙｌｄｉｇ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ９５／３２３０５号に記載されるように「ペプチド核酸」と称される）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらの組み合わせが含まれる。プローブの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースいずれか、あるいは、例えば、２’−Ｏ−メチルリボースおよび２’ハロゲン化物置換（例えば２’−Ｆ）などの既知の置換を有する同様の化合物であることも可能である。窒素性塩基は、慣用的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その既知の類似体（例えばイノシンまたは「Ｉ」；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５−３６，Ａｄａｍｓら監修，第１１版，１９９２を参照されたい）、プリン塩基類またはピリミジン塩基類の既知の誘導体（例えば、Ｎ^４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン類およびデアザ−またはアザ−ピリミジン類、５位または６位に置換基を有するピリミジン塩基類、２位、６位または８位に改変された置換基または置換置換基を有するプリン塩基類、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ^６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、およびＯ^４−アルキル−ピリミジン類（Ｃｏｏｋ、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ９３／１３１２１号を参照されたい））、および主鎖がポリマーの１以上の残基に関し、窒素性塩基を含まない、「無塩基性」残基（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい）であることも可能である。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見られる慣用的な糖、塩基および連結のみを含んでなることも可能であるし、または慣用的な構成要素および置換両方（例えばメトキシ主鎖を介して連結される慣用的塩基、または慣用的塩基および１以上の塩基類似体を含む核酸）を含むことも可能である。

【0049】

ＨＢＶに特異的な増幅プライマーおよび検出プローブの選択
望ましい特性を持つ増幅プライマーおよびプローブを設計するのに有用な指針を本明細書に記載する。ＨＢＶ核酸を増幅し、そして探査する（ｐｒｏｂｉｎｇ）のに最適な部位は、隣接配列の約２００塩基内に、そして好ましくは１１０塩基内に、長さ約１５塩基より大きい、２つ、そして好ましくは３つの保存領域を含有する。プライマーまたはプロモーター−プライマーのセットで観察される増幅の度合いは、オリゴヌクレオチドがその相補配列にハイブリダイズする能力および酵素的に伸長される能力を含む、いくつかの要因に応じる。ハイブリダイゼーション反応の度合いおよび特異性は、いくつかの要因に影響を受けるため、これらの要因を操作すると、標的に完全に相補的であるにしろ、そうでないにしろ、特定のオリゴヌクレオチドの正確な感度および特異性が決定されるであろう。変化するアッセイ条件の影響が当業者に知られ、そしてＨｏｇａｎら、米国特許第５，８４０，４８８号に記載され、該特許の開示は本明細書に援用される。

【0050】

標的核酸配列の長さ、そしてしたがってプライマー配列またはプローブ配列の長さが重要でありうる。ある場合、望ましいハイブリダイゼーション特性を有するプライマーまたはプローブを生じるであろう、位置および長さが異なる、特定の標的領域由来のいくつかの配列がありうる。完全に相補的でない核酸がハイブリダイズすることは可能であるが、通常、完全に相同な塩基配列の最長のストレッチが、主にハイブリッド安定性を決定するであろう。

【0051】

増幅プライマーおよびプローブは、オリゴヌクレオチド：非標的（すなわち標的核酸に類似の配列を持つ核酸）核酸ハイブリッドの安定性を最小限にするよう配置されるべきである。増幅プライマーおよび検出プローブが、標的および非標的配列間を区別可能であることが好ましい。プライマーおよびプローブを設計する際、これらのＴｍ値の相違は、可能な限り大きくするべきである（少なくとも２℃、そして好ましくは５℃）。

【0052】

ハイブリダイゼーションに阻害性である、強い内部構造を形成することが知られる核酸領域は、プライマーまたはプローブとしてより好ましくない。こうした構造の例には、ヘアピンループが含まれる。同様に、広範な自己相補性を持つオリゴヌクレオチドも回避すべきである。

【0053】

非特異的伸長（プライマー二量体または標的非コピー）の度合いもまた、増幅有効性に影響を及ぼしうる。このため、プライマーは、特に配列の３’端で、低い自己相補性または交差相補性を有するよう選択される。長いホモポリマー領域および高いＧＣ含量を回避して、偽のプライマー伸長を減少させる。設計のこの側面を補助するのに、商業的に入手可能なコンピュータソフトウェアが利用可能である。入手可能なコンピュータプログラムには、ＭａｃＤＮＡＳＩＳ^ＴＭ２．０（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｔｄ．）およびＯＬＩＧＯバージョン４．１（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれる。

【0054】

一般レベルの技術を有する当業者は、ハイブリダイゼーションが、相補核酸の２つの一本鎖の会合を伴い、水素結合二本鎖を形成することを認識するであろう。２つの鎖の一方が、完全にまたは部分的にハイブリッドに関与しているならば、その鎖が、新たなハイブリッドの形成に、より関与しにくいであろうことは暗黙の了解である。目的の配列のかなりの部分が一本鎖であるように、プライマーおよびプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの率および度合いを非常に増加させることが可能である。標的が、組み込まれたゲノム配列である場合、これは当然、二本鎖型を生じるであろう（ポリメラーゼ連鎖反応の産物の場合のように）。これらの二本鎖標的は、当然、プローブとのハイブリダイゼーションに阻害性であり、そしてハイブリダイゼーション工程前に、変性を要する。

【0055】

ポリヌクレオチドがその標的にハイブリダイズする率は、標的結合領域における標的二次構造の熱安定性の測定値である。ハイブリダイゼーション率の標準的な測定値は、リットルあたりのヌクレオチドのモル数に秒を乗じたものとして測定される、Ｃ_０ｔ_１／２である。したがって、これは、その濃度で最大ハイブリダイゼーションの５０％が生じる時間を乗じた、プローブ濃度である。この値は、多様な量のポリヌクレオチドを一定量の標的に、固定した時間、ハイブリダイズさせることによって、決定する。Ｃ_０ｔ_１／２は、一般の当業者によく知られるであろう標準法によって、グラフ的に見出される。

【0056】

好ましい増幅プライマー
プライマーおよびプローブを含む、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドの多くは、ＨＢＶ、サブタイプＡＤＷの配列由来であった。クローニングされたＢ型肝炎ウイルスＤＮＡの全ヌクレオチド配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号Ｖ００８６６を通じてアクセス可能である。

【0057】

一般的に言って、本発明にしたがった増幅反応を行うのに有用なプライマーは、下流ＨＢＶ相補配列、および場合によって、ＨＢＶ標的に相補的でない上流配列を有する。ＨＢＶ標的核酸の一方の鎖に相補的な特定のプライマー（すなわち「第一鎖」プライマー）のＨＢＶ相補配列は、好ましくは、長さ２０〜５０塩基であり、そして配列番号２の２０〜５０の隣接塩基を有し、ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物並びにヌクレオチド類似体の置換が可能である。ＨＢＶ標的核酸の第二鎖または相対する鎖に相補的な特定のプライマー（すなわち「第二鎖」プライマー）のＨＢＶ相補配列は、好ましくは、長さ２０〜５４塩基であり、そして配列番号４の２０〜５４の隣接塩基を有し、ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物並びにヌクレオチド類似体の置換が可能である。もちろん、ＨＢＶ標的に相補的でない、場合による上流配列が、プライマーの全体の長さに加わるであろう。場合による上流配列の例は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターであろう。

【0058】

増幅反応を行うのに有用なプライマーは、異なる長さを有することも可能である。例えば、ＨＢＶ標的核酸配列の一方の鎖に相補的な増幅オリゴヌクレオチド（すなわち第一鎖プライマー）は、好ましくは１００塩基まで、より好ましくは１８〜６０塩基の長さを有し、そして１８〜２７塩基、またはさらにより好ましくは２０〜２３塩基の長さの範囲のＨＢＶ相補配列を有し、そしてＧＴＧＴＣＴＴＧＧＣＣＡＡＡＡＴＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＴＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡＴＴＴＧＴＣＣＴＧＧＴＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＴＴＴＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴ（配列番号１）に示す配列に実質的に対応する、１以上の窒素性塩基類似体の置換が可能である、少なくとも１８の隣接塩基を含む。この群に属する、プロモーター−プライマーを含むプライマーの例には、配列番号１６〜４９が含まれる。ＨＢＶ核酸を増幅するのにさらにより非常に好ましいプライマーは、１００塩基まで、より好ましくは２０〜６０塩基の長さを有し、そしてＣＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＴＴＴＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴ（配列番号２）に実質的に対応する配列内に含有される、１以上の窒素性塩基類似体の置換が可能である、少なくとも２０の隣接塩基、より好ましくは２０〜２４の隣接塩基を含むＨＢＶ相補配列を有する。この群に属するプライマーの例には、配列番号２２〜２８、および配列番号３９〜４５のそれぞれのＴ７プロモーター−プライマーが含まれる。ＨＢＶ核酸を増幅するプライマーの別の非常に好ましいコレクションは、１００塩基まで、より好ましくは２０〜６０塩基の長さを有し、そしてＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴ（配列番号３）に実質的に対応する配列内に含有される、１以上の窒素性塩基類似体の置換が可能である、少なくとも２３の隣接塩基、より好ましくは２３〜２４の隣接塩基を含むＨＢＶ相補配列を有する。この群に属するプライマーの例には、配列番号２４〜２８、および配列番号４１〜４５のそれぞれのＴ７プロモーター−プライマーが含まれる。ＨＢＶ配列を増幅するのにＴＭＡ反応を用いた場合、Ｔ７プロモーター−プライマーなど、これらの特性を有するプライマーは、プロモーター−プライマーとして用いるのに非常に好ましい。もちろん、プライマーがＴ７プロモーター−プライマーである場合、５’端に、Ｔ７プロモーター配列が含まれるであろうし、これは典型的には、プライマーの長さを約２７〜３３塩基、増加させる。プロモーター−プライマーの例には、配列番号３３〜４９に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書に開示するプロモーター−プライマーは、上に引用するＴＭＡ法を用いた核酸増幅反応を行うのに特に望ましい。

【0059】

増幅反応を行うのに、いずれかの組み合わせで上述のプライマーとともに使用可能な他のプライマー（すなわち第二鎖プライマー）は、ＨＢＶ標的核酸配列の相対する鎖に相補的である。ＨＢＶ標的核酸配列のこの相対する鎖に相補的な増幅プライマーは、好ましくは１００塩基、またはより好ましくは２０〜３１塩基、またはさらにより好ましくは２０〜２１塩基の長さを有する。これらのプライマーは、非プロモーター・プライマー（すなわちプロモーター−プライマーに比較した際、ＨＢＶテンプレートの相対する鎖に相補的であるプライマー）として使用するのに特に好ましい。本明細書に開示するように、これらのプライマーは、ＧＧＡＡＴＴＡＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＡＴＡＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧ（配列番号４）に実質的に対応する配列由来で、窒素性塩基類似体の置換が可能である、少なくとも２０の隣接塩基を有する。これらの基準を満たす特定の増幅プライマーの例には、配列番号５〜１５に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。さらにより好ましいのは、ＡＧＧＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＡＴＡＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧ（配列番号１４２）に実質的に対応する配列由来で、窒素性塩基類似体の置換が可能である、少なくとも２０の隣接塩基を有するプライマーである。これらの基準を満たす特定の増幅プライマーの例には、配列番号５〜９、１１および１５に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。

【0060】

上に明記する可変長の増幅プライマーは、標的結合に関与せず、そして増幅法または検出法に実質的に影響を与えない可能性がある、外来性の（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ）配列の存在に対応すると意図するのを理解すべきである。例えば、本発明にしたがって、増幅反応を行うのに有用なプロモーター−プライマーは、ＨＢＶ標的核酸にハイブリダイズする、少なくとも最小の配列、および最小配列上流に位置するプロモーター配列を有する。しかし、標的結合配列およびプロモーター配列間に配列を挿入すると、増幅反応における有用性を危うくすることなく、プライマーの長さを変化させることが可能である。さらに、増幅プライマーおよび検出プローブの長さは、これらのオリゴヌクレオチド配列が、望ましい相補配列にハイブリダイズするのに必須の最小必要条件に適合する限り、好みの問題である。

【0061】

表１および表２は、ＨＢＶ核酸を増幅するためのプライマーとして使用した、オリゴヌクレオチド配列の特定の例を示す。表１は、核酸の一方の鎖上のＨＢＶ配列に相補的なプライマーの配列を示す。表２は、本発明の開発中に用いた、ＨＢＶ標的相補配列およびプロモーター−プライマーの全長配列両方の配列を示す。表１のオリゴヌクレオチド配列と比較して、表２のオリゴヌクレオチド配列は、ＨＢＶゲノムの相対する核酸鎖に相補的である。

【0062】

表１
増幅プライマーのポリヌクレオチド配列

【0063】

【表1】

【0064】

表２は、ＨＢＶ標的相補オリゴヌクレオチド配列（配列番号１６〜３２）および対応するプロモーター−プライマー配列（配列番号３３〜４９）を示す。上述のように、すべてのプロモーター−プライマーには、その３’端に、ＨＢＶ標的配列に相補的な配列が、そしてその５’端に、Ｔ７プロモーター配列が含まれた。

