特許 5963748 中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後予測方法、キット及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5963748

(24)【登録日】2016年7月8日

(45)【発行日】2016年8月3日

(54)【発明の名称】中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後予測方法、キット及び使用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20160721BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160721BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   C12N15/00 A

【請求項の数】13

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2013-523999(P2013-523999)

(86)(22)【出願日】2012年7月13日

(86)【国際出願番号】JP2012067922

(87)【国際公開番号】WO2013008911

(87)【国際公開日】20130117

【審査請求日】2015年7月10日

(31)【優先権主張番号】特願2011-154664(P2011-154664)

(32)【優先日】2011年7月13日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2011-271087(P2011-271087)

(32)【優先日】2011年12月12日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2011-277473(P2011-277473)

(32)【優先日】2011年12月19日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2012-34695(P2012-34695)

(32)【優先日】2012年2月21日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】509349141

【氏名又は名称】京都府公立大学法人

(73)【特許権者】

【識別番号】304027279

【氏名又は名称】国立大学法人 新潟大学

(73)【特許権者】

【識別番号】304020177

【氏名又は名称】国立大学法人山口大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】山中 龍也

(72)【発明者】

【氏名】岩立 康男

(72)【発明者】

【氏名】藤井 幸彦

(72)【発明者】

【氏名】角間 辰之

(72)【発明者】

【氏名】川口 淳

(72)【発明者】

【氏名】梶原 浩司

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 成田善孝, 他，悪性脳腫瘍の髄液蛋白・組織プロテオミクス解析による新規診断マーカーの開発，希少がん(悪性脳腫瘍)の個別適正化治療のためのTRI(Translational Research Informatics)システムの構築に，2008, p.11-16

【文献】 JIANG, H., et al.，Joint analysis of two microarray gene-expression data sets to select lung adenocarcinoma marker gene，BMC Bioinformatics.，2004, vol.5, no.81，p.1/12-12/12

【文献】 MA, Y., et al，Population-based molecular prognosis of breast cancer by transcriptional profiling.，Clin. Cancer Res.，2007, vol.13，p.2014-2022

【文献】 ISHWARAN, H., et al.，Random survival forests for high-dimensional data.，Stat. Anal. Data Mining，vol.4，p.115-132，published online January 2011

【文献】 ISHWARAN, H., et al.，High-dimensional variable selection for survival data.，J. Amer. Stat. Assoc.，2010, vol.105，p.205-217

【文献】 下川敏雄, 他，生存時間研究における調整型ランダムフォーレスト法，電子情報通信学会技術研究報告，2010, vol.110，p.71-77

【文献】 SUNG, C.O., et al.，Genomic profiling combined with gene expression profiling in primary central nervous system lymphoma，Blood，Jan. 2011, vol.117, no.4，p.1291-1300

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測する方法であって、
該患者から採取された試料において、遺伝子ＢＲＣＡ１の発現レベルを測定する工程、及びＢＲＣＡ１の発現がＰＯＳＩＴＩＶＥである場合に予後が不良であると予測し、ＢＲＣＡ１の発現がＮＥＧＡＴＩＶＥである場合に予後が良好であると予測する工程を含む、方法。

【請求項2】

少なくとも以下の６遺伝子：
ＢＲＣＡ１、ＲＯＣＫ１、ＦＡＮＣＡ、ＺＮＦ６８１、ＰＰＰ３Ｒ１、ＲＢＢＰ８の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ＲＢＢＰ８とＢＲＣＡ１とＰＰＰ３Ｒ１の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

さらに年齢及び一般全身状態（ＫＰＳ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を評価する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項6】

ＲＢＢＰ８とＢＲＣＡ１とＰＰＰ３Ｒ１の発現レベルを測定する工程、年齢と一般全身状態（ＫＰＳ）を評価する工程を含み、これら５つの因子に基づき中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測することを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項7】

以下の２３遺伝子：
ＧＬＯＤ４、ＺＮＦ６８１、ＡＦＡＰ１ＡＳ、ＲＢＢＰ８、ＥＰＣＡＭ、ＦＡＮＣＡ、ＰＧＡＭ１、ＲＯＣＫ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＳＣ４ＭＯＬ、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＡＴＡＤ１、ＰＰＭ１Ｅ、ＮＵＢＰＬ、ＢＲＣＡ１、ＧＧＨ、ＮＥＸＮ、ＧＡＰＤＨ、ＧＮＡＳＡＳ、ＤＮＡＪＣ１２、ＰＰＰ３Ｒ１、ＳＴＩＬ、ＴＲＭＴ６
全ての発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記遺伝子の発現レベルを統計処理し、予測生存関数を算出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記遺伝子の発現レベルと年齢及び一般全身状態（ＫＰＳ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を評価レベルを統計処理し、予測生存関数を算出する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。

【請求項10】

下記の予後予測式

【数1】

を用いてＺ_１を算出し、Ｚの値に基づいて予後を予測する、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

