特許 5963757 ＥＴＦＢの細胞異常増殖への適用方法及び異常増殖抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5963757

(24)【登録日】2016年7月8日

(45)【発行日】2016年8月3日

(54)【発明の名称】ＥＴＦＢの細胞異常増殖への適用方法及び異常増殖抑制剤

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20160721BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20160721BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160721BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12Q1/02

   C12N15/00 A

【請求項の数】11

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2013-532386(P2013-532386)

(86)(22)【出願日】2011年12月27日

(86)【国際出願番号】JP2011080247

(87)【国際公開番号】WO2013035209

(87)【国際公開日】20130314

【審査請求日】2014年11月25日

(31)【優先権主張番号】特願2011-206582(P2011-206582)

(32)【優先日】2011年9月5日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】507029007

【氏名又は名称】株式会社ポーラファルマ

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(74)【代理人】

【識別番号】100151596

【弁理士】

【氏名又は名称】下田 俊明

(72)【発明者】

【氏名】廣川 重成

(72)【発明者】

【氏名】北島 裕之

(72)【発明者】

【氏名】島貫 智匡

【審査官】 伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】 HIROKAWA S. et al.,，Journal of Dermatological Science, 22 August, 2011, Vol.64, pp.119-126

【文献】 Journal of Investigative Dermatology，2007, Vol.127, pp.526-537

【文献】 Experimental and Molecular Pathology，2010, Vol.89, pp.236-240

【文献】 International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics，2006, Vol.65, pp.234-245

【文献】 ZHANG Y. et al.,，Journal of Investigative Dermatology, 2003, Vol.120, pp.849-857

【文献】 HENRIQUES B. J. et al.,，Biochimica et Biophysica Acta, 2010, Vol.1802, pp.1070-1077

【文献】 GRINNELL F. et al.,，Annual Review of Cell and Developmental Biology, 2010, Vol.26, pp.335-361

【文献】 HADJIPANAYI E. et al.,，Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 2009, Vol.3, pp.77-84

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

採取された線維芽細胞におけるＥＴＦＢ（エレクトロントランスファー フラボノプロテイン ベータ サブユニット）の発現の度合いを指標とする、線維芽細胞の増殖状態の鑑別法であって、
被検試料の線維芽細胞におけるＥＴＦＢの発現量が、被検試料の正常線維芽細胞又は被検試料と同一若しくは類似の生物種の正常線維芽細胞又は確立された正常線維芽細胞である、対照の線維芽細胞における発現量に対して高い場合には、線維芽細胞のマイオファイブロブラストへの分化に起因する線維化が生じている蓋然性が高く、
被検試料の線維芽細胞におけるＥＴＦＢの発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して同じ又は低い場合には、線維芽細胞の増殖が正常に保たれている蓋然性が高い、と判別する、線維芽細胞の増殖状態の鑑別法。

【請求項2】

線維化が、肥厚性瘢痕の形成である、請求項１に記載の鑑別法。

【請求項3】

線維化を疑われる臓器から採取された線維芽細胞における、ＥＴＦＢの発現の度合いを指標とする、臓器における線維化の鑑別法であって、
被検試料の線維芽細胞におけるＥＴＦＢの発現量が、被検試料の正常線維芽細胞又は被検試料と同一若しくは類似の生物種の正常線維芽細胞又は確立された正常線維芽細胞である、対照の線維芽細胞における発現量に対して高い場合には、当該臓器において、線維芽細胞のマイオファイブロブラストへの分化に起因する線維化が起こっている蓋然性が高いと判別し、
被検試料の線維芽細胞におけるＥＴＦＢの発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して同じ又は低い場合には、線維化が起こっている蓋然性は低いと判別する、臓器における線維化の鑑別法。

【請求項4】

前記臓器が皮膚である、請求項３に記載の臓器における線維化の鑑別法。

【請求項5】

線維芽細胞を、張力及びＴＧＦ−βの存在下コラーゲンゲル中で、被検物質の存在下及び非存在下培養し、
被検物質の存在下培養した場合、ＥＴＦＢの発現量が非存在下培養したときよりも低い場合には、当該被検物質が、線維芽細胞のマイオファイブロブラストへの分化に起因する
線維化抑制剤であるとする、線維化抑制剤の鑑別法。

【請求項6】

前記線維化は、肥厚性瘢痕の形成である、請求項５に記載の線維化抑制剤の鑑別法。

【請求項7】

前記線維化が皮膚における肥厚性瘢痕である、請求項６に記載の線維化抑制剤の鑑別法。

【請求項8】

前記ＥＴＦＢの発現がタンパク質の発現である、請求項１〜７の何れか１項に記載の鑑別法。

【請求項9】

前記ＥＴＦＢの発現がＲＮＡの発現である、請求項１〜７の何れか１項に記載の鑑別法。

【請求項10】

ＥＴＦＢの発現の度合いをポリメリゼーションチェインリアクション（ＰＣＲ）で測定する、請求項９に記載の鑑別法。

【請求項11】

前記ＰＣＲに用いるプライマーは、
配列番号１に記載のオリゴヌクレオチド又はこれを部分配列に持ち、ＥＴＦＢをコードする塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチド、及び、
配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド又はこれを部分配列に持ち、ＥＴＦＢをコードする塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の鑑別法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、エレクトロントランスファー フラボノプロテイン ベータサブユニット（Electron transfer flavoprotein beta subunit；ＥＴＦＢ）の細胞増殖への適用と、その抑制剤、該抑制剤からなる細胞の異常増殖症の処置薬に関する。

【背景技術】

【0002】

線維芽細胞の異常増殖は、例えば、傷の跡に生じる肥厚性瘢痕や、肺における線維症や肝硬変、腎硬化症などのように種々の疾病へと関連している。これらの異常増殖を誘起する過程において、ＴＧＦ−βが関与していると言われる（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３を参照）が、ＴＧＦ−βはマルチタスクの生体物質であるため、単純な抑制で対処するわけにはいかない面が少なからずあったし、副作用の少ない有効なＴＧＦ−β阻害剤が存在しないこともその辺に起因するものと思われる。即ち、ＴＧＦ−βの下流において、この疾患に直結した線維芽細胞の異常増殖の因子を探し出し、これを選択的に抑制することが、前記線維芽細胞異常増殖症の有効な抑制手段になると考えられる。
一方、ＥＴＦＢは電子伝達に係わる蛋白質であり（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７を参照）、時として、バイオマーカーに使用されることもあるが、その実態についてはあまり知られていない。脂質貯留性筋疾患においては、ＥＴＦＢの変異が見られるとの報告（例えば、非特許文献１を参照）、ＩＩ型糖尿病の要因の一つであるとの示唆（例えば、非特許文献２を参照）、マルチプル・アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼ・デフィシェンシー（Multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency；ＭＡＤＤ）の一要素であるとの示唆（例えば、非特許文献３を参照）などが知られているが、皮膚などとの関連も、線維芽細胞との関係も全く知られていない。また、ＥＴＦＢとＴＧＦ−βとの関連も全く知られていない。