【0065】

表２
増幅プライマーのポリヌクレオチド配列

【0066】

【表2A】

【0067】

【表2B】

【0068】

ＴＭＡ反応において、ＨＢＶ配列を増幅するのに好ましいプライマーセットには、ＨＢＶ標的配列にハイブリダイズする第一のプライマー（表２に列挙するプライマーの１つなど）および第一のプライマーの伸長産物の配列に相補的な第二のプライマー（表１に列挙するプライマー配列の１つなど）が含まれる。非常に好ましい態様において、第一のプライマーは、その５’端にＴ７プロモーター配列を含む、プロモーター−プライマーである。

【0069】

好ましい検出プローブ
本発明の別の側面は、ＨＢＶ核酸を検出するハイブリダイゼーションプローブとして使用可能なオリゴヌクレオチドに関する。ＨＢＶの核酸中に存在する標的核酸配列を増幅するための方法は、単位複製配列を検出する、場合によるさらなる工程を含むことが可能である。ＨＢＶ核酸を検出するためのこの方法は、標的核酸配列またはその相補体に優先的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションアッセイプローブと試験試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させ、それによって、検出のため、安定なプローブ：標的二重鎖を形成する工程を含む。次に、試験試料中のＨＢＶ核酸の存在または非存在の指標として、ハイブリッドが試験試料中に存在するかどうか決定する工程がある。これは、プローブ：標的二重鎖を検出することを伴う可能性がある。

【0070】

ＨＢＶ核酸配列を検出するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブには、ＨＢＶ標的核酸配列に実質的に相補的な塩基配列が含まれる。したがって、本発明のプローブは、ＨＢＶ標的核酸配列の一方の鎖、またはその相補体にハイブリダイズする。これらのプローブは、場合によって、ＨＢＶ核酸に相補的であることもまたはないことも可能な、標的核酸領域外のさらなる塩基も有することが可能である。

【0071】

好ましいプローブは、塩濃度が０．６〜０．９Ｍの範囲である場合、約６０℃に対応する、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするために、標的核酸に十分に相同である。好ましい塩には、塩化リチウムが含まれるが、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムなどの他の塩もまた、ハイブリダイゼーション溶液中で使用可能である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、あるいは、０．４８Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、並びに各１ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡによって、あるいは０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％ラウリル硫酸リチウム、６０ｍＭコハク酸リチウム、並びに各１０ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡによって提供される。

【0072】

ＨＢＶ核酸配列を検出するのに好ましい特定のプローブは、１７〜２３ヌクレオチドの範囲の長さの標的相補配列を有する。ＨＢＶ核酸を検出するのに使用可能な非常に好ましいプローブは、長さ２３ヌクレオチドの、より好ましくは２２ヌクレオチドの、より好ましくは２０ヌクレオチドの、より好ましくは１９ヌクレオチドの、より好ましくは１８ヌクレオチドの、またはより好ましくは１７ヌクレオチドの標的相補配列を有する。もちろん、これらの標的相補配列は、直鎖配列であることも可能であるし、あるいは分子ビーコンの構造に含有されるか、または検出しようとするＨＢＶ標的配列に相補的でない、場合による１以上の核酸配列を有する他の構築物の構造に含有されることも可能である。上述のように、プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせ、核酸類似体で作成することも可能であるし、または１以上の修飾ヌクレオシド（例えばリボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシド）を含有することも可能である。

【0073】

本明細書に開示するアッセイを行うのに使用可能なプローブの例には、ＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＡＴＡＧＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号６７）に示す配列、またはその相補体内に含有される、少なくとも１７、より好ましくは１７〜２３、またはより好ましくは１７〜１９の隣接ヌクレオチドが含まれ、ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物並びにヌクレオチド類似体の置換が可能である。本発明にしたがった、特定の好ましいプローブには、検出可能標識が含まれる。１つの態様において、この標識は、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステルである。例えば、米国特許第５，５８５，４８１号；および米国特許第５，６３９，６０４号に実質的に記載されるように、特に後者の特許の第１０欄第６行から第１１欄第３行に、そして実施例８に記載されるように、リンカーを介して付着した化学発光アクリジニウムエステル化合物で、検出プローブを標識することも可能である。これらの特許文書に含有される開示は、本明細書に援用される。ハイブリダイゼーションプローブが、内部に配置されたリンカーを介してアクリジニウムエステル部分で標識されている場合、プローブは、好ましくは、その開示が本明細書に援用される米国特許第６，２４５，５１９号にしたがって「保護プローブ」の存在下で保存される。例えば、プローブが長さ１９塩基であり、そして６位および７位の間に連結されるアクリジニウムエステルを有するならば、対応する保護プローブは、必要な示差Ｔｍを提供するため、長さ１６塩基であることも可能である。この場合、我々は、プローブに連結されるアクリジニウムエステル標識の一方の側に３つの相補塩基、およびもう一方の側に１３の相補塩基を有する保護プローブを用いた。もちろん、他の配列変動も想定可能である。

【0074】

表３は、ＨＢＶ単位複製配列を検出するのに用いた、ハイブリダイゼーションプローブの配列を示す。ＨＢＶ核酸配列を検出する別のプローブは、ＨＢＶの相対するセンス鎖にハイブリダイズ可能であるため、本発明はまた、表に示す配列に相補的なオリゴヌクレオチドも含む。

【0075】

表３
ＨＢＶ検出プローブのポリヌクレオチド配列

【0076】

【表3】

【0077】

本発明のいくつかの態様において、ＨＢＶ単位複製配列を検出するのに用いるプローブ配列には、メトキシ主鎖、または核酸主鎖中の少なくとも１つのメトキシ連結が含まれる。

【0078】

捕捉オリゴヌクレオチドの選択および使用
好ましい捕捉オリゴヌクレオチドには、固体支持体上の固定用の標的として働く第二の配列（すなわち「テール」配列）に共有結合した、ＨＢＶ配列（すなわち「ＨＢＶ標的配列」）に相補的な第一の配列が含まれる。捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列を連結するいかなる主鎖も使用可能である。特定の好ましい態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは、主鎖中、少なくとも１つのメトキシ連結を含む。好ましくは捕捉オリゴヌクレオチドの３’端にあるテール配列を用いて、相補塩基配列にハイブリダイズさせ、生物学的試料中の他の構成要素に優先して、ハイブリダイズした標的ＨＢＶ核酸を捕捉する手段を提供する。

【0079】

テール配列中で、相補塩基配列にハイブリダイズするいかなる塩基配列も使用可能であるが、ハイブリダイズする配列が、約５〜５０ヌクレオチド残基の長さに渡ることが好ましい。特に好ましいテール配列は、実質的にホモポリマー性であり、約１０〜約４０ヌクレオチド残基、またはより好ましくは約１４〜約３０残基を含有する。本発明にしたがった捕捉オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ標的ポリヌクレオチドに特異的に結合する第一の配列、および固体支持体に固定されたオリゴ（ｄＴ）ストレッチに特異的に結合する第二の配列を含むことが可能である。

【0080】

図１に例示する構成要素を用いて、生物学的試料中のＨＢＶ配列を検出する１つのアッセイは、捕捉オリゴヌクレオチドを用いて標的核酸を捕捉する工程、少なくとも２つのプライマーを用いて、捕捉した標的領域を増幅する工程、および、まず増幅した核酸に含有される配列に標識プローブをハイブリダイズさせ、そして次いで、結合した標識プローブから生じるシグナルを検出することによって、増幅した核酸を検出する工程を含む。

【0081】

捕捉工程は、好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドを用い、該工程では、ハイブリダイゼーション条件下で、１部分の捕捉オリゴヌクレオチドが標的核酸中の配列に特異的にハイブリダイズし、そしてテール部分が、標的領域を試料の他の構成要素から分離するのを可能にする、リガンド（例えばビオチン−アビジン結合対）などの結合対の１つの構成要素として働く。好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分は、固体支持体粒子に固定された相補配列にハイブリダイズする配列である。好ましくは、まず、捕捉オリゴヌクレオチドおよび標的核酸は、溶液相ハイブリダイゼーション動力学を利用するため、溶液中にある。ハイブリダイゼーションは、捕捉オリゴヌクレオチド：標的核酸複合体を産生し、該複合体は、相補固定化配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分のハイブリダイゼーションを通じて、固定化プローブに結合可能である。したがって、標的核酸、捕捉オリゴヌクレオチドおよび固定化プローブを含んでなる複合体が、ハイブリダイゼーション条件下で形成される。好ましくは、固定化プローブは、テール配列に相補的であり、そして固体支持体に付着する、反復配列であり、そしてより好ましくは、ホモポリマー配列（例えばポリＡ、ポリＴ、ポリＣまたはポリＧ）である。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分がポリＡ配列を含有する場合、固定化プローブはポリＴ配列を含有するであろうが、相補配列のいかなる組み合わせも使用可能である。捕捉オリゴヌクレオチドはまた、「スペーサー」残基も含有可能であり、該スペーサー残基は、標的にハイブリダイズする塩基配列および固定化プローブにハイブリダイズするテールの塩基配列間に位置する、１以上の塩基である。標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド複合体に結合するのに、いかなる固体支持体も使用可能である。有用な支持体は、マトリックスまたは溶液中の遊離粒子（例えばニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および好ましくは磁気誘引可能粒子）いずれかであることも可能である。固体支持体に固定化プローブを付着させる方法が周知である。支持体は、好ましくは、標準法（例えば遠心分離、磁気粒子の磁気誘引など）を用いて溶液から回収可能な粒子である。好ましい支持体は常磁性単分散粒子（すなわち±約５％でサイズが均一）である。

【0082】

標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド：固定化プローブ複合体を回収すると、（生物学的試料におけるその濃度に比較して）標的核酸が効率的に濃縮され、そして生物学的試料中に存在する可能性がある増幅阻害因子から標的核酸が精製される。捕捉された標的核酸は、例えば、上述のように、付着した標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド：固定化プローブ複合体を含む粒子を、洗浄溶液に再懸濁し、そして次いで、洗浄溶液から、付着した複合体を含む粒子を回収することによって、１回以上洗浄し、標的をさらに精製することが可能である。好ましい態様において、捕捉工程は、連続的に、捕捉オリゴヌクレオチドを標的核酸とハイブリダイズさせ、そして次いで、ハイブリダイゼーション条件を調整し、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分と、固定化相補配列とのハイブリダイゼーションを可能にすることによって、行う（例えば、ＰＣＴ第ＷＯ９８／５０５８３号に記載されるように）。捕捉工程、およびいかなるものでもよい、場合による洗浄工程が完了すると、次いで、標的核酸を増幅可能である。操作工程数を制限するため、標的核酸は、場合によって、捕捉オリゴヌクレオチドから遊離させることなく、増幅させることも可能である。

【0083】

ＨＢＶ核酸の２つの異なる領域を、本明細書において、捕捉オリゴヌクレオチドの標的として記載し、各領域は、本明細書記載の方法によって増幅可能なＨＢＶ核酸配列を定義する、相対して配置された境界の１つの外側に位置する。これらの領域の１つにハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドの配列は、ＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＣＣＡＡＡＡＴＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＴＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＣ（配列番号６８）に実質的に対応する配列内に含有される。捕捉オリゴヌクレオチドのＨＢＶ相補部分の好ましい長さは、２０〜４０ヌクレオチド、より好ましくは２５〜３０ヌクレオチドの範囲に属する。このカテゴリーに属する有用な捕捉オリゴヌクレオチドの例には、配列番号７０〜７６に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。ＨＢＶ核酸配列の他の領域にハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドの配列は、ＣＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＴＡＣＴＡＧＴＧＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＴＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＴＴＴＧＧＣＴＴＴ（配列番号６９）に実質的に対応する配列内に含有される。これらの捕捉オリゴヌクレオチドの好ましい大きさは、長さ２５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは２５〜３２ヌクレオチドの範囲に属する。このカテゴリーに属する有用な捕捉オリゴヌクレオチドの例には、配列番号７７〜８７のＨＢＶ相補配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。有用な捕捉オリゴヌクレオチドは、ミスマッチ配列が、増幅しようとする配列を含有するＨＢＶ核酸にハイブリダイズする限り、上述の配列に対するミスマッチを含有することも可能である。本明細書記載の各捕捉オリゴヌクレオチドには、３’端のポリ（ｄＡ）テールに連結された、表４に示すＨＢＶ相補配列の１つが含まれた。配列番号７１および配列番号８０に同定するオリゴヌクレオチドを例外として、捕捉オリゴヌクレオチドにはすべて、ＨＢＶ相補配列およびポリ（ｄＡ）テール間に配置される３つのチミジンヌクレオチドもまた含まれた。下に示すように、これらのチミジンヌクレオチドの存在は、捕捉法の成功に必須であるとは考えられない。特に、配列番号８６の捕捉オリゴヌクレオチドの１６位には、天然に存在する「Ｇ」核酸塩基の代わりに「Ｃ」核酸塩基が存在することから、本発明の捕捉オリゴヌクレオチドには、少なくとも１つの塩基置換が許容されることが立証された。