下記の予後予測式

【数2】

（ここでＡＧＥは年齢値、ＫＰＳとは７０以上であれば１，以下なら０、ＰＰＰ３Ｒ１，ＢＲＣＡ１，ＲＢＢＰ８とは免疫組織化学染色で１ポイント以上なら１，０ポイントなら０）
を用いてＺ_２を算出し、Ｚ_２の値に基づいて予後を予測する、請求項６に記載の方法。

【請求項12】

中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測するためのキットであって、遺伝子ＢＲＣＡ１に対するプローブまたはプライマーを含む、請求項１に記載の方法に用いるためのキット。

【請求項13】

中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測するための遺伝子ＢＲＣＡ１の使用であって、請求項１に記載の方法に用いるための使用。

【請求項14】

予後の予測が生存期間の予測である、請求項１３に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１１年７月１３日に出願された日本国特許出願第２０１１−１５４６６４号明細書、２０１１年１２月１２日に出願された日本国特許出願第２０１１−２７１０８７号明細書、２０１１年１２月１９日に出願された日本国特許出願第２０１１−２７７４７３号明細書及び２０１２年２月２１日に出願された日本国特許出願第２０１２−０３４６９５号明細書（これらの開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。

【0002】

本発明は、中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測する方法、ならびに前記方法に用いるキット、予後予測式及び使用に関する。

【背景技術】

【0003】

中枢神経原発悪性リンパ腫患者の診断は、従来病理組織学的診断を基本になされていた。しかしながら、診断区分内にも依然として多くの個体差が存在し、正確な予後予測ができていなかった。それゆえ、中枢神経原発悪性リンパ腫のさらなる予後予測マーカーが必要とされている。

【0004】

中枢神経原発悪性リンパ腫は中枢神経系に原発する節外性非ホジキン型リンパ腫で、多くは瀰漫性大細胞性B細胞リンパ腫である。 この疾患に対しては標準治療であるHigh dose Methotrexate（HD-MTX）の化学療法と放射線療法が行われている。一般的にはその2年生存率は60-65％、生存期間中央値は33-39.5か月である。しかしながら、本発明者が臨床に携わる中で、同じB細胞型の中枢神経原発悪性リンパ腫でありながら５年以上の長期生存する症例群と１-２年で再発死亡する予後不良症例群が存在することを経験している（非特許文献１）。予後不良症例群ではHD-MTXだけでなく、より積極的な治療（非特許文献２）を行う必要があり、これらの予後良好群と不良群とを区別する診断マーカーの開発が強く望まれる。

【0005】

中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後不良と関連する因子に関しては１）年齢６０歳以上、２）入院時のKernofsky performance statusが不良、３）血清中のLDH値が高値、４）髄液中の蛋白量が高値、５）腫瘍が画像上で脳深部に存在するなどとする報告も見られるが（非特許文献３）、実際には予後予測の指標となる適切なマーカーがないというのが諸家の見解である。

【0006】

近年、マイクロアレイ技術による、各種癌の分類（非特許文献４−６）、脳腫瘍サブクラスの同定（非特許文献７−１５）、分子マーカーの発見（非特許文献１６−２３）、疾患の予後予測（非特許文献２４−２７）が可能となってきている。病理組織学的診断と異なり、分子診断は診断時の腫瘍の遺伝子発現プロファイルに基づき個人の長期的な転帰を予測することができ、臨床医が最適な臨床判断を行う助けとなる。その代表例として、乳癌におけるOncotype DX診断キットがあげられる。これは発現プロファイルによる治療方針の決定を行い、乳癌の術後５年以内の転移リスクを評価し、術後補助化学療法追加の選択に資するものであり、FDAから認可され臨床で利用されている（非特許文献２８）。

【0007】

中枢神経原発悪性リンパ腫患者の腫瘍組織を用いた遺伝子発現解析は数編の報告が見られるが（非特許文献２９-３１）、いずれも１０-２０数症例の少数例の解析から腫瘍に高発現する遺伝子を同定するのにとどまり、遺伝子発現解析から予後を検討する報告は認められない。本発明者の方法により中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を正確に判定できる可能性が示唆され、患者に大きな利益がもたらされるものと期待される。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Yamanaka R, Morii K, Shinbo Y, et al. Results of treatment of 112 cases of primary CNS lymphoma. Jpn J Clin Oncol 2008;38(5):373-380.

【非特許文献2】Soussain C, Hoang-Xuan K, Taillandier L, et al. Intensive chemotherapy followed by hematopoietic stem-cell rescue for refractory and recurrent primary CNS and intraocular lymphoma: Societe Francaise de Greffe de Moelle Osseuse-Therapie Cellulaire. J Clin Oncol 2009;26(15):2512-2518

【非特許文献3】Ferreri AJ, Blay JY, Reni M, et al. Prognostic scoring system for primary CNS lymphomas: the International Extranodal Lymphoma Study Group experience. J Clin Oncol. 2003;21(2):266-272.

【非特許文献4】Ramaswamy S, Tamayo P, Rifkin R, et al. Multiclass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98: 15149-15154.

【非特許文献5】Rickman DS, Bobek MP, Misek DE, et al. Distinctive molecular profiles of high-grade and low-grade gliomas based on oligonucleotide microarray analysis. Cancer Res 2001;61:6885-6891.