【0003】

他方、線維芽細胞をコラーゲンゲル中で張力をかけて培養した場合、細胞増殖が亢進し、コラーゲン発現等が上昇し、線維化に近似した現象が観察され、これにＴＧＦ−βが存在した場合、線維芽細胞のマイオフィブロブラストへの分化も観察されることは既に報告されている（例えば、非特許文献４を参照）。しかしながら、この様な現象における細胞増殖の因子は明らかにされていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１０−２２２３５１号公報

【特許文献2】特開２０１０−５９１２４号公報

【特許文献3】特開２００９−４０７９６号公報

【特許文献4】特表２０１０−５０８０１４号公報

【特許文献5】国際公開ＷＯ２００６／０５４７２２号パンフレット

【特許文献6】特表２０１０−５１４４４１号公報

【特許文献7】特開２０１０−１０７４６１号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Wen B. et. al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 2010 ;81(2):231-6

【非特許文献2】Lu H. et. al.,J.Mol. Cell Proteomics. 2008 ;7(8):1434-51

【非特許文献3】Schiff M. et.al.,Mol. Genet. Metab. 2006 ;88(2):153-8

【非特許文献4】Au K. et. al., Exp. Mol. Pathol. 2010 ; 89(3):236-240

【発明の概要】

【0006】

本発明は、この様な状況下為されたものであり、線維芽細胞の異常増殖を早期に鑑別し、これを抑制する手段を提供することを課題とする。

【0007】

この様な状況に鑑みて、本発明者らは、線維芽細胞の異常増殖を早期に鑑別し、これを抑制する手段を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、線維芽細胞を張力存在下コラーゲンゲル中で培養した場合と、張力非存在下コラーゲンゲル中で培養した場合の発現蛋白質の比較を行うことにより、ＥＴＦＢの発現が前条件において亢進することを見出し、このものが線維芽細胞の異常増殖の因子であることを突き止め、発明を完成させるに至った。

【0008】

即ち、本発明は以下に示すとおりである。
＜１＞ ＥＴＦＢ（エレクトロントランスファー フラボノプロテイン ベータ サブユニット）の発現の度合いを指標とする、線維芽細胞の増殖状態の鑑別法であって、
当該ＥＴＦＢの発現の度合いが高い場合には、線維芽細胞の異常増殖が生じている蓋然性が高く、
ＥＴＦＢの発現の度合いが低い場合には、線維芽細胞の増殖が正常に保たれている蓋然性が高い、と判別する、線維芽細胞の増殖状態の鑑別法。
＜２＞ 前記ＥＴＦＢの発現の度合いが高い場合が、被検試料の線維芽細胞における発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して高い場合であり、
前記ＥＴＦＢの発現の度合いが低い場合が、被検試料の線維芽細胞における発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して同じ又は低い場合である、＜１＞に記載の鑑別法。
＜３＞ 前記線維芽細胞の異常増殖が、繊維化である、＜１＞に記載の鑑別法。
＜４＞ 前記線維化が、線維芽細胞のマイオファイブロブラストへの分化に起因しているものである、＜３＞に記載の鑑別法。
＜５＞ 線維芽細胞の異常増殖が、肥厚性瘢痕の形成である、＜１＞に記載の鑑別法。
＜６＞ 線維化を疑われる臓器の線維芽細胞における、ＥＴＦＢの発現の度合いを指標とする、臓器における線維化の鑑別法であって、
ＥＴＦＢの発現の度合いが高い場合には、当該臓器において線維化が起こっている蓋然性が高いと判別し、
ＥＴＦＢの亢進が認められない場合には、線維化が起こっている蓋然性は低いと判別する、臓器における線維化の鑑別法。
＜７＞ 前記ＥＴＦＢの発現の度合いが高い場合が、被検試料の臓器における発現量が、対照における発現量に対して高い場合であり、
ＥＴＦＢの亢進が認められない場合が、被検試料の臓器における発現量が、対照における発現量に対して同じ又は低い場合である、＜６＞に記載の臓器における線維化の鑑別法。
＜８＞ 前記臓器が皮膚である、＜７＞に記載の臓器における線維化の鑑別法。
＜９＞ 線維芽細胞を、張力の存在下コラーゲンゲル中で、被検物質の存在下及び非存在下培養し、
被検物質の存在下培養した場合、ＥＴＦＢの発現量が非存在下培養したときよりも低い場合には、当該被検物質が、線維化抑制剤であるとする、線維化抑制剤の鑑別法。
＜１０＞ 前記線維化は、肥厚性瘢痕の形成である、＜９＞に記載の異常線維化抑制剤の鑑別法。
＜１１＞ 前記線維化が皮膚における肥厚性瘢痕である、＜１０＞に記載の線維化抑制剤の鑑別法。
＜１２＞ 前記ＥＴＦＢの発現がタンパク質の発現である、＜１＞〜＜１１＞の何れかに記載の鑑別法。
＜１３＞ 前記ＥＴＦＢの発現がＲＮＡの発現である、＜１＞〜＜１１＞の何れかに記載の鑑別法。
＜１４＞ ＥＴＦＢの発現の度合いをポリメリゼーションチェインリアクション（ＰＣＲ）で測定する、＜１３＞に記載の鑑別法。
＜１５＞ 前記ＰＣＲに用いるプライマーは、
配列番号１に記載のオリゴヌクレオチド又はこれを部分配列に持ち、ＥＴＦＢをコードする塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチド、及び、
配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド又はこれを部分配列に持ち、ＥＴＦＢをコードする塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドである、＜１４＞に記載の鑑別法。
＜１６＞ 線維芽細胞を、張力の存在下コラーゲンゲル中で、被検物質の存在下及び非存在下培養し、被検物質の存在下培養した場合、ＥＴＦＢの発現量が非存在下培養したときよりも低い被検物質からなる、線維化抑制剤。
＜１７＞ 前記線維化は、肥厚性瘢痕の形成である、＜１６＞に記載の線維化抑制剤。
＜１８＞ ＜１６＞に記載の線維化抑制剤を有効成分とする、肥厚性瘢痕処置薬。
＜１９＞ 生じた肥厚性瘢痕の治療用である、＜１８＞に記載の肥厚性瘢痕処置薬。
＜２０＞ 生じた肥厚性瘢痕が悪化をしないための予防用である、＜１８＞に記載の肥厚性瘢痕処置薬。
＜２１＞ 生じる蓋然性が高い瘢痕が生じることを防ぐ予防用である、＜１８＞に記載の肥厚性瘢痕処置薬。
＜２２＞ ＥＴＦＢをコードする塩基配列を増幅することができる、配列番号１又は２に表されるオリゴヌクレオチドと実質同一なオリゴヌクレオチド。

【0009】

本発明によれば、線維芽細胞の異常増殖を早期に鑑別し、これを抑制する手段を提供することが出来る。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】実施例１のコラーゲンゲル内培養の結果を示す図である。

【図2】実施例１のＥＴＦＢの線維芽細胞の増殖に与える影響を示した図である。

【図3】実施例１のＴＧＦ−βで誘導されるストレスファイバー形成に対するＥＴＦＢ ｓｉＲＮＡの影響を示す図（写真）である。ＥＴＦＢまたは陰性対照（Negative control） siRNAを導入したCCD-1113sk細胞にＴＧＦ−β（11ng/ml）を添加後３日日培養し、Phalloidin染色を実施した。