【0084】

表４
捕捉オリゴヌクレオチドのＨＢＶ相補部分のポリヌクレオチド配列

【0085】

【表4】

【0086】

ＨＢＶポリヌクレオチド配列を増幅し、そして検出するのに好ましい方法
本発明の好ましい方法を、以下に示す実施例に記載し、そして例示する。図１は、ＨＢＶゲノム（太い水平な実線によって示す）の標的領域を検出するのに使用可能な１つの系を図式的に例示する。この系は、４つのオリゴヌクレオチド（より短い実線によって示す）：標的領域でＨＢＶ配列に特異的にハイブリダイズする配列、および生物学的試料中に存在する標的領域を捕捉するため、固体支持体に固定された相補配列にハイブリダイズするテール（「Ｔ」）を含む、１つの捕捉オリゴヌクレオチド；標的領域でＨＢＶ配列に特異的にハイブリダイズする配列、および二重鎖で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの機能するプロモーターとして作用するＴ７プロモーター配列（「Ｐ」）を含む、１つのＴ７プロモーター−プライマー；Ｔ７プロモーター−プライマーを用いて、標的領域配列から作成される第一鎖ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする配列を含む、１つの非Ｔ７プライマー；および２つのプライマーを用いて増幅される標的領域の一部に特異的にハイブリダイズする配列を含む、１つの標識プローブを含む。

【0087】

上に示すように、２つのプライマーを用いる、捕捉された標的領域の増幅は、一般のレベルの技術を有する当業者によく知られるであろう、多様な既知の核酸増幅反応いずれによっても達成可能である。好ましい態様において、ＴＭＡなどの転写関連増幅反応を使用する。こうした態様において、標的核酸の単一コピーから、多くの鎖の核酸を産生し、こうして、増幅した配列に結合するプローブを検出することによって、標的の検出を可能にする。好ましくは、転写関連増幅は、溶液中で、適切な塩および緩衝剤と共に、２種類のプライマー（１つはプロモーター配列を含有するため、プロモーター−プライマーと称され、図１ではＲＮＡポリメラーゼを表す「Ｐ」と示す）、２つの酵素（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）、および基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）を用い、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を生じる。

【0088】

図１を参照すると、転写仲介増幅中、捕捉された標的核酸は、Ｔ７プロモーター−プライマーとして示される第一のプライマーにハイブリダイズする。逆転写酵素を用いて、標的ＤＮＡをテンプレートとして用い、Ｔ７プロモーター−プライマーから相補ＤＮＡ鎖を合成する。非Ｔ７プライマーとして示される、第二のプライマーは、新たに合成されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズし、そして逆転写酵素の作用によって伸長されてＤＮＡ二重鎖が形成され、それによって二本鎖Ｔ７プロモーター領域が形成される。次いで、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、この機能するＴ７プロモーターを用いることによって、多数のＲＮＡ転写物を生成する。ＴＭＡの自己触媒機構は、ＲＮＡ転写物をテンプレートとして用いるｃＤＮＡ合成工程に続いて、反復してハイブリダイゼーション工程および重合工程を使用し、さらなる転写物を産生して、それによって標的領域特異的核酸配列を増幅する。

【0089】

検出工程は、上述の増幅したＲＮＡ転写物または単位複製配列に特異的に結合する、少なくとも１つの検出プローブを用いる。好ましくは、検出プローブは、均質検出系を用いて検出可能な標識で標識される。例えば、標識プローブは、上述のような、化学発光シグナルが産生され、そして検出されることが可能な、アクリジニウムエステル化合物で標識されることも可能である。あるいは、標識プローブは、蛍光体および消光剤部分を含んでなることも可能である。分子ビーコンは、均質検出系で使用可能なこうした標識プローブの１つの態様である。

【0090】

マルチプレックス増幅反応
多数の解析物ポリヌクレオチドを検出する簡便な試験形式は、異なるプライマーセットを用いて同時に増幅反応を行うことを伴い、ここで、反応中合成される単位複製配列を、ハイブリダイゼーションによって検出する。これに関して、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（カリフォルニア州サンディエゴ）は、３つの重要な工程を用いて、単一試験管マルチプレックス形式でＨＩＶ−１および／またはＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）核酸を検出するＨＩＶ−１／ＨＣＶ試験を開発した。最初の試料調製法において、血漿を界面活性剤で処理してウイルスゲノムＲＮＡを遊離させ、標的特異的オリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズさせ、そして磁気微小粒子上に捕捉して、該粒子を磁場中で血漿から分離する。次に、転写に基づくポリヌクレオチド増幅系を使用して、単一反応中で、ＨＩＶ−１および／またはＨＣＶ標的ＲＮＡを増幅する。最後に、ＨＩＶ−１またはＨＣＶ単位複製配列に相補的な化学発光プローブの核酸ハイブリダイゼーションを用いて、検出を達成する。アッセイが陽性結果を生じたら、識別試験を行って、２つのウイルス間を区別する。

【0091】

以下に記載する方法において、ＨＩＶ−１核酸を増幅し、そして検出するのに特に用いたオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有した。ＨＩＶ−１核酸の一方の鎖に特異的な増幅プライマーには、ＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴ（配列番号９８）およびＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＣＴＡ（配列番号９９）の配列が含まれ、各プライマーには、ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴ（配列番号１００）およびＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＣＴＡ（配列番号１０１）の対応するプロモーター−プライマーを生じる、場合による上流プロモーター配列がさらに含まれた。本発明の開発中に用いた、相対する鎖のプライマーは、ＧＣＣＴＣＡＡＴＡＡＡＧＣＴＴＧＣＣ（配列番号１０２）およびＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧ（配列番号１０３）の配列を有した。本明細書に示すマルチプレックスデータを得るのには用いなかったが、好ましい相対する鎖の代替プライマーには、ＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧ（配列番号１０４）およびＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧ（配列番号１０５）が含まれる。ＨＩＶ単位複製配列を検出するためのプローブは、ＣＣＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧ（配列番号１０６）（７位および８位のヌクレオチド間でＡＥ標識されている）、ＣＵＧＧＵＡＩＣＵＡＧＡＧＡＵＣＣＣＵＣ（配列番号１０７）（９位および１０位のヌクレオチド間でＡＥ標識されている）、およびＧＧＡＴＴＧＧＩＩＩＧＴＡＣＡＧＴＧＣ（配列番号１０８）（５位および６位のヌクレオチド間でＡＥ標識されている）に示す配列を有した。ＣＣＡＣＡＡＧＣＵＵＡＧＡＡＧＡＵＡＧＡＧＡＧＧ（配列番号１０９）（１０位および１１位のヌクレオチド間でＡＥ標識されている）の配列を有するプローブを、内部対照単位複製配列を検出するのに用いた。最後の位がＤＮＡヌクレオチドに占められたことを除いて、これらのプローブをすべて、２’−ＯＭｅ類似体を用いて調製し、それによってＲＮＡに均等な塩基およびＤＮＡに均等な塩基、塩基類似体並びにヌクレオチド主鎖類似体の組み合わせを用いて、プローブを柔軟に調製可能であることを確認した。プローブ保護オリゴヌクレオチドは、ＧＧＡＴＣＴＣＴＡＧＣＴＡＣＣ（配列番号１１０）、ＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧ（配列番号１１１）、およびＣＴＡＴＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧ（配列番号１１２）の配列を有した。捕捉オリゴヌクレオチドには、ＡＣＵＧＡＣＧＣＵＣＵＣＧＣＡＣＣＣＡＵＣ（配列番号１１３）およびＵＣＵＧＣＵＧＵＣＣＣＵＧＵＡＡＵＡＡＡＣＣＣＧ（配列番号１１４）のＨＩＶ相補配列が含まれ、そして２’−ＯＭｅ類似体を用いて該捕捉オリゴヌクレオチドを調製し、そして３つのＴ残基を間に配置して、３’端でＡ_３０のテール配列に連結した。

【0092】

ＨＣＶ核酸を増幅し、そして検出するのに用いた、好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有した。ＨＣＶ核酸の一方の鎖に特異的な増幅プライマーには、ＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧＣＩＡＣＣＣＡＡＣ（配列番号１１５）の配列が含まれ、そしてＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧＣＩＡＣＣＣＡＡＣ（配列番号１１６）の対応するプロモーター−プライマーを生じる、場合による上流プロモーター配列がさらに含まれた。本発明の開発中に用いた、相対する鎖のプライマーは、ＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡ（配列番号１１７）およびＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧ（配列番号１１８）の配列を有した。ＨＣＶ単位複製配列を検出するためのプローブは、ＣＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＵＡＧＵＧＧＵＣＴ（配列番号１１９）（１４位および１５位のヌクレオチド間でＡＥ標識されている）、およびＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣ（配列番号１２０）（１３位および１４位のヌクレオチド間でＡＥ標識されている）に示す配列を有した。ＨＣＶ単位複製配列の検出は、ＡＧＣＣＵＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＣＣＴ（配列番号１２１）の配列を有するヘルパープローブの使用によって促進された。上述のように、最後の位がＤＮＡヌクレオチドに占められたことを除いて、これらのプローブを、２’−ＯＭｅ類似体を用いて調製し、それによってＲＮＡに均等な塩基およびＤＮＡに均等な塩基、塩基類似体並びにヌクレオチド主鎖類似体の組み合わせを用いて、プローブを柔軟に調製可能であることを確認した。プローブ保護オリゴヌクレオチドは、ＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣ（配列番号１２２）およびＧＴＡＣＴＣＡＣＣＧＧＴＴＣ（配列番号１２３）の配列を有した。捕捉オリゴヌクレオチドには、ＧＧＧＣＡＣＵＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＵ（配列番号１２４）およびＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＧＧＵＣＵＡＣＧ（配列番号１２５）のＨＣＶ相補配列が含まれ、そして２’−ＯＭｅ類似体を用いて該捕捉オリゴヌクレオチドを調製し、そして３つのＴ残基を間に配置して、３’端でＡ_３０のテール配列に連結した。

【0093】

特に、上述のオリゴヌクレオチドは、単一解析物検出に関して本明細書に記載する条件下で使用可能である。実際、ＨＩＶ−１を増幅し、そして検出するのに用いたオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−１を検出するための独立型アッセイで使用可能であり、そしてＨＣＶを増幅し、そして検出するのに用いたオリゴヌクレオチドは、ＨＣＶを検出するための独立型アッセイで使用可能である。これらの代替独立型アッセイの各々が、本発明の好ましい態様に相当する。さらに、ＨＩＶ−１を増幅し、そして検出するのに用いたオリゴヌクレオチドは、マルチプレックス反応において、ＨＣＶを増幅し、そして検出するのに用いたオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用されてきている。再び、この組み合わせが、本発明の別の好ましい態様に相当する。最後に、本明細書の多くの実施例に開示するように、ＨＩＶ−１およびＨＣＶ増幅および検出オリゴヌクレオチドを組み合わせて用いて、ＨＩＶ−１、ＨＣＶおよびＨＢＶ解析物のいずれかまたはすべてを増幅し、そして検出することが可能なアッセイが用意されてきている。

【0094】

マルチプレックス増幅反応において、各プライマーセットが、異なる解析物ポリヌクレオチドに特異的である、異なるプライマーセットの数が増加するにつれて、プライマー間、並びにプライマーおよび無関係な単位複製配列間の望ましくない相互作用の機会が増加する。本明細書に開示する最も非常に好ましいプライマー配列は、ＨＢＶ核酸のみを特異的に増幅する反応で使用可能であり、そしてまた、ＨＩＶ−１およびＨＣＶからウイルス特異的配列を増幅することがさらに可能な単一ポリヌクレオチド増幅反応における試薬としても使用可能である。