【非特許文献6】Kim S, Dougherty ER, Shmulevich I, et al. Identification of combination gene sets for glioma classification. Mol Cancer Ther 2002;1:1229-1236.

【非特許文献7】Khan J, Wei JS, Ringner M, et al. Classification and diagnostic prediction of cancers using gene expression profiling and artificial neural networks. Nat Med 2001;7:673-679.

【非特許文献8】Mischel PS, Shai R, Shi T, et al. Identification of molecular subtypes of glioblastoma by gene expression profiling. Oncogene 2003;22:2361-2373.

【非特許文献9】Nigro JM, Misra A, Zhang L, et al. Integrated array-comparative genomic hybridization and expression array profiles identify clinically relevant molecular subtypes of glioblastoma. Cancer Res 2005;65:1678-1686.

【非特許文献10】Shai R, Shi T, Kremen TJ, et al. Gene expression profiling identifies molecular subtypes of gliomas. Oncogene 2003;22:4918-4923.

【非特許文献11】Sorlie T, Tibshirani R, Parker J, et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:8418-8423.

【非特許文献12】Liang Y, Diehn M, Watson N,et al. Gene expression profiling reveals molecularly and clinically distinct subtypes of glioblastoma multiforme. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:5814-5819.

【非特許文献13】Wong KK, Chang YM, Tsang YT, et al. Expression analysis of juvenile pilocytic astrocytomas by oligonucleotide microarray reveals two potential subgroups. Cancer Res 2005;65:76-84.

【非特許文献14】Shirahata M, Iwao-Koizumi K, Saito S, et al. Gene expression-based molecular diagnostic system for malignant gliomas is superior to histological diagnosis. Clin Cancer Res 2007;13:7341-7356.

【非特許文献15】Li A, Walling J, Ahn S,et al. Unsupervised analysis of transcriptomic profiles reveals six glioma subtypes. Cancer Res 2009;69:2091-2099.

【非特許文献16】Sallinen SL, Sallinen PK, Haapasalo HK, et al. Identification of differentially expressed genes in human gliomas by DNA microarray and tissue chip techniques. Cancer Res 2000;60:6617-6622.

【非特許文献17】Godard S, Getz G, Delorenzi M, et al. Classification of human astrocytic gliomas on the basis of gene expression: a correlated group of genes with angiogenic activity emerges as a strong predictor of subtypes. Cancer Res 2003; 63:6613-6625.

【非特許文献18】Rich JN, Hans C, Jones B, et al. Gene expression profiling and genetic markers in glioblastoma survival. Cancer Res 2005;65:4051-4058.

【非特許文献19】Somasundaram K, Reddy SP, Vinnakota K, et al. Upregulation of ASCL1 and inhibition of Notch signaling pathway characterize progressive astrocytoma. Oncogene 2005; 24:7073-7083.

【非特許文献20】Horvath S, Zhang B, Carlson M, et al. Analysis of oncogenic signaling networks in glioblastoma identifies ASPM as a molecular target. Proc Natl Acad Sci U S A 2006 ;103:17402-17407.

【非特許文献21】Yamanaka R, Arao T, Yajima N, et al. Identification of expressed genes characterizing long-term survival in malignant glioma patients. Oncogene 2006;25:5994-6002.

【非特許文献22】Soroceanu L, Kharbanda S, Chen R, et al. Identification of IGF2 signaling through phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 3 as a growth-promoting axis in glioblastoma. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:3466-3471.

【非特許文献23】Reddy SP, Britto R, Vinnakota K, et al. Novel glioblastoma markers with diagnostic and prognostic value identified through transcriptome analysis. Clin Cancer Res 2008;14:2978-2987.

【非特許文献24】Nutt CL, Mani DR, Betensky RA, et al. Gene expression-based classification of malignant gliomas correlates better with survival than histological classification. Cancer Res 2003;63:1602-1607.

【非特許文献25】Freije WA, Castro-Vargas FE, Fang Z, et al. Gene expression profiling of gliomas strongly predicts survival. Cancer Res 2004; 64:6503-6510.

【非特許文献26】Petalidis LP, Oulas A, Backlund M, et al. Improved grading and survival prediction of human astrocytic brain tumors by artificial neural network analysis of gene expression microarray data. Mol Cancer Ther 2008;7:1013-1024.

【非特許文献27】Marko NF, Toms SA, Barnett GH, Weil R.Genomic expression patterns distinguish long-term from short-term glioblastoma survivors: a preliminary feasibility study. Genomics 2008;91:395-406.

【非特許文献28】van de Vijver MJ, He YD, van't Veer LJ, et al. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 2002;347(25):1999-2009.

【非特許文献29】Rubenstein JL, Fridlyand J, Shen A, et al. Gene expression and angiotropism in primary CNS lymphoma. Blood 2006;107(9):3716-3723.

【非特許文献30】Tun HW, Personett D, Baskerville KA, et al. Pathway analysis of primary central nervous system lymphoma. Blood 2008;111(6):3200-3210.