【図4】実施例１のＥＴＦＢ ｓｉＲＮＡのコラーゲンゲル収縮に与える影響を示す図である。ＥＴＦＢまたはNegative control siRNAを導入し、コラーゲンゲル内培養を実施し、ゲル収縮を観察した(n=6)。

【図5】実施例１のＥＴＦＢ ｓｉＲＮＡのα-平滑筋アクチン（ＳＭＡ）をコードしたＲＮＡの産生量への影響（Negative control）を示す図である。ETFBまたはNegative control siRNAを導入し、コラーゲンゲル内培養を実施し、培養１日ごとにRNAを収集し、コラーゲン1A1（COL1A1）（B）及びSMA(C)のmRNA発現を、qRT-PCRにて確認した。ＡはNegative control siRNA導入下、付着状態及び遊離状態におけるETFBの発現量を示し、ＢはNegative control siRNA導入下、付着状態及び遊離状態におけるCOL1A1の発現量を示し、ＣはNegative control siRNA導入下、付着状態及び遊離状態におけるSMAの発現量を示す。

【図6】実施例１のＥＴＦＢ ｓｉＲＮＡのコラーゲン産生、ＳＭＡ産生に与える影響を示す図である。ETFBまたはNegative control siRNAを導入し、TGF-β（300ng/ml）を添加または非添加した状態でコラーゲンゲル内培養を実施し、培養１日後のRNAを収集し、COL1A1（A）、SMA(B)並びにETFB(C)のmRNA発現を、qRT-PCRにて確認した。ＡはTGF-β存在又は非存在下、Negative control siRNA又はETFB siRNA導入によるCOL1A1の発現量の変化を示し、ＢはTGF-β存在又は非存在下、Negative control siRNA又はETFB siRNA導入によるSMAの発現量の変化を示し、ＣはTGF-β存在又は非存在下、Negative control siRNA又はETFB siRNA導入によるETFBの発現量の変化を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

（ＥＴＦＢ）
本発明の主要素となる、ＥＴＦＢは、エレクトロントランスファー フラボノプロテイン ベータ サブユニットとも称され、その詳細な塩基配列、アミノ酸配列は既にジーンバンクなどの遺伝子データバンクに登録されている。例えば、ヒト型のＥＴＦＢであれば、ジーンバンクにCAG33108.1で登録されている。このものは、以下の手続を経て、線維芽細胞の増殖因子として同定された。

【0012】

線維芽細胞の増殖因子の同定に用いる、コラーゲンゲル中での張力負荷条件での培養においては、線維芽細胞は細胞増殖、コラーゲン発現上昇等が起こり、この増殖においては、細胞の形態、液性因子の発現が線維化の状態に近似している。一方、張力の負荷がない場合には、この様な増殖現象は観察されない。即ち、線維芽細胞をコラーゲンゲル中で張力負荷で培養した場合と、張力を負荷しないで培養した場合の発現蛋白質或いは発現RNAを比較し、張力負荷の条件でのみ発現する又は発現が亢進する蛋白質、RNAをとらえれば、それが線維芽細胞の増殖の因子、線維化の因子である蓋然性が高い。この様にして同定した蛋白質或いはRNAについて、ｓｉＲＮＡ等を用いて、ノックダウン実験を行い、その結果、線維芽細胞の増殖或いは線維化が抑制されれば、線維芽細胞の増殖因子或いは線維化の因子であるといえる。
したがって、本発明では、ＲＮＡ等の遺伝子をターゲットとすることも出来るし、蛋白質をターゲットとすることも出来る。

【0013】

蛋白質をターゲットにする場合には、線維芽細胞の培養物及び／又は培養生産物について、例えば、ＤＤ法（ディファレンシャル・ディスプレイ法）によるプロテオーム解析などを行うことが出来る。すなわち、二次元電気泳動による展開、DD、得られたスポットをMALDI-TOF-MSにて同定する。同定されたタンパク質に対する機能抑制を実施し、病態が改善するかその可能性があるかを確認する。そしてそのターゲットとなるタンパク質の立体構造を調査し、活性中心を突き止め、その活性中心に高い親和性ではまり込む化合物を設計しようというものである。プロテオーム解析でのDD、siRNA等による機能抑制技術、コンピューターを利用したターゲットタンパクの構造解析およ生物学的実験による活性中心の検討を行うと言った手技である。

【0014】

この様な解析に用いる線維芽細胞としては、確立された細胞であれば特段の限定無く用いることが出来るが、最終実施形態がヒトの線維芽細胞であることから、ヒトの線維芽細胞を用いることが出来る。ヒトの線維芽細胞としては、CCD-1113Sk細胞（ATCC No. CRL2439、ヒト皮膚真皮正常線維芽細胞、黒人39歳女性由来）、CCD-1109Sk（ATCC No. CRL2361、ヒト皮膚真皮正常線維芽細胞、白人21歳男性由来）、またはCCD-1032Sk（ATCC No. CRL2439、ヒト皮膚真皮正常線維芽細胞、白人新生児由来）等が好適に例示でき、これらはＡＴＣＣ等から有償分譲してもらうことにより利用することが出来る。これらの培養はＦＢＳ加ＤＭＥＭ培地やＲＰＭＩ培地などで培養することが出来る。

【0015】

また、この様にプロテオーム解析で蛋白質を同定することにより、ジーンバンクなどの遺伝子情報を利用して、対応する遺伝子の塩基配列を推定することが出来る。これにより、対応するｃ−ＤＮＡやＲＮＡをＰＣＲによって増幅することができる。更に、ｓｉＲＮＡを作成し、ノックアウト実験を行うことも出来る。ノックアウト実験により、当該ターゲット蛋白質が実際に線維芽細胞の増殖や線維化に寄与しているかも検証することが出来る。