【0095】

ＨＢＶ核酸を検出するキット
本発明はまた、ウイルス核酸テンプレートを用いて、ポリヌクレオチド増幅反応を行うためのキットも含む。特定の好ましいキットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅反応において、ＨＢＶ核酸を増幅するのに使用可能なオリゴヌクレオチドプライマー対を含有する。典型的なキットには、増幅しようとするＨＢＶ核酸配列の相対する鎖に相補的な、第一および第二の増幅オリゴヌクレオチドが含まれる。「第一鎖」プライマーとも称される第一の増幅オリゴヌクレオチドには、ＨＢＶ核酸の一方の鎖に相補的な下流配列、および場合によって、そのＨＢＶ核酸に相補的でない上流配列が含まれる。第一の増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは１００塩基までの長さ、より好ましくは２０〜６０塩基の長さを有し、そして配列番号２に実質的に対応する配列内に含有される、１以上のヌクレオチドまたは窒素性塩基類似体の置換が可能である、少なくとも２０の隣接塩基、より好ましくは２０〜５０の隣接塩基、さらにより好ましくは２０〜２４の隣接塩基を含むＨＢＶ相補配列を有する。この群に属するプライマーには、配列番号２２〜２８、および配列番号３９〜４５の対応するＴ７プロモーター−プライマーが含まれる。第二の増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは１００塩基まで、またはより好ましくは２０〜３１塩基、またはさらにより好ましくは２０〜２１塩基の長さを有する。「第二鎖」プライマーとも称される、この第二のプライマーは、配列番号４に実質的に対応する配列内に含有される、ヌクレオチドまたは窒素性塩基類似体の置換が可能である、少なくとも２０の隣接塩基、より好ましくは２０〜５４の隣接塩基、より好ましくは２０〜２１の隣接塩基を有する。これらの基準を満たす増幅プライマーには、配列番号５〜１５に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。該キットは、１以上のオリゴヌクレオチド検出プローブをさらに含有することも可能である。これらのプローブは、配列番号６７に示す配列、またはその相補体内に含有される、少なくとも１７の隣接ヌクレオチド、より好ましくは１７〜２３の隣接ヌクレオチド、またはより好ましくは１７〜１９の隣接ヌクレオチドを含むことも可能であり、ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物並びにヌクレオチド類似体の置換が可能である。特に好ましいプローブには、配列番号５０、配列番号５７および配列番号５４の配列を有するものが含まれるが、本明細書に開示する他のプローブも使用可能であり、そして本発明の範囲内に属すると意図される。もちろん、これらの配列の相補体もまた、ＨＢＶ配列を検出するプローブとして使用可能である。キットに含まれることが可能な他のプローブは、実施例１０に記載される種類の分子ビーコン・ハイブリダイゼーションプローブである。本発明にしたがったさらに他のキットは、増幅前に、他の種からＨＢＶテンプレート核酸を精製するための捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含むことが可能である。典型的な捕捉オリゴヌクレオチドは、１００ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号６８の少なくとも２０の隣接ヌクレオチド、より好ましくは２０〜４０の隣接ヌクレオチド、またはさらにより好ましくは２５〜３０の隣接ヌクレオチドの範囲に属するＨＢＶ相補部分を有する。このカテゴリーに属する有用な捕捉オリゴヌクレオチドの例には、配列番号７０〜７６に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。別の捕捉オリゴヌクレオチドは、１００ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号６９の少なくとも２５の隣接ヌクレオチド、より好ましくは２５〜５０の隣接ヌクレオチド、またはさらにより好ましくは２５〜３２の隣接ヌクレオチドの範囲に属するＨＢＶ相補部分を有する。このカテゴリーに属する有用な捕捉オリゴヌクレオチドの例には、配列番号７７〜８７に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。実際、ＨＢＶ核酸を検出する、発明された方法を実施するのに有用なキットは、互いにパッケージングした組み合わせで、本明細書に開示する、増幅オリゴヌクレオチド組成物および／または検出プローブ組成物および／または捕捉オリゴヌクレオチド組成物の、本質的にいずれを含むことも可能である。

【0096】

本発明にしたがった他の好ましいキットには、ＨＢＶ以外のウイルス標的の核酸を増幅するが、ＨＢＶ標的核酸を増幅するプライマーと組み合わせて使用可能な、プライマーが含まれる。例えば、ＨＢＶ標的核酸を増幅するプライマーは、ＨＩＶ−１および／またはＨＣＶ標的核酸を増幅するのに使用可能なプライマーとパッケージングした組み合わせにあることも可能である。ＨＩＶ−１およびＨＣＶを増幅するための典型的なプライマーを本明細書に開示する。特に好ましい態様において、該キットには、ＨＢＶ、ＨＩＶ−１およびＨＣＶを増幅するためのプライマーが含まれる。さらに他のキットには、ＨＩＶ−１またはＨＣＶ標的核酸いずれかの１つのみを増幅するのに使用可能なプライマーが含まれる。さらに他のキットには、ＨＩＶ−１およびＨＣＶ両方を増幅するプライマーが含まれるが、ＨＢＶ核酸を増幅するプライマーが含まれない。したがって、多くの異なるキット構成が本発明に含まれることが明らかであるはずである。ＨＩＶ−１およびＨＣＶ核酸を増幅し、そして検出するためのプライマーおよび捕捉オリゴヌクレオチド配列を本明細書に開示する。

【実施例】

【0097】

本発明の一般的な原理は、以下の限定されない実施例を参照することによって、より完全に認識可能である。
実施例１は、ハイブリダイゼーションプローブを同定し、続いてＨＢＶ核酸を検出するアッセイにおいて、該プローブを用いる方法を記載する。この方法では、適切な７つの合成オリゴヌクレオチドのうち１つが、候補プローブが結合する標的として働いた。

【0098】

（実施例１）
ＨＢＶを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ
ＲＮＡまたは２’−ＯＭｅ主鎖を用いた標準的実験室法にしたがって、合成ＨＢＶ標的オリゴヌクレオチドを調製した。これらの標的は以下の配列を有した：
ＵＵＣＣＵＣＵＵＣＡＵＣＣＵＧＣＵ（配列番号８８）；
ＵＵＣＣＵＣＵＵＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＵ（配列番号８９）；
ＵＵＣＣＵＣＵＧＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＵＧＵＵＧ（配列番号９０）；
ＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＵＧＵＵＧＧ（配列番号９１）；
ＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＵＧＵＵＧＧＵＵＣＵＵＣＵＧＧＡＣＵＡＵＣＡＡＧＧ（配列番号９２）；
ＵＵＧＧＵＵＣＵＵＣＵＧＧＡＣＵＡＵＣＡＡＧＧ（配列番号９３）；および
ＣＡＡＧＧＵＡＵＧＵＵＧＣＣＣＧＵ（配列番号９４）。
２’−ＯＭｅヌクレオチドを用いて、合成ＨＢＶ標的にハイブリダイズするための候補プローブを調製し、そしてこのプローブは、表３に示す配列を有した。特に、配列番号９０に同定する標的配列の８位は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂの配列に特徴的なＧ部分によって占められた。

【0099】

ハイブリダイゼーション反応は、５ｘ１０^５ＲＬＵに対応するＡＥ標識プローブの量を含有するハイブリダイゼーション緩衝液１００μｌ体積、および１００ｆｍｏｌの合成ＨＢＶ標的オリゴヌクレオチドを含有する１０μｌからなった。陰性対照反応では、ＨＢＶ標的オリゴヌクレオチドを省いた。その開示が上で本明細書に援用されている米国特許第５，５８５，４８１号および第５，６３９，６０４号に記載される方法にしたがって、内部に配置された非ヌクレオチドリンカーによってオリゴヌクレオチド構造に連結されたＡＥ部分を用いて、表５に列挙するプローブを各々、標識した。異なるリンカー位を使用することによって、この標識技術の汎用性（ｖｅｒｓｉｔｉｌｉｔｙ）を確認した。より具体的には、配列番号５０のプローブ上のリンカーは、８位および９位の間に位置し、配列番号５１のプローブ上のリンカーは、５位および６位の間に位置し、配列番号５２のプローブ上のリンカーは、５位および６位の間に位置し、配列番号５３のプローブ上のリンカーは、１１位および１２位の間に位置し、配列番号５４のプローブ上のリンカーは、６位および７位の間または１３位および１４位の間に位置し、配列番号５５のプローブ上のリンカーは、１７位および１８位の間または８位および９位の間に位置し、配列番号５６のプローブ上のリンカーは、１４位および１５位の間に位置し、配列番号５７のプローブ上のリンカーは、８位および９位の間に位置し、配列番号５８のプローブ上のリンカーは、１０位および１１位の間に位置し、配列番号５９のプローブ上のリンカーは、１３位および１４位の間に位置し、配列番号６０のプローブ上のリンカーは、８位および９位の間に位置し、配列番号６１のプローブ上のリンカーは、９位および１０位の間に位置し、配列番号６２のプローブ上のリンカーは、６位および７位の間に位置し、配列番号６３のプローブ上のリンカーは、１４位および１５位の間に位置し、配列番号６４のプローブ上のリンカーは、１７位および１８位の間に位置し、配列番号６５のプローブ上のリンカーは、５位および６位の間に位置し、そして配列番号６６のプローブ上のリンカーは、８位および９位の間に位置する。０．０５Ｍコハク酸リチウム（ｐＨ５）、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡを含有する溶液２００μｌ中、６０℃で１５分間、プローブハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション反応に続いて、３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）および１％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；コネチカット州ダンベリー）を添加した。これらの混合物をまず、６０℃で１０分間インキュベーションして、ハイブリダイズしていないプローブを不活性化し、そしてその後、室温に冷却した。１ｍＭ硝酸および０．１％（ｖ／ｖ）過酸化水素を自動的に注入した後、１Ｎ水酸化ナトリウムを含有する溶液を注入するよう設定した、ＬＥＡＤＥＲ Ｉ発光測定装置（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いて、各試料において、ハイブリダイズしたプローブによる化学発光をアッセイした。化学発光反応の結果を、相対光単位（ＲＬＵ）で測定した。この方法から得た試料結果を表５に示す。

【0100】

表５
プローブハイブリダイゼーション結果

【0101】

【表5】

【0102】

表５に示す結果は、各プローブが、低いバックグラウンドシグナルで、そしてＨＢＶ標的オリゴヌクレオチドとの少なくとも穏やかなレベルの陽性反応を生じたことを示した。しかし、プローブのいくつかは、実質的に他のものより優れた結果を生じ、それによって、ＨＢＶ配列におけるプローブ結合の好ましい標的領域が定義された。より具体的には、配列番号６５〜６６のプローブを例外として、すべてのプローブは、対応するプローブハイブリダイゼーションシグナルの０．５％未満の陰性対照値を生じた。このパターンに基づいて、ＨＢＶ単位複製配列にハイブリダイズし、そして該配列を検出するのに好ましいプローブには、ＣＣＴＴＧＡＴＡＧＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号９５）に示す配列、またはその相補体内に含有される、１７〜２３の隣接ヌクレオチドが含まれ、ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物並びにヌクレオチド類似体の存在が可能である。特に、配列番号５４のプローブに関して示す結果は、６位および７位の間に位置するリンカーを有するオリゴヌクレオチドに関するものであるが、１３位および１４位の間に位置するリンカーを含む、同一の核酸塩基配列を有するプローブに関しても、実質的に同一の結果が得られた。これらの代替物の各々は、発明されたプローブの好ましい態様に相当する。さらに、配列番号５５のプローブに関して表に示す結果は、１７位および１８位の間に位置するリンカーを有するオリゴヌクレオチドに関するものであり、優れているが、８位および９位の間に位置するリンカーを持つ同一の核酸塩基配列を有するプローブに関しては、いくぶん低い値が得られた。これらの代替物もまた、各々、発明されたプローブの好ましい態様に相当する。実際、上述のプローブいずれかに連結された検出可能標識いずれかの配置は、多様であることも可能であり、そしてなお本発明の範囲内に属することも可能である。

【0103】

ある範囲の増幅プライマーおよび捕捉オリゴヌクレオチドが、生物学的試料中のＨＢＶ核酸を検出可能であることを立証するため、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４（２つの上述の標識位を有する別個のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる）、配列番号５７、および配列番号５８の配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを続いて用いた。これらの配列またはその相補体を有するプローブは、ＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物の存在並びにヌクレオチド類似体の置換が可能であり、各々、本発明の特に好ましい態様に相当する。

【0104】

核酸テンプレートの供給源としてＨＢＶビリオンを使用する一連の方法において、ＨＢＶ核酸を増幅するのに好ましいプライマーの組み合わせを同定した。以下に記載する方法を用いて、プロモーター−プライマーおよび相対する鎖のプライマーを、組み合わせてスクリーニングした。転写仲介増幅（ＴＭＡ）プロトコルを用いて、これらの方法を特に行ったが、本明細書に開示するプライマーを用いて、一般レベルの技術を有する当業者によく知られるであろう代替ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅法によって単位複製配列を産生することも可能である。

【0105】

実施例２は、有用な増幅プライマーを同定する方法を記載する。この方法で記載するＨＢＶ特異的標的捕捉オリゴヌクレオチド、増幅プライマーおよびプローブに加えて、該反応にはまた、ＨＩＶ−１およびＨＣＶ解析物に特異的な上述のオリゴヌクレオチドも含まれた。ＨＩＶ−１およびＨＣＶオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ解析物の検出に実質的には寄与しなかった。

【0106】

（実施例２）
増幅プライマーの同定
ＨＢＶ遺伝子型Ａのビリオンは、プライマー対のセットを使用する増幅反応において、ＨＢＶテンプレート配列の供給源として働いた。その開示が上で本明細書に援用される、Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号に本質的に記載されるように、ＴＭＡ反応を行った。各プロモーター−プライマーには、ＨＢＶ相補配列上流のＴ７プロモーター配列ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号９６）が含まれた。１００μｌの反応緩衝液中、約７〜３３コピーの間のＨＢＶテンプレート、および１〜２０ｐｍｏｌの各プライマーを用いて、多様なプライマーの組み合わせに関して増幅反応を行った。ＨＩＶ特異的オリゴヌクレオチドでなく、ＨＢＶ特異的オリゴヌクレオチドを用いて、テンプレートを捕捉したことを除いて、公開国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／１８６８５号に開示される方法に本質的にしたがい、増幅前に、核酸に標本プロセシングおよび標的捕捉を行った。重要なことに、該方法で用いる捕捉オリゴヌクレオチドはすべて、増幅可能なＨＢＶテンプレートを捕捉可能であることが知られた。したがって、この方法は、異なるプライマーおよびプローブの組み合わせが、マルチプレックス増幅アッセイにおいて、協調する能力に重点を置いた。５〜２５国際単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）のＨＢＶを含有する感染血清のストック試料５００μｌアリコットを用いて、すべての方法を行った。特に、この方法で用いたビリオン調製の１ＩＵ中には、およそ３コピーのＨＢＶゲノムがある。標的核酸およびプライマーを６０℃に１０分間加熱して、そして次いで４２℃に冷却し、プライマーアニーリングを促進した。次いで、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（５，６００単位／反応）およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（３，５００単位／反応）を混合物に添加した。最終増幅反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３５ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、および５％（ｗ／ｖ）グリセロールを含有した。４２℃で１時間インキュベーションした後、１００μｌ増幅反応すべてを、本質的に実施例１に記載するようなハイブリダイゼーションアッセイに供した。より具体的には、表３に列挙する６つの異なるプローブの１以上を、アクリジニウムエステルで約１〜１．２ｘ１０^８ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性に標識し、そして次いで、ハイブリダイゼーション反応において、用いた各プローブに関して、７．５ｘ１０^５ＲＬＵに同等の量を用いた。陽性結果と判断するには、プローブハイブリダイゼーションを示す化学発光シグナルは、アッセイにおいて、５０，０００ＲＬＵを越えていなければならなかった。