【非特許文献31】Montesinos-Rongen M, Brunn A, Bentink S, et al. Gene expression profiling suggests primary central nervous system lymphomas to be derived from a late germinal center B cell. Leukemia 2008;22(2):400-4005.

【非特許文献32】Sung CO, Kim SC, Karnan S, et al. Genomic profiling combined with gene expression profiling in primary central nervous system lymphoma. Blood 2011;117(4):1291-1300.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、中枢神経原発悪性リンパ腫患者の新規な予後予測方法、キット及び使用を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、中枢神経原発悪性リンパ腫患者３２人の摘出腫瘍からmRNAを抽出し、GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Expression array (Affymetrix, Inc.)（約47,000遺伝子を含む）を用いて各mRNAの発現量を測定した。これらの発現プロファイルと、追跡調査により得た各患者の術後の生存期間との相関を統計学的に処理し、発現プロファイルと生存期間との間に強い相関を示す遺伝子を同定した。さらに、これらの遺伝子の発現量を用いた予後予測法を考案した。これにより本発明を完成するに至った。

【0011】

本発明は、以下の中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後予測方法、キット及び使用を提供するものである。
項１． 中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測する方法であって、該患者から採取された試料において、以下の２３遺伝子：
ＧＬＯＤ４、ＺＮＦ６８１、ＡＦＡＰ１ＡＳ、ＲＢＢＰ８、ＥＰＣＡＭ、ＦＡＮＣＡ、ＰＧＡＭ１、ＲＯＣＫ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＳＣ４ＭＯＬ、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＡＴＡＤ１、ＰＰＭ１Ｅ、ＮＵＢＰＬ、ＢＲＣＡ１、ＧＧＨ、ＮＥＸＮ、ＧＡＰＤＨ、ＧＮＡＳＡＳ、ＤＮＡＪＣ１２、 ＰＰＰ３Ｒ１、ＳＴＩＬ、ＴＲＭＴ６
の少なくとも１種の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、方法。
項２． 少なくとも以下の６遺伝子：
ＢＲＣＡ１、ＲＯＣＫ１、ＦＡＮＣＡ、ＺＮＦ６８１、ＰＰＰ３Ｒ１、ＲＢＢＰ８の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、項１に記載の方法。
項３． ＢＲＣＡ１の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、項１又は２に記載の方法。
項４． ＲＢＢＰ８とＢＲＣＡ１とＰＰＰ３Ｒ１の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、項１又は２に記載の方法。
項５． さらに年齢及び一般全身状態（ＫＰＳ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を評価する工程を含むことを特徴とする項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６． ＲＢＢＰ８とＢＲＣＡ１とＰＰＰ３Ｒ１の発現レベルを測定する工程、年齢と一般全身状態（ＫＰＳ）を評価する工程を含み、これら５つの因子に基づき中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測することを特徴とする項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７． 前記２３遺伝子全ての発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、項１又は２に記載の方法。
項８． 前記遺伝子の発現レベルを統計処理し、予測生存関数を算出する工程をさらに含む、項１〜４、７のいずれかに記載の方法。
項９． 前記遺伝子の発現レベルと年齢及び一般全身状態（ＫＰＳ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を評価レベルを統計処理し、予測生存関数を算出する工程をさらに含む、項５又は６に記載の方法。
項１０． 下記の予後予測式

【0012】

【数1】

【0013】

を用いてZ₁を算出し、Z₁の値に基づいて予後を予測する、項１〜４，６，７のいずれかに記載の方法。
項１１． 下記の予後予測式

【0014】

【数2】

【0015】

(ここでAGEは年齢値、KPSとは70以上であれば1,以下なら0、PPP3R1, BRCA1, RBBP8とは免疫組織化学染色で1ポイント以上なら1,0ポイントなら0)
を用いてZ₂を算出し、Z₂の値に基づいて予後を予測する、項６に記載の方法。
項１２． 中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測するためのキットであって、以下の２３遺伝子：
ＧＬＯＤ４、ＺＮＦ６８１、ＡＦＡＰ１ＡＳ、ＲＢＢＰ８、ＥＰＣＡＭ、ＦＡＮＣＡ、ＰＧＡＭ１、ＲＯＣＫ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＳＣ４ＭＯＬ、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＡＴＡＤ１、ＰＰＭ１Ｅ、ＮＵＢＰＬ、ＢＲＣＡ１、ＧＧＨ、ＮＥＸＮ、ＧＡＰＤＨ、ＧＮＡＳＡＳ、ＤＮＡＪＣ１２、 ＰＰＰ３Ｒ１、ＳＴＩＬ、ＴＲＭＴ６
の少なくとも１種に対するプローブまたはプライマーを含むキット。
項１３． 以下の２３遺伝子：
ＧＬＯＤ４、ＺＮＦ６８１、ＡＦＡＰ１ＡＳ、ＲＢＢＰ８、ＥＰＣＡＭ、ＦＡＮＣＡ、ＰＧＡＭ１、ＲＯＣＫ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＳＣ４ＭＯＬ、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＡＴＡＤ１、ＰＰＭ１Ｅ、ＮＵＢＰＬ、ＢＲＣＡ１、ＧＧＨ、ＮＥＸＮ、ＧＡＰＤＨ、ＧＮＡＳＡＳ、ＤＮＡＪＣ１２、 ＰＰＰ３Ｒ１、ＳＴＩＬ、ＴＲＭＴ６
の少なくとも１種の中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測するための使用。
項１４． 予後の予測が生存期間の予測である、項１３に記載の使用。