【0016】

（線維芽細胞の増殖状態の鑑別法）
この様な過程を経て、本願発明者らは、線維芽細胞のコラーゲンゲル中での張力負荷培養、具体的には、細胞が培養器の壁面乃至は底面に付着した状態で培養される条件において、ＥＴＦＢが特異的に産生されることを見出した。即ち、線維芽細胞のコラーゲンゲル中での培養において、ＥＴＦＢの産生量を指標に線維化等の線維芽細胞の異常増殖が促進されているか否かを鑑別することが出来る。
すなわち、本発明の一形態は、線維芽細胞の増殖状態の鑑別法において、ＥＴＦＢ（エレクトロントランスファー フラボノプロテイン ベータ サブユニット）の発現の度合いを指標とする、増殖状態の鑑別法であって、
ＥＴＦＢの発現の度合いが高い場合には、線維芽細胞の異常増殖が生じている蓋然性が高く、
ＥＴＦＢの発現の度合いが低い場合には、線維芽細胞の増殖が正常に保たれている蓋然性が高い、と判別する、線維芽細胞の増殖状態の鑑別法である。
ここで、「ＥＴＦＢの発現の度合いを指標とする」とは、「ＥＴＦＢの発現の度合いをマーカーとして測定する」と言うこともできる。
「線維芽細胞の異常増殖が生じている蓋然性が高い」とは、「線維芽細胞の異常増殖が生じているリスクが高い」と言うこともできる。「線維芽細胞の増殖が正常に保たれている蓋然性が高い」とは、「線維芽細胞の異常増殖が生じているリスクが低い」と言うこともできる。「線維芽細胞の増殖状態の鑑別法」は、「線維芽細胞の異常増殖のリスクの予測方法」と言うこともできる。
ＥＴＦＢの発現の度合いが高い場合とは、被検試料の線維芽細胞における発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して高い場合であり、
ＥＴＦＢの発現の度合いが低い場合とは、被検試料の線維芽細胞における発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して同じ又は低い場合であり得る。
ＥＴＦＢの発現の度合いが高い場合とは、限定されないが、例えば、被検試料の線維芽細胞においては発現しているが、対照の線維芽細胞においては発現していないか、又は被検試料の線維芽細胞における発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して１５０％以上、３００％以上、５００％以上であり得、
ＥＴＦＢの発現の度合いが低い場合とは、限定されないが、例えば、被検試料の線維芽細胞における発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して同じ又は７０％以下、５０％以下、１０％以下であり得る。
被検試料の線維芽細胞は、線維芽細胞の増殖状態を鑑別される必要のある対象の細胞であり、特に限定されず、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物等由来の細胞であり得る。
対照の線維芽細胞は、対象の正常線維芽細胞又は対象と同一又は類似の生物種の正常線維芽細胞又は確立された正常線維芽細胞であり得る。確立された正常線維芽細胞としては、上記と同様の確立された細胞を用いることが出来る。
ＥＴＦＢの発現の度合いは、後記のとおり、ＥＴＦＢ蛋白質の発現を測定してもよく、ＥＴＦＢをコードしたＲＮＡ等の遺伝子の発現を測定してもよい。線維芽細胞におけるＥＴＦＢ蛋白質又はＥＴＦＢをコードした遺伝子の測定方法は、特に限定されず、例えば、常法に従って、細胞を破砕し、ＥＴＦＢ蛋白質又はＥＴＦＢをコードした遺伝子を含む細胞抽出液を得て、細胞抽出液に含まれるＥＴＦＢ蛋白質又はＥＴＦＢをコードした遺伝子を、後記のような通常の測定方法により測定することにより行うことが出来る。
本発明において「線維芽細胞の異常増殖」とは、線維芽細胞の異常増殖による疾患状態であり得る。線維芽細胞の異常増殖による疾患状態は、特に限定されず、例えば線維化（具体的には、肥厚性瘢痕、ケロイド、強皮症、面皰瘢痕、肺線維症、肝線維症等）、線維芽細胞のマイオファイブロブラストへの分化に起因している線維化等であり得る。

【0017】

本発明の別の形態は、線維化を疑われる臓器の線維芽細胞における、ＥＴＦＢの発現の度合いを指標とする、臓器における線維化の鑑別法であって、ＥＴＦＢの発現の度合いが高い場合には、当該臓器において線維化が起こっている蓋然性が高いと判別し、ＥＴＦＢの亢進が認められない場合には、線維化が起こっている蓋然性は低いと判別する、臓器における線維化の鑑別法である。
ここで、「臓器において線維化が起こっている蓋然性が高い」とは、「臓器において線維化が起こっているリスクが高い」と言うこともできる。「線維化が起こっている蓋然性が低い」とは、「線維化が起こっているリスクが低い」と言うこともできる。「臓器における線維化の鑑別法」は、「臓器における線維化のリスクの予測方法」と言うこともできる。
ＥＴＦＢの発現の度合いが高い場合とは、被検試料の臓器における発現量が、対照における発現量に対して高い場合であり、
ＥＴＦＢの亢進が認められない場合とは、被検試料の臓器における発現量が、対照における発現量に対して同じ又は低い場合であり得る。
ＥＴＦＢの発現の度合いが高い場合とは、限定されないが、例えば、被検試料の臓器においては発現しているが、対照においては発現していないか、又は被検試料の臓器における発現量が、対照における発現量に対して１５０％以上、３００％以上、５００％以上であり得、
ＥＴＦＢの発現の度合いが低い場合とは、限定されないが、例えば、被検試料の臓器における発現量が、対照における発現量に対して同じ又は７０％以下、５０％以下、１０％以下であり得る。
被検試料の臓器は、臓器における線維化を鑑別される必要のある対象の臓器であり、特に限定されず、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物等由来の臓器であり得る。なお、対象の臓器から得られる培養細胞、培養組織、血液等を被検試料として用いてもよい。
対照は、対象の同じ又は別の臓器の正常部分又は対象と同一又は類似の生物種の臓器又は細胞あるいは確立された正常細胞であり得る。確立された正常細胞としては、上記と同様の確立された細胞を用いることが出来る。
本発明の臓器における線維化の鑑別法の対象となる「臓器」とは、特に限定されず、例えば皮膚、肺或いは肝臓などの内臓等であり得る。
ＥＴＦＢの発現の度合いは、後記のとおり、ＥＴＦＢ蛋白質の発現を測定してもよく、ＥＴＦＢをコードしたＲＮＡ等の遺伝子の発現を測定してもよい。臓器の線維芽細胞におけるＥＴＦＢ蛋白質又はＥＴＦＢをコードした遺伝子の測定方法は、特に限定されず、例えば、常法に従って、細胞を破砕し、ＥＴＦＢ蛋白質又はＥＴＦＢをコードした遺伝子を含む細胞抽出液を得て、細胞抽出液に含まれるＥＴＦＢ蛋白質又はＥＴＦＢをコードした遺伝子を、後記のような通常の測定方法により測定することにより行うことが出来る。

【0018】

（異常増殖抑制剤の鑑別法）
本発明の線維芽細胞の増殖状態の鑑別法を応用すれば、被検物質の存在下でＥＴＦＢの産生量が高まるか、抑制されるかで当該被検物質が異常増殖促進剤であるか、異常増殖抑制剤であるかが鑑別される。
ここで、異常増殖とは、線維芽細胞の異常増殖による疾患状態であり得る。線維芽細胞の異常増殖による疾患状態は、特に限定されず、例えば線維化（具体的には、肥厚性瘢痕、ケロイド、面皰瘢痕、強皮症、肺線維症、肝線維症等）、線維芽細胞のマイオファイブロブラストへの分化に起因している線維化等であり得る。
本発明の一形態は、線維芽細胞を、張力の存在下コラーゲンゲル中で、被検物質の存在下及び非存在下培養し、
被検物質の存在下培養した場合、ＥＴＦＢの発現量が非存在下培養したときよりも低い場合には、当該被検物質が、線維化抑制剤であるとする、線維化抑制剤の鑑別法である。
被検物質の存在下培養した場合、ＥＴＦＢの発現量が非存在下培養したときよりも低い場合とは、限定されないが、例えば、被検物質の存在下において発現していないか、被検物質の存在下における発現量が、ＥＴＦＢの発現量が非存在下における発現量に対して７０％以下、５０％以下、１０％以下であり得る。
コラーゲンゲル中での被検物質の存在下及び非存在下の培養は、陰性対照の細胞の増殖が良好であり、被検物質の存在下及び非存在下で細胞の増殖の差異が明確となるような培養条件であってよく、限定されないが、例えば、コラーゲン濃度０．０５〜０．５ｗｔ％ゲル中で、３０〜４０℃、１２〜７２時間の培養により、行うことが出来る。
「線維化抑制剤の鑑別法」は、「線維化抑制剤のスクリーニング法」と言うこともできる。
被検物質としては、天然物又は合成品のいずれであってもよく、通常医薬等の候補物質となり得るものであってよく、具体的には、植物および微生物由来の抽出物およびその精製品、低分子合成化合物、抗体、ペプチド、アプタマー、siRNA、遺伝子治療に用いられる核酸、その修飾体や誘導体などを挙げることができる。