【0107】

表６は、異なる組み合わせのプライマー、プローブおよびＨＢＶテンプレート・インプットレベルを用いて行った増幅法の結果を示す。表の最後の列に陽性検出％として結果を示し、そしてこの結果は、さらに、該方法で用いた反復試験数を示した。必ずしも同時に行わなくてもよいいくつかの方法から、これらの結果を収集した。

【0108】

表６
多様なプライマーの組み合わせを用いた、ＨＢＶポリヌクレオチド配列の増幅

【0109】

【表6A】

【0110】

【表6B】

【0111】

【表6C】

【0112】

【表6D】

【0113】

表６に示す結果によって、７コピー／反応と同程度に低いテンプレートレベルであっても、プライマーの組み合わせの多くが、非常に高いレベルのＨＢＶ検出可能性を生じることが示された。重要なことに、ＨＢＶテンプレートがこれらのアッセイで検出可能であることを示す結果によって、適切なプライマーの組み合わせが、ＨＢＶ核酸配列を増幅するのに協調可能であることが立証され、そしてＨＩＶ／ＨＣＶマルチプレックス反応の他の構成要素が、複雑な反応混合物において、ＨＢＶプライマーの組み合わせが機能する能力に干渉しないことがさらに立証された。陽性結果、すなわち非ゼロレベルのＨＢＶ検出可能性が試験中に観察されたことによって、プライマーの組み合わせが、ＨＢＶのみを増幅するアッセイにおいて有用であるとともに、ＨＩＶ−１およびＨＣＶテンプレートを増幅可能なマルチプレックスアッセイにおいて有用であることも示された。ＨＢＶ配列の増幅および検出が起こらなかったことを示す陰性結果は、マルチプレックスアッセイにのみ該当した。陰性結果は、例えば、マルチプレックス反応において、ＨＢＶプライマーおよび他のウイルス標的の１つを増幅するのに用いたプライマー間の望ましくない相互作用のためであった可能性もある。以下に示す感度データに支持されるように、本明細書に示す結果において、低いが、測定可能なレベルのＨＢＶ検出可能性を生じるプライマーの組み合わせは、ＨＢＶテンプレートの増幅に成功したことを示し、そしてこうした組み合わせがＨＢＶ核酸増幅アッセイの有用な構成要素であることを確証した。これらの有用なプライマーに定義される上流ドメインおよび下流ドメイン内に含有される他のプライマーもまた、ＨＢＶ配列を増幅するのに使用可能である。

【0114】

表６に示す結果によって、配列番号１６、配列番号１８、または配列番号１９のＨＢＶ相補配列を含むプロモーター−プライマーが、優れたレベルの検出可能性を生じる増幅反応に関与し、このことは、反応が単一のプロモーター−プライマーのみを含む場合であっても、そして一本鎖Ｍ１３クローンがＨＢＶ遺伝子型Ａテンプレートの供給源であっても、あてはまることがさらに示された。この結果は、表９に示す結果に示すように、一本鎖Ｍ１３クローンが、ＨＢＶ遺伝子型Ｇテンプレートの供給源として働く場合の、２つのプロモーター−プライマーの見かけの必要条件とは、いくぶん異なっていた。いかなる特定の理論に縛られることも望まないが、一本鎖Ｍ１３テンプレートと組み合わせて単一のプロモーター−プライマーを用いた場合、いくつかの場合のみで、比較的優れた結果が観察されたことは、アッセイ感度が異なるレベルであることを反映する可能性もある。

【0115】

特定の好ましい態様において、ＨＢＶ核酸を増幅するための少なくとも２つのプライマーセットであって：（ｉ）配列番号２２または配列番号２３の塩基配列を有するか、または該塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含んでなる、第一の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号１５または配列番号１１の塩基配列を有するか、または該塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含んでなる、第二の増幅プライマーを含む、前記セットを提供する。ＨＢＶゲノムに存在しない、プロモーター配列などの、ＨＢＶ標的配列に相補的でない、場合による配列が、標的相補配列の上流に位置する位で、プライマーに付加されていることも可能である。特に好ましい組み合わせにおいて、第一の増幅プライマーは、配列番号２３の塩基配列を有するか、または該塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含んでなるプロモーター−プライマー（例えば配列番号４０）であり、そして第二の増幅プライマーは、配列番号１１の塩基配列を有するか、または該塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含んでなる。

【0116】

先の実施例におけるように、有用な捕捉オリゴヌクレオチドを同定する方法はまた、ＨＢＶ核酸供給源として、ＨＢＶ遺伝子型Ａ陽性血漿のストックも使用した。試験を受けた各オリゴヌクレオチドには、オリゴ（ｄＡ）テール配列に連結されたＨＢＶ特異的配列が含まれた。機能する捕捉オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ標的およびオリゴ（ｄＴ）を展示する磁気粒子と組み合わせると、ＨＢＶ ＤＮＡおよび粒子を架橋し、それによってＨＢＶ標的を固定した。微粒子複合体を溶液から除去することは、ＨＢＶテンプレートを濃縮する手段に相当した。以下に記載する方法において、捕捉オリゴヌクレオチドをＨＢＶ ＤＮＡおよびオリゴ（ｄＴ）で修飾した磁気粒子と接触させた。収集した粒子を洗浄し、結合したＨＢＶ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応で増幅し、そして生じた増幅産物を均質保護アッセイにおいて検出した。陽性結果によって、捕捉オリゴヌクレオチドが、標的捕捉工程中、磁気粒子上にＨＢＶ ＤＮＡ標的を固定し、そして増幅工程および検出工程が成功であったことが示された。

【0117】

以下の実施例は、候補ＨＢＶ捕捉オリゴヌクレオチドを試験するのに用いる方法を記載する。この方法で記載するＨＢＶ特異的標的捕捉、増幅プライマー、およびプローブに加えて、該反応にはまた、ＨＩＶ−１およびＨＣＶ解析物に特異的な上述のオリゴヌクレオチドも含まれた。ＨＩＶ−１およびＨＣＶオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ解析物の検出に実質的には寄与しなかった。

【0118】

（実施例３）
異なる捕捉オリゴヌクレオチドを用いたＨＢＶ標的配列の検出
５００μｌの体積を有し、そして６〜２０コピーのＨＢＶゲノムを含有する、ＨＢＶ感染血漿試料を、総量１．６ｐｍｏｌの捕捉オリゴヌクレオチド（１．６ｐｍｏｌの単一の捕捉オリゴヌクレオチド、各０．８ｐｍｏｌの２つの捕捉オリゴヌクレオチド、または各０．５３ｐｍｏｌの３つの捕捉オリゴヌクレオチドいずれか）、およびポリ（ｄＴ_１４）に共有結合した０．７〜１．０５μ常磁性粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ、インディアナ州インディアナポリス）約４０μｇを含有する溶解／捕捉試薬４００μｌ中に分散させた。該方法に用いた捕捉オリゴヌクレオチドは、表４に示す配列を有した。溶解／捕捉試薬は、ＨＩＶ−１内部増幅対照テンプレート、ＨＩＶ−１およびＨＣＶ特異的捕捉オリゴヌクレオチド、並びに２９４ｍＭラウリル硫酸リチウム、７３０ｍＭ塩化リチウム、および５０ｍＭ水酸化リチウムを含有する１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝溶液をさらに含んだ。上述のように、配列番号７１および配列番号８０の配列を含むものを除いて、表４に示す各捕捉オリゴヌクレオチドには、ＨＢＶ相補配列およびオリゴ（ｄＡ）テール領域間に、５’−ＴＴＴ−３’スペーサー配列を配置した。特に、５’−ＴＴＴ−３’配列の存在または非存在を除いて同一の配列を有するいくつかのオリゴヌクレオチドの試験は、実質的に類似の結果を生じ、それによって、スペーサー配列が任意であることが示された。混合物を５５〜６０℃に約１５〜３０分間加熱し、そして次いで、室温に冷却してハイブリダイゼーションを可能にした。Ｗａｎｇら、米国特許第４，８９５，６５０号に記載するものなどの方法を用いて、磁場を適用し、固定化捕捉オリゴヌクレオチドおよびＨＢＶ ＤＮＡを含有する粒子複合体を収集した。１ｍｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６．５ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチル−パラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピル−パラベン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム）で粒子を２回洗浄した。次いで、洗浄した粒子を、実施例２に記載する増幅試薬７５μｌに再懸濁した。この試薬には、塩、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、ＨＢＶ特異的プライマーとともに、ＨＩＶ−１およびＨＣＶ標的配列を増幅可能なプライマーが含まれた。次いで、ＨＢＶ標的核酸を増幅し、そして本質的に実施例１に記載するように、均質保護アッセイを用いて、増幅産物を検出した。内部対照単位複製配列に特異的なプローブと、またはＨＢＶ単位複製配列に特異的なプローブとハイブリダイズした際に陽性シグナルを生じる反応を、有効な実験とスコア付けした。有効な実験をＨＢＶ単位複製配列の存在に関して陽性と見なすためには、プローブハイブリダイゼーションを示す化学発光シグナルは、アッセイにおいて、５０，０００ＲＬＵを越えていなければならなかった。

【0119】

表７は、ＨＢＶ特異的捕捉オリゴヌクレオチド（単数または複数）の同一性、および系がＨＢＶ配列を有効に増幅し、そして検出する能力と相関する試料結果を示す。増幅反応において、陽性結果を達成するため、ＨＢＶ捕捉オリゴヌクレオチドは、増幅プライマーおよびプローブ（単数または複数）と協同で作用して、ＨＢＶテンプレート核酸を捕捉し、ＨＢＶテンプレート核酸を増幅し、そして次いで増幅した核酸を検出可能でなければならなかった。しかし、実験設計はまた、ＨＩＶ−１およびＨＣＶ標的核酸を増幅するのに用いるプライマーが、ＨＢＶテンプレート核酸の捕捉、増幅および検出に実質的に干渉しないことも必要とした。したがって、陽性結果は、ＨＢＶ特異的アッセイにおいてのみでなく、ＨＩＶ−１およびＨＣＶ標的核酸を増幅可能なマルチプレックス反応の背景においても機能する、捕捉オリゴヌクレオチド、増幅プライマーおよび検出プローブの組み合わせを同定した。

【0120】

特に、この方法で用い、そして表７に列挙するプロモーター−プライマーは、Ｔ７プロモーターを含む全長配列によって同定される。しかし、プロモーター−プライマーのＨＢＶ相補部分は、ポリメラーゼ連鎖反応などの代替プロトコルによって増幅反応を行うための必須配列に相当し、プロモーター配列は場合によることが理解されるものとする。したがって、配列番号３３〜４９は、場合によるプロモーター配列を所持し、そして対応する配列番号１６〜３２は、それぞれの必須ＨＢＶ相補配列に相当する。これらの後者のＨＢＶ相補配列は、ＨＢＶ核酸を増幅する、相対する鎖のプライマーと組み合わせて有用である。

【0121】

表７
異なる組み合わせの捕捉オリゴヌクレオチド、増幅プライマーおよび検出プローブを用いたＨＢＶ検出の効率

【0122】

【表7A】

【0123】

【表7B】

【0124】

【表7C】

【0125】

表７に示す結果によって、捕捉オリゴヌクレオチド、増幅プライマーおよび検出プローブの特定の組み合わせが、他のものより実質的により優れた結果を生じることが確認された。例えば、配列番号２３のＨＢＶ相補配列を含有するプロモーター−プライマー（すなわち配列番号４０）および配列番号１５の相対する鎖のプライマーは、２０コピーのＨＢＶテンプレートしか含有しない増幅反応の１００％で陽性結果を生じることが可能であった。これらのプライマーは、ＨＢＶ核酸を増幅するのに特に好ましい組み合わせに相当する。同様に、配列番号５４の上述のプローブ、並びに配列番号５０および配列番号５７のプローブの組み合わせは、非常に効率的な方式で、ＨＢＶ単位複製配列を検出可能であった。これらの配列を有するプローブ、またはこれらに相補的な配列を有するプローブが、ＨＢＶ核酸を検出するのに好ましい。