【発明の効果】

【0016】

本発明により、中枢神経原発悪性リンパ腫患者のより正確な予後予測が可能となった。

【0017】

メトトレキセート大量投与と放射線療法による通常の治療方針では予後が悪い(生存期間が短い)と予測される場合、さらに多くの抗癌剤を組み合わせて大量投与したり、造血幹細胞、骨髄細胞の移植を行うなどの治療法を選択することができるようになる。

【0018】

本発明は、中枢神経原発悪性リンパ腫の治療法の選択と予後の改善効果に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】6遺伝子についての周辺プロット。縦軸の値は所定の遺伝子発現についての期待死亡者数を表し、横軸は遺伝子発現値を示す。灰色の点は死亡症例を表し、黒色の点は追跡最終日まで生存した症例（打ち切り症例）を表す。線はLOWESS（locally weighted scattedplot）補整を表す。

【図2】A)遺伝子発現についてのSAM解析により分類された群の生存曲線による比較、B) 適用した２３遺伝子のセットによるRandom survival forest modelにより分類された群の生存曲線による比較。

【図3】A)高用量メソトレキセート（HD-MTX）により治療された症例を適用した２３遺伝子のセットによるRandom survival forest modelにより分類された群の生存曲線による比較。B) 高用量メソトレキセートを含む多剤併用化学療法により治療された症例を適用した２３遺伝子のセットによるRandom survival forest modelにより分類された群の生存曲線による比較。

【図4】２３遺伝子予測式により分類された群の生存曲線による比較。

【図5】Training setについての年齢、ＫＰＳ、ＢＲＣＡ１、ＰＰＰ３Ｒ１、ＲＢＢＰ８の５つの因子を含む予測式により分類された群の生存曲線による比較。

【図6】Validation setについての年齢、ＫＰＳ、ＢＲＣＡ１、ＰＰＰ３Ｒ１、ＲＢＢＰ８の５つの因子を含む予測式により分類された群の生存曲線による比較。

【図7-1】（A）BRCA1の免疫組織化学染色の代表的な結果。

【図7-2】(B) Trainging setにおいてBRCA1発現レベルにより分類された群の生存曲線による比較。

【図7-3】(C) Validation setにおいてBRCA1発現レベルにより分類された群の生存曲線による比較。

【発明を実施するための形態】

【0020】

中枢神経原発悪性リンパ腫としては、中枢神経系に原発する節外性非ホジキン型リンパ腫が挙げられ、特に瀰漫性大細胞性B細胞リンパ腫が挙げられる。

【0021】

本発明は、その発現レベルが中枢神経原発悪性リンパ腫患者の生存期間と高い相関を示す２３種の遺伝子を同定したことに基づく。すなわち、本発明の予後予測方法は、表１に示す２３遺伝子の発現レベルを測定し、この発現レベルから予後を予測するものである。ここで、遺伝子の発現レベルとしては、mRNAの発現レベル、タンパク質の発現レベルが挙げられ、特にmRNAの発現レベルが挙げられる。以下においては、mRNAの発現レベルの測定を例に取り説明する。

【0022】

各遺伝子の発現レベルを測定するための患者試料としては、患者から採取した中枢神経原発悪性リンパ腫の腫瘍組織を使用することができる。常套的方法により、この組織から全RNAまたはmRNAを抽出し、cDNAを合成して、実験に使用する。腫瘍組織は、初回手術時に、或いは生検により採取すればよい。

【0023】

遺伝子の発現レベルは、常套的方法により測定すればよい。発現レベルの測定方法としては、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法などが挙げられるが、なかでもＤＮＡマイクロアレイ法が好適である。

【0024】

ＤＮＡマイクロアレイ法では、測定対象とする遺伝子に対するプローブを含むマイクロアレイを使用する。かかるマイクロアレイとしては、Gene Chip Human Genome U133 Plus 2.0 Expression array (Affymetrix, Inc.)が挙げられる。あるいは、測定対象の遺伝子に対するプローブを合成し、スライドガラスなどの適当な基盤上に固定して、所望のマイクロアレイを作製してもよい。マイクロアレイの作製およびデータ解析の方法は、例えばMicroarray Technology and Cancer Gene Profiling. Simone Mocellin (ed). Landes Bioscience, Austin, Tx, 2006などに記載される。

【0025】

ＤＮＡマイクロアレイ法による発現レベルの測定は、例えば以下のとおりである。まず、各腫瘍組織からISOGEN（ニッポンジーン）を用いて全RNAを抽出する。次いで、RNAをGene Chip Human Genome U133 Plus 2.0 Expression array (Affymetrix, Inc.)（約47,000遺伝子を含む）でのハイブリダイゼーション用に処理し、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後のチップは、Fluidics Station 450、High-Resolution Microarray Scanner 3000、およびGCOS Workstation Version 1.3 (Affymetrix, Inc.)を用いて解析することができる。