【0019】

この様な鑑別において、ＥＴＦＢは蛋白質として定量することも出来るし、ＥＴＦＢをコードしたＲＮＡ等の遺伝子として定量することも出来る。タンパク質又は遺伝子の定量法としては、常法を用いることが出来る。例えば、ゲル電気泳動法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法等の免疫測定法、免疫組織化学分析法、ノーザンブロット法、PCR法などで測定することができる。ＲＮＡ等の遺伝子の定量にはＰＣＲによる増幅法を応用できるので、特に好ましい。

【0020】

ＥＴＦＢをタンパク質として定量する場合、ゲル中のタンパク質を染色可能な試薬や、ＥＴＦＢを特異的に認識する抗体を用いるとよい。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよい。これらの抗体は公知の方法で製造することができる。抗体は、必要により、蛍光色素、放射性同位元素、酵素などで標識してもよい。

【0021】

ＥＴＦＢを遺伝子として定量する場合、ＥＴＦＢのmRNAと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマー及び前記mRNAを鋳型として合成されるcDNAと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマーからなる１対の核酸プライマーを用いるとよい。プライマーは、測定の対象となる遺伝子の配列情報に基づいて設計することができる。
ＰＣＲ反応を行うためのプライマーとしては、例えば、配列表の配列番号１或いは配列表の配列番号2に示すオリゴヌクレオチドを用いることが出来る。かかる配列を部分配列として含み、ＥＴＦＢをコードする塩基配列を増幅することができる、同様の効果を示すオリゴヌクレオチドは、本発明の技術範囲に属する。同オリゴヌクレオチドの長さとしては、限定されないが、例えば、１０〜５０塩基、１５〜３０塩基程度である。

【0022】

（異常増殖抑制剤）
斯くの如くに、被検物質を評価し、ＥＴＦＢ発現の抑制作用を認めたものについては、線維芽細胞異常増殖抑制剤とし判別することが出来る。かかる線維芽細胞異常増殖抑制剤は、同抑制剤を有効成分として皮膚外用剤や、医薬組成物に加工することにより、瘢痕、特に肥厚性瘢痕などの線維芽細胞異常増殖に起因する疾病の予防又は治療用の医薬とすることが出来る。予防薬としては、瘢痕、特に肥厚性瘢痕などが生じる蓋然性の高い部位、例えば、手術における切除箇所の周辺などに、肥厚性瘢痕が生じる前に予め投与し肥厚性瘢痕の生成を防ぐ、また、生じた肥厚性瘢痕が悪化しない様に予め投与する様な使用が好ましく開示でき、治療においては、既に生じてしまった肥厚性瘢痕等の瘢痕に投与し、当該瘢痕を縮小させる使用が好ましく例示できる。当該医薬の製剤化は、前記線維芽異常増殖抑制剤と製剤化のための任意成分、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、分散剤、界面活性剤等を加えて、常法に従って処理することにより、医薬製剤に加工することが出来る。医薬製剤としては、内服薬、外用剤、注射剤などの剤形に加工可能であるが、外用剤に加工することが特に好ましい。

【0023】

また、皮膚片などの生体より採取されたサンプルについて、当該サンプルにおいてＥＴＦＢがどの程度発現しているかを、ＰＣＲ等によって確認することにより、当該サンプルの周辺の瘢痕化への傾向を知ることが出来る。

【0024】

以下、実施例を挙げて更に詳細に説明を加える。

【実施例1】

【0025】

（細胞培養）
ヒト皮膚正常線維芽細胞の種類は、ATCCより入手可能な細胞が多数存在するが、ケロイド細胞株である（KELFIB）のプロファイルに最も近いCCD-1113Sk細胞（39歳黒人女性由来）を優先的に用いた。

【0026】

線維芽細胞は、DMEM（D-6046、Sigma）にFBS10%（添加した培地で組織培養フラスコ（353024、BD FALCON））にて37℃、CO₂濃度5%の環境下に設定したインキュベーター（M14-3158、Forma Scientific、サンヨー）にて培養した。継代の際にはPBSにて細胞を洗浄後、0.05%トリプシン溶液（T4049、Sigma）を添加し、インキュベーターにて2〜3分インキュベートした後に細胞を回収、継代して用いた。継代は３〜4日おきに実施し、この場合、継代数は７〜12までのものを用いた。

【0027】

（コラーゲンゲル中での細胞培養）
コラーゲンゲル中での培養はVarediらの方法の変法を用いた。即ち、粉末培地より通常の5倍に濃縮したDMEM(5xDMEM、D5523、Sigma）を作製し、以下に示す混合比で最終的にDMEM培地と同様な組成となるようにコラーゲン溶液を作製した。作製したコラーゲン溶液は恒温槽にて12℃にて使用まで保存した。コラーゲン原液の必要量（1mg/mLの際は7mL）、5xDMEM 7mL、200mM HEPES 3.5mL、0.03% NaH₂CO₃ 3.5mL、0.01% NaOH 1.5mL、FBS必要量（10％の際は3.5mL）、H₂Oにて総量31.5mLとした。Basal layerを作製する場合には、あらかじめ24穴または6穴組織培養プレート（24穴;353047、6穴;353046、BD FALCON）に24穴の場合は250μL、6穴の場合には1mLのコラーゲン溶液を添加し、インキュベーターにて15分以上静置しコラーゲンを固化させた。

【0028】

1x10⁶cells/mLの細胞浮遊液を作製し、12℃に保存したコラーゲン溶液と、コラーゲン溶液：細胞浮遊液=9:1の混合比にて混合し、よく撹拌した後に速やかにプレートに播種、インキュベーターに移動した。播種量は24穴プレートでは1mL、6穴プレートでは4mL（いずれも1x10⁵cells/mL）とした。浮遊ゲルを作製する場合は、インキュベーターにて2時間培養後、スパチュラを用いて穴の縁よりゲルを離し遊離させ培養を継続した。

【0029】

（細胞数の計測）
それぞれの実験によって決められた培養時間後、最終濃度310U/mLとなるようにDMEMを用いて調製したコラゲナーゼ溶液に、コラーゲンゲルをスパチュラでプレートよりはがして添加し、37℃にて20〜40分振盪しコラーゲンを消化した。消化した細胞浮遊液を1500rpmにて3〜5分遠心分離し細胞を回収した。回収した細胞に対し100μLの培地を添加し、トリパンブルー染色を施した後Burkel-Turk血球計算盤にて1/5の希釈率にて生細胞数を計測した。