【0126】

表７に示す結果によって、捕捉オリゴヌクレオチド、増幅プライマーおよび検出プローブの特定の組み合わせが、マルチプレックス増幅系において、相乗的に働くことがさらに示された。例えば、配列番号７４および配列番号８６の捕捉オリゴヌクレオチド、配列番号１５の増幅プライマー、並びに配列番号２３のＨＢＶ相補配列を含有するプロモーター−プライマー（すなわち配列番号４０）を、配列番号５０および配列番号５７のプローブとともに用い、２０コピーのＨＢＶテンプレート核酸を用いて行った試験に関して示した結果によって、これらのプライマーおよびプローブが各々、有効な実験の１００％で、ＨＢＶテンプレート核酸を増幅し、そして検出することが可能であることが立証された。ＨＢＶテンプレート核酸２０コピーを含有する反応において、同一プライマーおよびプローブを、配列番号７１および配列番号８０に同定する捕捉オリゴヌクレオチドの１つのみと組み合わせて用いると、有効な実験のわずか約３０％でしか陽性結果が達成されなかった。しかし、配列番号７１および配列番号８０の配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドを、互いに組み合わせて用いると、各オリゴヌクレオチドが、単一の捕捉オリゴヌクレオチドのみを有する試験で用いた総量の半分しか存在しなくても、１００％に近づく、劇的により高い結果が達成された。これによって、インプット標的が非常に低いレベルであっても、アッセイ試薬の特定の組み合わせが、予期されぬ、優れた結果をどのように生じるかが立証された。

【0127】

実施例４は、発明されたオリゴヌクレオチドの特定のセットを用いて、本明細書に記載する、異なる増幅アッセイが、異なる感度範囲にどのように特徴付けられたかを例示する方法を記載する。この方法からの知見によって、増幅反応で用いたテンプレートのレベルが特定の閾値を越えた場合、増幅アッセイにおいて、１００％の陽性ＨＢＶ検出結果を得ることが可能であると確証された。以下に示す結果を本明細書の他の実施例の結果と比較することによって明らかであろうように、この閾値は、増幅反応に用いた特定の組み合わせのオリゴヌクレオチドに依存する。特に、この実施例に記載するアッセイは、配列番号５７のプローブが検出工程に用いる唯一のプローブである場合であっても、ＨＢＶ遺伝子型Ａ〜Ｇを検出した。

【0128】

（実施例４）
ＨＢＶ核酸の検出
ＨＩＶ−１およびＨＣＶ配列を増幅するのに必要なプライマーを省いたことを除いて、本質的に先行する実施例に記載するように、核酸増幅反応を行った。この方法に用いる捕捉オリゴヌクレオチドには、配列番号７１および配列番号８０のＨＢＶ相補配列が含まれた。増幅プライマーには、配列番号２２および配列番号２３の配列が含まれ、これらの配列は各々、その５’端に付加されたＴ７プロモーター配列を有した。プロモーター・プライマーの全長配列を、配列番号３９および配列番号４０に示した。相対する鎖のプライマーは、配列番号１５および配列番号１１に示す配列を有した。該方法で用いるアクリジニウムエステル標識プローブは、上述のような、配列番号５０および配列番号５７に示す配列を有した。ビリオン含有血漿５００μｌアリコットを、上述の界面活性剤溶解および標的捕捉法に供した。やはり上述の方法を用いて、増幅反応を行い、そして増幅産物を検出した。この方法でプロセシングした試料のビリオン濃度は、０〜１００ＥＵ／ｍｌの範囲であり、１ＥＵはＨＢＶゲノムおよそ３コピーに相当する。増幅反応におけるＨＢＶ標的配列の陽性検出を、本質的に先行する実施例に記載するように、評価した。

【0129】

表８に示す結果によって、３００コピーのＨＢＶテンプレートを用いて行った反応の１００％が陽性結果を生じ、そして反応あたり、７５〜１５０コピーの間のあるレベルでは、９５％の陽性が達成されることが示された。重要なことに、配列番号１５として同定するプライマーの非存在下で増幅反応を行うと、実質的に類似の結果が得られた。したがって、ＨＢＶ核酸を増幅するのに好ましいプライマーの組み合わせは、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号１１に示すＨＢＶ相補配列を有し、配列番号１５のプライマーは任意であった。ＨＢＶ増幅産物を検出するのに好ましいプローブ組成物には、配列番号５７のプローブが含まれ、配列番号５０のプローブをさらに包含するかどうかは、任意であった。

【0130】

表８
感度試験は、アッセイにおいて検出されるテンプレートレベルの範囲を確立する

【0131】

【表8】

【0132】

明記したレベルのインプット・テンプレートでは高レベルのＨＢＶ検出を生じなかった、表６および表７に列挙するプライマーの組み合わせであっても、テンプレートの量が十分に高ければ、１００％検出可能に近づくレベルで、ＨＢＶ含有試料を同定可能であったことが、表８の結果によってさらに確認された。これらの知見に基づいて、インプット・テンプレートの量が反応あたり６〜２０コピーの範囲であった場合に、少なくともＨＢＶ検出のある程度の測定値を生じたプライマーの組み合わせは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＢＶ核酸を増幅するための方法において、有用であると見なされると結論付けられる。いくつかの状況において、非常に高感度のアッセイを生じるプライマーの組み合わせを用いることが望ましい可能性があるが、他の状況では、いくぶんより低い感度によって特徴付けられるアッセイを用いることから利益が得られる可能性もある。したがって、表６および表７で測定可能な結果を生じる、本明細書に開示するプライマーの組み合わせいずれかは、ＨＢＶ核酸増幅アッセイの構成要素として使用可能であり、そして本発明の範囲内に属する。

【0133】

実施例５は、先行する実施例の定性的アッセイをどのように定量形式に適応可能であるかを例示する。３つのＨＢＶ遺伝子型Ａ陽性対照のスパイク回収は、アッセイ性能の定量的評価を提供した。該アッセイは、その開示が本明細書に援用される米国特許第６，２９４，３３８号記載の偽標的の使用に頼る。ＲＮＡまたはＤＮＡ偽標的いずれを定量的アッセイに使用することも可能であるが、以下の方法は、ＲＮＡ偽標的を用いて行われた。

【0134】

（実施例５）
ＨＢＶを測定する定量的アッセイ
定量的アッセイに用いたオリゴヌクレオチド構成要素は、配列番号５０のプローブを省いたことを除いて、先行する実施例に用いた試薬と同一であった。各増幅反応には、約８０ｘ１０^６コピーに対応する量の配列番号９７の配列を有するＲＮＡ偽標的がさらに含まれた。３８０〜１２，０００ＨＢＶ ＩＵ／ｍｌの範囲の濃度を有するＨＢＶ遺伝子型Ａ標準物質を、別個の反応において、ＨＢＶテンプレートの供給源として用いて、標準曲線を生じた。実質的に上に記載するように、６０分間の期間、ＴＭＡ反応を行った。１：６．２５の比のアクリジニウムエステル標識種および非標識種の組み合わせとして、配列番号５７の上述のプローブを使用する、標準的均質保護アッセイを用いて、増幅したＨＢＶ配列の検出を行った。非標識プローブの使用によって、すべての化学発光シグナルが、特異的にハイブリダイズしたプローブを測定する照度計の信頼可能な反応範囲内に属することが可能になった。偽標的単位複製配列は、この方法で用いたプローブによっては検出されなかった。

【0135】

図２に示す結果によって、定量的アッセイが、０〜１２，０００ＩＵ／ｍｌの広い範囲のＨＢＶ濃度に渡って、インプットＨＢＶテンプレートの量およびハイブリダイゼーションシグナル強度間の実質的に線形の関係をどのように生じるかが示された。このアッセイの検出下限は、単一増幅反応において、ＨＢＶ核酸約１ＩＵ／ｍｌ、または１〜２コピーであった。したがって、この定量的アッセイは、非常に高感度であり、そして非常に広い範囲に渡って正確な方式で、ＨＢＶ濃度、またはテンプレートコピー数を測定する能力を有した。

【0136】

実施例６は、ＴＭＡ反応における第二のプロモーター−プライマーの使用が、どのように、異なるＨＢＶ遺伝子型の検出可能性に陽性に影響を及ぼしうるかを立証する方法を記載する。この方法で記載するＨＢＶ特異的標的捕捉オリゴヌクレオチド、増幅プライマー、およびプローブに加えて、該反応にはまた、ＨＩＶ−１およびＨＣＶ解析物に特異的な上述のオリゴヌクレオチドも含まれた。ＨＩＶ−１およびＨＣＶオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ解析物の検出に実質的には寄与しなかった。

【0137】

（実施例６）
ＨＢＶ遺伝子型の改善された検出可能性
Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（フロリダ州フォート・ローダーデール）またはＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ（マサチューセッツ州ウェストブリッジウォーター）から、遺伝子型決定されたＨＢＶ含有試料（遺伝子型Ａ〜Ｆ）を得た。製造供給元の解析証明書によって、定量値が提供され、そしてこの値は、ＡＭＰＬＩＣＯＲ ＨＢＶ ＭＯＮＩＴＯＲアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）からの結果に基づいた。ＨＢＶ遺伝子型Ｇビリオンを含有する血漿試料がないため、配列番号８７を含む捕捉オリゴヌクレオチドを除いて、すべての相当するオリゴヌクレオチドに対応するＨＢＶ遺伝子型Ｇ核酸配列を含む、一本鎖Ｍ１３クローンが、この遺伝子型の配列を増幅する方法のテンプレートとして働いた。陰性ヒト血漿を用いた患者血漿試料の連続希釈によって、パネルメンバーを作成した。内部対照を含有する、標的捕捉試薬（配列番号７３、配列番号８０および配列番号８７のＨＢＶ相補配列を有する上述の捕捉オリゴヌクレオチドを、磁気粒子とともに含有する、ＨＥＰＥＳ緩衝界面活性剤溶液）４００μｌ、および各標本またはパネルメンバー５００μｌを、手動で、１０試験管単位（ＴＴＵ）にピペッティングした。標的捕捉試薬および標本を添加した後、ＴＴＵをボルテックスし、そして６０℃の水槽中、２０分間インキュベーションし、その後、室温（１５〜３０℃）で１４〜２０分間インキュベーションした。次いで、ＴＴＵのラックを磁気分離ベイに９〜２０分間入れた。各試験管から液体を吸引し、そして次いで、１ｍｌの洗浄溶液と交換した。ラックをボルテックスし、そして再び分離ベイに４〜１０分間入れた。各試験管から洗浄溶液を吸引し、そして洗浄工程および分離工程を反復し、最後の吸引で終えた。最終吸引工程後、７５μｌの増幅試薬（Ｔｒｉｓ緩衝溶液中の２つの異なるプライマー配合物の１つ、ｄＮＴＰ類、ＮＴＰ類および補助因子を含む）を各試験管に添加した。プライマー配合物Ａには、配列番号２３のＨＢＶ相補配列を有するプロモーター−プライマー（すなわち配列番号４０）とともに、配列番号１５および配列番号１１に同定する、相対する鎖のプライマーが含まれた。プライマー配合物Ｂには、配列番号２６のＨＢＶ相補配列を有するプロモーター−プライマー（すなわち配列番号４３）がさらに含まれた。各混合物に２００μｌの不活性油を上層して、増幅工程中の蒸発を妨げ、そしてＴＴＵのラックをボルテックスして、微小粒子を再懸濁した。２５μｌの酵素試薬（ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ緩衝溶液中のＭＭＬＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を添加する前に、ラックを水槽中、６０℃で１０分間インキュベーションし、その後、４１．５℃で９〜２０分間平衡化した。酵素試薬を添加した直後、ＴＴＵのラックをインキュベーターから取り出して、そして震蘯して混合した。次いで、ラックを水槽中、４１．５℃で６０分間インキュベーションした。増幅後、コハク酸緩衝界面活性溶液中、配列番号５４の上述のアクリジニウムエステル標識プローブを含むプローブ試薬１００μｌを各試験管に添加し、ボルテックスし、そして水槽中、６０℃で１５分間インキュベーションした。プローブハイブリダイゼーション工程の完了後、２５０μｌの選択試薬（界面活性剤を含むホウ酸緩衝溶液）を各試験管に添加した。試験管をボルテックスし、そして次いで、６０℃で１０分間インキュベーションした。６０℃の水槽から取り出した後、ＴＴＵのラックを水槽中、１９〜２７℃に１０〜７５分間冷却し、そして次いで、０．１％過酸化水素および１ｍＭ硝酸の溶液２００μｌ；および１Ｎ ＮａＯＨ ２００μｌを自動的に注入するよう設定したＬＥＡＤＥＲ ＨＣ＋照度計（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カリフォルニア州サンディエゴ）に入れた。反応性を決定するため、各１００試験管実験に含まれる陽性標準物質および陰性標準物質から生成したカットオフ値に、生じた化学発光を比較した。各標本反応のアッセイ性能を監視するため、標的捕捉試薬中に含有される内部対照を各試験標本に添加した。内部対照は、ＨＩＶ−１の一部および内部対照プローブに標的とされるユニークな配列を含有する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成転写物からなった。各反応中の内部対照シグナルは、異なる標識を持つプローブからの光放出の動力学が異なることによって、ＨＢＶシグナルとは区別された。迅速に光を放出させるプローブを用いて内部対照増幅産物を検出し、一方、より遅い光放出動力学を持つプローブを用いて、ＨＢＶに特異的な単位複製配列を検出した。照度計からのインプットを受け取ったソフトウェアは、２つのシグナル間を識別した。これらの方法の結果を表９に示す。