【0026】

２３種の各遺伝子の配列は、表１に示すGenBank番号に基づき特定可能である。

【0027】

なお、以下においては、２３種全ての遺伝子の発現レベルを測定する方法について記載するが、本発明は、これら２３種全ての遺伝子の発現レベルを測定することは必須ではなく、これらの各遺伝子を単独で或いは２種以上を組み合わせて発現レベルを測定し、予後を予測してもよい。２３種の遺伝子と中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後の予測との関連性については、Variable Importance (VI)値の絶対値が大きいほど関連性が高い。従って、２３遺伝子を関連性の高い方から順番に並べると、
(１)ＢＲＣＡ１、(２)ＰＰＰ３Ｒ１、(３)ＲＢＢＰ８、(４)ＧＬＯＤ４、(５)ＺＮＦ６８１、(６)ＡＦＡＰ１ＡＳ、(７)ＥＰＣＡＭ、（８）ＦＡＮＣＡとＰＧＡＭ１、（１０）ＲＯＣＫ１とＰＯＬＲ１ＤとＳＣ４ＭＯＬとＣＣＤＣ８８Ａ、(１４)ＡＴＡＤ１とＰＰＭ１ＥとＮＵＢＰＬ、（１７）ＧＧＨとＮＥＸＮ、(１９)ＧＡＰＤＨ、（２０）ＧＮＡＳＡＳとＤＮＡＪＣ１２、（２２）ＳＴＩＬ、（２３）ＴＲＭＴ６
となる。

【0028】

BRCA1, PPP3R1, RBBP8は年齢およびKPSの評価と組み合わせることで、５つの因子により中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測することができる。

【0029】

年齢及びＫＰＳの評価は、２３遺伝子の少なくとも１種、特にBRCA1及び／又はPPP3R1及び／又はRBBP8の発現レベルと組み合わせることによって、効果的に中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測することができる。

【0030】

さらに、中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後は、BRCA1単独の発現レベルに基づき予測することができる。

【0031】

患者の予後は、測定した遺伝子の発現レベルを統計処理し、予測生存関数（すなわち、各時点においてそれ以降生存する確率）を算出することによって予測することができる。すなわち、本明細書において「予後」は試料の採取後の生存期間或いは一定期間以上生存する確率を意味する。選択された２３個の遺伝子発現量に対して主成分分析を行い，第1主成分スコアを抽出した．RSFにより群分けされた予後良群と悪群を用い，ROC解析を行い，主成分スコアのカットオフ値を求め，そのカットオフ値より大か小かで予後良群か悪かを判別するルールを作成した。各遺伝子発現量(具体的にはmRNAの発現量)を表２の式に代入し，Zを計算した上で，下のルールで群分けすることができる。
Z ＞ 1.82 ⇒ 予後不良群
Z ≦ 1.82 ⇒ 予後良好群

【0032】

本発明のキットは、本発明の予後予測方法に用いることができるものであり、表１に示す２３遺伝子に対するプローブまたはプライマーを含む。各遺伝子に対するプローブおよびプライマーは、その遺伝子の配列情報に基づき、常套的方法により合成することができる。キットは、測定方法に応じて、その他必要な試薬を含んでいてもよい。本発明のキットは、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法などに用いられるキットである。ＤＮＡマイクロアレイ法用のキットとしては、前記プローブが適当な基盤上に固定されたマイクロアレイを含むものが挙げられる。プライマー、プローブの設計は、市販の設計ソフト（たとえば、Wisconsin GCG package Version 10.2、Oligo^TM(National Bioscience Inc.)、GENETYX(ソフトウェア開発（株）））を用いる等、常法により容易に行うことができる。

【0033】

本発明の遺伝子は、中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測するために使用されるものであり、本発明の予後予測方法に用いるＤＮＡマイクロアレイ用のプローブやＰＣＲ用プライマーなどを作製するために用いることができる。

【0034】

本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。

【実施例1】

【0035】

１．材料および方法
（１）サンプル
組織は、回収後５分以内に液体窒素中で凍結し、-80℃で保存した。サンプルは、新潟大学の有資格の病理学者により評価した。新潟大学医学部（プロトコール#70）、千葉大学医学部および山口大学医学部ヒト研究倫理委員会のガイドラインにしたがい、全ての患者からサンプルの使用についてインフォームドコンセントを得た。全生存率は、診断データから測定した。生存期間の最終日は、死亡日または追跡最終日とした。