【0030】

（TUNEL染色）
コラーゲンゲルのコラーゲンを消化し、細胞を回収後、1mLのDMEM培地および細胞固定液（Collection Fluid、6768315、Thermo Shandon）を加え、転倒混和した。その細胞浮遊液をCytospin（Thermo scientific）にて分遠心し、スライドガラスに付着させ標本を作製した。作製した標本にin situ Apoptosis Detection Kit（MK500, Takara）にて取扱説明書にしたがってTUNEL染色を施した。検鏡は蛍光顕微鏡（ECLIPSE E600、Nikon）にて100〜400倍の倍率で行い、付着条件下および遊離条件下の陽性細胞出現を観察した。

【0031】

（二次元電気泳動）
付着状態および遊離状態培養のコラーゲンゲルプレートをそれぞれ8〜10枚作製し、培養後1日において前述の手法と同様にコラーゲンを消化した。ただし、コラゲナーゼによる非特異的なタンパク質分解を可能な限り抑制するため、1mMのBenzamidinehydrochrolide Hydrate（B6506、Sigma）および0.1mMのN-α-p-Tosyl-L-Lysine Chloromethylketone Hydrochloride（TLCK、T7254、Sigma）存在下にて実施した。

【0032】

消化後の細胞を遠心分離によりエッペンドルフチューブに回収し、PBSにて2回洗浄した。この間の作業は可能な限り氷冷下で実施した。そのときの細胞湿重量は100〜200mgであった。膜画分の抽出はProteoPrep Membrane Extraction Kit（Sigma）を取扱説明書に従い使用した。なお、細胞を融解する際にはプロテアーゼ（Protease Inhibitor Cocktail、P2714、Sigma）およびフォスファターゼ阻害剤（Phosphatase inhibitor cocktail I＆II、P2850&P5726、Sigma）を取扱説明書に従い添加した。抽出したタンパク質はCoomassie Protein Assay Reagent Kit（2320、PIERCE）にて取扱説明書に従ってタンパク質量を測定し、ディープフリーザーにて使用まで保存した。1回の抽出での抽出率（細胞の湿重量から得られた膜タンパク質の量）は約1/300であった。

【0033】

二次元電気泳動はファルマシア社の二次元電気泳動装置を用いて実施した。等電点電気泳動は18 cmのゲル（Immobile Dry Strip、Amersham）を用い、pIレンジ：3〜10NL（non-linear）、5.5〜6.7および6〜9を検討した。タンパク質のアプライ量は100〜300μgとした。等電点電気泳動は、取扱説明書に従いCup loading法にて展開した。電気泳動装置はEttan IPGphor IEF System（Amersham）を用い、展開条件は以下に示す条件とした。
50μA/Strip、20℃
S1：Gradient 500V 1min.
S2：Gradient 4000V 4h
S3：Step-n-hold 8000V 10h
S4：Step-n-hold 6000V 回収まで

【0034】

等電点電気泳動後、Multiphor II electrophoresis unit（18-1018-06、Amersham）およびElectrophoresis Power supply（19-3500-01、Amersham）にてSDS-PAGEを実施した。ゲルはプレキャストゲル（Excel-Gel SDS、80-1255-53、Amersham、245×110mm、0.5mm thin、Gradient 8-18%）を用い、泳動条件をS1:600V、400mA、13W、30min.、S2：600V、400mA、30W、16hとした。展開後のゲルは自動染色装置（Hoefer Processor Plus、Amersham）にてSilver stain MS kit（299-58901、和光純薬）を用いて取扱説明書に従って銀染色を実施し、各ゲルで染色条件が同等となるように染色を実施した。なお、現像時間は6分とした。以上の操作を繰り返し、付着状態および遊離状態、pIレンジあたりそれぞれ5枚ずつのゲルを作製した。MALDI-TOF-MS解析まで、8.7%Glycerol液中に4℃にて保存した。

【0035】

（ディファレンシャル・ディスプレイ解析）
染色が終了したゲルは、スキャナー（ImageScanner III、28-9076-07、Amersham）を用いてコンピューターに取り込んだ。取り込んだ画像は画像解析ソフト（2D Master Elite Ver. 4.01、2D Master Database Ver. 4.00、Amersham）を用いて以下の手順にて解析を実施した。DDにおける全体的な流れは以下に示す。
（１）コンピューターによるスポットの自動検出、目視確認による重複スポットの修正
（２）スポットとして検出されていないゲルのバックグランドおよび染色されたスポット全体の染色強度のゲル間での標準化
（３）ゲル間で移動度から共通に存在すると認識されるスポットのナンバリング（マッチング、ここで検出される番号をMatch No.と呼ぶ）、ならびに同じサンプルの泳動像が真に同等であるかどうかの統計処理（本処理で同等と判断されたゲルをDDに供した）。
（４）t検定によるDD（棄却率10%）
また、同時に目視にてDDを実施し、コンピューター処理にて算出されたスポットが真に染色強度が異なるかどうかの判断、ならびにコンピューター処理では有意とはならなかったが、目視にて強度が異なるスポットの追加を実施した。

【0036】

＜１＞スポット検出
ImageScanner IIIにて取り込んだ画像をトリミングし、サイズを同等とした。2DMaster Eliteにて自動スポット検出を以下のパラメーターで実施した。
Peak Dilation Parameters:
Min. Peak Area 85
Max. Peak Area 1100
Min. Aspect Ratio 0.4
Max. Aspect Ratio 4.5
Min. Area Ratio 50

【0037】

＜２＞バックグランド除去およびスポット強度標準化
2D Master Eliteに搭載されているバックグランド除去設定およびスキャンされたゲル染色濃度を標準化する作業を取扱説明書に従い実施した。
Max. Number of Touching Peaks 20
Background Intensity 0
Step Size 1
Smoothing Size 1
Histogram Equalization なし
Tidy Edges あり
その後目視によりスポットを確認し、重複して認識されているスポットの修正を実施した。

【0038】

＜３＞スポットマッチングおよびゲル同等性判断
スポット像が良好でスポット数の多い遊離状態のゲル像をReference gelに設定し、取扱説明書に従いスポットのマッチングを実施した。また、2D Master Databaseに搭載されているTest Hypothesis機能を用いてReference gelとのDunnett検定を実施し、5枚のゲルのうち、3枚以上同等と認められた群について＜４＞の作業を実施した。

【0039】

＜４＞付着状態および遊離状態での培養細胞のDD
2D Master Databaseを用い、マッチングしたスポットについて棄却率10%のt検定を実施し、スポット強度に違いのあるものを抽出した。その後算出されたスポットを目視にて確認し、目視でも違いがあるかを確認した。また同時にスポット全体について目視にて再確認し、コンピューター処理で検出されなかった、付着状態・遊離状態で濃度に違いがあるスポットを追加した。