【0138】

表９
ＨＢＶ遺伝子型の改善された検出可能性

【0139】

【表9】

【0140】

表９に示す結果に示すように、２つのプロモーター−プライマーを含むプライマー配合物は、５０コピーレベルで異なるＨＢＶ遺伝子型各々を含有する試料の１００％において、好適にＨＢＶを検出した。これは、１つのプロモーター−プライマーしか含まない増幅反応において、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＧテンプレートを同じテンプレートコピーレベルで用いた場合には、あてはまらなかった。単一のプロモーター−プライマーおよびクローニングしたＨＢＶ遺伝子型Ｇテンプレートを用いて行ったＴＭＡ反応で得た陰性結果は、完全に一本鎖であるテンプレートを使用したための人為的結果であった。ＨＢＶ遺伝子型Ｇビリオンをテンプレート供給源として、そしてプライマー配合物Ｂをプライマー供給源として用いて行った別個の試験では、１５コピー／反応および５０コピー／反応の両方で、１００％の検出可能性を生じた。ＨＢＶ遺伝子型Ａ〜Ｇの核酸を非常に高感度な様式で増幅することが望ましい場合、反応において、２つの第一鎖プライマーおよび少なくとも１つの第二鎖プライマーを用いることが好ましい。特定の例において、ＨＢＶ遺伝子型Ａ〜Ｇの核酸を非常に高感度のＴＭＡ反応において増幅することが望ましい場合、反応において、２つのプロモーター・プライマーおよび少なくとも１つの非プロモーター・プライマーを用いることが好ましい。もちろん、１つの上流プライマーおよび１つの下流プライマーのみを用いて、熱周期プロトコルに基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応、または新たに合成された核酸鎖をテンプレートから物理的に分離する工程を伴う方法を行うことも可能である。

【0141】

以下の実施例は、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドの組み合わせを、ＨＩＶ−１およびＨＣＶ核酸各々を非常に高感度な様式で検出することも可能なマルチプレックス反応でも使用可能であることを示す証拠を提示する。

【0142】

実施例７は、ＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチド、並びに本明細書に開示する増幅プロトコルおよび検出プロトコルを用いて、ＨＩＶ−１標的核酸を検出する方法を記載する。

【0143】

（実施例７）
マルチプレックス増幅反応におけるＨＩＶ−１の検出
ＨＩＶ−１ ＷＨＯ標準サブタイプＢ（９７／６５６）の試料を、陰性ヒト血漿中に希釈して、０〜３００ＩＵ／ｍｌの範囲のウイルス力価を生じた。次いで、配列番号１００〜１１４のＨＩＶ−１特異的オリゴヌクレオチドとともに、配列番号１１５〜１２５のＨＣＶ特異的オリゴヌクレオチドおよびＨＢＶ特異的オリゴヌクレオチドを用いて、実施例２に記載する方法にしたがって、この希釈パネルの５００μｌ試料を、標本プロセシング、標的捕捉、増幅および検出に供した。ＨＩＶ−１特異的捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１１３〜１１４の配列を有した。配列番号１００〜１０１のＨＩＶ−１特異的プロモーター−プライマーは、それぞれ、上流プロモーター配列に付加された配列番号９８〜９９の必須ＨＩＶ相補配列を有した。相対する鎖のプライマーは、配列番号１０２〜１０３の配列を有した。プローブは、配列番号１０６〜１０８の配列を有した。ＨＣＶ特異的捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１２４〜１２５の配列を有した。配列番号１１６のＨＣＶ特異的プロモーター−プライマーは、上流プロモーター配列に付加された配列番号１１５の必須ＨＣＶ相補配列を有した。相対する鎖のプライマーは、配列番号１１７〜１１８の配列を有した。プローブは、配列番号１２０および１２２の配列を有した。この方法のＨＢＶ特異的オリゴヌクレオチドには、配列番号７３、配列番号８０および配列番号８７のＨＢＶ相補配列を有する捕捉オリゴヌクレオチド；配列番号４０、配列番号４３、配列番号１５および配列番号１１の増幅プライマー；および配列番号５４の上述のハイブリダイゼーション検出プローブが含まれた。配列番号４０および４３のＨＢＶ特異的プロモーター−プライマーは、それぞれ、上流プロモーター配列に付加された、配列番号２３および２６の必須ＨＢＶ相補配列を有した。２０の反復実験を行い、そして９５％の信頼区間で９５％検出可能性が測定された。方法の結果を表１０に示す。

【0144】

表１０
マルチプレックス増幅反応におけるＨＩＶ−１核酸の検出

【0145】

【表10】

【0146】

表１０に示す結果によって、ＨＣＶおよびＨＢＶ核酸もまた検出可能なマルチプレックス反応において、ＨＩＶ−１核酸が検出されることが明らかに示された。さらに、さらなる試験によって、このアッセイのＨＩＶ−１種／群検出可能性には、反応が１００コピー／ｍｌ以上のＨＩＶ−１を含有している場合、１００％陽性に近づくレベルのＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｎ群およびＯ群が含まれた。上に示すように、この方法で用いたＨＩＶ−１特異的オリゴヌクレオチドのコレクションを、ＨＩＶ−１を検出する独立型アッセイで、あるいはＨＣＶまたはＨＢＶに特異的なオリゴヌクレオチドと組み合わせて二重アッセイを生成して、用いることも可能である。

【0147】

実施例８は、ＨＣＶに特異的なオリゴヌクレオチド、並びに本明細書に開示する増幅プロトコルおよび検出プロトコルを用いて、ＨＣＶ標的核酸を検出する方法を記載する。
（実施例８）
マルチプレックス増幅反応におけるＨＣＶの検出
ＨＣＶ ＷＨＯ標準遺伝子型Ｉ（９６／７９０）の試料を、陰性ヒト血漿中に希釈して、０〜１００ＩＵ／ｍｌの範囲のウイルス力価を生じた。次いで、先の実施例に記載するオリゴヌクレオチドおよび方法を用いて、この希釈パネルの５００μｌ試料を、標本プロセシング、標的捕捉、増幅および検出に供した。２０の反復実験を行い、そして９５％の信頼区間で９５％検出可能性が測定された。方法の結果を表１１に示す。

【0148】

表１１
マルチプレックス増幅反応におけるＨＣＶ核酸の検出

【0149】

【表11】

【0150】

表１１に示す結果によって、ＨＩＶおよびＨＢＶ核酸もまた検出可能なマルチプレックス反応において、ＨＣＶ核酸が検出されることが明らかに示された。さらに、さらなる試験によって、反応が１００コピー／ｍｌ以上のＨＣＶを含有している場合、ＨＣＶ遺伝子型１、１ｂ、２ｂ、２ａ／ｃ、３、３ｅ、４、４ａ、４ｂ／ｃ、５、５ａ、６、６ａはすべて、１００％陽性で検出されることが示された。上に示すように、この方法で用いたＨＣＶ特異的オリゴヌクレオチドのコレクションを、ＨＣＶを検出する独立型アッセイで、あるいはＨＩＶまたはＨＢＶに特異的なオリゴヌクレオチドと組み合わせて二重アッセイを生成して、用いることも可能である。

【0151】

実施例９は、ＨＢＶに特異的なオリゴヌクレオチド、並びに本明細書に開示する増幅プロトコルおよび検出プロトコルを用いて、ＨＢＶ標的核酸を検出する方法を記載する。以下に提示する実験結果は、このアッセイの感度を定量的に例示する。

【0152】

（実施例９）
マルチプレックス増幅反応におけるＨＢＶの検出
ＨＢＶ ＷＨＯ標準遺伝子型Ａ（９７／７４６）の試料を、陰性ヒト血漿中に希釈して、０〜４５ＩＵ／ｍｌの範囲のウイルス力価を生じた。次いで、実施例７に記載するオリゴヌクレオチドおよび方法を用いて、この希釈パネルの５００μｌ試料を、標本プロセシング、標的捕捉、増幅および検出に供した。８０の反復実験を行い、そして９５％の信頼区間で９５％検出可能性が測定された。方法の結果を表１２に示す。

【0153】

表１２
マルチプレックス増幅反応におけるＨＢＶ核酸の検出

【0154】

【表12】

【0155】

表１２に示す結果によって、ＨＩＶ−１およびＨＣＶ核酸もまた検出可能なマルチプレックス反応において、ＨＢＶ核酸が検出されることが明らかに示された。さらに、ＨＢＶ遺伝子型Ａ〜Ｇの核酸はすべて、このアッセイで検出可能であった。上に示すように、この方法で用いたＨＢＶ特異的オリゴヌクレオチドのコレクションを、ＨＢＶを検出する独立型アッセイで、あるいはＨＩＶまたはＨＣＶに特異的なオリゴヌクレオチドと組み合わせて二重アッセイを生成して、用いることも可能である。

【0156】

上述の解析物検出系の汎用性をさらに例示するため、単位複製配列産生を、「リアルタイム」増幅法において、時間の関数として、監視した。増幅反応に含まれる単位複製配列特異的分子ビーコンは、単位複製配列合成を連続して監視する手段を提供した。時間とともに蛍光放出が増加することから、分子ビーコンにハイブリダイズし、そしてプローブの「開いた」コンホメーションへの検出可能な推移を引き起こす単位複製配列が産生されたことが示された。

【0157】

分子ビーコンは、標的相補ループ配列、標的の非存在下で相補塩基対形成によって相互作用して「ステム」構造（すなわち「閉じた」コンホメーション）を形成する親和性対（または核酸「アーム」）、およびプローブが閉じたコンホメーションにある際に相互作用する標識対のセットを含んでなる。標的核酸およびプローブの標的相補配列のハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離させて、それによってプローブを開いたコンホメーションにシフトさせる。このシフトは、例えば蛍光体および消光剤であることも可能な、標識対のメンバー間の相互作用減少のため、検出可能である。分子ビーコンは、米国特許第５，９２５，５１７号に完全に記載され、該特許文書の開示は本明細書に援用される。

【0158】

商業的に入手可能なソフトウェアを用いて、ＨＢＶ、ＨＩＶ−１またはＨＣＶ単位複製配列に特異的な分子ビーコンを用いて得られる、時間に依存する結果を解析した。これらの解析物からの結果によって、増幅反応に含まれる標的コピー数、および蛍光シグナルがバックグラウンド閾値を越える時間（すなわちバックグラウンドを越える「発生時間」）の間に、強い線形の関係が示された。以下に提示する結果によって確認されるように、これらの方法は、非常に広い範囲に渡って、解析物標的量を定量化するのに有用であった。より具体的には、既知の量の解析物ポリヌクレオチドを標準物質標準として用いる場合、測定された発生時間を標準的プロットと比較することによって、試験試料に存在する解析物の量を決定することが可能である。

【0159】

増幅および検出が同時に行われるように、以下に記載する方法で用いる増幅反応が、一定の温度で、そして別個の検出工程のための中断を伴わずに行われる事実から、分子ビーコンには厳しい必要条件が課せられた。より具体的には、方法の成功は、単位複製配列が指数的増幅機構のテンプレートとして続いて使用されるのを阻害することなく、分子ビーコンが単位複製配列に結合することを必要とした。実際、分子ビーコンの存在下で、増幅反応が効率的に進行可能であるという知見によって、標的とプローブの相互作用が、増幅反応を不可逆的に阻害しないか、また損なわないことが示された。

【0160】

実施例１０は、各々相互作用する蛍光体／消光剤対で標識された分子ビーコンプローブを用いて、ＴＭＡ反応において、時間に依存する単位複製配列産生を監視する方法を記載する。この実施例に記載する分子ビーコンは、増幅した核酸産物の一方の鎖にしかハイブリダイズしないが、相補プローブ配列もまた、相対する核酸鎖にハイブリダイズすると予測され、そしてしたがって、本発明の範囲内に属する。

【0161】

（実施例１０）
単位複製配列産生のリアルタイム監視
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（カリフォルニア州フォスターシティー）ＥＸＰＥＤＩＴＥモデル８９０９自動化合成装置上、３’消光剤連結調節孔ガラス（ＣＰＧ）および５’蛍光体標識ホスホロアミダイトを用いて、標準的固相ホスファイトトリエステル化学反応によって、ＨＢＶ、ＨＩＶ−１またはＨＣＶ単位複製配列に結合特異性を有する分子ビーコンを合成した。分子ビーコンを構築するのに用いた蛍光体には、フルオレセイン、ＲＯＸおよびＣＹ５色素が含まれた。ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ２（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；カリフォルニア州ナバト）およびＤＡＢＣＹＬを消光剤として用いた。２’−メトキシヌクレオチド類似体を用いて、すべての分子ビーコンを構築した。Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（バージニア州スターリング）から、ＣＰＧおよびホスホロアミダイト試薬を購入した。合成後、濃水酸化アンモニウム（３０％）を６０℃で２時間用いる処理によって、プローブを脱保護し、そして固体支持体マトリックスから切断した。次に、一般レベルの技術を有する当業者によく知られるであろう標準法を用いて、ポリアクリルアミド電気泳動後、ＨＰＬＣを用いて、プローブを精製した。