【0036】

（２）RNA抽出およびアレイハイブリダイゼーション
各腫瘍からの約100mgの組織を用いて、ISOGEN（ニッポンジーン）により製造元の説明書にしたがい全RNAを抽出した。得られたRNAの質は、Bioanalyzer System (Agilent Technologies) によりRNA Pico Chipを用いて検証した。28S/18S比＞0.7であってリボゾームピークの崩壊が見られないサンプルのみを本研究に使用した。RNA（1μg）をGene Chip Human Genome U133 Plus 2.0 Expression array (Affymetrix, Inc.)（約47,000遺伝子を含む）でのハイブリダイゼーション用に処理した。ハイブリダイゼーション後、Fluidics Station 450、High-Resolution Microarray Scanner 3000、およびGCOS Workstation Version 1.3 (Affymetrix, Inc.)を用いてチップを処理した。

【0037】

（３）統計学的解析
統計学的解析は全て、Rソフトウェア（R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. 2011 ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org）およびBioconductor（Gentleman R, Carey V, Bates D, et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol 2004, 5:R80）にて行った。

【0038】

生存期間の予測因子となる遺伝子を選択するため、Random Survival Forest -Variable Hunting 法(Ishwaran H, Kogalur UB, Gorodeski EZ, Minn AJ and Lauer MS High-dimensional variable selection for survival data. J. Amer. Stat. Assoc, 2010;105: 205-217)をあてはめ、小さいminimum depthを有する遺伝子のセットを選択した．Random Survival Forestパッケージ内のvarSel関数において、繰り返し数100，ステップサイズ5とし他の値についてはデフォルトセッティングを使用した。

【0039】

Ward's minimum variance cluster analysisにより、あてはめたRandom Survival Forest modelから評価した全ての死亡時点についての各個人のensemble cumulative hazard functionをインプットとして用いて、サンプルを2つの生存群に分けた。Kaplan-Meier method (Kaplan EL, Meier P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Am Statist Assoc 1958;53:457- 481) を用いて、各群について生存分布を評価した。Log-rank検定を用いて生存群間の相違を調べた。比較のため、Random Survival Forest ModelをSAM法（Tusher VG, Tibshirani R, Chu G: Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98:5116-21.）への置き換えに基づく別の2群について行った。

【0040】

中枢神経原発悪性リンパ腫の多くは瀰漫性大細胞性B細胞リンパ腫であった。

【0041】

２．結果
（１）患者特性
2000年〜2010年に外科的切除ないし生検術を受けた患者３２人から、非処置中枢神経原発悪性リンパ腫標本を得た。患者の平均年齢は64.1歳（44-76歳）であり、男性17人、女性15人であった。手術前のKarnofsky Performance Status (KPS)は、70以上が19人、60以下が13人であった。以上をTraining setとする。さらにValidation setとして表１に示す43症例を解析した。Training setと Validation setは深部病変がValidation setに多く見られる以外、年齢、性別、KPS, 病変数、病理組織、化学療法レジメなどに有意差がなかった。

【0042】

（２）予測遺伝子の選択
２３遺伝子が予測因子として選択された。表１は、これら遺伝子および各遺伝子のVariable Importance (VI)を示す。図１は、推定集合死亡率と選択した6つの遺伝子（BRCA1、ROCK1、FANCA、ZNF681、PPP3R1、およびRBBP8）との間の関係を示す散布図である。

【0043】

（３）選択遺伝子を用いた生存率解析
SAM（A）、適用した２３遺伝子のセットによるRandom survival forest model（B）により分類された群について、Kaplan-Meier曲線を描いた（図２）。対応するLogrank検定のためのp値（p）は、遺伝子発現がp<0.038、および２３遺伝子によるRandom Survival Forest modelがp＜0.0001であった。これらの結果は、Random Survival Forest modelの方が遺伝子発現を直接用いるよりも有用であることを示す。

【0044】

（４）選択遺伝子を用いた生存率解析の治療法別による比較
高用量メソトレキセートにより治療された症例（A）、高用量メソトレキセートを含む多剤併用化学療法により治療された症例（B）を適用した２３遺伝子のセットによるRandom survival forest modelにより分類された群について、Kaplan-Meier曲線を描いた（図３）。対応するLogrank検定のためのp値（p）は、高用量メソトレキセート群がp=0.0001、および高用量メソトレキセートを含む多剤併用化学療法群がp＜0.0001であった。これらの結果は、治療法によらず２３遺伝子のセットによって予後が良く予測可能であるという事を示す。

【0045】

（５）２３遺伝子予測式により分類された群の比較
２３遺伝子予測式により分類された群の比較ついて、Kaplan-Meier曲線を描いた（図４）。対応するLogrank検定のためのp値（p）は、p＜0.0001であった。この結果は、２３遺伝子予測式により予後を良く予測可能であるという事を示す。

【0046】

【表1】

【0047】

予測式を示す。

【0048】

【数3】

【0049】

上のZ₁を計算した上で，下のルールで群分けする．
Z₁ ＞ 1.82 ⇒ 予後不良群
Z₁ ≦ 1.82 ⇒ 予後良好群

【実施例2】

【0050】

１．材料および方法
表２に示す様に、Training SetとValidation Setの異なる症例群を設定した。Training Setはいままでの解析に用いた症例群で。Validation Setは新たな症例群となる。