【0040】

前述の手技にて、発現量に違いがあると認められたスポットに関し、MALDI-TOF-MSによる推定を実施した。解析により同等と判断された3〜4枚のゲルより、発現量が多かった方の群のスポットを切り出した。タンパク量が少ないことが予想されたことから、これらのゲル断片をまとめてひとつのサンプルとして試験に供した。スポットの脱銀およびトリプシン消化は96穴のトリプシン消化装置およびキット（Montage In-GelDigest Kit、ミリポア）を用いて取扱説明書に従い実施した。トリプシン消化を実施したタンパク質をアンカーチップ（74115、ブルカーダルトニクス）にマトリクス（CHCAmatrix；10mg/mL α-CHCA in acetone-Ethanol 1:1v/v）と共に1μLスポットし、乾燥後MALDI-TOF-MS（AutoFlex II、ブルカーダルトニクス）にてPeptide Mass Fingerprinting（PMF）解析を実施した。PMF解析はマトリックスから飛び出すペプチド断片の質量パターンからタンパク質を推定する方法である。タンパク質量が十分存在するスポットに関しては、疑似MS/MS解析であり、アミノ酸配列を解析できるPost Source Decay（PSD）解析を実施し同定を試みた。これらの解析結果をデータベース検索にかけて結果を得たが、そのデータベースは、MASCOT（Ver.1.9、Matrix science）を用い、PMF解析で得た結果はMOWSEアルゴリズムによるスコア分布において確率95%以上であり、MASCOT上で算出されている分子量および等電点が同等のものをそのタンパクとして決定した。PSD解析はそのアミノ酸配列から同データベースを用いて候補を検索し、分子量および等電点が同等のものをそのタンパク質とした。本実験条件においてBSAを用いたPMF解析による検出下限は5fmolであった。

【0041】

合計31のスポットについて決定を試みた。MALDI-TOF-MSで決定したタンパクのリストを表１および２に示す。31個のスポットのうち、決定したタンパクは18個（中性領域8個、塩基性領域10個）であった。そのうち付着状態において発現量が高かったタンパクは8個、遊離状態において発現量が高かったタンパクは9個、スポットシフトと考えられるタンパクが1個であった。また、膜に局在しているタンパクが9、核が2、細胞質局在が3、分泌タンパクが1、不明が3であった。外膜のタンパクは得られなかったが、細胞内の膜タンパクについてはある程度得られ、総タンパクで多く得られるシャペロンは2種であり、画分化は効果があったものと考えられた。付着状態において発現量の高かった8個のタンパクはミトコンドリア膜に局在しているものが3種、核に存在しているものが2種、膜に局在しているものが1種、局在不明が2種であった。また、得られたタンパクの中で創傷治癒および瘢痕形成に関する報告があるものは、Citrate synthaseが創傷形成後10日のうちに発現量が高まるという報告、Galectin-3のノックアウトマウスで角膜創傷における再上皮化の遅延が認められたという報告、ETFBが低出力の赤色光を線維芽細胞に照射した際に発現上昇する報告がある以外は不明であった。

【0042】

【表1】

【0043】

【表2】

【0044】

（siRNAの抑制効果および特異性確認試験）
細胞は前述と同様にCCD-1113sk細胞（ATCC No. CRL2439、ヒト皮膚真皮正常線維芽細胞、黒人39歳女性由来）を用い、前述の手法と同様に維持した。導入試薬としてリポフェクタミン2000（LF2000、11668019、Invitrogen）を取扱説明書に従い用いた。導入の際にはOPTI-MEM（31985062、Invitrogen）を培地として使用した。LF2000は陽イオン性のリポソームであり、陰イオン性のsiRNAとコンプレックスを形成し、エンドソームまたはリソソームを経由して細胞内に取り込まれる。siRNAは表３に記載したものを用い、Galectin-3以外は購入した。Galectin-3はTakaraのHPでのsiRNA Design Support System（http://www.takara-bio.co.jp/rnai/intro.htm）を用いて設計した。使用に際し、単層培養にてトランスフェクション後1日間培養したCCD-1113sk細胞を用いて、QuantiGeneによりmRNAの発現抑制を確認した。また、使用したsiRNAの特異性を確認するために、BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）によりsiRNAが作用する配列を検索し、その類似配列を持つ遺伝子に対するQuantiGeneプローブを用いて同様のサンプルよりmRNAを測定し、抑制効果が認められかったsiRNAを使用した。また、陰性対照としてSilencer Negative control siRNA #1（4611、Ambion）を用いた。

【0045】

【表3】

【0046】

上述のsiRNAの抑制効果および特異性確認試験では、CCD-1113sk細胞を2.5x10⁴個、12穴プレートに前日に培養し、LF2000を用いて取扱説明書に従いsiRNAを導入した。用いたLF2000量は終濃度で4μL/well、siRNAは33nM、培地量は2mLであった。そのまま1日培養し、Lysis Buffer（QG0503、Panomics）を1mL添加しQuantiGeneでの測定試料とし、使用までディープフリーザーで保存した。QuantiGeneは取扱説明書に従い処理を行い、1サンプルあたりn=2で測定を実施した。測定はプレートリーダー（ARVO.SX、Wallac、PerkinElmer）を用い、45℃の条件下で化学発光の測定を実施した。以下の式１にて抑制率を算出し、ターゲット遺伝子の抑制率が20%以下であり、特異性確認遺伝子が抑制されないものを用いた。

【0047】

【数1】

【0048】

コラーゲンゲル内培養では、CCD-1113sk細胞を1.5x10⁵個/10cmディッシュ（353003、FALCON）に播種し、一晩培養後、LF2000を取扱説明書に従って使用し、siRNAをトランスフェクトした。1日後、これらの細胞を用い、上述と同様の方法で1時点遺伝子あたりn=2としコラーゲンゲル内培養を実施した。コラーゲンゲル内培養開始日より培養後4日まで1日ごとにゲル内の細胞数を計測した。細胞数の計測は上述の方法で実施した。培養開始日および培養後3〜4日の計測に用いた細胞は各群の細胞を集め、Lysis Bufferを100μL添加し、QuantiGeneによりmRNAの測定を実施した。なお、QuantiGeneは以下の表４に示すプローブを購入し使用した。

【0049】

【表4】

【0050】

上記の結果を基に、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションによる、線維芽細胞異常増殖抑制蛋白質の同定を行った。即ち、それぞれの蛋白質のｓｉＲＮＡを購入し、10cm²シャーレにて24時間培養後にｓｉＲＮＡトランスフェクション処理を実施し、その24時間後にコラーゲンゲル内培養を実施した。その結果は図1に示す。黒の棒グラフは付着状態の結果、白の棒グラフは遊離状態の結果を示す。付着状態において細胞増殖の抑制を示した因子は、GAL3、EHD1およびETFBであった。また、DnaJB5は細胞数の増殖亢進を認めた。一方、遊離条件下においてGAL3ならびにDnaJB5は細胞数の減少を認め、細胞毒性が示唆された。MO25およびCSは細胞増殖の亢進が認められた。GAL3は付着状態にて細胞増殖抑制が認められたが、遊離状態下において細胞数減少を認めたことから、この細胞増殖抑制は細胞毒性による可能性が否定できなかったことから候補から除外した。一方、EHD1およびETFBは遊離状態においても細胞数の顕著な低下を認めず、かつ、付着状態において細胞増殖抑制を示した。そこで、2因子について再現性を確認すべく、より詳細に試験を実施した。その結果、EHD1は再現性が得られなかった。一方、ETFBは付着状態においてNegative controlよりも細胞増殖の抑制が認められ、付着状態では細胞数は顕著に低下せず（図２を参照）同様の傾向が認められ、再現性が得られた。