【0162】

該方法で用いたＨＢＶ、ＨＩＶ−１およびＨＣＶ核酸標的は、既知の濃度の人工的標的または合成標的であった。ＨＢＶ標的は、各プライマーに対応するかまたは相補的な配列を含む、ＨＢＶゲノムの一部を含有する一本鎖Ｍ１３クローンであった。ＨＩＶ−１標的は合成転写物であった。ＨＣＶ標的は、ＨＣＶゲノム配列を含むＡＲＭＯＲＥＤ ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．；テキサス州オースティン）であった。ＡＲＭＯＲＥＤ ＲＮＡ（登録商標）技術は、特異的ＲＮＡ配列およびウイルスコートタンパク質を偽ウイルス粒子に集合させることによって、リボヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ対照および標準を産生するために用いられる。分子ビーコンを約１．５ｐｍｏｌ／反応のレベルで用いた。ＨＢＶを増幅する反応は、５ｘ１０^２〜５ｘ１０^９テンプレートコピー／反応を含有した。ＨＩＶ−１を増幅する反応は、５ｘ１０^１〜５ｘ１０^６テンプレートコピー／反応を含有した。ＨＣＶを増幅する反応は、５〜５ｘ１０^８テンプレートコピー／反応を含有した。

【0163】

本質的に実施例２に記載するような塩および試薬、標的ポリヌクレオチド、並びに分子ビーコンを含む１５μｌの緩衝溶液を含有する試験管にまず、１５μｌの不活性油を上層して蒸発を妨げた。次いで、試験管を乾燥熱ブロック中、６０℃で１０分間インキュベーションして、プライマーアニーリングを促進した。ＨＢＶ標的を増幅するプライマーは、配列番号２３、配列番号２６、配列番号１５および配列番号１１の標的相補配列を有した。ＨＩＶ−１標的を増幅するプライマーは、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３および配列番号１０２の標的相補配列を有した。ＨＣＶ標的を増幅するプライマーは、配列番号１１５、配列番号１１７および配列番号１１８の標的相補配列を有した。特に、ＨＢＶ特異的分子ビーコンを試験するのに用いた増幅反応には、３つの標的すべてを増幅するためのプライマーすべてが含まれた。ＨＩＶ−１およびＨＣＶ特異的分子ビーコンを試験するのに用いた増幅反応には、これらの標的両方を増幅するためのプライマーがすべて含まれたが、ＨＢＶ標的を増幅するためのプライマーは含まれなかった。もちろん、以下に記載する分子ビーコンはいずれも、いかなる組み合わせのプライマーを含む増幅反応でも使用可能であると意図される。６０℃のインキュベーション工程に続いて、試験管を４２℃の熱ブロックに移し、そして次いで１０分間インキュベーションした。マルチチャネルピペッターを用いて、ＭＭＬＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素両方を含む酵素試薬の５μｌアリコットを各試験管に添加した。試験管を簡単にボルテックスし、そして次いで、あらかじめ４２℃に温めておいたＲＯＴＯＲＧＥＮＥ−２０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；オーストラリア・シドニー）ローターに移した。４２℃で増幅反応を行い、蛍光読み取りを３０秒ごとに行い、そしてＲＯＴＯＲＧＥＮＥ−２０００装置とバンドリングされた標準的ソフトウェアを用いて、結果をリアルタイムで解析した。

【0164】

表１３は、本発明の開発中に用いた、ＨＢＶ特異的分子ビーコンの標的相補ループ配列を示す。分子ビーコンは各々、付加された５’ＣＣＧＡＧアーム配列、および付加された３’ＣＵＣＧＧアーム配列を含んだ。各プローブは、５’端にＣＹ５蛍光体を、そして３’端にＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ ２部分を含んだ。ＨＢＶ特異的分子ビーコンはすべて、長さ１２〜２０ヌクレオチドであり、そして配列ＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号１２６）内に含有される１２〜２０の隣接ヌクレオチドを含む、標的相補ループ配列を有し、ヌクレオチド類似体並びにＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物の存在が可能であった。

【0165】

表１３
ＨＢＶ特異的分子ビーコンの標的相補ループ配列

【0166】

【表13】

【0167】

表１４に示す結果によって、ＨＢＶ特異的分子ビーコンの１つを含む増幅反応は、望ましいことに、時間とともに増加する蛍光シグナルを生じることが確認された。すべての結果は、３つ組で行う反応に基づいた。重要なことに、異なる分子ビーコンは、リアルタイムアッセイ形式で、いくぶん異なって振る舞った。例えば、配列番号１２７の標的相補ループ配列を有する非常に好ましい分子ビーコンを含む反応は、標的数が多いと迅速な検出を生じ、そして試験したインプット標的レベルのすべての範囲に渡って、対数プロット上、蛍光シグナルおよび標的量間に、強い線形の関係を生じた（図３を参照されたい）。このプローブを用いて得られた発生時間の読み取りの変動計数（ＣＶ）は、３．２％以下であり、これによって、データ点間の正確さが非常に高レベルであることが示された。配列番号１３３の標的相補ループ配列を有する分子ビーコンを含む反応は、異なる反応特性を示し、低い標的レベルでのプローブ反応のため、試験した標的インプットレベルの範囲に渡って、いくぶん、より線形でなかった。この後者のプローブは、５，０００コピーより多いＨＢＶのＨＢＶ標的量を検出し、そして定量化するのに特に有用であろう。

【0168】

表１４
異なる分子ビーコンの測定された発生時間

【0169】

【表14】

【0170】

「ＮＴ」＝未試験
「ＮＤ」＝検出されない
^＊＝３回の反復実験のうち１回のみが反応性
^＊＊＝３回の反復実験のうち２回のみが反応性
表１５は、本発明の開発中に用いたＨＩＶ特異的分子ビーコンの標的相補ループ配列を示す。配列番号１３４の標的相補ループ配列を有する分子ビーコンは、付加された５’ＣＣＧＡＧアーム配列、および付加された３’ＣＵＣＧＧアーム配列を含んだ。このプローブは、５’端にＲＯＸ蛍光体を、そして３’端にＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ ２消光剤部分を含んだ。関連する分子ビーコンは、同一の標的相補ループ配列を有したが、全体の配列５’−ＣＣＧＡＧＡＧＧＧＵＡＣＡＧＵＧＣＡＧＧＧＧＵＣＵＣＧＧ−３’（配列番号１３５）を有した。上述のＨＩＶ特異的分子ビーコンと比較すると、このプローブのアームは各々、該プローブの標的相補ループ配列にすぐ隣接した単一のさらなるヌクレオチドを含んだ。このプローブはまた、５’端にフルオレセイン蛍光体（ＲＯＸの代わり）を、そして３’端にＤＡＢＣＹＬ消光剤部分（ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ２ ＱＵＥＮＣＨＥＲ ２の代わり）も含んだ。配列番号１３６の標的相補ループ配列を有する分子ビーコンは、付加された５’ＣＣＧＡＧＡアーム配列、および付加された３’ＵＣＵＣＧＧアーム配列を含んだ。このプローブはまた、５’端にフルオレセイン蛍光体を、そして３’端にＤＡＢＣＹＬ消光剤部分も含んだ。これらの方法に用いた分子ビーコンは、長さ１６〜１７ヌクレオチドであり、そして配列ＧＧＧＧＴＡＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧ（配列番号１３７）内に含有される１６〜１７の隣接ヌクレオチドを含む、標的相補ループ配列を有し、ヌクレオチド類似体並びにＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物の存在が可能であった。

【0171】

表１５
ＨＩＶ特異的分子ビーコンの標的相補ループ配列

【0172】

【表15】

【0173】

表１６に示す結果によって、ＨＩＶ特異的分子ビーコンの１つを含む増幅反応は、望ましいことに、時間とともに増加する蛍光シグナルを生じることが確認された。配列番号１３４の標的相補ループ配列を含む分子ビーコンは、低い標的レベルで、迅速な検出を可能にした。このプローブを含む反応を３つ組で行い、そしてこの反応は、ＨＩＶ−１標的の５ｘ１０^１〜５ｘ１０^５コピー／反応に渡る、少なくとも４対数の有用な動的範囲で、インプット標的レベルおよび蛍光シグナル間の強い線形の関係を示した。結果を表に示していないが、さらなる試験によって、この分子ビーコンを含む反応の動的範囲は、ＨＩＶ−１標的の５ｘ１０^７または５ｘ１０^８コピー／反応までに渡ることが示された。配列番号１３５の配列を有する分子ビーコンは、発生時間に対するインプット標的量の対数グラフ上、二相性のプロットを示した。これらの反応を５つの反復実験で行い、ＨＩＶ−１標的の５ｘ１０^３〜５ｘ１０^６コピー／反応の範囲で、インプット標的量および発生時間間の強い線形の関係が示され、そして５ｘ１０^１〜５ｘ１０^３コピー／反応の範囲で、いくぶんより弱い線形の関係が示された。この分子ビーコンは、リアルタイムアッセイにおいて、より高い範囲の標的量を定量化するのに特に有用であるが、ＨＩＶ−１テンプレートの５ｘ１０^１〜５ｘ１０^６コピー／反応に渡る範囲を含む、少なくとも５対数の有用な動的範囲を示した。配列番号１３６の標的相補ループ配列を有する分子ビーコンを含む反応を３つ組で行い、そしてこの反応は、ＨＩＶ−１標的の５ｘ１０^２〜５ｘ１０^５コピー／反応に渡る、少なくとも３対数の有用な動的範囲で、インプット標的レベルおよび蛍光シグナル間の強い線形の関係を示した。興味深いことに、この分子ビーコンを含む増幅反応は、他の２つのＨＩＶ特異的分子ビーコンいずれかを含む反応に比較した際、低い標的量を検出するのに、わずかに長い時間を必要とした。

【0174】

表１６
異なる分子ビーコンの測定された発生時間

【0175】

【表16】

【0176】

「ＮＴ」＝未試験
「ＮＤ」＝検出されない
表１７は、本発明の開発中に用いたＨＣＶ特異的分子ビーコンの標的相補ループ配列を示す。配列番号１３８の標的相補ループ配列を含む分子ビーコンは、付加された５’ＣＣＧＡＧＧアーム配列、および付加された３’ＣＣＵＣＧアーム配列を含んだ。この分子ビーコンは、５’端にＣＹ５蛍光体を、そして３’端にＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ ２部分を含んだ。配列番号１３９の標的相補ループ配列を含む分子ビーコンは、付加された５’ＣＣＧＡＧアーム配列、および付加された３’ＣＵＣＧＧアーム配列を含んだ。この分子ビーコンは、５’端のフルオレセイン蛍光体で、そして３’端のＤＡＢＣＹＬ部分で標識された。配列番号１４０の標的相補ループ配列を含む分子ビーコンは、付加された５’ＣＧＧＡＣアーム配列、および付加された３’ＧＵＣＣＧアーム配列を含んだ。この分子ビーコンは、５’端のＣＹ５蛍光体で、そして３’端のＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ ２部分で標識された。配列番号１３８、配列番号１３９および配列番号１４０の標的相補ループ配列を含むプローブの標的相補ループ配列を宿する分子ビーコンを、それぞれ、５回、３回および４回の反復実験で試験した。これらの方法に用いた分子ビーコンはすべて、長さ１０〜１４ヌクレオチドであり、そして配列ＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣ（配列番号１４１）内に含有される１０〜１４の隣接ヌクレオチドを含む、標的相補ループ配列を有し、ヌクレオチド類似体並びにＲＮＡ均等物およびＤＮＡ均等物の存在が可能であった。

【0177】

表１７
ＨＣＶ特異的分子ビーコンの標的相補ループ配列

【0178】

【表17】

【0179】

表１８に示す結果によって、ＨＣＶ特異的分子ビーコンの１つを含む増幅反応は、望ましいことに、時間とともに増加する蛍光シグナルを生じることが確認された。配列番号１３８の標的相補ループ配列を有する分子ビーコンを含む反応は、約６対数の有用な動的範囲を示し、ＨＣＶテンプレートの５ｘ１０^１〜５ｘ１０^７コピー／反応に渡る標的量範囲で、優れた結果が達成された。配列番号１３９の標的相補ループ配列を有する分子ビーコンを含む反応は、約７対数の有用な動的範囲を示し、ＨＣＶテンプレートの約５ｘ１０^１〜５ｘ１０^８コピー／反応の範囲で、優れた結果が達成された。配列番号１４０の標的相補ループ配列を有する分子ビーコンを含む反応は、約８対数の有用な動的範囲を示し、ＨＣＶテンプレートの約５〜５ｘ１０^８コピー／反応の全範囲に渡って、素晴らしい結果が達成された。

【0180】

表１８
異なる分子ビーコンの測定された発生時間

【0181】

【表18】

【0182】

「ＮＴ」＝未試験
^＊＝３回の反復実験のうち１回のみが反応性
^＊＊＝４回の反復実験のうち３回のみが反応性
本発明は、いくつかの特定の実施例およびその態様に関して記載されている。もちろん、前述の詳細な説明を概観すれば、本発明のいくつかの異なる態様が、一般の技術を有する当業者に示唆されるであろう。したがって、本発明の真の範囲は、付随する請求項を参照して、決定すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]