【0051】

【表2】

【0052】

（１）免疫組織化学
ホルマリン固定パラフィン包埋組織標本の5ミクロンの切片を用いて免疫組織化学を行った。BRCA1 (抗体希釈1:200; Abcam), FANCA (抗体希釈1:3000; Abcam), PPP3R1(抗体希釈1:100; Abcam), ROCK1 (抗体希釈1:125; SIGMA), RBBP8 (抗体希釈1:200; Abnova)、CD79a (抗体希釈1:50;DAKO)を一次抗体として用いた。染色強度は、なし、または、弱い陽性（0ポイント）、中程度の陽性（1ポイント）、または強い陽性（2ポイント）に分類した。3回の独立した測定の平均を小数点一桁まで計算した。観察者は患者番号を認識していなかった。

【0053】

（２）リアルタイム定量的PCRによる発現差異の検証
StepOne RealTime PCR system (Applied Biosystems) において、TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) を用いて、製造元のプロトコールにしたがい定量的PCR（QPCR）を行った。TaqMan Gene Expression Assay Mixには、プライマーおよびTaqManプローブはApplied BiosystemsのATAD1(Hs00907773_g1),BRCA1(Hs01556193_m1), FANCA(Hs01116668_m1),GAPDH(Hs99999905_m1),GGH(Hs00914163_m1),GNASAS(Hs00294858_m1),PGAM1(Hs01652468_g1),PPP3R1(Hs01547793_m1),RBBP8(Hs00161222_m1),ROCK1(Hs01127699_m1),STIL(Hs00161700_m1),TRMT6(Hs00210942_m1),ZNF681(Hs01862022_s1)が含まれた。全RNA（5μg）を、SuperScript II (Invirtogen) を用いて逆転写してcDNAとした。このcDNA（1μl）をQPCRに使用した。検証は、はじめに評価した腫瘍の一部について行った。アッセイはデュプリケートで行った。QPCRの生データは、反応が対数期に到達するのに必要なサイクル数である。GAPDHの発現をQPCRデータの標準化に使用した。腫瘍群間の平均発現変化は、2^-ΔΔCT法（Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 ;25:402-408）を用いて計算した。

【0054】

２．結果
（１）前記の１２遺伝子について、QPCRによる検証ができた（データ非提示）。

【0055】

（２）Z₁式を算出した方法で、臨床データと免疫組織化学染色の結果を考慮に入れたより簡略化した予後予測式を考案した。Z₂ = 0.04 × AGE - 0.58 × KPS + 0.22 ×PPP3R1 + 1.42 × BRCA1 + 1.11 × RBBP8.
(ここでAGEは年齢値、KPSとは70以上であれば1,以下なら0、PPP3R1, BRCA1, RBBP8とは免疫組織化学染色で1ポイント以上なら1,0ポイントなら0)
・ルール
Z₂ ＞ 3.48 ⇒ Poor群
Z₂ ≦ 3.48 ⇒ Good群
このルールに従って生存曲線を描いたものが図５、６である。
Z2式でより簡易に予後良好群と不良群がTraining set（図５）、Validation Set（図６）
でも分けられることがわかる。
Z₂式でより簡易に予後良好群と不良群が分けられることがわかる。

【0056】

（３）患者の生存期間とBRCA1の発現を検討した。図７（A）BRCA1の免疫組織化学染色の代表的な結果が示されている。CD79aとBRCA1の二重染色によりBRCA1陽性細胞が腫瘍細胞であることが示される。３２症例のBRCA1の免疫組織染色での発現がPOSITIVE（１ポイント以上）/NEGATIVE（０ポイント）で２群に分けると、無増悪生存期間（C, p=0.019）は２群間で有意差を認めた。即ち、BRCA1の発現変化（転写レベルおよびタンパク質レベル）で予後良好群か不良群かに分けられることが示された。また、validation setでも同様の事が確かめられた（D, p=0.0038）。

【0057】

（４）患者の無増悪生存期間(PFS)、全生存期間(OS)を入院時の年齢（６５歳以上/未満か）、性別、KPS（７０以上/未満か）、画像上の病変数が単発性/多発性か、画像上の病変が浅部/深部（脳室周囲、基底核、脳梁、脳幹、小脳）か、血清LDH値が216 IU/L以上/未満か、髄液中のタンパク値が45 mg/dl以上/未満か、手術療法は摘出術/生検術か、化学療法はHD-MTX/HD-MTXを含む多剤併用療法か、BRCA1, FANCA, PPP3R1, ROCK1, RBBP8の各免疫組織化学染色がPOSITIVE（１ポイント以上）/NEGATIVE（０ポイント）、 Z₁値が1.82以上/未満か、Z₂値が3.48以上/未満かで２群間比較した単変量解析結果が表３に示されている。Z₁値とZ₂値がPFS, OSを、またBRCA1免疫組織化学染色がPFSを有意に２群に分けることができることが示される。

【0058】

（５）患者の全生存期間(OS)と各因子の関係の多変量解析結果が表４に示されている。Z₁値とZ_２値を比較するとZ₁値が有意,Z₁値とその他の変量を比較するとZ₁値が有意であることが示される。

【0059】

【表3】

【0060】

【表4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】