【0051】

（ｓｉＲＮＡによるノックダウン実験）
前述のＥＴＦＢの機能を調べるために、ｓｉＲＮＡによるノックダウン実験を行った。即ち、CCD-1113sk細胞（ATCC No. CRL2439、ヒト皮膚真皮正常線維芽細胞、黒人39歳女性由来）を用い、上述と同様に維持した。siRNAおよび導入試薬は上述と同様のものを用いた。また、陰性対照としてSilencer Negative control siRNA #1（4611、Ambion）、またはAllStars Negative Control siRNA(Cat. No. 1027281, QIAGEN)を用いた。導入方法は前述の方法と同様に実施した。
TGF-βを添加する場合は、コラーゲン溶液作製時にHuman rTGF-β1（100-B-010、R&D Systems）を添加し混合後、同様に播種した。
mRNAの測定はqRT-PCRを実施した。すなわち、各実験にて回収した細胞よりRNeasy mini kit（74104、QIAGEN）を取扱説明書にしたがってtotal RNAを精製した。RNA0.1μgよりQuantiTect Reverse Transcription Kit（205311、QIAGEN）を用いて取扱説明書に従いcDNAを調製した。cDNA5μLに対しQuantiTect SYBR GreenPCR Kit（204145、QIAGEN）を用いて、real-time PCR machine（ABI PRISM 6700、Applied Biosystem Inc.）によりmRNA発現量を測定した。なお、測定はtriplicateとし、同時にGAPDの発現量測定を実施した。プライマーは表５に記載の以下のものを使用した。また、コラーゲンゲル培養を実施し、培養0日からスキャナー（Multiscanner III、アマシャム）を用いて24穴プレートを撮影した。撮影後、NIH Imageを用いてwell内のゲルの面積を測定した。Wellの底面積を100%とし、測定した面積のパーセントを算出した。

【0052】

【表5】

【0053】

CCD-1113sk細胞にsiRNAをトランスフェクトし1日培養後、5x10⁴個の細胞を、カバーグラスを沈めた6穴プレートに播種した。その際、Human rTGF-β1（100-B-010、R&D Systems）を最終濃度で0または11ng/mL添加し、3日間培養した。培養後PBSにて2回洗浄し、10％中性緩衝ホルマリンを加え20分室温にて固定した。PBSにて2回洗浄後に0.2%Triton-X100を含むPBSにて15分処理し、TBSにて3回洗浄した。その後Phalloidin Alexa 488（A-12379、Invitrogen）を5unit/well添加し、20分間室温処理した。TBSにて3回洗浄後にスライドグラスを取り出し、Fluoromount（K024, Diagnostics BioSystems（コスモバイオ））にて封入し、蛍光顕微鏡（ECLIPSE E600、Nikon）にて観察した。結果を図３に示す。上段左図はTGF-β 11ng/mL存在下、Negative control siRNA添加系の結果、上段右図はTGF-β
11ng/mL存在下、ETFB siRNA添加系の結果である。下段は、それぞれ上段の図の拡大図である。これより、ｓｉＲＮＡ添加系ではＴＧＦ−β存在下でもアクチンフィラメントの形成が見られないことが判る。

【0054】

ETFBに対するsiRNAをトランスフェクトした細胞に対してゲル収縮の遅延が起こらないかどうかを確認した。その結果、ETFBに対するsiRNAをトランスフェクトした細胞では、Negative control siRNAを処理した線維芽細胞と同様に培養1日でほぼ20%に収縮し、その後もほぼNegative controlと差異のない収縮率であった(図4を参照）。以上よりin vitroの本モデルにおいてはETFBの機能欠損は傷口を塞ぐ作用に対して悪影響を与えないことが示唆された。また、この実験結果は、肥厚性瘢痕を含むケロイド性の線維芽細胞でも、通常の線維芽細胞と同様の挙動を示すことを示唆した。これはケロイドなどの線維芽細胞の増殖に対しても本願発明の方法が適用できることを意味する。

【0055】

過剰なコラーゲン発現は、線維芽細胞がマイオファイブロブラストに分化することによって引き起こされ、線維芽細胞におけるマイオファイブロブラスト分化マーカーとしてSMA（α-smooth muscle actin）の発現上昇が報告されている。また、SMA発現上昇はTGF-βの刺激により引き起こされる。もしETFB機能抑制がコラーゲン、SMA発現を抑制するのであれば本因子は線維芽細胞の過剰な細胞数増殖を抑制することによって肥厚を抑制する可能性に加え肥厚性瘢痕治療薬としての期待が高まる。そこでこれらの因子の挙動を確認した。

【0056】

まずコラーゲンゲル内培養の付着状態におけるETFB、COL1A1、SMA mRNAの挙動をNegative controlおよびETFBのsiRNAをトランスフェクトした状態で調査した（図５）。Negative controlでは、ETFBは培養3日後までは発現量が増加した。COL1A1はばらつきはあるものの培養3日後まで発現量は増加した。SMAは培養1日が最大値となり、その後低下した。一方、ETFB siRNAを処理した群は、ETFBは培養4日後までその発現はほとんど認められず、siRNAの効果が持続していた。

【0057】

TGF-β存在下におけるコラーゲンゲル内培養でETFB機能欠損がコラーゲン、SMA発現に与える影響を確認した。Negative controlまたはETFBのsiRNAをCCD-1113sk細胞にトランスフェクトし、コラーゲンゲル内培養を開始する際に調製するコラーゲンゲル溶液にrTGF-βを最終濃度で300ng/mLになるように添加し、培養1日後にコラゲナーゼを用いて細胞を回収し、ETFB, COL1A1ならびにSMAのmRNAの発現量を測定した（図６）。その結果、ETFB発現量はTGF-β添加により約1.5倍上昇した。COL1A1はTGF-β添加によりNegative control、ETFB siRNAいずれの処理においても2〜2.5倍発現量が上昇した。一方SMAはNegative controlはTGF-β添加により発現量が1.7倍増加したのに対し、ETFB siRNA処理群は増加を認めなかった。以上の結果より、ETFBの機能欠損は張力によって引き起こされる線維芽細胞増殖を抑制することに加え、コラーゲンの発現には影響がなく、SMA発現上昇、すなわちマイオファイブロブラスト分化を抑制することが判る。

【0058】

これらの結果より、ＥＴＦＢは線維芽細胞異常増殖の因子であることが証明された。この動向をモニターすることにより、瘢痕などの線維芽細胞の異常増殖の起こる蓋然性を判別することが出来ることも判る。また、コラーゲンゲル中での線維芽細胞の培養において、張力存在下及び非存在下でのＥＴＦＢの動向が被検物質によりどの様に変化するかを判別することにより、線維芽細胞異常増殖を抑制する成分をスクリーニングすることも出来る。また、このような条件でスクリーニングされた線維芽細胞異常増殖を抑制する成分は、線維芽細胞増殖を抑制することに加え、SMA発現上昇、すなわちマイオファイブロブラスト分化を抑制することが出来る。したがって、同成分は、線維芽細胞増殖を抑制し、さらに線維芽細胞がマイオファイブロブラストに分化することによって引き起こされる過剰なコラーゲン発現を抑制することにより、このような現象が関与する疾患、すなわち、線維化並びに肥厚性瘢痕等の治療及び予防薬として用いることが出来ることが判る。

【産業上の利用可能性】

【0059】

本発明は線維芽細胞異常増殖を抑制する医薬の開発に応用できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]